Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
VETERINAR CLUJ-NAPOCA
COALA DOCTORAL
FACULTATEA DE ZOOTEHNIE I BIOTEHNOLOGII
CRIOCONSERVAREA
MATERIALULUI SPERMATIC
PROVENIT DE LA UNELE RASE
LOCALE DE SUINE
Conductor tiinific
Prof. Dr. MICLEA Vasile
Cluj-Napoca
2013
CUPRINS
INTRODUCERE ...........
Partea I STUDIU BIBLIOGRAFIC ...................................................................................
CAPITOLUL I
CONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC............
1.1. METODE DE CONSERVARE A MATERIALULUI SEMINAL .....................
1.1.1. Conservarea la temperatura camerei ..............
1.1.2. Conservarea prin refrigerare ..............
1.1.3. Conservarea prin congelare ...............
1.2. FACTORI DE INFLUEN AI CONGELRII SPERMEI .............
1.2.1. Factori interni de influen ai congelrii spermei ..............
1.2.2. Factori externi de influen ai congelrii spermei .............
1.2.2.1. Diluani i ageni crioprotectori .................
1.2.2.2. Viteza de centrifugare a spermei ............
1.2.3. Cauze care diminueaz calitatea spermei crioconservate ..............
1.3. TEHNICI DE CONGELARE ....................
1.4. DECONGELAREA MATERIALULUI SEMINAL ..............
CAPITOLUL II
SURSELE, ROLUL FIZIOLOGIC I MECANISMUL DE FORMARE AL
RADICALILOR LIBERI ......................................................................................................
2.1. SURSE DE RADICALI LIBERI ............................
2.1.1. Surse interne ..........................................................................................................
2.1.2. Surse externe ..........................................................................................................
2.2. SPECIILE REACTIVE ALE OXIGENULUI (ROS) .................
2.3. MECANISMUL DE PRODUCERE AL RADICALILOR LIBERI ...........................
2.4. LEZIUNI CAUZATE DE CTRE RADICALII LIBERI ..........................................
2.4.1. Stresul oxidativ ......................................................................................................
2.4.2. Efectele negative ale radicalilor liberi n spermatozoizi .......................................
CAPITOLUL III
ANTIOXIDANII I ROLUL LOR N CONSERVAREA MATERIALULUI SEMINAL
3.1. VITAMINA E (ALFA TOCOFEROLUL) ...............
3.2. VITAMINA C (ACIDUL ASCORBIC) ..............
3.3. PIGMENII CAROTENOIDICI ............
Partea A II A CERCETRI PROPRII ...........................................................................
SCOPUL I OBIECTIVELE CERCETRII ............
CAPITOLUL IV
OPTIMIZAREA PROTOCOLULUI DE CRIOCONSERVARE A MATERIALULUI
SEMINAL DE VIER PROVENIT DE LA RASELE BAZNA I MANGALIA ...............
4.1. ANTRENAMENTUL VIERILOR ..............
4.2. EVALUAREA APTITUDINILOR DE REPRODUCIE ALE VIERILOR ..............
4.2.1. ntocmirea spermogramei uzuale a spermei brute .............
4.3. DETERMINAREA INFLUENEI DILUANILOR PENTRU STOCARE DE
SCURT DURAT ASUPRA CRIOCONSERVRII MATERIALULUI SEMINAL DE
VIER ..................................................................................................
Ing. VARO GHIURU Florin
Pag.
5
6
6
6
6
6
7
8
8
8
8
9
9
9
10
10
10
11
11
11
11
11
12
12
13
13
14
14
16
16
17
17
17
17
17
2
17
18
19
19
19
20
20
20
21
22
22
22
22
25
25
25
27
27
28
31
31
32
33
33
33
34
34
35
36
36
36
37
37
38
38
39
41
INTRODUCERE
Creterea animalelor este o ramur deosebit de dinamic a tiinei i practicii agricole,
caracteristic impus n principal de factorul economic. Deoarece preferinele consumatorilor
sunt ntro continu evoluie, cresctorul trebuie s posede capacitatea educaional, informaiile
i mijloacele prin care prevede piaa i conduce activitatea de producie pentru a veni n
ntmpinarea acestora.
Mijloacele zootehnice prin care se coordoneaz procesul de producie sunt diverse i de
cele mai multe ori cu influene i interdependene reciproce.
Tehnologiile de producie consacrate, dar cu aplicabilitate actual, alturi de noile
biotehnologii, determin, pe lng creterea numeric a efectivelor de animale, i mbuntirea
potenialului productiv al acestora.
La ora actual un numr descresctor de rase sunt responsabile de creterea procentului
de producere a hranei. n Europa i la nivel global, eroziunea genetic este n plin desfurare,
multe dintre rase se pierd, sau se afl sub risc de extincie datorit factorului economic implicat
n selecie i a driftului genetic.
Strategiile de reproducie la care apeleaz creterea animalelor sunt ntro continu
rennoire i se refer la nsmnarea artificial, dirijarea ciclurilor estrale, transferul de
embrioni, fecundaia in vitro, congelarea i sexarea embrionilor, etc. nsmnarea artificial este
deja o biotehnologie de reproducie clasic, care s-a raspndit treptat, mai ales dup ce s-a reuit
conservarea spermatozoizilor prin congelare. Conservarea materialului spermatic urmrete
meninerea capacitii fecundante a spermatozoizilor o perioad de timp a crei durat este n
funcie de metodele folosite. Se reuete astfel evitarea risipei de material spermatic i scderea
numrului de masculi, pentru c femelele sunt nsmnate pe masur ce intr n clduri.
n anul 1949 Polge i colaboratorii descoper efectul crioprotector al glicerolului asupra
spermatozoizilor. Acest fapt a avut un uria impact asupra creterii taurinelor, anticipndu-se
acelai efect i asupra celorlalte specii de interes zootehnic. ntre anii 1950-1960, prin protocoale
de conservare consacrate la taurine, s-a ncercat crioconservarea spermei de vier, obinndu-se la
decongelare spermatozoizi mobili, dar aceast mobilitate nu a fost concretizat prin fertilitate
(Graham i col., 1971; Bwanga, 1991). n anul 1970, Polge a fost primul cercettor care a descris
o metod ce a demonstrat experimental fertilitatea spermei de vier congelate decongelate, prin
inseminare chirurgical intraoviductal. Aceste rezultate au fost reconfirmate n 1971 prin
inseminare via cervix de ctre grupuri diferite de cercettori (Graham i col. 1971, Pursel i
Johnson 1974). Bazndu-se pe aceste informaii, n 1975, Westendorf i colaboratorii pun la
punct o tehnic de congelare a spermei de vier n paiete, tehnic care a fost mbuntit i de ali
autori pe parcurs. Aceast tehnic este de referin i astzi, fiind cea mai folosit metod.
Dei folosirea materialului spermatic congelat duce la obinerea de produi vii, rata ftrii
este mult sczut comparativ folosirii spermei de vier diluate. Cu toate aceste rezultate
inferioare, exist argumente puternice care s susin rolul spermei de vier congelate n anumite
segmente ale creterii industriale ale suinelor.
n ultimii ani a aprut o tendin a preferinelor consumatorilor din Romnia ctre
produsele tradiionale, n mod special al celor ecologice. Iar dac ne gndim c reetele acestor
specialiti au fost create cu carne marmorat i perselat, cu grsime intramuscular obinut de
la rasele Bazna i Mangalia, caliti nentlnite la hibrizii de carne, atunci trebuie s ne preocupe
descoperirea unor metode de pstrare a genofondului provenit de la ele. Iar pentru faptul c n
ar exist un efectiv foarte sczut de indivizi aparinnd acestor rase, nsmnrile artificiale cu
material seminal crioconservat ar putea fi soluia pentru repopularea fermelor.
Partea I
STUDIU BIBLIOGRAFIC
CAPITOLUL I
CONSERVAREA MATERIALULUI SPERMATIC
1.1. METODE DE CONSERVARE A MATERIALULUI SEMINAL
1.1.1. Conservarea la temperatura camerei
Conservarea la temperatura camerei este procedeul care poate fi practicat la toate speciile
de animale, dar are o utilizare mai mare la suine. Pentru reuita conservrii se folosesc diluani
special destinai acestui scop, ei fiind formai de obicei dintro soluie ce posed capacitate mare
de tamponare, cantiti reduse de glbenu de ou, catalaz i diferite combinaii de antibiotice.
Materialul spermatic nediluat poate fi pstrat 1-2 ore la 18-20C, nainte de a fi inoculat. Acest
interval este necesar pentru controlul ejaculatului, transportul la femelele n clduri i inoculare.
Durata conservrii nu poate fi mai mare deoarece la temperatura menionat spermatozoizii i
menin metabolismul destul de ridicat, epuizndu-i rezervele. Pentru a realiza o conservare
reuit, se admit la diluare numai ejaculatele care ndeplinesc anumii indici minimali. Volume
ale ejaculatelor de peste 200 ml cu o concentraie mai mare de 200 milioane/ml i mobilitate
ridicat sunt considerate garania pstrrii viabilitii spermatozoizilor o perioad lung de timp.
Gradul optim al diluiei este cuprins ntre 1:8 i 1:20. n general spermatozoizii provenii de la
mamifere, n urma dilurii, i sporesc iniial mobilitatea, dup care aceasta scade, iar la nivelul
membranelor apar leziuni. Gradul diluiei stabilete concentraia spermatozoizilor pe doza de
inoculat. Se consider c nu apar diferene dac concentraia este variabil ntre limitele de 20
80 x 109 spermatozoizi/ml. Diluarea propriu-zis are o singur etap, respectiv peste cantitatea
de diluant rezultat din calcularea gradului diluiei se toarn materialul spermatic recoltat,
omogenizndu-se uor ntreg amestecul. Temperatura la care se realizeaz diluarea este de 30
34C, respectarea condiiilor de izotermie fiind obligatorie. Controlul dilurii urmrete
mobilitatea spermatozoizilor. Timpul de echilibrare, n care temperatura materialului spermatic
diluat scade la 15 16C, nu este permis s fie mai mic de 2 ore sau mai mare de 5 ore. Volumul
optim al unei doze este de 100 ml, iar coninutul n spermatozoizi cuprins ntre 2 i 4 miliarde.
1.1.2. Conservarea prin refrigerare
Refrigerarea materialului spermatic diluat a constituit o perioad de timp singura i cea
mai rspndit metod de conservare, dar a fost sau este nlocuit treptat de congelare. Cu toate
modificrile din compoziia chimic a soluiei saline, glbenuul de ou a rmas la nivelul maxim
acceptat de 20%, care asigur protecia spermatozoizilor mpotriva ocului determinat de
scderea temperaturii. n principiu, dup diluare i echilibrare, materialul spermatic se pune la
frigider pentru pstrare timp de 2 3 zile, la temperatura de 4 5C. Datorit temperaturii de
refrigerare spermatozoizii i diminueaz metabolismul. Calitile diluantului, alturi de
reducerea substanelor de catabolism, fac posibil conservarea capacitii fecundante a
spermatozoizilor n perioada de timp menionat. Meninerea temperaturii de refrigerare trebuie
s se realizeze obligatoriu i n timpul transportului dozelor de inoculat la femelele n clduri.
naintea utilizrii pentru inoculare, materialul spermatic refrigerat poate fi adus rapid la
temperatura corporal fr a-i influena negativ capacitatea fecundant. Avantajele metodei sunt
cele cunoscute. Astfel este posibil ca masculii valoroi s fie grupai pentru ca recoltarea,
controlul, diluarea i conservarea spermei s se fac de ctre personal specializat, n condiii care
asigur meninerea capacitii fecundante i previne contaminarea acesteia. Dezavantajele
Ing. VARO GHIURU Florin
Diluani care se folosesc pentru conservarea materialului seminal peste 4 zile: Acromax,
Androhep, Modena, Mulberry III, Rading, X-Cell, Zorlesco, ZORPVA i alii).
Diluanii din prima clas sunt folosii pentru prepararea dozelor care se distribuie pe
distane scurte (cum este sistemul European, n care frecvent dozele de inseminare sunt obinute
chiar n ferma n care are loc inseminarea artificial), iar cei din categoria a doua sunt folosii n
cazul transportului dozelor la distane mari (SUA, Norvegia, etc.). Diluanii care conin glicerol
se adaug n cadrul protocolului de crioconservare de obicei atunci cnd sperma a fost deja
diluat i rcit pn la temperatura de 5C (Almid i Johnson, 1988). Dei diluanii sunt foarte
diferii din punct de vedere a compoziiei chimice, majoritatea se caracterizeaz printro
concentraie relativ mic de glicerol i o perioad scurt de echilibrare.
10
Factorii fiziologici se refer la statusul mental cum este stresul, emoia, etc. i condiiile
de boal i sunt responsabili pentru producerea de radicali liberi. Sursele externe i mai ales cele
interne necesit o dezbatere mai ampl pentru a fi pe deplin nelese.
2.1.1. Surse interne
Acestea pot fi reacii enzimatice, care servesc ca surs de radicali liberi. Ele includ acele
reacii implicate n lanul respirator, n fagocitoz, sinteza prostaglandinei i n sistemul
citocromului P450. Cteva surse interne care genereaz radicali liberi sunt mitocondriile, xantin
oxidazele, fagocitele, reaciile ce implic fierul i alte metale de tranziie, peroxizomii, calea
metabolic a arahidonatului, exerciiul fizic, ischemia/reperfuzia i inflamaia.
2.1.2. Surse externe
Sursele externe includ reaciile non-enzimatice ale oxigenului cu compui organici.
Radicalii liberi apar de asemenea n reacii care sunt iniiate de radiaiile ionizante. Cteva surse
externe de radicali liberi sunt fumul de igar, poluanii din mediu, radiaiile, lumina ultraviolet,
ozonul, anumite medicamente, pesticidele, anestezicele i solvenii industriali.
2.2. SPECIILE REACTIVE ALE OXIGENULUI (ROS)
Radicalii liberi pot fi definii ca molecule sau fragmente moleculare ce conin unul sau
mai muli electroni nepereche pe orbitalul lor atomic sau molecular (Halliwell i Gutteridge,
1999). Acest sau aceti electroni imprim un grad considerabil de reactivitate radicalului liber.
Radicalii derivai ai oxigenului reprezint cea mai important clas de specii reactive generate n
sistemele vii (Miller i col., 1990). Acetia sunt urmtorii: Radicalul hidroperoxil, Radicalul
superoxid, Peroxidul de hidrogen, Oxigenul singlet i Oxigenul triplet.
2.3. MECANISMUL DE PRODUCERE AL RADICALILOR LIBERI
Un radical poate dona electronul su nepereche unei alte molecule. Poate apoi s ia un
electron de la alt molecul pentru a-l mperechea pe al su, sau poate simplu s se alture cu
totul acelei molecule. Cnd radicalul primete sau cedeaz un electron, sau se alipete, anionul
format devine radical la rndul su. Astfel, viitoarele reacii, ce decurg ca reacii n lan, fac ca
un radical s dea natere altuia (Halliwell i Gutteridge, 1984). Radicalii liberi pot fi formai pe
trei ci:
Prin clivaj homolitic al legturii covalente dintro molecul normal, fiecare fragment
reinnd unul dintre cei doi electroni pereche.
X:Y
X* + Y*
Prin pierderea unui electron nepereche dintro molecul normal.
X:Y
X+ + Y Prin adiia unui electron nepereche la o molecul normal.
X + eX2.4. LEZIUNI CAUZATE DE CTRE RADICALII LIBERI
Dac radicalii liberi nu sunt inactivai, reactivitatea lor chimic poate leza toate
macromoleculele celulare, incluznd proteinele, carbohidraii, lipidele i acizii nucleici. Atacul
oxidativ asupra proteinelor conduce la modificri specifice ale aminoacizilor, fragmentarea
lanurilor peptidice, agregarea produilor formai n urma reaciilor ncruciate, modificarea
ncrcturilor electrice i creterea predispoziiei la proteoliz (Farr i Kogoma, 1991). Oxigenul
activat i agenii care genereaz radicali liberi ai oxigenului, cum sunt radiaiile ionizante, induc
Ing. VARO GHIURU Florin
11
numeroase leziuni ale ADN-ului, acestea cauznd deleii, mutaii i alte efecte genetice letale.
Att partea bazelor, ct i a glucidelor din ADN sunt predispuse la oxidare, determinnd
degradri ale bazelor, scindare monocatenar i ncruciri ale proteinelor.
2.4.1. Stresul oxidativ
Sies (1985) a definit stresul oxidativ ca un dezechilibru sever aprut ntre agenii oxidani
(speciile reactive ale oxigenului i azotului) i antioxidani, dezechilibru manifestat n favoarea
primilor i care duce la apariia de leziuni n sistemele vii. Acest dezechilibru apare fie datorit
reducerii capacitii de aprare pe care o posed antioxidanii, fie n urma interaciunii cu
substane ce produc oxidarea, lund natere radicalii liberi. Datorit instabilitii lor, acetia
ncearc s ating stabilitatea structural, punnd n comun electronul liber cu grupri electrofile
provenite de la orice molecul aflat n apropiere (lipide, proteine, carbohidrai sau acizi
nucleici) (Pierce i col., 2004). Aceasta determin o serie de reacii n lan care duc la
depolarizarea membranei mitocondriale, eliberarea citocromului C, provoac leziuni la nivelul
acizilor nucleici i oxideaz acizii grai polinesaturai, ceea ce duce la moartea celulelor. n
cadrul tehnicilor de reproducie asistat, procesul de congelare decongelare face celulele mult
mai sensibile la ROS. Ba mai mult, acest proces reduce concentraia de glutation (GSH) cu 78%,
iar activitatea superoxid dismutazei cu 50% n spermatozoizii bovini. Incrementarea peroxidrii
lipidice, observat dup crioconservarea spermei, se datoreaz scderii activitii SOD, ceea ce
sugereaz clar c stresul oxidativ are loc n timpul i/sau dup ciclul de congelare decongelare.
Aceasta explic parial efectul vtmtor al crioconservrii asupra viabilitii gameilor sau a
embrionilor. Modificrile lipidelor datorate ROS i modificrile spaiale ale structurilor
membranare pot conduce clar la leziuni criogene (Moreira da Silva i col., 2010). Sperma
genereaz concentraii mici i controlate de radicali liberi, n special radicali superoxid, peroxizi
de hidrogen i oxid nitric, deoarece acetia acioneaz ca mediatori n procesele de capacitare,
hiperactivare i reacie acrozomal, care sunt cruciale pentru dobndirea abilitii de fertilizare,
dar i pentru ataarea la zona pellucida. Mecanismul de producere a ROS de ctre spermatozoizi
este nc neclar. Este propus o ipotez cum c o NADPH oxidaz care genereaz O2-, similar
cu cea ntlnit n leucocitele fagocitare, este implicat n acest proces. Exist cteva mecanisme
de aprare mpotriva speciilor reactive ale oxigenului pe care sperma le deine. Printre acestea se
numr catalaza, acidul uric, taurina, tiolii, acidul ascorbic i -tocoferolul, dar cele mai
importante sunt superoxid dismutaza i sistemul glutation peroxidaz glutation reductaz. Dei
exist aparent disponibile toate aceste mecanisme de aprare, totui sperma matur se pare c nu
este protejat adecvat, datorit concentraiei ridicate de lipide membranare nesaturate i a unei
insuficiene relative de enzime de tipul SOD, din cauza absenei citoplasmei. Acest deficit este
parial compensat de ctre sistemul antioxidant foarte puternic, prezent n plasma seminal, care,
n contradictoriu cu celelalte fluide biologice, conine concentraii semnificative de SOD, xantin
oxidaz, oxid nitric, catalaz, glutation peroxidaz, plus acid ascorbic, tioli, acid uric, -tocoferol
i un nivel ridicat de glutation (Moreira da Silva i col., 2010).
2.4.2. Efectele negative ale radicalilor liberi n spermatozoizi
Stresul oxidativ provocat de ctre radicalii liberi precum superoxidul, care difuzeaz uor
prin membrana celular, alternd structura i funciile celor mai multe molecule celulare (lipide,
proteine, acizi nucleici), este responsabil de majoritatea leziunilor ce apar. Consecinele acestora
sunt multiple i includ modificri ale activitii mitocondriale, distrugerea ATP i apoptoza.
Speciile reactive ale oxigenului produc oxidarea lipidelor, ceea ce duce la disfuncii
mitocondriale i are efecte negative asupra transportului metaboliilor. Ca urmare, fluiditatea
Ing. VARO GHIURU Florin
12
13
prezeni n citoplasm. Radicalul tocoferoxil care rezult, reacioneaz cu un alt radical peroxil,
dnd natere unui produs stabil, tocoferilchinona. Astfel, o singur molecul de tocoferol este
capabil s duc la ntreruperea a dou reacii de oxidare. Vitamina E este poate cel mai bine
cunoscut inhibitor al peroxidrilor lipidice din membranele biologic active, care acionnd ca un
sanitar ce nltur radicalii lipidici peroxil (LOO) i alcoxil (LO), previne leziunile oxidative
din sperma crioconservat. Unii ageni reductori, cum sunt ascorbatul, cisteina i glutationul pot
regenera vitamina E din radicalul tocoferoxil, ceea ce ar putea explica efectele cumulative ale
acestor compui i inhibarea oxidrii lipidelor de ctre vitamina E i ascorbat. Tocoferolii pot
reduce Fe3+ la Fe2+ i Cu2+ la Cu+, asfel nct ar putea avea anumite efecte prooxidante in vitro.
3.2. VITAMINA C (ACIDUL ASCORBIC)
Acidul ascorbic, sau vitamina C, face parte dintr-o grup de vitamine hidrosolubile
eseniale pentu buna funcionare a organismului, un micronutrient implicat n mai multe funcii
biologice. Majoritatea animalelor sunt capabile s sintetizeze vitamina C din glucoz, ns
oamenii, alte primate, purceii de Guineea i liliecii de fructe nu posed gulonolacton oxidaza,
ultima enzim implicat n sinteza vitaminei C, aadar necesit prezena acestei vitamine n
alimentaie. Vitamina C se gsete n toate plantele, dar este prezent n cantiti mai mari n
unele fructe, cum sunt citricele, mceele, fructele de ctin sau merele (Neamu i col., 1993).
Cantitatea n care se gsete, variaz ntre 10 i 100 mg/100g, de cteva ori mai mare dect
coninutul n alte vitamine. Concentraia mare este determinat de abundena sursei acidului
ascorbic, adic glucidele, i de calea relativ simpl de biosintetizare. Absena ei prelungit n
aceste cazuri genereaz erori n modificrile post-translaionare ale colagenului ce pot cauza
boala numit scorbut, sau chiar moartea. Pe lng activitatea sa antiscorbutic, vitamina C este
un potent agent reductor i consumator de radicali liberi n sistemele biologice (Hacievki
Aysun, 2009). A fost asociat fertilitii timp de civa ani i poate avea o importan deosebit
din punct de vedere evolutiv, dar rolul su n reproducie este nc incert. Structura sa este
nrudit cu cea a hexozelor, putnd fi considerat -lactona unui acid hexuronic, numit acid Lgulonic. n molecul mai sunt cuprinse i patru grupri OH dintre care dou sunt alcoolice (la
C5 i C6) i dou enolice (la C2 i C3). Datorit structurii sale asimetrice, acidul ascorbic prezint
patru stereoizomeri, ns forma levogir la atomul de carbon C 5 este cea biologic activ. n
celule, vitamina C este transportat sub forma oxidat de acid dehidroascorbic prin intermediul
transportului facilitat (Sagun i col., 2005). Acidul ascorbic i acidul dehidroascorbic formeaz
n celule un important sistem de oxido reducere care regleaz potenialul redox celular i
contribuie la transportul hidrogenului pe cale nonenzimatic. Acest sistem previne oxidarea unor
biomolecule, adic a lipidelor, proteinelor i ADN-ului nuclear i mitocondrial datorit
interaciunii sale cu radicalii OH, alcoxil, peroxizii, O2- sau oxigenul singlet (1O2) dintre
speciile reactive ale oxigenului i NO sau peroxinitritul dintre cele ale azotului. n mitocondrii,
acidul ascorbic previne att depolarizarea membranei, ct i eliberarea citocromului C,
evenimente ce au loc n timpul apoptozei celulare (Sagun i col., 2005). Activitatea antioxidant
a vitaminei C n cazul ADN-ului este un subiect controversat, studii in vivo i in vitro susinnd
att efectul ei benefic antimutagen, ct i unul negativ prooxidant.
3.3. PIGMENII CAROTENOIDICI
Dintre diferitele clase de pigmeni naturali, carotenoidele sunt cele mai importante i mai
larg rspndite, fiind cunoscute n prezent peste 600 (Olson i Krinsky, 1995) dintre care 24 sunt
folosite n hrana omului. Ele sunt liposolubile i imprim culoarea roie, galben, albastr sau
portocalie esuturilor n care se afl. n regnul vegetal, carotenoidele se gsesc n toate organele
Ing. VARO GHIURU Florin
14
15
16
17
18
semnificative, aadar alegerea n continuare a unui singur diluant de lucru s-a fcut pe criterii pur
financiare. S-a preferat diluantul propriu, necesarul de chimicale conducnd la obinerea unui
pre mai sczut fa de diluanii comerciali ambalai n pliculee. Reeta este una asemntoare
BTS-ului ca i componente chimice, dar diferit ca i gramaj.
Tabelul 1.
Mobilitatea spermatozoizilor de vier postcongelare n funcie de diluant
Diluant
BTS
MR-A
Androhep Plus
Diluant propriu
FEY/FEYGO
LEY/LEYGO
Androhep Cryoguard
151.581
411,000a
361,871a
*Diferenele dintre oricare variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative
19
Rezultatele obinute n urma sigilrii paietelor prin cele trei metode, au evideniat clar
diferenele dintre procentele de mobilitate ale spermei dup decongelare din paietele sigilate cu
polivinil alcool, cu bile metalice i cele sigilate cu cletele termic ce dezvolt o temperatur de
200C. Procentul mic obinut n urma folosirii cletelui termic se datoreaz unei fluctuaii mari
de temperatur. Acest clete dezvolt 200C, energia caloric difuznd rapid prin volumul mic de
sperm aflat n paieta de 0,5 ml. Se pare c spermatozoizii nu supravieuiesc n numr mare
acestui oc, de aceea nu se recomand n continuare utilizarea metodei. Din datele graficului 1
rezult diferene semnificative ntre rezultatele metodei cu sigilare termic i celelalte dou
metode la care temperatura nu fluctueaz. ntre metoda sigilrii paietelor cu bile metalice i cea a
sigilrii cu dopuri de polivinil alcool nu sunt diferene semnificative, ns paietele cu PVA sunt
intacte n numr mai mare dect cele cu bile metalice dup decongelare. Aadar s-a ales mai
departe metoda sigilrii paietelor cu pudr de PVA.
20
Mobilitate (%)
50
40
30
20
10
V
P
do
pu
ri
de
u
C
bi
le
Te
rm
ic
et
al
ic
e
Metoda de sigilare
Vierii reinui pentru efectuarea cercetrilor prin caracteristicile fenotipice aparin celor
dou rase locale de interes.
Vierii Mangalia, spre deosebire de cei din rasa Bazna, manifest un comportament
sexual capricios, fiind mai greu de lucrat cu ei. Aadar se recomand tratarea lor cu mai mult
atenie i rbdare.
La vierii reinui pentru recoltare sperma brut are calitatea necesar pentru a fi utilizat
n experienele de crioconservare.
Mediul de crioconservare a spermei de vier preparat cu diluani LEY i LEYGO este cel
mai indicat pentru rasele Bazna i Mangalia. O concentraie de 11% lactoz n LEY i 6%
glicerol n LEYGO au condus la rezultate mai bune dect cele obinute n cazul folosirii
diluanilor FEY i FEYGO.
Sigilarea paietelor cu dopuri de polivinil alcool sau bile metalice nu conduce la diferene
asigurate statistic privind mobilitatea spermei dup decongelare. Utilizarea dopurilor de polivinil
alcool determin scderea nesemnificativ a numrului de paiete cu material spermatic
compromis dup decongelare.
21
CAPITOLUL V
EFECTUL SUPLIMENTRII CU ANTIOXIDANI A MEDIULUI DE
CRIOCONSERVARE A SPERMEI PROVENIT DE LA RASELE
BAZNA I MANGALIA
5.1. EFECTUL SUPLIMENTRII CU VITAMINA E A MEDIULUI DE CRIOCONSERVARE
ASUPRA MOBILITII SPERMATOZOIZILOR
5.1.1. Material i metod
Materialul seminal a provenit de la 2 vieri Bazna, 2 Mangalia i 2 hibrizi comerciali PIC.
Vierii utilizai au fost antrenai pentru recoltarea manual cu manechinul artificial i au prezentat
libidou sexual normal. Recoltarea materialului spermatic, evaluarea imediat dup recoltare a
acestuia cu privire la volumul fraciunii spermatice, concentraia, determinarea mobilitii, a
procentului de aglutinare, a osmolaritii, pH-ului, aspectelor morfologice, protocolul de
crioconservare i metoda de analiz statistic au fost aceleai ca i cele de la subcapitolul 4.3.1.
menionate anterior n tez. Antioxidantul folosit a fost Trolox (acid 2-carboxilic-6-hidroxi2,5,7,8-tetrametilcroman), o variant hidrosolubil a vitaminei E. Antioxidantul a fost
suplimentat ntrun anumit moment al protocolului de crioconservare i anume imediat dup etapa
de adugare a diluantului pentru diluia final LEYGO, la 5C, n vitrina frigorific. Aadar
antioxidantul se adaug n mediul de crioconservare a spermei, obinut conform protocolului de
crioconservare descris, prin amestecul diluantului pentru diluia iniial LEY i a celui pentru
diluia final LEYGO. Antioxidantul nu se adaug n compoziia niciunuia dintre cei doi diluani,
ci va intra n compoziia mediului de crioconservare, dup ce au fost adugai cei doi diluani.
Concentraiile molare de Trolox propuse pentru cercetare au fost: 50 M, 100 M, 200 M, 300
M i 400 M. Deoarece ntre procentele de mobilitate ale spermatozoizilor obinute la
decongelare exist diferene de la o paiet la alta, n cadrul aceleiai etape de crioconservare, sau decongelat pentru fiecare variant experimental cte 3 paiete al cror coninut s-a amestecat,
iar amestecul obinut a fost supus analizei mobilitii postcongelare prin testul de anduran.
Acest procedeu a fost folosit pentru toate analizele privind mobilitatea spermatozoizilor
congelai i decongelai, n cazul n care nu se specific altfel. S-au crioconservat i analizat dup
decongelare un numr de 5 ejaculate pentru fiecare dintre cei 6 vieri.
5.1.2. Rezultate i discuii
La vierii Bazna, se observ c vitamina E n concentraie 200 M adugat n mediul de
crioconservare a materialului seminal crete semnificativ procentul de mobilitate fa de martor
(fr adaos de antioxidant), de la 5 minute dup decongelare, pn la 2 ore. Pentru primul vier,
notat Bazna 1, diferena e distinct semnificativ pn la intervalul de 30 minute, iar de acolo
pn la 2 ore, aceasta este foarte semnificativ. Pentru vierul Bazna 2, situaia este asemntoare,
ba chiar mai bun, aici varianta 200 M Trolox st mai bine la mobilitate de la 5 minute dup
decongelare i pn la dou ore, cu diferene foarte semnificative. n cifre exacte, pentru Bazna
1, la 5 minute de la decongelare varianta martor avea 27% mobilitate a spermatozoizilor, pe cnd
varianta 200 M avea 38%, deci o diferen de 11%. Pentru Bazna 2, diferena e i mai mare, de
la 38% la 58%, adic 20%. Ctre intervalul de 2 ore, diferenele devin tot mai mari. Diferena de
mobilitate la dou ore ntre martor i E 200 M pentru Bazna 1 este de 17%, de la 18% la 35%,
iar pentru Bazna 2 este de 16%.
22
60
Martor
50 M
100 M
200 M
300 M
400 M
40
20
80
Martor
50 M
100 M
200 M
300 M
400 M
60
40
20
h
2
h
1
m
in
30
10
m
in
m
in
h
2
h
1
m
in
30
m
in
10
in
50 M
60
200 M
40
h
1
m
5
in
in
h
2
30
10
m
in
0
m
in
20
m
in
300 M
400 M
20
100 M
in
40
M a r to r
60
80
Martor
50 M
100 M
200 M
300 M
400 M
80
V ie r u l M a n g a lita 2 - v ita m in a E
23
vitamine, al crei aport este uniform n cazul rasei Mangalia pe tot parcursul intervalului de timp
de la decongelare, fr diferene atribuite individului. Acest fapt este posibil datorit rusticitii i
a omogenitii rasei, aceasta rmnnd neameliorat i bine consolidat de mult timp ncoace.
Uniformitatea, nsoit de diferenele mari de mobilitate ntre martor i Trolox 200 M,
sugereaz aciunea mai pregnant a antioxidantului asupra raselor rustice, acest efect fiind
posibil de obinut i asupra altor rase nrudite cu Mangalia. Ritmul de scdere a procentului de
mobilitate pe parcursul trecerii timpului de la decongelare este mult mai lent la varianta 200 M
Trolox, att la Mangalia, dar i la Bazna.
80
M a rto r
80
M a r to r
50 M
60
100 M
50 M
60
100 M
200 M
40
300 M
200 M
40
300 M
400 M
20
400 M
20
V ie ru l P IC 1 - v ita m in a E
h
2
h
1
in
m
3
m
0
1
in
in
h
2
h
1
in
30
in
m
10
in
V ie r u l P IC 2 - v ita m in a E
24
25
80
Martor
50 M
100 M
200 M
300 M
400 M
40
20
Martor
50 M
100 M
200 M
300 M
400 M
60
40
20
h
2
h
1
m
in
30
10
m
in
m
in
h
2
h
1
m
in
30
m
in
10
m
in
60
h
2
in
h
2
30
10
m
5
0
m
in
0
m
in
20
in
20
40
m
in
40
Martor
50 M
100 M
200 M
300 M
400 M
30
60
80
m
in
Martor
50 M
100 M
200 M
300 M
400 M
10
80
26
Astfel, concentraia de 200 M acid ascorbic n mediul de crioconservare este cea care aduce
mbuntiri semnificative statistic n cazul vierului PIC 1 (cel cu mobilitatea sczut la martor)
i doar n intervalul de 5 minute pn la o or dup decongelare.
60
Martor
50 M
100 M
200 M
300 M
400 M
40
20
80
Martor
50 M
100 M
200 M
300 M
400 M
60
40
20
h
2
h
1
m
in
30
m
in
10
in
h
2
h
1
m
in
30
m
in
10
in
27
Adaos de vitamina C (acid ascorbic) 200 M pentru c a fost varianta cu cele mai bune
rezultate din studiul axat pe aceast vitamin i pentru a face o paralel ntre rezultatele
obinute n variantele cu amestecuri de antioxidani i aceasta;
- Adaos de vitamina E (Trolox) 200 M pentru c a evideniat cele mai pregnante influene la
capitolul su;
- Amestec de vitamina C 200 M i vitamina E 200 M pentru c reprezint combinaia celor
mai bune variante anterioare;
- Amestec de vitamina C 200 M i vitamina E 400 M, miznd pe o doz dubl de Trolox,
presupunnd c aportul de acid ascorbic nu reuete s regenereze toi radicalii tocoferolului,
o parte din ei angrenndu-se n alte tipuri de reacii;
Pentru fiecare variant experimental studiat, s-au decongelat cte 3 paiete al cror
coninut a fost amestecat, pentru a evita posibilele diferene de mobilitate de la o paiet la alta.
De la fiecare din cei 6 vieri, s-au recoltat cte 5 ejaculate n scopul crioconservrii.
-
28
Vierul Bazna 2
80
60
40
20
60
40
20
h
2
h
1
m
in
30
m
in
10
m
in
h
2
h
1
m
in
30
m
in
10
m
in
80
Martor
Martor
C 200M
C 200M
E 200M
E 200M
C+E 200+200M
C+E 200+200M
C+E 200+400M
C+E 200+400M
29
Vierul Mangalita 1
80
60
40
20
60
40
20
h
2
h
1
in
30
in
m
10
h
2
h
1
m
in
30
m
in
10
m
in
5
in
80
Martor
Martor
C 200M
C 200M
E 200M
E 200M
C+E 200+200M
C+E 200+200M
C+E 200+400M
C+E 200+400M
30
Vierul PIC 1
80
60
40
20
60
40
20
h
2
h
1
in
30
in
m
10
h
2
h
1
in
m
30
10
in
in
m
5
in
80
Martor
Martor
C 200M
C 200M
E 200M
E 200M
C+E 200+200M
C+E 200+200M
C+E 200+400M
C+E 200+400M
31
10 min
30 min
1h
2h
Martor
Luteina 5 M
Luteina 10 M
Luteina 20 M
Luteina 40 M
32
concentraie mai mare de 10 M este deja prea mult pentru a conferi efectul maxim de protecie.
Cauza nu se poate explica datorit puinelor date disponibile.
5.5. EFECTUL SUPLIMENTRII CU AMESTEC DE VITAMINE C I E I LUTEIN A
MEDIULUI DE CRIOCONSERVARE ASUPRA MOBILITII SPERMATOZOIZILOR
5.5.1. Material i metod
Materialul seminal a provenit de la aceiai 6 vieri descrii i prezentai fiecare n parte cu
fotografie n subcapitolul 5.1.1. din tez. Recoltarea materialului spermatic, evaluarea imediat
dup recoltare a acestuia cu privire la volumul fraciunii spermatice, concentraia, determinarea
mobilitii, a procentului de aglutinare, a osmolaritii, pH-ului, aspectelor morfologice,
protocolul de crioconservare i metoda de analiz statistic au fost aceleai ca i cele de la
subcapitolul 4.3.1. menionate anterior n tez. Antioxidanii folosii pe perioada cercetrilor au
fost: acidul ascorbic (vitamina C), -tocoferolul (vitamina E) varianta hidrosolubil Trolox i
luteina, procurai de la SIGMA Aldrich, Germania. Antioxidanii au fost adugai n mediul de
crioconservare a spermei, dup etapa de diluie cu LEYGO, la 5C. Variantele experimentale
pentru acest set de experimente sunt:
Martor congelarea clasic, fr adaos de antioxidani
Adaos de lutein n concentraie de 10 M
Adaos de vitamina C 200 M i E 400 M
Adaos de vitamina C 200 M, E 400 M i lutein 10 M
5.5.2. Rezultate i discuii
Cele mai bune valori se ntlnesc la C 200 M + E 400 M i la adaosul de lutein 10
M, procentele fiind asemntoare, cu diferene nesemnificative din punct de vedere statistic.
Surprinztor este c rezultatele amestecului alctuit din vitamina C n concentraie 200 M,
vitamina E 400 M i lutein 10 M aduc un spor al procentului de mobilitate al
spermatozoizilor de vier crioconservai mai mic dect n cazul luteinei 10 M studiat separat,
sau al amestecului format doar din vitamina C 200M i E 400M n cazul tuturor vierilor de la
care s-a recoltat sperma.
Tabelul 4.
Procentul de mobilitate a spermatozoizilor provenii de la vierii Bazna, crioconservai
n mediu cu amestecuri de antioxidani
Vierii Bazna (MediaESM)
Timp de evaluare
5 min
10 min
30 min
1h
2h
311.87
332.55
392.44
322.00
261.87
Martor (M)
461.00a 482.00a 551.58a
501.58a
431.22a
Lutein 10 M (L10)
450.00a 491.00a 550.00a 491.00a,b 441.00a
C 200+E 400 M (C200+E400)
421.22b
350.00b
C 200+E 400+Lutein 10 M (C200+E400+L10) 421.22a 451.58a 491.87a
*Diferenele pe coloan dintre oricare variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative
Varianta
La Bazna rezultatele obinute la varianta C 200 M + E 400 M sunt mai bune dect la C
200 M + E 400 M + lutein 10 M, la un interval de dou ore de la decongelarea materialului
seminal, diferenele fiind distinct semnificative din punct de vedere statistic. Luteina 10 M are
de asemenea valori semnificativ mai bune fa de amestecul celor trei antioxidani, nc de la o
or de echilibrare. La Mangalia amestecul C 200 M + E 400 M este semnificativ mai bun de
la 30 de minute postcongelare fa de C 200 M + E 400 M + lutein 10 M i la fel i luteina
10 M, de la o or.
33
Tabelul 5.
Procentul de mobilitate a spermatozoizilor provenii de la vierii Mangalia, crioconservai
n mediu cu amestecuri de antioxidani
Vierii Mangalia (MediaESM)
Timp de evaluare
5 min
10 min
30 min
1h
2h
291.87
311.87
361.87
292.44
222.00
Martor (M)
441.00a 471.22a 531.22a,b 491.00a 421.22a
Lutein 10 M (L10)
451.58a 481.22a
572.00b
491.00a 431.22a
C 200+E 400 M (C200+E400)
482.55a
411.87b 341.00b
C 200+E 400+Lutein 10 M (C200+E400+L10) 411.87a 442.44a
*Diferenele pe coloan dintre oricare variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative
Varianta
i pentru vierii PIC lucrurile stau la fel, n acest caz att adaosul de vitamine C 200 M +
E 400 M ct i luteina 10 M nregistrnd valori semnificativ superioare amestecului C 200 M
+ E 400 M + lutein 10 M.
Tabelul 6.
Procentul de mobilitate a spermatozoizilor provenii de la vierii PIC, crioconservai
n mediu cu amestecuri de antioxidani
Vierii PIC (MediaESM)
Timp de evaluare
5 min
10 min
30 min
1h
2h
291.87
302.23
361.87
273.00
183.00
Martor (M)
441.00a 471.22a 531.22a 481.22a 431.22a
Lutein 10 M (L10)
461.00a 471.22a 531.22a 471.22a 431.22a
C 200+E 400 M (C200+E400)
C 200+E 400+Lutein 10 M (C200+E400+L10) 402.23a 412.44a 452.23a 402.23a 341.00b
*Diferenele pe coloan dintre oricare variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative
Varianta
Este posibil ca cei trei antioxidani adugai mpreun n concentraiile amintite anterior
s depeasc cantitatea optim, devenind uor toxici prin reacii pro-oxidante pentru materialul
seminal de vier. Chiar dac rezultatele nregistrate pentru cele 2 variante, lutein 10 M,
respectiv C 200 M + E 400 M, nu prezint diferene asigurate statistic, ntre ele exist o
diferen, aceea c luteina 10 M are o dinamic uniform i independent de factori precum
rasa sau individul, ceea ce ne face s spunem c mediul pe baz de lactoz, glbenu de ou,
glicerol i Orvus es paste, suplimentat cu 10 M lutein, pe care noi l-am preparat pentru prima
dat la nivel mondial, reprezint mediul universal cel mai potrivit pentru crioconservarea
materialului seminal de vier, cu importan major n viitorul nsmnrilor artificiale la suine,
att n Romnia, ct i n strintate.
5.6. DETERMINAREA INTEGRITII FUNCIONALE A SPERMATOZOIZILOR DE
VIER CRIOCONSERVAI
5.6.1. Material i metod
Materialul seminal a provenit de la aceiai 6 vieri descrii i prezentai fiecare n parte cu
fotografie n subcapitolul 5.1.1. din tez. Recoltarea materialului spermatic, evaluarea imediat
dup recoltare a acestuia cu privire la volumul fraciunii spermatice, concentraia, determinarea
mobilitii, a procentului de aglutinare, a osmolaritii, pH-ului, aspectelor morfologice,
protocolul de crioconservare i metoda de analiz statistic au fost aceleai ca i cele de la
subcapitolul 4.3.1. menionate anterior n tez. Antioxidanii folosii pe perioada cercetrilor au
fost: acidul ascorbic (vitamina C), -tocoferolul (vitamina E) varianta hidrosolubil Trolox i
luteina, procurai de la SIGMA Aldrich, Germania. Antioxidanii au fost adugai n mediul de
crioconservare a spermei, imediat dup diluia cu LEYGO, la 5C. Pentru determinarea
integritii funcionale a fost utilizat testul HOST (Hypo Osmotic Swelling Test). Acestui tip de
Ing. VARO GHIURU Florin
34
examinare au fost supuse doar variantele experimentale care au evideniat rezultate bune pentru
testul mobilitii spermatozoizilor dup decongelare i anume:
Martor (fr adaos)
C 200 M, E 200 M,
C 200+E 200 M, C 200+E 400 M,
Lut 5 M, Lut 10 M, Lut 20 M, Lut 40 M,
C 200+E 400+Lut 10 M.
5.6.2. Rezultate i discuii
Rezultatele cercetrilor noastre privind rspunsul HOST al spermei de vier crioconservate
evideniaz efectul benefic al adaosului de antioxidani n mediul pe baz de lactoz i glbenu
de ou. n varianta martor, n care nu s-a folosit niciun antioxidant, s-a ntlnit numrul cel mai
mic de celule spermatice cu rspuns HOST pozitiv, adic cu membran integr i funcional, i
anume 14,67%.
Tabelul 7.
Procente de spermatozoizi crioconservai HOST pozitivi
Rasa
MediaSD
Bazna Mangalia
PIC
14 a
15 a
15 a
Martor
14,67 0,58 a,d
17 a
16 a
21 a,b
C 200
18 2,65 c,d,g
18 a
16 a
23 a,b
E 200
19 3,61 d,e
25 a
17 a
29,5 a,b
C 200+E 200
23,83 6,33 d,h
28 a
19 a
35,5 b
C 200+E 400
27,5 8,26 b,e,h
17 a
18 a
18,5 a,c
L5
17,83 0,76 a,d,i
27 a
21 a
34,5 b
L 10
27,5 6,76 b,e,f,h
25 a
15,5 a
26 a,b
L 20
22,17 5,80 a,d,f,h
23 a
14 a
26 a,b
L 40
21 6,24 a,d,f,h
28 a
18 a
34 b,c
C 200+E 400+L 10
26,67 8,08 b,e,f,g,h,i
*Diferenele pe coloan dintre oricare variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative
Varianta
Variantele pentru care s-au nregistrat cele mai bune rspunsuri HOST, adic cei mai
muli spermatozoizi funcionali, sunt aceleai ca i cele care au evideniat cele mai bune procente
ale mobilitii spermei dup decongelare, fapt ce coreleaz aceste dou teste. Aadar, dac ntre
varianta amestecului de vitamina C 200 M i E 400 M i cea cu adaos de lutein n
concentraie 10 M nu sunt diferene semnificative din prisma procentului de mobilitate, acelai
lucru se poate spune i n cazul testului hipoosmotic, unde ambele variante au obinut un procent
egal de 27,5% spermatozoizi HOST pozitivi, mult mai ridicat dect al martorului, 14,67%.
Studiind i factorul ras, se poate spune c la congelarea clasic, procentul HOST este
aproximativ acelai att la hibrizii PIC ct i la Bazna i Mangalia. ns efectul benefic al
adaosului de antioxidani este evident mai pronunat la PIC, urmnd n ordine descresctoare
Bazna, apoi Mangalia. La vierii PIC mbuntirile aduse de ctre cele mai bune variante fa de
martor au valori cu 20,5% mai mult n cazul amestecului C 200+E 400 M i 19,5% n cazul
luteinei 10 M, la Bazna cu 14%, respectiv 13%, iar la Mangalia cu 4%, respectiv 6%. O
explicaie a acestui fapt este c o ras mai rustic, aa cum este Mangalia, nu prezint o
sensibilitate la fel de mare ca i rasele ameliorate sau hibrizii de carne, ca n cazul PIC. Corelnd
evaluarea mobilitii cu evaluarea integritii membranare HOST, variantele optime sunt
amestecul de vitamine C 200+E 400 M i adaosul de lutein n concentraie 10 M, care
conduc la aceleai rezultate n ambele cazuri. Datorit rezultatelor semnificativ mai slabe
obinute pentru varianta amestecului C+E+lutein din punct de vedere al mobilitii, aceasta nu
35
poate fi considerat o variant optim, dei testul HOST nu arat diferene semnificative ntre
aceasta i celelalte dou variante catalogate anterior.
5.7. DETERMINAREA ANOMALIILOR MORFOLOGICE ALE SPERMATOZOIZILOR DE
VIER CRIOCONSERVAI
5.7.1. Material i metod
Materialul seminal a provenit de la aceiai 6 vieri descrii i prezentai fiecare n parte cu
fotografie n subcapitolul 5.1.1. din tez. Recoltarea materialului spermatic, evaluarea imediat
dup recoltare a acestuia cu privire la volumul fraciunii spermatice, concentraia, determinarea
mobilitii, a procentului de aglutinare, a osmolaritii, pH-ului, aspectelor morfologice,
protocolul de crioconservare i metoda de analiz statistic au fost aceleai ca i cele de la
subcapitolul 4.3.1. menionate anterior n tez. Antioxidanii folosii pe perioada cercetrilor au
fost: acidul ascorbic (vitamina C), -tocoferolul (vitamina E) varianta hidrosolubil Trolox i
luteina, procurai de la SIGMA Aldrich, Germania. Pentru determinarea anomaliilor spermatice
i acrozomiale s-a apelat la metoda Hancock. Variantele studiate au fost aceleai ca i n cazul
determinrii integritii funcionale a spermatozoizilor prin HOST:
Martor (fr adaos)
C 200 M, E 200 M,
C 200+E 200 M, C 200+E 400 M,
Lut 5 M, Lut 10 M, Lut 20 M, Lut 40 M,
C 200+E 400+Lut 10 M.
5.7.2. Rezultate i discuii
n experimentele desfurate pentru a analiza sperma crioconservat din punct de vedere
al aspectelor morfologice, variantele cu adaos de antioxidani n mediul pe baz de lactoz i
glbenu de ou aduc o mbuntire i la acest capitol. Ca rezultat se remarc o cretere a
procentului de mobilitate a spermatozoizilor decongelai, iar funcionalitatea acestora este mult
mbuntit. Variantele experimentale cu valori optime sunt amestecul de vitamine C 200+E
400 M, cu procente ale anomaliilor acrozomale de 21,5% la Bazna i 21% la Mangalia i PIC,
i cea cu adaos de lutein 10 M, cu valori de 21,25% la Bazna, 21,5% la Mangalia i 14,25% la
PIC, rezultate foarte bune n comparaie cu martorul de 33% Bazna, 34% Mangalia i 31% la
PIC. Aadar, influena cea mai mare se observ la hibrizii de carne, cu o diferen de 10%,
respectiv 16,75% pentru variantele optime, urmai de Mangalia cu 13%, respectiv 12,5%, apoi
de Bazna cu diferene de 11,5% i 11,75%.
Tabelul 8.
Rezultatele obinute n urma aplicrii testului Hancock la sperma crioconservat
Total anomalii %
Rasa Bazna
Rasa Mangalia
Hibrizii PIC
Martor
C 200
E 200
57
43
55
35
33,5
35
31,75
31
29,5
C 200
+
E 200
35
35
33
C 200
+
E 400
28,75
32
28
L5
L 10
L 20
L 40
31,25
36
31,25
26,25
27
26,25
29,75
31.75
28,25
31,75
32,75
31,75
C 200+
E 400+
L 10
30,75
31,5
40,5
36
Tabelul 9.
Variantele cu diferene statistice evideniate n urma aplicrii testului Hancock la sperma
crioconservat
Varianta
Martor vs. C 200
Gradul de semnificaie
Bazna Mangalia PIC
***
ns
*
***
ns
***
ns
***
**
****
****
***
Martor vs. L 5
****
ns
**
Martor vs. L 10
****
****
****
Martor vs. L 20
****
****
***
Martor vs. L 40
***
****
**
ns
ns
Deci, vorbind din nou de factorul ras, se remarc rusticitatea Mangaliei, dar i a Baznei
i totodat sensibilitatea materialului seminal provenit de la hibrizii de carne, mult ameliorai.
Corelnd toate trei testele, cel al mobilitii, cel al integritii membranare HOST i cel al
identificrii procentului i tipurilor de anomalii prezente, Hancock, rezult c variantele pentru
crioconservarea materialului seminal de vier rmn amestecarea i adugarea de acid ascorbic
200 M i -tocoferol Trolox 400 M n mediul pe baz de lactoz i glbenu de ou i de
asemenea adaosul de lutein 10 M n acelai tip de mediu, deoarece conduc la obinerea de
rezultate optime, fr diferene semnificative ntre ele. Din cercetrile efectuate se observ c
antioxidanii acioneaz protectiv ndeosebi asupra uneia dintre categoriile de anomalii
acrozomale i anume acrozomul n detaare, care apare cu cea mai mare frecven la martor.
Celelalte tipuri de anomalii ale celulelor spermatice nu vor fi discutate, deoarece ele nu in de
procesul de crioconservare n sine, ci mai mult de spermatogenez. Pentru exemplificare, vor fi
prezentate mai jos imagini surprinse cu ajutorul unei camere digitale conectat la microscop.
Aceste fotografii surprind spermatozoizi cu diferite anomalii acrozomale, incapabili de a efectua
procesul de fecundare, dei sunt mobili.
5.8. DETERMINAREA INDICELUI DE FRAGMENTARE A ADN-ULUI
SPERMATOZOIZILOR DE VIER CRIOCONSERVAI
5.8.1. Material i metod
Materialul seminal a provenit de la 2 vieri din rasa Bazna i 2 vieri din rasa Mangalia,
descrii i prezentai fiecare n parte cu fotografie n subcapitolul 5.1.1. din tez. Recoltarea
materialului spermatic, evaluarea imediat dup recoltare a acestuia cu privire la volumul
fraciunii spermatice, concentraia, determinarea mobilitii, a procentului de aglutinare, a
osmolaritii, pH-ului, aspectelor morfologice, protocolul de crioconservare i metoda de
analiz statistic au fost aceleai ca i cele de la subcapitolul 4.3.1. menionate anterior n tez.
Antioxidanii folosii au fost: acidul ascorbic (vitamina C), -tocoferolul (vitamina E) varianta
hidrosolubil Trolox i luteina, procurai de la SIGMA Aldrich, Germania. Determinarea
indicelui de fragmentare a ADN-ului (DIF) s-a efectuat cu ajutorul unui kit de colorare SpermSus-Halomax de la Halotech DNA (ChromaCell SL, Madrid, Spania) cu urmtorul coninut: 25
lame pretratate, 25 flacoane cu agaroz cu topire lent, un flacon 200 ml soluie de liz pe baz
de -mercaptoetanol, cu care se lucreaz n hot sau ni, i dou flacoane cu colorani A i B.
Materiale necesare neincluse n kit au fost: microscop optic, frigider la 4C, baie de ap la 37C,
mnui de latex, lamele, micropipete, recipient de plastic pentru incubri orizontale, ap distilat,
Ing. VARO GHIURU Florin
37
etanol 70%, 90% i 100%. Datorit existenei rezultatelor din studiile anterioare, mai ales ale
celor obinute n urma determinrii anomaliilor spermatice prin metoda Hancock, care au
concretizat deja variantele pozitive cu adaos de antioxidani n diluantul pentru congelare a
spermei de vier, la realizarea studiului actual s-au urmrit doar aceste variante i anume:
- martorul (fr adaos de antioxidant)
- Trolox (vitamina E) 200M
- amestecul de vitamine C 200+E 400 M
- lutein 10 M
5.8.2. Rezultate i discuii
Kitul de colorare Sperm-Sus-Halomax, descris la material i metod, are ca fundament
protocolul SCD (Sperm Chromatin Dispersion) ce se bazeaz pe rspunsul difereniat al
nucleilor spermatozoizilor de vier, fragmentai sau nefragmentai, n momentul n care sunt
supui unui tratament de deproteinizare. Extracia proteinelor nucleare din spermatozoizii cu
ADN fragmentat elibereaz fragmentele de ADN, iar cromatina este dispersat de jur mprejur,
formnd un halou periferic colorat. Cu ct indicele de fragmentare al ADN-ului este mai mare
(grad 2 sau 3), cu att haloul este mai mare. Dac nu exist ADN fragmentat, haloul este mic sau
inexistent. Un spermatozoid fr halou (grad de fragmentare 0 sau 1) este un spermatozoid cu
ADN integru, nefragmentat, capabil de fertilizare.
Tabelul 10.
Valorile indicelui de fragmentare a ADN-ului spermatic, exprimate n procente
MediaSD
Martor
E 200
C 200+E 400
L 10
Bazna
20,251,75a 16,631,51a,c
141,85b,c
13,881,55b,c
Mangalia 20,373,62a 18,624,47a,c 14,123,22b,c 13,753,49b,c
*Diferenele pe linie dintre oricare variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative
Rasa
38
Aportul de vitamina C are un efect benefic mai pregnant independent de ras asupra
spermatozoizilor cu mobilitate mai sczut dup decongelare.
Luteina este singurul antioxidant, dintre cei 3 studiai, cu aceeai influen pozitiv
asupra materialului spermatic crioconservat, independent de ras sau individ.
39
3.
ntocmirea spermogramei uzuale imediat dup recoltarea materialului seminal este
necesar deoarece reprezint cel de-al doilea criteriu important pentru admiterea vierilor i
ejaculatelor la recoltare i respectiv prelucrare n vederea crioconservrii.
4.
Diluantul pentru stocare de scurt durat preparat de noi nu are influen negativ asupra
crioconservrii materialului seminal provenit de la hibrizii PIC i rasele Bazna i Mangalia, dar
este mai ieftin.
5.
Diluanii LEY i LEYGO dau rezultate superioare diluanilor pe baz de fructoz n
crioconservarea spermei de vier, independent de materialul biologic utilizat.
6.
mpaietarea n paiete de 0,25 ml sau 0,5 ml nu influeneaz rezultatele crioconservrii.
7.
Sigilarea paietelor cu dopuri de polivinil alcool este metoda preferat datorit rezultatelor
bune privind pstrarea mobilitii spermatozoizilor i a numrului mai mare de paiete integre
dup decongelare, n raport cu metoda bilelor metalice.
8.
Aciunea antioxidanilor adugai n mediul de crioconservare determin creterea
procentului de spermatozoizi mobili, protejeaz membranele, reduce anomaliile acrozomale i
morfologice, dup decongelare.
9.
Durata de pstrare a calitii spermatozoizilor crioconservai la valori impuse de utilizarea
spermei pentru inoculare este mai mare n cazul adaosului de antioxidani. La rasele Mangalia i
Bazna, acest efect al antioxidanilor este mai ridicat comparativ hibrizilor PIC, independent de
momentul controlului.
10.
Aciunea antioxidanilor este mai pregnant, independent de ras, n cazul
spermatozoizilor cu mobilitate sczut dup decongelare.
11.
Concentraiile optime de antioxidani adugate separat la mediul de congelare sunt de 200
M vitamina C, 200 M vitamina E.
12.
Concentraia de 10 M lutein n mediul de crioconservare a spermei de vier duce la
obinerea celor mai bune rezultate, cu privire la mobilitate, integritatea membranar, a ADN-ului
i apariia anomaliilor acrozomale. Totodat, luteina este singurul antioxidant, dintre cei 3
studiai, a crui influen este independent de ras sau individ i este uniform.
13.
Amestecul de vitamine n varianta C 200 M + E 400 M are aciune complementar,
rezultatele evalurilor fiind caracteristice spermatozoizilor crioconservai care au capacitate
fecundant ridicat.
14.
Suplimentarea amestecului C 200 M + E 400 M cu 10 M lutein nu mbuntete
calitatea spermatozoizilor de vier crioconservai, comparativ variantei C 200 M + E 400 M,
independent de ras sau individ.
15.
Dinamica pstrrii calitii spermatozoizilor crioconservai, asigurat de antioxidani este
mai mare la sperma provenit de la vierii Mangalia, urmai de Bazna i PIC.
40
BIBLIOGRAFIE SELECTIV
1. Bogdan Dorina (1993) Curs de tehnologia nsmnrilor artificiale, ediia a II-a
revzut, Ed. Tipo Agronomia, Cluj-Napoca.
2. Breininger Elizabeth, Norma B. Beorlegui, C. OFlaherty, Martha T. Beconi, 2005
Alpha-tocopherol improves biochemical and dynamic parameters in cryopreserved boar
semen, Theriogenology, 63:2126-2135.
3. Ciobanu D.C., A.E. Day, A. Nagy, R. Wales, M.F. Rothschild, G.S. Plastow, 2001
Genetic variation in two conserved local Romanian pig breeds using type 1 DNA
markers, Genet Sel Evol., 33(4):417-32.
4. Dinu Veronica, E. Trua, Elena Popa-Cristea, Aurora Popescu, 1996 Biochimie
medical. Mic tratat, Editura Medical, Bucureti.
5. Hettig Andrea, V. Miclea, M. Zhan, I. Roman, Ileana Miclea, 2010 The Influence of
Exposure Time to Ethylene Glycol on Immature Swine Oocytes Vitrification, Buletin
USAMV Animal Science and Biotechnologies, 67: 487.
6. Hettig Andrea, V. Miclea, M. Zhan, I. Roman, Ileana Miclea, M. Botha, A. Rusu, F.
Varo-Ghiuru, 2011 Vitrification of Immature Swine Oocytes by the SSV Technique
using Different Concentration of Cryoprotector and Exposure Time, Buletin USAMVB
Timioara, Animal Science and Biotechnologies, 44:336-339.
7. Ladoi Ioan, 1999 Embriotehnologie animal, Ed. Victor Melenti, Cluj-Napoca
8. Miclea Ileana, 2010 Efectul utilizrii unor antioxidani n mediile de maturare a
ovocitelor i de cultur a embrionilor, Tez de doctorat, Universitatea de tiine Agricole
i Medicin Veterinar Cluj-Napoca.
9. Miclea Ileana, Andrea Bunea, M. Zhan, V. Miclea, 2007 The isolation, analysis and
testing of sea buckthorn carotenoids on murine macrophage cultures, Lucrri tiinifice
Zootehnie i Biotehnologii-Simpozionul Creterea animalelor n perspectiva unei
agriculturi sustenabile, ISSN 1221-5287, 40(1):140-145.
10. Miclea Ileana, M. Zhan, A. Rusu, F. Ghiuru, V. Miclea, 2009 The effect of several
ascorbic acid concentrations on swine oocyte maturation and embryo culture, UASVM
Ion Ionescu de la Brad Iai, Lucrri tiinifice, Seria Zootehnie, ISSN 1454-7368,
52 (14):35-40.
11. Miclea V., 1997 Biologia reproduciei i nsmnri artificiale, partea I, Ed. Tipo
Agronomia, Cluj-Napoca
12. Miclea V., 2003 nsmnarea artificial la animalele de ferm, Ed. Argonaut, ClujNapoca.
13. Miclea V., M. Zhan, Ileana Miclea, Elena Iliiu, A.L. Rusu, F. Varo-Ghiuru, 2011a
Effect of freezing on spermatozoa from Tigaie rams belonging to the mountain ecotype,
Bulletin of USAMB TIMIOARA , Scientific Papers: Animal Science and
Biotechnologies, 44 (1): 297-299.
14. Miclea V., M. Zhan, S. Nagy, Ileana Miclea, A.L. Rusu, F. Varo-Ghiuru, 2011b
Freezing of spermatozoa from Tigaie rams belonging to the hill ecotype, Bulletin of
USAMB TIMIOARA , Scientific Papers: Animal Science and Biotechnologies, 44 (1):
294-296.
15. Mirean Vioara, Adel Ersek, Maria Camelia Rducu, 2003 Fiziologia animalelor
domestice. Ed. Risoprint Cluj-Napoca.
16. Mirean Vioara, 2009 Anatomie Comparat Histologie i Embriologie, Editura
Academicpres, Cluj-Napoca.
Ing. VARO GHIURU Florin
41
17. Moa Cristina, Ana Rou, Gh. Cmpeanu, 2002 Compui bioactivi de origine vegetal.
Abordri biotehnologice n: Cmpeanu, Gh., I. F. Dumitru, Progrese n biotehnologie,
vol. 2, Editura Ars Docendi, Bucureti, 107-118.
18. Murean Adriana, Irina Chi, C. Login, Camelia Alb, oimia Suciu, Adriana Filip,
Nicoleta Decea, 2007 In vivo studies on protective effect of exogenous antioxidants
during normal gestation, USAMV-CN Bulletin, 64(1-2):193-197.
19. Neamu G., Gh. Cmpeanu, Carmen Socaciu, 1993 Biochimie vegetal (partea
structural), Editura Ceres, Bucureti.
20. Pcal N., 1998 Transferul de embrioni la mamifere, Edit. Helicon, Timioara, ISBN
973-574-535-6.
21. Pcal N., 2000 Biologia reproducerii animalelor, Edit. Mirton, Timioara, ISBN 973585-146-6.
22. Rusu A.V., 2011 Evaluarea aciunii unor componeni din diluant asupra stocrii i
crioconservrii spermei de vier, Tez de doctorat. Universitatea de tiine Agricole i
Medicin Veterinar Cluj-Napoca.
23. Socaciu Carmen, R. Jessel, H.A. Diehl, 2000 Competitive carotenoid and cholesterol
incorporation into liposomes: effects on membrane phase transition, fluidity, polarity and
anisotropy, Chemistry and Physics of Lipids, 106:79-88.
24. Tma V., G. Neamu, 1986 Pigmeni carotenoidici i metabolii, vol I., Editura Ceres,
Bucureti.
25. Tploag P.R., 2011 Metode de intensivizare i eficien a reproduciei la suine i
taurine, Editura Granada, Bucureti, ISBN 978-606-8254-08-1.
26. Tploag P.R., A. onea, A. Iancu, Elena Mitrnescu, 2013 Researches regarding age,
breed and collecting season influence in quality and quantity boars semen, Scientific
Papers. Series D. Animal Science. Vol. LVI, ISSN 2285-5750; ISSN CD-ROM 22855769; ISSN-L 2285-5750.
27. Varo-Ghiuru F., I. Ladoi, I. Roman, Andrea Hettig, M. Zhan, V. Miclea, 2010 Antioxidant Medium For Mangalitza Boar Semen Cryopreservation, Bulletin UASVM
Animal Science and Biotechnologies, 67(1-2):445-451.
28. Varo-Ghiuru F., V. Miclea, Ileana Miclea, M. Zhan, Andrea Hettig, L. Crlea, 2011
The Effect of Lutein Added in the Mangalitza Boar Cryopreserved Semen Media,
Bulletin UASVM Animal Science and Biotechnologies, 68(1-2):443.
29. Varo-Ghiuru F., V. Miclea, Ileana Miclea, M. Zhan, Andrea Hettig, L. Crlea, 2011 The Influence of Ascorbic Acid and Alpha-Tocopherol in the Mangalitza Boar Semen
Cryopreservation Media, Bulletin UASVM Animal Science and Biotechnologies, 68(12):444.
30. Westendorf P., L. Richter, H. Treu, 1975 Tierfgefrigerung von Ebersperma: labor und
besamungsergebinsse mit dem Hlsenberger Pailleten Verfahren; Deutsche Tierarzt.
Wschr., 82:261-267.
31. Zhan M., F. Varo-Ghiuru, A. Hettig, I. Miclea, V. Mirean, I. Roman, V. Miclea, 2012
Improving quality of frozen-thawed Mangalitsa boar semen using different antioxidants
supplementation, Reproduction in Domestic Animals, 47(5):115.
32. Zhan M., V. Miclea, F. Ghiuru, I. Roman, A. Rusu, Ileana Miclea, M. Mihilescu, 2010
The Influence of Freezing on Some Rare Breeds Boar Semen Cryopreservation,
Bulletin UASVM Animal Science and Biotechnologies, 67(1-2).
42