Sunteți pe pagina 1din 42

UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN

VETERINAR CLUJ-NAPOCA
COALA DOCTORAL
FACULTATEA DE ZOOTEHNIE I BIOTEHNOLOGII

Ing. VARO-GHIURU Florin

REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT

CRIOCONSERVAREA
MATERIALULUI SPERMATIC
PROVENIT DE LA UNELE RASE
LOCALE DE SUINE

Conductor tiinific
Prof. Dr. MICLEA Vasile

Cluj-Napoca
2013

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

CUPRINS

INTRODUCERE ...........
Partea I STUDIU BIBLIOGRAFIC ...................................................................................
CAPITOLUL I
CONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC............
1.1. METODE DE CONSERVARE A MATERIALULUI SEMINAL .....................
1.1.1. Conservarea la temperatura camerei ..............
1.1.2. Conservarea prin refrigerare ..............
1.1.3. Conservarea prin congelare ...............
1.2. FACTORI DE INFLUEN AI CONGELRII SPERMEI .............
1.2.1. Factori interni de influen ai congelrii spermei ..............
1.2.2. Factori externi de influen ai congelrii spermei .............
1.2.2.1. Diluani i ageni crioprotectori .................
1.2.2.2. Viteza de centrifugare a spermei ............
1.2.3. Cauze care diminueaz calitatea spermei crioconservate ..............
1.3. TEHNICI DE CONGELARE ....................
1.4. DECONGELAREA MATERIALULUI SEMINAL ..............
CAPITOLUL II
SURSELE, ROLUL FIZIOLOGIC I MECANISMUL DE FORMARE AL
RADICALILOR LIBERI ......................................................................................................
2.1. SURSE DE RADICALI LIBERI ............................
2.1.1. Surse interne ..........................................................................................................
2.1.2. Surse externe ..........................................................................................................
2.2. SPECIILE REACTIVE ALE OXIGENULUI (ROS) .................
2.3. MECANISMUL DE PRODUCERE AL RADICALILOR LIBERI ...........................
2.4. LEZIUNI CAUZATE DE CTRE RADICALII LIBERI ..........................................
2.4.1. Stresul oxidativ ......................................................................................................
2.4.2. Efectele negative ale radicalilor liberi n spermatozoizi .......................................
CAPITOLUL III
ANTIOXIDANII I ROLUL LOR N CONSERVAREA MATERIALULUI SEMINAL
3.1. VITAMINA E (ALFA TOCOFEROLUL) ...............
3.2. VITAMINA C (ACIDUL ASCORBIC) ..............
3.3. PIGMENII CAROTENOIDICI ............
Partea A II A CERCETRI PROPRII ...........................................................................
SCOPUL I OBIECTIVELE CERCETRII ............
CAPITOLUL IV
OPTIMIZAREA PROTOCOLULUI DE CRIOCONSERVARE A MATERIALULUI
SEMINAL DE VIER PROVENIT DE LA RASELE BAZNA I MANGALIA ...............
4.1. ANTRENAMENTUL VIERILOR ..............
4.2. EVALUAREA APTITUDINILOR DE REPRODUCIE ALE VIERILOR ..............
4.2.1. ntocmirea spermogramei uzuale a spermei brute .............
4.3. DETERMINAREA INFLUENEI DILUANILOR PENTRU STOCARE DE
SCURT DURAT ASUPRA CRIOCONSERVRII MATERIALULUI SEMINAL DE
VIER ..................................................................................................
Ing. VARO GHIURU Florin

Pag.
5
6
6
6
6
6
7
8
8
8
8
9
9
9
10

10
10
11
11
11
11
11
12
12
13
13
14
14
16
16

17
17
17
17

17
2

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

4.3.1. Material i metod .................................................................................................


4.3.2. Rezultate i discuii ................................................................................................
4.4. DETERMINAREA INFLUENEI DILUANILOR UTILIZAI PENTRU
DILUIA INIIAL I PENTRU CEA FINAL ASUPRA CRIOCONSERVRII
MATERIALULUI SEMINAL DE VIER ..............................................................................
4.4.1. Material i metod .................................................................................................
4.4.2. Rezultate i discuii ................................................................................................
4.5. EFECTUL METODEI DE MPAIETARE I SIGILARE ASUPRA
REZULTATELOR CRIOCONSERVRII MATERIALULUI SEMINAL DE VIER ........
4.5.1. Material i metod .................................................................................................
4.5.2. Rezultate i discuii ................................................................................................
4.6. CONCLUZII PARIALE ...........................................................................................
CAPITOLUL V
EFECTUL SUPLIMENTRII CU ANTIOXIDANI A MEDIULUI DE
CRIOCONSERVARE A SPERMEI PROVENIT DE LA RASELE BAZNA I
MANGALIA .......................................................................................................................
5.1. EFECTUL SUPLIMENTRII CU VITAMINA E A MEDIULUI DE
CRIOCONSERVARE ASUPRA MOBILITII SPERMATOZOIZILOR ........................
5.1.1. Material i metod .................................................................................................
5.1.2. Rezultate i discuii ................................................................................................
5.2. EFECTUL SUPLIMENTRII CU VITAMINA C A MEDIULUI DE
CRIOCONSERVARE ASUPRA MOBILITII SPERMATOZOIZILOR ........................
5.2.1. Material i metod .................................................................................................
5.2.2. Rezultate i discuii ................................................................................................
5.3. EFECTUL SUPLIMENTRII CU AMESTECURI DE VITAMINE C I E A
MEDIULUI DE CRIOCONSERVARE ASUPRA MOBILITII
SPERMATOZOIZILOR .......................................................................................................
5.3.1. Material i metod .................................................................................................
5.3.2. Rezultate i discuii ................................................................................................
5.4. EFECTUL SUPLIMENTRII CU LUTEIN A MEDIULUI DE
CRIOCONSERVARE ASUPRA MOBILITII SPERMATOZOIZILOR ........................
5.4.1. Material i metod .................................................................................................
5.4.2. Rezultate i discuii ................................................................................................
5.5. EFECTUL SUPLIMENTRII CU AMESTEC DE VITAMINE C I E I
LUTEIN A MEDIULUI DE CRIOCONSERVARE ASUPRA MOBILITII
SPERMATOZOIZILOR .......................................................................................................
5.5.1. Material i metod .................................................................................................
5.5.2. Rezultate i discuii ................................................................................................
5.6. DETERMINAREA INTEGRITII FUNCIONALE A SPERMATOZOIZILOR
DE VIER CRIOCONSERVAI ............................................................................................
5.6.1. Material i metod .................................................................................................
5.6.2. Rezultate i discuii ................................................................................................
5.7. DETERMINAREA ANOMALIILOR MORFOLOGICE ALE
SPERMATOZOIZILOR DE VIER CRIOCONSERVAI ...................................................
5.7.1. Material i metod .................................................................................................
5.7.2. Rezultate i discuii ................................................................................................

Ing. VARO GHIURU Florin

17
18

19
19
19
20
20
20
21

22
22
22
22
25
25
25

27
27
28
31
31
32

33
33
33
34
34
35
36
36
36

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

5.8. DETERMINAREA INDICELUI DE FRAGMENTARE A ADN-ULUI


SPERMATOZOIZILOR DE VIER CRIOCONSERVAI ...................................................
5.8.1. Material i metod .................................................................................................
5.8.2. Rezultate i discuii ................................................................................................
5.9. CONCLUZII PARIALE ...........................................................................................
CAPITOLUL VI
CONCLUZII FINALE ..........................................................................................................
BIBLIOGRAFIE SELECTIV .................

Ing. VARO GHIURU Florin

37
37
38
38
39
41

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

INTRODUCERE
Creterea animalelor este o ramur deosebit de dinamic a tiinei i practicii agricole,
caracteristic impus n principal de factorul economic. Deoarece preferinele consumatorilor
sunt ntro continu evoluie, cresctorul trebuie s posede capacitatea educaional, informaiile
i mijloacele prin care prevede piaa i conduce activitatea de producie pentru a veni n
ntmpinarea acestora.
Mijloacele zootehnice prin care se coordoneaz procesul de producie sunt diverse i de
cele mai multe ori cu influene i interdependene reciproce.
Tehnologiile de producie consacrate, dar cu aplicabilitate actual, alturi de noile
biotehnologii, determin, pe lng creterea numeric a efectivelor de animale, i mbuntirea
potenialului productiv al acestora.
La ora actual un numr descresctor de rase sunt responsabile de creterea procentului
de producere a hranei. n Europa i la nivel global, eroziunea genetic este n plin desfurare,
multe dintre rase se pierd, sau se afl sub risc de extincie datorit factorului economic implicat
n selecie i a driftului genetic.
Strategiile de reproducie la care apeleaz creterea animalelor sunt ntro continu
rennoire i se refer la nsmnarea artificial, dirijarea ciclurilor estrale, transferul de
embrioni, fecundaia in vitro, congelarea i sexarea embrionilor, etc. nsmnarea artificial este
deja o biotehnologie de reproducie clasic, care s-a raspndit treptat, mai ales dup ce s-a reuit
conservarea spermatozoizilor prin congelare. Conservarea materialului spermatic urmrete
meninerea capacitii fecundante a spermatozoizilor o perioad de timp a crei durat este n
funcie de metodele folosite. Se reuete astfel evitarea risipei de material spermatic i scderea
numrului de masculi, pentru c femelele sunt nsmnate pe masur ce intr n clduri.
n anul 1949 Polge i colaboratorii descoper efectul crioprotector al glicerolului asupra
spermatozoizilor. Acest fapt a avut un uria impact asupra creterii taurinelor, anticipndu-se
acelai efect i asupra celorlalte specii de interes zootehnic. ntre anii 1950-1960, prin protocoale
de conservare consacrate la taurine, s-a ncercat crioconservarea spermei de vier, obinndu-se la
decongelare spermatozoizi mobili, dar aceast mobilitate nu a fost concretizat prin fertilitate
(Graham i col., 1971; Bwanga, 1991). n anul 1970, Polge a fost primul cercettor care a descris
o metod ce a demonstrat experimental fertilitatea spermei de vier congelate decongelate, prin
inseminare chirurgical intraoviductal. Aceste rezultate au fost reconfirmate n 1971 prin
inseminare via cervix de ctre grupuri diferite de cercettori (Graham i col. 1971, Pursel i
Johnson 1974). Bazndu-se pe aceste informaii, n 1975, Westendorf i colaboratorii pun la
punct o tehnic de congelare a spermei de vier n paiete, tehnic care a fost mbuntit i de ali
autori pe parcurs. Aceast tehnic este de referin i astzi, fiind cea mai folosit metod.
Dei folosirea materialului spermatic congelat duce la obinerea de produi vii, rata ftrii
este mult sczut comparativ folosirii spermei de vier diluate. Cu toate aceste rezultate
inferioare, exist argumente puternice care s susin rolul spermei de vier congelate n anumite
segmente ale creterii industriale ale suinelor.
n ultimii ani a aprut o tendin a preferinelor consumatorilor din Romnia ctre
produsele tradiionale, n mod special al celor ecologice. Iar dac ne gndim c reetele acestor
specialiti au fost create cu carne marmorat i perselat, cu grsime intramuscular obinut de
la rasele Bazna i Mangalia, caliti nentlnite la hibrizii de carne, atunci trebuie s ne preocupe
descoperirea unor metode de pstrare a genofondului provenit de la ele. Iar pentru faptul c n
ar exist un efectiv foarte sczut de indivizi aparinnd acestor rase, nsmnrile artificiale cu
material seminal crioconservat ar putea fi soluia pentru repopularea fermelor.

Ing. VARO GHIURU Florin

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

Partea I
STUDIU BIBLIOGRAFIC
CAPITOLUL I
CONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC
1.1. METODE DE CONSERVARE A MATERIALULUI SEMINAL
1.1.1. Conservarea la temperatura camerei
Conservarea la temperatura camerei este procedeul care poate fi practicat la toate speciile
de animale, dar are o utilizare mai mare la suine. Pentru reuita conservrii se folosesc diluani
special destinai acestui scop, ei fiind formai de obicei dintro soluie ce posed capacitate mare
de tamponare, cantiti reduse de glbenu de ou, catalaz i diferite combinaii de antibiotice.
Materialul spermatic nediluat poate fi pstrat 1-2 ore la 18-20C, nainte de a fi inoculat. Acest
interval este necesar pentru controlul ejaculatului, transportul la femelele n clduri i inoculare.
Durata conservrii nu poate fi mai mare deoarece la temperatura menionat spermatozoizii i
menin metabolismul destul de ridicat, epuizndu-i rezervele. Pentru a realiza o conservare
reuit, se admit la diluare numai ejaculatele care ndeplinesc anumii indici minimali. Volume
ale ejaculatelor de peste 200 ml cu o concentraie mai mare de 200 milioane/ml i mobilitate
ridicat sunt considerate garania pstrrii viabilitii spermatozoizilor o perioad lung de timp.
Gradul optim al diluiei este cuprins ntre 1:8 i 1:20. n general spermatozoizii provenii de la
mamifere, n urma dilurii, i sporesc iniial mobilitatea, dup care aceasta scade, iar la nivelul
membranelor apar leziuni. Gradul diluiei stabilete concentraia spermatozoizilor pe doza de
inoculat. Se consider c nu apar diferene dac concentraia este variabil ntre limitele de 20
80 x 109 spermatozoizi/ml. Diluarea propriu-zis are o singur etap, respectiv peste cantitatea
de diluant rezultat din calcularea gradului diluiei se toarn materialul spermatic recoltat,
omogenizndu-se uor ntreg amestecul. Temperatura la care se realizeaz diluarea este de 30
34C, respectarea condiiilor de izotermie fiind obligatorie. Controlul dilurii urmrete
mobilitatea spermatozoizilor. Timpul de echilibrare, n care temperatura materialului spermatic
diluat scade la 15 16C, nu este permis s fie mai mic de 2 ore sau mai mare de 5 ore. Volumul
optim al unei doze este de 100 ml, iar coninutul n spermatozoizi cuprins ntre 2 i 4 miliarde.
1.1.2. Conservarea prin refrigerare
Refrigerarea materialului spermatic diluat a constituit o perioad de timp singura i cea
mai rspndit metod de conservare, dar a fost sau este nlocuit treptat de congelare. Cu toate
modificrile din compoziia chimic a soluiei saline, glbenuul de ou a rmas la nivelul maxim
acceptat de 20%, care asigur protecia spermatozoizilor mpotriva ocului determinat de
scderea temperaturii. n principiu, dup diluare i echilibrare, materialul spermatic se pune la
frigider pentru pstrare timp de 2 3 zile, la temperatura de 4 5C. Datorit temperaturii de
refrigerare spermatozoizii i diminueaz metabolismul. Calitile diluantului, alturi de
reducerea substanelor de catabolism, fac posibil conservarea capacitii fecundante a
spermatozoizilor n perioada de timp menionat. Meninerea temperaturii de refrigerare trebuie
s se realizeze obligatoriu i n timpul transportului dozelor de inoculat la femelele n clduri.
naintea utilizrii pentru inoculare, materialul spermatic refrigerat poate fi adus rapid la
temperatura corporal fr a-i influena negativ capacitatea fecundant. Avantajele metodei sunt
cele cunoscute. Astfel este posibil ca masculii valoroi s fie grupai pentru ca recoltarea,
controlul, diluarea i conservarea spermei s se fac de ctre personal specializat, n condiii care
asigur meninerea capacitii fecundante i previne contaminarea acesteia. Dezavantajele
Ing. VARO GHIURU Florin

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

refrigerrii se refer la ngreunarea operaiunilor, la manipulare i limitarea transportului la


distane de maxim 200 km datorit timpului relativ scurt de conservare. Dac nu sunt
sincronizate cldurile la femele, se face risip de material spermatic. De asemenea comerul
internaional cu material spermatic refrigerat este mult ngreunat (Miclea V., 2003).
1.1.3. Conservarea prin congelare
Conservarea prin congelare, sau crioconservarea, se bazeaz pe principiul c
temperaturile sczute determin o reducere a micrii moleculare la nivel intracelular i implicit
o scdere semnificativ a metabolismului pn la nivele extrem de reduse, rezultnd aa numita
anabioz. Din punct de vedere biologic, supunerea celulelor la aciunea temperaturilor sczute
conduce n primul rnd la pierderea apei intracelulare i cristalizarea celei reziduale. Astfel, la 150C practic toate procesele biologice intracelulare nceteaz, iar la -196C (temperatura
azotului lichid) toate reaciile termice din sistemele apoase sunt sistate, instalndu-se anabioza.
Pe de alt parte, este evident c aciunea frigului provoac la nivel celular leziuni i defeciuni
multiple, multe dintre ele ireversibile, ce conduc la o scdere drastic a viabilitii celulare. Toate
aceste efecte negative se datoreaz a ceea ce, n literatura de specialitate, poart denumirea de
oc criogen sau afrigore. Acesta se manifest mai pregnant la nivelul membranelor celulare
prin pierderea permeabilitii selective a microfilamentelor i microtubulilor, precum i la cel
mitocondrial. Mecanismul ocului criogen este insuficient cunoscut, existnd ns o serie de
ipoteze, mai mult sau mai puin plauzibile. Unul dintre primele efecte ale aciunii temperaturilor
sczute asupra membranelor este trecerea fosfolipidelor din starea lor natural fluid, n cea
gelatinoas, apoi cristalin. Acest fenomen poart denumirea de tranziie de faz i are ca
efect reducerea treptat a flexibilitii membranelor. Astfel, cu ct temperatura scade, cu att are
loc o augumentare a concentraiei colesterolului membranar (component implicat esenial n
fluiditatea membranelor) i o rigidizare a membranelor. Pe de alt parte, creterea concentraiei
colesterolului determin gelificarea membranelor i ntrzierea momentului cristalizrii lor. Un
alt efect al scderii temperaturii este reducerea treptat a cantitii de ATP, cu consecine
negative asupra eficienei funcionrii pompei de ioni (Na + i K+). Implicaia acestui fapt este
profund, dac avem n vedere c pompa de Na + i K+ este mecanismul de baz al reglrii
volumului celular. Astfel, la temperatura corpului, ionii traverseaz membranele cu o anumit
vitez. Pe msura scderii temperaturii, viteza de ieire a lor se reduce, conducnd la o cretere
intracitoplasmatic a concentraiei acestora. n paralel, membranele celulare se depolarizeaz,
influxul de Ca2+ crete, rezultnd o hidrolizare a fosfolipidelor, respectiv o cretere exagerat a
permeabilitii membranelor, cu consecine negative asupra viabilitii celulare. Apariia n
celule a cristalelor de ghea, ca rezultat al solidificrii treptate a apei, conduce la denaturri
fizico-chimice majore, prin distrugerea parial sau total a arhitecturii i microcompartimentrii
celulare, (Mazur, 2004) cu efecte nefaste asupra funciilor metabolice. Mai mult, extinderea
cristalelor determin o cretere a concentraiei solviilor intracitoplasmatici, respectiv o total
debalansare osmotic, urmat de moartea celulei, (Ladoi, 1999). Caracteristicile materialului
spermatic impun ca pentru congelare s se in cont de factorii interni i externi. Rcirea rapid
de la temperatura corporal la temperatura de congelare este duntoare pentru c produce
modificri ireversibile la nivelul membranelor. Spermatozoizii de vier dobndesc o anume
rezisten la ocul termic, dac sunt incubai 2 7 ore n plasm seminal (Butler i Roberts,
1975).

Ing. VARO GHIURU Florin

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

1.2. FACTORI DE INFLUEN AI CONGELRII SPERMEI


1.2.1. Factori interni de influen ai congelrii spermei
Factorii interni sunt reprezentai de caracteristicile interne ale celulei spermatice,
diferenele care apar ntre vieri, chiar dac provin din aceeai ras, diferenele care apar ntre
ejaculate, etc. Un factor limitant n reuita conservrii spermei de vier este variabilitatea dat de
ras, individ i variaiile date de fraciunea de sperm din care se preleveaz materialul biologic.
1.2.2. Factori externi de influen ai congelrii spermei
Factorii externi sunt reprezentai de compoziia chimic a diluantului, tipul i concentraia
agentului crioprotector, gradul diluiei, rata de scdere a temperaturii, durata i temperatura fazei
de echilibru i protocolul folosit n congelare decongelare. Simpla ngheare i dezgheare a
celulelor spermatice, respectiv a oricror celule animale existente n fluidele tisulare sau n
soluii saline comparabile, determin moartea acestora. Rcirea rapid a spermei de la
temperatura corpului pn la temperaturi apropiate de punctul de nghe, determin o reducere
ireversibil a mobilitii spermatozoizilor (Watson i Morris, 1987). O rcire rapid determin de
asemenea o eliberare intracelular a unor enzime (Pursel i Johnson, 1974), o eliberare de lipide
(Darin-Bennet i col., 1973) i o redistribuire a concentraiei intracelulare a ionilor.
1.2.2.1. Diluani i ageni crioprotectori
Prin diluant se nelege acea soluie folosit pentru a mrii volumul ejaculatului pn la
numrul de doze de inseminare dorite. Aceast diluie trebuie s permit meninerea
proprietilor biologice specifice celulei spermatice, proprieti care garanteaz capacitatea de
fecundare a spermatozoidului.
Pe baza compoziiei chimice diluanii se mpart n dou clase:

Diluani fr substane tampon: glbenu de ou glucoz, glbenu de ou lactoz,


glbenu de ou sucroz EDTA i diferite sruri de Ca i Mg, etc.

Diluani cu substane tampon: glicin fosfat, glucoz fosfat, glbenu de ou glucoz


citrat, glbenu de ou glucoz citrat EDTA proteine unitol-uree, Beltswille F3 i F5,
tris fructoz EDTA glbenu de ou, tris glucoz EDTA glbenu de ou, etc.
Din punct de vedere practic diluanii se pot clasifica n dou mari clase:

Diluani care se folosesc pentru conservarea de scurt durat a materialului seminal, 1 3


zile: Beltsville Liquid (BL-1), Beltsville Thawing Solution (BTS), KIEV, Illinois Variable
Temperature (IVT), etc.

Diluani care se folosesc pentru conservarea materialului seminal peste 4 zile: Acromax,
Androhep, Modena, Mulberry III, Rading, X-Cell, Zorlesco, ZORPVA i alii).
Diluanii din prima clas sunt folosii pentru prepararea dozelor care se distribuie pe
distane scurte (cum este sistemul European, n care frecvent dozele de inseminare sunt obinute
chiar n ferma n care are loc inseminarea artificial), iar cei din categoria a doua sunt folosii n
cazul transportului dozelor la distane mari (SUA, Norvegia, etc.). Diluanii care conin glicerol
se adaug n cadrul protocolului de crioconservare de obicei atunci cnd sperma a fost deja
diluat i rcit pn la temperatura de 5C (Almid i Johnson, 1988). Dei diluanii sunt foarte
diferii din punct de vedere a compoziiei chimice, majoritatea se caracterizeaz printro
concentraie relativ mic de glicerol i o perioad scurt de echilibrare.

Ing. VARO GHIURU Florin

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

1.2.2.2. Viteza de centrifugare a spermei


Centrifugarea este utilizat n tehnicile de crioconservare spermatic pentru eliminarea
plasmei seminale. Integritatea acrozomal este imun la efectele centrifugrii, astfel tehnica se
utilizeaz n primul rnd pentru simplitatea ei (Carvajal Gema i col., 2004). n general nu se
face rabat de la protocolul adoptat. Detaliile care trebuie urmrite n cadrul centrifugrii sunt
viteza de rotaie (g), durata de centrifugare i temperatura de centrifugare. Cel mai recomandat
protocol este cel care prevede 10 minute, 800 x g la 15C (Hernndez Marta i col., 2007;
Elizabeth Breininger i col., 2005), ns n literatura de specialitate sunt ntlnite i alte variante.
nc nu este pe deplin explicat efectul centrifugrii asupra parametrilor spermatici postcongelare.
1.2.3. Cauze care diminueaz calitatea spermei crioconservate
Principalele cauze care diminueaz fertilitatea spermei crioconservate sunt:
Schimbarea de temperatur sau efectul de oc termic (cold-shock) ce se caracterizeaz
prin scderea relativ brusc a temperaturii ntre 30 i 0C. Spermatozoizii de vier pot dobndi o
oarecare rezisten la efectul temperaturii sczute prin simpla incubare a spermei la temperatura
camerei pentru cteva ore. Dup 2 7 ore de la incubare majoritatea spermatozoizilor dobndesc
rezisten la temperaturile de rcire.
Stresul de crioconservare. Adiia i eliminarea agenilor crioprotectori n proporii
molare induc un stres osmotic substanial asupra membranei spermatozoidului ( Gadella B.M. i
R. A. van Gestel, 2004). Acetia sunt deosebit de sensibili i la efectul toxic al crioprotectorilor
(Gry B. Boe-Hansen i col., 2005). Din acest motiv se poate aduga pentru crioprotecie un
detergent sintetic pe baz de sodiu i trietanolamin sulfat cunoscut sub denumirea de ORVUS
ES PASTE, binecunoscut pentru calitile crioprotectoare n prezena glbenuului de ou.
Formarea cristalelor de ghea este n strns corelaie cu stresul osmotic i cu
eliminarea soluiilor n urma congelrii. Spermatozoizii sunt congelai n general cu rate de
scdere a temperaturii de 15 60/minut, acestea fiind n general stabilite empiric n funcie de
ratele de supravieuire obinute ( Gao G.Y. i col., 1995). Formarea cristalelor de ghea depinde
i de volumul soluiei supuse congelrii. Volumele mici de sub 0,5 ml, care sunt comune pentru
materialul spermatic ambalat n paiete, nghea la temperaturi cu 10 15C sub punctul de
nghe al soluiilor respective. Cristalele de ghea intraspermatice voluminoase i n cantiti
mari distrug parial sau total arhitectura spermatozoizilor, cu influene negative asupra funciilor
celulei. Prin coborrea temperaturii de nghe, nucleii de cristalizare sunt mai mici, cristalele de
ghea mai fine i mai puin duntoare.
Cele mai importante efecte ale crioconservrii materialului seminal sunt: Scderea
mobilitii, degradarea oxidativ i alterarea membranelor.
1.3. TEHNICI DE CONGELARE
Tehnicile de congelare au efecte majore asupra reuitei crioconservrii materialului
spermatic de vier. Etapele parcurse de la diluarea iniial a materialului spermatic (centrifugarea,
ambalarea i tipurile de ambalaje utilizate, timpii de congelare i ratele de scdere a temperaturii,
decongelarea n funcie de temperatura i timpul de expunere la aceasta i diluanii de
decongelare) influeneaz variabil parametrii spermatici i capacitatea fecundant a acestora. n
marea majoritate a cazurilor, se apeleaz la o tehnic de criostocare descris de Westenford i
col. n 1975 (Funahashi H. i T. Sano., 2005), modificat de diferii autori (Bwanga i col. 1991;
Thurston i col. 1999; Carvajal G. i col. 2004).

Ing. VARO GHIURU Florin

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

1.4. DECONGELAREA MATERIALULUI SEMINAL


Rata de decongelare, exprimat n secunde, i temperatura la care se face decongelarea
este un factor determinant al ratei de criosupravieuire. Sperma de vier a fost congelat n pastile
pe ghea cu suprafaa uscat i mai nou n macropaiete, folosind vaporii statici de azot lichid.
Rata de supravieuire a spermatozoizilor congelai n pastile i decongelai rapid prin plonjarea
lor direct n diluani prenclzii a fost superioar celei obinute n cazul macropaietelor, n care
din cauza diametrului lor mare, rata optim de temperatur la decongelare nu a putut fi realizat
(Weitze i col., 1988). Succesul ratei de decongelare este dependent de rata de congelare.
(Mazur, 1985). n cazul spermei de vier congelat la rate optime de temperatur (Fiser i Fairfull,
1990), mobilitatea i integritatea acrozomal a spermatozoizilor a fost mbuntit prin creterea
ratei de decongelare, la fel i n cazul pastilelor (Salamon i col., 1973). Aceste rezultate
confirm ipoteza care susine c n urma unei congelri rapide, crioleziunile sunt determinate n
principal de o cretere (recretere) a cristalelor de ghea n cazul unei decongelri lente, de
aceea ratele ridicate de temperatur la decongelarea materialului seminal sunt cele mai indicate
(Mazur, 1985). Efectul ratei de decongelare asupra integritii acrozomului este influenat de
concentraia de glicerol, concentraiile mai ridicate fiind mai duntoare (Almid i Johnson,
1988). Trebuie reinut faptul c doar o mic parte din spermatozoizii congelai la rate suboptime
vor supravieui unei decongelri lente sau rapide. Aceasta sugereaz c spermatozoizii de vier
sunt afectai serios de congelarea lent i doar un numr mic de spermatozoizi pot fi salvai
printro rat optim la decongelare. O congelare reuit presupune o combinare optim ntre cele
trei variabile: concentraia de glicerol, rata de congelare i nu n ultimul rnd rata de decongelare.
Lund n considerare meninerea mobilitii i a integritii acrozomale, acest optim este
reprezentat de un compromis: 3% glicerol, o rat de congelare (cuprins n intervalul 0C50C/minut) de 30C/min i o rat de decongelare de 1200C/min.
CAPITOLUL II
SURSELE, ROLUL FIZIOLOGIC I MECANISMUL DE FORMARE AL
RADICALILOR LIBERI
n mod ironic, oxigenul care este un element indispensabil pentru via, poate produce
organismelor efecte severe, vtmtoare n anumite situaii. Majoritatea posibilelor efecte nocive
ale oxigenului se datoreaz formrii i activitii unor compui chimici cunoscui ca specii
reactive ale oxigenului (ROS), care au tendina de a dona oxigen unor alte substane. ROS este
un termen colectiv care include radicali ai oxigenului i civa ageni de oxidare non-radicali,
cum sunt HOCl (acid hipocloros), peroxidul de hidrogen, ozonul, etc. (Halliwell i col., 1995).
Multe asemenea specii reactive sunt radicali liberi i au surplus unul sau mai muli electroni
liberi flotani, pe care caut s i mperecheze i de aceea devin instabili i foarte reactivi (Bagchi
i Puri, 1998). O larg varietate de radicali liberi ai oxigenului, dar i alte specii reactive pot fi
produse n organism. Ionii metalici tranziionali accelereaz frecvena daunelor induse de
radicalii liberi.
2.1. SURSE DE RADICALI LIBERI
Radicalii liberi i alte specii reactive provin fie din procese metabolice eseniale i
normale, fie din surse externe, cum ar fi expunerea la raze x, ozon, fum de igar, poluani din
aer, chimicale industriale, etc. O clasare propus a surselor radicalilor liberi este urmtoarea:
Surse interne, surse externe i factori fiziologici.

Ing. VARO GHIURU Florin

10

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

Factorii fiziologici se refer la statusul mental cum este stresul, emoia, etc. i condiiile
de boal i sunt responsabili pentru producerea de radicali liberi. Sursele externe i mai ales cele
interne necesit o dezbatere mai ampl pentru a fi pe deplin nelese.
2.1.1. Surse interne
Acestea pot fi reacii enzimatice, care servesc ca surs de radicali liberi. Ele includ acele
reacii implicate n lanul respirator, n fagocitoz, sinteza prostaglandinei i n sistemul
citocromului P450. Cteva surse interne care genereaz radicali liberi sunt mitocondriile, xantin
oxidazele, fagocitele, reaciile ce implic fierul i alte metale de tranziie, peroxizomii, calea
metabolic a arahidonatului, exerciiul fizic, ischemia/reperfuzia i inflamaia.
2.1.2. Surse externe
Sursele externe includ reaciile non-enzimatice ale oxigenului cu compui organici.
Radicalii liberi apar de asemenea n reacii care sunt iniiate de radiaiile ionizante. Cteva surse
externe de radicali liberi sunt fumul de igar, poluanii din mediu, radiaiile, lumina ultraviolet,
ozonul, anumite medicamente, pesticidele, anestezicele i solvenii industriali.
2.2. SPECIILE REACTIVE ALE OXIGENULUI (ROS)
Radicalii liberi pot fi definii ca molecule sau fragmente moleculare ce conin unul sau
mai muli electroni nepereche pe orbitalul lor atomic sau molecular (Halliwell i Gutteridge,
1999). Acest sau aceti electroni imprim un grad considerabil de reactivitate radicalului liber.
Radicalii derivai ai oxigenului reprezint cea mai important clas de specii reactive generate n
sistemele vii (Miller i col., 1990). Acetia sunt urmtorii: Radicalul hidroperoxil, Radicalul
superoxid, Peroxidul de hidrogen, Oxigenul singlet i Oxigenul triplet.
2.3. MECANISMUL DE PRODUCERE AL RADICALILOR LIBERI
Un radical poate dona electronul su nepereche unei alte molecule. Poate apoi s ia un
electron de la alt molecul pentru a-l mperechea pe al su, sau poate simplu s se alture cu
totul acelei molecule. Cnd radicalul primete sau cedeaz un electron, sau se alipete, anionul
format devine radical la rndul su. Astfel, viitoarele reacii, ce decurg ca reacii n lan, fac ca
un radical s dea natere altuia (Halliwell i Gutteridge, 1984). Radicalii liberi pot fi formai pe
trei ci:
Prin clivaj homolitic al legturii covalente dintro molecul normal, fiecare fragment
reinnd unul dintre cei doi electroni pereche.
X:Y
X* + Y*
Prin pierderea unui electron nepereche dintro molecul normal.
X:Y
X+ + Y Prin adiia unui electron nepereche la o molecul normal.
X + eX2.4. LEZIUNI CAUZATE DE CTRE RADICALII LIBERI
Dac radicalii liberi nu sunt inactivai, reactivitatea lor chimic poate leza toate
macromoleculele celulare, incluznd proteinele, carbohidraii, lipidele i acizii nucleici. Atacul
oxidativ asupra proteinelor conduce la modificri specifice ale aminoacizilor, fragmentarea
lanurilor peptidice, agregarea produilor formai n urma reaciilor ncruciate, modificarea
ncrcturilor electrice i creterea predispoziiei la proteoliz (Farr i Kogoma, 1991). Oxigenul
activat i agenii care genereaz radicali liberi ai oxigenului, cum sunt radiaiile ionizante, induc
Ing. VARO GHIURU Florin

11

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

numeroase leziuni ale ADN-ului, acestea cauznd deleii, mutaii i alte efecte genetice letale.
Att partea bazelor, ct i a glucidelor din ADN sunt predispuse la oxidare, determinnd
degradri ale bazelor, scindare monocatenar i ncruciri ale proteinelor.
2.4.1. Stresul oxidativ
Sies (1985) a definit stresul oxidativ ca un dezechilibru sever aprut ntre agenii oxidani
(speciile reactive ale oxigenului i azotului) i antioxidani, dezechilibru manifestat n favoarea
primilor i care duce la apariia de leziuni n sistemele vii. Acest dezechilibru apare fie datorit
reducerii capacitii de aprare pe care o posed antioxidanii, fie n urma interaciunii cu
substane ce produc oxidarea, lund natere radicalii liberi. Datorit instabilitii lor, acetia
ncearc s ating stabilitatea structural, punnd n comun electronul liber cu grupri electrofile
provenite de la orice molecul aflat n apropiere (lipide, proteine, carbohidrai sau acizi
nucleici) (Pierce i col., 2004). Aceasta determin o serie de reacii n lan care duc la
depolarizarea membranei mitocondriale, eliberarea citocromului C, provoac leziuni la nivelul
acizilor nucleici i oxideaz acizii grai polinesaturai, ceea ce duce la moartea celulelor. n
cadrul tehnicilor de reproducie asistat, procesul de congelare decongelare face celulele mult
mai sensibile la ROS. Ba mai mult, acest proces reduce concentraia de glutation (GSH) cu 78%,
iar activitatea superoxid dismutazei cu 50% n spermatozoizii bovini. Incrementarea peroxidrii
lipidice, observat dup crioconservarea spermei, se datoreaz scderii activitii SOD, ceea ce
sugereaz clar c stresul oxidativ are loc n timpul i/sau dup ciclul de congelare decongelare.
Aceasta explic parial efectul vtmtor al crioconservrii asupra viabilitii gameilor sau a
embrionilor. Modificrile lipidelor datorate ROS i modificrile spaiale ale structurilor
membranare pot conduce clar la leziuni criogene (Moreira da Silva i col., 2010). Sperma
genereaz concentraii mici i controlate de radicali liberi, n special radicali superoxid, peroxizi
de hidrogen i oxid nitric, deoarece acetia acioneaz ca mediatori n procesele de capacitare,
hiperactivare i reacie acrozomal, care sunt cruciale pentru dobndirea abilitii de fertilizare,
dar i pentru ataarea la zona pellucida. Mecanismul de producere a ROS de ctre spermatozoizi
este nc neclar. Este propus o ipotez cum c o NADPH oxidaz care genereaz O2-, similar
cu cea ntlnit n leucocitele fagocitare, este implicat n acest proces. Exist cteva mecanisme
de aprare mpotriva speciilor reactive ale oxigenului pe care sperma le deine. Printre acestea se
numr catalaza, acidul uric, taurina, tiolii, acidul ascorbic i -tocoferolul, dar cele mai
importante sunt superoxid dismutaza i sistemul glutation peroxidaz glutation reductaz. Dei
exist aparent disponibile toate aceste mecanisme de aprare, totui sperma matur se pare c nu
este protejat adecvat, datorit concentraiei ridicate de lipide membranare nesaturate i a unei
insuficiene relative de enzime de tipul SOD, din cauza absenei citoplasmei. Acest deficit este
parial compensat de ctre sistemul antioxidant foarte puternic, prezent n plasma seminal, care,
n contradictoriu cu celelalte fluide biologice, conine concentraii semnificative de SOD, xantin
oxidaz, oxid nitric, catalaz, glutation peroxidaz, plus acid ascorbic, tioli, acid uric, -tocoferol
i un nivel ridicat de glutation (Moreira da Silva i col., 2010).
2.4.2. Efectele negative ale radicalilor liberi n spermatozoizi
Stresul oxidativ provocat de ctre radicalii liberi precum superoxidul, care difuzeaz uor
prin membrana celular, alternd structura i funciile celor mai multe molecule celulare (lipide,
proteine, acizi nucleici), este responsabil de majoritatea leziunilor ce apar. Consecinele acestora
sunt multiple i includ modificri ale activitii mitocondriale, distrugerea ATP i apoptoza.
Speciile reactive ale oxigenului produc oxidarea lipidelor, ceea ce duce la disfuncii
mitocondriale i are efecte negative asupra transportului metaboliilor. Ca urmare, fluiditatea
Ing. VARO GHIURU Florin

12

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

membranelor scade, crescnd permeabilitatea acestora fa de substane care n mod normal nu le


pot traversa, iar efectul este reprezentat de apariia unor leziuni la nivelul proteinelor
membranare. Cationii metalici precum Cu i Fe accelereaz oxidarea lipidelor (Miclea Ileana,
2010).
CAPITOLUL III
ANTIOXIDANII I ROLUL LOR N CONSERVAREA SPERMEI
Pe parcursul evoluiei, organismele i-au dezvoltat un mecanism specific de protecie
pentru a se apra mpotriva oxigenului reactiv i anume mecanismul antioxidant. De aceea,
prezena lui n organisme este factorul major care susine existena lor ntrun mediu bogat n
oxigen. Aceste mecanisme sunt descrise sub termenul general de sistem antioxidant . Acest
sistem include:
Antioxidani liposolubili (vit. A, vit. E, carotenoizi);
Antioxidani hidrosolubili (acid ascorbic, acid uric, taurina);
Enzime antioxidante: glutation peroxidaza (GPx), catalaza (CAT), superoxid dismutaza
(SOD);
n general, antioxidanii acioneaz pe urmtoarele ci:
Prin reacia de rupere a lanului, ex: -tocoferolul, care acioneaz n fraciunea lipidic
pentru a captura radicalii liberi.
Prin reducerea concentraiei de ROS, ex: Glutationul.
Prin curarea radicalilor iniiatori, ex: superoxid dismutaza care acioneaz n fraciunea
lipidic pentru a captura radicalii superoxid.
Prin chelatarea catalizatorilor metalelor tranziionale: un grup de compui care acioneaz
prin sechestrarea metalelor tranziionale, cunoscute bine ca pro-oxidani. Astfel,
transferina, lactoferina i feritina funcioneaz ca ageni ce pstreaz stresul oxidativ
indus de fier n limite normale, iar ceruloplasmina i albumina ca sechestrani ai cuprului.
3.1. VITAMINA E (ALFA TOCOFEROLUL)
Termenul de vitamina E este unul generic, o denumire folosit pentru un grup de 8
componente structural nrudite, sintetizate n plante, n cantitate mai mare n muguri, frunze i
semine n stare de germinaie, coninutul ei variind ntre 80 i 250 g/g (Neamu i col., 1993).
Formele vitaminei E pot fi mprite n dou familii de compui, tocoferolii i tocotrienolii,
cunoscui sub denumirea colectiv de tocoli. Din tocol deriv prin metilri n diverse poziii (C 5,
C7 sau C8) cei patru tocoferoli naturali: (alfa), (beta), (gamma) i (delta). Tocotrienolii
conin n plus trei legturi duble i sunt ntlnii sub aceleai patru forme (alfa), (beta),
(gamma) i (delta), n funcie de locul substituiei. Se pare c fosfolipidele din mitocondrii,
reticulul endoplasmatic i membranele plasmatice posed o afinitate deosebit pentru tocoferol, ceea ce duce la concluzia c vitamina E se concentreaz n aceste formaiuni. Ea este
depozitat i n esutul adipos (Dinu i col., 1996). Cea mai bine cunoscut funcie a vitaminei E
este aceea de antioxidant, ea nlturnd radicalii liberi care pot iniia sau propaga oxidarea
lipidelor. Aceast aciune se datoreaz capacitii sale de a interaciona cu radicalii peroxilipidici
mai rapid dect acetia o pot face cu acizii grai nvecinai, sau cu proteinele membranare.
Tocoferolul este ancorat n membrana celular prin intermediul lanului izoprenoidic, astfel nct
inelul croman care reprezint partea activ a moleculei s se afle la suprafaa structurii
lipoproteice, ntr-o pozitie care s-i permit interaciunea att cu aceasta, ct i cu radicalii liberi
Ing. VARO GHIURU Florin

13

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

prezeni n citoplasm. Radicalul tocoferoxil care rezult, reacioneaz cu un alt radical peroxil,
dnd natere unui produs stabil, tocoferilchinona. Astfel, o singur molecul de tocoferol este
capabil s duc la ntreruperea a dou reacii de oxidare. Vitamina E este poate cel mai bine
cunoscut inhibitor al peroxidrilor lipidice din membranele biologic active, care acionnd ca un
sanitar ce nltur radicalii lipidici peroxil (LOO) i alcoxil (LO), previne leziunile oxidative
din sperma crioconservat. Unii ageni reductori, cum sunt ascorbatul, cisteina i glutationul pot
regenera vitamina E din radicalul tocoferoxil, ceea ce ar putea explica efectele cumulative ale
acestor compui i inhibarea oxidrii lipidelor de ctre vitamina E i ascorbat. Tocoferolii pot
reduce Fe3+ la Fe2+ i Cu2+ la Cu+, asfel nct ar putea avea anumite efecte prooxidante in vitro.
3.2. VITAMINA C (ACIDUL ASCORBIC)
Acidul ascorbic, sau vitamina C, face parte dintr-o grup de vitamine hidrosolubile
eseniale pentu buna funcionare a organismului, un micronutrient implicat n mai multe funcii
biologice. Majoritatea animalelor sunt capabile s sintetizeze vitamina C din glucoz, ns
oamenii, alte primate, purceii de Guineea i liliecii de fructe nu posed gulonolacton oxidaza,
ultima enzim implicat n sinteza vitaminei C, aadar necesit prezena acestei vitamine n
alimentaie. Vitamina C se gsete n toate plantele, dar este prezent n cantiti mai mari n
unele fructe, cum sunt citricele, mceele, fructele de ctin sau merele (Neamu i col., 1993).
Cantitatea n care se gsete, variaz ntre 10 i 100 mg/100g, de cteva ori mai mare dect
coninutul n alte vitamine. Concentraia mare este determinat de abundena sursei acidului
ascorbic, adic glucidele, i de calea relativ simpl de biosintetizare. Absena ei prelungit n
aceste cazuri genereaz erori n modificrile post-translaionare ale colagenului ce pot cauza
boala numit scorbut, sau chiar moartea. Pe lng activitatea sa antiscorbutic, vitamina C este
un potent agent reductor i consumator de radicali liberi n sistemele biologice (Hacievki
Aysun, 2009). A fost asociat fertilitii timp de civa ani i poate avea o importan deosebit
din punct de vedere evolutiv, dar rolul su n reproducie este nc incert. Structura sa este
nrudit cu cea a hexozelor, putnd fi considerat -lactona unui acid hexuronic, numit acid Lgulonic. n molecul mai sunt cuprinse i patru grupri OH dintre care dou sunt alcoolice (la
C5 i C6) i dou enolice (la C2 i C3). Datorit structurii sale asimetrice, acidul ascorbic prezint
patru stereoizomeri, ns forma levogir la atomul de carbon C 5 este cea biologic activ. n
celule, vitamina C este transportat sub forma oxidat de acid dehidroascorbic prin intermediul
transportului facilitat (Sagun i col., 2005). Acidul ascorbic i acidul dehidroascorbic formeaz
n celule un important sistem de oxido reducere care regleaz potenialul redox celular i
contribuie la transportul hidrogenului pe cale nonenzimatic. Acest sistem previne oxidarea unor
biomolecule, adic a lipidelor, proteinelor i ADN-ului nuclear i mitocondrial datorit
interaciunii sale cu radicalii OH, alcoxil, peroxizii, O2- sau oxigenul singlet (1O2) dintre
speciile reactive ale oxigenului i NO sau peroxinitritul dintre cele ale azotului. n mitocondrii,
acidul ascorbic previne att depolarizarea membranei, ct i eliberarea citocromului C,
evenimente ce au loc n timpul apoptozei celulare (Sagun i col., 2005). Activitatea antioxidant
a vitaminei C n cazul ADN-ului este un subiect controversat, studii in vivo i in vitro susinnd
att efectul ei benefic antimutagen, ct i unul negativ prooxidant.
3.3. PIGMENII CAROTENOIDICI
Dintre diferitele clase de pigmeni naturali, carotenoidele sunt cele mai importante i mai
larg rspndite, fiind cunoscute n prezent peste 600 (Olson i Krinsky, 1995) dintre care 24 sunt
folosite n hrana omului. Ele sunt liposolubile i imprim culoarea roie, galben, albastr sau
portocalie esuturilor n care se afl. n regnul vegetal, carotenoidele se gsesc n toate organele
Ing. VARO GHIURU Florin

14

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

plantelor, att clorofiliene, ct si neclorofiliene. La plantele superioare se afl n cloroplatii


esuturilor fotosintetizante (frunze, tulpini, muguri, sepale), dar i n cromoplatii celor
nefotosintetizante (fructe, flori, semine, rdcini, polen). n frunzele i esuturile verzi, culoarea
carotenoidelor este mascat de culoarea verde imprimat de clorofile. Ele au capacitatea de a
absorbi radiaiile luminoase din domeniul vizibil (400-500 nm). Aceti pigmeni sunt sintetizai
numai de ctre regnul vegetal i se gsesc de asemenea n plantele inferioare, n alge i n
bacterii. n plante, absorb lumina pe care o transfer la clorofile pentru a fi utilizat n fotosintez
(Young i Britton, 1993). Carotenoidele protejeaz moleculele de clorofil sau alte substane
active (citocromi, peroxidaze, catalaze, pigmeni flavonoidici, vitamina B 12, vitaminele E,
vitaminele K, etc.) mpotriva fotooxidrii i efectelor acesteia, prevenind distrugerea celulei de
ctre radicalii liberi ai oxigenului (Demming-Adams i col., 1996). Deoarece pot fixa oxigenul,
formnd compui oxigenai puin stabili, pigmenii carotenoidici intervin n procesele de
oxidoreducere. Din punct de vedere chimic, pigmenii carotenoidici se caracterizeaz printro
structur cu legturi duble conjugate, care determin caracterul nesaturat i deci posibilitatea
reaciilor de oxidare i autooxidare (n prezena aerului) i capacitatea de absorbie a unor radiaii
luminoase, pe care le transfer la clorofile pentru a fi utilizate n fotosintez (Tma i Neamu,
1986). Luteina este considerat un antioxidant puternic, alturi de zeaxantin, amndou fcnd
parte din clasa carotenoidelor xantofile. Luteina se gsete cel mai frecvent n legumele cu
frunze verzi: spanac, salat, nap, gulie, brocoli, mazre verde, etc. i n glbenuul de ou. Rolul
su antioxidant n organism este manifestat cu precdere la nivelul ochilor. Acumularea sa n
macula lutea protejeaz retina mpotriva degradrii oxidative, indus de regul de lumina
albastr, o lumin cu und scurt ce produce degenerarea macular odat cu naintarea n vrst.
Carotenoidele sunt depozitate, n primul rnd, n esutul adipos al animalelor, dar i n ovar, n
snge i lapte, precum i n glbenuul de ou (Moa si col., 2002). In vivo, carotenoidele se
gsesc de obicei localizate n membrane, unde prezint o stabilitate mult mai mare dect atunci
cnd sunt izolate ntr-o soluie organic in vitro (Miclea Ileana, 2010). Potrivit FAO (1998), cei
mai importani antioxidani sunt, pe lng acidul ascorbic i tocoferolii, carotenoidele i
flavonoidele. Proprietile lor antioxidante au fost puse pe seama sistemului cromofor extins,
alctuit din lanul polienic n care alterneaz cel puin 11 legturi duble cu cele simple (Britton,
1995). Dar proprietile lor chimice sunt de cele mai multe ori influenate de interaciunea cu alte
molecule, cum ar fi lipidele sau proteinele din membrane. Rolul proteinelor n special este
deosebit de important pentru meninerea poziiei corecte a carotenoidului fa de alte molecule.
Carotenoidele se asociaz cu prile lipidice ale moleculelor de lipoproteine, ceea ce le permite
s interacioneze cu radicalii i n mediu apos (Britton, 1995). Potrivit lui Paiva i col. (1999),
proprietile antioxidante ale carotenoidelor se concretizeaz prin capacitatea lor de a neutraliza
oxigenul singlet (1O2) i ali radicali liberi precum OH, H2O2. n urma reaciei cu 1O2 rezult un
carotenoid n stare excitat, care disipeaz energia ctigat sub form de cldur printr-o serie
de interaciuni de tipul rotaiilor i vibraiilor cu solventul n care se gsete, rezultnd astfel
carotenoidul original care poate fi reciclat n alte reacii de acest tip. Dintre radicalii liberi
formai n organism, carotenoidele reactioneaz cel mai eficient cu cei peroxil rezultai n urma
procesului de oxidare a lipidelor. nlturarea lor ntrerupe secvena de reacii care ar duce n final
la apariia de leziuni n compartimentele lipidice ale celulei (Stahl i Sies, 2003). Potrivit lui
Haila (1999), pigmenii carotenoidici interacioneaz mai eficient cu oxizii lipidici n prezena
unei molecule stabilizatoare precum -tocoferolul. De aceea, carotenoidele sunt considerate a fi
deosebit de importante pentru impiedicarea oxidrii lipoproteinelor i meninerea integritii
membranelor celulare. LDL conin n mod natural o molecul de carotenoide i 12 de tocoferol, ns cantitatea acestora este mic n comparaie cu cele aproximativ 2300 de molecule
Ing. VARO GHIURU Florin

15

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

de lipide oxidabile. Carotenoidele posed o activitate dual ca anti i prooxidani, ce depinde de


presiunea oxigenului: ntre 2 i 20 i pn la 150 mm Hg -carotenul actioneaz ca antioxidant,
n timp ce la 750 mm Hg produce oxidarea in vitro (Palozza, 1998), ns efectul lui este
ameliorat de ctre -tocoferol. A fost emis ipoteza conform creia carotenoidele sunt parte a
unei reele de antioxidani intracelulari, alturi de vitaminele C i E. Aceasta, deoarece pe de o
parte vitamina C poate regenera vitamina E n sistemele lipidice in vitro, iar pe de alta carotenul reacioneaz cu radicalul tocoferoxil, reciclnd molecula de -tocoferol. Radicalul
carotenoidic rezultat ar putea fi preluat de ctre vitamina C (Miclea Ileana, 2010). Carotenoidele
reactioneaz cu oxigenul molecular i radicalii acestuia precum superoxidul i hidroxilul,
principalele specii reactive de oxigen care se formeaz n ovocite i embrion (Guerin i col.,
2001). n plus, pot preveni oxidarea lipidelor de ctre radicalii liberi, proces ce are ca i rezultat
apariia unor substane cu efecte negative asupra celulelor (Halliwell i Chirico, 1993) i a cror
prezen a fost asociat de ctre Noda i col. (1991) cu blocajul embrionilor de oarece n stadiul
de 2 celule. Beta-carotenul, nrudit cu luteina, -tocoferolul i oxidul nitric, trei antioxidani cu
molecul mic ce acioneaz la nivel membranar, inhib peroxidarea lipidic n membranele
celulare. Beta-carotenul ofer protecie mpotriva peroxidrii lipidice mediate de oxigenul
singlet, dar nu mpiedic peroxidarea mediat de radicalii liberi. lfa-tocoferolul nu protejeaz
celulele mpotriva oxigenului singlet, dar inhib formarea de radicali liberi n membranele
celulare. Oxidul nitric nu ofer protecie direct mpotriva oxigenului singlet, dar este un
excepional antioxidant, avnd ca efect ntreruperea reaciilor n lan de formare a radicalilor
liberi. Acesta are abilitatea de a stopa consumul de oxigen n timpul peroxidrii lipidice mediate
de radicalii liberi. Aceste trei mici molecule antioxidante se pare c dein mecanisme
complementare n lupta mpotriva oxidrilor membranare (Schafer Freya, 2002).
Partea a II-a
CERCETRI PROPRII
SCOPUL I OBIECTIVELE CERCETRII
Aa cum rezult din partea bibliografic a lucrrii, mai sunt nc multe necunoscute
pentru a putea spune c metodele de crioconservare a materialului spermatic de vier reprezint o
reuit absolut. Dac la aceste considerente adugm i factorul de influen ras, rezult
tematica acestei teze, definit n continuare ca scop i obiective.
Scopul: crioconservarea materialului spermatic provenit de la rasele autohtone de
suine, Bazna i Mangalia.
Studiile efectuate pn acum se bazeaz preponderent pe observaii survenite n mare
parte n urma unor tatonri privind crioconservarea materialului spermatic de vier. Ca urmare, nu
este ntmpltor faptul c rezultatele actuale nu sunt satisfctoare, dei muli factori de influen
au fost optimizai. Avnd n vedere scopul, ne-am propus realizarea acestuia parcurgnd
urmtoarele obiective-activiti:
Optimizarea protocolului de crioconservare a materialului seminal de vier
Studierea efectului suplimentrii cu antioxidani a mediului de crioconservare a spermei
provenit de la rasele Bazna i Mangalia asupra mobilitii spermatozoizilor dup
decongelare
Studierea efectului suplimentrii cu antioxidani a mediului de crioconservare a spermei
provenit de la rasele Bazna i Mangalia asupra integritii membranelor
spermatozoizilor dup decongelare

Ing. VARO GHIURU Florin

16

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

Studierea efectului suplimentrii cu antioxidani a mediului de crioconservare a spermei


provenit de la rasele Bazna i Mangalia asupra apariiei anomaliilor spermatice dup
decongelare
Studierea efectului suplimentrii cu antioxidani a mediului de crioconservare a spermei
provenit de la rasele Bazna i Mangalia asupra indicelui de fragmentare a ADN-ului
spermatozoizilor dup decongelare.
CAPITOLUL IV
OPTIMIZAREA PROTOCOLULUI DE CRIOCONSERVARE A MATERIALULUI
SEMINAL DE VIER PROVENIT DE LA RASELE BAZNA I MANGALIA
4.1. ANTRENAMENTUL VIERILOR
Antrenamentul vierilor s-a realizat urmrind anumii pai strici, dup cum urmeaz:
- Etapa de obinuire
- Etapa de parcurgere a traseului din boxa de cazare n boxa de recoltare
- Stabilirea relaiei de ncredere ntre om i animal i efectuarea saltului
- Evaluarea rspunsului la antrenament
4.2. EVALUAREA APTITUDINILOR DE REPRODUCIE ALE VIERILOR
n momentul n care prin recoltri repetate s-au obinut ejaculate cu volume aproximativ
constante i calitate bun a materialului seminal, vierii acceptai n programul de cercetare au
fost supui mai departe testului aptitudinilor proprii. Foarte important a fost stabilirea
temperamentului fiecrui vier, deoarece pentru nsmnri artificiale se accept doar cei cu
temperament vioi sau linitit. Apoi materialul seminal diluat pentru I.A., provenit de la fiecare
vier n parte, a fost utilizat pentru a nsmna un anumit numr de scroafe pentru a se urmri
descendena. Toi vierii alei au trecut i acest test, performanele lor ncadrndu-se n limitele
normale pentru fiecare ras n parte.
4.2.1. ntocmirea spermogramei uzuale a spermei brute
n momentul n care un vier este ales pentru recoltare de material seminal n scopul
utilizrii pentru nsmnri artificiale sau pentru cercetri de laborator, este foarte important s i
se ntocmeasc spermograma uzual. Aceasta este esenial pentru fiecare ejaculat n parte,
deoarece calitatea acelui ejaculat depinde de muli factori i poate fi diferit de la o zi la alta. n
cazul inteniei producerii de doze cu material seminal pentru A.I., dac spermograma arat c
ejaculatul nu se ncadreaz n standardele permise, acesta nu se folosete mai departe. n cazul de
fa, noi am efectuat spermogramele uzuale pentru a urmri pretabilitatea ejaculatelor la
crioconservare. Spermogramele uzuale au prezentat valori ncadrate n intervalul caracteristic
parametrilor speciei.
4.3. DETERMINAREA INFLUENEI DILUANILOR PENTRU STOCARE DE SCURT
DURAT ASUPRA CRIOCONSERVRII MATERIALULUI SEMINAL DE VIER
4.3.1. Material i metod
Diluanii pentru diluia iniial cuprini n studiu sunt:
- BTS (Beltsville Thawing Solution), produs de Minitb, Germania
- MR-A, produs de Kubus S.A., Spania
- Androhep Plus, produs de Minitb, Germania

Ing. VARO GHIURU Florin

17

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

Diluant produs n laboratorul de conservare a germoplasmei animale (CGA) din cadrul


USAMV Cluj-Napoca, dup o reet asemntoare BTS-ului, notat n continuare ca Diluant
propriu.
Materialul seminal a provenit de la 2 vieri aparinnd rasei autohtone Bazna. Cercetrile
au fost realizate pe cte 5 ejaculate diferite de la cei 2 vieri menionai, congelndu-se i
decongelndu-se din fiecare ejaculat un numr de 5 paiete pentru fiecare diluant n parte. S-a ales
doar rasa Bazna, deoarece au fost primii vieri care au rspuns pozitiv antrenamentului de
recoltare a spermei. Recoltarea materialului spermatic s-a fcut pe manechin artificial prin
metoda manual, folosind mnui sterile pentru prevenirea contaminrii (Miclea V., 2003).
Evaluarea materialului spermatic imediat dup recoltare a presupus determinarea unor
parametrii i ntocmirea spermogramei uzuale: volumul, culoarea, mirosul, opacitatea, gradul de
impurificare, vscozitatea, pH-ul i osmolaritatea prin controlul macroscopic, iar concentraia,
mobilitatea, aglutinarea, viabilitatea i morfologia spermatozoizilor prin controlul microscopic.
Protocolul de crioconservare este cel descris de Westendorf i col., 1975, pe alocuri modificat.
S-a folosit material care a prezentat un minim de 70% mobilitate i 80% integritate morfologic.
Acesta s-a diluat 1:1 cu unul dintre diluanii pentru diluia iniial, BTS, MR-A, Androhep Plus
sau Diluant propriu, i s-a pstrat timp de 2 ore la temperatura camerei pentru echilibrare. S-a
msurat concentraia, apoi s-a echilibrat timp de nc 2 ore ntro centrifug cu rcire la 15C.
Dup aceast perioad, materialul seminal s-a centrifugat timp de 10 minute la 800 x g. Dup ce
s-a nlturat supernatantul, s-a executat o diluie cu diluant pentru diluia iniial LEY prercit la
15C. Raportul a fost de 3 pri diluant la o parte material spermatic. Ulterior, proba a fost rcit
timp de 2 ore prin reducerea treptat a temperaturii, pn s-a atins temperatura de 5C. Aceast
etap s-a desfurat n totalitate n centrifuga cu rcire. Menionm c n comparaie cu
protocolul clasic, pe baza rezultatelor unor date experimentale preliminare privind mobilitatea
spermatozoizilor crioconservai, perioada de pstrare a spermatozoizilor diluai n raport de 1:1
la temperatura camerei a fost crescut de la 1,5 la 2 ore. De asemenea, pe baza acelorai
rezultate, durata de scdere a temperaturii de la +15C la +5C a fost prelungit cu 30 de minute,
ajungnd tot la 2 ore. Modificrile au constituit o contribuie original i o prim optimizare. n
urma acestei perioade de rcire, s-a adugat diluantul pentru diluia final, numit LEYGO, n
proporie de 1/2 parte diluant la o parte prob, obinndu-se o concentraie final de glicerol de
3% i de 1 x 109 spermatozoizi/ml. Metoda de mpaietare a presupus ambalarea materialului n
paiete de 0,5 ml i sigilarea cu dopuri de PVA la temperatura de 5C. Dup mpaietare, paietele
s-au introdus ntrun aparat criostat cu baie de alcool sintetic, unde s-a sczut temperatura de la
+5C la -5C cu o rat de 3C/min. La temperatura de -5C paietele s-au pstrat timp de un minut
pentru producerea autoseeding-ului. Congelarea s-a produs ntro baie de azot lichid, n vapori de
azot lichid ( la 5 cm distan de nivelul azotului lichid ) timp de 15 minute, la temperatura de 145C, apoi paietele au fost imersate n azot lichid pentru crioconservare. Decongelarea s-a
efectuat prin introducerea paietelor ntro baie de ap nclzit la 50C i meninerea lor timp de
12 secunde. Rezultatele au fost analizate statistic utiliznd ANOVA. Cnd ANOVA a relevat
diferene semnificative, s-a aplicat testul comparaiilor multiple Tukey. Toate analizele au fost
efectuate utiliznd softul GraphPad Prism.
-

4.3.2. Rezultate i discuii


Dup o sptmn de la crioconservarea spermei provenite de la vierii Bazna cu cele 4
tipuri de diluani pentru stocare de scurt durat, au fost decongelate paietele aparinnd fiecrui
tip n parte. S-au stabilit cu ajutorul microscopiei procentele de mobilitate ale spermatozoizilor
decongelai. Rezultatele au fost evaluate la 5 minute postcongelare i nu au evideniat diferene
Ing. VARO GHIURU Florin

18

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

semnificative, aadar alegerea n continuare a unui singur diluant de lucru s-a fcut pe criterii pur
financiare. S-a preferat diluantul propriu, necesarul de chimicale conducnd la obinerea unui
pre mai sczut fa de diluanii comerciali ambalai n pliculee. Reeta este una asemntoare
BTS-ului ca i componente chimice, dar diferit ca i gramaj.
Tabelul 1.
Mobilitatea spermatozoizilor de vier postcongelare n funcie de diluant
Diluant
BTS
MR-A
Androhep Plus
Diluant propriu

Media ESM (%)


421.225
401.581
411.000
422.000

4.4. DETERMINAREA INFLUENEI DILUANILOR UTILIZAI PENTRU DILUIA


INIIAL I PENTRU CEA FINAL ASUPRA CRIOCONSERVRII MATERIALULUI
SEMINAL DE VIER
4.4.1. Material i metod
Materialul seminal a provenit de la 2 vieri Bazna i 2 Mangalia, de la care au fost
recoltate cte 3 ejaculate care au fost supuse crioconservrii, din fiecare decongelndu-se cte 5
paiete pentru analiza mobilitii spermatozoizilor. Recoltarea materialului spermatic, evaluarea
imediat dup recoltare a acestuia privind volumul fraciunii spermatice, concentraia,
determinarea mobilitii, a procentului de aglutinare, a osmolaritii, pH-ului, aspectelor
morfologice, protocolul de crioconservare i metoda de analiz statistic au fost aceleai ca i
cele de la subcapitolul 4.3.1., menionate anterior i descrise n detaliu. Diluanii utilizai pentru
diluia iniial i pentru cea final n scopul preparrii mediului de crioconservare a spermei de
vier au fost: LEY/LEYGO, FEY/FEYGO i Androhep Cryoguard.
4.4.2. Rezultate i discuii
Deoarece n urma utilizrii mediilor de crioconservare cu adaos de fructoz FEY/FEYGO
se obine o mobilitate cu 26% mai slab comparativ celor de tip LEY/LEYGO, s-a renunat la
utilizarea acestei metode de congelare. Rezultatele noastre obinute n urma acestui set de
experiene sunt n concordan cu cele din literatura de specialitate. Un procent de 11% lactoz
n LEY i 6% glicerol n LEYGO au condus la rezultatele publicate. Diferena dintre varianta cu
LEY/LEYGO i cea cu Androhep Cryoguard este nesemnificativ, aadar s-a ales n continuare
folosirea pentru cercetare a mediilor LEY i LEYGO, preparate n laborator cu glbenu de ou
proaspt, variant convenabil att din punct de vedere economic, dar i din punct de vedere al
rezultatelor puin mai bune.
Tabelul 2.
Mobilitatea spermatozoizilor la 10 min dup decongelare n funcie de mediile de crioconservare
folosite
Medii de crioconservare

Media ESM (%)

FEY/FEYGO
LEY/LEYGO
Androhep Cryoguard

151.581
411,000a
361,871a

*Diferenele dintre oricare variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative

Ing. VARO GHIURU Florin

19

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

4.5. EFECTUL METODEI DE MPAIETARE I SIGILARE ASUPRA REZULTATELOR


CRIOCONSERVRII MATERIALULUI SEMINAL DE VIER
4.5.1. Material i metod
Materialul seminal a provenit de la un singur vier Bazna de la care s-au prelevat 3
ejaculate, dorindu-se ca pentru acest capitol de cercetri, majoritatea parametrilor s fie aceiai,
diferenele rezultnd doar din metoda de mpaietare i sigilare a paietelor. Recoltarea
materialului spermatic, evaluarea imediat dup recoltare a acestuia cu privire la volumul
fraciunii spermatice, concentraia, determinarea mobilitii, a procentului de aglutinare, a
osmolaritii, pH-ului, aspectelor morfologice, protocolul de crioconservare i metoda de
analiz statistic au fost aceleai ca i cele de la subcapitolul 4.3.1. menionate anterior. n
cadrul protocolului de crioconservare, n etapa mpaietrii s-au folosit att paiete de 0,25 ml, ct
i paiete de 0,5 ml, procurate de la Minitb (Tiefenbach, Germania). S-au crioconservat din
acelai ejaculat 30 paiete de 0,25 ml i 30 paiete de 0,5 ml. Dintre fiecare 30 paiete, 10 au fost
sigilate manual cu bile metalice, 10 cu dopuri din pudr de PVA Polivinil alcool (Nordic
Invest, Cluj-Napoca, Romnia) i 10 cu ajutorul cletelui termic (200C). Toate paietele au fost
decongelate dup ce au fost pstrate o sptmn n azot lichid la -196C i cu ajutorul
microscopului a fost notat mobilitatea spermatozoizilor la 5 minute de incubare la 37C.
Rezultatele au fost interpretate statistic.
4.5.2. Rezultate i discuii
Ambalarea materialului seminal de vier pentru crioconservare n paiete de plastic de 0,25
ml sau 0,5 ml a condus la obinerea unor rezultate cu diferene nesemnificative din punct de
vedere statistic. Aadar, s-a continuat cercetarea influenei adaosului de antioxidani n mediile
de crioconservare prin folosirea paietelor de 0,5 ml, deoarece se manevreaz mai facil i sunt mai
fiabile atunci cnd mpaietarea se face manual.
Tabelul 3.
Mobilitatea spermatozoizilor de vier crioconservai, mpaietai n paiete de volume diferite
Tipul de paiet
0,25 ml, plastic
0,5 ml, plastic

Media ESM (%)


412.449
464.848

Rezultatele obinute n urma sigilrii paietelor prin cele trei metode, au evideniat clar
diferenele dintre procentele de mobilitate ale spermei dup decongelare din paietele sigilate cu
polivinil alcool, cu bile metalice i cele sigilate cu cletele termic ce dezvolt o temperatur de
200C. Procentul mic obinut n urma folosirii cletelui termic se datoreaz unei fluctuaii mari
de temperatur. Acest clete dezvolt 200C, energia caloric difuznd rapid prin volumul mic de
sperm aflat n paieta de 0,5 ml. Se pare c spermatozoizii nu supravieuiesc n numr mare
acestui oc, de aceea nu se recomand n continuare utilizarea metodei. Din datele graficului 1
rezult diferene semnificative ntre rezultatele metodei cu sigilare termic i celelalte dou
metode la care temperatura nu fluctueaz. ntre metoda sigilrii paietelor cu bile metalice i cea a
sigilrii cu dopuri de polivinil alcool nu sunt diferene semnificative, ns paietele cu PVA sunt
intacte n numr mai mare dect cele cu bile metalice dup decongelare. Aadar s-a ales mai
departe metoda sigilrii paietelor cu pudr de PVA.

Ing. VARO GHIURU Florin

20

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

Mobilitate (%)

50
40
30
20
10

V
P
do
pu
ri
de
u
C

bi
le

Te
rm

ic

et
al
ic
e

Metoda de sigilare

Graficul 1. Mobilitatea spermatozoizilor crioconservai la 5 minute dup decongelare, n raport


cu tehnica de sigilare a paietelor
4.6. CONCLUZII PARIALE
Rezultatele obinute n acest capitol au generat urmtoarele concluzii pariale:

Vierii reinui pentru efectuarea cercetrilor prin caracteristicile fenotipice aparin celor
dou rase locale de interes.

Aptitudinile de reproducie a exemplarelor studiate, permit efectuarea cu succes a


antrenamentului pentru recoltare.

Vierii Mangalia, spre deosebire de cei din rasa Bazna, manifest un comportament
sexual capricios, fiind mai greu de lucrat cu ei. Aadar se recomand tratarea lor cu mai mult
atenie i rbdare.

ntre rase i n cadrul acestora, n funcie de individ i ejaculat, exist o variabilitate


ridicat privind calitatea spermei brute.

La vierii reinui pentru recoltare sperma brut are calitatea necesar pentru a fi utilizat
n experienele de crioconservare.

Diluanii pentru stocare de scurt durat au caracteristici biofizice asemntoare i nu


influeneaz semnificativ mobilitatea materialului seminal indiferent de rasele de la care provine.
Ca urmare, preul de obinere constituie criteriul de alegere pentru diluantul care va fi folosit n
continuare.

Mediul de crioconservare a spermei de vier preparat cu diluani LEY i LEYGO este cel
mai indicat pentru rasele Bazna i Mangalia. O concentraie de 11% lactoz n LEY i 6%
glicerol n LEYGO au condus la rezultate mai bune dect cele obinute n cazul folosirii
diluanilor FEY i FEYGO.

Ambalarea n paiete de 0,25 ml sau 0,5 ml nu influeneaz rezultatele crioconservrii.


Folosirea volumelor de 0,5 ml este de preferat pentru c permit mpaietarea mai facil i dau
posibilitatea reconstituirii unui numr mai mare de doze pentru inoculare.

Sigilarea paietelor cu dopuri de polivinil alcool sau bile metalice nu conduce la diferene
asigurate statistic privind mobilitatea spermei dup decongelare. Utilizarea dopurilor de polivinil
alcool determin scderea nesemnificativ a numrului de paiete cu material spermatic
compromis dup decongelare.

Ing. VARO GHIURU Florin

21

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

CAPITOLUL V
EFECTUL SUPLIMENTRII CU ANTIOXIDANI A MEDIULUI DE
CRIOCONSERVARE A SPERMEI PROVENIT DE LA RASELE
BAZNA I MANGALIA
5.1. EFECTUL SUPLIMENTRII CU VITAMINA E A MEDIULUI DE CRIOCONSERVARE
ASUPRA MOBILITII SPERMATOZOIZILOR
5.1.1. Material i metod
Materialul seminal a provenit de la 2 vieri Bazna, 2 Mangalia i 2 hibrizi comerciali PIC.
Vierii utilizai au fost antrenai pentru recoltarea manual cu manechinul artificial i au prezentat
libidou sexual normal. Recoltarea materialului spermatic, evaluarea imediat dup recoltare a
acestuia cu privire la volumul fraciunii spermatice, concentraia, determinarea mobilitii, a
procentului de aglutinare, a osmolaritii, pH-ului, aspectelor morfologice, protocolul de
crioconservare i metoda de analiz statistic au fost aceleai ca i cele de la subcapitolul 4.3.1.
menionate anterior n tez. Antioxidantul folosit a fost Trolox (acid 2-carboxilic-6-hidroxi2,5,7,8-tetrametilcroman), o variant hidrosolubil a vitaminei E. Antioxidantul a fost
suplimentat ntrun anumit moment al protocolului de crioconservare i anume imediat dup etapa
de adugare a diluantului pentru diluia final LEYGO, la 5C, n vitrina frigorific. Aadar
antioxidantul se adaug n mediul de crioconservare a spermei, obinut conform protocolului de
crioconservare descris, prin amestecul diluantului pentru diluia iniial LEY i a celui pentru
diluia final LEYGO. Antioxidantul nu se adaug n compoziia niciunuia dintre cei doi diluani,
ci va intra n compoziia mediului de crioconservare, dup ce au fost adugai cei doi diluani.
Concentraiile molare de Trolox propuse pentru cercetare au fost: 50 M, 100 M, 200 M, 300
M i 400 M. Deoarece ntre procentele de mobilitate ale spermatozoizilor obinute la
decongelare exist diferene de la o paiet la alta, n cadrul aceleiai etape de crioconservare, sau decongelat pentru fiecare variant experimental cte 3 paiete al cror coninut s-a amestecat,
iar amestecul obinut a fost supus analizei mobilitii postcongelare prin testul de anduran.
Acest procedeu a fost folosit pentru toate analizele privind mobilitatea spermatozoizilor
congelai i decongelai, n cazul n care nu se specific altfel. S-au crioconservat i analizat dup
decongelare un numr de 5 ejaculate pentru fiecare dintre cei 6 vieri.
5.1.2. Rezultate i discuii
La vierii Bazna, se observ c vitamina E n concentraie 200 M adugat n mediul de
crioconservare a materialului seminal crete semnificativ procentul de mobilitate fa de martor
(fr adaos de antioxidant), de la 5 minute dup decongelare, pn la 2 ore. Pentru primul vier,
notat Bazna 1, diferena e distinct semnificativ pn la intervalul de 30 minute, iar de acolo
pn la 2 ore, aceasta este foarte semnificativ. Pentru vierul Bazna 2, situaia este asemntoare,
ba chiar mai bun, aici varianta 200 M Trolox st mai bine la mobilitate de la 5 minute dup
decongelare i pn la dou ore, cu diferene foarte semnificative. n cifre exacte, pentru Bazna
1, la 5 minute de la decongelare varianta martor avea 27% mobilitate a spermatozoizilor, pe cnd
varianta 200 M avea 38%, deci o diferen de 11%. Pentru Bazna 2, diferena e i mai mare, de
la 38% la 58%, adic 20%. Ctre intervalul de 2 ore, diferenele devin tot mai mari. Diferena de
mobilitate la dou ore ntre martor i E 200 M pentru Bazna 1 este de 17%, de la 18% la 35%,
iar pentru Bazna 2 este de 16%.

Ing. VARO GHIURU Florin

22

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

60

Martor
50 M
100 M
200 M
300 M
400 M

40

20

80

Martor
50 M
100 M
200 M
300 M
400 M

60
40
20

h
2

h
1

m
in
30

10

Vierul Bazna 1 - vitamina E

m
in

m
in

h
2

h
1

m
in
30

m
in
10

in

Vierul Bazna 2 - vitamina E

Graficul 2. Procentul de mobilitate a spermatozoizilor vierilor Bazna, crioconservai n mediu cu


adaos de vitamina E
Dinamica influenei vitaminei E asupra mobilitii spermatozoizilor la Bazna nu este una
uniform, ci difer de la un individ la cellalt, fapt posibil datorit ameliorrii suferite n timp.
Lund n discuie varianta cu cele mai bune rezultate, la Bazna 1, procentul de mobilitate crete
de la 5 minute dup decongelare la 30 minute, iar apoi scade ctre 2 ore. Pentru Bazna 2 lucrurile
stau altfel, aici procentul fiind meninut constant de la 5 la 30 de minute, apoi scznd treptat
spre intervalul de 2 ore.

50 M
60

200 M
40

Vierul Mangalita 1 - vitamina E

h
1

m
5

in

in

h
2

30

10

m
in

0
m
in

20

m
in

300 M
400 M

20

100 M

in

40

M a r to r

60

80

Martor
50 M
100 M
200 M
300 M
400 M

80

V ie r u l M a n g a lita 2 - v ita m in a E

Graficul 3. Procentul de mobilitate a spermatozoizilor vierilor Mangalia, crioconservai n


mediu cu adaos de vitamina E
La vierii Mangalia rezultatele sunt asemntoare pentru ambii indivizi. Tot varianta
Trolox 200 M se evideniaz cu diferene foarte semnificative fa de martor i n general
semnificative fa de celelalte variante pe ntreaga perioad a testului de anduran. Dar cel mai
de interes timp de evaluare este chiar cel de 2 ore, iar concentraia de 200 M reuete s creasc
procentul de mobilitate de la 20% n varianta martor la 35% pentru Mangalia 1 i de la 12% la
26% pentru Mangalia 2, deci o diferen de 14-15%, care nseamn un numr aproape dublu de
spermatozoizi mobili i sigur anse de fecundare mai mari. Graficul 3 evideniaz clar nivelul
pn la care vitamina E crete procentul de mobilitate i totodat dinamica influenei acestei
Ing. VARO GHIURU Florin

23

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

vitamine, al crei aport este uniform n cazul rasei Mangalia pe tot parcursul intervalului de timp
de la decongelare, fr diferene atribuite individului. Acest fapt este posibil datorit rusticitii i
a omogenitii rasei, aceasta rmnnd neameliorat i bine consolidat de mult timp ncoace.
Uniformitatea, nsoit de diferenele mari de mobilitate ntre martor i Trolox 200 M,
sugereaz aciunea mai pregnant a antioxidantului asupra raselor rustice, acest efect fiind
posibil de obinut i asupra altor rase nrudite cu Mangalia. Ritmul de scdere a procentului de
mobilitate pe parcursul trecerii timpului de la decongelare este mult mai lent la varianta 200 M
Trolox, att la Mangalia, dar i la Bazna.
80

M a rto r

80

M a r to r

50 M
60

100 M

50 M
60

100 M

200 M
40

300 M

200 M
40

300 M

400 M
20

400 M
20

V ie ru l P IC 1 - v ita m in a E

h
2

h
1

in
m
3

m
0
1

in

in

h
2

h
1

in
30

in
m
10

in

V ie r u l P IC 2 - v ita m in a E

Graficul 4. Procentul de mobilitate a spermatozoizilor hibrizilor PIC, crioconservai n mediu cu


adaos de vitamina E
La vierii PIC, materialul seminal reacioneaz diferit la adaosul de vitamina E, n funcie
de vierul de la care provine. Sperma crioconservat cu adaos de 200 M Trolox, provenit de la
primul vier notat PIC 1, d dovad de un procent de mobilitate semnificativ mai mare dect cel
al martorului fr adaos. n schimb, la cel de-al doilea vier notat PIC 2, apar diferene ale
mediilor exprimate n cifre, ns sunt nesemnificative din punct de vedere statistic. Totui dup 2
ore de la decongelare, chiar i n cazul vierului PIC 2, diferena ntre martor i 200 M este
foarte semnificativ, media martorului fiind de 15%, iar cea a variantei cu 200 M fiind de 32%,
deci o diferen de 17%, din nou un procent aproape dublu. Diferenele individuale sunt date de
faptul c vierii PIC sunt hibrizi, sunt mult ameliorai i totodat mai puin consolidai. Ne-am
ateptat la apariia acestui gen de diferene, tocmai de aceea am ales hibrizii pentru a efectua o
comparaie ntre ei i rasele autohtone. Concluzia este una ct se poate de simpl. Vitamina E
influeneaz rezultatele crioconservrii dependent de individ, diferenele ntre indivizi fiind tot
mai mari cu ct variabilitatea raselor scade. Aadar, pentru nsmnri artificiale cu sperm
crioconservat, este recomandat folosirea adaosului de Trolox n aceast concentraie. Totodat
este recomandat decongelarea la locul faptei i inocularea ct mai rapid a materialului seminal.
Astfel, spermatozoizii i vor menine mobilitatea ntrun numr mai mare fa de cei
crioconservai clasic i vor crete ansele fecundrii unui numr ct mai ridicat de ovule, cu
aplicaie imediat n obinerea unui numr mai mare de purcei viabili. Per ansamblu, concentraia
de Trolox 200 M aduce un aport benefic mobilitii spermatozoizilor de vier fa de varianta
martor, imediat dup decongelare, dar mai ales n intervalul de o or dou, foarte important
pentru o rat mai ridicat a fecunditii, mai ales dac inocularea materialului seminal se
efectueaz imediat ce paietele au fost decongelate.

Ing. VARO GHIURU Florin

24

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

Faptul c o concentraie mai mic de 200 M Trolox nu conduce la rezultate


semnificative fa de martor, ne face s credem c titrul de antioxidani prezent n mambrana
plasmatic a spermatozoidului nu este suficient. Pe cealalt parte, o concentraie peste 200 M
devine din ce n ce mai nociv pentru celul, cu ct concentraia crete, tocmai de aceea fiind
necesar tatonarea i descoperirea unui titru optim. n literatura de specialitate se ntlnesc studii
care vorbesc despre scderea fluiditii membranelor lipidice n prezena unui titru mare de tocoferol, scderea fluiditii fiind strns corelat cu creterea concentraiei de vitamina E. O
membran cu fluiditate sczut reduce schimburile dintre celul i mediul extern, afectnd astfel
viabilitatea acesteia. Aceasta poate fi explicaia i pentru rezultatele noastre obinute la
concentraii mai mari de 200 M vitamina E. Rezultatele noastre, coroborate cu cele publicate n
alte articole i citate n prezenta tez, indic rolul important pe care l joac -tocoferolul n
crioconservare, prin reducerea leziunilor membranare ce apar datorit producerii excesive de
specii reactive ale oxigenului.
5.2. EFECTUL SUPLIMENTRII CU VITAMINA C A MEDIULUI DE CRIOCONSERVARE
ASUPRA MOBILITII SPERMATOZOIZILOR
5.2.1. Material i metod
Materialul seminal a provenit de la aceiai 6 vieri descrii i prezentai fiecare n parte cu
fotografie n subcapitolul 5.1.1. din tez. Recoltarea materialului spermatic, evaluarea imediat
dup recoltare a acestuia cu privire la volumul fraciunii spermatice, concentraia, determinarea
mobilitii, a procentului de aglutinare,a osmolaritii, pH-ului, aspectelor morfologice,
protocolul de crioconservare i metoda de analiz statistic au fost aceleai ca i cele de la
subcapitolul 4.3.1. menionate anterior n tez. Antioxidantul folosit a fost acidul ascorbic
(vitamina C), produs de Sigma Aldrich, Germania. Acesta a fost adugat, asemenea Trolox-ului,
n mediul de crioconservare a spermei, la 5C (detalii n subcapitolul 5.1.1.). Variantele
experimentale i concentraiile molare de vitamina C aferente lor au fost:
- martor, fr adaos de acid ascorbic
- adaos de acid ascorbic 50 M
- adaos de acid ascorbic 100 M
- adaos de acid ascorbic 200 M
- adaos de acid ascorbic 300 M
- adaos de acid ascorbic 400 M.
Pentru fiecare variant experimental studiat, s-au decongelat cte 3 paiete al cror
coninut a fost amestecat, pentru a evita posibilele diferene de mobilitate de la o paiet la alta.
Au fost recoltate cte 5 ejaculate de la fiecare dintre cei 6 vieri.
5.2.2. Rezultate i discuii
La vierul Bazna 1, ntre varianta martor la 5 minute dup decongelare i C 200 M la
acelai interval, exist o diferen de 5%, la 30 minute diferena crete la 10%, iar la 2 ore
diferena mai scade puin, dar e de 7%. Pentru Bazna 1, rezultatele sunt semnificativ mai bune de
la 30 minute dup decongelare i pn la 2 ore. n cazul vierului Bazna 2 lucrurile stau mai bine,
observnd diferene semnificative n favoarea concentraiei de 200 M fa de martor la oricare
interval de timp. Ca i concluzie, materialul seminal al celor doi vieri Bazna rspunde diferit la
tratamentul cu acid ascorbic, rednd diferene asociate factorului individ. Spermatozoizii
provenii de la vierii Mangalia manifest diferit sensibilitate pentru aportul extern de vitamina
C. Pentru vierul Mangalia 1 exist o mbuntire semnificativ doar la 5 minute dup
decongelare, la comparaia ntre martor i varianta cu aport de 200 M acid ascorbic. La vierul
Ing. VARO GHIURU Florin

25

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

Mangalia 2, pentru aceeai concentraie, diferenele apar de la 30 minute dup decongelare i


sunt tot mai mari cu ct intervalul de timp crete. Observm c diferena procentului de
mobilitate ntre martor i vitamina C 200 M la Mangalia 2 este de 8% la 30 minute de la
decongelare, apoi 26% la o or i 17 % la dou ore. O concentraie mai mare de 300 400 M se
pare c duneaz spermatozoizilor de Mangalia, ns cauza acestui fenomen nu este nc pe
deplin cunoscut sau explicat de ctre specialiti.
60

80

Martor
50 M
100 M
200 M
300 M
400 M

40

20

Martor
50 M
100 M
200 M
300 M
400 M

60
40
20

Vierul Bazna 1 - vitamina C

h
2

h
1

m
in
30

10

m
in

m
in

h
2

h
1

m
in
30

m
in
10

m
in

Vierul Bazna 2 - vitamina C

Graficul 5. Procentul de mobilitate a spermatozoizilor vierilor Bazna, crioconservai n mediu cu


adaos de vitamina C

60

Vierul Mangalita 1 - vitamina C

h
2

in

h
2

30

10

m
5

0
m
in

0
m
in

20

in

20

40

m
in

40

Martor
50 M
100 M
200 M
300 M
400 M

30

60

80

m
in

Martor
50 M
100 M
200 M
300 M
400 M

10

80

Vierul Mangalita 2 - vitamina C

Graficul 6. Procentul de mobilitate a spermatozoizilor vierilor Mangalia, crioconservai n


mediu cu adaos de vitamina C
Aadar, exist o diferen a influenei vitaminei C dat de factorul individ la rasele Bazna
i Mangalia, iar dac privim graficele, se observ c mbuntiri mai mari ale procentelor de
mobilitate apar la vierii cu mobilitatea mai sczut pentru varianta martor. Deci adaosul
vitaminei C este important pentru vierii catalogai n literatura de specialitate cu termenul englez
de low sperm freezability, termen care se traduce ca vieri cu pretabilitate sczut la
crioconservarea materialului seminal. Dac aceti vieri au valoare biologic mare, atunci este
necesar un mediu de crioconservare adecvat, care s permit stocarea materialului lor seminal n
azot lichid n cadrul unor bnci de gene, pentru eventuale utilizri dup perioade ndelungate de
timp: ani, zeci sau sute de ani. De remarcat este c n cazul hibrizilor PIC, vitamina C
influeneaz mobilitatea spermatozoizilor dependent de individ. Aportul cel mai mare l are
asupra spermatozoizilor provenii de la vierul cu cea mai slab mobilitate la varianta fr adaos.
Ing. VARO GHIURU Florin

26

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

Astfel, concentraia de 200 M acid ascorbic n mediul de crioconservare este cea care aduce
mbuntiri semnificative statistic n cazul vierului PIC 1 (cel cu mobilitatea sczut la martor)
i doar n intervalul de 5 minute pn la o or dup decongelare.
60

Martor
50 M
100 M
200 M
300 M
400 M

40

20

80

Martor
50 M
100 M
200 M
300 M
400 M

60
40
20

Vierul PIC 1 - vitamina C

h
2

h
1

m
in
30

m
in
10

in

h
2

h
1

m
in
30

m
in
10

in

Vierul PIC 2 - vitamina C

Graficul 7. Procentul de mobilitate a spermatozoizilor hibrizilor PIC, crioconservai n mediu cu


adaos de vitamina C
Analiznd rezultatele obinute pentru toi cei 6 vieri cuprini n experiment, apreciem c
un supliment de 200 M acid ascorbic n diluantul de congelare a spermei conduce la majorarea
procentului de mobilitate a spermatozoizilor n mod semnificativ dup o or de la decongelare,
adic de la 31% ct prezint martorul, la 43%, deci o diferen de 12%. Dinamica influenei
acestei vitamine nu este constant pentru niciuna dintre rasele pe care a fost studiat, dar varianta
200 M face abstracie i se situeaz ntotdeauna cu rezultatele peste cele ale martorului,
indiferent de ras sau individ. Singurul lucru ce depinde de aceti doi factori amintii este nivelul
cu care concentraia de 200 M vitamina C reuete s mbunteasc mobilitatea
spermatozoizilor dup decongelare.
5.3. EFECTUL SUPLIMENTRII CU AMESTECURI DE VITAMINE C I E A MEDIULUI
DE CRIOCONSERVARE ASUPRA MOBILITII SPERMATOZOIZILOR
5.3.1. Material i metod
Materialul seminal a provenit de la aceiai 6 vieri descrii i prezentai fiecare n parte cu
fotografie n subcapitolul 5.1.1. din tez. Recoltarea materialului spermatic, evaluarea imediat
dup recoltare a acestuia cu privire la volumul fraciunii spermatice, concentraia, determinarea
mobilitii, a procentului de aglutinare, a osmolaritii, pH-ului, aspectelor morfologice,
protocolul de crioconservare i metoda de analiz statistic au fost aceleai ca i cele de la
subcapitolul 4.3.1. menionate anterior n tez. Antioxidanii folosii au fost acidul ascorbic
(vitamina C), produs de Sigma Aldrich, Germania i Trolox (acid 2-carboxilic-6-hidroxi2,5,7,8-tetrametilcroman), Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, SUA, varianta
hidrosolubil a vitaminei E. Antioxidanii sau amestecurile au fost adugate n mediul de
crioconservare a spermei, la 5C (detaliat n subcapitolul 5.1.1.). Variantele experimentale i
concentraiile molare utilizate au fost urmtoarele:
- Martor, fr adaos de antioxidani, pe congelarea clasic, pentru a putea raporta celelalte
rezultate la aceast variant i pentru a observa uor diferenele dac acestea exist;

Ing. VARO GHIURU Florin

27

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

Adaos de vitamina C (acid ascorbic) 200 M pentru c a fost varianta cu cele mai bune
rezultate din studiul axat pe aceast vitamin i pentru a face o paralel ntre rezultatele
obinute n variantele cu amestecuri de antioxidani i aceasta;
- Adaos de vitamina E (Trolox) 200 M pentru c a evideniat cele mai pregnante influene la
capitolul su;
- Amestec de vitamina C 200 M i vitamina E 200 M pentru c reprezint combinaia celor
mai bune variante anterioare;
- Amestec de vitamina C 200 M i vitamina E 400 M, miznd pe o doz dubl de Trolox,
presupunnd c aportul de acid ascorbic nu reuete s regenereze toi radicalii tocoferolului,
o parte din ei angrenndu-se n alte tipuri de reacii;
Pentru fiecare variant experimental studiat, s-au decongelat cte 3 paiete al cror
coninut a fost amestecat, pentru a evita posibilele diferene de mobilitate de la o paiet la alta.
De la fiecare din cei 6 vieri, s-au recoltat cte 5 ejaculate n scopul crioconservrii.
-

5.3.2. Rezultate i discuii


Rezultatele obinute n urma analizei influenei adaosului unui amestec de vitamine C i E
n mediul de crioconservare a materialului seminal de vier la rasele autohtone Bazna i
Mangalia arat c este mai indicat utilizarea celor dou vitamine combinate dect separat. ns
efectul lor asupra procentului de mobilitate a spermatozoizilor este diferit de la o ras la alta i
totodat de la un individ la altul. Acum, n cazul ambilor vieri Bazna, fiecare variant cu adaos
de antioxidant aduce un aport favorabil la procentul de mobilitate al spermatozoizilor. Se
observ c dinamica mobilitii spermatozoizilor este puternic influenat de prezena
vitaminelor. Dac procentul de mobilitate crete treptat de la 5 minute dup decongelare pn la
30 minute i apoi scade n aceeai msur pn la 2 ore pentru martor, la variantele C 200+E 200
sau C 200+E 400 M de la 30 de minute postcongelare scderea este mult mai lent. La timpul
de evaluare de 2 ore varianta cu cea mai sczut mobilitate este martorul, urmat apoi de cea cu
vitamina C 200 M, apoi vitamina E 200 M, apoi amestecul C 200+E 200 M, iar cel mai bun
rezultat l aduce amestecul C 200+E 400 M. La vierul Bazna 1, ambele variante cu amestec de
antioxidani au o influen pozitiv, diferenele fiind foarte semnificative din punct de vedere
statistic fa de martor, pentru care se citete o mobilitate de 29% la 5 minute de la decongelare,
care crete pn la 30 de minute, iar apoi scade, ajungnd la un procent de 16% la dou ore.
Amestecul C 200+E 400 M urc cu aceeai dinamic de la 48%, dar scade foarte uor doar
pn la 41%. Dei n cifre se remarc o diferen ntre cele dou variante cu amestecuri, n
favoarea celui cu 200 M vitamina C i 400 M vitamina E, se observ c aceasta nu este
semnificativ statistic. Vierul Bazna 2 prezint mobilitate crescut la varianta martor fa de
Bazna 1: 38% la 5 minute i 26% la dou ore, fa de 29%, respectiv 16%, iar dinamica
influenei antioxidanilor este diferit n cazul su, relevnd diferene asociate individului.
Oricare dintre variantele cu antioxidani influeneaz pozitiv, conducnd la diferene foarte
semnificative fa de martor pe ntreg parcursul testului de anduran, ns fa de Bazna 1,
fiecare variant crete n aceeai msur procentul de mobilitate n intervalul 5 pn la 30 minute
de la decongelare. De la acest timp de decongelare i pn la 2 ore, doar C 200+E 400 M se
remarc cu o influen semnificativ mai bun fa de restul variantelor, exceptnd C 200+E 200
M, fa de care diferena este nesemnificativ. n linii mari, dinamica mobilitii la acest vier
pentru varianta martor este aceeai ca i la Bazna 1, adic urc treptat de la 5 minute dup
decongelare pn la 30 minute, apoi scade destul de repede ctre 2 ore. ns pentru variantele cu
antioxidani, dinamica este total diferit. Mobilitatea nregistreaz cel mai mare procent la 5

Ing. VARO GHIURU Florin

28

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

minute de la decongelare, se menine la valori aproximativ egale pn la 30 minute, iar apoi


scade foarte lent pn la timpul de evaluare de 2 ore.
Vierul Bazna 1

Vierul Bazna 2
80

Mobilitatea n procente (%)

60

40

20

60

40

20

Intervalul de timp de la decongelare

h
2

h
1

m
in
30

m
in
10

m
in

h
2

h
1

m
in
30

m
in
10

m
in

Mobilitatea n procente (%)

80

Intervalul de timp de la decongelare

Martor

Martor

C 200M

C 200M

E 200M

E 200M

C+E 200+200M

C+E 200+200M

C+E 200+400M

C+E 200+400M

Graficul 8. Procentul de mobilitate a spermatozoizilor provenii de la vierii Bazna, crioconservai


n medii suplimentate cu amestecuri de vitamine C i E
Ambele amestecuri de antioxidani au condus la rezultate foarte bune, fr diferene
semnificative ntre ele, ns pentru faptul c procentele sunt cu 2-4% mai mari la C 200+E 400
M, putem s spunem c amestecul de vitamina C 200 M i vitamina E 400 M a condus la
cele mai bune rezultate obinute la sperma provenit de la vierul Bazna 2, n comparaie cu toate
celelalte variante studiate pn n momentul de fa n aceast tez. Mai concret, amestecul C
200+E 400 M prezint o mobilitate de 60% la 5 minute, crete la 63% la 30 minute, iar apoi
scade la 48% la 2 ore, procent care conduce la o rat acceptabil de fecundare a ovocidelor n
cazul folosirii la nsmnri artificiale. Raportate la martor, diferenele cu care acest amestec de
vitamine mbuntete mobilitatea sunt de 22% la 5 minute, 18% la 30 minute i, cel mai
important, din nou 22% la dou ore de la decongelare. La ambii vieri din rasa Mangalia
amestecul C 200+E 400 M a condus la obinerea celor mai bune rezultate. n cazul acestei rase,
chiar i diferenele ntre cele dou variante cu amestec de antioxidani, determinate la 30 minute
la Mangalia 1 i la 5 minute, respectiv o or la Mangalia 2, sunt asigurate statistic. n cazul
vierului Mangalia 1, martorul, pe congelarea clasic, a condus la obinerea unui procent de 43%
spermatozoizi mobili la 5 minute dup decongelare, care a urcat pn la 49% la 30 minute i apoi
a sczut la 23% la timpul de evaluare de 2 ore. Amestecul C 200+E 400 M a condus la rezultate
mai bune cu o cretere a mobilitii spermatozoizilor de 22% fa de martor la 5 minute, de 20%
la 30 minute i 24% la 2 ore, obinndu-se o mobilitate de 65% la 5 minute, 69% la 30 minute,
respectiv 47% la 2 ore. Pentru vierul Mangalia 2 rezultatele arat astfel: pentru martor 48%
mobilitate la 5 minute, 49% la 30 minute i 12% dup 2 ore. Combinaia de vitamine C 200 M
i E 400 M a prezentat 69% spermatozoizi mobili la 5 minute, 65% la 30 minute i 44% la 2
ore, deci apar diferene de 21%, 16%, respectiv 32% fa de martor la cele trei intervale de timp.
Graficul 9 permite vizualizarea i observarea mai rapid a dinamicii influenei antioxidanilor la
rasa Mangalia, o dinamic asemntoare pentru cei doi vieri. Oricare dintre variantele analizate
a contribuit mai mult sau mai puin la mbuntirea procentului de mobilitate n comparaie cu
martorul, ns amestecul C+E 200+400 M are i n cazul vierilor Mangalia o dinamic diferit

Ing. VARO GHIURU Florin

29

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

fa de cea a martorului, n sensul c mobilitatea spermatozoizilor scade mult mai lent cu ct


timpul de la decongelare crete, tradus printro protecie sporit asupra viabilitii lor.
Vierul Mangalita 2

Vierul Mangalita 1
80

Mobilitatea n procente (%)

60

40

20

60

40

20

h
2

h
1

in
30

in
m
10

h
2

h
1

m
in
30

m
in
10

m
in
5

Intervalul de timp de la decongelare

in

Mobilitatea n procente (%)

80

Intervalul de timp de la decongelare

Martor

Martor

C 200M

C 200M

E 200M

E 200M

C+E 200+200M

C+E 200+200M

C+E 200+400M

C+E 200+400M

Graficul 9. Procentul de mobilitate a spermatozoizilor provenii de la vierii Mangalia,


crioconservai n medii suplimentate cu amestecuri de vitamine C i E
Pentru rasa Mangalia, nici de data aceasta nu apar diferene ale influenei amestecurilor
de antioxidani atribuite individului ca factor, suplimentarea mediului cu cele dou vitamine fiind
benefic n cazul ambilor vieri. Mai mult, pentru Mangalia 2, care are o pretabilitate mai sczut
la crioconservare, argumentat de procentul mic de mobilitate a martorului la 2 ore de la
decongelare, influena amestecului C 200+E 400 M este mult mai pregnant de la timpul de
evaluare de 30 minute i pn la 2 ore, fa de Mangalia 1. i asupra materialului seminal
provenit de la hibrizii PIC, influena cea mai mare a avut-o amestecul C 200+E 400 M, cu
diferene foarte semnificative pe tot parcursul testului de anduran la vierul PIC 1 i diferene
foarte semnificative doar la intervalul de 2 ore la vierul PIC 2. Pentru PIC 1, C 200+E 400 M a
adus un aport de aproximativ 27% fa de martor pe toat durata testului de anduran, adic de
la 5 minute pn la 2 ore de la decongelarea materialului seminal crioconservat. Martorul a avut
39% la 5 minute, 40% la 30 minute i 12% la dou ore. Amestecul a avut 66%, 67%, respectiv
38%, reprezentnd un salt spectaculos de la un procent ineficient la unul satisfctor atunci cnd
este vorba de I.A. cu sperm crioconservat de vier. Pentru PIC 2, vitamina C nu are nicio
influen asupra mobilitii spermatozoizilor, lucru cunoscut deja din subcapitolul anterior. Pn
la intervalul de 30 de minute de la decongelare, rezultatele tuturor variantelor sunt asemntoare,
fr diferene statistice, ns la timpul de evaluare de o or, variantele cu amestec de antioxidani
conduc la obinerea unor procente mai ridicate de mobilitate, asigurate statistic. La 2 ore, toate
cele trei variante ce conin vitamina E, adic E 200 M, C 200+E 200 M i C 200+ E 400 M
prezint diferene foarte semnificative att fa de martor, ct i de C 200 M, ns ntre ele nu
exist diferene statistice, ceea ce nseamn c n cazul acestui individ doar prezena vitaminei E
n mediul de crioconservare este suficient. Dac ne referim strict la timpul de evaluare de 2 ore
la PIC 2, este important de remarcat diferena de mobilitate ntre martor i C 200 + E 400 M.
Martorul are o mobilitate de 12%, iar amestecul de vitamine menionat are 32%, deci o diferen
de 20%, mai mic ntr-adevr dect la PIC 1, ns absolut necesar nsmnrilor artificiale cu
material seminal crioconservat. Hibrizii de carne PIC dau dovad i de aceast dat de o mare

Ing. VARO GHIURU Florin

30

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

variabilitate ntre indivizi, dinamica influenei amestecurilor de antioxidani fiind i de data


aceasta foarte diferit pentru cei doi vieri.
Vierul PIC 2

Vierul PIC 1
80

Mobilitatea n procente (%)

60

40

20

60

40

20

Intervalul de timp de la decongelare

h
2

h
1

in
30

in
m
10

h
2

h
1

in
m
30

10

in

in
m
5

in

Mobilitatea n procente (%)

80

Intervalul de timp de la decongelare

Martor

Martor

C 200M

C 200M

E 200M

E 200M

C+E 200+200M

C+E 200+200M

C+E 200+400M

C+E 200+400M

Graficul 10. Procentul de mobilitate a spermatozoizilor provenii de la hibrizii PIC,


crioconservai n medii suplimentate cu amestecuri de vitamine C i E
innd cont c cei doi antioxidani acioneaz n arii diferite ale celulei, pe ci diferite i
n concentraii optime diferite, nu este deloc surprinztor de ce rezultate mai bune au fost
obinute prin amestecarea lor. Aadar combinaia acestora are n cele mai multe cazuri un efect
antioxidant mai pronunat dect fiecare n parte, aa cum au concluzionat i Azzi i colaboratorii
si n 2003, acelai rezultat nregistrndu-l i Dalvit i colaboratorii n 2005, dar pe ovocite.
Rezultatele mai bune obinute prin folosirea amestecului C 200+E 400 M fa de cele ale
combinaiei C 200+E 200 M pot argumenta c vitamina C nu reuete s regenereze toi
radicalii vitaminei E, unii dintre ei implicndu-se n alte reacii i fiind insuficieni n
concentraie 200 M. Importana adaosului amestecului C 200+E 400 M n mediul de
crioconservare pe baz de lactoz, glbenu de ou, glicerol i Orvus es paste, se vede cel mai
bine la 2 ore de la decongelare, interval de timp la care variantele martor ale tuturor vierilor au
procente foarte sczute. Acest amestec reuete s ridice chiar mai mult dect dublu procentul de
mobilitate a spermatozoizilor, iar aceast rezisten n timp duce la obinerea unor rate ale
fertilitii mai mari, satisfctoare. Studiind mobilitatea spermatozoizilor la microscop, s-a
observat c spermatozoizii de vier aparinnd rasei Mangalia au o micare mai energic n
mediile cu antioxidani dup decongelare (Varo Ghiuru, 2010).
5.4. EFECTUL SUPLIMENTRII CU LUTEIN A MEDIULUI DE CRIOCONSERVARE
ASUPRA MOBILITII SPERMATOZOIZILOR
5.4.1. Material i metod
Materialul seminal a provenit de la aceiai 6 vieri descrii i prezentai fiecare n parte cu
fotografie n subcapitolul 5.1.1. din tez. Recoltarea materialului spermatic, evaluarea imediat
dup recoltare a acestuia cu privire la volumul fraciunii spermatice, concentraia, determinarea
mobilitii, a procentului de aglutinare, a osmolaritii, pH-ului, aspectelor morfologice,
protocolul de crioconservare i metoda de analiz statistic au fost aceleai ca i cele de la
subcapitolul 4.3.1. menionate anterior n tez. Antioxidantul folosit a fost luteina, adugat n
mediul de crioconservare a spermei de vier, imediat dup diluia cu diluantul LEYGO, la 5C.
Ing. VARO GHIURU Florin

31

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

Variantele experimentale cu concentraiile molare utilizate sunt:


- martor, fr adaos de lutein
- adaos de lutein 5 M
- adaos de lutein 10 M
- adaos de lutein 20 M
- adaos de lutein 40 M
Pentru fiecare variant experimental studiat, s-au decongelat cte 5 paiete provenite de
la fiecare vier n parte, fiecare paiet fiind analizat pentru a stabilii mobilitatea, apoi s-a fcut
media. De la fiecare vier au fost recoltate cte 5 ejaculate.
5.4.2. Rezultate i discuii
Rezultatele noastre privind determinarea influenei adaosului de lutein n mediul de
crioconservare pe baz de lactoz, glbenu de ou, glicerol i Orvus es Paste arat o sporire
benefic a procentului de spermatozoizi de vier mobili dup decongelare pentru toate
concentraiile testate fa de varianta martor, att la rasele autohtone Bazna i Mangalia, ct i la
hibrizii de carne PIC, ns creterea se dovedete a avea urmtoarele particulariti:
Mai mare la varianta cu o concentraie de 5 M comparativ martorului.
Mai mare la varianta de 10 M dect la 5 M. Aceasta este clasat ca cea mai bun
variant, cu procentul maxim de mobilitate a spermatozoizilor.
Mai mic la varianta 20 M dect la 10 M, dar mai mare dect variantele cu 5 M sau
40 M
Mai mic la varianta 40 M dect la 10 M i 20 M, dar mai mare dect la 5 M, sau
la varianta martor.
Oferind aceast dinamic constant, luteina pare a fi antioxidantul cel mai indicat de pn
acum, deoarece indiferent de ras sau de individ, efectul se manifest n aceeai msur, fapt
observat din primele noastre analize, motiv pentru care rezultatele sunt prezentate mpreun pe
rase i nu pe individ.
70
60
50
40
30
20
10
0
5 min

10 min

30 min

1h

2h

Martor

Luteina 5 M

Luteina 10 M

Luteina 20 M

Luteina 40 M

Graficul 11. Influena diferitelor concentraii de lutein asupra procentului de mobilitate a


spermatozoizilor de vier
Aceste rezultate contureaz ideea c luteina este un antioxidant foarte puternic ce
conduce doar prin folosirea sa n concentraia optim de 10 M la obinerea unor procente ale
mobilitii spermatozoizilor de vier crioconservai i decongelai asemntoare cu cele obinute
prin adaosul amestecului de vitamine C 200 M i E 400 M. Totodat se poate spune c o
Ing. VARO GHIURU Florin

32

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

concentraie mai mare de 10 M este deja prea mult pentru a conferi efectul maxim de protecie.
Cauza nu se poate explica datorit puinelor date disponibile.
5.5. EFECTUL SUPLIMENTRII CU AMESTEC DE VITAMINE C I E I LUTEIN A
MEDIULUI DE CRIOCONSERVARE ASUPRA MOBILITII SPERMATOZOIZILOR
5.5.1. Material i metod
Materialul seminal a provenit de la aceiai 6 vieri descrii i prezentai fiecare n parte cu
fotografie n subcapitolul 5.1.1. din tez. Recoltarea materialului spermatic, evaluarea imediat
dup recoltare a acestuia cu privire la volumul fraciunii spermatice, concentraia, determinarea
mobilitii, a procentului de aglutinare, a osmolaritii, pH-ului, aspectelor morfologice,
protocolul de crioconservare i metoda de analiz statistic au fost aceleai ca i cele de la
subcapitolul 4.3.1. menionate anterior n tez. Antioxidanii folosii pe perioada cercetrilor au
fost: acidul ascorbic (vitamina C), -tocoferolul (vitamina E) varianta hidrosolubil Trolox i
luteina, procurai de la SIGMA Aldrich, Germania. Antioxidanii au fost adugai n mediul de
crioconservare a spermei, dup etapa de diluie cu LEYGO, la 5C. Variantele experimentale
pentru acest set de experimente sunt:
Martor congelarea clasic, fr adaos de antioxidani
Adaos de lutein n concentraie de 10 M
Adaos de vitamina C 200 M i E 400 M
Adaos de vitamina C 200 M, E 400 M i lutein 10 M
5.5.2. Rezultate i discuii
Cele mai bune valori se ntlnesc la C 200 M + E 400 M i la adaosul de lutein 10
M, procentele fiind asemntoare, cu diferene nesemnificative din punct de vedere statistic.
Surprinztor este c rezultatele amestecului alctuit din vitamina C n concentraie 200 M,
vitamina E 400 M i lutein 10 M aduc un spor al procentului de mobilitate al
spermatozoizilor de vier crioconservai mai mic dect n cazul luteinei 10 M studiat separat,
sau al amestecului format doar din vitamina C 200M i E 400M n cazul tuturor vierilor de la
care s-a recoltat sperma.
Tabelul 4.
Procentul de mobilitate a spermatozoizilor provenii de la vierii Bazna, crioconservai
n mediu cu amestecuri de antioxidani
Vierii Bazna (MediaESM)
Timp de evaluare
5 min
10 min
30 min
1h
2h
311.87
332.55
392.44
322.00
261.87
Martor (M)
461.00a 482.00a 551.58a
501.58a
431.22a
Lutein 10 M (L10)
450.00a 491.00a 550.00a 491.00a,b 441.00a
C 200+E 400 M (C200+E400)
421.22b
350.00b
C 200+E 400+Lutein 10 M (C200+E400+L10) 421.22a 451.58a 491.87a
*Diferenele pe coloan dintre oricare variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative
Varianta

La Bazna rezultatele obinute la varianta C 200 M + E 400 M sunt mai bune dect la C
200 M + E 400 M + lutein 10 M, la un interval de dou ore de la decongelarea materialului
seminal, diferenele fiind distinct semnificative din punct de vedere statistic. Luteina 10 M are
de asemenea valori semnificativ mai bune fa de amestecul celor trei antioxidani, nc de la o
or de echilibrare. La Mangalia amestecul C 200 M + E 400 M este semnificativ mai bun de
la 30 de minute postcongelare fa de C 200 M + E 400 M + lutein 10 M i la fel i luteina
10 M, de la o or.

Ing. VARO GHIURU Florin

33

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

Tabelul 5.
Procentul de mobilitate a spermatozoizilor provenii de la vierii Mangalia, crioconservai
n mediu cu amestecuri de antioxidani
Vierii Mangalia (MediaESM)
Timp de evaluare
5 min
10 min
30 min
1h
2h
291.87
311.87
361.87
292.44
222.00
Martor (M)
441.00a 471.22a 531.22a,b 491.00a 421.22a
Lutein 10 M (L10)
451.58a 481.22a
572.00b
491.00a 431.22a
C 200+E 400 M (C200+E400)
482.55a
411.87b 341.00b
C 200+E 400+Lutein 10 M (C200+E400+L10) 411.87a 442.44a
*Diferenele pe coloan dintre oricare variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative
Varianta

i pentru vierii PIC lucrurile stau la fel, n acest caz att adaosul de vitamine C 200 M +
E 400 M ct i luteina 10 M nregistrnd valori semnificativ superioare amestecului C 200 M
+ E 400 M + lutein 10 M.
Tabelul 6.
Procentul de mobilitate a spermatozoizilor provenii de la vierii PIC, crioconservai
n mediu cu amestecuri de antioxidani
Vierii PIC (MediaESM)
Timp de evaluare
5 min
10 min
30 min
1h
2h
291.87
302.23
361.87
273.00
183.00
Martor (M)
441.00a 471.22a 531.22a 481.22a 431.22a
Lutein 10 M (L10)
461.00a 471.22a 531.22a 471.22a 431.22a
C 200+E 400 M (C200+E400)
C 200+E 400+Lutein 10 M (C200+E400+L10) 402.23a 412.44a 452.23a 402.23a 341.00b
*Diferenele pe coloan dintre oricare variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative
Varianta

Este posibil ca cei trei antioxidani adugai mpreun n concentraiile amintite anterior
s depeasc cantitatea optim, devenind uor toxici prin reacii pro-oxidante pentru materialul
seminal de vier. Chiar dac rezultatele nregistrate pentru cele 2 variante, lutein 10 M,
respectiv C 200 M + E 400 M, nu prezint diferene asigurate statistic, ntre ele exist o
diferen, aceea c luteina 10 M are o dinamic uniform i independent de factori precum
rasa sau individul, ceea ce ne face s spunem c mediul pe baz de lactoz, glbenu de ou,
glicerol i Orvus es paste, suplimentat cu 10 M lutein, pe care noi l-am preparat pentru prima
dat la nivel mondial, reprezint mediul universal cel mai potrivit pentru crioconservarea
materialului seminal de vier, cu importan major n viitorul nsmnrilor artificiale la suine,
att n Romnia, ct i n strintate.
5.6. DETERMINAREA INTEGRITII FUNCIONALE A SPERMATOZOIZILOR DE
VIER CRIOCONSERVAI
5.6.1. Material i metod
Materialul seminal a provenit de la aceiai 6 vieri descrii i prezentai fiecare n parte cu
fotografie n subcapitolul 5.1.1. din tez. Recoltarea materialului spermatic, evaluarea imediat
dup recoltare a acestuia cu privire la volumul fraciunii spermatice, concentraia, determinarea
mobilitii, a procentului de aglutinare, a osmolaritii, pH-ului, aspectelor morfologice,
protocolul de crioconservare i metoda de analiz statistic au fost aceleai ca i cele de la
subcapitolul 4.3.1. menionate anterior n tez. Antioxidanii folosii pe perioada cercetrilor au
fost: acidul ascorbic (vitamina C), -tocoferolul (vitamina E) varianta hidrosolubil Trolox i
luteina, procurai de la SIGMA Aldrich, Germania. Antioxidanii au fost adugai n mediul de
crioconservare a spermei, imediat dup diluia cu LEYGO, la 5C. Pentru determinarea
integritii funcionale a fost utilizat testul HOST (Hypo Osmotic Swelling Test). Acestui tip de
Ing. VARO GHIURU Florin

34

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

examinare au fost supuse doar variantele experimentale care au evideniat rezultate bune pentru
testul mobilitii spermatozoizilor dup decongelare i anume:
Martor (fr adaos)
C 200 M, E 200 M,
C 200+E 200 M, C 200+E 400 M,
Lut 5 M, Lut 10 M, Lut 20 M, Lut 40 M,
C 200+E 400+Lut 10 M.
5.6.2. Rezultate i discuii
Rezultatele cercetrilor noastre privind rspunsul HOST al spermei de vier crioconservate
evideniaz efectul benefic al adaosului de antioxidani n mediul pe baz de lactoz i glbenu
de ou. n varianta martor, n care nu s-a folosit niciun antioxidant, s-a ntlnit numrul cel mai
mic de celule spermatice cu rspuns HOST pozitiv, adic cu membran integr i funcional, i
anume 14,67%.
Tabelul 7.
Procente de spermatozoizi crioconservai HOST pozitivi
Rasa
MediaSD
Bazna Mangalia
PIC
14 a
15 a
15 a
Martor
14,67 0,58 a,d
17 a
16 a
21 a,b
C 200
18 2,65 c,d,g
18 a
16 a
23 a,b
E 200
19 3,61 d,e
25 a
17 a
29,5 a,b
C 200+E 200
23,83 6,33 d,h
28 a
19 a
35,5 b
C 200+E 400
27,5 8,26 b,e,h
17 a
18 a
18,5 a,c
L5
17,83 0,76 a,d,i
27 a
21 a
34,5 b
L 10
27,5 6,76 b,e,f,h
25 a
15,5 a
26 a,b
L 20
22,17 5,80 a,d,f,h
23 a
14 a
26 a,b
L 40
21 6,24 a,d,f,h
28 a
18 a
34 b,c
C 200+E 400+L 10
26,67 8,08 b,e,f,g,h,i
*Diferenele pe coloan dintre oricare variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative
Varianta

Variantele pentru care s-au nregistrat cele mai bune rspunsuri HOST, adic cei mai
muli spermatozoizi funcionali, sunt aceleai ca i cele care au evideniat cele mai bune procente
ale mobilitii spermei dup decongelare, fapt ce coreleaz aceste dou teste. Aadar, dac ntre
varianta amestecului de vitamina C 200 M i E 400 M i cea cu adaos de lutein n
concentraie 10 M nu sunt diferene semnificative din prisma procentului de mobilitate, acelai
lucru se poate spune i n cazul testului hipoosmotic, unde ambele variante au obinut un procent
egal de 27,5% spermatozoizi HOST pozitivi, mult mai ridicat dect al martorului, 14,67%.
Studiind i factorul ras, se poate spune c la congelarea clasic, procentul HOST este
aproximativ acelai att la hibrizii PIC ct i la Bazna i Mangalia. ns efectul benefic al
adaosului de antioxidani este evident mai pronunat la PIC, urmnd n ordine descresctoare
Bazna, apoi Mangalia. La vierii PIC mbuntirile aduse de ctre cele mai bune variante fa de
martor au valori cu 20,5% mai mult n cazul amestecului C 200+E 400 M i 19,5% n cazul
luteinei 10 M, la Bazna cu 14%, respectiv 13%, iar la Mangalia cu 4%, respectiv 6%. O
explicaie a acestui fapt este c o ras mai rustic, aa cum este Mangalia, nu prezint o
sensibilitate la fel de mare ca i rasele ameliorate sau hibrizii de carne, ca n cazul PIC. Corelnd
evaluarea mobilitii cu evaluarea integritii membranare HOST, variantele optime sunt
amestecul de vitamine C 200+E 400 M i adaosul de lutein n concentraie 10 M, care
conduc la aceleai rezultate n ambele cazuri. Datorit rezultatelor semnificativ mai slabe
obinute pentru varianta amestecului C+E+lutein din punct de vedere al mobilitii, aceasta nu

Ing. VARO GHIURU Florin

35

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

poate fi considerat o variant optim, dei testul HOST nu arat diferene semnificative ntre
aceasta i celelalte dou variante catalogate anterior.
5.7. DETERMINAREA ANOMALIILOR MORFOLOGICE ALE SPERMATOZOIZILOR DE
VIER CRIOCONSERVAI
5.7.1. Material i metod
Materialul seminal a provenit de la aceiai 6 vieri descrii i prezentai fiecare n parte cu
fotografie n subcapitolul 5.1.1. din tez. Recoltarea materialului spermatic, evaluarea imediat
dup recoltare a acestuia cu privire la volumul fraciunii spermatice, concentraia, determinarea
mobilitii, a procentului de aglutinare, a osmolaritii, pH-ului, aspectelor morfologice,
protocolul de crioconservare i metoda de analiz statistic au fost aceleai ca i cele de la
subcapitolul 4.3.1. menionate anterior n tez. Antioxidanii folosii pe perioada cercetrilor au
fost: acidul ascorbic (vitamina C), -tocoferolul (vitamina E) varianta hidrosolubil Trolox i
luteina, procurai de la SIGMA Aldrich, Germania. Pentru determinarea anomaliilor spermatice
i acrozomiale s-a apelat la metoda Hancock. Variantele studiate au fost aceleai ca i n cazul
determinrii integritii funcionale a spermatozoizilor prin HOST:
Martor (fr adaos)
C 200 M, E 200 M,
C 200+E 200 M, C 200+E 400 M,
Lut 5 M, Lut 10 M, Lut 20 M, Lut 40 M,
C 200+E 400+Lut 10 M.
5.7.2. Rezultate i discuii
n experimentele desfurate pentru a analiza sperma crioconservat din punct de vedere
al aspectelor morfologice, variantele cu adaos de antioxidani n mediul pe baz de lactoz i
glbenu de ou aduc o mbuntire i la acest capitol. Ca rezultat se remarc o cretere a
procentului de mobilitate a spermatozoizilor decongelai, iar funcionalitatea acestora este mult
mbuntit. Variantele experimentale cu valori optime sunt amestecul de vitamine C 200+E
400 M, cu procente ale anomaliilor acrozomale de 21,5% la Bazna i 21% la Mangalia i PIC,
i cea cu adaos de lutein 10 M, cu valori de 21,25% la Bazna, 21,5% la Mangalia i 14,25% la
PIC, rezultate foarte bune n comparaie cu martorul de 33% Bazna, 34% Mangalia i 31% la
PIC. Aadar, influena cea mai mare se observ la hibrizii de carne, cu o diferen de 10%,
respectiv 16,75% pentru variantele optime, urmai de Mangalia cu 13%, respectiv 12,5%, apoi
de Bazna cu diferene de 11,5% i 11,75%.
Tabelul 8.
Rezultatele obinute n urma aplicrii testului Hancock la sperma crioconservat
Total anomalii %
Rasa Bazna
Rasa Mangalia
Hibrizii PIC

Martor

C 200

E 200

57
43
55

35
33,5
35

31,75
31
29,5

Ing. VARO GHIURU Florin

C 200
+
E 200
35
35
33

C 200
+
E 400
28,75
32
28

L5

L 10

L 20

L 40

31,25
36
31,25

26,25
27
26,25

29,75
31.75
28,25

31,75
32,75
31,75

C 200+
E 400+
L 10
30,75
31,5
40,5

36

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

Tabelul 9.
Variantele cu diferene statistice evideniate n urma aplicrii testului Hancock la sperma
crioconservat
Varianta
Martor vs. C 200

Gradul de semnificaie
Bazna Mangalia PIC
***
ns
*

Martor vs. E 200

***

ns

Martor vs. C 200+E 200

***

ns

***
**

Martor vs. C 200+E 400

****

****

***

Martor vs. L 5

****

ns

**

Martor vs. L 10

****

****

****

Martor vs. L 20

****

****

***

Martor vs. L 40

***

****

**

ns

ns

Martor vs. C 200+E 400+L 10 ****

Deci, vorbind din nou de factorul ras, se remarc rusticitatea Mangaliei, dar i a Baznei
i totodat sensibilitatea materialului seminal provenit de la hibrizii de carne, mult ameliorai.
Corelnd toate trei testele, cel al mobilitii, cel al integritii membranare HOST i cel al
identificrii procentului i tipurilor de anomalii prezente, Hancock, rezult c variantele pentru
crioconservarea materialului seminal de vier rmn amestecarea i adugarea de acid ascorbic
200 M i -tocoferol Trolox 400 M n mediul pe baz de lactoz i glbenu de ou i de
asemenea adaosul de lutein 10 M n acelai tip de mediu, deoarece conduc la obinerea de
rezultate optime, fr diferene semnificative ntre ele. Din cercetrile efectuate se observ c
antioxidanii acioneaz protectiv ndeosebi asupra uneia dintre categoriile de anomalii
acrozomale i anume acrozomul n detaare, care apare cu cea mai mare frecven la martor.
Celelalte tipuri de anomalii ale celulelor spermatice nu vor fi discutate, deoarece ele nu in de
procesul de crioconservare n sine, ci mai mult de spermatogenez. Pentru exemplificare, vor fi
prezentate mai jos imagini surprinse cu ajutorul unei camere digitale conectat la microscop.
Aceste fotografii surprind spermatozoizi cu diferite anomalii acrozomale, incapabili de a efectua
procesul de fecundare, dei sunt mobili.
5.8. DETERMINAREA INDICELUI DE FRAGMENTARE A ADN-ULUI
SPERMATOZOIZILOR DE VIER CRIOCONSERVAI
5.8.1. Material i metod
Materialul seminal a provenit de la 2 vieri din rasa Bazna i 2 vieri din rasa Mangalia,
descrii i prezentai fiecare n parte cu fotografie n subcapitolul 5.1.1. din tez. Recoltarea
materialului spermatic, evaluarea imediat dup recoltare a acestuia cu privire la volumul
fraciunii spermatice, concentraia, determinarea mobilitii, a procentului de aglutinare, a
osmolaritii, pH-ului, aspectelor morfologice, protocolul de crioconservare i metoda de
analiz statistic au fost aceleai ca i cele de la subcapitolul 4.3.1. menionate anterior n tez.
Antioxidanii folosii au fost: acidul ascorbic (vitamina C), -tocoferolul (vitamina E) varianta
hidrosolubil Trolox i luteina, procurai de la SIGMA Aldrich, Germania. Determinarea
indicelui de fragmentare a ADN-ului (DIF) s-a efectuat cu ajutorul unui kit de colorare SpermSus-Halomax de la Halotech DNA (ChromaCell SL, Madrid, Spania) cu urmtorul coninut: 25
lame pretratate, 25 flacoane cu agaroz cu topire lent, un flacon 200 ml soluie de liz pe baz
de -mercaptoetanol, cu care se lucreaz n hot sau ni, i dou flacoane cu colorani A i B.
Materiale necesare neincluse n kit au fost: microscop optic, frigider la 4C, baie de ap la 37C,
mnui de latex, lamele, micropipete, recipient de plastic pentru incubri orizontale, ap distilat,
Ing. VARO GHIURU Florin

37

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

etanol 70%, 90% i 100%. Datorit existenei rezultatelor din studiile anterioare, mai ales ale
celor obinute n urma determinrii anomaliilor spermatice prin metoda Hancock, care au
concretizat deja variantele pozitive cu adaos de antioxidani n diluantul pentru congelare a
spermei de vier, la realizarea studiului actual s-au urmrit doar aceste variante i anume:
- martorul (fr adaos de antioxidant)
- Trolox (vitamina E) 200M
- amestecul de vitamine C 200+E 400 M
- lutein 10 M
5.8.2. Rezultate i discuii
Kitul de colorare Sperm-Sus-Halomax, descris la material i metod, are ca fundament
protocolul SCD (Sperm Chromatin Dispersion) ce se bazeaz pe rspunsul difereniat al
nucleilor spermatozoizilor de vier, fragmentai sau nefragmentai, n momentul n care sunt
supui unui tratament de deproteinizare. Extracia proteinelor nucleare din spermatozoizii cu
ADN fragmentat elibereaz fragmentele de ADN, iar cromatina este dispersat de jur mprejur,
formnd un halou periferic colorat. Cu ct indicele de fragmentare al ADN-ului este mai mare
(grad 2 sau 3), cu att haloul este mai mare. Dac nu exist ADN fragmentat, haloul este mic sau
inexistent. Un spermatozoid fr halou (grad de fragmentare 0 sau 1) este un spermatozoid cu
ADN integru, nefragmentat, capabil de fertilizare.
Tabelul 10.
Valorile indicelui de fragmentare a ADN-ului spermatic, exprimate n procente
MediaSD
Martor
E 200
C 200+E 400
L 10
Bazna
20,251,75a 16,631,51a,c
141,85b,c
13,881,55b,c
Mangalia 20,373,62a 18,624,47a,c 14,123,22b,c 13,753,49b,c
*Diferenele pe linie dintre oricare variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative
Rasa

Att n cazul rasei Bazna, ct i la Mangalia, variantele cu aport de antioxidani reduc


frecvena apariiei ADN-ului fragmentat n urma crioconservrii i decongelrii materialului
seminal de vier. Rezultate semnificativ mai bune fa de martorul obinut prin congelare clasic,
fr adaos de antioxidani, pentru ambele rase, apar ns doar atunci cnd se adaug un amestec
de vitamine C 200+E 400 M, sau cnd este adugat lutein n concentraie 10 M, ntre aceste
dou variante nu exist diferene statistice. Rezultatele prezentate, corelate cu cele obinute
anterior, demonstreaz c antioxidanii adugai n diluantul de congelare a spermei de vier au o
aciune benefic nu doar asupra mobilitii progresive, ci i a integritii membranare, a
frecvenei apariiei anomaliilor spermatice i a indicelui de fragmentare a ADN-ului.
5.9. CONCLUZII PARIALE

Concentraia de 200 M vitamina E, preparatul hidrosolubil Trolox, adugat n mediul


de crioconservare pe baz de lactoz a spermei asigur procente de mobilitate ridicat a
spermatozoizilor independent de intervalul de analiz post congelare.

Aciunea vitaminei E asupra mobilitii spermatozoizilor crioconservai este dependent


de ras i individ. Rasele Bazna i Mangalia rspund mai intens la aciunea vitaminei E prin
creterea procentului de spermatozoizi mobili dup decongelare.

Durata de pstrare a mobilitii spermatozoizilor crioconservai la valorile impuse de


utilizarea spermei pentru inoculare este mai mare n cazul adaosului de vitamina E. La rasele
Mangalia i Bazna, procentele de mobilitate a spermatozoizilor sunt mai ridicate comparativ
hibrizilor PIC, independent de momentul controlului.
Ing. VARO GHIURU Florin

38

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

Concentraia de 200 M vitamina C adugat n mediul de crioconservare pe baz de


lactoz a spermei asigur procente de mobilitate ridicat a spermatozoizilor independent de
intervalul de analiz post congelare.

Aportul de vitamina C are un efect benefic mai pregnant independent de ras asupra
spermatozoizilor cu mobilitate mai sczut dup decongelare.

Acidul ascorbic mbuntete mobilitatea spermatozoizilor provenii de la vierii Bazna i


Mangalia comparativ celor recoltai de la vierii PIC.

Dinamica mobilitii spermatozoizilor postcongelare prezint un vrf la dou ore dup


care se manifest efectul vitaminei C prin prelungirea viabilitii cu procente de interes pentru
practica nsmnrilor artificiale.

Adaosul unui amestec de vitamine C 200 M + E 400 M n mediul de crioconservare, n


cazul raselor Bazna i Mangalia, influeneaz pozitiv mobilitatea spermatozoizilor, ns la valori
mai ridicate comparativ situaiei cnd sunt utilizate separat cele dou vitamine.

Concentraia de 10 M lutein n mediul de crioconservare a spermei de vier determin


cele mai ridicate procente de mobilitate a spermatozoizilor crioconservai, la valori aproximativ
egale cu cele ale amestecului de vitamine C 200 M + E 400 M.

Luteina este singurul antioxidant, dintre cei 3 studiai, cu aceeai influen pozitiv
asupra materialului spermatic crioconservat, independent de ras sau individ.

Luteina 10 M poteneaz efectul antioxidant a vitaminelor C i E, determinnd


prelungirea duratei de utilizare a spermatozoizilor de vier dup decongelare, independent de
individ i rasa de la care acetia provin.

Membranele spermatozoizilor i pstreaz integritatea n urma congelrii la procente mai


ridicate dac s-a realizat suplimentarea mediului de congelare cu antioxidani.

Amestecul de vitamine C 200 M + E 400 M sau varianta lutein 10 M adugate


separat n mediul de crioconservare a materialului seminal de vier provenit de la Bazna i
Mangalia conduce la obinerea celor mai bune procente de spermatozoizi cu integritate
membranar, fr ca diferenele s fie asigurate statistic.

Anomaliile acrozomale au o frecven mai sczut, independent de ras, dac se face


suplimentarea mediului de congelare cu antioxidani.

Variantele C 200 M + E 400 M i lutein 10 M asigur procentele cele mai mici de


spermatozoizi cu anomalii morfologice dup decongelare.

Amestecul de vitamine C 200 M + E 400 M sau varianta lutein 10 M adugate


separat n mediul de crioconservare conduce la obinerea celor mai mici procente de
spermatozoizi cu ADN-ul fragmentat, fr diferene asigurate statistic, independent de ras.
CAPITOLUL VI
CONCLUZII FINALE
Rezultatele obinute la finalul acestor experimente au generat urmtoarele concluzii
finale:
1.
Comportamentul sexual al vierilor din rasele locale sau hibrizii de carne avui n studiu
este criteriul definitoriu pentru reinerea indivizilor n scopul antrenamentului n vederea
recoltrii materialului spermatic.
2.
Spre deosebire de vierii Bazna, cei din rasa Mangalia manifest un comportament sexual
capricios, fiind mai greu de lucrat cu ei, aadar se recomand tratarea lor cu mai mult atenie i
rbdare.

Ing. VARO GHIURU Florin

39

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

3.
ntocmirea spermogramei uzuale imediat dup recoltarea materialului seminal este
necesar deoarece reprezint cel de-al doilea criteriu important pentru admiterea vierilor i
ejaculatelor la recoltare i respectiv prelucrare n vederea crioconservrii.
4.
Diluantul pentru stocare de scurt durat preparat de noi nu are influen negativ asupra
crioconservrii materialului seminal provenit de la hibrizii PIC i rasele Bazna i Mangalia, dar
este mai ieftin.
5.
Diluanii LEY i LEYGO dau rezultate superioare diluanilor pe baz de fructoz n
crioconservarea spermei de vier, independent de materialul biologic utilizat.
6.
mpaietarea n paiete de 0,25 ml sau 0,5 ml nu influeneaz rezultatele crioconservrii.
7.
Sigilarea paietelor cu dopuri de polivinil alcool este metoda preferat datorit rezultatelor
bune privind pstrarea mobilitii spermatozoizilor i a numrului mai mare de paiete integre
dup decongelare, n raport cu metoda bilelor metalice.
8.
Aciunea antioxidanilor adugai n mediul de crioconservare determin creterea
procentului de spermatozoizi mobili, protejeaz membranele, reduce anomaliile acrozomale i
morfologice, dup decongelare.
9.
Durata de pstrare a calitii spermatozoizilor crioconservai la valori impuse de utilizarea
spermei pentru inoculare este mai mare n cazul adaosului de antioxidani. La rasele Mangalia i
Bazna, acest efect al antioxidanilor este mai ridicat comparativ hibrizilor PIC, independent de
momentul controlului.
10.
Aciunea antioxidanilor este mai pregnant, independent de ras, n cazul
spermatozoizilor cu mobilitate sczut dup decongelare.
11.
Concentraiile optime de antioxidani adugate separat la mediul de congelare sunt de 200
M vitamina C, 200 M vitamina E.
12.
Concentraia de 10 M lutein n mediul de crioconservare a spermei de vier duce la
obinerea celor mai bune rezultate, cu privire la mobilitate, integritatea membranar, a ADN-ului
i apariia anomaliilor acrozomale. Totodat, luteina este singurul antioxidant, dintre cei 3
studiai, a crui influen este independent de ras sau individ i este uniform.
13.
Amestecul de vitamine n varianta C 200 M + E 400 M are aciune complementar,
rezultatele evalurilor fiind caracteristice spermatozoizilor crioconservai care au capacitate
fecundant ridicat.
14.
Suplimentarea amestecului C 200 M + E 400 M cu 10 M lutein nu mbuntete
calitatea spermatozoizilor de vier crioconservai, comparativ variantei C 200 M + E 400 M,
independent de ras sau individ.
15.
Dinamica pstrrii calitii spermatozoizilor crioconservai, asigurat de antioxidani este
mai mare la sperma provenit de la vierii Mangalia, urmai de Bazna i PIC.

Ing. VARO GHIURU Florin

40

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

BIBLIOGRAFIE SELECTIV
1. Bogdan Dorina (1993) Curs de tehnologia nsmnrilor artificiale, ediia a II-a
revzut, Ed. Tipo Agronomia, Cluj-Napoca.
2. Breininger Elizabeth, Norma B. Beorlegui, C. OFlaherty, Martha T. Beconi, 2005
Alpha-tocopherol improves biochemical and dynamic parameters in cryopreserved boar
semen, Theriogenology, 63:2126-2135.
3. Ciobanu D.C., A.E. Day, A. Nagy, R. Wales, M.F. Rothschild, G.S. Plastow, 2001
Genetic variation in two conserved local Romanian pig breeds using type 1 DNA
markers, Genet Sel Evol., 33(4):417-32.
4. Dinu Veronica, E. Trua, Elena Popa-Cristea, Aurora Popescu, 1996 Biochimie
medical. Mic tratat, Editura Medical, Bucureti.
5. Hettig Andrea, V. Miclea, M. Zhan, I. Roman, Ileana Miclea, 2010 The Influence of
Exposure Time to Ethylene Glycol on Immature Swine Oocytes Vitrification, Buletin
USAMV Animal Science and Biotechnologies, 67: 487.
6. Hettig Andrea, V. Miclea, M. Zhan, I. Roman, Ileana Miclea, M. Botha, A. Rusu, F.
Varo-Ghiuru, 2011 Vitrification of Immature Swine Oocytes by the SSV Technique
using Different Concentration of Cryoprotector and Exposure Time, Buletin USAMVB
Timioara, Animal Science and Biotechnologies, 44:336-339.
7. Ladoi Ioan, 1999 Embriotehnologie animal, Ed. Victor Melenti, Cluj-Napoca
8. Miclea Ileana, 2010 Efectul utilizrii unor antioxidani n mediile de maturare a
ovocitelor i de cultur a embrionilor, Tez de doctorat, Universitatea de tiine Agricole
i Medicin Veterinar Cluj-Napoca.
9. Miclea Ileana, Andrea Bunea, M. Zhan, V. Miclea, 2007 The isolation, analysis and
testing of sea buckthorn carotenoids on murine macrophage cultures, Lucrri tiinifice
Zootehnie i Biotehnologii-Simpozionul Creterea animalelor n perspectiva unei
agriculturi sustenabile, ISSN 1221-5287, 40(1):140-145.
10. Miclea Ileana, M. Zhan, A. Rusu, F. Ghiuru, V. Miclea, 2009 The effect of several
ascorbic acid concentrations on swine oocyte maturation and embryo culture, UASVM
Ion Ionescu de la Brad Iai, Lucrri tiinifice, Seria Zootehnie, ISSN 1454-7368,
52 (14):35-40.
11. Miclea V., 1997 Biologia reproduciei i nsmnri artificiale, partea I, Ed. Tipo
Agronomia, Cluj-Napoca
12. Miclea V., 2003 nsmnarea artificial la animalele de ferm, Ed. Argonaut, ClujNapoca.
13. Miclea V., M. Zhan, Ileana Miclea, Elena Iliiu, A.L. Rusu, F. Varo-Ghiuru, 2011a
Effect of freezing on spermatozoa from Tigaie rams belonging to the mountain ecotype,
Bulletin of USAMB TIMIOARA , Scientific Papers: Animal Science and
Biotechnologies, 44 (1): 297-299.
14. Miclea V., M. Zhan, S. Nagy, Ileana Miclea, A.L. Rusu, F. Varo-Ghiuru, 2011b
Freezing of spermatozoa from Tigaie rams belonging to the hill ecotype, Bulletin of
USAMB TIMIOARA , Scientific Papers: Animal Science and Biotechnologies, 44 (1):
294-296.
15. Mirean Vioara, Adel Ersek, Maria Camelia Rducu, 2003 Fiziologia animalelor
domestice. Ed. Risoprint Cluj-Napoca.
16. Mirean Vioara, 2009 Anatomie Comparat Histologie i Embriologie, Editura
Academicpres, Cluj-Napoca.
Ing. VARO GHIURU Florin

41

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC


PROVENIT DE LA UNELE RASE LOCALE DE SUINE

17. Moa Cristina, Ana Rou, Gh. Cmpeanu, 2002 Compui bioactivi de origine vegetal.
Abordri biotehnologice n: Cmpeanu, Gh., I. F. Dumitru, Progrese n biotehnologie,
vol. 2, Editura Ars Docendi, Bucureti, 107-118.
18. Murean Adriana, Irina Chi, C. Login, Camelia Alb, oimia Suciu, Adriana Filip,
Nicoleta Decea, 2007 In vivo studies on protective effect of exogenous antioxidants
during normal gestation, USAMV-CN Bulletin, 64(1-2):193-197.
19. Neamu G., Gh. Cmpeanu, Carmen Socaciu, 1993 Biochimie vegetal (partea
structural), Editura Ceres, Bucureti.
20. Pcal N., 1998 Transferul de embrioni la mamifere, Edit. Helicon, Timioara, ISBN
973-574-535-6.
21. Pcal N., 2000 Biologia reproducerii animalelor, Edit. Mirton, Timioara, ISBN 973585-146-6.
22. Rusu A.V., 2011 Evaluarea aciunii unor componeni din diluant asupra stocrii i
crioconservrii spermei de vier, Tez de doctorat. Universitatea de tiine Agricole i
Medicin Veterinar Cluj-Napoca.
23. Socaciu Carmen, R. Jessel, H.A. Diehl, 2000 Competitive carotenoid and cholesterol
incorporation into liposomes: effects on membrane phase transition, fluidity, polarity and
anisotropy, Chemistry and Physics of Lipids, 106:79-88.
24. Tma V., G. Neamu, 1986 Pigmeni carotenoidici i metabolii, vol I., Editura Ceres,
Bucureti.
25. Tploag P.R., 2011 Metode de intensivizare i eficien a reproduciei la suine i
taurine, Editura Granada, Bucureti, ISBN 978-606-8254-08-1.
26. Tploag P.R., A. onea, A. Iancu, Elena Mitrnescu, 2013 Researches regarding age,
breed and collecting season influence in quality and quantity boars semen, Scientific
Papers. Series D. Animal Science. Vol. LVI, ISSN 2285-5750; ISSN CD-ROM 22855769; ISSN-L 2285-5750.
27. Varo-Ghiuru F., I. Ladoi, I. Roman, Andrea Hettig, M. Zhan, V. Miclea, 2010 Antioxidant Medium For Mangalitza Boar Semen Cryopreservation, Bulletin UASVM
Animal Science and Biotechnologies, 67(1-2):445-451.
28. Varo-Ghiuru F., V. Miclea, Ileana Miclea, M. Zhan, Andrea Hettig, L. Crlea, 2011
The Effect of Lutein Added in the Mangalitza Boar Cryopreserved Semen Media,
Bulletin UASVM Animal Science and Biotechnologies, 68(1-2):443.
29. Varo-Ghiuru F., V. Miclea, Ileana Miclea, M. Zhan, Andrea Hettig, L. Crlea, 2011 The Influence of Ascorbic Acid and Alpha-Tocopherol in the Mangalitza Boar Semen
Cryopreservation Media, Bulletin UASVM Animal Science and Biotechnologies, 68(12):444.
30. Westendorf P., L. Richter, H. Treu, 1975 Tierfgefrigerung von Ebersperma: labor und
besamungsergebinsse mit dem Hlsenberger Pailleten Verfahren; Deutsche Tierarzt.
Wschr., 82:261-267.
31. Zhan M., F. Varo-Ghiuru, A. Hettig, I. Miclea, V. Mirean, I. Roman, V. Miclea, 2012
Improving quality of frozen-thawed Mangalitsa boar semen using different antioxidants
supplementation, Reproduction in Domestic Animals, 47(5):115.
32. Zhan M., V. Miclea, F. Ghiuru, I. Roman, A. Rusu, Ileana Miclea, M. Mihilescu, 2010
The Influence of Freezing on Some Rare Breeds Boar Semen Cryopreservation,
Bulletin UASVM Animal Science and Biotechnologies, 67(1-2).

Ing. VARO GHIURU Florin

42

S-ar putea să vă placă și