Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Aceast metod, cu toate c este folosit pe scar larg n laboratoare, permite de fapt
numai eliminarea antibioticelor complet inactive i eventual selecionarea antibioticelor
foarte active, pentru c tehnica nu este standardizat.
7.1.2. Antibiograma difuzimetric comparativ (Stokes, Bal)
Se efectueaz pentru microorganismul de testat n paralel cu un microorganism de
referin, din aceeai specie (sau o specie asemntoare). Spre exemplu, pentru cocii
Gram-pozitivi putem alege pentru comparaie o tulpin de Staphylococcus spp. Tulpina
de referin are o sensibilitate cunoscut la diferitele antibiotice pe care le utilizm.
Prin aceast metod se nltur o parte din factorii de eroare ai metodei precedente, spre
ex. calitatea mediului, calitatea discurilor de antibiotice, care vor fi identice pentru
microorganismul de referin i pentru microorganismul testat. Rezultatele se exprim cu
termenii: sensibil, intermediar, rezistent, n funcie de diametrul zonelor de
inhibiie a multiplicrii celor doi germeni, fa de acelai antibiotic (jumtile de cerc se
examineaz comparativ). n cazul n care cunoatem CMI (concentraia minim
inhibitorie) a microorganismului de referin, putem face aprecieri cu privire la CMI
pentru microorganismul testat.
Din punct de vedere tehnic, pe o plac de forma unui ptrat (mprit n 3 zone egale
marcnd pe partea extern a plcii liniile de demarcaie) se inoculeaz n treimea medie
microorganismul de referin iar n treimile exterioare 2 microorganisme diferite, pentru
care dorim s realizm testarea. Inoculul trebuie s fie astfel realizat nct s conduc la
apariia dup incubare a unor colonii foarte apropiate, dar care s nu fie confluente.
Plasm microcomprimatele cu antibiotice pe liniile de demarcaie dintre culturi. Incubm
peste noapte la 35-37C urmnd ca n ziua urmtoare s citim i s interpretm
rezultatele.
7.1.3. Antibiograma difuzimetric standardizat (Kirby-Bauer, NCCLS)
Din punct de vedere tehnic se realizeaz asemntor cu prima metod prezentat, dar este
standardizat, fiind singura metod difuzimetric recunoscut pe plan internaional, care
permite obinerea unor rezultate reproductibile i corelabile ntre laboratoare diferite.
Elementele necesare standardizrii sunt:
- mediul (n majoritatea cazurilor agar Mueller-Hinton, pentru c are o valoare
nutritiv corespunztoare i nu conine substane cu aciune inhibitoare)
- exist elemente minerale care trebuie adugate n cazul testrii anumitor
microorganisme (ex. Mg2+ i Ca2+, pentru tulpini de Pseudomonas aeruginosa,
atunci cnd este testat sensibilitatea la aminoglicozide);
- se va verifica pH-ul mediului (de obicei cuprins ntre 7,2 i 7,4);
- exist suplimente nutritive care trebuie adugate n cazul testrii unor
microorganisme pretenioase;
- grosimea mediului trebuie s fie de 4 mm (25 ml de mediu/plac de 9 cm);
- inoculul, care se obine de preferat din 5 colonii izolate (cultur pur) i trebuie s
aib o turbiditate corespunztoare standardului turbidimetric 0,5 McFarland
(circa 108 uniti formatoare de colonii/ml) n majoritatea cazurilor;
- timpul de incubare (n majoritatea cazurilor 16-18 ore la 35-37C, nu mai mult de
2-3 plci suprapuse), atmosfera de incubare, umiditatea atmosferei de incubare;
- nainte de a deschide folia care include benzile, inspectm pentru a observa dac exist
perforri; dac folia respectiv nu este intact, atunci benzile din interiorul ei nu se mai
pot folosi; dac nu sunt probleme, pentru a deschide o folie mai nti tiem cu o foarfec
de-a lungul liniei ntrerupte apoi ntre compartimentele ce conin benzile
- scoatem benzile din folie cu ajutorul unei pensete i le punem n plci Petri sterile; apoi
le putem aplica pe mediul de cultur care conine inoculul microbian de testat
- pstrm restul benzilor n tuburi n care introducem o substan desicant pentru a le
proteja fa de umezeal; este necesar protecia i fa de cldur i expunerea direct la
lumin (punem tuburile n congelator, la -20C)
B. Inoculul bacterian:
- cu ajutorul ansei sau a unei pipete, transferm mai multe colonii dintr-o cultur
bacterian de 18-24 de ore ntr-un tub cu soluie salin steril sau bulion; omogenizm
(exist i varianta s transferm mai multe colonii n bulion, s incubm timp de 2-8 ore
pn cnd obinem densitatea dorit)
- ajustm (vizual) densitatea folosind soluie salin steril 0,85% sau bulion, la un
standard de turbiditate echivalent cu 0.5 McFarland; alternativ, suspensia se poate ajusta
la standardul dorit cu ajutorul unui nefelometru (aprecierea vizual a turbiditii
inoculului nu garanteaz numrul corect al unitilor formatoare de colonii).
C. Inocularea plcilor:
- introducem tamponul steril n tubul care conine suspensia bacterian de testat, rotim de
cteva ori, apoi eliminm excesul de lichid prin presarea tamponului de pereii interiori ai
tubului;
- depunem inoculul pe suprafaa plcii cu mediul de cultur avnd grij s acoperim
complet suprafaa mediului (ex. inoculm pe 3 direcii diferite, rotind placa cu cte o
treime);
- lsm placa timp de circa 10 minute, ca s se usuce, nainte de a aplica benzile E test.
D. Aplicarea benzilor E test:
- lum cu grij o band fr s atingem sau zgriem partea pe care este depus agentul
antimicrobian; dac folosim pensa steril, apucm cu grij de captul benzii notat cu E
(benzile trebuie s fie complet separate una de cealalt nainte de a le aplica pe suprafaa
mediului de cultur inoculat cu tulpina de testat); dac se folosete aplicatorul E test,
banda adeziv trebuie s fie n poziia corect (la fiecare capt al aplicatorului);
- aplicm banda E test pe suprafaa mediului de cultur, cu captul ce conine
concentraia cea mai mare aproape de marginea plcii;
- dac lucrm cu plci cu diametrul de 90 mm, aplicm una sau dou benzi; dac lucrm
cu plci cu diametrul de 150 mm, putem aplica ase benzi E test (benzile se pun la
distane egale, radial, pornind din centrul plcii; marginea captului benzii notat cu E
trebuie s ating marginea plcii);
- banda trebuie s fie n contact cu suprafaa agarului; eliminm eventualele bule de aer
de sub band cu ajutorul unei pense ncepnd de la marginea bulei i mutnd-o n sus pe
gradient pn la captul notat cu E (prezena bulelor mici nu va afecta rezultatul testrii);
- banda aplicat pe suprafaa agarului nu se mut n alt poziie (lund contact cu mediul
de cultur, agentul antimicrobian de pe partea posterioar se elibereaz imediat); dac
banda a fost aplicat cu partea posterioar n sus atunci se apuc cu grij, se ntoarce i se
pune corect pe suprafaa mediului; dac banda a atins suprafaa mesei de lucru sau un alt
obiect, se poate folosi n continuare att timp ct nu a luat contact cu o substan lichid.
E. Incubarea:
- timpul i temperatura de incubare depind de variantele de microorganism-agent
antimicrobian ce urmeaz a fi testate;
- incubarea n atmosfer de CO 2 modific pH-ul mediului de cultur i poate afecta
activitatea agenilor antimicrobieni; se folosete numai n cazul n care microorganismele
supuse testrii necesit pentru multiplicare CO2 (Haemophilus spp., Neisseria
gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae etc).
Interpretarea rezultatelor:
- putem citi rezultatul n cazul n care creterea bacterian este confluent sau aproape
confluent;
- inem placa lng o surs de lumin (atunci cnd mediul este Mueller-Hinton); citim
valoarea CMI n punctul n care creterea bacterian intersecteaz banda E test; dac
am utilizat agar Mueller-Hinton suplimentat cu 5% snge de oaie, sau geloz-chocolate
Mueller-Hinton sau alt mediu opac, vom utiliza pentru citirea rezultatului o surs de
lumin reflectant i o lup;
- pe geloz-snge citim zona de inhibiie a creterii bacteriene nu zona de inhibiie a
hemolizei;
n cazul n care nu apare nicio zon de inhibiie, raportm valoarea CMI ca fiind mai
mare dect cea mai mare concentraie a agentului antimicrobian de pe banda E test;
dac zona de inhibiie nu intersecteaz banda (zona de inhibiie se afl sub banda
E test), valoarea CMI se raporteaz ca fiind mai mic dect concentraia cea mai
sczut a agentului antimicrobian de pe banda E test;
- n cazul unei valori CMI situat ntre dou marcaje ale gradientului benzii, rezultatul pe
care l notm va fi valoarea cea mai mare;
- raportm rezultatul obinut pentru tulpina studiat dup ce verificm rezultatul obinut
pentru tulpina de referin (control de calitate);
- rezultatele CMI se interpreteaz conform criteriilor stabilite de NCCLS (National
Committee for Clinical Laboratory Standards).
7.1.8. Alte tehnici de testare clasice
Testarea sensibilitii la antibiotice a bacteriilor anaerobe:
metodele sunt utile n special din punct de vedere al supravegherii
epidemiologice, dar sunt rezervate pentru laboratoarele de referin
se pot utiliza tehnici de diluie n mediu lichid sau solid, tehnici de microdiluii n
mediu lichid, teste pentru producerea de -lactamaz etc.
Testarea sensibilitii mycobacteriilor
se efectueaz respectnd prevederile Programului Naional de Control al
Tuberculozei (care indic situaiile n care vor fi efectuate aceste testri)
se pot utiliza metoda concentraiilor absolute, metoda proporiilor, metoda
rapoartelor de rezisten, metode radiometrice etc.
Testarea sensibilitii altor bacterii
exist i alte bacterii pentru care trebuie respectate condiii particulare
spre exemplu pentru testarea sensibilitii stafilococilor la oxacilin/meticilin se
recomand ca mediul s conin 4% NaCl, pentru testarea sensibilitii la
antibiotice a streptococilor se recomand ca mediul s conin 5% snge
defibrinat de berbec etc.
Sfrit curs
BIBLIOGRAFIE
Popa M.I., Popa G.L., Antibiotice i chimioterapice, n Popa M.I. (coord.), Microbiologie
Medical, vol 1 - curs UMF Carol Davila, 2010.