Sunteți pe pagina 1din 2

DOZAREA PROTEINELOR PRIN METODA BRADFORD

Metoda Bradford este mult mai sensibil dect metoda Biuretului. Cu ajutorul acestei
metode se pot doza proteine cu o concentraie cuprins ntre 0,1 2 mg/ml.
Principiul metodei. n mediu puternic acid, colorantul Coomassie Brilliant Blue G
(CBBG), se afl predominant n form cationic total protonat, roie, cu un maxim al
absorbanei n jurul valorii de 465 nm precum i n forma de culoare verde cu un maxim al
absorbanei la 650 nm i ntr-o mai mic msur n forma anionic de culoare albastr cu un
maxim al absorbanei la 590 nm (Figura 1 i Figura 2). Dintre formele ionice ale colorantului,
doar forma anionic se leag la proteine la nivelul resturilor de lizin i arginin ncrcate pozitiv,
formnd un complex de culoare albastr. Concomitent cu formarea complexului albastru are loc o
modificare a maximului de absorbie de la 465 nm la 595 nm (Figura 2). Intensitatea culorii
msurat la 595 nm este direct proporional cu cantitatea de protein din proba de analizat.

Figura 1. Formele ionice ale colorantului CBBG

Figura 2. Modificarea maximului de absorbie a colorantului CBBG n prezena proteinelor de la


465 nm la 595 nm

Reactivi i soluii
1. Soluie standard de albumin seric bovin (BSA) 2 mg/ml preparat extemporaneum
n acelai mediu n care s-a efectuat extracia proteinelor;
2. Reactiv Bradford: 100 mg de colorant CBBG se dizolv n 50 ml de etanol 95%.
Soluia alcolic se amestec cu 100ml de acid fosforic 85% i se aduce la 1 litru cu
ap distilat;
3. Extract proteic total (EPT);
4. Mediu de extracie.
Modul de lucru

se fac diluii ale EPT a crei concentraie n proteine dorim s o determinm;


din soluia stoc de 2 mg/ml BSA se efectueaz urmtoarele diluii:
Nr
l soluie
eprubet 2 mg/ml
BSA
1
0
2
25
3
50
4
75
5
100
6
125
7
150

l mediu de
extracie
200
175
150
125
100
75
50

Concentraie
obinut
(mg/ml)
0
0,25
0,5
0,75
1
1,25
1,5

D.O.595 nm

ntr-o plcu de 96 de godeuri se pipeteaz n godeuri distincte cte 5 l din fiecare


prob (constituite din diluii ale EPT) i din fiecare etaloan (diluii ale soluiei stoc de
BSA din eprubetele 1 7) peste care se adaug 250 l de reactiv Bradford;
plcua se agit 30 s i se las n repaus 15 de minute la temperatura camerei;
la cititorul automat de plci BioRad 680 se citesc densitile optice (extinciile) att
ale probelor ce conin EPT, ct i ale etaloanelor de BSA la o lungime de und
cuprins ntre 590 690 nm;
se traseaz o curb etalon notnd pe abscis concentraia proteic n mg/ml iar pe
ordonat valorile D.O.570 nm corespunztoare etaloanelor de BSA;
cu ajutorul curbei etalon se transform unitiile de D.O.595 nm obinute pentru
diluiile EPT n valori de concentraie (mg/ml) i se mulesc cu factorul de diluie
corespunztor.