Sunteți pe pagina 1din 9

Curs 7.

Testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice.


Metode de testare a sensibilitii bactecteriilor la ageni antimicrobieni
7.1. Metode de testare a sensibilitii in vitro
Antibiograma face parte din prima categorie de metode menionate. Reprezint metoda
de laborator prin care se apreciaz sensibilitatea la antibiotice a germenilor recoltai de la
bolnavii cu infecii bacteriene, dup cultivare pe medii mbogite, care s permit
dezvoltarea optim a microorganismului pentru care se efectueaz testarea (de exemplu
pe agar Mueller-Hinton).
Pentru antibiograme trebuie s folosim culturi pure (reprezentnd o singur tulpin
bacterian), chiar n cazul infeciilor multibacteriene. Cele mai frecvent utilizate tehnici
sunt:
a) Tehnicile calitative:
- antibiograma difuzimetric comun (cu discuri)
- antibiograma difuzimetric comparativ
- antibiograma difuzimetric standardizat
- antibiogramele difuzimetrice rapide
b) Tehnicile cantitative:
- metoda diluiilor n mediu lichid
- metoda diluiilor n agar
- metoda microdiluiilor n agar
- metoda punctelor de ruptur
- testul E
- metode i sisteme comerciale, automatizate, de testare etc.
7.1.1. Antibiograma difuzimetric comun
Din punct de vedere tehnic nsmnm germenul de testat pe mediul solid
(ex. agar Mueller-Hinton) turnat n plci Petri. nsmnarea se poate realiza de exemplu
prin inundarea plcii urmat de aspirarea, aseptic, a excesului de inocul sau cu ajutorul
unui tampon (exist i alte variante tehnice). Dup circa 20 minute (timp n care placa
Petri se las cu capacul ntredeschis n vecintatea becului de gaz, aprins) se aplic
microcomprimatele n care sunt ncorporate antibiotice n concentraie standardizat.
Aplicarea microcomprimatelor se poate face cu ajutorul unei pense, n condiii aseptice,
sau cu ajutorul unui aplicator automat (la minim 30 mm distan ntre ele i minim 15
mm de marginea plcii; vom utiliza 5 antibiotice diferite pentru o plac Petri cu diametrul
de 9 cm).
Microcomprimatele trebuie s vin n contact perfect cu mediul, motiv pentru
care, cu ajutorul unei pense le presm uor (dup caz). Dup nc 15-20 minute, incubm
plcile peste noapte n termostat, la 28 sau 35-37C, n funcie de temperatura optim de
multiplicare a microorganismului testat.
Antibioticul eliberat din microcomprimat difuzeaz n mediu, realiznd zone de
inhibiie n care coloniile microbiene nu se dezvolt.
Cu ct zona de inhibiie este mai larg, cu att germenul va fi considerat mai sensibil.
Dac n interiorul zonei de inhibiie (chiar dac diametrul nregistrat este foarte mare) se
dezvolt colonii, mutani rezisteni, germenul va fi considerat rezistent.

Aceast metod, cu toate c este folosit pe scar larg n laboratoare, permite de fapt
numai eliminarea antibioticelor complet inactive i eventual selecionarea antibioticelor
foarte active, pentru c tehnica nu este standardizat.
7.1.2. Antibiograma difuzimetric comparativ (Stokes, Bal)
Se efectueaz pentru microorganismul de testat n paralel cu un microorganism de
referin, din aceeai specie (sau o specie asemntoare). Spre exemplu, pentru cocii
Gram-pozitivi putem alege pentru comparaie o tulpin de Staphylococcus spp. Tulpina
de referin are o sensibilitate cunoscut la diferitele antibiotice pe care le utilizm.
Prin aceast metod se nltur o parte din factorii de eroare ai metodei precedente, spre
ex. calitatea mediului, calitatea discurilor de antibiotice, care vor fi identice pentru
microorganismul de referin i pentru microorganismul testat. Rezultatele se exprim cu
termenii: sensibil, intermediar, rezistent, n funcie de diametrul zonelor de
inhibiie a multiplicrii celor doi germeni, fa de acelai antibiotic (jumtile de cerc se
examineaz comparativ). n cazul n care cunoatem CMI (concentraia minim
inhibitorie) a microorganismului de referin, putem face aprecieri cu privire la CMI
pentru microorganismul testat.
Din punct de vedere tehnic, pe o plac de forma unui ptrat (mprit n 3 zone egale
marcnd pe partea extern a plcii liniile de demarcaie) se inoculeaz n treimea medie
microorganismul de referin iar n treimile exterioare 2 microorganisme diferite, pentru
care dorim s realizm testarea. Inoculul trebuie s fie astfel realizat nct s conduc la
apariia dup incubare a unor colonii foarte apropiate, dar care s nu fie confluente.
Plasm microcomprimatele cu antibiotice pe liniile de demarcaie dintre culturi. Incubm
peste noapte la 35-37C urmnd ca n ziua urmtoare s citim i s interpretm
rezultatele.
7.1.3. Antibiograma difuzimetric standardizat (Kirby-Bauer, NCCLS)
Din punct de vedere tehnic se realizeaz asemntor cu prima metod prezentat, dar este
standardizat, fiind singura metod difuzimetric recunoscut pe plan internaional, care
permite obinerea unor rezultate reproductibile i corelabile ntre laboratoare diferite.
Elementele necesare standardizrii sunt:
- mediul (n majoritatea cazurilor agar Mueller-Hinton, pentru c are o valoare
nutritiv corespunztoare i nu conine substane cu aciune inhibitoare)
- exist elemente minerale care trebuie adugate n cazul testrii anumitor
microorganisme (ex. Mg2+ i Ca2+, pentru tulpini de Pseudomonas aeruginosa,
atunci cnd este testat sensibilitatea la aminoglicozide);
- se va verifica pH-ul mediului (de obicei cuprins ntre 7,2 i 7,4);
- exist suplimente nutritive care trebuie adugate n cazul testrii unor
microorganisme pretenioase;
- grosimea mediului trebuie s fie de 4 mm (25 ml de mediu/plac de 9 cm);
- inoculul, care se obine de preferat din 5 colonii izolate (cultur pur) i trebuie s
aib o turbiditate corespunztoare standardului turbidimetric 0,5 McFarland
(circa 108 uniti formatoare de colonii/ml) n majoritatea cazurilor;
- timpul de incubare (n majoritatea cazurilor 16-18 ore la 35-37C, nu mai mult de
2-3 plci suprapuse), atmosfera de incubare, umiditatea atmosferei de incubare;

concentraia substanelor antimicrobiene din microcomprimate i dimensiunea


microcomprimatelor (6 mm diametru);
- alegerea substanelor antimicrobiene pentru care se face testarea;
- pstrarea plcilor cu mediu pn n momentul utilizrii (maxim 7 zile, n pungi de
polietilen, la +4C);
- utilizarea tulpinilor de referin pentru controlul de calitate;
- interpretarea rezultatelor (se msoar diametrul zonei de inhibiie i se compar
rezultatele cu cele din tabelele puse la dispoziie de productori i/sau centrele de
referin).
Metodele difuzimetrice au dezavantajul c nu permit aprecierea concentraiilor eficace
ale antibioticului la nivelul focarului infecios.
7.1.4. Metoda diluiilor n mediu lichid
Acest tip de metod ofer informaii cu privire la CMI ale antibioticelor studiate,
fa de microorganismul testat. CMI = concentraia minim inhibitorie, reprezint cea
mai mic concentraie de agent antimicrobian, exprimat n micrograme/ml, care mai
exercit o aciune bacteriostatic asupra germenului testat.
Din punct de vedere tehnic, pentru fiecare antibiotic avem nevoie de mai multe
tuburi cu bulion Mueller-Hinton n concentraii descrescnde (diluii binare) pornind spre
ex. de la 16 micrograme/ml i pn la 0,125 micrograme/ml, n total 8 tuburi, plus
2 tuburi martor, fr antibiotic (cantitatea final va fi de 1 ml n fiecare tub). Preparm un
inocul standardizat turbidimetric i n condiii aseptice inoculm toate cele 10 tuburi cu
cte 1 ml de inocul. Agitm pentru a omogeniza. Incubm cele 8 tuburi cu antibiotice i
1 tub martor timp de 16-20 ore la 35-37C iar al doilea tub martor l meninem pentru
aceeai perioad la temperatura frigiderului. Pentru controlul de calitate utilizm i un ir
de tuburi pe care le inoculm cu o tulpin de referin corespunztoare. n ziua urmtoare
citim i interpretm rezultatele.
Deoarece am utilizat o cantitate de inocul egal cu cantitatea de mediu,
concentraia final de antibiotic se va njumti (de ex. n tubul n care diluia iniial a
fost de 16 mg/ml, diluia final va fi 8 mg/ml etc.). n tubul martor meninut la +4C ar
trebui s nu fie prezent creterea, n tubul martor meninut la 35-37C creterea trebuie
s fie prezent.
n tuburile inoculate cu tulpina de referin trebuie s avem rezultatul
corespunztor datelor pe care le cunoatem privitor la respectiva tulpin.
n tuburile cu microorganismul testat, ultima diluie care a inhibat dezvoltarea
microorganismului corespunde CMI. Se consider (n general, pentru c CMI difer n
funcie de specia microbian) c microorganismele n cazul crora CMI este 3 mg/ml
vor fi eficient inhibate de ctre antibioticul respectiv i in vivo.
CMI nu are aceeai valoare pentru genuri, specii sau tulpini diferite. De ex. CMI la
amoxicilin n cazul unor tulpini sensibile este de 0,1 mg/ml pentru Staphylococcus
aureus, 0,03 mg/ml pentru Streptococcus pneumoniae, 0,25 mg/ml pentru Haemophilus
influenzae, 2 mg/ml pentru E. coli, 16 mg ml (i practic aceasta semnific rezisten in
vivo) pentru Bacteroides fragilis iar n cazul Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas
aeruginosa sau Chlamydia trachomatis tulpinile sunt rezistente.

7.1.5. Determinarea CMB (concentraia minim bactericid)


Pornind de la rezultatul obinut prin metoda diluiilor n mediu lichid, se vor utiliza ca
surs de inocul tuburile n care dezvoltarea microbian a fost inhibat.
Este necesar o plac Petri cu agar Mueller-Hinton care va fi mprit n sectoare,
numrul de sectoare fiind corespunztor numrului de tuburi fr cretere microbian.
nsmnm n condiii aseptice din fiecare tub fr cretere microbian, fiecare n
sectorul de plac corespunztor. Incubm pentru 16-18 ore la 35-37C. CMB va
corespunde ultimei concentraii de antibiotic care a distrus microorganismele nsmnate
(sectoare de plac fr apariia culturii). Se consider c antibioticul va fi eficient in vivo
dac n serul pacientului se pot atinge concentraii de antibiotic care s depeasc de 4-8
ori CMB.
Determinarea CMI i CMB este extrem de important pentru aprecierea
eficacitii antimicrobiene a unui antibiotic asupra unei tulpini bacteriene.
Pentru tratamentul infeciilor severe (de exemplu endocardite, meningite, sepsis etc),
precum i la imunodeprimai, efectuarea acestei metode este indispensabil.
7.1.6. Metoda punctelor de ruptur (breakpoints)
Metoda este folosit n laboratoarele moderne de microbiologie i este utilizat
pentru a defini sensibilitatea i rezistena la antibiotice. Depinznd de metoda de testare
rezultatele sunt exprimate sub forma unei concentraii (mg/l sau g/ml) sau sub forma
unui diametru (mm).
Metoda este practicat de multe dintre laboratoarele din Europa de Vest, mai ales
dac volumul de munc este mare sau foarte mare. Prin aceast metod se pot testa mai
multe microorganisme, n acelai timp. Antibioticele sunt incorporate n mediul de
cultur, la o anumit concentraie limit, n funcie de cunotinele i datele acumulate
n ceea ce privete activitatea in vivo a respectivelor medicamente. Plcile sunt
inoculate simultan cu mai multe tulpini bacteriene, n spot, folosind un inoculator
construit special, sunt incubate n condiii corespunztoare pentru 16-18 ore. n cazul n
care tulpina sau tulpinile din diferitele specii bacteriene nu se dezvolt la aceast
concentraie limit de antibiotic (considerat ca fiind eficace in vivo), bacteria izolat
este considerat sensibil. n cazul n care bacteria se dezvolt (apare cultur bacterian),
bacteria izolat este considerat rezistent.
Aceast concentraie limit (breakpoint) trebuie setat n funcie de urmtoarele
date: distribuia CMI, evaluarea raportului PK/PD (farmacocinetic/farmacodinamic) i
rezultatele obinute n clinic n tratamentul pacienilor. PD reprezint studiul efectelor
medicamentului de-a lungul timpului i este n strns legtur cu PK care reprezint
modificrile concentraiilor medicamentului n timp.
Punctele de ruptur trebuie stabilite nainte ca un antibiotic s fie folosit n
clinic i trebuie s fie revzute cnd apar cazuri de rezisten la antibiotice. Totui
setarea de puncte de ruptur nu este perfect. Metoda este util i n realizarea unor
studii epidemiologice n ceea ce privete modificarea rezistenei la antibiotice n anumite
zone geografice.
7.1.7. Testul E; Determinarea CMI prin E test
E test reprezint o metod de testare in vitro a sensibilitii la antibiotice pentru
diferite microorganisme, inclusiv pentru bacteriile pretenioase i germenii anaerobi.

E test se aseamn metodei diluiei n agar combinnd principiile metodei


difuzimetrice cu cele de diluie. E test este uor de utilizat i spre deosebire de metoda
difuzimetric permite determinarea valorii CMI.
Din punct de vedere tehnic sunt necesare: o plac Petri cu agar Mueller-Hinton, inoculul
standardizat i langhetele din plastic pe care au fost fixate antibiotice n gradient, de ex. la
un capt 256 mg/ml ajungnd la cellalt capt la 0,016 mg/ml (cte o langhet pentru
fiecare antibiotic, cte 15 diluii marcate pe fiecare langhet). nsmnm
microorganismul care urmeaz a fi testat n condiii standardizate i depunem radiar
langhetele cu antibiotice.
Principiu:
Asemntor metodei difuzimetrice, E test necesit un inocul bacterian ajustat ca
turbiditate (standardizat), ce urmeaz a fi depus pe mediul de cultur potrivit
microorganismului studiat (ex. mediul Mueller-Hinton, geloz-snge etc), n plci Petri.
Benzile E test conin un gradient de agent antimicrobian i se aplic dup nsmnare.
n funcie de antibiotic, gradientul acoper un ir continuu de concentraii ntre
0,002-32 mg/ml; 0,016-256 mg/ml sau 0,064-1024 mg/ml. Dup incubare (timp de 16-18
ore la 35-37C) se formeaz o zon eliptic de inhibiie. Valoarea CMI se citete acolo
unde creterea bacterian intersecteaz banda E test.
Materiale i reactivi necesari:
- plci Petri cu agar Mueller-Hinton (pstrate la 2-8C pn n momentul
utilizrii);
- bulion Mueller-Hinton (cu 20-25 mg Ca2+ i 10-12,5 mg Mg2+/litru; se
repartizeaz cte 5 ml n tuburi sterile cu capac; se pstreaz la 2-8C);
- medii de cultur pentru meninerea n stare viabil a tulpinilor bacteriene
necesare efecturii controlului de calitate ;
- tulpini martor;
- inocul bacterian;
- soluie salin steril (0,85% NaCl) sau bulion Mueller-Hinton, pentru ajustarea
inoculului bacterian;
- benzi E test (a. cu ageni antimicrobieni cu nucleu lactam, b. cu ali ageni
antimicrobieni); se pstreaz n congelator la -20C pn n momentul utilizrii; au o
durat de utilizare de 1-2 ani (pentru prima grup) i respectiv de 2-3 ani
- tampoane sterile;
- standard de turbiditate McFarland de 0,5 i 1,0;
- pipete Pasteur sterile;
- foarfece;
- plci Petri sterile cu diametrul de 90 mm i respectiv de 150 mm;
- incubator cu atmosfer obinuit reglat la 34-35C; incubarea n atmosfer
mbogit cu CO2 este necesar n cazul testrii anumitor microorganisme;
- surs de lumin;
- aplicator E testi band adeziv (opional).
Tehnica de lucru:
A. Benzile E test
- scoatem plcile cu mediul de cultur i benzile E testdin congelator, le lsm la
temperatura camerei pentru echilibrare termic timp de 20 minute sau pn cnd nu mai
observm nici o urm de umezeal

- nainte de a deschide folia care include benzile, inspectm pentru a observa dac exist
perforri; dac folia respectiv nu este intact, atunci benzile din interiorul ei nu se mai
pot folosi; dac nu sunt probleme, pentru a deschide o folie mai nti tiem cu o foarfec
de-a lungul liniei ntrerupte apoi ntre compartimentele ce conin benzile
- scoatem benzile din folie cu ajutorul unei pensete i le punem n plci Petri sterile; apoi
le putem aplica pe mediul de cultur care conine inoculul microbian de testat
- pstrm restul benzilor n tuburi n care introducem o substan desicant pentru a le
proteja fa de umezeal; este necesar protecia i fa de cldur i expunerea direct la
lumin (punem tuburile n congelator, la -20C)
B. Inoculul bacterian:
- cu ajutorul ansei sau a unei pipete, transferm mai multe colonii dintr-o cultur
bacterian de 18-24 de ore ntr-un tub cu soluie salin steril sau bulion; omogenizm
(exist i varianta s transferm mai multe colonii n bulion, s incubm timp de 2-8 ore
pn cnd obinem densitatea dorit)
- ajustm (vizual) densitatea folosind soluie salin steril 0,85% sau bulion, la un
standard de turbiditate echivalent cu 0.5 McFarland; alternativ, suspensia se poate ajusta
la standardul dorit cu ajutorul unui nefelometru (aprecierea vizual a turbiditii
inoculului nu garanteaz numrul corect al unitilor formatoare de colonii).
C. Inocularea plcilor:
- introducem tamponul steril n tubul care conine suspensia bacterian de testat, rotim de
cteva ori, apoi eliminm excesul de lichid prin presarea tamponului de pereii interiori ai
tubului;
- depunem inoculul pe suprafaa plcii cu mediul de cultur avnd grij s acoperim
complet suprafaa mediului (ex. inoculm pe 3 direcii diferite, rotind placa cu cte o
treime);
- lsm placa timp de circa 10 minute, ca s se usuce, nainte de a aplica benzile E test.
D. Aplicarea benzilor E test:
- lum cu grij o band fr s atingem sau zgriem partea pe care este depus agentul
antimicrobian; dac folosim pensa steril, apucm cu grij de captul benzii notat cu E
(benzile trebuie s fie complet separate una de cealalt nainte de a le aplica pe suprafaa
mediului de cultur inoculat cu tulpina de testat); dac se folosete aplicatorul E test,
banda adeziv trebuie s fie n poziia corect (la fiecare capt al aplicatorului);
- aplicm banda E test pe suprafaa mediului de cultur, cu captul ce conine
concentraia cea mai mare aproape de marginea plcii;
- dac lucrm cu plci cu diametrul de 90 mm, aplicm una sau dou benzi; dac lucrm
cu plci cu diametrul de 150 mm, putem aplica ase benzi E test (benzile se pun la
distane egale, radial, pornind din centrul plcii; marginea captului benzii notat cu E
trebuie s ating marginea plcii);
- banda trebuie s fie n contact cu suprafaa agarului; eliminm eventualele bule de aer
de sub band cu ajutorul unei pense ncepnd de la marginea bulei i mutnd-o n sus pe
gradient pn la captul notat cu E (prezena bulelor mici nu va afecta rezultatul testrii);
- banda aplicat pe suprafaa agarului nu se mut n alt poziie (lund contact cu mediul
de cultur, agentul antimicrobian de pe partea posterioar se elibereaz imediat); dac
banda a fost aplicat cu partea posterioar n sus atunci se apuc cu grij, se ntoarce i se
pune corect pe suprafaa mediului; dac banda a atins suprafaa mesei de lucru sau un alt
obiect, se poate folosi n continuare att timp ct nu a luat contact cu o substan lichid.

E. Incubarea:
- timpul i temperatura de incubare depind de variantele de microorganism-agent
antimicrobian ce urmeaz a fi testate;
- incubarea n atmosfer de CO 2 modific pH-ul mediului de cultur i poate afecta
activitatea agenilor antimicrobieni; se folosete numai n cazul n care microorganismele
supuse testrii necesit pentru multiplicare CO2 (Haemophilus spp., Neisseria
gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae etc).
Interpretarea rezultatelor:
- putem citi rezultatul n cazul n care creterea bacterian este confluent sau aproape
confluent;
- inem placa lng o surs de lumin (atunci cnd mediul este Mueller-Hinton); citim
valoarea CMI n punctul n care creterea bacterian intersecteaz banda E test; dac
am utilizat agar Mueller-Hinton suplimentat cu 5% snge de oaie, sau geloz-chocolate
Mueller-Hinton sau alt mediu opac, vom utiliza pentru citirea rezultatului o surs de
lumin reflectant i o lup;
- pe geloz-snge citim zona de inhibiie a creterii bacteriene nu zona de inhibiie a
hemolizei;
n cazul n care nu apare nicio zon de inhibiie, raportm valoarea CMI ca fiind mai
mare dect cea mai mare concentraie a agentului antimicrobian de pe banda E test;
dac zona de inhibiie nu intersecteaz banda (zona de inhibiie se afl sub banda
E test), valoarea CMI se raporteaz ca fiind mai mic dect concentraia cea mai
sczut a agentului antimicrobian de pe banda E test;
- n cazul unei valori CMI situat ntre dou marcaje ale gradientului benzii, rezultatul pe
care l notm va fi valoarea cea mai mare;
- raportm rezultatul obinut pentru tulpina studiat dup ce verificm rezultatul obinut
pentru tulpina de referin (control de calitate);
- rezultatele CMI se interpreteaz conform criteriilor stabilite de NCCLS (National
Committee for Clinical Laboratory Standards).
7.1.8. Alte tehnici de testare clasice
Testarea sensibilitii la antibiotice a bacteriilor anaerobe:
metodele sunt utile n special din punct de vedere al supravegherii
epidemiologice, dar sunt rezervate pentru laboratoarele de referin
se pot utiliza tehnici de diluie n mediu lichid sau solid, tehnici de microdiluii n
mediu lichid, teste pentru producerea de -lactamaz etc.
Testarea sensibilitii mycobacteriilor
se efectueaz respectnd prevederile Programului Naional de Control al
Tuberculozei (care indic situaiile n care vor fi efectuate aceste testri)
se pot utiliza metoda concentraiilor absolute, metoda proporiilor, metoda
rapoartelor de rezisten, metode radiometrice etc.
Testarea sensibilitii altor bacterii
exist i alte bacterii pentru care trebuie respectate condiii particulare
spre exemplu pentru testarea sensibilitii stafilococilor la oxacilin/meticilin se
recomand ca mediul s conin 4% NaCl, pentru testarea sensibilitii la
antibiotice a streptococilor se recomand ca mediul s conin 5% snge
defibrinat de berbec etc.

Testarea sensibilitii fungilor (antifungigrama)


ine cont de temperatura i durata de incubare, care difer fa de cele pentru
bacterii, mediul utilizat fiind mediul Sabouraud
se pot utiliza tehnici de diluie n mediu lichid sau solid
Testarea producerii de -lactamaze
este util atunci cnd se verific sensibilitatea la antibiotice a microorganismelor
care pot produce -lactamaz (ex. Haemophilus spp., Staphylococcus aureus etc.)
se pot utiliza teste iodometrice, teste acidimetrice, teste cu cefalosporine
cromogene etc; exist i metode puse la punct pentru testarea sintezei de
-lactamaze cu spectru extins (ESBL).
Exist i sisteme automate (ex. ATB i rapid ATB) sau sisteme semiautomate (ex.
ATB Expression sau miniAPI), pentru testarea sensibilitii la antibiotice i
chimioterapice, utiliznd criteriile de interpretare NCCLS.
7.1.9. Tehnici de biologie molecular utilizate n testarea sensibilitii la antibiotice i
chimioterapice
Au fost imaginate o serie de metode semi-automatizate sau automatizate pentru a
optimiza obinerea unor rezultate corecte i n timp ct mai scurt, cu privire la
sensibilitatea/rezistena microorganismelor la antibiotice i chimioterapice. Metodele care
au la baz tehnicile de biologie molecular pot fi foarte utile (chiar dac costurile sunt
mai ridicate). De ex. se cunoate c agentul etiologic al tuberculozei se multiplic lent pe
medii de cultur i n aceste condiii rezultatele vor fi obinute n circa 2 sptmni prin
metodele clasice. Se pot utiliza diferite tehnici i n final hibridizarea molecular pentru a
studia diferite mutaii care pot s dea informaii cu privire la sensibilitatea/rezistena
tulpinilor studiate. Spre ex. INNO-LIPA Rif. TB (LIPA= Line Probe Assay), se realizeaz
cu ajutorul unei truse comerciale puse la punct n USA. Metoda permite concomitent
identificarea M. tuberculosis precum i testarea sensibilitii la rifampicin, dup o
amplificare genetic a unui material (ADN) provenit fie din culturi mycobacteriene, fie
chiar din produse clinice.
Principiul INNO-LIPA este hibridizarea ADN rezultat dintr-o amplificare prin PCR
(Polymerase Chain Reaction) cu sonde nucleotidice specifice, imobilizate sub forma unor
linii (benzi) paralele, pe fii de nitroceluloz. Sondele nucleotidice (S1-S5) sunt
biotinilate (cuplate cu biotin). Dup hibridizare se adaug streptavidin conjugat cu
fosfataz alcalin, acest conjugat atandu-se de produii de hibridizare rezultai anterior.
Incubarea n prezena unui reactiv cromogen conduce, n cazul existenei hibridizrii, la
apariia unor benzi colorate, vizibile. n cazul testrii rezistenei la rifampicin, se
urmrete apariia unei/unor mutaii la nivelul genei care codific pentru subunitatea a
ARN polimerazei (gena rpoB).
Identificarea apartenenei tulpinii testate la specia M. tuberculosis, este certificat cu
ajutorul unei oligonucleotide specifice, situat n poziia a 3-a, dup linia care marcheaz
fiecare fie-test i respectiv linia care permite verificarea calitii conjugatului
(conjugate control).
Produsul unei tulpini sensibile la rifampicin deine fragmente amplificate, care
hibridizeaz cu sondele specifice S1, S2, S3, S4 i respectiv S5. Absena uneia sau a mai
multor benzi demonstreaz c tulpina este rezistent la rifampicin.

Pentru tulpinile rezistente la rifampicin, trusa comercial INNO-LIPA permite


suplimentar aprecierea locusului mutaiei. De exemplu, o tulpin poate prezenta o mutaie
n regiunea R5 (serin-leucin) n timp ce alt tulpin prezint o mutaie n regiunea R4a
(histidin), aceste mutaii aprute la nivelul genei rpoB fiind dintre cele mai frecvente i
pot fi identificate prin aceast metod.
7.2. Metode de testare a sensibilitii in vivo i de apreciere a eficienei terapeutice
Eficiena terapeutic poate fi apreciat clinic, paraclinic i prin teste de laborator. Exist
unele criterii nespecifice de laborator care sunt utile n aprecierea eficienei terapeutice,
precum leucograma, examenul sedimentului urinar, examenul citologic al LCR, VSH,
proteina C reactiv etc.
Dintre metodele specifice utilizate pentru aprecierea eficacitii terapeutice sau pentru
evaluarea eventualei nociviti a medicamentelor folosite, vom enumera:
determinarea NEI (nivel de eficien inhibitorie) pentru ser, LCR sau alte
umori;
determinarea NEB (nivel de eficien bactericid) pentru ser, LCR sau alte
umori; puterea bactericid a serului celor tratai (NEB) msoar capacitatea
diluiilor din serul unui bolnav tratat cu antibiotice de a inactiva un inocul
coninnd germenul infectant; se determin diluia cea mai nalt de ser care mai
manifest capacitate bactericid;
utilizarea acestor metode a fost indicat n cazul endocarditelor bacteriene,
osteomielitelor, fibrozei chistice sau sepsisului la pacieni cu variate grade de
imunodepresie; produsele se recolteaz de obicei la o or dup administrarea unei
doze i cu cteva minute nainte de administrarea urmtoarei doze de antibiotic;
determinarea nivelului de antibiotic realizat n snge, LCR sau n alte umori (prin
metode microbiologice, enzimatice, HPLC etc).
-

Sfrit curs

BIBLIOGRAFIE
Popa M.I., Popa G.L., Antibiotice i chimioterapice, n Popa M.I. (coord.), Microbiologie
Medical, vol 1 - curs UMF Carol Davila, 2010.