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DEPARTAMENTO DE INGENIERA
UNIVERSIDAD DE CALDAS
GUAS DE
LABORATORIO
MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS
Mara Marcela Martnez Miranda
Bacteriloga y laboratorista clnico
M.Sc. Microbiologa
2016-1
[CARRERA
ndice
INTRODUCCIN
Prctica 1. Efecto de los factores fsicos sobre el crecimiento microbiano.
Prctica 2. Preparacin de muestras y recuento de aerobios de mesfilos por la tcnica de
recuento en placa.
Prctica 3. Enumeracin de coliformes y E. coli por la tcnica de Nmero Ms Probable (NMP).
Prctica 4. Recuento de mohos y levaduras.
Prctica 5. Anlisis de microbiolgico de ambientes y superficies en la industria alimentaria.
Prctica 6. Anlisis microbiolgico del agua mediante la tcnica de filtracin por membrana
(FPM).
Prctica 7. Deteccin de Salmonella spp.
Prctica 8. Deteccin de Listeria monocytogenes.
Prctica 9. Determinacin de esporas de Clostridium sulfito reductor (ECSR) en agua.
Prctica 10. Recuento e identificacin de Staphylococcus coagulasa positivo.
Prctica 11. Recuento e identificacin de Bacillus cereus.
Prctica 12. Evaluacin de esterilidad comercial de conservas.
TEMPORALIZACIN
Introduccin
Los alimentos, al igual que el agua, no son productos estriles cuya carga microbiana vara de
acuerdo del tipo de alimento, su origen, procesamiento, conservacin y manejo.
La calidad microbiolgica de los productos alimentarios hace referencia a dos aspectos
fundamentales: la calidad higinico-sanitaria y la calidad comercial. La primera tiene una gran
importancia debido a que su ausencia conlleva un considerable riesgo para la salud del
consumidor, ya que los alimentos pueden ser vehculos de microorganismos patgenos.
Respecto a la segunda, cabe sealar que hay microorganismos que aunque carezcan de
significado sanitario, pueden ser causa de deterioro del alimento, modificando su color,
aroma, sabor, consistencia o aspecto de forma tal que sea rechazado por el consumidor.
El anlisis microbiolgico de alimentos est destinado a la bsqueda de agentes patgenos o
de microorganismos indicadores de una contaminacin no admisible, de modo que se asegure
la calidad higinico-sanitaria y comercial de los mismos. Aunque los microorganismos ms
importantes en cuanto a la salud pblica son aquellos que desarrollan enfermedades
transmitidas por alimentos (ETA), tales como Salmonella, Staphylococcus aureus, Clostridium
perfringens, etc., existe un grupo de microorganismos de especial utilidad en la industria
alimentaria, que son los llamados "indicadores". Estos microorganismos no son
necesariamente patgenos y su presencia se relaciona con la existencia de contaminacin,
avisando de la posible existencia de patgenos y otros microorganismos que pueden alterar el
producto. Estos microorganismos "indicadores" se analizan de forma rutinaria, y de hecho, en
la legislacin se considera su anlisis como un parmetro de calidad microbiolgica.
El propsito de la presente gua de laboratorio es dar a conocer a los estudiantes de Ingeniera
de Alimentos de la Universidad de Caldas los diferentes procedimientos para el anlisis
microbiolgico de alimentos, de la aplicacin de Buenas Prcticas de Laboratorio, toma de
muestras, diluciones, hasta la fase analtica de los mismos, recuento, lectura, interpretacin y
presentacin de los resultados.
INTRODUCCIN
Insumos
Cultivos bacterianos y de levadura en caldo BHI pre-incubados durante 24-48 horas:
Pseudomonas aeruginosa
Bacillus cereus
Escherichia coli
Salmonella
Staphylococcus aureus
Saccharomyces cerevisiae
Materiales
Dos series de tubos con caldo BHI + NaCl a cinco concentraciones diferentes: 0.85%,
3.5%, 7%, 10% y 15% (10 tubos en total) x triplicado.
Dos series de tubos con caldo BHI + Sacarosa a cuatro concentraciones diferentes: 3%,
7.5%, 15% y 30% (8 tubos en total) x triplicado.
Dos series de tubos con caldo BHI a cuatro pH diferentes: 3.0, 5.0, 7.0 y 9.0 (8 tubos en
total) x triplicado.
Asas bacteriolgicas.
Pipetas de 1 ml.
Gradillas.
Marcador Sharpie.
Cronmetro.
Equipos
Nevera.
Incubadora a 37C.
Incubadora a 28C.
III. PROCEDIMIENTO
1. Determinacin de la temperatura ptima de crecimiento
Tomar una asada de cada uno de los cultivos bacterianos pre- incubados en caldo BHI:
E. coli, P. aeruginosa, B. cereus, Salmonella y S. aureus.
Sembrar tres lotes de tubos de agar TSA inclinado con cada uno de los cultivos
bacterianos pre-incubados en caldo BHI.
Registrar los resultados del crecimiento bacteriano en cruces. (+): crecimiento mnimo,
(++): crecimiento regular y (+++): crecimiento mximo.
Determinar la temperatura de crecimiento ptima para cada bacteria, que ser donde
se observe el mejor crecimiento.
Con un marcador divida el reverso de una placa de agar TSA en cinco partes.
Tomar una asada a intervalos de 10 minutos y sembrar cada vez en una de los sectores
de la placa de agar TSA hasta completar los 40 minutos.
Otro grupo de estudiantes debe trabajar igualmente con la bacteria esporulada B. cereus
para determinar su tiempo trmico mortal.
3. Influencia de la presin osmtica
Preparar dos series de cinco tubos de caldo BHI adicionado con NaCl en diferentes
concentraciones, al 0.85%, 3.5%, 7%, 10% y 15% y un control sin NaCl.
Preparar dos series de cuatro tubos de caldo BHI adicionado con sacarosa en diferentes
concentraciones, al 3%, 7.5%, 15% y 30% y un control sin sacarosa.
Inocular una serie de tubos con 0.1 ml por tubo de E. coli y otra serie con S. aureus.
Homogenice cada tubo.
4. Influencia del pH
Preparar dos series de tubos con caldo BHI y con diferentes pH (3.0, 5.0, 7.0 y 9.0).
Inocule una serie con 0.1 ml de E. coli y otra serie con la levadura S. cerevisiae.
IV. CUESTIONARIO
1. Defina el punto de muerte trmica (PMT) y el tiempo de destruccin trmica (TDT)
2. Cmo se define el tiempo de reduccin decimal?
3. En una curva de la tasa de crecimiento de un microorganismo en funcin de la
temperatura, se distinguen tres puntos importantes conocidos como temperaturas
cardinales, a qu se refieren estas temperaturas?
4. Qu factores influyen en la termorresistencia de los microorganismos? Explique cada
uno de ellos.
V. BIBLIOGRAFA
ALARCN, LR.; OLIVAS, E. Manual de prcticas de Microbiologa bsica y Microbiologa de
alimentos. Universidad Autnoma de Ciudad de Jurez (UACJ). 2001
JAY, J. Microbiologa Moderna de los Alimentos. 3 edicin. Zaragoza: Editorial Acribia, 1994.
PRADO, A.; RODRIGUEZ, S.; FIGUEROA, I.; SHIRAI, K. Manual de prcticas de laboratorio.
Microbiologa de Alimentos. Universidad Autnoma Metropolitana. 2013
RAY, B. Fundametal Food Microbiology. 3 edition. CRC Press Editorial. 2004.
INTRODUCCIN
Materiales (estriles)
Gasa estril.
Pipetas de 1 y 10 ml.
Mecheros de Bunsen.
Propiteadores.
Equipos
Balanza.
Licuadora.
Cuenta colonias
III. PROCEDIMIENTO
A. PREPARACIN DE LA MUESTRA
1. Muestras slidas o semislidas
Filtrar la suspensin usando una gaza poco tupida para retener los restos
macroscpicos de la muestra.
Dilucin sembrada
Volumen sembrado
UFC/g
IV. CUESTIONARIO
1. Elabore una tabla con la composicin qumica de las sustancias usadas como diluyentes en
el laboratorio de microbiologa de alimentos.
2. En una tabla, mencione y describa cada uno de los homogeneizadores de muestras de
alimentos. Cul es el ms usado en el laboratorio de microbiologa de alimentos?
3. Haga una tabla en la que enumere 10 alimentos a los que se les hace recuento de aerobios
mesfilos, los lmites microbiolgicos permitidos y la norma que lo establece en Colombia.
4. Busque en la pgina del Manual de Bacteriologa Analtica de la FDA la gua para calcular y
reportar las UFC de aerobios mesfilos (Items C y D) y extraiga los ejemplos que se
encuentran
all.
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm063346.htm
5. Haga una tabla comparativa entre tres mtodos normalizados diferentes para el recuento
de aerobios mesfilos, incluyendo diluyentes, medios de cultivo, condiciones de
incubacin, etc. (ISO, BAM-FDA, ICMSF, etc.).
V. BIBLIOGRAFA
ARMBULA, AL y MURCIA, GM. (1987). Fundamentos y tcnicas microbiolgicas de alimentos.
Santander: Universidad Industrial de Santander.
BOTERO A., Patricia y C., TIBADUIZA (2003). Instructivo para toma de muestras y anlisis de
productos alimenticios y bebidas en puertos. INVIMA. Bogot, D.F.
DPTO. HIGIENE Y TECNOLOGA DE ALIMENTOS. Prcticas de Microbiologa y Anlisis
Microbiolgico de los Alimentos. rea de Conocimiento de Nutricin y Bromatologa. Facultad
de
Veterinaria.
Universidad
de
Len.
Disponible
en:
http://www3.unileon.es/personal/wwdhtmpm/guiones.pdf Fecha de consulta: 23 de febrero
de 2010.
JEFE DE LABORATORIO (1998). Instructivo de anlisis: Recuento Aerobios Mesfilos. Obtenido
el 01 de febrero de 2008 en http://www.geocities.com/seguridad_alimentaria/meofilos.rtf
LISANDRO SIGNORINI, M, SEQUEIRA, GJ, BONAZZA, JC, et al. (2008). Utilizacin de
microorganismos marcadores para la evaluacin de las condiciones higinico-sanitarias en la
produccin primaria de leche.. Rev. Cient. (Maracaibo), vol.18, no.2, p.207-217. ISSN 07982259.
MARZOCCHI ediciones. (2005). Extraccin, Toma de muestras para anlisis de productos
alimenticios (Toxinas). Disponible en: http://riie.com.ar/?a=22355 Fecha de consulta: 23 de
febrero de 2010.
NORMA TCNICA COLOMBIANA. (2009). NTC 4092. REQUISITOS GENERALES Y DIRECTRICES
PARA ANLISIS MICROBIOLGICOS.
NORMA TCNICA COLOMBIANA. (2009). NTC 4519. METODO HORIZONTAL PARA EL
RECUENTO DE MICROORGANISMOS. TCNICA DE RECUENTO DE COLONIAS A 30C.
ORTIZ, LM. (2003). Material didctico de Microbiologa de Alimentos: Recuento de
microorganismos aerobios mesfilos. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en
http://www2.uah.es/farmacia/programas/microbiologia/material_didactico_de
_microlimentos.htm
PASCUAL, MR y CALDERN, V. (1999). Microbiologa alimentaria. Metodologa analtica para
alimentos y bebidas. 2 Ed. Ediciones Das de Santos.
THATCHER, FS. (1995). Anlisis microbiolgico de los alimentos. Zaragoza. Acribia, 271 p.
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INTRODUCCIN
Los coliformes son un grupo de bacterias de la familia Enterobacteriaceae que se
caracterizan por su capacidad para fermentar la lactosa con produccin de cido y gas, en
un periodo de 48 horas y a una temperatura de incubacin entre 30-37 C. Del grupo
coliformes forman parte los gneros bacterianos Escherichia, Enterobacter, Klebsiella y
Citrobacter. Estos microorganismos son ubicuos, se encuentran ampliamente distribuidos
en la naturaleza, el suelo, agua y tambin son carga normal del intestino del hombre y
animales de sangre caliente.
Dentro del grupo de los coliformes existe un subgrupo que es el de los coliformes fecales o
termotolerantes, que fermentan la lactosa con produccin de cido y gas a una
temperatura de 44,5C en presencia de sales biliares. Los coliformes fecales comprenden
principalmente la especie bacteriana Escherichia coli y algunas cepas de Klebsiella. El
verdadero ndice de contaminacin fecal es E. coli ya que su origen fecal es seguro.
Actualmente, los 3 grupos se utilizan como indicadores pero para diferentes aplicaciones.
La deteccin de coliformes se utiliza como un indicador de la calidad sanitaria de agua o
como un indicador general de condiciones sanitarias en el entorno de procesamiento de
alimentos. Los coliformes fecales siguen siendo el indicador de eleccin para la cra de
moluscos y mariscos en aguas de recoleccin y E. coli se utiliza para indicar la
contaminacin fecal reciente o procesamiento antihiginico (BAM-FDA, 2002).
El propsito de la presente prctica de laboratorio es proveer las herramientas necesarias
para que los estudiantes se capaciten en la tcnica de siembra por NMP para la
enumeracin de coliformes, coliformes fecales y E. coli.
Materiales
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Equipos
III. PROCEDIMIENTO
Preparacin de muestra y diluciones
1. Pesar o medir aspticamente 10 g/10 ml de la muestra y homogenizar con 90 ml de APT
0,1%.
2. Realizar 2 diluciones decimales seriadas de 10-2 y 10-3 a partir de la dilucin inicial
transfiriendo 1 ml a tubos con 9 ml de APT 0,1%.
Prueba Presuntiva
1. Preparar en una gradilla tres series de tres tubos cada una con 10 ml de caldo LST y
campana Durham.
2. Sembrar 1ml de cada una de las diluciones preparadas a cada uno de los tres tubos de
cada serie:
A tres tubos de la primera serie se adiciona 1ml de dilucin 1:10.
A tres tubos de la segunda serie se adiciona 1ml de dilucin 1:100.
A tres tubos de la tercera serie se adiciona 1ml de dilucin 1:1000.
3. Incubar a 35C haciendo lecturas a las 24 y 48 horas.
Lectura e interpretacin de la prueba presuntiva:
Observacin de la generacin de gas depositado en la campana Durham (al menos en 1/10
parte de su volumen) y de la aparicin de turbidez y coloracin amarilla en el medio de cultivo
como consecuencia de la fermentacin de la lactosa. Seleccionar los tubos positivos (turbidez +
gas) y desechar los dems.
Prueba confirmativa
1. Sembrar con asa bacteriolgica una muestra de los tubos positivos en LST (turbidez y gas)
en tubos con caldo LBVB y caldo EC y campana Durham.
2. Incubar los tubos con LBVB a 35C durante 18-24 horas para confirmacin de coliformes
totales.
3. Incubar los tubos con caldo EC a 44,5C durante 18-24 h para coliformes fecales.
Lectura e interpretacin de la prueba confirmativa
- Coliformes totales: La reaccin es positiva cuando se produce crecimiento (turbidez en el
tubo) y desprendimiento de gas en la campana Durham en los tubos con caldo LBVB.
- Coliformes fecales: La reaccin es positiva cuando se produce crecimiento (turbidez en el
tubo) y desprendimiento de gas en la campana Durham en los tubos con caldo E.C.
- Determinar NMP de coliformes fecales.
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Todos los tubos de caldo E.C. confirmados como positivos (turbidez + gas) de organismos
coliformes fecales en cada dilucin se utilizan para el aislamiento de E. coli en agar EMB y
comprobacin bioqumica de la produccin de indol.
Confirmacin de E. coli
Para la investigacin y recuento de E. coli se parte de los tubos confirmados como positivos
(crecimiento y formacin de gas a 44,5 C) para coliformes fecales en el medio E.C., de acuerdo
con los siguientes pasos.
1. Sembrar por estra con asa bacteriolgica los tubos positivos en agar EMB.
2. Incubar a 35C durante 24-48 horas.
3. La aparicin de colonias con brillo verde metlico o negras confirma la presencia de
coliformes.
4. Anotar el nmero de tubos confirmados en cada serie y recurrir a la tabla del NMP donde
se obtiene el recuento por gramo o mililitro de alimento.
Resultados:
Dilucin 10-1
Dilucin 10-2
Dilucin 10-3
N tubos positivos
(coliformes)
N tubos confirmados
(coliformes)
N tubos positivos
(coliformes fecales)
NMP coliformes/g:
NMP coliformes fecales/g:
5. Para investigar la produccin de indol se siembran 1-2 colonias de cada placa en tubos con
agua de triptona (TW).
6. Incubar en bao Mara a 44,5 C durante 24 horas.
7. Pasado este tiempo se incorporan 0,2 ml del reactivo de Kovacs a cada tubo. La reaccin
positiva se manifiesta por la formacin de un anillo rojo en la superficie del medio; la
reaccin negativa muestra anillo amarillento. E. coli al desaminar e hidrolizar el triptfano
del medio, produce indol que se pone de manifiesto al aadir el reactivo de Kovacs.
8. Cuando coincide crecimiento positivo (gas) en caldo BGBL a 44,5C, crecimiento
caracterstico sobre agar y EMB produccin de indol, se hace la lectura en la tabla del NMP
para obtener el nmero de E. coli por gramo o mililitro de muestra.
VI. CUESTRIONARIO
1. Consulte la composicin, empleo e interpretacin de cada uno de los medios usados en
esta prctica para la enumeracin de coliformes y E. coli (Elabore una tabla).
2. Consulte e imprima las tablas de NMP cuando se utilizan tres y cinco series de tubos para
cada ensayo, respectivamente.
3. Qu condiciones de proceso puede causar alto recuento de coliformes y E. coli en la
industria alimentaria?
4. Haga un diagrama de flujo para describir el procedimiento de recuento el placa de
coliformes y coliformes fecales, especificando diluyente, medio de cultivo, tiempo y
temperatura de incubacin, etc.
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5. Elabore una tabla donde enumere 10 alimentos a los cuales se le deba hacer la
enumeracin de coliformes, sus lmites microbiolgicos y la normativa que lo establece en
Colombia.
6. Consulte el mtodo de deteccin de E. coli O157:H7 en la NTC 4899 y haga un diagrama de
flujo del procedimiento A, B y C.
VII. BIBLIOGRAFA
ARAMBULA, AL y MURCIA, GM. (1987). Fundamentos y tcnicas microbiolgicas de alimentos.
Santander: Universidad Industrial de Santander.
BACTERIOLOGICAL ANALYTICAL MANUAL (2002). Enumeration of Escherichia coli and the
Coliform
Bacteria.
Disponible
en:
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064948.htm#conve
ntional
NORMA TCNICA COLOMBIANA (2009). NTC 4516. MTODO HORIZONTAL PARA LA
DETECCIN Y ENUMERACIN DE COLIFORMES TCNICA DEL NMERO MS PROBABLE.
NORMA TCNICA COLOMBIANA (2001). NTC 4899. MTODO PARA LA DETECCIN DE
Escherichia coli O157.
PASCUAL, M.R y CALDERN, V. (1999). Microbiologa alimentaria. Metodologa analtica para
alimentos y bebidas. 2 Ed. Ediciones Das de Santos.
THATCHER, FS. (1995). Anlisis microbiolgico de los alimentos. Zaragoza. Acribia, 271 p.
14
INTRODUCCIN
Los mohos y levaduras crecen con mayor rapidez que las bacterias en los alimentos cidos y
con baja actividad de agua, generando por ello importantes prdidas econmicas en la
industria de frutas frescas, jugos, vegetales, quesos, cereales, alimentos salazonados y
encurtidos, as como en alimentos congelados y deshidratados, cuyo almacenamiento se
realiza en condiciones inadecuadas. Adems, existe el peligro potencial de produccin de
micotoxinas por parte de algunos gneros de mohos.
Para conocer la calidad microbiolgica de este tipo de productos, se debe evaluar su tasa de
contaminacin por mohos y levaduras usando los mismos mtodos de recuento usados para
las bacterias (recuento en placa), pero por siembra en superficie. Los mohos y levaduras se
desarrollan en condiciones de aerobiosis, en medios de cultivo que favorezcan su desarrollo, a
temperaturas que varan entre 20 y 25C. Para el recuento de mohos y levaduras se utilizan
medios cidos (pH 5,6) con concentraciones relativamente elevadas de azcar y que adems
contienen antibiticos de amplio espectro para inhibir el crecimiento bacteriano.
El propsito de esta prctica de laboratorio es brindar a los estudiantes las bases
metodolgicas para que sean capaces de hacer el recuento de mohos y levaduras en alimentos
por el mtodo de recuento en placa por siembra en superficie y la interpretacin de los
resultados obtenidos en dicho recuento.
II.
MATERIALES
Reactivos e insumos
Muestras de alimentos slidos (queso, carne, arepa, huevo, frutas, cereales, etc.) o
alimentos lquidos (jugo, yogur, leche, salpicn de frutas, etc.).
Agar YGC (Yeast Extract Glucose Chloramphenicol Agar).
Diluyente: Agua peptonada tamponada 0,1% (APT).
Alcohol al 70%.
Materiales
Pipetas de 1 y 10 ml.
Tubos de ensayo con 9 ml de APT.
Erlenmeyer con 90 ml de APT.
Cajas de Petri con agar YGC.
Jarra para licuadora.
Utensilios para preparacin de la muestra.
Asa de Drigalsky.
Equipos
Licuadora.
Incubadora regulada a 25C.
Balanza.
III.
PROCEDIMIENTO
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CUESTIONARIO
BIBLIOGRAFA
LISANDRO SIGNORINI, M., SEQUEIRA, GJ., BONAZZA, JC. et al. (2008). Utilizacin de
microorganismos marcadores para la evaluacin de las condiciones higinico-sanitarias en la
produccin primaria de leche. Rev. Cient. (Maracaibo), Vol.18, No.2, p.207-217. ISSN 07982259.
PASCUAL, M.R y CALDERN, V. (1999). Microbiologa alimentaria. Metodologa analtica para
alimentos y bebidas. 2 Ed. Ediciones Das de Santos.
16
THATCHER, FS. y CLARK, DS., (1993) Anlisis Microbiolgico de los Alimentos. Edit. Acribia.
Zaragoza.
17
III. PROCEDIMIENTO
18
Superficies
Aerobios mesfilos
Enterobacterias
Manipuladores
Staphylococcus aureus
Enterobacterias
ANLISIS DE AMBIENTES
Tcnica de sedimentacin
1. Escoger una de las plantas de alimentos de la UTA para evaluar la carga microbiana de su
ambiente por medio de recuento de aerobios mesfilos (PCA) y mohos y levaduras (Agar
YGC).
2. Llevar las placas que se van a utilizar completamente cerradas, con cuidado de que no se
abran durante el transporte a la planta escogida.
3. Destapar las cajas de Petri y dejarlas abiertas durante 15 minutos.
4. Cerrar las cajas de Petri y llevar al laboratorio para su incubacin durante:
- 48 horas a 37C las placas de PC
- 4 a 5 das a 25C las placas de YGC
5. Realizar el recuento de aerobios mesfilos y mohos y levaduras e informar los resultados
obtenidos.
ANLISIS DE SUPERFICIES
Cada grupo debe seleccionar la superficie a analizar de un equipo, utensilio o mesn presente
en una de las plantas de alimentos de la UTA.
Mtodo del hisopo
1. Delimitar la superficie que se va a analizar usando una plantilla con una abertura de rea
conocida (p. ej. 100 cm2)
2. Humedecer un hisopo estril con APT 0,1% y restregar varias veces sobre la superficie
delimitada por la plantilla.
3. Introducir el escobilln en el tubo con APT 0,1% y dejar durante 15-30 min de manera que
los microorganismos se liberen del algodn al diluyente.
4. Sembrar 0,1 ml de la suspensin placas con agar PC y EMB por duplicado para recuento de
Aerobios Mesfilos y Enterobacterias, respectivamente.
5. Rastrillar el inculo con el asa de Drigalsky haciendo una siembra masiva por toda la
superficie del medio de cultivo.
6. Incubar las placas de cultivo a 35C durante 24- 48 horas.
7. Contar las colonias que hayan crecido posterior al tiempo de incubacin y dividir por el
rea muestreada.
8. Expresar los resultados.
ANLISIS DE MANIPULADORES
Toma de muestra de manipuladores por el mtodo del hisopo
Manos
19
2.
3.
4.
5.
GAMAZO, C., Lpez-Gui, I. y Daz, R. (1995). 2005. Manual prctico de microbiologa. (3 ed.).
Espaa: Editorial Masson S.A. 2005.
GMEZ, FJ. y Salgado, MT. 2006. Manual de procedimientos e instructivos. Laboratorio de
Microbiologa de Alimentos de la Unidad Tecnolgica de Alimentos (UTA) de la Universidad de
Caldas.
Guia de prctica de microbiologia. 2005. Departamento de Microbiologa II. Facultad de
Farmacia.
Universidad
Complutense.
Disponible
en:
http://www.ucm.es/info/mfar/pdfs/CYTA/Guia_CYTA_1.pdf
20
FUSTER, N. 2007. Importancia del control higinico de las superficies alimentarias mediante
tcnicas rpidas y tradicionales para evitar y/o minimizar las contaminaciones cruzadas.
Disponible en: http://www.tesisenxarxa.net/TDX-1005107-165210/index_cs.html
MICHANIE, S. 2012. Apuntes de laboratorio. Volumen II Monitoreo de la higiene de superficies.
Disponible en: http://www.britanialab.com/files/tcientificos/17.pdf
21
III. PROCEDIMIENTO
1. Colocar una membrana filtrante estril, bajo condiciones aspticas, sobre el centro del
portafiltro, usando pinzas estriles, con la superficie cuadriculada hacia arriba.
2. Ensamblar el equipo, colocando el dispositivo de filtracin y asegurando con una pinza.
3. Verter 100 ml de la muestra de agua en el portafiltro y proceder a filtrar.
4. Lavar el embudo con aproximadamente 100 ml de agua peptonada al 0,1%.
5. Remover la parte superior del portafiltro y, con una pinza estril, transferir la membrana a
la placa de Petri que contiene el medio de cultivo correspondiente al microorganismo que
se va a determinar:
Indicador
Coliformes y E. coli
Pseudomonas aeruginosa
Aerobios mesfilos
Medio de cultivo
Agar ENDO
Agar Cetrimide
Plate Count
Incubacin
Incubacin 35C por 24-48 h
22
23
INTRODUCCIN
Insumos
Muestra: productos crnicos, mayonesa, queso fresco, bizcocho, sopa o crema
instantnea.
Agua peptonada tamponada (APT) 0,1%.
Medio Rappaport-Vassiliadis (RV).
Agar Xilosa Linisa Desoxicolato (XLD).
Agar Salmonella Shigella (SS).
Agar Triple Hierro Azcar (TSI).
Caldo Urea.
Agar Lisina Hierro (LIA).
Medio de movilidad semislido.
Reactivo de Kovacs.
Agar Citrato de Simmons.
Materiales
Pipetas de 1 ml.
Tubos de ensayo con 10 ml de caldo RV.
Tubos con los deferentes medios para pruebas bioqumicas.
Gradillas.
Frasco con 225 ml de APT 0,1%.
Caja de Petri con agar S-S.
Frasco o jarra para licuar las muestras.
Utensilios: chuchillos, tenedores, cucharas, esptulas, etc.
24
Asa bacteriolgica.
Asa de punta.
Equipos
Incubadora regulada a 37C
Bao Mara regulado a 41,5C
Balanza
Licuadora
III.
PROCEDIMIENTO
TSI
Urea
Citrato de Simmons
LIA
Movilidad en SIM medio
Indol
8. Incubar a 35 2C por 24 3 h.
9. Luego de la incubacin, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovacs al tubo con SIM medio
para determinar produccin de Indol y realizar la lectura e interpretacin de todas las
pruebas bioqumicas.
IV.
CUESTIONARIO
1. Enumere las fases del ensayo de deteccin de Salmonella spp. y describa para qu se
realiza cada una.
2. Haga una tabla para enumerar los medios de enriquecimiento selectivo y los agares de
aislamiento selectivo que se utilizan en el ensayo de deteccin de Salmonella spp. y
describir su composicin y fundamento.
25
BIBLIOGRAFA
26
INTRODUCCIN
Materiales (estriles)
- Utensilios.
- Frasco de vidrio boca ancha.
- Tubos de 16 x 160 mm con tapa rosca.
- Asa bacteriolgica.
- Asa de punta.
- Vaso para licuadora.
- Portaobjeto.
- Cajas de Petri
Medios de cultivo, reactivos e insumos
- Muestra de alimento.
- Caldo Fraser concentracin.
- Oxoid Listeria agar cromognico (OCLA)
- SIM medio.
- Agua oxigenada.
- Agar base sangre.
- Sangre de cordero defibrinada.
- Perxido de hidrgeno al 3%
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Equipos:
- Incubadora regulada a 35C.
- Incubadora regulada a 30C
- Licuadora.
- Balanza.
III.
PROCEDIMIENTO
Enriquecimiento selectivo
a. Tomar 25 gramos de la muestra de distintas porciones del producto a analizar.
b. Colocar esta cantidad de muestra en un frasco de licuadora y adicionar 225 ml de caldo
Fraser concentracin.
c. Homogenizar durante 30 segundos, transferir a un frasco estril e incubar a 30C durante
24 2 horas.
Aislamiento selectivo
a. Agitar suevamente el frasco de enriquecimiento selectivo y con un asa estril tomar 10 l
de la muestra y sembrar por agotamiento en un agar selectivo para Listeria (OCLA).
b. Incubar por 24 h a 35C.
Confirmacin de Listeria monocytogenes
a. Observar la formacin de colonias verde fluorescentes (verde-amarillo) con un halo opaco
alrededor de la colonia, caractersticas de L. monocytogenes.
b. Seleccionar como mnimo cinco colonias aisladas tpicas y realizar las siguientes pruebas
bioqumicas:
Reaccin de la catalasa: se toma una colonia aislada y se suspende en una gota de
perxido de hidrgeno al 3% en una lmina portaobjetos. La formacin inmediata de
burbujas de gas indica una reaccin positiva.
Hemlisis en agar sangre: Estriar una colonia aislada en agar sangre de cordero al 5% e
incubar a 35C por 24-48 h. Observar las placas con luz brillante y evidenciar la
presencia de hemlisis estrecha.
Prueba de movilidad: Se inocula con asa recta por puncin central en tubos con medio
SIM y se incuba a 25C 2C por 2 a 5 das. Se observa el crecimiento tpico en forma
de sombrilla alrededor de la puncin.
IV.
CUESTIONARIO
1. Consulte sobre la composicin, empleo e interpretacin de los medios que se usan para la
determinacin de Listeria monocytogenes.
2. Elabore un cuadro donde describa el perfil bioqumico de las diferentes especies del
gnero Listeria.
3. Haga una tabla con 10 alimentos en los que es necesario determinar la presencia de L.
monocytogenes a nivel nacional y/o internacional y mencione la normativa que lo
establece.
4. Haga un diagrama de flujo del proceso de laboratorio para hacer Investigacin de L.
monocytogenes segn la NTC 4666. (Disponible en la biblioteca o en la UTA).
5. Investigue las pruebas rpidas y su fundamento disponibles para la deteccin de L.
monocytogenes en alimentos.
28
BIBLIOGRAFA
AFNOR UNI 03/04-04/05 (2003) Validation certificate for alternative analytical method
according to standard ISO 16140:
Foodsafety.gov
Listeria.
Disponible
http://espanol.foodsafety.gov/intoxicaci%C3%B3n/causas/bacteriasvirus/listeria/xtz/
en:
ICONTEC. NTC 4666 (1999). Mtodo horizontal para la deteccin de Listeria monocytogenes.
Parte 1. Mtodo de deteccin.
MCLANDSBOROUGH, L. A. (2004). Food microbiology laboratory. Vol. 17 de CRC series in
contemporary food science. CRC Press, ISBN 0849312671, 9780849312670. 179 pginas
MARZOCCA, M. A. y otros (2004) Deteccin de Listeria monocytogenes en distintos productos
alimenticios y en muestras ambientales de una amplia cadena de supermercados de la ciudad
de
Baha
Blanca.
Obtenido
el
15
de
octubre
de
2009
en
http://www.scielo.org.ar/pdf/ram/v36n4/v36n4a06.pdf
SANCHEZ, F, et al. (2006). Incidencia de especies de Listeria en una planta productora de
alimentos congelados. Ciencia UANL enero-marzo, ao/vol. IX, nmero 001 pp. 51.56
WIKIPEDIA
(2014).
Listeria
monocytogenes.
Disponible
en:
http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Listeria_monocytogenes&oldid=77447860
29
INTRODUCCIN
El grupo bacteriano sulfito reductor est integrado por grmenes pertenecientes al gnero
Clostridium, que tienen en comn reducir el sulfito a sulfuro. Se caracterizan por tener una
morfologa bacilar, ser Gram positivos, anaerobios estrictos o facultativos y capaces de formar
esporas (Acosta y Gonzlez, 1995, p 298). Las especies de Clostridium estn ampliamente
distribuidas en el ambiente, habitando el tracto gastrointestinal tanto de humanos como de
animales (Wikipedia, 2014). Dentro de este grupo existen dos especies importantes en la
industria alimentaria por su capacidad de producir toxi-infecciones: Cl. perfringens y Cl.
botulinum.
La enfermedad alimentaria causada por Cl. perfringens puede ocurrir cuando los alimentos
como la carne se cocinan sin el mantenimiento del calentamiento o la refrigeracin adecuados
antes de servir. Es frecuente la presencia de pequeas cantidades de Cl. perfringens en las
carnes crudas, aves, sopas deshidratadas, salsas, verduras crudas y especias (Rhodehamel &
Harmon, 2001). Los sntomas, que incluyen calambres abdominales intensos y diarrea, se han
atribuido a una enterotoxina producida durante la esporulacin del organismo en el intestino
(Rhodehamel & Harmon, 2001).
La intoxicacin causada por Cl botulinum o botulismo alimentario se presenta tras un perodo
de incubacin de 24 horas a 4 das despus de la absorcin de la toxina, vara desde formas
leves que no requieren atencin mdica hasta un cuadro grave que puede provocar la muerte
en 24 horas por una parlisis flcida descendente simtrica que ocasiona insuficiencia
respiratoria. Los sntomas comienzan con afectacin de los nervios craneales (diplopa,
disartria, disfagia), agravndose progresivamente la debilidad motora, que pasa a cuello,
brazos, trax y piernas. Puede haber nuseas, vmitos y dolor abdominal antes o despus del
comienzo de la parlisis. Hay adems mareos, visin borrosa y boca seca (Prez-Prez, 2003).
El recuento de Clostridium sulfito reductor se suele usar para evaluar la calidad higinica del
agua y productos de origen animal y se basa en el recuento de colonias de clulas vegetativas
o sus esporas con capacidad sulfito-reductora, desarrolladas en un medio de cultivo especfico,
incubadas en condiciones anaerbicas durante un tiempo y temperatura determinadas.
El propsito de esta prctica de laboratorio es brindar a los estudiantes las herramientas
necesarias para determinar el nmero de esporas de Clostridium sulfito reductor (ECSR) a
partir de una muestra de agua por mtodos de siembra profunda en tubo.
II.
30
Material
-
Pipetas de 10 ml.
Pipetas de 1 ml.
Gradillas para tubos.
Tubos de ensayo con 3 ml de parafina o agar-agar esteril.
Tubos de ensayo vacos estriles.
Tubos de ensayo con 15 ml de agar SPS fundido.
Tubos de ensayo con 9 ml de agua peptonada tamponada 1%.
Equipos
- Bao de agua con temperatura constante a 80C.
- Bao de agua con temperatura constante a 50C.
- Incubadora regulada a 35C.
III.
1.
PROCEDIMIENTO
Agitar vigorosamente la muestra para homogeneizar.
2.
3.
Una vez que estos tubos contienen los 10 mL de agua, mantenerlos en un bao de agua a
80 C durante 5 minutos a efecto de que se destruyan las formas vegetativas y
permanezcan solamente las formas esporuladas.
4.
Tomar los tubos con SPS agar a 50 C y proceder a su inoculacin profunda, de la siguiente
manera:
Con una pipeta estril tomar 5 mL de dicha agua e introducirla hasta el fondo del tubo
que contiene el agar.
Despus aadir una capa de vaselina parafina estril de unos 3 mm de espesor para
conseguir condiciones de anaerobiosis.
NOTA:
Si se sospecha que el agua est muy contaminada, se puede inocular 5 mL de muestra en un
tubo y 5 mL de las diluciones 10-1, 10-2..........
5.
Una vez inoculados todos los tubos, incubar a 37C (1C) durante 24 h (2 h).
6.
Transcurrido el perodo de incubacin, contar las colonias de color negro que aparezcan en
la totalidad de los cuatro tubos inoculados.
31
IV.
CALCULOS Y PRESENTACION DE RESULTADOS:
Efectuado el recuento en los tubos correspondientes, el resultado obtenido se calcular de la
siguiente manera:
- Si se han sembrado 20 mL de muestra, el resultado es directo.
- En caso de haber realizado diluciones, se aplica la siguiente frmula:
Nmero de ECSR/20 mL= (Nmero de colonias/volumen real de la muestra inoculada en mL) x
20.
LOS RESULTADOS SE EXPRESARAN ASI:
Nmero de ECSR: ____/20 mL.
V.
CUESTIONARIO
1.
2.
3.
4.
Haga un diagrama de flujo del procedimiento (9) y expresin de resultados (10) para hacer
el recuento de Clostridium sulfito reductores e identificacin de Clostridium perfringens
segn la NTC 4834.
5.
Haga una tabla para enumerar por lo menos 10 alimentos a los que se le debe realizar
recuento de esporas de Clostridium sulfito reductor, sus lmites microbiolgicos, y cul es
la norma que lo establece.
VI.
BIBLIOGRAFA
32
33
INTRODUCCIN
Insumos
Muestra de alimentos: queso fresco, producto crnico, producto lcteo, sopa instantnea.
Agua peptonada 0,1% + 2% de citrato de sodio.
Agar Baird Parker (BP).
Caldo Infusin Cerebro Corazn (BHI).
Plasma de conejo liofilizado.
Materiales
Pipetas de 1 ml.
Tubos de ensayo con 9 ml de diluyente.
Frascos con 90 ml de diluyente.
Caja de Petri con agar BP.
Frasco o jarra para homogenizar muestras.
Utensilios (cuchillos, tenedores, cucharas, etc.).
Asa de Drigalsky.
Equipos
Incubadora regulada a 35C
Balanza.
Licuadora.
III.
PROCEDIMIENTO
34
35
INTERPRETACIN
NEGATIVA
No se observa evidencia de la formacin de fibrina.
1+ Aparecen cogulos muy pequeos desorganizados.
POSITIVA
2+ Aparece un cogulo pequeo organizado.
3+ Aparece un gran cogulo organizado.
4+ Aparece coagulado todo el contenido del tubo.
4+ El cogulo se mantiene aun cuando se invierte el tubo.
IV.
CUESTIONARIO
1. Investigue sobre el agar Baird Parker (BP) su composicin, el agente selectivo, el agente
diferencial y las caractersticas de las colonias de S. aureus. Mencione otros medios que
se puedan usar para el aislamiento de este microorganismo.
2. Qu otras pruebas bioqumicas, adems de la coagulasa, se pueden usar para identificar
cepas enterotoxgenicas de S. aureus? Describa el procedimiento de cada una de ellas.
3. Investigue en la NTC 4779 el ejemplo de cmo se hace el clculo y la expresin de
resultados para el recuento de Estafilococos coagulasa positiva.
4. Haga una tabla en la que mencione mnimo 10 ejemplos de alimentos en los que se debe
hacer recuento de S. aureus, los ndices mximos (m y M) permisibles y las normas que lo
establecen.
5. Investigue por lo menos 6 casos reportados de brotes de intoxicacin estafilocccica a
nivel nacional e internacional.
6. Qu indica un alto recuento de S. aureus en alimentos?
36
V.
BIBLIOGRAFIA
BENNETT RW. and Lancette GA. (2001). BAM: Staphylococcus aureus. Disponible en:
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm071429.htm
Consultado: 6 de mayo de 2014.
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R.G.
(2002).
Estafilococos.
Disponible
en:
http://www.higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2017.pdf Consultado: 22 de febrero de 2008
DINGES, M, Orwin P, Schlievert P. (2000). Exotoxins of Staphylococcus aureus. Clin Microbiol
Rev. Vol. 13:16-34.
INPPAZOPS/OMS. Instituto Panamericano de Proteccin de Alimentos y ZoonosisOrganizacin Panamericana de la Salud. (2000). Sistema de Informacin Regional para la
Vigilancia de Enfermedades Transmitidas por Alimentos: Brotes de intoxicacin estafiloccica
de 1993 hasta 2000.
LABORATORIO DE TECNOLOGA EDUCATIVA. Departamento de Microbiologa y Gentica.
Universidad de Salamanca. (2005). Investigacin y Recuento de Staphylococcus aureus.
Obtenido
el
01
de
octubre
de
2009
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MERCADO, C. (2007). Los mbitos normativos, la gestin de la calidad y la inocuidad
alimentaria: una visin integral. Agroalim. Vol. 12(24): 119-31.
MOTA L. y Fernndez E. (2012). Intoxicacin estafiloccica por alimentos. Disponible en:
http://www.alimentacion.enfasis.com/articulos/65372-intoxicacion-estafilococica-alimentos.
Consultado: 6 de mayo de 2014.
THATCHER, F.S. y CLARK, D.S. (1993) Anlisis Microbiolgico de los Alimentos. Edit. Acribia.
Zaragoza.
37
INTRODUCCIN
Bacillus cereus es un bacilo Gram positivo, aerobio o anaerobio facultativo, formador de
esporas y mvil. Hidroliza la lecitina de la yema del huevo y no fermenta el manitol.
Es un microorganismo ubicuo abundante en la naturaleza. Se encuentra frecuentemente
en el suelo, polvo, vegetales, cereales, harinas, especias, plantas medicinales y algunos
alimentos crudos o procesados.
B. cereus puede producir dos enterotoxinas, la toxina diarreica y la toxina emtica,
relacionadas con dos formas de presentacin de esta toxiinfeccin: la primera, se
caracteriza por el dolor abdominal y la diarrea sin sangre que tiene un perodo de
incubacin de 4-16 h despus de la ingestin con sntomas que duran 12-24 h; la segunda,
se caracteriza por un ataque agudo de nuseas y vmitos y se produce dentro de 1-5 h
despus del consumo de alimentos contaminados (Acosta et al., 1995) (Martino et. al
2010).
Las cepas de B. cereus son muy variables en cuanto a su crecimiento y caractersticas de
supervivencia. Algunas son psicotrofas, siendo capaces de crecer a 4-5C pero no a 3035C, mientras que otras cepas son mesfilas y pueden crecer entre los 15C y los 50-55 C.
En general, no obstante, la temperatura ptima de crecimiento vara de 30 a 40C. Las
formas esporuladas, al igual que en el gnero Clostridium, son muy termo resistentes y
slo se eliminan mediante la esterilizacin (Tallent et. al., 2012).
La resistencia trmica de esporas de B. cereus en un medio con elevado contenido de agua
vuelve a este microorganismo un potencial peligro para el desarrollo de una intoxicacin si
las medidas higinico sanitarias y de elaboracin de alimentos no son las adecuadas.
En la siguiente prctica de laboratorio los estudiantes aprendern la metodologa para el
recuento e identificacin de B. cereus en alimentos por medio del recuento en placa y su
importancia como indicador en la industria alimentaria.
II.
38
Equipos
Licuadora
Balanza
Incubadora regulada a 30C
III.
Recuento en placa
1. Preparar y homogenizar la muestra, realizando las respectivas diluciones
2. Marcar cuatro cajas de Petri que contienen agar Cereus segn Mossel con fecha, muestra,
dilucin y No. del grupo.
3. Adicionar 0,1 ml de cada una de las diluciones en las cajas marcadas.
4. Extender la muestra con el asa de Drigalsky sobre toda la superficie del medio, y esperar
que se absorba el inculo.
5. Incubar por 18-24 horas a 30C.
6. Seleccionar las cajas que contengan menos de 150 colonias y contarlas colonias
caractersticas (colonias rosadas con bordes regulares e irregulares, con un halo denso a su
alrededor debido a la lecitinasa).
7. Tomar al menos tres colonias caractersticas y hacer una siembra por agotamiento en una
caja de agar sangre de cordero con el asa bacteriolgica.
8. Incubar durante 24 horas a 30C y observar la -hemlisis positiva de B. cereus.
IV.
CUESTIONARIO
1. Explique cul es el fundamento de Agar Manitol Yema de Huevo con Polimixina (MYPA) de
Mossel. Especifique cules son los compuestos selectivos, diferenciales y las caractersticas
de las colonias.
2. Haga un diagrama de flujo del mtodo de recuento de B. cereus segn la NTC 4679:2006
(disponible en el LMA_UTA).
3. Haga una tabla en la que mencione las diferentes pruebas bioqumicas que se pueden usar
para la confirmacin de B. cereus y su perfil bioqumico.
4. Investigue pruebas rpidas para la identificacin de B. cereus
5. Enumere cinco alimentos y su respetiva norma a los cuales se les exige la enumeracin de
B. cereus en Colombia.
6. Investigue por lo menos tres brotes causados por B. cereus a nivel nacional o internacional.
V.
BIBLIOGRAFA
ACOSTA, E y GONZALEZ ORTIZ, L (1995.) Fundamentos para el anlisis microbiolgico de
los alimentos. Barranquilla.
39
40
INTRODUCCIN
Insumos
Conservas o enlatados (2 por grupo)
Caldo Infusin Cerebro Corazn (BHI)
Almidn 0,1%
Alcohol al 70%
41
Agua tibia
Parafina o agar agar estril
Materiales
Reactivos para coloracin de Gram
Abrelatas estriles
Cuchillos-cucharas
Asa bacteriolgica
Cajas de Petri vacas
Tubos estriles
Toallas desechables o papel filtro
Pipetas graduadas
Laminas portaobjetos
Equipos
Balanza
Incubadora regulada a una temperatura de 35 C
Incubadora regulada a una temperatura de 55 C
Microscopio con objetivo de inmersin
Potencimetro
III.
PROCEDIMIENTO
42
INTERPRETACIN
V.
43
VI.
BIBLIOGRAFA
44
TEMPORALIZACIN
Prctica
Sesin 1
Sesin 2
Sesin 3
Sesin 4
Sesin 5
Lectura
prueba
confirmativa
Siembra
en
placa (E. coli)
Pruebas
Lectura placas
bioqumica
Siembra para
Lectura
e
pruebas
interpretacin
bioqumicas
de resultados
Inoculacin e
Lectura
e
incubacin de
Factores fsicos
interpretacin
cepas
de resultados
microbianas
Preparacin
Preparacin de
de muestras y
muestras
y
Recuento
diluciones
diluciones
y
colonias
Siembra
en
RAM.
placa
Preparacin
de
las
Coliformes y E. muestras
coli
Siembra
prueba
presuntiva
Mohos
levaduras
Ambientes
superficies
Anlisis
agua
Salmonella
Listeria
ECSR
Lectura
prueba
presuntiva
Siembra
prueba
confirmativa
Preparacin
y de
las Recuento
muestras
colonias
Siembra
y
Toma
muestras
Siembra
de
de
Recuento
colonias
Filtracin,
de siembra
e Recuento
incubacin de colonias
muestras
de
de
de
Lectura
e
PreAislamiento
Siembra
en
Enriquecimien
interpretacin
enriquecimien
en
agar pruebas
to selectivo
de
pruebas
to no selectivo
selectivo
bioqumicas
bioqumicas
Lectura
e
Enriquecimien Aislamiento
Pruebas
de interpretacin
to selectivo
selectivo
confirmacin de
pruebas
bioqumicas
Preparacin
de
las Recuento
muestras
colonias
Siembra
de
45
S. aureus
Preparacin
de
las
muestras
Siembra
Recuento de
Siembra
en Lectura
e
colonias
pruebas
interpretacin
Siembra
en
bioqumicas
de resultados
medio general
Bacillus cereus
Preparacin
de
las
muestras
Siembra
Recuento de
Siembra
en Lectura
e
colonias
pruebas
interpretacin
Siembra
en
bioqumicas
de resultados
medio general
Esterilidad
comercial
Preparacin
Inspeccin,
de
las
Lectura
e
preparacin e muestras para
interpretacin
incubacin de su
anlisis
de resultados
las muestras microbiolgic
o
46