Sunteți pe pagina 1din 27

Marius Bojita

Robert Sandulescu

Liviu Roman
Radu Oprean

UNIVERSITATEA DE MEDICINASl FARMACIE


JULIU HATIEGANU" CLUJ-NAPOCA

Volumul 2. Metode instrumentale in analiza


si controlul medicamentelor

Editura Intelcredo
DEVA

2003

ISBN 973-8197-15-5
Copyright Intelcredo 2003

Publicata de Intelcredo SA 2700-Deva


Editura tel: 0264/594914 FAX: 0264/594914
Serv. comercial tel. 0722-234058

INTRODUCERE

Toale drepturile asupra acestei lucrari apartin autorilor si editurii Intelcredo S.A.
Deva.
Nici o parte din acest volum nu poate fi copiata sau transmisa prin nici un mijloc,
electronic sau mecanic, inclusiv fotocopiere, inregistrare audio sau prin orice alt
sistem de stocare si redare a informatiei, fara permisiunea scrisa din partea autorilor
si editurii Intelcredo Deva.

T,tya?ita in

prin Intelcredo SA Deva si Imprimeria Ardealul Cluj-Napoca

Lucrarea execulata
la Imprimeria ,,ARDEALUL" Cluj
B-dul 21 Decembrie nr. 146 Cluj-Napoca
Tel.: 413871; Fax: 413883
Comanda nr. 3077/2003

Lucrarea Analizas. i controlul medicamentelor" afost conceputa in dona volume,


dintre care primul trateaza problematica generala a analizei si controlului medicamentelor, aducand in discufie cele mai noi date referitoare la calitatea s.i siguranta
medicamentului. Aceste aspecte includ date specifice privind prelevarea si esantionarea
probelor de inedicamente si pretratamentul lor pana la faza de masurare a semnalului
analitic. De asemenea, o importanta aparte s-a acordat In volumul 1 stabilitatii medicamentelor, normelor, cerintelor si performantelor actuate in domcniul analizei si
controlului inedicarnentelor in conexiune cu legislatia nafionala, a Comunitatii
Europene, a SUA si Japoniei, a OMS etc.
In prezent nu se poate vorbi de calitatea si siguranja medicamentelor fara o inalta
calitate profesionala a specialistilor din acest domeniu. Calitatea presupune pe de o parte
multa stiinja, iar pe de alta parte multa constiinta. lar stiinta implica o mare cantitate de
informatie, care asigura profesionalismul specialistilor care lucreaza in acest domeniu,
iar constiinfa impune responsabilitate, onestitate si o Tnalta moralitate. Aceste concepte
sunt formulate sub forma unor criterii dc calitate si acceptanta a calitatii medicamentelor, de acreditare a laboratoarelor de analizS si control si de atestare a competentei
speciaiistilor.
In elaborarcaacestui al doilea volum, care poarta subtitlul ,,Metode instnimentale
de analiza si control" s-a tinut seama de programa analitica in vigoare a acestei specialitati si de evolu{ia tehnologica a instrumentelor de masurare, de progresele rapide
din domeniul electronicii si informaticii in general si information analitice in particular.
Aceasta lucrare se bazeaza pe experienta acumulata de autori in cateva dcccnii de
activitate in invatamantnl farmaceutic romanesc, considerand ca cine nu cunoaste
problematica generala a analizei (calitative si cantitative), bazele teoretice si practice ale
acesteia, nu poate intelege procesele complexe care stau la baza metodelor instrumenlale
moderne. Multora dintre speciali^ti le ,,scapa" faptul ca peste 90% din cuantumul erorii
finale a unei analize se datoreaza esantionarii si pretratainentului probelor in etapele ce
premerg masiiratoarea analitica propriu-zisa. Far aceste erori sunt in mare masura erori
personale ale celor care lucreaza, datorandu-se In principal neatenjiei si lucrului neingrijit.

Pentru a veni Tn sprijinul Tnfelegerii si cunoasterii metodelor de analiza instrumeiitala, pentru fiecare tip de metoda se expun principiile tcoretice, aparatura, principalii
parametri operational! si importanfa lor, avantajele si limitele metodelor tratate, ca si
aplicatiile lor, in primul rand in analiza si controlul mcdicamenlelor. De asemenea, sunt
expuse si unele date referitoare la selectivilalea, exactitatca, precizia si sensibilitatea lor,
in comparatie cu alte metode, cu sublinierea necesitatii de a sc asigura Tntotdeauna un
raport costuri/beneficii acceptabil, iar in acest context si necesitatea reducerii lucrului/probS.
Desi acest volum include o mare cantitate de informajii, acestea sunt tratate intr-o
maniera inteligibila pentru a putea f i infelese si asimilate. Pe dc alta parte, aceasta lucrare
ofera o baza teoretica si practica polivalenta, adaptata cerintelor si exigentelor actuale
ale analizei si controlului de medicaments.
Ambele volume ale lucrarii ,,Analiza si controlul medicamentelor" se adreseaza
in primul rand sttiden}ilor facultatilor $i colegiilor de farmacie, dar ele sunt utile prin
problematica tratata si pentru studentii facultatilor de cliimie, de chimic alimentara etc.
cat si pentru cloctoranzii din aceste domenii, pentru cercetatori i cadre didactice universitare, inclusiv din domeniile biomedicale.
Aducem calde multumiri tuturor celor care ne-au sprijinit in elaborarea acestei
lucrari, Tntre care Agentia Nationala a Medicamentului, sponsorilor nostri si colegilor
apropiaji.
Cluj-Napoca
Decembrie 2002
Autorii

CUPRINS

CUPRINS
1NTRODUCERE
ABREVIERI
CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APL1CAT1I IN ANALIZA SI
CONTROLUL MEDICAMENTELOR
1.1. Notiuni generale
1.2. Bazele teoretice ale cromatograf iei
1.2.1. Parametri i cromatograf ici
1.2.2. Eficacitatea coloanei cromatograf ice
1.2.3. Simetria picurilor si modificarea formei lor
1.2.4. Largirea picurilor si dilutia cromatografica
1.2.5. Rezolutia separarii cromatografice
1.2.6. Detectia analitilor separaji cromatografic
1.2.7. Aplicafiile metodelor cromatografice
1.3. Cromatografia de lichide de inalta performanta
1.3.1. Cromatografia HPLC pecoloana
1.4. Unele preocupari actuale privind optimizarea continua a metodelor
cromatografice de analiza
1.4.1. Dezvoltarea fazelor stationare pe baza de carbon poros grafitat
1.4.2. Utilizarea in HPLC a unor faze stationare cu acces restrictiv
1.4.3. Aplicatii ale HPLC pe coloane DiscoveryCIS si RP-Amide C16
in analiza si controlul medicamentelor
1.4.4. Cresterea eficientei separarilor de medicamente utilizand dona
coloane cu sistem de comutare rapida si gradienti
1.4.5. Separari cromatografice ale moleculelor chirale
1.5. Electrocromatografia capilara (CEC)
1.5.1. Cuplajul electrocromatografiei capilare cu spectrometria de masa
1.6. Cromatografia cu fluide supercritice (SFC)
1.7. Cromatografia de excludere sterica
1.7.1. Notiuni generale. Definite, clasificare, tipuri de geltiri
1.7.2. Mecanismul separarii pe geluri. Parametrii mai impoftanti
1.8. Cromatografia de scliimb ionic
1.8.1. Definitia si structtira schimbatorilor de ioni
1.8.2. Proprietati fizico-chimice ale schimbatorilor de ioni.....

3
12

17
17
26
26
44
50
53
55
62
63
65
66
77
77
79
85
96
104
115
122
127
139
139
146
155
155
159

CUPRINS

1.8.3. Deplasarea echilibrelor de schimb ionic si factorii care o


influenteaza
1.8.4. Fenomenul Donan
1.8.5. Modul de operare in ioncromatografie
1.9. Cromatografia planara
1.9.1. Cromatografia pe hartie
1.9.2. Cromatografia pe strat subtire (CSS)
1.9.3. Evaluarea densitometrica a cromatogramelor CSS
1.10. Cromatografia de gaze
1.10.1. Definite. Aparatura
1.10.2. Coloane, faze stationare si mobile
1.10.3. Conditii de operare in Cromatografia de gaze
1.10.4. Detector! utilizati in Cromatografia de gaze
1.10.4.1. Detectori.il de conductibilitate termicS
1.10.4.2. Detectorul cu ionizare In flacarS
1.10.4.3. Detectoul termoionic
1.10.4.4. Detectorul prin fotometrie de flacara
1.10.4.5. Detectorul cu captura de electron!
1.10.5. Aplicatii ale cromatografiei de gaze In controlul medicamentului
1.10.6. CuplaJLiI GC-MS pentru analiza rapida in radiatii moleculare
supersonice
1.10.7. Cuplaju) LC-GC
1.10.8. Cuplajul HPLC-HRGC
CAPITOLUL 2. ELECTROFOREZA
2.1. Notiuni introductive
2.2. Electroforeza zonala...
2.3. Factorii care influenteaza electroforeza
2.4. Imunoelectroforeza
2.5. Electroforeza prin izofocalizare
2.6. Electroforeza bidimensionala
2.7. Electroforeza capilara
2.7.1. Electroforeza capilara zonala
2.7.2. Electroforeza capilara micelara
2.7.3. Electroforeza capilara pe gel
2.7.4. Separarea enantiomerilor prin CE in contracurent
2.7.5. Aplicarea electroforezei capiiare in analiza ?i controlul
medicamentelor ilicite
:
2.7.6. Separari CE chirale

162
163
165
173
173
:. 174
188
198
198
202
209
213
213
215
216
217
218
221
226
234
237
240
240
243
245
250
251
252
252
256
257
258
259
264
277

CUPRINS

2.7.7. Utilizarea electroforezei, in preconcentrarea tinor medicamente


prin bio sau imunoafinitate

281

CAPITOLUL 3 NOTIUNI GENERALE REFERITOARE LA METODELE


OPTICE SPECTRALE DE ANALIZA
289
CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE [N ULTRAVIOLET
SI IN VIZIBIL
296
4.1. Oomeniul spectral UV - VIS. Originea absorbtiei
4.2. Absorbtia luininii. Tranzitii electronice
4.3. Producerea culorii. Cromofori. Solvatocromie.Deplasari bato $i
hipsocrome
4.4. Spectrofotometria UV-VIS
4.5. Legea fundamentals a absorbtiei
4.6. Abater) de la legea Lambert-Beer. Erori datorate instrumentelor
4.7. Determinari cantitative. Curba de calibrare
4.8. Utilizarea spectrelor electronice pentru studii de structural - activitate
4.9. Inregistrarea spectrelor
4.10. Determinarea valorii pK a din masur3tori spectrofotometrice
4.11. Exemple de spectre UV ale unor substan}e inedicamentoase
4.12. Spectrometria derivatS

296
298
302
306
308
310
312
315
318
321
324
327

CAPITOLUL 5 SPECTROMETRIA ATOMICA


5.1. Spectrometria de absorbtie atomica si de emisie atomica in flacara
5.2. Spectrometria de absorbtie atomica electrotermala
5.3. Spectrometria atomica de emisie in plasma
5.4. Aplicatii ale spectrometriei atomice

333
333
338
346
350

CAPITOLUL 6 SPECTROMETRIA IN INFRAROSU


6.1. Regiuni spectrale IR. Moduri de vibratie moleculara .
6.2. Obtinerea spectrelor IR si interpretarea lor
."
6.2.1. Etape in Inregistrarea spectrelor IR
6.2.1.1. Etape la inregistrarea spectrelor in IR - apropiat
6.3. Spectrometre cu transformare Fourier
6.4. Spectrometria de difuzie Raman
6.5. Intocmirea unei biblioteci de spectre IR de referinfa pentru
medicamente

353
353
356
362
365
366
373
...382

CUPRINS

CAPiTOLUL 7 SPECTROFLUORIMETRIA
7.1. Notiuni generale
7.2. Masurarea intensitalii fluorescentei
7.3. Polarizatia de fluorescenta

383
383
385
394

CAPITOLUL 8 SPECTROMETRIA DE FLUORESCENTA CU RAZE X 400


8.1. Notiuni introductive
400
8.2. Spectrul de fluorescenta X
402
8.3. Detectoare de fluorescenta X
407
8.4. Analizorul cu raze X cu energie dispersive (EDX)
411
CAPITOLUL 9 SPECTRE DE M1CROUNDE
9.1. Studiul cantitativ al energiei de rotatie

415
..415

CAPITOLUL 1 0 METODE OPTICE NESPECTRALE

420

I O . I . Polarimetria
I O . I . I . Notiuni generale
l O . l . l . l . Lumina polarizata

420
420
420

10.1.2. Stereoizomerie, enantiomeri


I O.I.3. Polarimetrul
10.2. Dispersia rotatorie
10.3. Dicroismul circular
10.4. Refractometria
10.5. Turbidimetria sj nefelornetria

422
425
429
431
432
440

CAPITOLUL 1 1 SPECTROMETRIA DE WIASA


11.1. Notiuni generale
11.2. Apar'atura. Spectrometrul de masa
11.3. Procedee de fragmentare a moleculelor
11.4. Detectoare
1 1.5. Performanfele spectrometrelor de masa
11.6. Tipuri de analizoare de masa
11.6.1. Analizorul cu camp magnetic
11.6.2. Analizorul electromagnetic
1 1.6.3. Analizori cu capcane de ioni
11.6.4. Analizorul cu filtru cvadrupol
11.6.5. Analizorul cu timp de zbor
11.7. Unele aplicatii analitice ale spectrometriei de masa

445
445
446
448
455
456
458
458
459
460
462
464
466

CUPRINS

11.7.1. Cuplajul gazcromatografie-spectrometrie de masa (GC-MS)


11.7.2. Cuplajul cromatografie de lichide-spectrometrie de masa
(UPLC-MS)
11.7.3. Identificarea unei molecule de analit
11.7.4. Determinarea formulelor brute
11.7.5. Stabilirea formulei moleculare
11.7.6. Utilizarea spectrometriei de masa in analiza cantitativa
11.7.7. Delerminarea rapoartelor izotopice
11.7.8. Identificarea unui compus cu ajutorul spectrotecii MS
11.7.9. Alte aplicatii ale spectrometriei de masa in analiza ?i controlul
medicamentelor
CAPITOLUL

467
469
472
473
474
478
479
481
....482

12 SPECTROMETRIA DE REZONANTA MAGNETICA

NUCLEARA
12.1. Producerea spinului nuclear
12.2. Absorbtia de radiatii s.i variatia energiei.
12.3. Grupuri sau populatii de nuclee
12.4. Ecuatia Larmor
12.5. Deplasarea chimica si relaxarea
12.6. Deplasarea chimica si masurarea ei
12.7. Factorii care influenteaza deplasarea chimica
12.8. Cuplajul spin-spin si structura hiperfina
12.8.1. Cuplajul heteronuclear
12.8.2. Cuplaje homonucleave
12.9. Unele aplicatii cantitative ale RMN
12.10. Procedee utilizate in RMN
12.10.1. Rezonan{a magnetica nucleara cu unde continue
12.10.2. Rezonanta magnetica nucleara cu impulsuri
12.10.3. Rezonanfa magnetica nucleara cu rezolutie joasa ...,...,_
12.10.4. Unele date importante in analiza si controlul medicamentelor
CAPITOLUL 1 O METODE ELECTROCHIMICE IN ANALIZA SI
CONTROLUL MEDICAMENTELOR
13.1. Notiuni generale
13.2. Procese redox in electroanaliza
13.3. Titrarea potentiometrica
13.3.1. Montajul in titrarea potentiometrica
13.3.2. Masurarea diferentei de potenfial

489
489
491
495

497
498
501
502
505
506
509
512
516
516
516
517
517

528

528
53 I
536
536
537

CUPRINS

10

13.3.3. Eroti sistematice si aleatoare in titrarea potenfiometricS


13.3.4. Electrozi indicator! si de referinta in titrarea potentiometrica
13.3.4.1. Electrozi indicator!

541
545
545

13.3.4.2. Electrozi de referinta


552
13.3.4.3. Electrozi membrane cationi i anioni selectivi
555
13.3.4.4. Electrozi membrana modificata substante medicaincntoase sensibili569
13.3.5. Senzori microcip de siliciu
571
13.4. VoUamperometria si coulometria
573
13.4.1. Dozarea voltamperometrica
573
13.4.2. Polarografia
576
13.4.2.1. Polarografia la curent contiiiuu
576
13.4.2.2. Polarografia impulsionala (cu impulsuri, pulspolarografia) ... 579
13.4.3. Voltamperometria cu redizolvare anodica (stripping voltainetria)
584
13.4.4. Voltainetria stripping puls diferenjjala adsorbtiva
587
13.4.5. Electrozi pasta de carbon utilizati in metodele voltamperoinetrice.... 589
13.5. Titrarea couloinetrica
596
13.5.1. Coulometria potentiostatica
596
13.5.2. Coulometria galvanostatica
597
13.6. Determinarea coulometrica a apei, Karl Fischer
598
13.7. Aplicatii ale metodelor electroanalitice in analiza si controlul
.602
medicamentelor
CAPITOLUL I 4 METODE DE ANALIZA PRIN MARCAREA
SUBSTANTELOR
14.1. Nofiuni introductive
14.2. Tehnici izotopice de analiza
14.2.1. Marcarea cu un radioizotop
14.2.2. Tehnica imunoenzimatica
14.2.3. Analiza radioimunologica (RIA)
14.2.4. Analiza fluoroimunologica (IFA)
14.2.5. Analiza prin activare neutronica (NAA)
14.2.5.1. Detectia $i dozarea cu un spectrometru NAA
14.2.5.2. Determinarea prin dilutie izotopica
14.2.5.3. Tehnica dozimetrica

"41 IS.
I D WIETODE TERWIICE iN ANALIZA 1 CONTROLUL
MEDICAMENTELOR
15.1. Notiuni introductive
15.2. Analiza termogravimetrica si termogravimetrica derivata
15.3. Calorimetria cu scanare diferentiala (DSC)

608
608
609
609
614
615
616
616
618
619

CUPRINS

15.4. Analiza tennomecanica (TMA)


15.5. Titrare entalpica sail termometrica
15.6. Titrarea calorimetrica izoterma

11

659
667
675

CAPITOLUL 1 6 UTILIZAREA CHEMOMETRIEI IN ANALIZA SI


CONTROLUL MEDICAMENTELOR
677
16.1. Preprocesarea probelor
677
16.1.1.Normalizarea
677
16.2. Netezirea sau curafirea semnalului analitic de zgomotul de fond
680
16.2.1. Curatirea medie
680
16.2.2. Curatirea medie succesiva (continua, ciclica)
681
16.2.3. Curatirea mediana succesivS
682
16.2.4. Curajirea polinomiala succesiva
684
16.2.5. Cura{irea cu filtrul Fourier
685
16.3. Corectia liniei de baza
689
16.3.1. Abordarea prin modelare explicita
689
16.3.2. Derivarea
691
16.3.3. Diferenfa simpla continua (succesiva)
692
16.3.4. Diferen^a medie succesiva (continua)
693
16.3.5. Metoda Savitzky-Golay si metodaGorry
694
16.4. Tipuri de funcjii de calibrare
695
16.4:1. Nivelul unic de calibrare
695
16.4.2. Calibrareanivel tnultiplu (multi-level)
695
16.5. Controlul calitajii formularilor farmaceutice
697
16.5.!. Controlul calitafii formularilor farmaceutice continand
catecolamine
697
16.5.2. Designul statistic experimental aplicat la medicamente
697
16.5.3. Aplicarea designului statistic la determinarea nimesulidei si a
combinafiei diazepam-otiloniu
698
16.5.4. Determinarea CZE a clorhidratului de rufloxacina
699
16.5.5. Utilizareastatisticii variate pentru determinarea altor medicamente..701
16.5.6. Designul Plackett-Burmann
704

620

DICTIONAR TEHNIC DE SPECIAL1TATE

707

CAPITOLUL

622
622
623
634

B1BL1OGRAFIE....

....765

ABREVIERI

12

ABREVIERI
A: AASf = spectrometrie de absorbjie atomica in f lacara
AASe = spectrometrie de absorbtie atomica electrotermala
Ac = acetat
ACP = polarografie la curent alternativ
AdSV = voltamctrie stripping adsorbtiva
AES = spectrometrie atomica de emisie
AFM = microscopie atomica fortata
AMD = developare multipla automata
ANCOVA = sistem de analiza a cqvarianjei
AP = alcalin fosfataza
APC1 = ionizare chimica la presiune atmosferica
ASV = voltametrie stripping anodica
B: BGE = electrolit suport sau de fond (background electrolyte)
BioFETS = biosenzori - tranzistori cu efect de camp
C: CASM = analiza calorimetrica cu microscopie de scanare
CCPE = electrod compozit carbon-polimer
(CC) = suma corectata a patratelor concentratiilor
CCD = project compus central (in designul experimental)
CCS A = analiza stripping la curent constant
CCZE = electroforeza zonaia capilara chirala
CD = ciclodextrine neutre
CDs = ciclodextrine incarcate negativ
CE = electroforeza capilara
CIE = captura interna de electroni in fluorescenja cu raze X
C1EF = concentrare capilara izoelectrica (Capillary isoelectric focusing)
C1T = citrat
CPE = electrod pasta de carbon
(CR) = suma corectata a patratelor produselor incrucisate ale concentrafiilor (C)
si semnalelor analitice (R)
CRM = material standard de referinta
CSV = voltametrie stripping catodica
CUT = test de conformitate al continutului
CVD = depunere chimica de vapori

ABREVIERI

13

D: D (sau Da) = Dalton, imitate de masiira a masei egala cu 1/12 din masa atomului de
"C, utilizata in biologie, microbiologie etc.
DAD = detector cu diode in linie (bareta)
DCV = voltametrie la curent direct
DEG = dietilenglicol
(DF) = suma totala a patratelor gradelor de libertate
DMA = analiza mecanica dinamica
DME = electrod picurator de mercur
DPP = polarografie pulsdiferentialS
DPV = voltametrie pulsdiferentiala
E: EAS = spectrometrie electronica de absorbfie
ECHP =electroforeza capilara de inalta performanta
EC1 = injectie electrocinetica
EDX = energia dispersive a razelor X
EELS = spectroscopie electronica, cu pierdere de energie (a electronului)
EF = electroforeza prin izofocalizare
EIA = analizfi imunoenzimatica (test imunoenzimologic)
ELSD = detector evaporator cu lumina dispersata
EOF = flux electrbosmotic
ERE = eiectrod de referinta extern
ES = extracfie sinergica
ESC = electrod saturat de calomel
ESH (NHE) = electrod saturat de hidrogen (sau normal de hidrogen)
F: FA = analiza frontala
FAB = bombardare cu atomi rapizi (fast atomic bombardment)
FCD = design fafa centrata
f.e.m. = fortS electromotrice (electromotoare)
FFT = filtru de netezire/curatire Fourier, a semnalului analitic (in chemometrie)
FIA = analiza cu injecfic in flux
FR= flavin reductaza
FSOT = coloana tubulara deschisa din silice topita
FTIR = spectroscopie in infrarosu cu transformare Fourier
G: GC = cromatografie in faza gazoasa (gazcromatografie)
GCE = electrod de carbon sticlos (glassy carbon electrode)

14

ABREVIERI

GC-ICP-MS = cuplaj gazcromatografie-plasma cuplala inductiv-spectrometrie de


masa
GC-MS-MS = cuplaj gazcromatografic - masspectrometrie - masspeetrometrie
OFF = glicil-L-fenilalanil-L-fenilanil
GOD = glucozoxidaza
H: HIS = ionizare selectiva hipertermala de suprafata
HPCE = electroforeza capilara de inalta performanta
HMDE = electrod picatura de mercur suspendata/stationara
IIPLC = cromatografie de lichide de inalta performanta
HPTLC = cromatografie pe strat subtire de inalta performanta
HRGC = gazcromatografie de Tnalta rezolujie
I: IDT = analizor cu capcana de ioni (iontrape detector)
IEC = captura interna de electron!
IFA = analiza fluorimunologica (fluorimetric immunologic analysis)
IMS = spectrometru cu mobilitate de ioni
IR = infrarosu (spectroscopie in infrarosu)
IRE = electrod de referinta intern
ISE = electrod ion selectiv (EIS)
L: LAMMA = spectrometru (analizor) de masa cu microsonda
LAMPA = metilpropilamidaacidului lisergic
LC = cromatografie de lichide
LIF = fluorescenta laser - indusa
LLE = eluent organic continuu
LOMO = orbital molecular eel mai putin ocupat
LSD = dietilamida acidului lisergic
LSV = voltametrie cu scanare liniara
M: MALD1 = desorbtia cu ionizare a matricei asistata de laser
MASM = analiza mecano-termala cu microscopic de baleiaj
MCA = analiza multicomponent
MCPE = electrod pasta de carbon mod if icat
MEB = microscopic electronica cu baleiaj
MEKC = cromatografie capilara electrocinetica in mediu micelar
MGCE = electrod de carbon sticlos modificat

ABREVIERI

MS = spectrometrie de masa
(MS) = media totala a patratelor (SS)10(aia/(DF)tot!1|a, in statistica
MTDSC = calorimetria de scanare diferenjiala la temperatura modulata
N: NAA= analiza prin activare cu neutron!
NADH = nicotinamid-adenin dinucleotida, forma redusa
NIST = National Institute for Standards and Technology - USA
NPD = detector termoionic
NPLC = lichid-cromatografie pe faza normala
NPP = polarografie cu puls normal
NPBP = N-propil-p-hidroxibenzoat (standard intern)
O: OES = spectroscopie de emisie optica
OPTLC = cromatografie pe strat subjire suprapresurizata (over pressure TLC)
P: PCA = analiza component principal
PCP = fenilciclidina
,. PDMS -polidimetilsiloxan
PEEK = polietercetona
PET = polietilentereftalat
PLD = depunere puls-laser
PLM = microscopic cu lumina polarizata
PMD = developare multipla programata
PMT = tub fotomultiplicator
PP = fenilfosfat
PPD = polarografie impulsionala diferentiala
PPN = polarografie impulsionala cu puls normal
PPO = polifenoloxidaza
PSA = analiza stripping potentiometrica
PtE = electrod de platina
PTFE = politrifluoretena (teflon)
R: R1A = analiza radioimunologica (test radioimunologic)
RGCE = electrod rotitor de carbon sticlos
RMS = substanta de referinta/standard
RPLC = lichid cromatografie pe faz5 inversa

15

16

ABREVIERI

(RR) = Simla corectata a patratelor semnalelor analitice


RSD = deviajia standard relativa (%)
RSM = metodologia raspunsului suprafefei/ariei (pentru dcterminarea robustejii)
S: SAM = autoasamblare monostrat (cu referire la senzori electrochimici)
SCE = cromatografie de excludere de marline
SCSI = sistem computer mic cu interfata pentru prelucrarea rapida a datelor
SDU = imitate de eliberare (livrare) a solventului (in SPE si si SPME)
SEC = concentrafia electrolitului suport
SEF = factor rapid dc intensificare
SEM-EDX = microscopie cu scanare electronica, cu energie dispersiva a razelor X
SFA = analiza in flux segmentat
SFC = cromatografie cu fluide supercritice
SFE = extracfie cu fluide supercritice
SMBs = radiatii supersonice moleculare
SPE = extractia in faza solida
SPME = microextractia in faza solida
(SS) = suma patratelor regresiilor (aclica a patratelor regresiilor si a mediilor
patratelor reziduale)
(SS)| = SSi = eroarea instrumental^
(SS)L = SSL = eroarea cle neconordanta
(SS)O = SSO = eroarea generala (SS( + SSp + SSL)
(SS)p = SSP = eroarea procedurala (sail de metoda)
T: TLC = cromatografia pe strat subtire
TOF = timp de zbor
TOFA = analiza (analizor) cu timp de zbor
TXRF = spectrometria de fluorescenta cu raze X, cu reflexie totals
U: UV = ultraviolet
UV-V1S = spectrometrie Tn UV si VIS
V: VIS = vizibil
W: WCOT = coloana tubulara deschisa cu perete acoperit
X: XRD = difractie cu raze X

1.1. Notiuni generate


Cromatografia este una din ramurile mari, vaste ale analizei instrunientale cu
aplicatii largi in separarca, detecjia si determinarea substan{elor chimice in general si in
analiza si controlul medicamentelor in particular. Tehnicile cromatografice de analiza
sunt in primul rand tehnici cle separare dintre cele mai selective si mai eficiente. inclusiv
pentru urrnele de substance. Asociate cu metode de detecjie, tehnicile cromatografice sunt
capabile sa sesizeze cantitati infime de substanta, ceea ce le confera o mare sensibilitate
precum i capacitate sigura de clozare pana la nivele cle ppb, ppt, in functie de sensibilitatea detectorului. Tehnicile cromatografice de analiza" se numara printre metodele
instrunientale cele mai performante de analizS, raspunzancl unor cerinfe majore ale
societatii care se pot formula astfel:
- mai repede (citius), deci cu viteza mai mare;
- eficienta mai inalta (altius), deci mai buna;
- forla mai mare (fortius) in ceea ce privesle:
- selectivitatea;
- sensibililatea;
- automatizarea;
- miniaturizarea senzorilor si altor componente;
- tratarea datelor analitice;
- scopul aplicatiilor tehnicilor instrunientale cle analiza, inclusiv acelor
cromatografice.

18

CAPITOL.UL 1

CROMATOGRAFIA. APLICATM IN ANALIZA 51 CONTROLUL MEDICAMENTELOR

Pentru realizarea acestor objective sunt necesare sisteme de analiza complexe, sau
chiar de analiza totala, care trebuie sa includa uii numar important de ,,unilati" destinate
unor etape precizate de analiza, asa cum rezulta din schema urmatoare (Figura 1.1):

Figura 1.1 Sistem de analiza complexa


1 = imitate de tratare a probei; 2 ~ imitate de injectie a probei; 3 = imitate de purificare
a probei; 4 = unitate de separare analitica (coloana); 5 = imitate de reacfic (bio) chimica;
6 = unitate de detectie; 7 = unitate de prelucrare a datelor
Cromatografia a Cost descoperita (inventata) de botanistul rus Tswet care Tn 1906 a
separat o serie de pigment! vegetali cum sunt dorofilele si xantofilele, din extracte Tn
eter de petrol, pe o coloana de carbonat de calciu fin pulverizat. Introducand un solvent in partea superioarS a coloanei, el a constatat ci zona intens colorata din capul
coloanei se deplaseaza de sus in jos, iar componentii se separS In functie de viteza lor
de migrare si afinitatea lor fa(a de faza stationara (CaC03), Tn zone colorate distincte,
sub forma de inele, care corespund diversilor pigment! separati. Tswet a denumit
aceste proces de separare ,,cromatografie", termen care provine de la grecescul
,,chroma" (culoare) si ,,graphein" (a scrie). Pentru detectia pigmen(ilor separati se poate
izola fiecare zona de concentra(ie (inel) din care se poate extrage pigmentul separat, sau
se poate ,,elua" fiecare pigment succesiv prin adaugarea unor solvent! potriviti, iar efluendi (fractiunile) se culeg separat, procedandu-se apoi la detectia lor.
Un rol important In dezvoltarea cromatografiei 1-au avut Martin si Synge (premiul Nobel
- 1962) care au dcscoperit (1941) cromatografia de reparlitie, care a stimulat cercetarile In acest domeniu, ceea ce a dus la descoperirea proceselor intime de separare,
la stabilirea parametrilor cromatografiei si la dezvoltarea continue a performantelor
de separare, detectie si de dozare ale metodelor cromatografice.

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICATII TN ANALIZA 51 CONTROLUL MEDICAWIENTELOR

19

pregatirea fazei sta{ionare;


fixarea inijiala a analijilor in capul coloanei, pe faza stationara, dupa
introducerea solutiei de proba;
deplasarea selectiva - caracteristica a anali|ilor, care sunt antrenati de sus in
jos de catre faza mobila, In cadrul procesului de elufie (developare).
identificarea anali}ilor separafi, pe masura ce acestia ies din coloana separatoare si tree in detector
inregistrarea cromatogramelor, calcularea ariilor picurilor si a altor parametrisidozareaanalitilorcorespunzatori, concomitentcuevaluareastatistica
a rezultatelor (regasirilor) etc.
Tinand seama de cele expuse, ca si de numerosii factori care sunt implicati in
separare, in asigurarea selectivitatii si rezolujiei, ca si de caracteristicile detectorilor
utilizafi, respectiv de sensibilitatea lor, de reproductibilitatea proceselor de separare,
detec{ie si de dozare, este greu de dat o clasificare atotcuprinzatoare.
Totusi, avand in vedere natura fazelor stationare ^i a celor mobile se poate da o
clasificare acceptabila si rezonabila a metodelor cromatografice, asa cum se observa din
figura 1.3. In figura 1.2 se prezinta o schema mai explicita si niai intuitiva a aceslei
clasificari.

Datorita complexitatii proceselor de separare, a numarului mare de factori care


influenteaza separarea, a numarului inaredetehnici si dedetectori estedificila formularea unei clefinitii general valabile a cromatografiei. Se poate spunc insa ca toate tehnici le
cromatografice au ca elemente comune o .,faza stationara" si o ,,faza mobila", iar componentii unui amestec de analizat sunt antrenati in lungul coloanei de un flux de faza mobila
(gazoasa sau lichida), cu viteze diferite, ceea ce constituie procesul fundamental al separarii.
Pe de alta partc, la baza tuturor metodelor cromatografice de separare stau patru procese
fundamentale: adsorbtia pe suporturi solide, repartitia intre faza stationara si aceea mobila,
schimbul ionic si excluderea-difuzia. Prin urmare, principiul separarii poate sa fie diferit,
dar etapele analizei cromatografice sunt acelcasi si anume:
Figura 1.2 Clasificarea intuitiva a tehnicilor cromatografice

20

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

Faza
stationary

Procesul
cromatografic

Tip u I
'<

^
adsorbtie

K
\ >

excludere

organic solids

Solids

K
\ i
\
\

adsorbtie

i
*x"

anorganic solida
organic solida

lichid vokilil

>
I/

lichid ncvolatil
cromatografie de afiniuue

si
r\

anorganic solida

I
/

organic solida

:/

excludere

A
\;
\

separiiri polarc
separSri ncpolarc

\
'
I
I

s*\
\i
I

schimb ionic

ion cromatografie

x.
^^
^

ra?ini chelalante

fuza adsorbiia normals sau


inversa
/

CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

21

In acest context, trebuie precizat ca alegerea fazelor stationare se face in functie


de masa moleculara a analitilor, de solubilitatea lor in solvent! organic! si Tn apa, de
caracterul lor nepolar/polar sau ionic etc., asa cum se poate observa Tn figurile 1.4 si 1.5
(dupa E. Merck).

anorganic solulfi

"^L
.

CAPITOLUL 1

fa/.a leaiita normala sau


inversa

ciotnalografie in coniracureni

i
Figura 1.3 Clasificarea metodelor cromatografice

De remarcat ca, exista posibilitatea utilizarii unei scheme simplificate de alegere


a fazei stationare, pentru un an limit tip de proces cromatografie.
Asa de cxemplu, pentru cromatografia de adsorbtie se poate u t i l i z a o schema ..triunghiularS" pentru alegerea fazei stationare si a celei mobile in functie dc activitatea fazei
stationare adsorbante si de polaritalea analitilor asa cum se, poate observa Tn figura 1.6;
din aceasta figura se constats ca activitatea fa/.ei stationare este Impartita in cinci sectoare.
Destul de frecvent analistul este pus Tn situatia de a alege pentru un anumit tip de
analiti tehnici cromatografice de adsorbjie sau de repartitie. Pentru aceasta trebuie sa se
cunoasca structure analitilor, respectiv tipul de grupari functionale, numarul acestora si
polaritatea lor.
Pentru exemplificare, tn figura 1.7 se da un ghid de alegere pentru procedcele de
adsorbtie si de repartitie.
Cu cat polaritatea compusilor este mai mare adsorbtia lor este mai accentuata. iar
elutia mai dificila; de aceea procedeele de adsorbtie sunt utilizate mai ales Tn cazul
compusilor nepolari sau cu polaritate mica, Tn timp ce procedeele de repartitie sunt
utilizate pentru separarea compusilor cu polaritate mare. Pe de aha parte trebuie avut Tn
vedere ca dubla legatura C = C nu mareste polaritatea unei molecule Tn masura Tn care
o mareste o grupare functionala, in schimb ciclul aromatic mareste polaritatea Intr-o
masura mai mare decat trei difcle legaturi izolate Tntr-o catena liniara.
In functie de procesele care stau la baza separarilor cromatografice exista:
- Cromatografie de adsorbtie, faza stationara f iind un suport solid (ex. A^O-), SiOj
etc.) care are proprietati adsorbante.
- Cromatografie de repartitie, in care faza stationara este o pelicula de lichid fixata
pe un suport solid (ex. SiCy, faza stationara lichida nefiind miscibila cu faza
mobila.
- Cromatografle de schimb ionic, Tn care faza stafionara este un compus macromolecular reticulat, care contine un numar mare de grupari functionale acide
sau bazice, capabile sa schimbe protoni sau ioni alcalini cu cationi bi si trivalenli
(gruparile acide) sau anioni precum OH~, Cl~ etc. cu anioni mai grei si cu sarcina
mai mare (gruparile bazice); schimbatorii de ioni se mai numesc si rasini
cationice (sau cationiti) sau anionice (sau anioniti).
- Cromatografie de excludere sterica sau de excludere - difuzie, Tn care faza stal ionara
este dc regula un gel, care se comporta ca o sita moleculara fixand anumite
molecule si eliminancl altele Tn functie de marimea, respectiv masa lor
moleculara.

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA $l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICAT" IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

faziS dircctd normala:


Liclirospher/Superspher Si, CN,
DIOL.NH;, AliispherAl
fazfi invcrsA: Lichrospher/Superspher
CN, RP-8, RP Select B, RP 18

H nepolari

cromatografie de gel permeatie (GPC,


SEC), cu eluent organic, Lichrogel PS

PAH faza inversa: Lichrospher PAH

I neionici

H polari

ionizabili

neionici

ionizabil fazil Uircclii minmila:


Aliispher A, AI
ionizabili
ionizabil - fazil invcrsa:
Purospher RP 18, RP 18e, Aluspher
RP - Select B
ionizabil - faza inversii cu clucnp'
alcalini: Aluspher R - Select B
faza invcrsa: Lichrospher RP 8, RP 18, Purospher RP 18
cu apa ca eluent, Lichrospher NH : , D10L cu apa/solv.
org. eluent

ionizabili
puternic
acid/bazic

I'azS inversii, pcrcchi dc ioni: Lichrospher/Superspher


RP 8, RP Select B. RP 18, RP8e, RP 18e

cationi
anorganici

cromatografie de schimb ionic: Lichrospher ICCA,


Polyspher ICCA

3C1Z1

organic!

Analiti
chindi

fazi inversil - percchi dc ioni:


Lichrospher/Superspher RP 8, RP
Select B, RP 18. RP 8e, RP 18e
fn/.a inversa cu control de pll:
Lichrospher/Superspher RP 8, RP
Select B, RP 18, RP 8e, RP 18e

faza invcrsa cu control de pH: Licherosphei/Superspher


RP 18, RP 18e, cu eluent de tampon: Lichrospher NH?,
D1QL cu eluent/ tampon solv. org

anioni anorg.
ac. org.

faza inversa cu sorbenti cu pori mari:


Lichrospher WP300RP18

fazil invcrsS: Uchrospher/SuperspheiCN, RP 8, RP Select B, RP 18, RP 8e,


RP I8e, Purospher RP 18, RP 18e

neonc

cromatografic de gel permeatie (GPC,


SEC), cu eluent apos: Fractogel EMD
GPC
cromatografie de excludere ionica:
Fractogel EMD-TMAE, DEAE, DMAE,
SO *~ , -COO", hidroxilapatit

I proteine, peptide [

monozaharide

cromatografie de excludere: Polyspher CHOH


faziS inversa: Lichrospher NH;

mono-, dizaharide

romat. sch-ligand: Polyspher CHCA, CHPB

cromatografie hidrofobica (HIC): \


Fractogel EMD-Propyl, Phenyl I
faza inversa cu sorbenfi cu pori mari:
Lichrospher WP300 RP18
cromatografie de afinitate: Fractogel
EMD Chelat, TA, Epoxy, Azlacton,
Heparine

I acizi nucleic!

cromatografie de schimb ionic:


Fractogel EMD-DMAE,
Hydroxylapatite
cromatografie de gel permeatie (GPC,
SEC), cu eluent apos: Polyspher CH
NA, BIOGPC, DIOL 500

cromatografic dc .schimb ionic: Polyspher 1C AN-1


cromatografie dc cxcluderc ionica: Polyspher OA HY,
OAKC

fazS inversa cu sorbenti cu pori mari:


Lichrospher WP300RP18

zaharide

cromatografie de schimb ionic:


Fractogel EMD-TMAE
faza directs (normals): Lichrospher
NH,

Nota: GPC = gel permeation chromatography


SEC = size exclusion cromatography

vcrsa: Lichrospher NH 3

Chira-Dex, Chira-Dex GAMMA, Whelk-01, ChiraSep DNBPG, ChiraSpher NT, Celulose triacetat

Nota: RP - fazS inversS

igura 1.4 Alegerea fazei stationare pentru molecule cu mase moleculare < 1000 u.a.m.

Figura 1.5 Alegerea fazelor stationare pentru molecule cu mase moleculare


mai mari de 1000 u.a.m.

23

CAPITOLUL 1

CAPITOLUL 1

inalta

In afara de aceste tipuri fundamentale de metode cromatograf ice exista inca unele
procedee cromatograf ice specifice, caracteristice unor specii chimice, datorita unor
interactiuni foarte selective; dintre acestea se pot mentiona cateva:

polar&

Faza
stationary

Faza mobila

activitate

slabs
nepolarS

nepolari

polari

amestec de
analiti

Figura 1.6 Schema triunghiulara de alegere a fazei stajionare


adsorbante si a fazei mobile

CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

25

CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

- cromatografia de aflnitate care se bazeaza pe proprietalea unor adsorbanti macromolecular! de a manifesta o afinitate specifics pentru anuiniti analiti. Cromatografia
de afinitate exploateaza caracteristicile functionate ale analifilor, respectiv interac(iunile specifice dintre moleculeie de analit ?i un ligand fixat pe un suport inert
insolubil (numit curent,.suport imunoadsorbant"); in fapt liganzii (CLI diferite mase
moleculare) sunt inclu;i In suportul solid, caruia Ti confers specificitate (sau eel pufin
o mare selectivitate) pentru anumite molecule de analit, fata de care manifesta o
afinitate, legandu-le prin covalenta.
- cromatograflachiraia, de adsorbtie sau repartitie care se caracterizeaza prin structure
chiraia a fazei stationare sau a fazei mobile, ceea ce permite separarea selectiva a
analitilor chirali, respectiv a enantiomerilor.
- cromatografia cu lichide supercritice, care exploateaza solubilitatea analitilor Tntr-un
fluid supercritic (ex. COi) ca atare sau modificat (ex. cu metanol), care asigura
extragerea analitilor din matrice, ce sunt apoi separati cromatografic.
- electrocromatografia capilara micelaHi care este o tehnica hibrida care inibina cromatografia cu electroforeza.
Desigur ca se poate face o clasif icare a metoclelor cromatograf ice ?i in f unctie de
procedeul practic utilizat si anume:
- cromatografla pe coloana, in care faza stationara este plasata intr-o coloana
(tub) de metal sau de sticla, sau de silice topita.
- cromatografia planurS sau de suprafata pe hartie sau pe strat subtire.
In functie de migrarea fazei mobile se disting:

polaritntea gniparilor function fil

Hielrocarburi
5,1 derivati

Douoi'i tie
proton i

Do-ivati oxigennti ai
hiilrocarlmrilor

///

O I

// I //

i,l"H

!,,

F<H RX RNO, , R O R RC-OR RG-R RC-H i H C - W H R R j N H , ROH

compusii cei
msuputin polar!
ADSORBTIE

Coinpu.;i
iouici

Ho

AT OH RCftH i Neudeoflde MH.-E-CO,

.......**- \ jy ii|>a functionsila


JJT-......-

ZgrupSri function ale

_vt_._ 3 gj-unftri functioiuile


x
4 grupiiri fimctionata
^s. 5 saj| lna j innite oj'upai-i funclionale

REPARTITIE
coinpu.yii cci
,naj ,,oial.j

Figura 1.7 Ghid de alegere a procedeelor de adsorbfle $i repartitie

cromatografia prin developare in care analitii raman pe faza stationara sau sunt localizati pe aceasta (ex. separarea clorof ilelor si xantofilelor pe carbonat de calciu) in
functie de directia de migrare; exista developare ascendenta sau descendants,
monodimensionala sau bidimensionala (migrari in directii perpendiculare, deci la
90), circulars etc.
cromatografia de elude, in care analitii sunt eluati pana la iesirea lor completa din
coloana, deci din faza stationara, fiind posibila culegcrea succesiva a fracjiunilor
de analiti; in acest caz detectia se face in efluenti.
Din toate clatele prczentate pana aici rezulta ca intr-adevar nu este posibila o
clasificare unica, atotcuprinzatoare, general valabila pentru toate tehnicile si procedeele
cromatografice de analiza; dar este posibila intelegerea complexitatii si nestitafii
domeniului analizei cromatografice, de unde si intelegerea aplicabilitatii largi in diverse
domenii a acestor metode, datorita seleclivitatii (uneori a specif icitatii) lor, ca si datorita
sensibilitatii si in general a performantelor proceselor de separare, detectie, clozare,
purificare-preparare etc.

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICAT" IN ANALIZA l CONTROLUL MEDiCAMENTELOR

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA $1 CONTROLUL MEDICAMENTELOR

.2. Bazele teoretice ale cromatografiei


1.2.1. Parametrii cromatografiei

Bin Bs

[B]
KDB = [B] s

proba

faza mobila

I T

(a)

t3

to

Pentru a intelege mecanismul separarii in cromatografia de lichide (LC) de


epartitie se admite ca se analizeaza o proba continand doi analiti A si B; se admite de
isemenea ca se utilizeaza o coloana pregatita in prealabil prin fixarea pe particulele de
uport inert, a unui film (pelicula) de lichid faza stationara, potrivita (compatibila cu
inalitii). Apoi se introduce un volum de proba (in metodele inalt performante se introduc
le la cativa la cateva zeci de U.L de solutie foarte diluata de proba); se adauga apoi faza
nobila putin cate pufin cand se produce developarea, adica migrarea de sus in jos a
mali|ilor, cu viteze diferite; continuand adaugarea fazei mobile se produce elutia, adica
ixtractia din coloana a fiecarui analit, pana la iesirea din coloana; in aparatele actuale
le cromatograf ie, ef luentul se conduce direct la detector in care se face detectia analitilor
;eparati. In figura 1.8 sunt reprezentate aceste etape ale separarii cromatografice.
Din cele expuse se observa ca procesul de separare se produce treptat, intre faza
;tationara si faza mobila existand un echilibru, dcterminat de concentratiile fiecarui
malit in faza stationara si faza mobila, al caror raport reprezinta coeficientul de
repartitie sau de distributie:
[A]s _ CAS
(1.1)

CAs = concentratia lui A in faza stationara


CAm = concentratia lui A in faza mobila

(1.2)

CBs si CBm au acelea?! semnificajii ca pentru A

Pe langa datele prezentate anterior trebuie sa se cunoasca o serie de nojiuni


;oretice general valabile, referitoare la procesele de separare cromatografica, notiuni
are se pot transforma (adapta) tuturor metodelor cromatografice. De aceea, in cele ce
rmeaza se fac referiri la cromatograf ia de lichide bazata pe repartitia unor analiti intre
oua faze. Se admite ca trebuie sa se analizeze un amestec de analiti (diferiti), care
~ebuie sa fie separati (aceasta fiind scopul principal al cromatografiei); indiferent de
shnica aleasa, metodele au cateva aspecte comune:
- anali}ii din amestec se repartizeaza intre faza stationara si faza mobila, care sunt
nemiscibile (sau foarte pufin solubile una in alta); intre cantitatile de analiti
repartizati in cele dona faze exista un echilibru ce depinde de insusjrile fiecarui
analit faja de cele douS faze.
- adaugand continuu faza mobila ,,noua sau proaspata" are loc deplasarea echilibrului de repartitie, antrenand migrarea analitilor de-a-lungul fazei stationare, cu
viteze diferite.
- separarea consta in eluarea continua a analitilor care migrand cu viteza caracteristica fiecaruia, parasesc succesiv coloana.

[A]m

CBs

27

CAIH

t4

detector

B/
A

(b)

to

ti

Figura 1.8 Separarea componentilor A(.) si B (..) dintr-un amestec

a) Schema separarii succesive ; b) Seinnalul de iesire al detectorului pentru cei doi


component!, in functie de timpii de elutie

Puterea de separare a unei coloane depinde de mai multi factori, dar in principal
depinde de vitezele relative de elutie care sunt determinate chiar de coeficienjii de
repartitie ai celor doi analiti intre cele dona faze, stationara si mobila. Ideal ar fi caacesti
coeficienji de repartitie sa fie independent! de concentratia analitilor, ceea ce inseamna
ca intotdeauna Cs sa fie proportional cu Cm.

CAPITOLUL 1

CROWIATOGRAFIA. APLICATII iN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

Prin reprezentarea grafica a concentratiei analiti lor A i B separati, concentrate


ire este egala cu aria de sub pic, in funcfie de timpul de elutie (retentie) sail volumul de
iujie (retentie) se obtine cromatograma celor doi analiti asa cum se poate observa din
isura 1.9.

CAPITOLUL 1

In context se defineste timpul de retentie maxim al unui analit tR, ca fiind timpul
care se scurge de la injectia (introducerea) probei de analit in coloana si aparitia (iesirea)
picurilor analitului la detector.
Pe de alta parte viteza liniara medie de deplasare a analitului in coloana, vm = L/tR,
este egala cu raportul dintre lungimea L a coloanei si timpul de retentie. lar viteza liniara
medie ,,u" a moleculelor fazei mobile este data de raportul dintre lungimeacoioanei si timpul
mort, u = L/t,,,; timpul mort tM este timpul necesar ca o specie neretinuta sau faza mobila
(solventul) sa traverseze coloana pana la iesire; evident ca este vorba de lungimea coloanei
de faza stationara numita si lungime utila, si nu de lungimea tubului de sticla, silice sau
metalic in care se af la faza stationara. Trebuie precizat ca volumul total al coloanei VT este
ocupat de faza stationara Vs si de volumul fazei mobile VM, deci:

VT = VS + VM
A

distanta parcursa

Flgura 1.9 Cromatograma amestecului substantelor A si B, respectiv


profilele concentrapor picurilor In doua momente ale
migrarii lor, adica la timpii ti si tz
Din f igurile 1.8 si 1.9 se constata ca substanta B este mai puternic retinuta pe faza
stationara decat substanta A, de aceea B se deplaseaza cu viteza mai mica; desigur ca
unbele substance parcurg aceeasi distanta d, egala cu lungimea fazei stationare, dar cu
k'iteze diferite.
vA=^

(1-3)

(1.4)
L = lungimea coloanei de faza stationara in cm (sau mm)
Se mai constata de asemenea ca pe masura ce creste distanta dintre cele doua
picuri, A si B, deci odata cu apropierea de baza coloanei, se produce o largire a celor
doua picuri, mai vizibila la baza picurilor, ceea ce micsoreaza eficienta separarii lor.
Trebuie precizat ca prin alegerca (stabilirea) unor conditii judicioase est posibil ca accasta
largire a picurilor sa se produca mai meet (lent) decat separarea, ceea ce inseamna o
rezolutic mai buna; aceasta implica o lungime mai potrivila (mai mare) a coloanei;
puterea de separare a unei coloane cromatografice se poate imbunatati prin controlul
unor parametri cum sunt (vezi si rezolutia, f igura 1.26):
- cresterea vitezei de separare a picurilor;
- micsorarea vitezei de largire a picurilor.

29

CROWIATOGRAFIA. APLICATII iN ANALIZA SI CONTROLUL MEDICAMENTELOR

(1.5)

In legatura cu faza stationara trebuie sa se faca unele precizari:


1. ea este formata din particule fine solide, sferice (sau aproape sferice) pe
suprafata carora se produc interactiile cu analiti (ex. In cromatografia de
adsorbjie);
2. ea este formata din particule fine solide, care sunt suportul pe care se fixeaza
faza stationara lichida ca in cromatografia de repartitie;
3. particulele de suport solid pot avea grefate sau adsorbite pe suprafata lor
substante sau grupari chimice cum sunt C8, CIS etc, si care participa la
procesele cromatografice;
4. in coloanele capilare utilizate in cromatografia de gaze, faza stationara este
fixata in stare omogena. sub forma unui film (pelicula) pe peretii interior! ai
acestora;
5. particulele de faza stationara se caracterizeaza prin cativa parametri intre care
diametrul lor mediu (dp), omogenitatea marimii lor si suprafata specifics
(SSp), dar si prin diametrul porilor unora dintre particule, asa cum se poate
vedea din tabelul I . I Suprafata specifics a porilor creste odata cu numarul lor
si scade odata cu cresterea marimii lor.
Tabelul 1.1. Caracteristici ale particulelor de SiO2 in LC si Chromosorb In GC
Caracteristici
Diametvul mediu al particulelor, dp in |ini
Diametrul mediu al porilor, nm
Suprafata specifics SSp in m /g
Porozitatea tolala, et
Perrneabilitatea, K=dp2/O (cm2)

SiOzTnLC
3-lOjim
6-lOnm
400-lOOOm 2 /Q
- suport poros: 0,80
- suport ueporos: 0,35-0,40
I0" 9 cm 2

Chromosorb in GC

1 50-180 Jim
(80- 100 mesh)
300-4000 nm
1 00-500 in2/"
-

10' 7 cm 2

JO

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

Volumul dintre particulele (granulele) de faza stationara, numit si volum inter;titial sau intergranular, este ocupat de faza mobila, se noteaza cu V M si se numeste volum
nort; el a fost definit mai sus. Volumul mort este egal cu suma volumului porilor, care
;e umple cu faza mobila si se numeste volum intragranular Vp si volumul intragranular
\n (Figura 1.10):

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICATH IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

31

Diferentele dintre marimile date in tabelul 1.1 permit cunoasterea permeabilitatii


specifice a coloanei, K, care caracterizeaza usurinta cu care faza mobila poate traversa
coloanacromatograf ica si sa se evalueze calitatea umplerii coloanei care are dimensiunea
unei suprafete si care se poate calcula cu ajutorul relatiei (Kozeny-Carman):
(1.11)

sau

Volum intragranular, V p

Ku = -

(1.12)

Volum intergranular, V]
Calitatea umplerii este caracterizata de permeabilitatea K, care creste cu patratul
diametrului particulelor dp. In relajia (12) 3> este factorul de rezistenta la curgere,
exprimat printr-un numar (fara dimensiuni) care depinde de forma granulelor, de
porozitatea lor, de textura lor si de calitatea umplerii coloanei si pe exprima' prin relatia:

Figura 1.10 Volumul intra si intergranular

VM = Vp + Vi

(1.6)

Volumul coloanei goale (a tubului de sticia sau silice) Vcol, cu lungimea L si


diametral interior d.i. sau (dcol) se poate calcula astfel:

Porozitatea totala a coloanei, respectiv a tuturor granulelor de faza stationara, et


se poate calcula fScand raportul dintre volumul mort si volumul coloanei, deci:
et =

VM
Vcol

(1.8)

Aceastl porozitate este suma porozitatii intragranulare p si a celei intergranulare,


Et = Ei + p

Vi
.
i T ~ ; r iar Hn " .
Vcol
Vcol

ISO^l-Ef)
,3

(1.13)

Valoarea numerica a factorului de rezistenfa este egala cu <t>=500 pentru granulele


poroase cu forma regulata, sferica si cu 0=1^00 pentru granulele poroase cu forma
neregulata.
De altfel curgerea unui lichid sau fluid - faza mobila se poate datora gravitatii sau
unei presiuni care se exercita asupra fazei mobile cu ajutorul unei pompe Tn cromatografia de lichide si cu fluide supercritice, sau de catre un gazsub presume in cromatografia
in faza gazoasa.
Pe de alta parte, faza mobila, dar mai ales coloana, adica faza stationara, provoaca
o rezistenta la curgere; curgere care se caracterizeaza prin viteza ei liniara meclie, vm,
care se exprima in m/sec, si prin relatia:
vm=L/tm

(1.9)

(1.14)

L = lungimea coloanei
(1.10)

In cazul particulelor solide neporoase Vp = 0. ep = 0, iar volumul mort este egal cu


Vm = Vi volumul intergranular; evident ca si porozitatea totala este egala cu volumul
intergranular, el = Vi, fiind cuprinsa in intervalul 0,35 - 0,45, ceea ce Inseamna ca peste
60% din volumul coloanei este ocupat de granule neporoase ale fazei stationare. In cazul
particulelor poroase et = 0,85, coloana este ocupata de granule poroase in proportie de
peste 80-90%.

t m = timpul necesar fazei mobile pentru a parcurge distan{a L


Viteza liniara medie vm depinde de temperatura, de presiunea impusa fazei mobile
si de natura coloanei (adica a fazei stationare); iar la temperatura constants aceasta viteza
se exprima prin rela|ia urmatoare (Darcy):

APK 0
vm = viteza liniara medie de curgere, in m/s

(1.15)

32

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICATH IN ANALIZA l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

K = constanta de permeabilitate a coloanei, exprimata in m fiind dependents de


diametral particuleior dp pentru o coloanS umpluta
L = lungimea coloanei, in m
il = vascozitatea fazei mobile in pascal-s, Pa-s (IPa-secunda = 10 poises)
AP = pierderea de sarcina (greutate) in pascali (1 Pa = 10"5 bar = 9,8 10"6atm)

Pierderea AP reprezinta diferenta dint re presiunea impusa fazei mobile la intrarea


in coloana (Pe) si presiunea observata la iesirea din coloana (Ps):

AP = Pe - Ps

(1.16)

Desigur cS pentru a realiza o separare buna a analifilor trebuie sa se stabileasca o


viteza liniara optima de curgere a fazei mobile, ceea ce implica o alegere judicioasa a
presiunii impose Pe; de asemenea trebuie sa se Jina seama ca pierderea AP (de care
depinde calitatea separarii) depinde de vascozitatea fazei mobile si de permeabilitatea
coloanei K dependents la randul ei de lungimea sa, L. Pierderea AP se poate deduce din
relatia (1.15) :
AP = ^

(1.17)

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICATH IN ANALIZA l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

33

Pentru a infelcge fenomenele implicate in separarea cromatografica este necesar


sa se cunoasca structura discret discontinua a transferului de masa (de analifi) prin
coloana, imaginandu-se ca o coloana este alcatuita dintr-un numar foarte mare de ,,ctaje
minuscule" numite ,,platouri teoretice", masade analiti transferandu-se de pe un platou pe
altul, conform unei succesiuni continue de echilibre de transfer (conceptul este oarecum
asemanator distilarii lichidelor intr-o coloana de distilare). Trebuie subliniat faptul ca teoria
platourilor teoretice are neajunsul ca ea considers cromatografia ca o suits discontinua de
operatiuni, deci de echilibre si ca f iecare echilibru se realizeaza separat si integral, netinanduse seama de fenomenul de difuzie si de curgerea continuS a fazei mobile, care micsoreaza
schimburile (transferurile de masa). De aceea an aparut si alte teorii In aceasta privinta, intre
care teoria cinetica, In care se ia in considerare aspectul dinamic al fazei mobile si inf luenta
temperaturii si a presiunii asupra curgerii si implicit asupra separarii cromatografice.
In acest context este necesar sa se discute distribufia/repartifia anali|ilor intre doua
faze, curgerea fazei mobile (care provoaca separarea anali^ilor) si elutia succesiva a
analitilor si detectia lor.
Distrlbiitia termodinamM a analitilor intre faza stationara si cea mobila cand
concentratiile lor nu sunt mari, respectiv cand faza stationara nu este saturata in analiti,
se admite ca este regulata si independents de concentra^iile (cantitatile) altor substante
prezente. Tn acest caz intre concentratiile unui analit in faza stationara, Cs, si in faza
mobila CM, exista o relatie liniara, exprimata pjin relatia:

K
Cs =

Pierderea AP se poate exprima si in func{ie de diametru! particuleior, dp si de


factorul de rezistenja O astfel:

AP =

Vm Lr|<t>

(1.18)

di

Avand in vedere ca vascozitatea lichidelor este de cca. 100 de ori mai mare decat
aceea a gazelor, presiunile necesare in cromatografia de lichide (HPLC) trebuie sa fie
de cca. 100 de ori mai mari decat in cromatografia in faza gazoasa (de ex. vascozitatea
apei la 20 este egala cu Pa-s =10"J Pa-s iar presiunea heliului - gaz purtator in GC, este
egala cu t| = 1,94-10 Pa-s).
Considerand o coloana HPLC de 20 cm lungime si cu particulele de 10 tun, pentru
a obtine o viteza liniara medie de 10"2 m/s trebuie sa se utilizeze o presume de intrare Pe
de cateva sute de bari, deci de cateva sute de atmosfere. Deoarece lichidele nu sunt
compresibile (pana la cca 600 bari) viteza fazei mobile este practic constanta, in schimb
in gazcromatografie, gazele fiind compresibile, viteza fazei mobile nu mai este liniara
si nici constanta, ea creste cu lungimea coloanei, deci a distantei parcurse.
Performantele analitice ale coloanelor cromatografice sunt determinate de caracteristicile acestora, respectiv de natura fazei stationare si in acest context se impun unele
lamuriri privind factorii sau parametrii cromatografici.

(1.19)

Kpj = este coef icientul de distribute al unei substante


intre substante intre cele douafaze.
Trebuie subliniat ca in cazul cromatografie gaz-lichid (GL) nu se utilizeaza
coef icientul de distributie ci coef icientul de repartitie, in cromatografia de adsorbtie se
utilizeaza coeficientul de adsorbtie, iar in cromatografia pe gel este valabila constanta
de difuzie.
Marimea KD se numeste ,,coeficientul termodinamic de distributie", putandu-se
exprima in functie de ,,entalpia libera standard de distribute", AG s/i corespunde diferentei
entalpiilor libere, rezultate din transferul unui analit standard cu dilutie infinita din faza
mobila, catre faza stationara:
(1.20)

AG = - RT InKo

Coeficientul termodinamic de distributie se poate exprima si prin utilizarea


,potenjiale!or chimice" standard, |i , ale analitului in fiecare din cele doua faze:

RT

RT

(1.21)

34

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA $l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

De aceea, potentialul chimic standard, care are dimensiunile unei energii/mol,


trebuie sa fie Tnlocuit cu potentialul chimic (0, care rezulta din interacfiuni specifice,
ion ice sail moleculare, la care este supus analitul din partea fazei stationare si a fazei
mobile. Potentialul chimic este mult influentat de temperatura si de polaritatea compusilor, dec! de activitatea a = fC, f fiind coeficientul de activitate (totdeauna subunitar;
cand f=l, a=C ), iar C este concentrajia:
(1.22)

(j. = (J + RT In a

La echilibru cele doua potentiate chimice sunt egale:


U.s = Mm, respectiv:

H-RTlnam

In as

(1.23)

iar
(is -Hm = RT In am - RT In as

rn^

RT

(1.24)

(1.25)

as

Prin urmare:
.,
i 3m
as
In KD = - In = In = In
3s
am

(1.26)

In sfarsit, daca se considers ca in solutie diluata coeficientul de activitate al


analitiilui are valori foarte apropiate si foarte mici:
C
C
(1.27)
In KD = In -^ iar KD = TT~
Cm

Cm

Coeficientul termodinamic de distributie KQ este prin urmare o caracteristica a


unui analit dat, in conditii bine determinate; iar in conditii identice analitii care au naturi
diferite au evident coeficienti de distributie diferiti, ceea ce permite separarea lor
cromatografica.
Trebuie Tnsa precizat ca bazele teoretice ale variafiei potenfialului chimic standard,
A|_i sunt mai complicate, dar scarile de polaritate stabilite mai mult empiric sunt utilizate
pentru exprimarea unor interactiuni si anume:
- seria eluotropa (a lui Snyder), care descrie energia deadsorb(ie EQ a moleculelor fazei
mobile pe unitatea de suprafafa de adsorbant, ceea ce exprima forta eluanla a fazei
mobile;
- polaritatea (P') a solventilor calculata dupa Rohrschneider plecand de la datele experimentale efectuate in cromatografia de gaze;
- parametrii de solubilitate, 5 (a lui Hildebrand) care reprezinta energia necesara
pentru a transforma un mol de solvent din stare lichida in stare gazoasa in conditii
normale, se bazeaza pe masuratori entalpice;

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICATII TN ANALIZA SI CONTROLUL MEDICAMENTELOR

35

In procesul cromatografic o importanta deosebita o are ,,curgerea separativa a


fazei mobile" care implica deplasarile separative si profilul elufiei.
Curgerea fazei mobile perturba echilibrele de distributie a analitului intre cele
doua faze, stationara si mobila, ceea ce determina deplasarea succesiva a echilibrului Tn
coloana, astfel ca pe masura ce au loc aceste deplasari se creeaza echilibre noi cu faza
stationara. Deplasarile analifilor de-a lungul coloanei sunt determinate de doua procese
mai importante si anume:
de ,,fenomenul de transport" prin antrenare si prin difuziune Tn faza mobila, care nu
este selectiv dar care este guvernat de viteza de curgere a fazei mobile.
de ,,procesul de reteinle selectM" a analitilor, retentie care se datoreaza afinitatii
fiecarui analit fafa dc fazele stationara si mobila, afinitati care se exprima la randui
lor prin coeficienjii de distributie (Figura 1.11).
De subliniat ca ,,transportul Tn
faza mobila" (care se face Tn sensul
curgerii), prin antrenare sau translatie
are loc datoritagravitatiei sau datorita
presiunii impuse unui fluid cu o
pompa (ca Tn cromatografia de lichide
sau cu fluide supercritice) sau prin
detenta unui gaz aflat sub presiune (ca
in cromatografia Tn faza gazoasa).

Curgerea unui fluid depinde si


este deci influenjata si de rezistenta Figura 1.11 Profilul Gaussian al celor doi analiti
separati prin migrarea (deplasarea) lor
la curgere datorata vascozitSfii fazei
mobile, de permeabilitatea coloanei
si de pierderea de sarcina. despre care s-a vorbit anterior.
Transportul se face, asa cum s-a mai aratat, si prin difuziune, Tn cazurile Tn care
concentratiile unei substante Tn diferite puncte ale acestuia, sunt diferite. In astfel de
cazuri datorita tendintei de omogenizare a concentratiilor se produc o miscare a
moleculelor de substanta dinspre zona mai concentrata spre aceea mai diluata. Aceasta
miscare se numeste difuziune si se poate evalua prin legea lui Pick, care coreleaza
difuziunea, deci miscareasubstanj;ei, respectiv intensitateafluxului J cu traversarea unei
suprafete S, cu coeficientul de difuzie D si cu diferenta de concentratie ,,dc" existenta
Tntre doua puncte ale mediului, Tntre care exista distanta dx:
(1.28)
dx
Coeficientul de difuziune D este o marime caracteristica a unei substante, fiind
legata de marimca ei Tn conditii date de temperatura, vascozitatea mediului si tinand
seama si de natura ei; D se exprima Tn m /s. Pentru determinarea experimentala a
coeficientului de difuziune, in cazul unor molecule mici dizolvate Tn apa, se poate utiliza
relatia:

36

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

(1.29)
Tn care / este coeficientul de frecare, exprimabil prin relafia:
/ = 6pNrq

(1.30)

Tn care:
r = raza moleculelor considerate de forma sferica

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

37

este de tip Gaussian, deci poate fi asemuit cu o curba Gauss. Aceasta Tnseamna ca la un
moment dat al migrarii cromatografice, substanta este localizata pe un platou (imaginat
ca o suprafata orizontala extrem de tngusta) al coloanei si se distribuie simetric Tn jurul
unei valori maxime cu ordonata y0 si abscisa x0.
In figura 1. 13 este prezentat traseul geometric al unei curbe Gauss si ecuatiei unei
astfel de curbe, fiecare punct fiind caracterizat prin ordonata lui, y, si prin distanta x Tn
raport cu axa de simetrie a ordonatei yp.

N = numarul lui Avogadro (notat astfel pentru a-l deosebi de numarul de platouri
teoretice N)

y =.

yo

(x-xo)
2a2

(1.31)

/ = vascozitatea mediului
Trebuie subliniat faptul ca deplasarea prin difuziune este mult mai mica (slaba)
decat aceea prin curgere, coef icientii de difuziune f iind de 1 0 - 103 ori mai mici in lichide
decat Tn gaze. Fenomenele de difuzie sunt mai accentuate si dcci mai importante in
cromatografia de gaze, datorita vascozitatii mai mici a mediului (fata de cromatograf ia
de lichide), intervenind intr-o masura importanta in largirea benzilor (picurilor) mai ales
Tn GC.
Deplasarea unui analit si Tn general a unei substante Tntr-o coloana cromatograf ica,
de ex. in cazul cromatografiei de repartitie, poate fi asemuita cu un transfer de masa a
analit +
substanfei, repetat de un numar
faza mobila
foarte mare de ori, conform unui
I
numar tot atat de mare de echilibre
care se stabilesc si se distrug'.
Aceste transferuri se fac de pe niste
,,niveluri" sau ,,etaje" extrem de inguste, pe altele, succesiv, numite
,,platouri teoretice", care sunt in
fond niste niveluri imaginare intr-o
faza stafionara reala, asa cum se
poate observa din figura 1.12.
Transferul de masa, respectiv deplasarea selectiva a unui
analit Tn coloana cromatograf ica se
-frits
face Tn conditii experimentale bine
determinate (granulatie, porozitate, tip de faza mobila, concentratie de analit, temperatura etc).
Pe baza teoriei platourilor teoretice
se poate aprecia ca dupa un anumit Figura 1.12 Reprezentarea intuitiva a ,,platourilor
teoretice" intr-o coloana cromatografica
parcurs in coloana, profilul concentratiei analitului in faza mobila

0,507 -

Figura 1.13 Traseul geometric al curbei Gauss, reprezentand profilul concentra|iei


unui analit In cursui procesului de separare cromatografica
Aa cum se observa, curba Gauss este simetrica prezentand un maxim B si doua
puncte de inflexiune E si F. Pentru ordonata maximului curbei se atribuie valoarea
yO=l ,000; punctele de inflexiune E 5! F au ordonatele egale, y E = YI: = 0,607, iar distan tele
lor Tn raport cu axa de simetrie (BD) sunt egale cu abaterea tip o, prin urmare largimea
picului Tnlre punctele E si F este cgala cu 2a. Pe de alta parte, semi-Tnaltimea picutui este
egala cu y\/2 = 0,500 iar largimea picului pentru aceasta valoare a ordonatei este egala
cu 2,34a.
Examinand cu atentie curba se observa ca ea se Inscrie intr-un triunghi isoscel,
AGI, ale carui laturi mai lungi sunt tangente la curba Tn punctele de inflexiune. De
asemenea s-a stabilit tot prin conventie ca inaltimea triunghiului este egala cu ordonata
punctului A, deci yA= 1,200, iar largimea sa la baza este egala cu latura GI = 4o.
Este important de observal ca abaterea tip, sau mai bine varianja o2 are o distanta
de migrare egala cu Z si reprezinta dispersia substantei Tn coloana, iar cresterea largimii

38

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICAJII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

curbei Gauss (deci a picului) se poate exprima prin cresterea varianjei da , dupS o
deplasare egala cu dZ (vezi figura 1.14), deoarece cresterea do2 este proportionals cu
deplasarea dZ; in acest context se poate scrie:
0z

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

39

translate
difuzie

(1.32)
difuzie

Factorul de proportionalitate se noteaza cu H, el fiind o caracteristicS datorata


analitului, naturii fazei stationare, naturii fazei mobile, ca si conditiilor de separare
cromatografica cum sunt debitul fazei mobile si temperatura; factorul de proportionalitate este independent de deplasare; pc baza acestor consideratiuni se poate scrie pentru
cresterea variantei egalitatea.
do2 = HdZ
(1.33)
In continuarea acestor rationamente se poate considera ca la intrarea in coloana,
largirea prin difuziune 00 este nula (deci Z=0), ea fiind maxima dupa parcurgea de catre
analit a intregii coloane cu lungimea L. Prin extrapolarea inicii deplasari dZ la intreaga
coloana marimile discutate dz devine L, o^+dz devine OL iar da devine AaL ; prin
urmare se poate scrie:
a 2 -On
insS OQ = 0.ceea ce 'face

ca

(1.34)

ecuajia (1.34) sS devina:


(1.35)

de unde:

H = -rk ia

(1.36)

Se poate spune ca deplasarea analitului in coloana se traduce prin deplasarea curbei


Gauss, care imprima largimea ei (deci a picului) si este determinata de difuziune si de
miscarea de translate (Figura 1.14).
Factorul de proporfionalitate H corespunde, cresterii variantei curbei Gauss pe
unitatea de lungime a migrarii; iar conform teoriei platourilor teoretice coloana cromatografica este asemuita unui numar foarte mare de volume elementare, considerandu-se
ca in fiecare dintre acestea se realizeaza un echilibru perfect de distribute a analitului
intre faza mobila si aceea stationara. Notiunea de volum elemental' se poate inlocui cu
notiunea de inaitime, deoarece sectiunea coloanei are o suprafata constants, respectiv
raportul dintre volum i aceastS suprafata; in acest fel se ajunge la a considera factorul
de proportionalitate H ca fiind inaltimea platoului teoretic pentru coloana utilizata,
inaitime care se exprima in mm (dar H poate avea si alte dimensiuni; a se vedea mai
departe). Cunoscand inaltimea platoului teoretic si lungimea coloanei se poate calcula
numarul de platouri teoretice pentru o anumita coloana.
N=

(1.37)

z+dz

Figura 1.14 Deplasarea analitului ?i largimea curbei Gauss (picului)

O mare importanta in analiza cromatografica o are, ,,elufia analitului", respectiv


,,obtinerea picului cromatograflc". Separarea cromatografica implica in mod necesar migrarea completa a analitului prin toata faza stationara pana la iesirea completa din coloana.
Aceasta migrare depinde de afinitatea fazei stafionare fata de analit. de caracteristicile
coloanei (tipul de faza stationara, marimea particulelor, porozitatea, suprafata specifics etc)
si de volumul de faza mobila adaugat, care curge prin coloana.
Pentru o substanta nerejinuta in coloana, deci nesupusa proceselor cromatografice, este suficient un volum de faza mobila egal cu volumul moil, V M , pentru a culege
substanta la iesirea din coloana; cu alte cuvinte o astfel de substanta se elimina in frontul
fazei mobile.
In realitate substantele de analizat aflate in amestec au o anumita afinitate fa{a de
faza stationara, determinata de structure lor chimica i de marimea moleculelor lor. De
aceea, cand frontul fazei ajunge la iesirea din coloana, analijii sunt cu atat mai putin
deplasati in coloana cu cat afinitatea lor pentru faza stationara este mai mare. Iar pentru
eluarea analitilor trebuie sa se adauge un volum de faza stationara cu atat mai mare cu
cat ei sunt mai retinufi in coloana, respectiv pe faza stationara.
Pentru un amestec de analiti este posibil sa se utilizeze un detector, plasat cat mai
aproape de iesirea ef luentului din coloana, si sa se inregistreze continuu semnalul analitic
care este proportional cu variatiile concentratiilor analitilor separati si eluati si care
evident traverseaza coloana, obtinandu-se cromatograma corespunzatoare, inregistrata
de un Tnregistrator (recorder) care face par.te din ansamblul componentelor instrumentului de analiza cromatografica.
Prin urmare pentru fiecare analit, intensitatea semnalului detectorului, transmis
catre inregistrator, este proportionals cu cantitatea de analit din proba analizata; f iecarui
analit ii corespunde in consecinta un pic pe cromatograma, care se inregistreaza intr-un
sistem de coordonate drepte; traseul unei astfel de cromatograme este dat in figura 1.15,
pe care sunt inscrise si cateva marimi fundamentale.

40

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA SI CONTROLUL

MEDICAMENTELOR

to sau VM

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA SI CONTROLUL MEDICAMENTELOR

41

De regula eluentul iesit din coloana este detectat printr-un semnal sau pic al
detectorului (primul pic in figura 1.15) si Tncepand din acest moment sc
masoara timpul de retentie al analitului, timp care se noteaza cut R si se numeste
,,timp de retentie corectat", el calculanciu-se astfel:

d R sau tR sau V R

t'r = t R - t M
linia
de baza
b

d (cm) sau
t(min) sau
V (mL)

volumul de retentie, se noteaza cu VR (volumul de retentie brut) si el reprezinta


volumul de faza mobila necesar pentru a aduce analitul cu concentrafia sa
maxima in detector; volumul de retentie se poale deduce din timpul de retentie
tR si in acest caz trebuie sa se fina seama de volumul mort de faza mobila,
respectiv de volumul mort al coloanei, care trebuie sa se scada din volumul brut
de retentie obtinandu-se astfel, volumul de retentie corectat (sau redus; volumul
mort se poate nota cu VQ iar cu timpul mort to).

Figura 1.15 Traseul unei cromatograme si picul componentului separat


dR = distanta de la inceputul procesului cromatografic la maximul picului
b = largimea picului la baza, egala cu baza triunghiului in care se Tnscrie cea mai mare
parte a curbei Gauss
h = inaltimea picului cromatografic
s = suprafata de sub pic, cuprinsa intre abscisele G si I si curba Gauss
to = timpul mort
V M = volmnul mort; V R = volumul de retentie; t R = timpul de reten^ie.
Pentru intclegerea corecta a proceselor cromatograf ice si pentru utilizarea corecta
si eficienta a metodelor cromatografice de analiza trebuie sa se cunoasca o serie de
parametri sau marimi, care definesc si explica procesele cromatografice de separare.
(A) Mlrimi de retentie, care caracterizeaza retinerea analifilor in coloana cromatograf ica, respectiv pe faza stationara, marimi exprimate in timp, voluin, distanta si
factor de retentie (numit si raport de retentie). Toate aceste marimi sunt legate de
coef icientul de distribute al analitului KD, intre fazele stajionara si mobila (distanta
de retentie notata cu da se poate Tnlocui cu timpul de retenlie tR sau cu volumul de
retentie VR cu care este proportionals).
- timpul de retenfie este egal cu timpul scurs de la intvoducerea probei de analit in
coloana si momentul in care iese maximul picului din coloana (deci concentrajia
maxima).
De notat cS viteza de tnregistrare a picului este constants, iar masurarea distantei dR
permite sS sc cunoasca timpul de retentie 1R. EluentuI (faza mobila) neretimit de
coloana iese mull mai repede din aceasta, iar timpul necesar ca faza mobila sa ajungil
la detector se noteaza cu t 0 sau t M si se numeste timp mort. Acest timp se datoreaza
parcursului obligatoriu al fazei mobile prin spa|iile mterstifiale (dintre particulele de
faza stationary) ca si volumelor moarte ale diferitelor parti componente ale aparatului.

(1.38)

V'r = V R - V M

(1.39)

raportul de retentie, notat cu RR, se exprima prin raportul dintre viteza medie de
deplasare a analitului VA si viteza medie de deplasare a fazei mobile (sau a
substanfelor neretinute) VM:
(1.40)

sau daca se inlocuiesc VA ?i VM, cu expresiile lor in care se introduc lungimea


coloanei L si timpul de retentie tR, respectiv timpul mort IM, se obtine pentru
raportul de retentie expresia:
"-

' -

-! -

tM

(1.41)

/tR _ tM

(1.42)

este posibil de asemenea sa se inlocuiasca raportul tM/tR cu raportul volumelor


corespunzatoare VM/VR sau cu

C!M

VM

KR ~; "7^
dA VR

(1.43)

d^ = distanfa parcursa de volumul mort de faza mobila (VM)


d A = distanta pana la maximul picului analitului A; ambele aceste doua marimi
se pot masura pe cromatograma
Raporlul de retentie are o valoare subunitara iar valoarea sa maxima poate fi egala cu
unitatea atunci c:ind o substanfi nu este refinuta pe coloana, caz in care substanta se
deplascaza cu aceeasi viteza ca si faza mobila.

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

factorul de retenfie sau de capacitate, notat cu k' se exprima prin raportul dintre
cantitatea de analit care se gaseste in faza stationara, Qs, si cantitatea de analit
care se gaseste in faza mobila, QM; uneori se utilizeaza pentru factorul de
capacitate simbolul K, dar este preferat k' care arata mai bine ca acest raport nu
are o valoare constants, decat in conditii bine stabilite:
k' =

Qs

CsVs

KpVs

QM

(1.44)

VM

Exprimarea ,,factor de retentie" este de preferat in locul aceleia de ,,factor de


capacitate" pentru a se evita confundarea acestuia cu ,,capacitatea coloanei" referitor la cantitatea maxima de subslanja care poate fi fixata pe coloana. Trebuie
subliniat ca marimile de retenfie depind de substantele implicate in procesul
cromatograf ic sj de coloane, respectiv de faza stationara, de aceea ele se pot exprima
unele prin altele.
Astfel, volumul de retentie VR se poate exprima in funcfie de coeficientul de
distribute KD si fracfia molara a analitului in faza mobila. Analilul se deplaseaza
prin coloana numai atunci cand el se gaseste in faza mobila, de aceea cantitatea
lui in faza mobilS se poate exprima prin fracfia sa molara in aceasta faza, care
este egala cu raportul analitului in faza mobila, QM si cantitatea totala de analit
introdusa in coloana, QT. Aceasta din urma este egala cu suma QM si Qs, deci
Ql = QM + Qs, astfel ca raportul de retentie se poate exprima astfel:
RR =

OM

RR =

CROMATOGRAFIA. APLICATII [N ANALIZA 51 CONTROLUL MEDICAMENTELOR

(1.45)

' = ^? d e u n d e V s = ^f

_
~

, astfel ca raportul de retentie primeste o alt3

M ~_ M

tR ~ VR ~ CMVM + K D C M

- = VM + k'VM

VR = VM + KDVS = VM
deci:

(1.50)
Ecuatia (1.50) se poate scrie sj sub forma urmatoare:
VR
= 1 -k'

VM

(1.51)

Tinand seama ca acest raport este egal cu raportul de retentie, conform ecuajiei
(1 .43), ca si de faptul ca raportul de retentie este egal cu raportul tM/tR (conform
ecuatiei 1 .5 1) se deduce o ecuatie referitoare la timp, deci:
1
VM MVi
RR = TT~
VR =.T~
' tR = 1 + k'

(1.52)
(1.53)

iar daca se inlocuie$te tM cu valoarea sa IM = L/VM se obtine o relatie care aratS


importanja deosebita a vitezei fazei mobile asupra timpului de retenjie:
L

Pe de alta parte Cs
expresie:

(1.49)

Prin inlocuirea Vs cu valoarea sa din relatia (1.48) se obtin:

= tM(l+k')
(1.46)

C M V M + CSVS

43

- Pentru exprimarea volumului de retemie si a timpuhu de retemic in funcfie de


factorul de retentie, k' se pleaca de la expresia volumului Vs in funcfie de
factorul de retentie (vezi relafia 1.44):

QM

iar QM = CM VM, raportul de retentie devine:

cum Qs =

CAPITOLUL 1

" k')

(1.54)

- In acest contextse potvalorifica ecuatiile 1.52si 1.53 pentru calculareafactorului


de retentie k', plecand de la timpii de retentie masurati pe o cromatograma:

VM
+ KDVS

k' = t R - t M
tM

de unde se poate deduce volumul de retentie astfel:

(1.55)

sau daca se tine seama ca tR - IM = tR (timpul de retentie corectat) se objine:


(1.48)

Aceasta este una din relafiile fundamentale ale cromatografiei, pentru un anumit
analit si evident pentru condi(ii experimentale bine definite, intre care in primul rand
timpul, temperatura, prcsiunea etc. Relatia (1.48) leagi volumul de retentie cu coeficientul de distribute KD 51 cu volumele de fazS stationara $i mobila.

k' = ^
tM

(1.56) '

Valoarea factorului de capacitate cre?te odata cu timpul t^ cu care este proportional.


Timpul mort t M este constant pentru o coloana data, pentru o substanfa neretinuta,
t R = t M iar k'=0;

CAPITOLUL 1

44

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICATM IN ANALIZA 51 CONTROLUL MEDICAMENTELOR

45

ICAJII IN ANALIZA l CONTROLUL MEDICAMENTELOR


CROMATOGRAFIA. APLi

In aceasta abordare numarul de platouri teoretice devine egal cu:

In temeiul celor discutate se poate aprecia ca optimizarea proceselor cromatografice in faza lichida necesita cautarea unui compromis intre valorile k' cerute pentru
o separarc buna a analitilor si timpul de analiza care trebuie sa fie cat mai scurt posibil.

1.2.2. Eficacitatea coloanei cromatografice


Eficienta coloanei cromatografice care se traduce prin eficacitatea separarii
cromatografice depinde in primul rand de numarul de platouri teoretice, fiind cu atat
mai mare cu cat acest numar este mai mare (este o situatie similara si in cazul extractiei,
mai ales in faza solida). Prin urmare un analist isi poate da seama de eficienta unei
coloane cromatografice, pe care o utilizeaza, prin determinarea numarului de platouri
teoretice al coloanei (data de relatia 1.57) care caracterizeaza functionarea coloanei.
~N umarul de platouri teoretice depinde de geometria si natura chimica a fazelor stajionara
si mobila, dar s.i de toti ceilalti factor! care influenteaza repartitia analitului in faza
stationara si mobila.
N=^(1.57)
n

De aceea, aa cum s-a aratat anterior, valoarea inaltimii platoului teoretic (sau
talerului teoretic) depinde nu numai de lungimea coloanei ci si de varianta picului
cromatografic in cauza, OL ; prin urmare:

(1.58)

'

Tnlocuind valoarea lui H in relatia lui N se objine:


(1.59)

De retinut ca abaterea tip o (varianta) a curbei Gauss este implicata in largimea


picului cromatografic, deoarece largimea bazei picului este identica bazei triunghiului
AGI si este egala cu 4oL, asa cum se poate observa din figura 1.13. Marimea H nu are
dimensiunile unei inaltimi, asa cum prevede teoria platourilor (conform careia se
exprima in mm). H putandu-se exprima in func^e de volumul de reten^ie VR, timpul de
retentie tR sau de distanta pana la maximul picului, dR, conform relajiilor urmatoare:

Hv

VR
" N

(1.60)

tR

(1.61)

dR

(1.62)

(1.63)

Iar daca se exprima a in raport de largimea bazei picului b, stiind ca o = b/4, se


obtine:
16dR 16VR 16tR
(1.64)

Evident ca din relaj:ia (1.64) se poate deduce ecuatia care da largimea bazei picului

(b):
_ 4dR = 4Vg _ 4tR

VN"

"

(1.65)

Din toate cele expuse rezulta ca numarul de platouri teoretice N se poate calcula
in functie de distanta d R a picului (adica din momentul injectarii pana la maximul
picului), de volumul de retentie VR, de timpul de retenfie tR si de largimea bazei picului
b sau chiar 5 = 1/2 h = 2,354a. Prin urmare se pot face pe cromatograma masuratori de
dR, de b si de largime a picului la semimaltimea acestuia, 8, ceea ce usureaza calcularea
numarului de platouri teoretice astfel:
16tR 5,54tR
(1.66)

Adesea se prefers masurarea largimii 5 a picului la semiinaltimea acestuia (h/2).


deoarece aceasta parte a picului este adesea mai simetrica decat intreg picul (care include
largimea b). Odata cunoscut numarul de platouri teoretice si lungimea coloanei cromatografice se poate calcula inaltimea talerului teoretic, H = L/N, pentru respectiva
coloana.
Din cele expuse, se poate trage concluzia ca eficacitatea unei coloane cromatografice este cu atat mai mare cu cat numarul de platouri teoretice este mai mare, respectiv
cu cat sunt mai mici baza picului b (sau 5) si abaterea tip OL a coloanei. Cu alte cuvinte
,,eficacitatea coloanei exprima insiisirea ei, capadtatea ei de a da picuri cat rnai sinietrke,
mai stramte $i cu baze mai rnici, condifii in care se ob^in cele mat bunc separari ale analitilor"
(vezi si rezolu|ia).
Este important de retinut faptul ca pentru o aceeasi coloana, deci pentru o aceeasi
faza stationara, distributiile analitilor intre faza stationara si aceea mobila sunt diferite
(analitii avand concentratii diferite), de aceea se obtin picuri cromatografice de forma
similara dar cu inaltimi diferite (desigur in condifii identice) si cu largimi diferite, iar
numarul platourilor teoretice difera de la analit la analit.

46

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

Inaltimeatalerului teoretic H si implicit eficacitatea coloanei este influentata de mai


multi factori. Teoria platourilor teoretice, desi a pevmis sS se traga unele concluzii
experimentale verificate, nu tine seama de faptul ca procesul cromatografic este continuu s.i ca el consta dintr-un continuu schimb Tntre fazele mobila s.i stajionara. Pe de alia,
procesele de separare cromatografica sunt influentate de condifiile in care se face
trecerea fazei mobile prin f aza stationara, mai ales daca se modif ica debitul fazei mobile,
ceea ce determina largirea sau ingustarea picurilor, iar de astfel de probleme teoria
platourilor teoretice nu poate sa fina seama. In schimb teoria cinetica (a lui Giddings)
referitoare la Tnaljimea talerului teoretic, coreleaza acest parametru H cu numarul
talerelor teoretice al coloanei, cu viteza de curgere a fazei mobile, cu temperature si cu
aparatura. In continuare sunt discutaji cativa factori care inf luenteaza Tnaltimea platoului teoretic si deci ef icacitatea acestuia:
- viteza liniarS de curgere a fazei mobile este guvernata pentru cromatografia in
faza gazoasa de ecuatia lui van Deineter:
H = A + + cvm
Vm

(1.67)

A = difuzia turbulenta detenninata de curgerea neregulatfi a fazei mobile prin


coloana/faza stationara
B = difuzia longitudinals
C = coeficientul de rezistenta la transferul de inasa
difuzia turbulenta este data de particule solide mici, acoperite sau nu cu un film
subtire de lichid, cu forma si traiecte diferite de deplasare. Viteza de curgere
este cu atat mai regulata si mai apropiata de profilul teoretic cu cat particulele
de faza stationara sunt mai omogene si cu cat coloana este umpluta mai regulat
mai uniform. inaintarea neregulata a analijilor ce trebuie sa fie separati
cromatografic, produce turbulence care determina largirea zonei, in care se afla
f iecare analit, prin difuziune turbulenta. Difuzia turbulenta A, depinde in afara
de debitul fazei stationare sj de caracteristicile particulelor, crescand cu
diametrul lor (vezi figura 1.16).

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICATM JN ANALIZA $l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

47

- difuzia longitudinals B, exprima influenfa difuziunii moleculelor Tn directia de


curgere a fazei mobile asa cum se poate observa din figura 1.17.

Stif
Figura 1.17 Reprezentarea schematica a difuziunii longitudinals, B

Difuziunea longitudinals este un proces general valabil pentru toate particulele


care se gasesc intr-un fluid (lichid, gaz, fluicle supercritice) care se deplaseaza, acest
proces fiind cu atat mai accentual cu cat viteza de curgere a fluidului este mai mica, asa
cum rezulta din expresia termenului B/vm din ecuatia (1 .67). Valoarea difuziei longitudinals se poate calcula folosind relafia:
B = 2yDM

(1.68)

in care:
yeste un factor de intortochere care exprima influenta coloanei adica influenta
granulelor (granulometria) si uniformita|ii umplerii coloanei, fiind cu atat mai
mica cu cat inaintarea moleculelor de analiti si a fazei mobile este mai uniforma;
DM este coeficientul de difuziune moleculara a analitului considerat Tn faza eluata
(efluent), care Tn cazul fazelor mobile lichide este foarte mic (neglijabil), dar
Tn cazul gazelor este de 104-106 ori mai mare, si creste cu cre?terea temperaturii,
scazand insa cu presiunea.
- coeficientul de rezistentS la transferul de inasa C, reprezinta inegalitafile de pasaj
(trecere) a moleculelor dintr-o faza Tn alta; astfel de procese se produc si la
fixarea analifilor pe particulele de faza stajionara si Tn timpul elutiei, deci tot
tiinpul proceselor cromatograf ice; se pot distinge trei situatii asa cum rezulta din
figura 1.18.

Figura 1.16 Reprezentarea schematica a difuziei turbulente A


Figura 1.18 Reprezentarea schematica a rezistentei la transferurile de masa

48

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

(a) nu toate moleculele din faza mobilS sunt antrenate cu aceeasi viteza, constatandu-se ca cele din mijlocul fluxului se deplaseaza cu o viteza mai mare decat
cele dinspre exterior (dinsprc perejii coloanei), de aceea conclitiile de repartitie sunt diferite (vezi f igura 1.18 a)
(b) contactul dintre fazele mobila si stationara nu este identic peste tot, deoarece
traiectul de la suprafata este diferit de eel dintre sinuozitatile din interiorul
suportului (vezi f igura 1.18 b)
(c) cand faza stationara este lichida, deci cand particulele de suport solid sunt
acoperite cu o pelicula de lichid, moleculele fixate pe faza stationara se gasesc
la distante diferite fata de faza mobila; de aici rezulta ca elujia nu se face cu
aceeasi viteza pentru toate moleculele, timpul de sedere a acestora Tn faza
stationara este functie de drumul ce trebuie parcurs (vezi f igura 1.18 c).

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

- inaltimea redusa:

h = -7dp

Se poate dovedi matematic si graf ic, pe baza ecuatiei lui Deemter ca prin cresterea
debitului fazei mobile se produce o crestere a inaltimii talerului teoretic H, ceea ce are
ca urmare scurtarea timpului de contact a fazei mobile cu cea stationara, astfel ca
echilibrele n-au timpul necesar pentru a se stabili complet. Daca viteza fazei mobile este
mai mica decat viteza optima v0 = VB/C , devin preponderente fenomenele de difuziune
longitudinala, ceea ce contribuie de asemenea la cresterea lui H.
Marimi reduse. Aceste marimi se utilizeaza pentru a se putea compara mai bine
intre ele, metodele cromatografice Tn faza gazoasa, lichida si supercritica, scop pentru
care se si produc coloane diferite care opereaza Tn condi|ii diferite. Marimilc reduse sunt
marimi fundamental definite anterior, dar exprimate Tn functie de marimea particulelor, aclica de diametrul lor ,,dp" pentru coloane umplute, sau pentru coloane capilare
neumplute, care an diametrul interior ,,dc". Se definesc Tn aceasta idee urmatoarele marimi
reduse:
- lungimea redusa:
i
i
l=i- ?i l=i(1.69a)
dn

h=
dc

(1.69b)

Aceasta marime reprezinta pentru o coloana uinpluta, inaltimea coloanei de faza


stationara, sau de suport, ocupatS de un ,,volum de particule" care corespund
echilibrului analit-faza mobila-faza stationara. Inaltimea redusa are. in vecinatatea
conditiilor optime, valori intre 2 si 4. Rezulta ca dona coloane (sau mai multe)
umplute cu particule cu diametre diferite, pot sa aiba aceeasi Tnaltime redusa si deci
aceeasi eficacitate, in functie de conditiile de lucru experimental.
viteza redusa este data de relatia urraatoare:
Vmdp
1

Toate accstc situatii si procese de care trebuie sa se Jina seama, determina


intarzieri la stabilirea echilibrelor cu atat mai accentuate cu cat debitul fazei mobile este
mai mare (deci viteza de curgere a fazei mobile este mai mare). De aceea trebuie sa fie
atenuati acesti factor! prin micsorarea distantelor ce trebuie parcurse in fiecare faza,
reducand diametrul particulelor, grosimea fazei stationare si utilizand coloana cu umplutura regulata si bine tasata pentru a nu include goluri (tasarea nu trebuie sa fie
exagerata).

si

49

~ DM

(1.70)

Tn care:
vm este viteza liniara medie a fazei mobile
dp este diametrul particulelor
DM este coeficientul de difuziune moleculara a analitului in eluat
Viteza redusa arc evident dimensiunile unei viteze si ea intervine si in ecuafia
lui Knox de calculare a valorii Tnal{imii reduse h, a platoului teoretic:

+ CV

(1.71)

Tn care:
A este difuzia turbulentS
B este difuzia longitudinala
C este coeficientul de rezistenta la transferurile de masa.
inaltiinea redusa a platoului teoretic h r este alcatuita din trei componenta si
anume: h = h - difuziune turbulenta + h-difuziune longitudinala + h-transfer de
masa Tn care:
- h - difuziune turbulenta = Av'{3 si reprezinta anizotropia curgerii si
dependentei de granulatie sau granulometrie, ca si de buna umplere a
coloanei; A trebuie sa fie cuprins Tntre 0,5 si 2, iar valori mai mari decat
acestea arata o umplere necorespunzatoare si o granulafic neregulata.

dc

La traversarea unei coloane de catre un analit se tine seama ca traversarea este


functie pe de o parte de lungimea coloanei, iar pe de alta parte de numarul de
particule cu diametrul dp, intalnite in cale. Doua coloane pot avea aceeasi
lungime redusa I = L/dp, daca acest raport ramane constant. In aceasta conceptie
rezulta ca o coloana mica poate avea aceeasi lungime redusa ca si o coloana mai
lunga, daca ea se umple cu particule care an un diainetru mai mic, iar analitii
care traverseaza astfel de coloane intalnesc acelasi numar de particule.

- h - difuziune longitudinala = , exprima influenta difuziunii longituclinale


YIa analitului in fazele extra si intragranulara; valoarea lui B este de cca 2.
- h - transfer de masa = Cv v si exprima influenta transferului de masa a
analitului Tntre cele doua faze, stationara si mobila.

50

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAF1A. APLICAJII IN ANALI2A ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

Din cele expuse rezulta ca exists o diferenta intre circulatia (deplasarea) fazelor
mobile extra si intragranulara de aceea repartitia analitului intre cele doua faze este
diferita, iar factorial de rezistenta, C, la transferurile de masa se poate exprima prin
relatia:
C = Cs + CM
(1.72)
- Cg = rezistenta la transferul de mas3 dinspre faza stationary catre faza mobila
- CM = rezistenta la transferul de masa dinspre faza mobila spre stationara
Factorul de rezistenta C poate fi considerat ca fiind panta dreptei h = /(vr) iar
valorile lui trebuie sa fie cuprinse intre 0,01 si 0,02, dar pot fi si mai mari in cazul
analitilor voluminosi (proteine sau faze stationare polimerice).
Datele si constatarile mentionate mai sus sunt valabile si pentru cromatograf ia de
gaze, cazuri in care este implicata si variatia temperaturii, astfel ca inaltimea talerului
teoretic poate fi corelata si cu temperature, prin ecuajia (1.73):

CAPITOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICAJII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAWIENTELOR

51

Prin urmare, relatia (1.74) arata ca intre migrare si concentratie exist! o relafie
care are unele implicatii si consecinfe practice importante in efectuarea separarii cromatografice, deoarece depunerea unei substante pe o coloana cromatografica nu este
riguros uniforma ci neregulata s.i de acest fapt trebuie sa se tina seama, avand in vedere
ca:
atunci cand distribufia este liniara se poate scrie:
8x/5t
1_
5v/8t ~ P + KD

(1.75)

deoarece /'(Cs) = K, deci o Constanta. In astfel de cazuri concentratia nu


intervine in viteza de deplasare a substantei, iar aceasta este aceeasi in toate
punctele coloanei. Evident ca in aceste cazuri picul este simetric de tip Gaussian

(1.73)

1.2.3. Simetria picurilor si modificarea formei lor


Atunci cand un pic de elutie are o forma Gaussiana se poate considera ca
distribujiaanalitului intre faza stafionara si cea mobila se face intr-un mod regulat, adica
ea mi depinde de concentratie. fiind aplicata relatia (1.19):

Figura 1.19 Izoterma liniara de distributie, pic Gaussian

Cs = KDM
Totusj, distributia termodinamica a analitului nu este intotdeauna perfect regulata,
datorita f enomenelor de adsorbtie care pot interveni sau cand este vorba de cantitati mari
de substante care trebuie sa fie separate cromatografic. In astfel de cazuri picurile nu
mai an forma simetrica datorita modif icarii repartitiei s.i migrarii cromatograf ice, ceea
ce inseamna ca viteza de migrare a unei substance in raport cu viteza fazei mobile este
legata de concentratie printr-o ecuatie diferentiala.
6x/5t

5v/5t

P+f(Cs)

(1.74)

- 8x/ 8t reprezinta viteza de deplasare a substantei, exprimata in distanta 8x parcursa de


substanta in coloana in timpul 8t;
- Sv/ 8t reprezinta viteza de deplasare a fazei mobile, adica volumul Sv de faza mobila
care traverseazS coloana in timpul St
- P = un factor care depinde de caracteristicile coloanei
= dC<; /dC]yi este derivata concentratici substantei in faza stafionara in raport
cu concentratia in faza mobila.

asa cum apare in Figura 1.19 al izotermei liniare.


in cazurile in care intervin fenomcne de adsorbtie, izotermele de distributie nu
mai sunt liniare, variind in functie de concentratie, conform legii lui Freundlich:
Cs = KC&

(1.76)

a = o constanta care depinde de substanfj, de adsorbant si de faza mobila.


Pentru cazuri de acest fel pot exista dou3 situatii practice:
(a) izotermele de distributie pot fi concave in raport cu abscisa, cand a < 1, deci
cu cat substanta este mai concentrata, CM este mai mare si cu atat derivata
f(Cs) devine mai mica, ceea ce duce la cresterea raportului in relatia (1.74);
migratia devine mai mare, iar punctele cromatogramei in care concentratia
este mai mare, migreaza mai rapid decat cele in care concentratia este mai
mica; de aceea zona de elutie se deformeaza, nemaif iind regulata; consecinta
este cS in cromatograf ia prin developare cromatograma prezinta o ,,coada",
iar in cromatograf ia de elutie picurile prezinta o ramura ascendenta mai intinsa
care corespunde fractiunilor mai sarace care migreaza mai incet, figura 1.20.

CAPITOLUL 1

52

CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA SI CONTROLUL MEDICAMENTELOR

CAPIVOLUL 1

CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA SI CONTROLUL MEDICAMENTELOR

53

100-

5Q-\

53
<S

Figura 1.20 Izoterma de distributie concava nesimetrica


(deformata, nemaifiind Gaussiana)

10-

timp
(b) izotermele de distributie pot fi convexe in raport cu abscisa, caz in care <x>l,
iar vitezele de migrate sunt invers proportionate cu concentratiile. Si in aceste
cazuri, mai putin frecvente, picurile nu sunt Gaussiene (Figura 1.21).

Figura 1.22 Reprezentarea asimetriei unui pic cromatografic si masurarea


largimii lui la 1/10 sau 1/20 din Tnal{imea sa

1.2.4. Largirea picurilor si dilutia cromatografica


C's

Plecand de la constatarea ca deplasarea unui analit in lungul coloanci cromatografice este Tnsotita de creterea volumului solutiei in care se gasete analitul (prin
adaugarea fazei mobile), fata de volumul probei lui introdus in cromatograf, sc produce
o largire a picului, concomitent cu micsorarea inaltimii sale clatorita diluarii analitului
in faza mobila, asa cum se poate observa in figura 1.23.

Figura 1.21 Izoterma de distributie convexS, nesimetrica, deformata,


ne-Gaussiana)

In cazurile picurilor asimetrice se poate exprima asimetria prin compararea


largimii unui pic la 1/2 din inalfimea lui (deci semilargimea) pe perpendiculara ce
coboara din maximu! picului pe abscisa. Intrucat exists dificultati inevitabile de determinare a largimii unui pic la baza sa, se fac masuratori pe o paralela la abscisa la 1/10
sau 1/20 din inaltimea picului, asa cum se observa in figura 1.22.
Se poate utiliza ,,factorul de asimetrie" pentru exprimareaacesteia, factor care este
egal cu raportul dintre semilargimile la 1/10 din inaltimea picului OB'/OA' sau ,,factorul de
simelrie" care se refera la 1/20 din inaltimea picului, dat de raportul b0i05/2A sau b0>05/AB
si A=OA.

timp
Figura 1.23 Reprezentarea largimii unui pic cu timpul deplasarii analitului in
coloana odata cu faza mobila

Fenomenul de largire a picurilor cromatografice depinde de eficacitatea coloanei


exprimata prin inaltimea talerului teoretic H sau prin inallimea lui redusa h, tinandu-se
seama de:
- natura fazei stafionare, de diametrul particulelor, de calitatea umplerii coloanei;
- de fenomenele ce insotesc curgerea fazei mobile, care depind de temperatura si
presiune;
- de natura analitului.