Diagnosticul prenatal folosind celula libera de

acizi nucleici in fluidele corpului matern: un

deceniu al progresului
Jill L. Maron si Diana W. Bianchi
Abilitatea de a detecta celule libere de acizi nucleici la femeile insarcinate a
avut o evolutie semnificativa in ultimul deceniu. O gramada de studii au
explorat domeniul biologic, genetic si semnificanta clinica a celulelor fetale
libere de ADN si ARN mesager in circulatia materna. Ca rezultat, intelegerea
deplina asupra circulatiei acizilor nucleici fetali a evoluat. Pana in prezent, 2
aplicatii, determinarea sexului si tipul Rh-ul fetal, s-au translatat la nivelul
medicinii clinice. In orice caz, cu ajutorul tehnicilor moleculare avansate
cum ar fi spectrofotometria, reactia cantitativa in lant in timp-real (RT-PCR),
distributia expresiei genice, usurinta cu care genele fetale pot fi detectate din
cadrul mamei, s-au imbunatatit considerabil. Noile transcriptii plancetare si
fetale de ARN mesager cat si modificarile epigenetice ale markerului
placentar de ADN, maspina, prezinta o aplicabilitate universala. Analiza
expresiei globale a ARN-ului mesager fetal atat in lichidul amniotic cat si in
sange asigura o noua intelegere de ansamblu fetal si patologic. Diagnosticul
prenatal este impins a evolua de la detectia aneuploidiilor la detectia
deviatiilor dintr-un ansamblu normal, care ar trebui sa asigure oportunitati
incredibile pentru tratamentul fetal.
INTRODUCERE
A trecut un deceniu de la prima detectie a celulelor fetale libere de
ADN in circulatia materna.[Lo et al. , 1997]. Raportul original, care a descris
in premiera identificarea SRY-ului in plasma femeilor insarcinate cu feti de
sex masculin, a extins campul non-invaziv al diagnosticului ante-natal.
Urmarind aceasta descoperire marcanta, principiile similare folosite pentru a
detecta ADN-ul fetal din circulatia materna au stat la baza identificarii ARN
mesager-ului fetal.[Poon et at., 2000]. Faptul ca celulele libere fetale de acizi
nucleici au fost destul de stabile pentru a fi izolate si masurate in plasma
materna, au invins ignoranta totala asupra aspectului molecular din timpul
sarcinii. Tesutul sursa, mecanismele de producere si cinetica atat a ADN-ului
fetal si a ARN-ului mesager din cadrul mamei au fost necunoscute in 1997.
Probabil ca cea mai mare semnificatie a fost constituita din limitarea

intelegerii privind rolul procesului de circulatie in timpul sarcinii si efectele

posibile asupra sanatatii mamei si fatului.
In timpul ultimilor 10 ani, cunostiitele biologice atat asupra
ADN-ului fetal cat si a ARN-ului mesager fetal au cunoscut o extindere
vasta. De la publicarea articolelor despre embrionii timpurii, o gramada de
studii au explorat semnificatia biologica si clinica a acizilor nucleici fetali
circuland printre cei materni. Acum, revizuim intelegerea noastra despre
biologia acizilor nucleici fetali la nivelul mamei si examinam aplicatiile
clinice prezente si viitoare pentru diagnosticul antenatal din cadrul
complicatiilor sarcinii sau dereglarile genetice.
Exploram de asemenea potentialul impact al analizei expresiei genice in
vederea unei mai bune intelegeri de ansamblu la nivel fetal din cadrul
fiziologiei si patologiei.
CELULELE LIBERE DE ADN IN PLASMA SI SERUL MATERN
Biologie
Sursa de tesut. Atat sursa cat si mecanismul prin care ADN-ul fetal este
eliberat in circulatia materna au constituit subiecte de speculatii.
Placenta, celulele fetale hemtopoietice, cat si insusi fatul au fost
considerate surse pentru ADN-ul fetal[Bianchi, 2004]. Majoritatea
studiilor au ajuns la concluzia ca placenta reprezinta sursa predominanta de
ADN fetal in circulatia materna. Ratele detectiei secventei de SRY in
monstrele de ser matern ale femeilor aflate in cursul tehnicii reproducerii
asistate (ART), si care sunt insarcinate cel putin un fat de sex masculin, au
descoperit faptul ca la 28 de zile de la transferul post-embrionar, 80% din
toti subiectii studiati prezinta nivele detectabile de ADN fetal.[Guibert et al.,
2003] Avand in vedere ca circulatia feto-placentare nu este realizata pana in
ziua 20-30 post-conceptiva, este sugerat faptul ca ADN-ul fetal e derivat din
trofoblast.
Un alt studiu, examinand nivelul celulei libere fetale de ADN in
plasma materna din cursul alegerii primului semestru medical terminat cu
misoprostol a relevat faptul ca ADN-ul fetal poate fi detectat la femei dupa
nastere in timpul unei proceduri de 11 zile.[Wataganara et al., 2005a]. Dat
fiind faptul ca aceste terminatii au fost un rezultat medical, mai bun decat cel
chirurgical, s-a teoretizat faptul ca bucatile reziduale placentare au contribuit
la bazinul circulatiei fetale de ADN.

Un caz interesant publicat in 2004 a asigurat dovezi si mai

convingatoare in faptul ca ADN-ul fetal isi are originea in placenta. O
femeie, cunoscuta drept purtatoare de homofilie A, a fost insarcinata cu un
fat mozaicat 45, X/46, X [Flori et al., 2004]. Aceasta rara anomalie genetica
a fost diagnosticata doar dupa ce screening-ul serului matern nu a putut
identifica nicio secventa SRY in ciuda faptului ca, la ultrasunete fatul
prezenta organe genitale masculine neambigue. Urmand stadiul de terminare
al sarcinii, doar citotrofoblastul a aratat un cariotip 45,X in timp ce toate
tesuturile fetale examinate au relevat mozaicismul incluzand linia celulara
isodica (Yp). Odata ce-a fost descoperit cromozomul Y in tesuturile fetale,
dar care nu e prezent nici i citotrofblast, nici in serul matern, s-a constatat ca
circulatia ADN-ului fetal acelular isi are originea din celulele
citotrofoblastului. Detectia ADN-ului placentar din 3 cazuri sigure de
mozaic placentar sustin in continuare ca celulele libere de ADN provin din
placenta[Masuzaki et al., 2004]. In acest studiu, 3 cazuri sustin ca mozaicul
placentar este compus dintr-o linie celulara diploida si o linie celulara cu
trisomie pentru 22,7 sau 2. In timp ce placenta contribuie la circulatia
materna a celulelor libere fetale de ADN, probabil aceasta nu este singura
sursa. Celulele hematopoietice fetale pot avea totusi o mica contributie in
cadrul bazinului de ADN. Este bine sustinut din punct de vedere
documentar ca eritrocitele fetale sunt prezente in plasma femeilor insarcinate
[Cheung et al., Bianchi et al., 1997; Al-Mufti et al.,2000]. Desi un studiu
comparativ a expus faptul ca nu exista nici o legatura intre numarul
eritroblastelor si nivelul celulelor libere fetale de ADN atat in cazurile
normale de sarcina cat si in cele patologice, aceeasi prezenta de eritrocite
fetale in circulatia materna le sugereaza potentialul, chiar daca intr-o masura
mai mica, de a elibera celulele libere fetale de ADN in plasma materna.
Mecanismele care evidentiaza eliberarea celulelor libere fetale in circulatia
materna. Mecanismele in cadrul carora celulele libere fetale sunt eliberate in
circulatia materna sunt necrozarea si/sau apoptoza celulelor fetale si/sau a
celulelor placentare, secretia activa de ADN fetal sau diferentierea finala
[Bischoff et al., 2005]. Dintre aceste 3 procese, apoptoza este candidatul
principal. Apoptoza e caracterizata prin fragmentarea ADN-ului genomic.
Acest proces este nerandomizat, iar rezultatele in generatia prevazuta indica
fragmente masurabile de ADN. Fragmentarea nucleara poate fi masurata
folosind deoxinucleotidil transferaza (TdT)- mediata dUTP, analiza
etichetata final (TUNEL). Cateva studii au utilizat tehnica TUNEL pentru a
ilustra faptul ca multe dintre celulele fetale intacte din circulatia materna
ajung in procesul de apoptoza activa [Sekizawa et al., 2000; van Wijk et al.,

2000; Hristoskova et al.,2001]. Celulele fetale intacte, reprezinta totusi o

mica fractie din totalul circulant de celule libere fetale de ADN.
Confirmarile ulterioare cum ca celule libere fetale de ADN isi au originea in
placenta versus apoptoza, provin dintr-un studiu recent dintr-un model in
vitro ce examineaza efectele stresului oxidativ in tesutul trofoblastic. Punand
sub intrebare prelungirile normalului, termenul de placenta normal oxigenat(
10% oxigen) urmat de conditiile culturii hipoxice(0.5% oxigen), Tjoa et al.
[2006a] a aratat ca concentratia de -hemoglobina a celulelor libere fetale de
ADN in tesutul supernatant a crescut semnificativ in urmatoarele 20 de ore
dupa hipoxie-reoxigenare. Apoptoza crescuta a celulelor a fost confirmata de
cresterea activitatii caspazei 3. interesant este faptul ca amandoua procesele,
eliberarea celulelor libere fetale de ADN si apoptoza, pot fi reduse
semnificativ prin aditia de antioxidanti, vitamina C si E in cultura medie.
Acest articol sugereaza ca nivelul circulant de ADN in sarcina a fost un
marker semnificativ al homeostaziei sincitio-trofoblastului. Se considera ca
majoritatea ADN-ului fetal circula prin legaturi membrano-veziculare,
cunoscute drept corpuri apoptotice. Halicka et al.[2000] a aratat ca exista o
impachetare separata de ADN si ARN in corpuri apoptotice in timpul
apoptozei. Folosind un dispozitiv de filtru centrifugal Microcon pentru a
maximiza refacerea tuturor formelor posibile de ADN fetal( acizi nucleici>
10 perechi de baze), apoi supunand bilele de acid nucleic la analiza cu
microscopul electronic, Bischoff a aratat ca ADN-ul fetal, gasit deseori sub
forma de nucleozomi, a fost inghitit de corpurile apoptotice. Aceasta
descoperire explica stabilitatea de scurta durata a celulelor libere fetale de
ADN in circulatia materna.
Dovada faptului ca celule libere fetale de ADN sunt eliberate in
circulatia materna prin apoptoza provine din fragmentele masurabile
de ADN fetal si detectia corpurilor apoptotice ce contin ADN fetal. Pana
la ora actuala au existat 2 articole in cadrul carora s-a studiat marimea
distriutiei de ADN matern si fetal. In amandoua studiile, fragmentele de
ADN fetal au fost gasite semnificant de reduse ca dimensiune in comparatie
cu cele de ADN matern. Folosind un panou cantitativ PCR, analizele cu
diferite dimensiuni ale ampliconului urmarind gena leptina, Chan et al. a
demonstrat de asemenea ca femeile insarcinate nu mai prezinta fragmente
ADN in comparatie cu controalele femeilor neinsarcinate. Motivul acestei
descoperiri ramane neclar. Totusi, fragmentele mai mici de ADN fetal sunt
sugestive pentru apoptoza iar usurinta prin care aceste fragmente pot fi
distinse din ADN-ul matern este de folos aplicatiilor clinice.

Cinetica. Detectia initiala a celulelor libere fetale de ADN s-a bazat pe

prezenta sau absenta cromozomului Y specific secventei, cum ar fi SRY, din
cadrul circulatiei materne. Cu folosirea tehnici RT-PCR, sensibilitatea
detectiilor s-a imbunatatit. ADN-ul fetal a fost gasit in serul si plasma
materna in stadiu timpuriu, cum ar fi a 7-a saptamana de gestatie. ADN-ul
fetal reprezinta 3.4% si respectiv 6.2% din totalul celulelor libere fetale de
ADN din plasma materna in sarcina timpurie si tarzie, iar nivelele de celule
libere fetale de ADN aproape 1,000 mai crescut decat ADN-ul prezent in
celulele fetale intacte circulante din plasma materna. Studii substantiale au
confirmat o crestere generala a ADN-ului fetal in timpul gestatiei[Ariga et
al., 2001; Honda et al., 2002; Chan et al., 2003; Birch et al., 2005]. Mai
precis, are loc o crestere de 21% pe saptamana de gestatie in primul
trimestru[Wataganara et al., 2005a], o mica stabilizare in al doilea trimestru,
iar apoi o crestere rapida in cele 8 saptamani, prioritara nasterii[ Bianchi,
1998; Lo et al., 1998a]. Concentratia fractionata de ADN fetal in serul
matern este oricum, mai scazuta decat in plasma materna, posibil indicator al
eliberarii ADN-ului din celulele sangvine materne in timpul procesului de
incapsulare[Lo, 2000].
La temperatura camerei, ADN-ul fetal e stabil in tubul de sange
recoltat pana la 24 de ore de la colectare[Angert et al., 2003]. Studind
diviziunile de plasma materna luate din acelasi tub original din ultimele 24
de ore, Angert et al., a descoperit ca totalul de celule libere de ADN a
crescut, in timp ce nivelele de ADN fetal, raman constante.
In calculul mediei jumatatii de viata pentru celulele libere fetale de
ADN circulante, Lo et al.a facut 2 asumptii critice. In primul rand, s-a
presupus ca toate celulele libere fetale de ADN detectate au fost din sarcina
curenta, si nu din celulele fetale care pot persista timp de decenii dupa
nastere la mama[Bianchi et al., 1996]. In al doilea rand, cu asa o rapida
curatire din circulatia materna, celulele libere fetale de ADN trebuie
eliberate in mod continuu in aceasta. In orice caz, in 2002 a aparut o
controversa privind aceste asumptii. Intr-un raport publicat Invernizzi et al.
[2002] a descoperit ca celulele libere fetale de ADN pot fi prezente in
plasma materna la decenii dupa sarcina. In cadrul unei revizuiri amanuntite a
metodelor folosite pentru obtinerea plasmei in acest studiu s-a constatat ca sa efectuat o singura centrifugare. Intr-un stadiu anterior al sangelui revizuit
prin protocoale, Chiu et al.[2001] a descoperit ca o singura centrifugare
trebuie sa fie urmata fie de o filtrare sau o microcentrifugare subsecventa
pentru a obtine intr-adevar plasma de celule libere.
Esuand realizarea centrifugarii aditionale, e probabil ca ADN-ul fetal
detectat in studiul lui Invernizzi et al. sa fie rezultatul contaminarii cu

rezidurile circulatiei celulelor fetale intacte din sarcinile precedente[Benachi

et al., 2003; Rijnders et al., 2004a].
Prin realizarea unei singure centrifugari a probelor control de sange de
la femei insarcinate si neinsarcinate, au fost raportate variatii zilnice
dramatice in celulele libere de ADN din plasma probelor. Oricum, o
reevaluare a propriilor studii a fost combatuta de autori dupa realizarea
faptului ca orice contaminare de compartiment celular poate contribui
semnificativ la totalul bazinului de ADN. Subiectii ulteriori, a caror plasma a
fost supusa fie unei filtrari subsecventiale sau unei microcentrifugari au
expus ca media variatiilor zilnice in celulele libere de ADN au avut o
variatie medie de 3.8 legaturi cu un maxim de 5.4 legaturi. Aceasta
descoperire a fost mai putin semnificativa comparativ cu diferenta de 13.567.9 legaturi in circulatia celulelor libere de ADN, reportata mai devreme.
Consideratii tehnice
Procesarea, imbogatirea si detectia ADN-ului fetal. Din colectia initiala de
probe materne pana la ultima analiza cuantificabila, masurarea acurata a
celulele libere fetale de ADN e dependenta de cativa factori. Probele de
sange obtinute fie in EDTA, heparina sau anticoagulante citrare nu indica
diferente in concentratiile de -globina ADN in cele 24 ore dupa recoltarea
colectiei. Oricum, peste 24 ore, EDTA arata cea mai mica variatie timpurie
comparativ cu heparina sau citratul. EDTA este asadar, anticoagulantul
principal de ales pentru procesarea intarziata a sangelui.
Protocoalele procesarii monstrelor afecteaza in mod evident
cuantificarea ADN-ului fetal in plasma materna. Dupa colectarea sangelui si
centrifugarea initiala, o filtrare subsecventiala sau o microcentrifugare este
esentiala pentru a obtine intr-adevar plasma de celule libere[Chiu et al.,
2001]. Tehincile alternative, cum ar fi procesarea printr-un gradient separator
Percoll, au ca rezultat imbogatirea plasmei, cresterea concentratiilor totale de
ADN. Odata cu detinerea plasmei, protocoalele extrase pot varia gradul
detectarii ADN-ului fetal. Majoritatea studiilor folosesc un manual, sistem
de capatai, pentru extractia totalului de ADN. Un articol recent a comparat o
metoda automata cu una manuala pentru obtinerea ADN-ului extras. In timp
ce tehnica extractiei manuale beneficiala cu 23.4% mai mult din totalul
celulelor libere de ADN, sistemul automat beneficiaza cu 40.7% mai multe
celulele libere fetale de ADN[Huang et al., 2005]. Oricum, ADN-ul obtinut
dupa extractia manuala s-a dovedit a fi mai bun pentru analizele PCR, in
special la concentratii mai mici. O evaluare similara a intregii extrageri
automate si detectia sistemului nu a descoperit inter-contaminari intre

probe[Costa and Ernault, 2002a]. Amandoua articolele au pus in evidenta

potentialul intensiv scazut al travaliului al analizelor bine determinate pe o
scara mai ampla a utilizarii de celulele libere fetale de ADN in diagnosticul
ante-natal non-invaziv.
In general, amplificarea si cuantificarea ADN-ului fetal se bazeaza pe
o sensibilitate si specificitate particulara de la laborator pentru detectarea
ADN-ului fetal. Incercarile de a optimiza detectia ADN-ului fetal, in special
in primul si al doilea trimestru au implicat o analiza care amplifica o
secventa fetala prezenta in copiile multiple din genomul fatului de sex
masculin[Zimmermann et al., 2005]. Prin urmarirea de DYS 14 in locul
SRY-ului, autorii au demonstrat ca o rata de 10 falduri prezinta o detectie
mai buna si limite cuantificabile pentru ADN-ul fetal.
Prin incercarea evaluarii reproducerii rezultatelor, o comparatie a
studiilor intre laboratoare a fost desfasurata, in care 5 centre participante au
primit fractiuni de plasma inghetata obtinute si procesate din aceeasi
proba[Johnson et al., 2004]. Sensibilitatea pentru detectia ADN-ului fetal a
variat peste centru de 31-97%, in timp ce specificitatea a fost mai putin
consistenta(93-100%). In ultima instanta, lipsa de acuratete a cuantificarii
ADN-ului fetal peste centre va limita aplicabilitata detectarii ADN-ului fetal
pentru diagnosticele non-invazive prenatale. Acest lucru a fost demostrat de
Birch et al., [2005], care a evidentiat acuratetea cuantificarii si variatia
concentratiilor de ADN prin gestatie. Din cauza faptului ca analiza
cantitativa prin RT-PCR este atat de acurata de asemeni standardelor ADN
folosite pentru calibrare, metoda folosita pentru prepararea seriilor diluate
ADN. Este principala pentru asigurarea stabilitatii, in special la concentratii
mici. Folosind o analiza de baza, exponentiala, cvasi-Newton, pentru a
creste acuratetea nivelelor cuantificate scazute, valori normale ale celulelor
libere fetale de ADN au fost stabilite in saptamanile 5-41 de gestatie. Aceste
valori sunt esentiale pentru analiza in aplicatiile de rutina clinice ale
incorporarii celulelor libere fetale de ADN. Au fost incercate tehnici
variabile de a mari procentul de celulele libere fetale de ADN obtinute din
circulatia materna. Notabil e faptul ca Dhallan et al.[2004] a condus un
studiu format din 2 faze in care probele de sange s-au recoltat pe EDTA sau
in tubi tratati cu formaldehida. Folmaldehida e o substanta chimica
cunoscuta prin faptul ca are rolul de a stabiliza membrana celulelor si a
impiedica liza celulara. Cuantificand ADN-ul fetal cu o rata de copii de SRY
si CYS, in care numarul de copii pentru fiecare gena a fost determinat prin
observarea celei mai mari serii diluate, autorii au aratat ca procentul mediu
de celulele libere fetale de ADN in probele cu formaldehida este de 20.2%
(comparat cu 7.7% din probele netratate). Autorii au presupus ca acea

crestere a ratei detectiilor celulelor libere fetale a fost multifactoriala.

Stabilizarea membranei celulare prin formaldehida, inhibitia a
deoziribonucleazelor cu formaldehida si o centrifugare fina initiala pentru a
scadea liza celulara, joaca un rol important in cresterea castigurilor de
celulele libere fetale de ADN. Aceste descoperiri au fost considerate initial
promitatoare[Simpson and Bischoff, 2004]. Totusi, cele 2 studii sus-amintite,
au generat rezultate conflictuale[Benachi et al, 2005; Chung et al., 2005].
Datele in cauza sunt considerate imbatabile in tehnica dilutiei pentru ADNul fetal cuantificat folosit de Dhllan et al. Studiile viitoare trebuie conduse
pentru a determina data exista vreo utilitate in stabilizarea celulelor in
formaldehida pentru detectarea ADN-ului fetal.
Metodele alternative pentru detectarea ADN-ului fetal. Pana in prezent,
majoritatea studiilor privind ADN-ul fetal circulant au folosit secvente
de cromozom Y ca biomarker fetal. Pentru implementarea universala a
investigarilor clinice, este necesar un marker fetal dependent unisex.
Markerii fetali epigenetici, cum ar fi metilarea ADN-ului ofera alta
alternativa. Modificarea epigenetica implica modificarea post-translationala
a secventei ADN si fenotipuri alternative consecutive fara modificarea
secventei ADN-ului acual[Herman et al., 1996]. Identificand metilarea
ADN-ului diferential dintre fat sau placenta si mama, detectia atat a celulelor
fetale materne cat si paterne mostenite s-a detectat in plasma materna[Poon
et al., 2002]. Aceasta tehnica se bazeaza pe identificarea locilor care au
metilari diferite, paterne si materne, pattern-uri mostenite genetic. Realizand
o conversie binsulfidica pe ADN-ul extras si amplificat, rezidurile nemetilate
de citozina devin uracil si rezidurile metilate de citozina raman
neschimbate[Frommer et al., 1992]. Urmarind metilarea specifica PCR,
ADN-ul este secventializat. In cazurile in care amandoua mostenirile fetale
si materne ale unui marker particular sunt nemetilate, se poate realiza un test
pentru primer-ul evaluator de extensie pentru a imbunatati sensibilitatea.
Desi aceasta metoda este facila, se bazeaza pe loci imprimati, care nu sunt in
mod neaparat fetal-specifici, si pe polimorfismul genetic, a detine
discriminarea dintre detectiile ADN-ului fetal si matern.
Studiul subsecvent a indentificat un marker plancetar epigenetic,
maspina, considerat primul marker universal al ADN-ului fetal in plasma
materna[Chim et al., 2005]. Maspina este metilata in leucocitele materne si
hipometilata in placenta.