Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
- consideraii generale
O preocupare important a microbiologilor este stabilirea unui diagnostic microbiologic
corect, imaginarea unor teste de laborator necesare acestuia, ca i studiilor de epidemiologie (care
se ocup cu monitorizarea incidenei bolilor infecioase, a transmiterii acestora n colectiviti i cu
elaborarea msurilor necesare profilaxiei acestor boli). Pe de alt parte, clinicienii ateapt de la
microbiologi identificarea agenilor patogeni, testarea sensibilitii tulpinilor microbiene la
antibiotice i o raportare rapid a rezultatelor care s furnizeze informaii relevante necesare
deciziilor medicale.
In general, este important semnalarea prezenei unei infecii, determinarea naturii sale
specifice i furnizarea de date care s permit instituirea unui tratament timpuriu. Pentru stabilirea
tratamentului, diagnosticul microbiologic timpuriu este mai urgent n bolile infecioase, dect n
orice alt tip de proces patologic. n multe infecii, morbiditatea i mortalitatea pot fi reduse
semnificativ dac se instituie n timpul cel mai scurt un tratament corect; n alte infecii,
spitalizarea poate fi evitat sau scurtat i interveniile chirurgicale specifice pot fi evitate, dac un
tratament antimicrobian este administrat rapid.
Cuantificarea rezultatelor. Acest concept nu a fost cu adevarat evaluat n microbiologie,
dect n cazul uroculturilor, dei poate fi folosit i n alte situaii. De exemplu, poate ajuta la: 1)
diferenierea unui microorganism prezent ca un contaminant, de unul implicat activ n infecie;
2) determinarea importanei relative a diferitelor microorganisme n infeciile mixte. In mod
obinuit, cuantificarea uzual prin metoda diluiilor sau prin metoda ansei calibrate nu este
necesar. Numrul microorganismelor prezente poate fi apreciat cu cretere abundent, cretere
moderat sau cretere srac, pe baza coloraiei Gram i a creterii constatate pe o plac cu
mediu de izolare (de ex., colonii extinse pe grupul 2 de striuri, pe grupul 3 etc.). Coloraia Gram
este important datorit diferenelor n biologia, sensibilitatea fa de ageni antimicrobieni, rata de
cretere a bacteriilor Gram pozitive i Gram negative, care pot fi corelate cu exigenele lor
nutritive sporite (n cazul germenilor pretenioi).
Diferitele metode de diagnostic (clasice i moderne), de detectare i ulterior de identificare
a agenilor infecioi, au grade de sensibilitate diferite, cu praguri diferite n ceea ce privete
densitatea numeric iniial a bacteriilor n proba patologic (tabelul nr. 12). Printre disciplinele
biologice care au realizat n ultimii ani progrese considerabile n materie de automatizare,
bacteriologia medical se numra printre cele care au ateptat cel mai mult progresul tehnic.
235
Tabel nr. 12. Principalele tipuri de metode de detectare a bacteriilor in probele patologice, in functie de densitatea
numerica a bacteriilor, care ilustreaza si gradul de sensibilitate a metodelor.
______________________________________________________________________________
Bacterii - Densitate numerica/ greutate
Metoda
Pragul de detectare
Microscopie
Serologie
Sonde
Sonde ramificate
106 - 1 ng
105 - 0,1 ng
104 0,01 ng
103 1pg
102 0,1 pg
10 - 0, 01 pg
1 - 1 fg
PCR / Cultura
> 1- 102 bacterii
______________________________________________________________________________
whippelii. Automatizarea mai accentuata a tehnicilor moleculare este o necesitate care ar face
aceasta tehnologie accesibila unui numar mai mare de laboratoare.
A doua etapa in evolutia tehnologica a constat in automatizarea tehnicilor de studiu a
sensibilitatii la agenti antimicrobieni prin microdilutie in mediu lichid, ceea ce a permis sa se
acceada la o simplificare metodologica si o exprimare parametrica a rezultatelor. Cuplarea
tehnicilor de identificare, cu aceste sisteme de citire interpretativa a antibiogramelor usureaza
munca si interpretarea rezultatelor de catre microbiologi. Totusi antibiograma realizata prin metoda
difuzimetrica ramne foarte utila pentru anumite genuri si specii bacteriene.
A treia etapa in evolutia tehnologica a constat in automatizarea unui examen, considerat pe
drept cuvant, ca cel mai important in domeniul bacteriologiei clinice, respectiv hemocultura, un
236
II.
III.
237
238
Recoltarea de probe corespunzatoare (de ex. snge si lichid cefalorahidian in cazul unei
suspiciuni de meningita);
Recoltarea probei trebuie sa se faca la momentul potrivit, in timpul fazei acute a bolii;
Daca este posibil, proba trebuie recoltata inainte de inceperea tratamentului cu substante
antimicrobiene;
Colectarea unei cantitati suficiente de produs biologic si un numar adecvat de probe (de ex. o
cantitate suficienta de snge/ser pentru mai mult de un set de determinari);
Transportul probelor biologice la laborator in timpul cel mai scurt, perioada in care trebuie
mentinute conditiile necesare mentinerii viabilitatii agentilor patogeni eventual prezenti in
probe; aceste conditii se refera la:
Temperatura care trebuie sa fie optima pentru supravietuirea tipului de germeni banuiti; de
ex. speciile de Neisseria sunt sensibile la temperaturi scazute, temperatura optima de transport
a probelor suspecte fiind de 37C, in timp ce pentru produsele polimicrobiene, temperatura
optima de transport este de 4C, evitndu-se multiplicarea germenilor asociati, prezenti in mod
normal in produsul biologic respectiv;
din culturile dezvoltate pe mediu lichid/solid se fac preparate fixe frotiuri, care se
examineaza la microscopul optic cu obiectivul de imersie si se determina tipul morfologic
(fig. 53) si afinitatile tinctoriale; frotiurile se coloreaza prin metoda Gram, cu mare valoare
pentru diagnosticul prezumtiv (fig. 54), ca si prin metode selective, daca este cazul (pentru
evidentierea sporilor, capsulei, incluziilor - prezenta diferitelor structuri intra - si extraparietale
fiind utile identificarii;
Biotipizarea poate fi realizata cu ajutorul testelor biochimice (fig. 55, 56, 57):
Sisteme de identificare biochimica multitest; ex.edii multitest mult utilizate in clinica, pentru
identificarea enterobacteriilor, sunt: TSI (fig. 56 C), MIU si MILF.
Sisteme microtest care se efectueaza in microvolume si care asociaza un numar mare de teste
in aceeasi placa/tub si care sunt de regula suficiente pentru a realiza o identifcare precisa (fig.
57 galerie API).
Fig. 53. Tipuri morfologice
de baza la bacterii.
243
244
A.
B.
C.
D.
a)
b)
c)
d)
e)
a)
b)
c)
245
identificare de tipul :
A. Chei dichotomice
B. Tabele de identificare (sisteme politetice)
C. Programe de identificare asistata de calculator
Principiile pe care se bazeaza aceste sisteme de identificare au fost prezentate succint la pag. 239.
Metode rapide de identificare/detectare a bacteriilor
Spre deosebire de toate aceste metode de testare a proprietatilor biochimice care sunt
dependente de cresterea bacteriilor, utilizarea unor teste cu substraturi enzimatice cromogene si
procedeele cromatografice, permit laboratoarelor sa identifice precis si rapid numeroase specii de
microorganisme. Substraturile cromogene detecteaza enzime preformate in bacterii si permit
identificarea unor microorganisme specifice direct in produsele patologige, metoda nefiind
dependenta de cresterea bacteriana. Rezultatele acestor teste rapide sunt luate in considerare, in
paralel cu cele traditionale, bazate pe cresterea pe medii selective, pe examinarea caracterelor de
colonie si a celor morfologice observate pe frotiuri colorate Gram. Testele bazate pe utilizarea de
substraturi cromogene, se utilizeaza in paralel si cu testele de tipul spoturilor, cum ar fi testul
catalazei si al oxidazei (fig. 56 A), pentru o identificarea prezumtiva corecta a microorganismelor
semnificative din punct de vedere clinic. Diferite variante ale acestor tehnici, ca si metoda gazcromatografiei pot fi folosite pentru detectarea produsilor bacterieni direct in probele clinice sau
pentru a furniza informatii ajutatoare identificarii bacteriilor la nivel de gen si specie.
5. Determinarea spectrului de sensibilitate (antibiotipului) tulpinii bacteriene
izolate, prin metoda antibiogramei in varianta difuzimetrica (Kirby - Bauer); se
determina spectrul de sensibilitate la un set de antibiotice, cunoscute ca fiind active
pentru grupul de bacterii caruia i apartine tulpina identificata, dar care sunt supuse
fenomenului de dobndire a rezistentei, cu scopul alegerii celui mai potrivit pentru
antibioterapie (fig. 59); determinarea concentratiei minime inhibitorii (C.M.I.) si
minime bactericide (C.M.B.), utile determinarii proprietatilor farmacologice ale
antibioticelor, ca si calcularii dozelor terapeutice sunt schematizate in fig. 58;
Mai nou, este utilizata si metoda E-test (spectru de sensibilitate+ C.M.I.) (v. fig. 46).
6. Serotipizarea permite caracterizarea din punct de vedere antigenic a tulpinii
bacteriene izolate, prin evidentierea antigenelor bacteriene, cu seruri imune poli- si
monospecifice, metoda aplicata mai ales in studiile epidemiologice; de ex. prin
reactii de aglutinare bacteriana (directa) pe lama (fig. 60) si in tub; reactii de latexaglutinare (aglutinare pasiva).
247
248
1 picatura suspensie
bacteriana
1 picatura suspensie
bacteriana
1 picatura
ser imun
1 picatura apa
fiziologica sterila
Fig. 60. Schema testului de aglutinare pe lama, realizat prin punerea in contact a unei
suspensii bacteriene, realizata prin omogenizarea in apa fiziologica sterila a unei colonii bacteriene
dintr-o cultura a tulpinii de serotipizat, cu seruri imune polispecifice si monospecifice, diluate
corespunzator titrului reactiei pe lama, indicat de producator (P = proba, M = martor).
II.
- studiul raspunsului imun al organismului gazda, fata de agentul infectios nu este obligatoriu, pentru ca
raspunsul imun fata de unii agenti infectiosi este tardiv, slab sau absent (de exemplu, in infectiile
locale); se investigheaza:
- Raspunsul imun mediat umoral metode de studiu:
o in vitro reactii serologice Ag-Ac, efectuate cu ser de pacient si antigene de
Desi metodele clasice ramn utile intr-un numar mare de cazuri, pentru bacteriile greu
cultivabile, metodele moleculare au permis progrese spectaculoase att in cercetare, ct si in
diagnosticul bacteriologic. Diagnosticul microbiologic bazat pe analize genetice prezinta
numeroase avantaje:
1. Este foarte indicat in cazul microorganismelor cu crestere lenta sau care cresc slab sau nu
cresc deloc pe medii de laborator, evitnd incubarile prelungite si rezultatele fals negative.
2. Deoarece nu este necesara insamntarea probelor si cultivarea agentilor patogeni, probele
patologice pot fi recoltate si pastrate prin inghetare perioade lungi de timp. Aceste probe
sunt utile si pentru verificarea eficacitatii vaccinurilor.
3. Permit identificarea de noi specii prin compararea datelor obtinute prin metode moleculare,
cu cele existente in bazele de date. De exemplu, in ultimul deceniu, prin astfel de metode
au fost
necunoscute : Bartonella
251
252