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Reacciones de Precipitacin Marzo 25, 2009

Reacciones de Precipitacin
Universidad Nacional Autnoma de Mxico.
Facultad de Estudios Superiores Zaragoza
Laboratorio de Inmunologa L-121, Campus I
Prez Prez Jos Manuel ____________
Prez Sevilla Alma Beatriz ____________
Equipo 3, Grupo 2802

Introduccin:
Los ensayos inmunolgicos se basan en la
especificidad de la unin Ag.- Ac. La unin antgenoanticuerpo depende de la complementariedad entre
ambas molculas.
En la interaccin in vitro de un Ag. con su
correspondiente Ac. se distinguen 2 etapas
1 Interaccin primaria: unin de un Ag. y su
correspondiente Ac. No es visualizable directamente y
no es demasiado influenciada por la temperatura, la
concentracin salina o la fuerza inica ni la agitacin.
Slo depende de la complementariedad.
2 Interaccin secundaria: los complejos inciales,
se agregan para dar diferentes fenmenos visibles
cuya caracterstica depender principalmente de la
naturaleza del antgeno. Esta etapa se acelera con la
temperatura, la agitacin y es dependiente de la
concentracin de electrolitos.
Las reacciones de interaccin secundarias son:
Precipitacin:
En este caso el antgeno es una molcula soluble y al
ponerse una solucin del mismo, en contacto con los
anticuerpos que origin, se forman complejos Ag-Ac
que al insolubilizarse en su mayor parte, dan una
reaccin de precipitacin, se desarrolla rpidamente
formndose los complejos Ag-Ac. despus los
complejos se agregan formando micelas o redes que al
alcanzan determinado tamao y precipitan. Esta etapa
se acelera con el aumento de la T (se la lleva a cabo
normalmente a 37C) y es adems dependiente de la
concentracin de electrolito.

Los tipos de reacciones de precipitacin son:


En medio slido (precipitacin en gel):
Se usa como soporte de la reaccin un gel de manera
que las molculas difundirn libremente a travs de l
y a lo largo del recorrido se ir formando un gradiente
de concentraciones que har que en un determinado
punto los reactivos se encuentren en su relacin de
equivalencia, en ese punto se producir un precipitado
que sobre el gel se ver como una ntida banda blanca
que permanece estable mientras un mayor flujo de
reactantes no provoque su re disolucin. .
Difusin simple monodimensional (mtodo de
Oudin): Se coloca en un tubo de ensayo agar fundido
mezclado con un vol. igual del antisuero a analizar (en
este caso queremos detectar la presencia de un Ac.)
Se deja solidificar y se aade la solucin de Ag, este
va a difundir por el agar formando un gradiente de
concentracin decreciente hacia el fondo del tubo, en
determinada zona Ag y Ac. alcanzarn la relacin de
equivalencia, formndose ah la banda de precipitado.
Difusin doble monodimensional ( mtodo de
Oakley Fulthorpe): En este caso colocamos en la
parte inferior del tubo un vol. de agar 1% fundido,
mezclado con un vol. igual del antisuero, dejamos
solidificar y agregamos igual vol. de agar 0,5%,
dejamos solidificar y por ultimo agregamos agar 1%
donde se encuentra disuelto el Ag.
Tanto el Ag. como el Ac. migrarn hacia la zona
media de menor concentracin, de manera que, otra
vez, se formarn gradientes .En este caso los reactivos
difunden en forma radial a partir del pocillo
generando
bandas
de
precipitacin
cuyas
caractersticas dependern de varios factores y
1

Reacciones de Precipitacin Marzo 25, 2009


determinado punto los reactivos estn en equivalencia
y precipiten.
- Difusin doble bidimensional (mtodo de
Ochterlony): Consiste en colocar en una placa de
Petri agar 1,5% al cual luego de solidificar se le
realizan perforaciones en forma de pocillos a distancia
conveniente y en dichas perforaciones se colocan
pequeas cantidades de Ag. y Ac. En este caso los
reactivos difunden en forma radial a partir del pocillo
generando bandas de precipitacin.
Esta tcnica es una doble difusin en agra, el
antgeno y anticuerpo se difunden en un medio
forman un inmunopresipitado estable.
-Mtodo de Macini. Inmunodifusion radial.
Sistema bidimensional en difusin cualitativa como
cuantitativa. La difusin radial del antgeno produce
un precipitado cuyo dimetro al cuadrado es
proporcional a la concentracin de antgeno. Esta
tcnica determina cuantitativamente la concentracin
del antgeno.
-Contra inmunoelectroforesis
Conocido como inmunofloresis, el mtodo se basa en
la electroforesis simultanea de antgeno y anticuerpo,
en direcciones opuestas, de pozos separados en el gel,
los anticuerpos se mueven hacia el ctodo debido a un
fenmeno de electroendosmosis, mientras el antgeno
que debe estar cargado negativamente se mueve al
anado, en el punto de encuentro se observa una
precipitacin. Solo se puede usar antgeno con carga
negativa
-Inmuno electroforesis
Combina 2 tcnicas la electroforesis y la
Inmunodifusion radial. La electroforesis que separa a
las protenas en sus constituyentes de acuerdo a sus
diferentes propiedades inicas, basada en la migracin
proteica.

Objetivo:
Evaluar y comparar los diferentes mtodos de
precipitacin,
como
precipitacin
en
capilar,
Inmunoelectroforesis, precipitacin en gel por mtodo de
Ouchterlony, Contrainmunoelectroforesis con en diferentes
antgenos, y anticuerpos.

Diagrama de Flujo:
Inmunoprecipitacin en capilar
Dividir 12 capilares en 4
Realizar diluciones del suero de rata (Ab)

Tomar el capilar y absorber por capilaridad el Ag


(anti suero de rata) hasta la primera marca
Girar 180 el capilar y por el otro extremo tomar la
dilucin del Ab hasta la primera marca.
En una barra de plastilina colocar cada capilar
Realizar para cada dilucin del ab
Llenar 2 capilares uno con Ag y otro con Ac
Dejar a temperatura ambiente 1 hora y guardar en
refrigeracin 48 horas
Tcnica de Ouchterlony

Barnizar con
agarosa al 0.1%

-Electroforesis
La electroforesis en acetato de celulosa separa las
protenas del suero en cinco fracciones que son la
albumina y la globulinas (alfa 1, alfa 2, beta y gama)

Perforar el agar
conagujeros.
Adicionar antgeno
en los pozos
inferiores Incube 24
horas en cmara
hmeda

Adicionar un
anticuerpo en el
pozo superior

Reacciones de Precipitacin Marzo 25, 2009

Resultados:

Inmunoelectroforesis
En una placa con agar
realizar un canal y dos
perforaciones colocar
en una el suero
problema y en el otro
gammaglobulina

Precipitacin en capilar.
Tabla 1.Precipiracin del complejo (Antigeno-Ancicuerpo) en
milmetros (mm) con respecto a la concentracin de Antigeno
adicionada (%/mL).

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

1
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
1:64
1:128
1:256
1:512

Concentracin
%/mL
100.0000
50.0000
25.0000
12.5000
6.2500
3.1250
1.5625
0.7812
0.3906
0.1953

11 Blanco

Antisuero de Rata

Negativo

12 Blanco

Suero de Rata

Negativo

Tubo
Adicionar azul de
bromofenol y correr la
electroforesis por 30
minutos a
30miliamperes

Adicionar antisuero
humano y dejar
precipitar durante 24
horas en cmara
hmeda

Contrainmuno
electroforesis

Precipitacin
(mm)
15
10
9
8
7
5
4
3
2
1

Grafica 1. Curva de calibracin, para la zona de equilibrio del


antgeno suero de rata contra anticuerpo de suero de rata

Curva de calibracin de mm de precipitacin


vs concentracin de antigeno de rata

Realizar en un
gel de agarosa
dos perforaciones

oresis

16

14

Colocar en un
pozo el antgeno,
y en otro el
anticuerpo y
ejercer corriente.
Por 30 minutos

Precipitacin (mm)

Dilucin

12
10
8
6
4
2
0
-5.00 5.00 15.00 25.00 35.00 45.00 55.00 65.00 75.00 85.00 95.00105.00

% de Antigeno/mL

Mtodo de Ouchterlony
Se realizo 3 sistemas en una placa de agarosa como se
muestra en la imagen

Reacciones de Precipitacin Marzo 25, 2009

Imagen A. Diseo de Identidad Cruzada, No identidad e


Identidad Total, en todos los casos no se observo precipitacin

Tabla 2. Resultados de 3 sistemas propuestos de precipitacin


por el mtodo de Ouchterlony
Sistema
Ac
Ag
Experimental Esperado
Identidad
Cruzada

Anti-AHV

No
Identidad

Anti- GM
Anti-AHV

Identidad

Anti-AHV

AHM

Negativo

AHV

Negativo

AHV
GH
AHV

Negativo
Negativo
Negativo

AHV

Negativo

Identidad
cruzada de
AHM y AHV
Precipitado
Precipitado
Curva
homognea de
precipitacin

AHM = Albumina Humana


AHV = Albumina de Huevo
ANTI-AH = Antialbumina de Huevo
GH = Gamaglobulina Humana
ANTI-GM = Anti-gamaglobulina Humana
ANTI-AHV = Anti Albumina de Huevo
ANTI-AHV = Anti Albumina de Huevo

Imagen C. Se observa banda de precipitacin en


gammaglobulina y albumina por lo cual se encuentra
contraminado con albumina
Tabla 4. Resultados de Inmunoelectroforesis de suero humano
total y Gammaglobulina, para observar la pureza de sta ultima
Sistema con anti
Experimental
Esperado
suero humano
Suero Humano Total
Gammaglobulina
Humana

Mltiples bandas
Varias bandas

Mltiples bandas
Una banda en
Gamaglobulina

Electroforesis
Se diseo un sistema con tres muestras los cuales se colocaron
por duplicado y triplicado, en acetato de celulosa.

Suero humano
globulina

Contrainmunoelectroforesis
El sistema se diseo con Gammaglobulina Humana, GHM
y Anticuerpo para Globulina Humana ANTI-GMH.

Albmina humana
Suero humano
globulina
Albmina humana
Suero humano

Imagen B. Sistema con GMH y Anti-GMH, con nula


precipitacin a los 20 minutos, debido a la ruptura del agar .

globulina
Imagen D. Corrimiento electrofortico de 8 muestras,

Tabla 3, Resultado del sistema propuesto para


contrainmunoelectroforesis.
Diseo
Experimental
Esperado
ANTI-GMH vs GMH

Negativo a
precipitacin

Precipitacin

Inmunoelectroforesis
Inmunoelectroforesis, mediante Suerto Total Humano, y
Gamaglobulina Humana, en el canal se deposito Antisuero
total

Anlisis de Resultados:
Precipitacin en capilar
La concentracin del suero de rata se tomo a una
concentracin de 100%/mL debido a que no se
conoca la concentracin, adems el suero proviene
de un animal previamente sangrado. Tabla 1.

Reacciones de Precipitacin Marzo 25, 2009


En este experimento no se logro obtener la zona de
equilibrio de antgeno y anticuerpo en suero de rata
debido a que se requera mayor dilucin del suero de
rata (antgeno) debido a una alta concentracin de
ste, Grafica 1.

Mtodo de Ouchterlony
Mediante este mtodo se diseo tres sistemas para la
identificacin de antgenos con identidad parcial, no
identidad y identidad total, se esperaba como lo indica
la tabla 2, que en los tres sistemas se registrara
precipitacin con sus respectivos resultados, sin
embargo al realizar la lectura a las 72 h, no se obtuvo
precipitacin, probablemente a una nula zona de
equilibrio entre el anticuerpo y el antgeno, llenado
inadecuado, velocidad de difusin tarda, incubacin y
que los recipientes de antgenos o anticuerpos
estuvieran contaminados, todos estos factores,
probablemente con llevaron a no observar
precipitacin.
Mtodo de Contrainmunoelectroforesis
En ste mtodo se esperaba la una zona de
precipitacin en la cual el anticuerpo de
gammaglobulina humana hubiera precipitado al
antgeno gammaglobulina humana Imagen B, sin
embargo no se observo, posiblemente a que se haya
colocado de manera inadecuada el antgeno y
anticuerpo, o que ambos no se correspondieran Tabla
2, tambin es posible a una nula zona de equilibrio,
as como tiempo de incubacin o contaminacin de
ambos reactivos.

Imagen C, y se comparo con una muestra de gamma


humana para observar la pureza de la muestra Tabla 4,
la cual presento varias bandas, en especial en la
albumina, por lo cual la muestra de gammaglobulina
no se encontraba pura. Debido a una inadecuada
dilucin por utilizar pipetas no calibradas o de
diferente volumen, y se debe considerar que el estudio
no se llevo bajo condiciones estandarizadas como el
manejo de la muestra, tratamiento y errores del
operador.

Conclusin:
Con base en el anlisis de resultados, se cumpli de
manera parcial el evaluar y comparar los mtodos de
precipitacin en capilar, mtodo de Ouchterlony,
Contrainmunoelectroforesis,
Inmunoelectroforesis
y
electroforesis, con diferentes antgenos y anticuerpos
respectivos, debido a que solo se logro evaluar los mtodos
de Inmunoelectrodifusin y electroforesis, se debe
considerar que el estudio no se llevo bajo condiciones
estandarizadas como el manejo de la muestra, tratamiento
y errores del operador, factores que contribuyeron a un no
cumplimento total de los objetivos.

Referencias:
Gualde N, Bourinat-Lafon J. Inmunologa. Mxico: Ed. Norma,
1994: Vol. 20: 23-50
Hudson L. C. Hay F. Inmunologa prctica. Espaa: Ed. Jims,
1979: 27-51.
Roitt I, et al. Inmunologa. 5 edicin. Espaa: Harcourt, 2000:
1- 26
Anbal Margni R. Inmunologa e inmunoqumica fundamentos.
Argentina: Ed. Panamericana, 1996: 418-423.

Mtodo de Inmunoelectrodifusin.
En una primera etapa se lleno un pozo con Suero
Humano Total (parte superior) y en otro con
Gammaglobulina (parte inferior) purificada en
sesiones anteriores, se realiza la electroforesis en la
cual separo cada muestra en su carga y peso,
posteriormente se utilizo un antisuero humano el cual
se coloco en el pozo entre cada muestra y con ello se
comparo las bandas del suero total humano contra
antisuero total, en la cual se observo mltiples bandas
5