15.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR MICROBIENE

Bolile transmisibile se afl i n prezent n topul cauzelor de mortalitate i morbiditate la nivel mondial i
consum o proporie nejustificat de mare din bugetul alocat sntii n rile n curs de dezvoltare. Conform
Organizaiei Mondiale a Sntii (OMS), diareea acut este cauza a 2.2 milioane decese anual. Infeciile acute
respiratorii (n principal, pneumonia) reprezint o alt cauz important a mortalitii, estimat la 4 milioane decese
anual (WHO, 2003). Numrul cazurilor de pneumonie bacterian cu H. influenzae i Str. pneumoniae i al tulpinilor
rezistente la benzilpeniciline este n continu cretere. Incidena bolilor cu transmitere sexual de origine viral sau
bacterian este de asemenea n permanent cretere (WHO, 2003).
Pentru prevenirea i controlul eficient al principalelor infecii bacteriene este necesar dezvoltarea unor
modaliti de supraveghere epidemiologic i monitorizare a maladiilor infecioase, precum i existena unor tehnici
de diagnostic sensibile, specifice i simple.
15.1. ASIGURAREA CALITII N BACTERIOLOGIE
NOMENCLATUR, DEFINIII
Asigurarea calitii (AC) reprezint ansamblul de aciuni prestabilite i sistematice necesare pentru ca un
produs sau un serviciu prestat s satisfac exigenele calitii, o iniiativ care tinde spre 0 erori i previne eroarea
n loc s o constate a posteriori (ISO 8402/1995). AC este procesul complet prin care calitatea raportrilor
laboratorului poate fi garantat. Pentru laboratorul de microbiologie, AC nseamn asigurarea obinerii unui rezultat
corect, n timpul optim, din proba adecvat, recoltat corespunztor, de la pacientul potrivit, cu interpretarea
rezultatelor pe baza datelor de referin corecte, la cel mai bun pre.
Calitatea reprezint aptitudinea unui produs, procedur sau serviciu de a satisface cerinele cunoscute i
poteniale ale utilizatorului (medicul de familie, medicul specialist, pacientul), la nivel tehnic, economic
(performane maxime la costuri competitive), ecologic (are n vedere protecia personalului i a mediului) i
informativ (un rezultat trebuie uneori nsoit de un comentariu i de asemenea, de explicarea necesitii ntrzierii
rspunsului, atunci cnd este cazul) (ISO 8402/1995).
Cerinele sau necesitile cunoscute se refer la analize uzuale ale produselor biologice clasice (snge,
urin etc.), care dac sunt realizate corect uureaz precizarea diagnosticului, iar cele poteniale se refer la analize
noi, realizate prin tehnici moderne din alte produse dect cele clasice (de exemplu, firul de pr), care necesit
interpretarea datelor obinute ca i posibilitatea de identificare a interferenelor i a cuantificrii acestora. Normele
n vigoare care reglementeaz funcionarea i asigurarea calitii n laboratorul de microbiologie sunt:
Ordinul MSP 1301/2007 /MO 617/06.11.2007 privind aprobarea Normelor privind funcionarea
laboratoarelor de analize medicale;
Standardul 15189 - Laboratoare medicale. Cerine particulare pentru calitate i competen;
Contract- cadru privind condiiile acordrii asistenei medicale n cadrul sistemului de asigurri sociale de
sntate pentru anul 2010;
Norme la Contract Cadru;
Ordinul MSP 1301/20.07.2007, seciunea a 9-a- Managementul calitii, Controlul intern de calitate i
evaluarea extern a calitii n laboratorul de analize medicale.
Sistemul analitic este definit ca ansamblul de mijloace analitice constituite dintr-o metod, un aparat, unul sau
mai multe programe informatice, unul sau mai muli reactivi, una sau mai multe soluii (eantioane) de calibrare, de
control care s permit determinarea naturii unui constituent sau a concentraiei acesteia, urmnd un protocol bine
definit.
Calificarea este operaiunea destinat demonstrrii faptului c un sistem analitic sau un instrument
funcioneaz corect i poate furniza rezultatele ateptate. Pentru personal, calificarea corespunde formrii dobndite
i impuse de reglementrile n vigoare i care este reinut prin formarea continu intern sau extern a personalului
de laborator.
Procedurile sunt operaiuni de lucru, tehnici i moduri care figureaz n documentaia scris a fiecrui
laborator.
Transferabilitatea este calitatea unei proceduri de lucru de a permite difuzarea sa i compararea cu rezultatele
obinute n alte laboratoare.
Valorile de referin sunt obinute pe o populaie de referin, exprimate n general cu limite minime/maxime,
stabilite n funcie de tehnicile utilizate sau eventual verificate, atunci cnd utilizeaz datele din literatura de
specialitate.
Este preferabil utilizarea noiunii de valoare de referin i nu cea de valoare normal sau standard.
1

Validarea este operaia prin care se verific faptul c un rezultat a fost obinut n condiii tehnice
corespunztoare; verificarea conformitii condiiilor de execuie cu cele menionate n procedurile de operare
standard i innd cont de rezultatele obinute cu eantioanele de control = validare analitic i validare biologic
= controlul validitii i coerenei rezultatelor obinute prin analiza unor probe, cu rezultate anterioare obinute n
laborator (WHO, 2003; REMIC, 2008).
Programele de asigurare a calitii reprezint o modalitate eficient de a menine
standardele de performan ale laboratoarelor de diagnostic, precum i actualizarea standardelor in vigoare atunci
cnd este necesar. n microbiologie, calitatea ia n consideraie durata, costul, precum i utilitatea sau relevana
clinic a testului.
Pentru a fi de bun calitate, un test de diagnostic trebuie s fie relevant clinic, adic trebuie s
ajute la prevenirea sau tratarea bolii. Parametrii de calitate ai unui test de diagnostic sunt: fiabilitatea (rezultatul
obinut este corect?), reproductibilitate (se obine acelai rezultat atunci cnd testul se repet?), viteza (este un test
destul de rapid pentru a fi util medicului n prescrierea tratamentului?) i raportul cost-beneficiu (este costul de
testare rezonabil n raport cu beneficiul pentru pacient i comunitate?) (WHO, 2003).
Factorii care influeneaz fiabilitatea i reproductibilitatea rezultatelor de laborator sunt reprezentai de:
- personal (performana unui tehnician de laborator este direct legat de calitatea educaiei i a formaiei
profesionale primite, de personalul cu experien, precum i de condiiile de angajare);
- factorii de mediu (spaiu inadecvat de lucru, de iluminat, sau de ventilaie, temperaturi extreme, nivelul de
zgomot excesiv sau periculos);
- calitatea produselor biologice - metoda i timpul de prelevare a probelor i sursa de recoltare sunt de
multe ori n afara controlului direct al laboratorului, dei acesta poart responsabilitatea pentru eliberarea
rezultatelor. De aceea este foarte important elaborarea de ctre laborator i rennoirea periodic a
instruciunilor de recoltare i transport al probelor i punerea acestora la dispoziia clinicienilor i a
ntregului personal medical implicat n realizarea acestei manevre;
- calitatea reactivilor, a produselor chimice, a sticlriei, a mediilor de cultur, a animalelor de
laborator;
- metoda de testare (unele metode sunt mai fiabile dect altele);
- echipamente (lipsa de echipamente, utilizarea incorect sau ntreinerea necorespunztoare a acestora);
- examinarea i citirea rezultatelor (citirea superficial sau examinarea un numr insuficient de cmpuri
microscopice poate genera erori);
- raportarea (erori de transcriere, sau rapoarte incomplete).
Calitatea interpretrii rezultatelor testului
Interpretarea este de o importan deosebit n microbiologie. n fiecare stadiu al diagnosticului, rezultatele
ar trebui s fie interpretate n scopul de a selecta metodele de testare optime, n termeni de durat i fiabilitate,
pentru urmtoarea etap de examinare.
Asigurarea calitii n cadrul laboratorului de microbiologie
AC in microbiologie este suma tuturor activitilor prin care un laborator garanteaz c rezultatele testelor
realizate sunt de bun calitate. Acestea trebuie s fie cuprinztoare pentru a acoperi fiecare etap, de la recoltare
pn la raportul final ctre clinician (fig. 321), raionale, pentru a permite identificarea punctelor critice, aplicate cu
o periodicitate regulat, pentru a asigura monitorizarea continu a procedurilor de testare i cu o frecven optim,
pentru a detecta i corecta erorile atunci cnd apar.
Una dintre abordrile comune ale implementrii sistemului de asigurare i control al calitii (AC/CC) este
sistemul celor 5 D (engl.) (EA 04/10, ISO/IEC 17025):
Decide care sunt punctele critice n care este relevant s se realizeze managementul calitii;
Descrie cine ce face, cnd i cum;
Realizeaz (engl. Do) ceea ce ai decis i descris;
Documenteaz ceea ce s-a realizat n mod real;
Verific (controleaz) (engl. Deem) dac procedurile i metodele utilizate au dat rezultatele dorite i remediaz,
acolo unde este necesar.
Pentru a putea decide care sunt punctele critice de control al calitii n cursul realizrii unei analize, trebuie ca
mai nti s se schieze un flux de lucru de la prelevarea probelor pn la raportarea rezultatelor (fig. 321). Toate
etapele din fluxul de lucru vor fi analizate i se va decide care dintre ele necesit o procedur operaional scris.
Este foarte important ca aceste puncte sa fie corect identificate pentru c lipsa unei proceduri operaionale poate
2

influena calitatea analizei. Pe de alt parte, numrul procedurilor trebuie limitat la minimum posibil, pentru a
diminua probabilitatea apariiei erorilor rezultate din nerespectarea procedurilor scrise.
ntre fixarea punctelor critice pentru managementul calitii i realizarea practic a dezideratului, exist un
echilibru foarte sensibil. De exemplu, temperatura este un factor critic pentru analizele microbiologice calitative,
dar exist numeroase opinii i ntrebri privind modalitatea corect de evaluare a acestui parametru: intervalul optim
de monitorizare a temperaturii este cel zilnic, sptamnal sau lunar? monitorizarea temperaturii se realizeaz ntr-un
singur punct sau este necesar s se cunoasc variaia sa spaial? termometrele trebuie calibrate la fiecare C, pentru
toate temperaturile pentru care sunt utilizate sau se poate extrapola plecnd de la 2 puncte de calibrare?
Un bun sistem de management al calitii este cel care d rezultate satisfctoare pentru sistemul AC/CC, fr a
se exagera ns n realizarea acestuia. Ca regul, se va acorda prioritate procedurilor sau echipamentelor care
influeneaz n mod direct rezultatele analizei.

Fig. 321. Fluxul etapelor preanalitice, analitice i postanalitice ale diagnosticului microbiologic (WHO, 2003).

Exist dou tipuri de control al sistemului de asigurare a calitii: intern i extern. Fiecare laborator are un
program de verificare intern a calitii (CIC) testelor efectuate care implic, n mod ideal: monitorizarea continu
a calitii testrii i verificarea tuturor etapelor de execuie, de la recoltare la raportare.
Controlul extern (CEC) se numete sistem de evaluare a calitii, n care performana unui laborator este
controlat de ctre o agenie extern. n unele ri, participarea este obligatorie, fiind reglementat legal (refuzul de
participare sau insuficienta participare poate antrena sanciuni penale) i necesar pentru acreditare. Evaluarea
extern a calitii implic: monitorizarea periodic a calitii de testare i verificarea la faa locului a metodelor de
identificare i, uneori, a tehnicilor de izolare. Controlul retroactiv permite confruntarea rezultatelor interlaboratoare,
n vederea ameliorrii calitii serviciilor prestate de laboratoarele participante. n vederea realizrii CEC,
organismul extern furnizeaz tuturor laboratoarelor acelai eantion, caracterizat, colecteaz rezultatele obinute i
le transmite mpreun cu comentariile unitilor participante. Participarea trebuie s fie loial, riguroas, fidel,
pentru c datele furnizate intr n analize globale efectuate la nivel naional. Rezultatele individuale i globale ale
CEC trebuie cunoscute de ctre ntreg colectivul laboratorului pentru a putea remedia erorile care au putut fi
obiectivate n urma CEC, a nlocui metodele neadecvate sau a mbunti sistemul de asigurare a calitii n cazul n
care erorile evideniate de participarea la CEC sunt aparent inexplicabile. Deciziile impuse la nivelul laboratorului
de ctre participarea la CEC trebuie pstrate n arhiva laboratorului timp de minimum 5 ani. Aceasta permite
identificarea unor erori repetate, iar n acest caz laboratorul este inspectat de o comisie de control al calitii. Se
recomand de asemenea participarea la CEC organizate de diferite organisme externe etc.
CRITERII DE CALITATE N MICROBIOLOGIE
Relevana clinic
Analiza microbiologic a diferitelor probe se realizeaz n scop preventiv, de diagnostic, prognostic sau
terapeutic. Personalul cu studii superioare care lucreaz ntr-un laborator de microbiologie are responsabilitatea
3

prelevrii corecte a probelor, a executrii analizei de laborator a probei, validrii rezultatelor i la nevoie,
confruntrii acestora cu date complementare (clinice, epidemiologice etc.), participnd deci n mod indirect la
interpretarea rezultatelor obinute. Un criteriu important de calitate pentru un test microbiologic este relevana
clinic care definete ct de mult contribuie un anumit test la prevenirea sau vindecarea bolilor infecioase.
Relevana clinic poate fi asigurat doar atunci cnd exist o bun comunicare ntre clinician i laborator.
De exemplu, dac n sputa sau n exudatul faringian al unui pacient spitalizat sunt identificate doar cteva colonii de
bacterii Gram-negative, identificarea de certitudine i realizarea antibiogramei nu au relevan clinic, deoarece nu
vor avea nici un efect asupra tratamentului pacientului. Dac este izolat Str. pyogenes, antibiograma nu are nici o
relevan clinic, din moment ce benzilpenicilina este antibioticul de elecie. n cazul n care E. coli este izolat
dintr-un caz sporadic de diaree fr urme de snge, identificarea serotipului este lipsit de relevan clinic,
deoarece nu exist nici o coresponden ntre serotip i patogenitate. n cazul n care un frotiu colorat Gram indic
"microbiot mixt potenial anaerob", identificarea de rutin a anaerobilor este lipsit de relevan clinic. Aceasta
ar fi costisitoare n timp i materiale i nu ar influena tratamentul pacientului. Dac o levur este izolat din tractul
respirator, trebuie realizate teste de identificare pentru Cryptococcus sp.(WHO, 2003).
Fiabilitatea
Pentru testele care dau rezultate cantitative, fiabilitatea este msurat prin exactitatea rezultatelor
(apropierea de valoarea real): analiza concentraiei antibioticului n ser, determinarea valorii concentraiei minime
inhibitorii (CMI), determinarea titrului de anticorpi din ser.
Pentru testele care dau rezultate calitative, fiabilitatea este msurat prin corectitudinea rezultatului:
identificarea agenilor patogeni, testarea sensibilitii la antibiotice prin metoda disc difuzimetric.
Utilizarea metodelor standardizate, precum i a terminologiei standard i a nomenclaturii recunoscute pe
plan internaional pentru microorganisme sunt eseniale pentru fiabilitate, de exemplu: S. aureus, nu "stafilococi
patogeni"; Str. pyogenes, nu "streptococi hemolitici" (WHO, 2003).
Reproductibilitatea sau precizia unui test microbiologic este influenat de lipsa de omogenitate a probelor
(o singur prob de la un pacient poate s conin mai mult de un organism, iar culturile repetate pot duce la
izolarea de organisme diferite), de lipsa de stabilitate (microorganismele dintr-o prob se pot multiplica cu rate
diferite, iar pentru a mbunti precizia unui test, probele ar trebui s fie testate ct mai curnd posibil dup
recoltare).
Eficiena unui test microbiologic este capacitatea acestuia de a furniza un diagnostic corect privitor la un
agent patogen sau la o condiie patologic. Acest parametru este msurat prin sensibilitate i specificitate.
Sensibilitatea este definit ca numrul total de rezultate pozitive / numrul total de pacieni infectai.
Aadar, cu ct sensibilitatea unui test este mai mare, cu att numrul rezultatelor fals-negative este mai mic (de
exemplu, sensibilitatea mediului MacConkey este slab pentru izolarea S. typhi din scaun, din cauza creterii rapide
pe acest mediu a bacteriilor nepatogene intestinale) (WHO, 2003).
Specificitatea se definete ca fiind numrul total de rezultate negative / numrul total de pacieni neinfectai.
Asadar, cu ct specificitatea unui test este mai mare, cu att numrul rezultatelor fals-pozitive este mai mic (de
exemplu, coloraia Ziehl-Neelsen a unui frotiu din sput este foarte specific pentru diagnosticarea tuberculozei, dar
pe un frotiu de urin este mult mai puin specific, deoarece ofer foarte multe rezultate fals pozitive, datorit
prezenei micobacteriilor atipice) (WHO, 2003).
Sensibilitatea i specificitatea unui test sunt interdependente. Prin reducerea nivelului de discriminare,
sensibilitatea unui test poate fi crescut, dar cu reducerea specificitii i vice-versa.
n prezent au fost elaborate, la nivel internaional, ghiduri de bun practic de laborator care nu se refer n
primul rnd la metodele utilizate (microbiologul are libertatea de a alege metodele optime pe baza recomandrilor
societilor tiinifice naionale sau internaionale de profil, sau validate chiar n laborator, ns n cazul din urm,
numai cu condiia ca rezultatele obinute s fie reproductibile). Ghidurile de bun practic de laborator conin reguli
care se refer n primul rnd la dotarea unui laborator, la organizarea acestuia, la modalitile de evaluare sau
control intern, de nregistrare a datelor obinute n toate etapele analizelor de laborator, de la prelevarea probelor
pn la eliberarea rezultatelor (REMIC, 2008). Procedurile de operare, mpreun cu controlul calitii, reprezint
elemente ale sistemului de asigurare a calitii, iar punerea lor n practic permite verificarea de ctre autoritile de
profil.
REGULI DE FUNCIONARE A UNUI LABORATOR DE CONTROL MICROBIOLOGIC
Organizarea laboratorului
Orice laborator care realizeaz analize microbiologice trebuie s aib un sistem de asigurare a calitii bazat
pe documente scrise (proceduri de operare standard) pentru fiecare etap a analizei microbiologice efectuate, ca i
4

pentru condiiile de execuie (instruciuni de lucru). Calitatea unei analize microbiologice depinde nu numai de
calitatea analizei n sine, ci i de organizarea general a laboratorului, calificarea i motivarea personalului (ISO
17025, REMIC, 2008). Controlul intern al calitii ncepe cu elaborarea procedurilor de operare care include toate
etapele de realizare a unei analize. Manualul de operare trebuie respectat, revizuit i actualizat periodic.
Laboratorul trebuie s aib o identitate bine stabilit n cadrul organizaiei din care face parte sau s aib
personalitate juridic. Organizarea i funcionarea laboratorului trebuie s ndeplineasc criteriile prevzute de lege,
att pentru sediul permanent, ct i pentru punctele de lucru sau facilitile de analiz pe teren.
Laboratorul:
a) Va avea personal de conducere cu autoritatea i competena necesare ndeplinirii sarcinilor de serviciu;
b) Va aduce dovezi c personalul de laborator nu este supus nici unei presiuni de ordin financiar sau comercial
care ar putea influena negativ calitatea muncii sale;
c) Acolo unde este cazul vor fi nominalizai manageri adjunci pentru a suplini personalul de conducere cnd
acesta lipsete din laborator;
d) Particip la exerciii de inter-comparare ntre laboratoarele de profil.
Sistemul calitii:
Documentaia sistemului calitii dintr-un laborator trebuie s conin pe lng procedurile operaionale,
urmtoarele documente adiionale:
a) lista personalului de laborator cu semntur autorizat;
b) procedura laboratorului pentru realizarea trasabilitii msurrii;
c) unde este cazul, o procedur care stabilete cum se documenteaz i se urmresc toate modificrile
introduse n activitatea de analiz curent;
d) procedurile pentru echipamentele majore i materialele de referin utilizate;
e) procedura pentru aciuni corective;
f) procedura pentru reclamaii;
g) procedura pentru pstrarea confidenialitii i proprietii intelectuale, dac este cazul.
Atunci cnd este nevoie de implementarea unor aciuni corective, acestea trebuie documentate. Responsabilul
cu asigurarea calitii va supraveghea punerea n aplicare a acestor msuri, cu respectarea calendarului stabilit.
Laboratorul va asigura calitatea rezultatelor furnizate pacienilor, prin implementarea unor controale periodice.
Procedura de control face obiectul reviziilor periodice i va include cel puin urmtoarele aspecte:
a) participarea la exerciii de inter-comparare i teste de capabilitate;
b) utilizarea cu regularitate a materialelor de referin i/sau materialelor cu caracteristici cunoscute,
preparate n laborator, ca parte a controlului de calitate al laboratorului;
c) repetarea analizelor pe probele conservate (contra probe), unde este cazul.
Organizarea unui sistem de calitate n laborator este responsabilitatea unei persoane desemnate de ctre director sau
de eful de laborator cu asigurarea calitii i privete mai multe aspecte:
Stabilirea unei organigrame a laboratorului:
- stabilirea fielor de post (se asigur c personalul corespunde din punctul de vedere al numrului, educaiei,
instruirilor periodice, cunotinelor tehnice i experienei, pentru funciile pe care le ocup i domeniul de
activitate declarat);
- asigur formaia personalului pentru o anumit sarcin i instruirea permanent a personalului;
- pune la dispoziia personalului procedurile de operare i instruciunile de lucru cuprinse n ghidurile de
specialitate;
- informeaz personalul cu privire la orice decizie sau introducere de noi proceduri sau instruciuni de lucru;
- menine nregistrrile relevante privind calificarea, instruirea, aptitudinile, experiena i competena
personalului;
- se asigur c normele de protecia muncii sunt cunoscute, respectate i aplicate.
Obligaiile personalului cu studii superioare din laborator:
- validarea analizelor (tehnic i biologic);
- semnarea buletinelor;
- transmiterea lor fr ntrziere.
Obligaiile personalului:
- trebuie s se conformeze la toate procedurile i instruciunile de lucru n vigoare din laborator.
Spaiul i condiiile de mediu:

cldirea laboratorului, spaiile de testare, sursele de energie, iluminatul, sistemul de nclzire i ventilaia,
trebuie s asigure condiiile optime de realizare a analizelor (laboratorul de microbiologie necesit spaii
luminate, aerate i fr praf);
- condiiile de mediu n spaiile n care se desfoar analizele trebuie s nu conduc la invalidarea rezultatelor
sau s influeneze negativ acurateea i precizia msurrii; trebuie acordat o atenie deosebit acestor aspecte
atunci cnd analizele se desfoar n alte spaii dect cele permanente ale laboratorului;
- se va asigura o separare efectiv a spaiilor nvecinate n care se desfoar activiti incompatibile;
- accesul i utilizarea spaiilor destinate analizelor vor fi definite i controlate;
- se vor asigura curenia i buna gospodrire a laboratorului.
Procedurile de lucru:
- toate etapele de lucru din fazele pre-analitic, analitic i post-analitic ale ncercrii (analizei), trebuie
documentate n proceduri de operare standard (POS);
- procedurile n vigoare, scrise, verificate, aprobate, datate sunt respectate de ctre personal;
- revizuirile procedurilor sunt notate, aprobate, nregistrate, datate i comunicate ntregului personal al
laboratorului;
- se ntocmesc fie cronologice ale tuturor operaiunilor (fluxuri de lucru) care s permit supravegherea
respectrii instruciunilor de lucru;
- n cazul n care se semnalizeaz o eroare de funcionare sau de executare, responsabilul cu calitatea ia iniiativa
nlocuirii acesteia i nregistreaz aciunile corective ntreprinse;
responsabilul cu calitatea asigur gestionarea adecvat a arhivelor.
Instalaiile, echipamentul, instrumentarul, consumabilele, reactivii, materialele de referin:
- laboratorul va fi dotat cu toate echipamentele i materialele de referin necesare pentru desfurarea corect a
analizelor;
- echipamentele vor fi meninute n mod corespunztor, activitatea fiind documentat de proceduri;
- orice echipament defect sau care produce rezultate suspecte va fi scos din uz, clar marcat i depozitat pe ct
posibil ntr-un spaiu exterior zonei de desfurare a analizelor, pn cnd va fi reparat i se va demonstra prin
teste de calibrare i verificare c a atins o performan satisfctoare. Laboratorul este obligat s examineze
influena utilizrii acestui echipament asupra rezultatelor analizelor anterioare;
- n cazul n care laboratorul utilizeaz echipamente care nu sunt n proprietatea i/sau controlul su, va lua toate
msurile necesare pentru a se asigura c se respect cerinele prevzute n standarde;
- toate consumabilele, reactivii, sunt n termen, disponibili, conservai n condiii bine definite, conform
reglementrilor n vigoare, adaptate la evoluia conoaterii tiinifice i datelor tehnice;
- resursele informatice utilizate pentru controlul, verificarea aparatelor sau pentru interpretarea rezultatelor
trebuie autorizate i actualizate.
Trasabilitatea msurrii i calibrarea:
- programul de calibrare/verificare i de validare a echipamentelor i a materialelor de referin va fi elaborat i
pus n aplicare astfel nct s asigure trasabilitatea la sistemul naional a msurrilor efectuate de laborator;
- materialele de referin sau substanele etalon vor fi utilizate de laborator numai n scopul calibrrii, dac nu se
pot prezenta dovezi obiective c performana lor ca materiale de referin nu se invalideaz prin utilizare n
activitatea curent.
Amenajarea i ntreinerea instalaiilor:
- construcia i localizarea trebuie s respecte reglementrile;
- amenajarea trebuie s permit izolarea activitilor cu risc de contaminare pentru operator i/sau prob (evitnd
aadar contaminarea la interior sau la exterior);
- trebuie s fie prevzute spaii de stocare la diferite temperaturi a materiilor prime, a reactivilor, separate de cele
utilizate pentru stocare probelor. Reactivii i materiile prime toxice sau periculoase se depoziteaz separat, n
condiii de securitate pentru personal i calitatea analizei probei, iar pe ambalajul lor trebuie s fie vizibile
meniunile: coroziv, iritant sau toxic;
- trebuie s existe proceduri scrise privind modalitatea de ntreinere a laboratorului.
Securitate:
- respectarea normelor regulamentare pentru evitarea riscului de incendiu i explozie;
- instalaiile de distribuire a gazului trebuie s respecte regulamentele i s fie verificate de personal autorizat;
- substanele inflamabile, periculoase, radioactive trebuie conservate regulamentar.
Instrumentar, echipamente:
- fiecare aparat trebuie s fie prevzut cu o carte tehnic;
6

- s fie adecvat pentru analizele microbiologice efectuate;

- s fie validate, ntreinute, curate, verificate periodic (metrologic).
Minim necesar pentru laboratorul de microbiologie:
- o centrifug;
- dou termostate;
- dispozitiv de anaerobioz;
- hot cu flux laminar;
- congelator 800C, tanc azot lichid dup caz;
- microscop optic;
- microscop inversat (pentru virologie);
- micrometru optic (pentru parazitologie);
- dispozitiv de colorare a lamelor.
Materiale i reactivi:
- achiziionate din surse conforme cu normele specifice folosite;
- conservate corespunztor, conform modului de utilizare prevzut de furnizor;
- reactivii preparai i/sau reconstituii n laborator trebuie s poarte data preparrii i cea a valabilitii soluiei
obinute. Prepararea, respectiv reconstituirea este prevzut n proceduri de operare sau instruciuni de lucru;
- toi reactivii expirai trebuie eliminai.
Mijloace informatice:
- accesul total sau parial la date trebuie limitat la personalul autorizat. Materialul informatic trebuie protejat fa
de accesul extern al persoanelor neautorizate;
- modificarea programelor sau a informaiilor coninute trebuie realizat numai de persoane autorizate, iar
modificrile trebuie nregistrate.
Responsabilul de meninere a sistemului informatic garanteaz c:
- personalul implicat respect regulile secretului profesional;
- sistemul este configurat i protejat pentru asigurarea confidenialitii;
- orice modificare se realizeaz de personal calificat, doar la cererea responsabilului de laborator i face obiectul
unui proces verbal detaliat, semnat, nregistrat i postat n arhiva laboratorului.
Eliminarea deeurilor:
- conform legislaiei i reglementrilor n vigoare;
- se separ n dou categorii: deeuri cu risc i deeuri asimilabile celor menajere;
- deeurile cu risc sunt separate n trei grupe:
a) potenial contaminate;
b) produi toxici sau chimici;
c) produi radioactivi.
- pentru fiecare din cele 3 grupe, trebuie s existe proceduri privind modalitile specifice de condiionare,
stocare, transport, tratare i pretratare sau eventual un contract cu o societate de profil pentru realizarea acestor
proceduri;
- deeurile asimilabile celor menajere sunt depozitate n containere care intr n circuitul de eliminare al
deeurilor menajere (pentru care trebuie s existe acordul colectivitii locale).
Execuia analizelor de laborator:
Laboratorul va avea proceduri de utilizare a tuturor echipamentelor relevante, instruciuni de manipulare i
pregtire pre-analitic a probelor i proceduri de lucru pentru metodele care n lipsa unor asemenea precizri, ar
pune n pericol corectitudinea rezultatelor.
Manualul propriu al laboratorului reprezint o cerin absolut necesar pentru AC deoarece:
- menine i mbuntete calitatea serviciilor laboratorului oferite pacientului i identific problemele rezultate
din practici greite;
- furnizeaz personalului instruciuni scrise despre efectuarea testrilor conform standardelor acceptate n
laborator;
- ajut la evitarea omisiunilor care apar n execuia testelor;
- furnizeaz tehnici standardizate scrise, utilizate n pregtirea personalului;
- faciliteaz pregtirea listelor de inventar pentru reactivi, medii i echipamente;
- promoveaz practicile corecte de biosiguran n laborator.
Procedurile se refer la:
- curarea spaiului de lucru;
7

igiena personal;
msuri de precauie siguran (zone pentru luarea mesei i fumat situate n afara spaiului de lucru,
manipularea i eliminarea materialelor infectate, vaccinrile corespunztoare pentru personal, de exemplu,
pentru hepatita B);
- asistena de rutin i ntreinerea echipamentelor;
- prelevarea probelor;
- nregistrarea probelor;
- eliminarea probelor necorespunzatoare;
- pregtirea mediilor de cultur (indiferent dac sunt achiziionate gata preparate sau sunt produse n laborator din
ingrediente de baz, trebuie s se asigure un stoc minim de medii care s acopere gama de analize efectuate: de
exemplu o baz de agar-agar care poate fi utilizat pentru pregtirea gelozei snge, gelozei chocolat i a mai
multor medii selective; un mediu foarte selectiv, agar Salmonella, Shigella sau dezoxicolat citrat i unul mai
puin mediu selectiv, agar MacConkey, necesare pentru izolarea enterobacteriaceelor patogene din probe de
materii fecale etc.; cantitile maxime de mediu care pot fi comandate trebuie epuizate n 6 luni, sau cel mult 1
an; cantitatea total ar trebui s fie ambalat n containere cu cantiti ce vor fi utilizate n maxim dou luni)
(WHO, 2003);
- transportul probelor;
- eventualele tratamente prealabile ale probei;
- recepia probelor;
- conservarea probelor nainte i dup analize;
- prelucrarea probelor;
- nregistrarea rezultatelor;
- raportarea rezultatelor;
- asigurarea calitii;
- gestionarea sistemelor informaionale eventual existente.
Toate instruciunile, standardele de metod, manualele i literatura de referin relevante pentru domeniul de
activitate a laboratorului, vor fi meninute la zi i vor fi accesibile personalului de laborator.
Laboratorul va avea un sistem documentat pentru identificarea unic a probelor de analizat, pentru a preveni
orice confuzie legat de identitatea acestora.
Laboratorul va avea proceduri i faciliti adecvate pentru a preveni deterioararea probelor n timpul depozitrii,
manipulrii, pregtirii i analizei. n situaiile n care probele trebuie depozitate i/sau pregtite n condiii speciale
de mediu, acestea vor fi asigurate, monitorizate i nregistrate. n cazul n care o prob sau o parte dintr-o prob
trebuie pstrat pentru repetarea analizelor (contra-proba), laboratorul va asigura toate condiiile pentru pstrarea
integritii i securitii acesteia.
Unde este cazul, laboratorul va avea proceduri pentru recepia i pstrarea n siguran a contra-probelor.
Procedurile pot avea anexe (de exemplu, fia de nregistrare a probelor). Numrul procedurilor trebuie s fie
unic, iar unele pot fi comune cu cele din alte laboratore (de exemplu, procedurile de nregistrare a reactivilor
chimici, de calibrare a pipetelor i balanelor).
Este de dorit ca toate procedurile s respecte un format unic, care sa cuprind urmtoarele puncte (REMIC,
2008):
- titlu unic;
- scopul procedurii;
- procedura;
- responsabiliti;
- numele autorului i al persoanei care aprob;
- data aprobrii, perioada de valabilitate, ediia.
Laboratorul va utiliza metode de analiz i proceduri de testare adecvate scopului, inclusiv pentru prelevarea
probelor, manipularea, transportul, depozitarea i pregtirea lor. Performanele metodelor de analiz vor respecta
limita de detecie, precizia i acurateea recomandate de legislaia n vigoare, n domeniul apei.
Ori de cte ori este necesar utilizarea unei metode nestandardizate, se va obine acordul pacientului, iar metoda
de analiz va fi documentat, validat, documentaia rezultat fiind accesibil solicitantului sau altor persoane
responsabile.
Atunci cnd prelevarea probelor este parte integrant a metodei de analiz, laboratorul va documenta aceast
situaie printr-o procedur special. Dac sunt aplicabile, se vor utiliza tehnici statistice pentru eantionare.
8

Dac se utilizeaz echipamente automate asistate de calculator pentru prelevarea, pregtirea, manipularea,
nregistrarea, raportarea i arhivarea rezultatelor analizelor, laboratorul se va asigura c:
a) sunt ndeplinite criteriile prezentului document;
b) soft-ul utilizat este adecvat i documentat;
c) sunt stabilite i implementate proceduri referitoare la protejarea integritii datelor; aceste proceduri vor include
cel puin securizarea datelor introduse, prelucrate, transmise, arhivate;
d) calculatoarele i echipamentele automate vor fi meninute n stare de funcionare adecvat prin asigurarea
condiiilor de mediu i de operare;
e) se vor stabili i implementa proceduri pentru meninerea securitii datelor, inclusiv prin prevenirea accesului
neautorizat.
Unde este cazul vor exista proceduri pentru achiziionarea, recepia i depozitarea materialelor consumabile utilizate
n activitatea de laborator.
Sub-contractarea analizelor
Sub-contractarea anumitor analize se va face doar cu un laborator cu un nivel de competen cel puin
echivalent cu al laboratorului care trimite analizele, iar pacientul va fi notificat.
nregistrarea rezultatelor
Laboratorul va menine un sistem de nregistrare a rezultatelor, adecvat activitii sale, n concordan cu
prevederile prezentului document. Laboratorul va nregistra toate observaiile i calculele originale i o copie dup
buletinele de analiz pe o perioad considerat ca adecvat. nregistrrile referitoare la fiecare analiz vor conine
suficiente informaii pentru a permite repetarea lor. Acolo unde este cazul, nregistrrile conexe, ca de exemplu
calibrrile, vor fi arhivate pe o perioad considerat adecvat.
Stocarea i conservarea arhivelor:
- rezultatele analizelor trebuie pstrate 5 ani (puse la dispoziia controalelor externe de calitate);
- procesele verbale privind msurile luate pentru corectarea erorilor evideniate n urma CEC 5 ani;
- rezultatele CIC 3 ani;
- 1 exemplar din manualul calitii 3 ani;
- contractele cu societile de profil i documentele legate de eliminarea deeurilor 3 ani;
- documentaia privind reactivii i consumabilele pe durata utilizrii lor;
- documentele referitoare la modificrile programelor informatice;
- arhiva trebuie depozitat ntr-un loc adecvat i care s asigure confidenialitatea datelor;
- laboratorul va avea proceduri pentru nregistrarea electronic a datelor. Dac arhiva este informatic se iau
msuri de evitare a pierderii de informaie (copii multiple pe CD-ROM cel puin dou, una pentru consultri,
una pentru pstrare).
Raportarea rezultatelor:
Rezultatele fiecrei analize sau serii de analize efectuate de laborator vor fi raportate cu acuratee, clar,
neambiguu i obiectiv, n conformitate cu instruciunile din metoda de analiz.
Rezultatele vor fi raportate sub forma unui buletin de analiz care va include toate informaiile necesare pentru
interpretarea rezultatelor i toate informaiile cerute de utilizarea metodei de analiz.
Buletinul de analiz se transmite imediat ce rezultatul analizei este obinut.
Buletinul de analiz va include cel puin urmtoarele informaii:
- titlul, de exemplu Buletin de analiz;
- denumirea i adresa laboratorului i locul n care a fost efectuat analiza;
- identificarea unic a buletinului de analiz;
- unde este cazul, numele i adresa solicitantului;
- descrierea i identificarea neambigu a probelor analizate;
- caracterizarea probei i condiiile n care aceasta a fost analizat;
- data i ora la care proba a fost recepionat, data i ora la care a fost analizat;
- specificarea metodei de analiz utilizate i descrierea neambigu a oricrei alte metode de analiz
nestandardizate utilizate;
- detalii despre procedura de prelevare a probei;
- se va meniona orice abatere de la metoda de analiz standardizat i orice alt informaie relevant, ca de
exemplu condiiile de mediu;
- msurrile, examinrile i rezultatele derivate, nsoite de tabele, grafice, schie sau fotografii dup caz i
orice abateri constatate;
- estimarea incertitudinii n msurare;
9

semntura i funcia persoanei responsabile pentru coninutul buletinului de analiz i data eliberrii
buletinului;
unde este relevant, declaraia rezultatele se refer exclusiv la proba analizat;
declaraia acest buletin de analiz nu va fi reprodus parial, fr acordul scris al laboratorului;
n cazul n care buletinul de analiz conine rezultate ale unor analize sub-contractate, aceste rezultate vor fi
clar marcate;
se va acorda atenie formei grafice a buletinului de analiz, astfel nct acesta s fie uor de citit; formatul
poate fi adaptat fiecrui tip de analiz, dar antetul se recomand a fi standardizat;
materialele adiionale buletinului de analiz vor fi organizate ntr-un document separat, intitulat de exemplu
Raport suplimentar la buletinul de analiz nr., care va primi un numr de ordine;
laboratorul va notifica n scris, cu promptitudine, solicitantul, asupra oricrui eveniment care produce dubii
asupra validitii rezultatelor nscrise n buletinul de analiz;
unde este cazul, laboratorul va asigura transmiterea rezultatelor ctre pacient, prin telefon, fax, alte mijloace
electronice sau pe suport magnetic, pe baza unei proceduri care respect prevederile n vigoare i
confidenialitatea datelor;
raportarea rezultatelor va respecta toate cerinele legislaiei n vigoare.

AUTORIZAIA DE DESCHIDERE A UNUI LABORATOR

Un laborator poate fi deschis doar de o persoan fizic, societate civil profesional sau societate anonim
sau societate cu responsabilitate limitat, un organism sau serviciu de stat, de un departament, o instituie public,
un organism mutualist sau de securitate social, un organism cu scop nelucrativ cu utilitate public necunoscut,
care posed o autorizaie eliberat de MS. eful laboratorului trebuie s aib o diplom n medicin, medicin
veterinar, farmacie sau o formaie specializat, certificate de studii aprofundate, echivalene, derogri. Tehnicienii
trebuie s aib diplome eliberate de instituiile aprobate de MS.
CIC se realizeaz n special cu probe de referin (materiale sau substane ale cror proprieti sunt
suficient de omogene i bine stabilite pentru a putea fi folosite pentru calibrarea unui aparat, evaluarea, compararea
i validarea unei metode de msurare, pentru evaluarea calitii altor materiale, demonstrarea acurateii rezultatelor,
monitorizarea performanelor laboratorului (ISO Guide 30:1992). Pe ct posibil, materialele de referin trebuie
utilizate n condiii adecvate (conform standardelor i recomandrilor producatorului). Metoda de referin este o
metod de investigare standard naional sau internaional, complet, cu acuratee i precizie demonstrate, care
descrie cu claritate i exactitate condiiile i procedurile necesare pentru msurarea uneia sau mai multor valori
proprii i poate fi utilizat pentru evaluarea acurateii altor metode pentru aceeai analiz sau pentru caracterizarea
unui material de referin. n laboratorul de microbiologie se controleaz echipamentele (tabelul 30), mediile de
cultur (tabelul 31, 32), discurile de antibiogram, materialele de lucru, sistemele de testare automat i se asigur
verificarea competenelor i performanelor personalului (ISO 15189, ISO 17025, L53/2005 i OUG 65/2005).
Organizarea controlului intern al calitii este responsabilitatea efului de laborator de analize medicale, iar
reprezentantul legal al laboratorului de analize medicale are obligaia de a asigura resursele necesare ndeplinirii
acestuia. CIC se efectueaz zilnic, sptmnal, lunar sau ori de cte ori este nevoie. Rezultatele obinute se
analizeaz de ctre specialistul responsabil de analiza respectiv, care decide acceptarea sau respingerea acestora
(Ord. MSP 1301/20.07.2007). n laboratorul de microbiologie se controleaz toate materialele, echipamentele i
procedurile de lucru. CIC trebuie s fie practic (util), realizabil (s se poat aplica) i abordabil (costuri accesibile).
Laboratorul de microbiologie trebuie s cuprind:
- un local de recepie;
- un birou de secretariat i arhiv;
- sal de prelevare a probelor;
- spltorie;
- camer pentru efectuarea propriu-zis a analizelor.
Tabelul 30. Controlul de calitate al echipamentelor.
Echipament
ntreinere de rutin
Jar de anaerobioz

Se cur sptmnal
Se reactiveaz
catalizatorul dup fiecare
utlizare (160oC, 2h).

Monitorizare
Se utilizeaz de fiecare
dat albastru de metilen ca
indicator.

10

Mentenan tehnic i
inspecie
Se verific sptmnal
etaneitatea garniturilor.

Autoclav

Centrifug
Etuv

Se nlocuiete catalizatorul
odat la 3 luni.
Curare i schimbarea
apei lunar.
Maxim 2 l de mediu.

tergerea pereilor interiori

cu antiseptic sptmnal
sau n caz de contaminare.
Curarea interiorului o
dat pe lun.

Incubator

Curarea interiorului i a
rafturilor o dat pe lun.

Microscop

tergerea lentilelor cu
material textil sau hrtie
special n fiecare zi.
Curarea prii mecanice
o dat pe sptmn.
Acoperire pentru
protejarea de praf.
Curare i decongelare o
dat la 2 luni i dup pan
de curent.
Curarea interiorului i
schimbarea apei o dat pe
lun.

Frigider
Baie de ap

Hota bacteriologic
Deionizator de ap

Dezinfecie i curire
sptmnal.

Verificarea i ajustarea
nivelului apei nainte de
fiecare utilizare.
nregistrarea timpului i
temperaturii de sterilizare
la fiecare utilizare.
Verificarea performanei
sptmnal cu suspensii de
spori de Bacillus
stearothermophilus sau
testul Bowie Dick.

Verificare o dat la 6 luni

nlocuirea anual a
periilor.
nregistrarea timpului i
temperaturii de sterilizare
la fiecare utilizare.
nregistrarea temperaturii
la nceputul zilei (35 +/1oC).
Verificarea alinierii
condensorului o dat pe
lun.

Verificare o dat la 6 luni.

nregistrarea temperaturii
n fiecare diminea (28oC).
Verificare zilnic a
nivelului apei.
nregistrarea temperaturii
n prima zi din fiecare
sptmn.
nregistrarea presiunii
aerului la fiecare
deschidere.
Zilnic - citirea
rezistivitii.
Sptmnal- culturi pentru
testarea microbiologic.

Verificare o dat la 6 luni.

Pipete automate

Verificare o dat la 6 luni.

Verificare anual.

Verificare o dat la 6 luni.

Verificare anual.

Verificare bianual.

Mediile de cultur
Mediile de cultur pot fi preparate n laborator din ingredientele de baz sau din pulberi deshidratate disponibile n
comer, sau pot fi achiziionate gata de utilizare.
Pulberile deshidratate comerciale sunt recomandate, deoarece se pot transporta i stoca uor, iar calitatea este
potenial mai bun dect a celor preparate n laborator din ingrediente. Acestea trebuie nsoite de certificate de
calitate, care s ateste performanele privind creterea i supravieuirea microorganismului int i inhibarea sau
supresarea creterii altor microorganisme.
Calitatea mediilor depinde de calitatea materialelor utilizate pentru obinerea lor, n special de calitatea apei
(concentraia n ioni de Ca nu trebuie s depeasc o anumit valoare, deoarece Ca are efect inhibitor asupra
creterii microorganismelor, conductivitatea < 15 S i valoarea pH nu mai mic de 5,5) i calitatea placilor Petri
11

(se utilizeaz numai plci din plastic borosilicat care nu elibereaz alkali n mediu, iar limita maxim admis de
reziduu toxic de EtO (etilenoxid) este de 1 g/g). Pentru rehidratarea mediilor deshidratate se va folosi apa
demineralizat, distilat steril.
Controlul calitii aditivilor este de asemenea foarte important.
Controlul sterilitii sngelui se realizeaz n dou etape:
1)Testarea iniial (se nregistreaz n registrul de control: specia animal de la care a provenit lotul de snge ,
numrul lotului i data expirrii, se scoate steril cu o sering o cantitate de 2,5 ml i se nsmneaz ntr-un flacon
de hemocultur care se incubeaz, iar flaconul original se refrigereaz):
o dac proba de control se pozitiveaz este anunat responsabilul de calitate, se face coloraie Gram, se
face subcultivare pe geloz snge, se identific specia contaminant i se scoate din uz flaconul cu
snge;
o dac proba de control este negativ, sngele se introduce n lucru pentru prepararea mediilor cu snge.
2)Testarea final (cteva picturi din flaconul utilizat se cultiv pe o plac de mediu cu snge, se incubeaz la
35C, 48 ore, apoi la temperatura camerei nc 48 ore, iar rezultatul se nregistreaz n registrul de control al
mediilor cu snge).
Mediile preparate trebuie controlate vizual privind caracteristicile fizice: prezena neregularitilor i a
bulelor de aer, grosimea (optim 4.0 0.2 mm) neuniform a stratului de mediu repartizat n plac, uscarea sau
deshidratarea mediului, nghearea sau cristalizarea acestuia n plac.
Mediile trebuie alese conform analizelor efectuate. Unele pot avea utilizri foarte diverse, altele foarte
speciale. De exemplu o baz de agar este utilizat pentru prepararea gelozei snge, gelozei chocolat i a mai multor
medii selective. Un mediu nalt selectiv (agar-Salmonella Shigella sau dezoxicolat citrat agar) i unul mai puin
selectiv (agar MacConkey) sunt necesare pentru izolarea enterobacteriilor patogene din probe de materii fecale.
Pentru izolarea Campylobacter spp. este necesar un mediu special (WHO, 2003).
Se comand de obicei cantitile de medii care vor fi folosite timp de 6 luni, sau cel mult 1 an.
Cantitatea total ar trebui s fie ambalat n containere care vor fi utilizate maxim n 1-2 luni.
La recepia mediilor, se asigur c recipientele sunt bine nchise. Deoarece mediile deshidratate pot absorbi
apa din atmosfer dup ce sunt depozitate ntr-un mediu cu umiditate ridicat, capacele se izoleaz cu cear de
parafin.
Se noteaz data primirii pe fiecare recipient.
Se depoziteaz la ntuneric, loc rcoros, bine ventilat.
Se rotete stocul, astfel nct materialele mai vechi s fie utilizate primele.
Se noteaz data deschiderii recipientului.
Se arunc mediile deshidratate ntrite sau care i-au schimbat culoarea.
Se ine o eviden scris a stocului de medii.
Stocarea mediilor de cultur
Mediile se pstreaz la loc ferit de lumin i cldur.
Mediile care conin snge, alte lichide organice sau antibiotice se pstreaz la frigider (mediile repartizate n
tuburi cu dopuri de vat/ tifon, timp de 2- 3 sptmni, cele cu capac cu filet, 3 luni, iar mediile rapartizate n plci
Petri, 4 sptmni).
Acurateea compoziiei mediilor, diluenilor i fluidelor de suspensie, preparate n laborator, trebuie
verificat n ceea ce privete asigurarea supravieuirii organismului int, inhibarea sau supresia creterii altor
organisme, proprietile biochimice (medii difereniale, speciale) i proprietile fizice (pH, volum i sterilitate) (EA
- 4/10).
Controlul calitii mediilor preparate (tabelul 32, 33)
1. Testarea pH. Valoarea pH a mediului preparat nu trebuie s fie verificat atunci cnd este corect preparat
din mediu deshidratat. n schimb, verificarea este necesar n cazul n care mediul este
preparat din ingrediente de baz. Mediul trebuie lsat s se rceasc nainte de testarea pH. Mediile solide ar trebui
testate cu un electrod de suprafa sau dup macerare n ap distilat. Dac pH difer cu mai puin de 0,2 uniti fa
de cel din caietul de sarcini, acesta se ajusteaz cu soluie de acid sau respectiv, soluie bazic.
2. Controlul sterilitii. Se recomand atunci cnd la baza solid se adaug componente precum sngele,
dup autoclavare. Se preleveaz 3-5% din fiecare lot i incubeaz la 35 OC, timp de 2 zile. Restul se pstreaz la
frigider. Dac pe plac apar mai mult de dou colonii, se arunc ntregul lot.
3. Testarea performanelor de cretere microbian (CLSI M22-A2. CLSI M22-A3). Laboratorul trebuie
s dein ntotdeauna un set proaspt de tulpini de referin (selectate dintre tulpinile de lucru, sau obinute din surse
comerciale sau oficiale) pentru monitorizarea performanei mediilor de cultur:
12

- se prepar o suspensie de densitate McFarland 0.5 (107- 108 UFC/mL) sau cu absorbana de 0.08-0.1 msurat la
625 nm;
- se incubeaz pe durata de timp recomandat n mod curent pentru mediul respectiv;
- se citesc plcile;
- se ine o eviden corect a rezultatelor.
Evaluarea creterii microorganismelor se realizeaz prin metode relative (mrimea coloniilor, caracteristicile
coloniilor) sau obiective (metoda ecometric, metoda proporiilor).
Tabelul 31. Tulpini de referin recomandate pentru controlul mediilor (WHO, 2003).
Enterobacterii
Bacterii
Gram-negative
fastidioase
Enterococcus faecalis (ATCC 29212)
Citrobacter freundii
Moraxella catarrhalis,
S. aureus (ATCC 25923)
Enterobacter cloacae
H. influenzae tip b
S. epidermidis
K. pneumoniae
beta-lactamaz-negativ
Str. agalactiae
Proteus mirabilis
beta-lactamaz-pozitiv
Str. mitis
E. coli (ATCC 25922)
H. parainfluenzae
S. typhimurium
Serratia marcescens
N. gonorrhoeae
Str. pneumoniae
Sh. flexneri
N. meningitidis
Str. pyogenes
Yersinia enterocolitica
CGP

Fungi
C. albicans

Ali BGN
Acinetobacter lwoffi
Ps. aeruginosa (ATCC 27853)
V. cholerae (non-01)

Tabelul 32. Teste de performan realizate pe mediile uzuale (WHO, 2003).

Mediu
Tulpina testat
Agar bil esculin 24h

Enterococcus faecalis
Streptococcus
-hemolitic
Str. pyogenes

Geloz snge, 24h, CO2

Anaerobi
Bacteroides fragilis
Cl. perfringens

Prezena creterii/aspectul
coloniilor sau mediului
Da/nnegrirea mediului
Nu
Da/ -hemoliz

Str. pneumoniae

Da/ -hemoliz

Geloz chocolat, 24h, CO2

H. influenzae

Da

Decarboxilaze

S. typhimurium

S. flexneri

S. typhimurium
K. pneumoniae

,
+
-

S. typhimurium
Proteus mirabilis

+
+

E. coli

Serratia marcescens

TSI (poriunea dreapt de min. 2.5

cm) (fig. 322)

S. typhimurium
S. flexneri
A. lwoffi
Citrobacter freundii

Pant roz, gaz + H2S

Pant roz, gaz
Mediu nemodificat
Pant galben, gaz + H2S

MacConkey cu cristal violet 24h

E. coli

Colonii roii

Lizin 48h
Ornitin 48h

Arginin-dihidrolaz 48h
Gelatinaz 24h

13

Malonat -24h

Agar Manitol Sare 24h

Rou metil/VogesProskauer 48h

Agar MuellerHinton 24h

P. mirabilis

Colonii incolore, neinvazive

E. faecalis

E. coli

K. pneumoniae

+ (albastru)

S. aureus

Colonii galbene

S. epidermidis

Colonii roii

E. coli

E. coli

+/-

K. pneumoniae

-/+

E. coli ATCC 25922

Zone de inhibiie
corespunztoare

(verde)

S. aureus ATCC 25923

Ps. aeruginosa ATCC
27853
Bulion cu nitrat 24h

E. coli

+
-

Acinetobacter lwoffi
Oxidare/fermentaie 24h

Ps. aeruginosa

Oxidare la suprafa

Dextroz

A. lwoffi

Nici o modificare

Ap peptonat (indol) 24h

E. coli

K. pneumoniae

E. coli

P. mirabilis

E. coli
S. typhimurium
Y. enterocolitica

Colonii incolore

Fenilalanin -dezaminaz /24h

Cu FeCl3

Agar SalmonellaShigella 24h

Dezoxicolat citrat agar 24h

Bulion selenit 24h

Citrat Simmons 48 h
Tiosulfat citrat sruri biliare 24h
Agar ThayerMartin 24h, CO2

S. flexneri
S. typhimurium

Colonii incolore
Colonii incolore
Cretere dup subcultivare

E. coli

E. coli
K. pneumoniae
Vibrio spp.

+, albastru
Colonii galbene

N. meningitidis
N. gonorrhoeae
Staphylococcus spp
E. coli
Candida

+
+
-

14

Bulion tioglicolat 24h

Uree 24h

Bacteroides fragilis
E. coli

+
-

P. mirabilis

+ (roz)

A.
Tub nensmnat

Dezaminarea
aminoacizilor
(alcalinizarea
pantei)
Fermentarea
Glucozei
Fermentarea
Lactozei
Fermentarea
Zaharozei
Gaz din glucoz
Producerea H2S
Exemple

4
4A- uoar realcalinizare a
pantei produs de
microorganismele rou metil
negative
+

Pseudomonas
Alcaligenes
Acinetobacter
Ali bacili Gramnegativi non
enterici

Morganella,
Providencia,
Shigella

+
Citrobacter,
Salmonella,
Proteus,
Edwardsiella

+
E. coli,
Enterobacter,
Klebsiella

-+
+
Citrobacter H2S+,
E. coli H2S+
Salmonella
lactozo+

15

B.

C.

Tub
nensmnat
Mobilitate
LDC
FAD
Exemple

+
+
E. coli

Tub
nensmnat
Mobilitate
Ureaz
Indol
Exemple

Shigella flexnerii

+
+
Proteus sp.

+
Salmonella sp.s

Fig. 322. Aspectul diferitelor sisteme multitest utiliate pentru evidenierea caracterelor biochimice ale microorganismelor: a) mediu TSI
nsmnat cu diferite specii de enterobacterii; mediu MILF (mobilitate, indol, LDC, FAD); mediu MIU (mobilitate, indol, ureaz).

Tabelul 33. Surse de neconformitate privind calitatea mediilor de cultur.

Nr. crt.
Neconformitate
Sursa
1.
Agar nesolidificat
Depirea temperaturii de sterilizare, pH sczut care poate
corespunztor
determina hidroliza acid a agarului, eroare de cntrire a
ingredentului,
omogenizare
insuficient,
calitate
necorespunztoare a agarului.
2.
pH incorect
Sticlrie contaminat chimic, ap impur, supranclzirea
mediului la sterilizare, pH msurat la o temperatur neadecvat,
deteriorarea mediilor deshidratate.
3.
Culoare necorespunztoare sau Ap impur, sticlrie murdar, pH necorespunztor,
nuan mai nchis
supranclzirea mediului la sterilizare, deteriorarea mediilor
deshidratate.
4.
Apariia de precipitate
Supranclzirea mediului la sterilizare, ap impur, sticlrie
contaminat, deteriorarea mediilor deshidratate.
5.
Inhibarea dezvoltrii
Supranclzirea mediului la sterilizare, deteriorarea mediilor
microorganismelor/ cretere deshidratate, sticlrie sau ap contaminate, erori de cntrire a
redus/ selectivitate redus
ingredientelor i de omogenizare a acestora.

Controlul coloranilor i reactivilor

Laboratorul trebuie s se asigure c toi reactivii (inclusiv soluiile stoc), mediile, diluenii i alte fluide de
suspensie sunt corect etichetate, indicnd cu exactitate identitatea produsului, concentraia, condiiile de pstrare,
date privind prepararea, date privind valabilitatea/perioada de pstrare recomandat (EA - 4/10).
Testarea (tabelul 34) trebui s fie efectuat:
- de fiecare dat cnd este preparat un nou lot de soluie de lucru;
- n fiecare sptmn (periodicitatea este critic pentru coloraia Ziehl-Neelsen la rece, n timp ce coloranii
utilizai n metoda clasic prezint o stabilitate de cteva luni).
Coloranii i reactivii trebuie aruncai atunci cnd:
- a fost atins data de expirare;
- apar semne vizibile de deteriorare (turbiditate, precipitate, modificri de culoare).
Tabelul 34. Controlul reactivilor de laborator (dup WHO, 2003).
Reactiv de testat
Control pozitiv
Control negativ
Bacitracina
Str. pyogenes (inhibiie)
E. faecalis

16

Mediu
Geloz snge

Catalaza
Coagulaza
b-Glucuronidaz, PGUAacid 4-Nitrofenil-b-Dglucopiranosiduronic
Coloraia Gram
ONPG Ortonitrofenil
+D galactopiranozid
Optochin
Oxidaz
Telurit
Factor V
Factori XV
ZiehlNeelsen

S. aureus
S. aureus
E. coli

E. faecalis
S. epidermidis
K. pneumoniae

TSA
TSA
TSA

Staphylococcus spp
E. coli

E. coli
S. typhimurium

Frotiu mixt
TSI

Str. pneumoniae
(inhibiie)
Ps. aeruginosa
E. faecalis
H. parainfluenzae
(cretere)
H. influenzae (cretere)
M. tuberculosis

Str. mitis

Geloz snge

E. coli
Str. agalactiae
H. influenzae

TSA
Geloz snge
TSA
TSA
Frotiu mixt

Controlul antigenelor de diagnostic i al antiserurilor:

- se urmeaz totdeauna instruciunile productorului;
- se pstreaz reactivii la temperatura recomandat. Unii reactivi serologici nu tolereaz congelarea;
- se evit congelarea i decongelarea repetate;
- nainte de congelare, antiserul se distribuie n poriuni mici, suficiente pentru cteva teste;
- pentru aglutinarea bacterian se folosesc totdeauna culturi proaspete i pure;
- serurile recoltate de la acelai pacient, n timpul fazei acute i convalescenei, trebuie testate cu acelai lot
de reactivi;
- pentru diagnosticul serologic al sifilisului, trebuie utilizate exclusiv proceduri recunoscute la nivel naional
sau internaional;
- fiecare lot de teste serologice trebuie s includ:
- un ser negativ (pentru controlul specificitii);
- un ser slab pozitiv (pentru controlul sensibilitii);
- un ser pozitiv cu titru nalt (pentru controlul tritrului);
se nregistreaz totdeauna valorile titrurilor serului de control.
Controlul testrii sensibilitii la antibiotice (antibiograma)
Testarea sensibilitii la antibiotice este reglementat de o serie de standarde: CLSI (Clinical and Laboratory
Standards Institute), DIN (Deutsches Institut fr Normung), BSAC (British Society for Antimicrobial
Chemotherapy), SRGA (Swedish Reference Grup for Antibiotics), SFM (Socit Franaise de Microbiologie),
EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, nfiinat din 1996).
Tulpinile standard de control pentru antibiogram sunt: S. aureus (ATCC 25923; NCTC 6571); E. coli (ATCC
25922; NCTC 10418) i Ps. aeruginosa (ATCC 27853; NCTC 10622), la care se adaug Enterococcus faecalis
(ATCC 29212), H. influenzae (ATCC 49247), Str. pneumoniae (ATCC 49619) (CLSI, 2010).
Testele ar trebui s fie efectuate cu cele trei tulpini standard atunci cnd un nou lot de discuri sau de mediu este
pus n folosin, respectiv o dat pe sptmn, n paralel cu antibiograma de rutin sau de fiecare dat cnd se obin
diametre n afara limitelor admise pentru tulpinile de referin:
- pentru antibiograma tulpinilor bacteriene fr exigene nutritive se utilizeaz ntodeauna mediul MllerHinton, care se testeaz cu tulpina de referin Enterococcus faecalis ATCC 29212, i discuri de SXT i
sulfonamid;
- corectarea pH (7.2-7.4) este obligatorie, deoarece este esenial pentru activitatea unor antibiotice;
- inoculul trebuie standardizat prin comparare cu standardul de turbiditate MacFarland 0.5 sau cu ajutorul
densitometrului;
- discurile se testeaz cu ajutorul tulpinilor de referin (discurile se pstreaz la +4 oC, cu excepia lactamicelor care se pstreaz la -20 oC);
- zonele de inhibiie trebuie msurate cu atenie i raportate la tabelele cu diametre critice, iar pentru fiecare
dintre tulpinile de referin, acestea trebuie s se ncadreze n limitele prevzute; citirea zonelor de inhibiie
obinute pentru tulpinile de referin se nregistreaz n Registrul de Control Discuri i nu este admis mai
mult de o eroare la 20 de testri consecutive sau de 3 abateri la 30 de testri consecutive, depirea acestei
17

limite necesitnd instituirea msurilor corective i retestarea unei alte serii de 20 de ncercri; dup
instituirea unor aciuni corective; pentru testrile sptmnale, controlul tulpinilor se efectueaz 5 zile
consecutiv, pentru fiecare combinaie microorganism antibiotic, cele 5 rezultate trebuind s fie cuprinse n
limitele admise, iar dac rezultatele sunt n afara limitelor, pentru acurateea i precizia controlului, se reia
testarea zilnic timp de 30 zile.
Tulpina de referin este definit ca orice microorganism caracterizat la nivel de gen i specie, clasificat i descris
conform caracteristicilor i originii (ISO 11133-1:2009) obinut dintr-o colecie recunoscut la nivel naional sau
internaional.
Cultura de referin este termenul general utilizat pentru culturi de referin, stocuri de referin i culturi de lucru.
O cultur stoc de referin este obinut prin pregtirea microorganismului dintr-un tip de cultur de colecie (se
pstreaz la -70C n TCB/Trisodium Citrat Glicerol).
Cultura stoc este reprezentat de un set de culturi identice separate, obinute printr-o singur subcultur dintr-o
tulpin de referin (ISO 11133-1:2009). Cu 24 de ore nainte de testare, din cultura stoc, printr-un pasaj, se obine
cultura de lucru, care se nlocuiete lunar prin subcultivare din cultura stoc i se pstreaz la 4-8C n agar nclinat
TSB/Geloz Chocolat pentru Haemofili.
Subcultura sau pasajul reprezint transferul microorganismelor pe un mediu proaspt, adecvat creterii. Creterea
unei culturi de referin sau a unei culturi stoc de referin din starea sa de conservare (ngheat sau liofilizat) nu
reprezint o subcultur.
ntreinerea i utilizarea culturilor stoc
Tulpinile de referin se selecteaz astfel nct un numr minim de tulpini s permit testarea unui numr ct mai
mare de caractere morfologice, metabolice i serologice. Acestea pot proveni din diferite produse patologice, dar
nsoite obligatoriu de o fi de identificare corespunztoare, din colecii oficiale, de la furnizori comerciali, din
controale externe de evaluare a calitii sau de la laboratoare de referin.
Conservarea pe termen lung se recomand s fie realizat prin liofilizare sau depozitare la -70 oC sau n azot
lichid. Alternativa la aceste metode este stocarea n glicerol la -20 oC. n scopul conservrii, se obine o cultur pur
pe un mediu solid adecvat, din care se recolteaz o ans plin care se suspend n mediul de conservare, reapartizat
n criotuburi, n volume de 1-2 ml. Se evit decongelrile i congelrile succesive, i se transfer dup 12-18 luni.
Conservarea se poate realiza i la temperatura camerei, dup obinerea culturilor pure pe medii repartizate n pant
(BHI - broth heart infusion cu adaos de snge proaspt sau tratat termic, pentru conservarea microorganismelor
fastidioase), i acoperirea culturii cu ulei de parafin steril sau pe mediu TSA repartizat n tuburi, n coloan
dreapt, nsmnat prin nepare. Se transfer dup 6-12 luni.
Pentru Neisseria i pentru streptococi se folosete mediul CTA (cystine trypticase agar), repartizat drept n tuburi,
nsmnat prin nepare i pstrat la 35 oC pentru Neisseria i la temperatura camerei pentru streptococi. Transferul
se realizeaz la fiecare 2 sptmni pentru Neisseria i la o lun pentru streptococi.
Tulpinile de anaerobi se conserv prin aceeai metod pe mediu cooked-meat agar, pstrat la temperatura camerei,
iar transferul se recomand la 2 luni.
Conservarea pe termen scurt
Culturile de lucru pentru testele de zilnice pot fi preparate astfel:
Microorganismele cu cretere rapid/streptococi
- se inoculeaz pe TSA /geloz snge - repartizat nclinat n tuburi cu dop filetat;
- se incubeaz peste noapte la 35oC;
- se pstreaz la frigider i se transfer la fiecare 2 sptmni.
Meningococi i Haemophilus
- se inoculeaz pe geloz repartizat nclinat sau n plci;
- se incubeaz peste noapte la 35oC;
- se pstreaz la temperatura camerei i se transfer de 2 ori pe sptmn.
Gonococci
- se inoculeaz pe geloz repartizat nclinat sau n plci;
- se incubeaz peste noapte i se pstreaz la 35oC;
- se transfer la fiecare 2 zile;
- tulpina de referin se poate nlocui cu una proaspt izolat.
Trimiterea probelor la laboratoarele de referin
Se recomand trimiterea probelor la laboratoare de referin n urmtoarele situaii:
- probe rar solicitate sau teste extrem de specializate (de exemplu, virologie, serodiagnosticul infeciilor
parazitare);
18

eantioane n duplicat pentru verificarea rezultatelor proprii;

probe care necesit confirmare sau tipizarea unor ageni patogeni de mare importan pentru sntatea public
(de exemplu, Salmonella sp., Shigella sp., V. cholerae, Brucella sp., meningococ i pneumococ);
- laboratoarele de referin ar trebui s fie n msur s furnizeze culturi de referin pentru controlul calitii,
seruri standard i reactivi i s rspund nevoilor de instruire;
- n cazul n care nu exist un program de control extern de calitate, laboratorul de referin
poate fi solicitat s furnizeze culturi i probe de control laboratoarelor.
Controlul extern al calitii (CEC)
Scopurile CEC (numit i test de proficien) sunt:
- s ofere o asigurare att medicilor, ct i publicului larg privind calitatea unui laborator;
- s furnizeze analize de bun calitate;
- s evalueze i s compare performanele laboratoarelor la scar naional;
- s identifice erorile frecvente;
- s ncurajeze utilizarea unor proceduri standardizate i uniformizate, utilizarea reactivilor standard;
- s ia msuri administrative (care pot include revocarea licenei de operare) n cazul laboratoarelor care nu
corespund;
- s stimuleze punerea n aplicare a programelor interne de control al calitii.
Organizarea CEC
Un program de evaluare a calitii const din distribuirea unor eantioane codificate laboratoarelor participante,
care trebuie s trateze i s manipuleze proba ca pe una de rutin.
Supravegherea trebuie s includ:
- o periodicitate de cel puin de 4 ori pe an;
- un minim de 3 probe analizate la fiecare participare;
- perioada de raportare trebuie s fie limitat, de exemplu 2 sptmni de la primirea probelor;
- instruciunile i formularele de raportare trebuie s nsoeasc probele trimise.
Culturile
Culturile bacteriene care trebuie identificate i testate pentru sensibilitate la antibiotice pot fi pure sau mixte i
trebuie s corespund la cel puin 3 din urmtoarele situaii:
- Specii bacteriene de mare importan pentru sntatea public, dar care sunt rareori izolate n practica de
rutin, de exemplu C. diphtheriae, S. paratyphi A (Brucella sp. i S. typhi nu pot fi utilizate ca probe n
schemele CEC, datorit riscului de infecii grave accidentale);
- Biotipuri normale, adesea identificate greit, de exemplu, E. coli H2S-pozitiv, E. coli lactozo-negativ,
Proteus ureaz-negativ;
- Specii nou recunoscute ca patogene sau patogeni oportuniti, de exemplu, Yersinia enterocolitica,
- Vibrio parahaemolyticus, Burkholderia cepacia, Pseudomonas sp.;
- Un amestec de Shigella sp., Citrobacter sp., E. coli, Klebsiella sp. pentru testarea competenei unui
laborator de a izola microorganismele patogene dintr-o prob contaminat cu microorganisme comensale;
- Un amestec de organisme nepatogene pentru testarea competenei unui laborator de a recunoate
eantioanele negative;
- Bacteriile cu profiluri de rezisten deosebite, de exemplu, S. aureus meticilino-rezistent (MRSA).
Seruri
Schemele de CEC trebuie s cuprind teste serologice pentru diagnosticul sifilisului, rubeolei
i brucelozei, infeciilor streptococice i febrei tifoide.
Raportarea rezultatelor
Dup primirea rapoartelor, rezultatele sunt analizate, iar raportul de analiz este trimis laboratoarelor n
termen de o lun cu acordarea unui anumit calificativ. Fiecare laborator va avea alocat un cod, astfel nct i va
putea analiza rezultatele n comparaie cu celelalte laboratoare participante, cu respectarea confidenialitii.
Prelevarea i transportul produselor patologice
n microbiologia clinic, scopul examinrii eantioanelor de esuturi, lichide sau secreii este de a izola i de
a identifica microroganismele patogene i de a determina sensibilitatea lor la antibiotice. Faza preanalitic este
foarte important pentru succesul analizei microbiologice i depinde de foarte muli factori:
corectitudinea recoltrii probei;
stabilirea gradului de urgen a analizei;
precizarea scopului analizei: pentru diagnostic, alegerea tratamentului, control post-terapeutic, controlul
microbiotei comensale etc.;
19

preocuparea pentru cercetarea unui anumit agent patogen;

evaluarea strii fiziologice a bolnavului;
considerarea noiunii de sejur tropical;
cunoaterea tratamentului anterior, mai ales cu antibiotice;
evaluarea riscului unei infecii cu ageni periculoi (rezisteni la antibiotice, nalt epidemiogeni, ca M.
tuberculosis, TBC, Brucela sp., Shigella sp., meningococ, hepatita viral).
Calitatea eantioanelor de produs patologic influeneaz n mod decisiv calitatea analizei efectuate. Probele
trebuie prelevate fr contaminare exterioar, cu minimum posibil de microbiot comensal i, obligatoriu, nainte
de tratamentul cu antibiotice. Situsul de recoltare poate fi i poarta de intrare sau calea de ieire a
microorganismelor (fistul/drenaj). n cazul leziunilor profunde, se recomand recoltarea probei ct mai aproape de
focarul infecios. Dac nu este posibil ntreruperea tratamentului cu antibiotice, se recomand recoltarea probelor
n mediu lichid pentru diluarea antibioticului, astfel nct acesta s ajung la concentraii subinhibitorii.
Eantioanele trebuie:
trimise ct mai repede posibil n laborator (15-30 min. 2 h), utiliznd medii de transport
corespunztoare care s asigure supravieuirea agentului patogen i s mpiedice proliferarea
contaminanilor;
etichetate i introduse n recipiente nchise ermetic, la temperaturi de 2-8 oC, pentru a evita
proliferarea intens a microbiotei comensale;
nsoite de date clinice (situl anatomic de recoltare, natura probei, condiiile de recoltare,
contextul fiziopatologic, clinic, epidemiologic, tratament, noiunea de deficit imunitar);
n cantitate suficient pentru realizarea unei analize complete (n cazul leziunilor cronice,
exist un numr mic de microorganisme care nu pot fi identificate nici pe frotiu i nici n
cultur i care necesit cantiti mari de prob hemocultur, lichide de puncie, biopsii).
Metodele de prelevare depind de tipul de ageni patogeni care pot infecta anumite zone i de tipul de
leziune i suspiciunea diagnosticului etiologic care poate interzice folosirea unor metode invazive, n scopul
diminurii riscului de diseminare a infeciei; de exemplu, recoltarea cu tamponul se face numai pentru probele de pe
tegumente i mucoase, nefiind recomandat pentru alte tipuri de probe din cauza volumului mic de prob recuperat i
a riscului de desicare i de contaminare. Se recomand prelevarea a dou probe, una pentru microscopie i una
pentru cultur. Trebuie precizat de asemenea, dac au fost prevzute probe i pentru alte examene (citologic,
histopatologic, imunologic, biochimic) sau dac repartizarea lor se face n laborator. Trebuie evitat contaminarea
pentru c, prin multiplicare, levurile i bacteriile comensale pot inhiba bacteriile patogene i pot fi considerate n
mod eronat ca patogeni oportuniti. n mod particular, problema contaminrii se pune n cazul hemoculturilor,
prelevatelor din tractul respirator, din sfera ORL, oculare, intestinale, genito-urinare, cutanate, subcutanate. S-au
depistat metode de prelevare din situri profunde care s evite contactul cu mucoasele colonizate de microbiot
endogen.
Conservarea probelor trebuie s evite desicarea (mai ales n cazul bacteriilor fragile H.influenzae, N.
menigitidis, N.gonorrhoeae) i multiplicarea.
Sursele de eroare sunt:
recoltarea probei n timpul tratamentului cu antibiotice, aplicarea antisepticelor locale nainte de
recoltarea probei;
utilizarea unei soluii cu antibiotice pentru recoltarea probei;
transportul sau stocarea necorespunztoare a probelor pn la analiz;
utilizarea unui mijloc de transport necorespunztor;
dificultatea recoltrii (care mpiedic obinerea unei probe reprezentative pentru procesul
infecios);
contaminarea probelor;
dificultatea de a distinge o simpl colonizare de o infecie veritabil cu patogeni oportuniti.
Condiii n care se poate refuza o prob:
prob neetichetat corespunztor;
recipiente deschise, sparte etc.;
probe vizibil contaminate;
probe recoltate de mai mult de 2 ore fr s fie conservate corespunztor;
probe neadecvate pentru analiza prescris.
nsmnarea probei trebuie s se fac imediat, pe medii corespunztoare (mbogite i selective).
Mediile vor fi alese n funcie de scopul urmrit care poate fi:
20

cercetarea, numrarea i identificarea tututor microoganismelor dintr-un sit anatomic, patogene

sau nepatogene; aceast abordare se recomand pentru siturile anatomice sterile n mod normal
(LCR, lichide de puncie, snge, esut).
o n acest caz se utilizeaz mediu mbogit care s permit creterea tuturor
microorganismelor prezente, de exemplu, n cazul supuraiilor profunde, de tipul abceselor
primare sau secundare cu disfuncie hematogen i cu origine ntr-un sit superficial (antrax,
traumatisme, prezena de catetere, arsuri) sau suprainfecii chirurgicale, localizri viscerale
(ficat, plmni, creier i rinichi) sau seroase (peritonite, pericardite, pleurezii, artrite)m
nsoite sau nu de bacteriemie;
abordarea prelevatelor nesterile invadate de microoganisme comensale sau saprobionte
(piele, cavitate bucal, ci aeriene, tub digestiv, mucoasa genito-urinar, mediu ambiant)
presupune utilizarea mediilor de cultur selective, care s favorizeze creterea i multiplicarea
agenilor infecioi, s limiteze multiplicarea microoganismelor comensale prezente n prob.
n unele cazuri, analiza microbiologic are drept scop detectarea portajului cronic sau a persistenei
microoganismelor, n vederea prevenirii sau controlului diseminrii la ali indivizi receptivi, de pild, detectarea
portajului de Str. agalactiae la viitoarele mame pentru prevenirea unei infecii neonatale, detectarea bacteriilor
multirezistente la antibiotice cu risc epidemiologic, de exemplu enterobacterii productoare de -lactamaze de
spectru larg, S. aureus rezistent la meticilin, Str. pneumoniae rezistent la penicilin i macrolide, Enterococcus
faecium/faecalis rezistent la vancomicin i aminoglicozide.
Modificarea microbiotei comensale poate fi de asemenea obiectul analizei microbiologice n anumite
contexte epidemice bine definite.
15.2. Tipuri de produse patologice recoltate n scopul unei analize microbiologice
O prob este reuit dac eantionul analizat se dovedete reprezentativ pentru statutul microbian prevalent
la nivelul zonei anatomice prelevate (tabelul 35).
SNGELE
Analiza bacteriologic a sngelui se numete hemocultur. Este indicat pentru diagnosticul septicemiei,
bacteriemiei i n orice tablou infecios sever (endocardite, meningite, pneumopatii, febr la pacienii neutropenici,
febr prelungit, orice hipertermie peste 38,5oC).
Momentul prelevrii trebuie s fie ct mai timpuriu posibil n cazul unui tablou infecios sever sau n timpul
frisonului. Caracterul intermitent al febrei necesit repetarea hemoculturii.
Situl anatomic este vena plicii cotului, jugulara, fontanela (la nou-nscut) sau lumenul cateterului vascular.
Antisepsia este capital i se face cu un antiseptic cu eficacitate imediat (alcool iodat) sau remanent
(clorhexidin).
Volumul recoltat este 5-10 ml la adult sau de 3-5 ml la nou-nscut i copilul mic, iar raportul cantitativ
mediu:snge este de 3%. Se recolteaz 2 probe de snge, una pentru anaerobi i una pentru aerobi.
URINA
Examenul bacteriologic al urinii se numete urocultur, dar pentru c acesta ar trebui nsoit de examenul
citologic, denumirea complet a analizei este de examen citobacteriologic (ECBU). Urina se preleveaz n cazul
suspiciunii unei infecii a tractului urinar superior sau inferior. Momentul prelevrii este dimineaa, prima urin,
jetul mijlociu, dup toaleta riguroas a tractului genito-urinar, n flacon steril, n volum de 5-10 ml. nsmnarea
trebuie s fie ct mai rapid, conservarea se poate face cteva ore, la +4 oC.
LCR
Recoltarea este indicat n cazul sindroamelor meningeene cu sau fr febr, cefalee, redoarea cefei,
fotofobie, hiperreflexie. Principalii ageni infecioi implicai sunt reprezentai de Str. pneumoniae, N. meningitidis
(la adult), H. influenzae (la copil) i Str. agalactiae, E. coli, L. monocytogenes (la nou-nscut). Prelevarea se face
prin puncie lombar, la nivelul L4 - L5, L5-S1, sau puncie suboccipital la copil i nou-nscut. Asepsia trebuie s fie
ireproabil, o contaminare chiar minim putnd cauza erori. Pentru asepsie se utilizeaz alcool iodat sau antiseptice
remanente (clorhexidin). Volumul de lichid recoltat (2-8 ml) este divizat n 3 fracii care vor fi supuse examenului
citologic, bacteriologic i respectiv biochimic i virologic.
Se recomand de asemenea examinarea cu tu de China pentru diagnosticul Cryptococcus neoformans i
evidenierea antigenelor solubile prin teste rapide, imunologice. nsmnarea se face pe medii mbogite (gelozchocolat cu factori de cretere). Recoltarea se face obligatoriu n spital, iar probele se menin la 30-37 oC pn la
nsmnare.
SECREIILE BRONHO-PULMONARE
21

Analiza secreiilor se recomand n caz de suspiciune clinic, steto-acustic sau radiologic de infecii
bronho-pulmonare, infecii comunitare cu pneumococ, legioneloze, tuberculoze, infecii nosocomiale, screening-ul
portajului de H. influenzae, Str. pneumoniae, Moraxella catarrhalis, S. aureus. Metodele de recoltare pot fi:
neinvazive (expectoraia, caz n care trebuie evitat contaminarea orofaringian), dup toaleta buco-dentar i
cltire cu ap distilat steril, dup tuse spontan sau indus prin kineziterapie (inhalare de aerosol de NaCl 3%), iar
pentru TBC, se recolteaz 3 probe, timp de 3 zile consecutiv; invazive, dirijate sub fibroscopie (aspirat bronic,
spltur bronic, spltur bronho-alveolar), puncie transtraheal, puncie pulmonar transparietal. ncrctura
microbian a expectoraiei este semnificativ dac depete valoarea de 107 UFC/ml. n cazul utilizrii unei
metode invazive, analiza este semnificativ dac ncrctura microbian este mai mare de 10 3 UFC/ml.
MATERIILE FECALE
Examenul bacteriologic al materiilor fecale se numete coprocultur i este indicat pentru diagnosticul
etiologic al diareei acute infecioase, gastroenteritelor izolate sau colective, portajului intestinal de Salmonela sau de
bacterii multirezistente. Momentul prelevrii: n timpul tulburrilor digestive, dac exist, fr o pregtire special
(nu se indic utilizarea de supozitoare sau clisma). Spre deosebire de examenul coproparazitologic, coprocultura nu
se repet (excepie n diagnosticul portajului de bacterii multirezistente, controlul eficienei tratamentului). Cnd
emisia spontan nu este posibil, se recomand recoltarea cu ajutorul tamponului rectal. Asepsia nu este necesar,
deoarece materiile fecale conin 10 9-1011 bacterii comensale/ml sau /g. nsmnarea se face imediat, multiplicarea
bacteriilor comensale deteminnd apariia fenomenelor de competiie i acidifierea mediului; cnd acest lucru nu
este posibil, materiile fecale sunt conservate n tampon fosfat, glicerol sau pstrare la +4 oC. n cazul scaunelor
dizenterice se recomand recoltarea materialului mucosangvinolent.
SECREII PURULENTE I SEROZITI
Analiza bacteriologic este indicat pentru a confirma i documenta o infecie nainte de instituirea unui
tratament sau n cazul ineficienei unui tratament administrat empiric. Metodele de prelevare sunt: superficiale
cnd situsul infeciei este direct accesibil i se realizeaz cu ajutorul unui tampon care se descarc imediat pe mediu
i profunde care necesit o puncie folosind o pipet sau sering. Antisepsia trebuie s fie riguroas n cazul
abceselor nchise; pentru abcesele cu fistul sau plag superficial infectat (arsuri, escare) se folosete o soluie
nebactericid. Transportul se face evitnd desicarea i n condiii de anaerobioz. nsmnarea se face imediat, n
30 minute de la recoltare, iar ca mediu de transport se poate utiliza mediul tip Stuart.
PRELEVATELE DIN SFERA ORL
Recoltarea este indicat pentru diagnosticul etiologic al anginelor (cu streptococi -hemolitici grup A,
asocierea fuso-spirochetian caracteristic anginei Vincent, C. diphtheriae, S. pneumoniae, H. influenzae), otite,
portaj de bacterii multirezistente. Recoltarea se face cu tamponul din: gt (exsudat faringian) (tamponarea
amigdalelor, palatului, lojelor amigdaliene, fr a atinge limba), nas (exsudat nazal pentru diagnostic de B.
pertussis), sinusuri (din meatul mijlociu al sinusurilor anterioare sau puncionarea sinusurilor maxilare), urechea
medie (puncie, tampon), urechea extern (tampon sub speculum). Recoltarea se face de obicei n laborator, cu dou
tampoane (unul utilizat pentru realizarea unui frotiu, iar cellalt pentru nsmnarea imediat pe mediu de cultur).
SECREII OCULARE
n mod normal mucoasa conjunctival este steril, dar examenul bacteriologic se realizeaz n mod
sistematic preoperator sau pentru diagnosticul etiologic al unei conjunctivite. Este interzis orice toalet local
nainte de prelevare, care se efectueaz dimineaa, din unghiul intern al ochiului, cu ajutorul tamponului cu care se
colecteaz secreiile acumulate n cursul nopii.
PRELEVATE DIN SFERA GENITAL
Se recomand n cazul unor infecii ale organelor genitale nsoite sau nu de secreii purulente, sau n cazul
prezenei unor ulceraii genitale.
La brbai se recolteaz pictura matinal (diagnostic de N. gonorrhoeae) sau se realizeaz un grataj al
mucoasei uretrale cu ajutorul unei chiurete sau tampon rigid spiralat care s permit recoltarea celulelor epiteliale
pentru diagnostic de Mycoplasma sau Chlamydia;
La femei, secreiile vaginale se recolteaz cu ajutorul unei pipete sterile nainte de orice toalet local,
tratament local, dup abstinen sexual de 3 zile, iar n cazul ulceraiilor genitale acestea se cur cu ser fiziologic
steril, se preseaz uor marginile ulceraiei pentru a provoca exsudarea i apoi se realizeaz recoltarea lichidului cu
ajutorul tamponului. nsmnarea trebuie s fie imediat, iar pentru diagnosticul infeciilor cu bacterii intracelulare
probele pot fi conservare la +4oC, n mediu adecvat de transport.
PRELEVATE TEGUMENTARE
Recoltarea este indicat pentru supravegherea colonizrii bacteriene la ari, biopsia cutanat permind i
analiza n profunzime a microbiotei sau pentru determinarea portajului de bacterii multirezistente. Prelevarea se
22

face cu ajutorul tamponului de la nivelul pliurilor axilare i inghinale, perineului, periombilical, periungular,
interdigital, palmar.
Avnd n vedere c numeroase prelevate sunt inutile sau neexplorabile, nainte de realizarea recoltrii unui
produs patologic n scopul unei analize microbiologice, trebuie s ne asigurm c analiza este necesar, c ajut la
mbuntirea tratamentului, trebuie s tim ce microoganisme cutm (bacterii, fungi, microorganisme greu
cultivabile), ce material i ce tehnic se aplic i dac este necesar i o analiz cantitativ.
Tabelul 35. Infecii bacteriene localizate: ageni etiologici, produse patologice i diagnostic (Brooks i colab., 2007)
Infecie

Produs patologic

Agent etiologic

Microscopie

Medii de cultur

Celulit

Biopsie de la marginea Streptococi, de grup A

leziunii eritematoase S. aureus.

Coci Grampozitivi.

Geloz snge.

Impetigo

Tampon

Streptococi, de grup A
S. aureus, C. diphtheriae.

Ulcere cutanate

Biopsie
Aspirat tisular

Microbiot mixt.

Microbiot mixt.

Geloz sange,
MacConkey, EMB; medii
pentru anaerobi.

Meningit

CSF

N. meningitidis

Diplococi Gramnegativi,
intracelulari.

Geloz chocolat, Geloz

snge.

Haemophilus influenzae

Cocobacili Gramnegativi, de
dimensiuni mici.

Geloz chocolat

Streptococcus pneumoniae

Diplococi Grampozitivi

Geloz snge

Streptococi de group B

Coci Gram-pozitivi Geloz snge

n lanuri.

Escherichia coli; alte

Enterobacteriaceae.

Bacili Gramnegativi.

Geloz snge

L. monocytogenes

Bacili Grampozitivi.

Geloz snge, hemoliz.

Abces cerebral

Puroi recoltat i
transportat n condiii
de anaerobioz

Infecie mixt; anaerobi i

coci aerobi Gram-pozitivi
sau coci/bacilli gramnegativi sau coci aerobi
Gram-pozitivi.

Coci Gram-pozitivi Geloz snge, geloz

sau microbiot
chocolat; medii pentru
mixt.
anaerobi.

Abces perioral

Puroi

Microbiot oro-faringian,
rar actinomicoz.

Microbiot mixt

Geloz sange, geloz

chocolat; medii pentru
anaerobi MacConkey sau
EMB.

Faringit

Tampon

Streptococi de grup A

Nu se recomand

Geloz snge sau mediu

selectiv

C. diphtheriae

Nu se recomand

Mediu Loeffler sau Pai',

apoi cistein telurit sau
mediu Tinsdale.

B. pertussis

Nu se recomand

Agar Regan-Lowe.

Tuse convulsiv
(pertusis)

Tampon

23

Infecie

Produs patologic

Agent etiologic

Microscopie

Medii de cultur

Epiglotit

Tampon

H. influenzae

Nu se recomand

Geloz chocolat sau

snge.

Pneumonie

Sput

Str. Pneumoniae

Frecvente PMN,
Geloz chocolat sau
coci Gram-pozitivi snge, MacConkey sau
n perechi sau
EMB.
lanuri, umflarea
capsulei.

S aureus rar

Coci Gram-pozitivi Geloz chocolat sau

n perechi, tetrade, snge, MacConkey sau
ciorchine.
EMB.

Enterobacteriaceae i ali
bacili Gram-negativi.

Bacili Gramnegativi.

Geloz snge,
MacConkey sau EMB.

Etiologie mixt aeroanaerob.

Microbiot
respiratorie mixt,
rareori PMN.

Geloz snge,
MacConkey, sau EMB;
mediu pentru anaerobi.
Geloz snge,
MacConkey, sau EMB;
mediu pentru anaerobi.

Emfizem pulmonar

Puroi

Aceeai ca n pneumonie sau Microbiot

microbiot mixt.
respiratorie mixt.

Abces hepatic

Puroi

E. coli; Bacteroides fragilis; Bacili GramGeloz snge,

microbiot mixt aerob sau negativi Microbiot MacConkey, sau EMB;
anaerob,
mixt.
mediu pentru anaerobi.
Entamoeba histolytica.

Colecistit

Bil

Bacili enterici aerobi Gram- Bacili Gramnegativi, B fragilis.

negativi.

Geloz snge,
MacConkey, sau EMB;
mediu pentru anaerobi.

Abces abdominal sau

perirectal

Puroi

Microbiot intestinal

Microbiot mixt,
uneori > 5 specii.

Geloz snge,
MacConkey, sau EMB;
mediu pentru anaerobi.

Febr enteric, tifoid

Snge, fecale, urin,

Salmonella typhi

Nu se recomand.

MacConkey, Hektoen,
agar cu sulfit de bismut;

Enterite, enterocolite,
diaree bacterian,
gastroenterite.

Fecale

Salmonella sp., altele dect

S. typhi.

PMN

MacConkey, Hektoen,
agar cu sulfit de bismut.

Shigella sp.

Coloraia Gram sau MacConkey, Hektoen,

cu albastru de
agar cu sulfit de bismut.
metilen poate
evidenia PMN.

Campylobacter jejuni

Bacili Gramnegativi n form

de aripi de
pasre", PMN.

Campy BAP incubat la

42C.

Vibrio cholerae

Nu se recomand.

Tiosulfat citrat bil

sucroz (TCBS) (colonii
galbene);
Ap peptonat cu
taurocolat.

Ali vibrioni

Nu se recomand.

Similar ca pentru V
cholerae

Yersinia enterocolitica

Nu se recomand.

MacConkey/CIN
(cefsulodin-Irgasannovobiocin) incubate la

25C, opional mbogire

la 4C.

24

Infecie

Produs patologic

Agent etiologic

Microscopie

Medii de cultur

Colit hemoragic sau

SHU

Fecale

E coli O157:H7

Nu se recomand.

MacConkey cu sorbitol
(colonii sorbitol
negative).

Infecii de tract urinar

Urin

E coli; Enterobacteriaceae;
ali bacili Gram-negativi.

Bacili Gramnegativi pe frotiu

din urin
necentrifugat 105
UFC/mL.

Blood agar; MacConkey

sau EMB.

Uretrit/cervicit

Tampon

Neisseria gonorrhoeae

Diplococi GramThayer-Martin modificat.

negativi asociai cu
PMN.

Chl. Trachomatis

PMN.

Celule McCoy tratate cu

cicloheximid.

Haemophilus ducreyi
(chancroid)

Microbiot mixt.

Geloz chocolat cu
IsoVitaleX i
vancomicin.

Ulcere genitale

Tampon

Treponema pallidum (sifilis) Microscop cu fon

negru sau de
fluorescen.

Boala inflamatorie
pelvic

Aspirat ganglionar

Chl. Trachomatis

PMN.

Tampon cervical

N gonorrhoeae

PMN associate cu Thayer-Martin modificat;

diplococi GramPCR
negativi diplococci;
microbiot mixt.

Chl. trachomatis

PCR

N. gonorrhoeae

diplococi GramMediu Thayer-Martin

negativi asociai cu modificat
PMN.

Chl. Trachomatis

PMN

Celule McCoy tratate cu

ciloheximid.

Microbiot mixt

Microbiot mixt.

Geloz snge,
MacConkey, sau EMB;
mediu pentru anaerobi.

S. aureus

Coci Gram-pozitivi Geloz snge, geloz

n perechi, tetrade, chocolat.
grmezi.

N. gonorrhoeae

Diplococi GramMediu Thayer-Martin

negativi asociai cu modificat.
PMN.

Alte specii

Tipuri morfologice Geloz snge, geloz

varibile, n funcie chocolat mediu pentru
de etiologie.
anaerobi.

Aspirat de col uterin

Artrit

Osteomielit

Aspirat articular,
snge,

Puroi sau os

Celule McCoy tratate cu

cicloheximid.

Celule McCoy tratate cu

ciloheximid

Multipl; frecvent S. aureus Tipuri morfologice Geloz snge,

varibile, n funcie MacConkey, sau EMB;
de etiologie.
mediu pentru anaerobi.

25

15.3. ANALIZA BACTERIOLOGIC A PROBELOR DIN TRACTUL RESPIRATOR

Infeciile tractului respirator sunt clasificate n infecii ale etajelor superioare (rinite, faringite sau angine,
sinuzite, otite, laringite) i inferioare (traheite, bronite, pneumonii, bronho-pneumonii, pleurezii).
Dintre ITRS cele mai frecvente sunt faringitele. n acest caz pentru diagnostic este necesar recoltarea exsudatului
faringian (etimologia pledeaz pentru forma exsudat: lb. latin, exsudatio -onis, ex = n afar, sdre = a transpira.
Forma folosit, exudat, este un exemplu de neologism deformat, impropriu folosit).
Recoltarea exsudatului faringian se recomand n cazul anginei acute, recidivante, ulcero-necrotice, candidozei orofaringiene i al unor boli cu transmitere sexual.
Acest produs nu prezint interes n cazul flegmoanelor amigdaliene cu colecii nchise, epiglotitei, produs
n principal de H. influenzae (diagnosticat prin hemocultur), n care recoltarea din gt poate fi periculoas,
sindromului anginos din infarctul pulmonar Lemierre, generat de Fusobacterium necrophorum (diagnosticat din
hemocultur sau puncie pleural), ulceraiilor oro-faringiene (prelevarea din leziune nu este recomandat datorit
prezenei treponemelor comensale, dificil de delimitat de T. pallidum la microscopul cu fond negru i cu
sensibilitate sczut pentru detectarea prin metoda IF).
70% din cazurile de faringite acute sunt de natur viral, iar Str. pyogenes (streptococul -hemolitic de grup A) este
principalul agent etiologic al anginei bacteriene acute, alturi de streptococii de grup B, C i G. Cultivarea rmne
metoda de referin pentru evidenierea acestei bacterii, cu o sensibilitate de 90-95% fa de 80-90% n cazul
truselor de identificare rapid.
Tabelul 36. Agenii patogeni, izolai din exsudatul farinagian, semnificativi n diferite contexte clinice (adaptat dup REMIC
2008, WHO, 2003, Buiuc i Negu, 2009).
Contextul clinic
Ageni patogeni
Angina acut
Str. pyogenes (grup A)
Streptococci -hemolitici de grup B, C i G.
Angina eritemoatoas (nsoti de o iritaie cutanat)
Str. pyogenes i Arcanobacterium
haemolyticum (mai ales la adultul tnr).
Angina recidivant
Suplimentar H. influenzae, S. aureus, Moraxella
(Branhamella) catarrhalis.
Angina ulcero-necrotic
Asociaia fusospirilar caracteristic anginei Vincent.
Angina difteric (cu membrane false)
C. diphtheriae (Begg, 1994).
Candidoza orofaringian
C. albicans.
Bilanul iniial al unei boli cu transmitere sexual
N. gonorrhoeae.
Faringita gonoreic
Pneumonie interstiial
Chl. pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae (mai ales la
copii).
Flegmonul amigdalian
S. pyogenes, H. influenzae, S. aureus, anaerobi
Amigdalit cu microabcese
(Fusobacterium spp., B. fragilis,
Peptostreptococcus spp.).

Patogenii semnificativi (tabelul 36) trebuie difereniai de speciile ce alctuiesc microbiota comensal de la
nivelul tractului respirator superior, care nu trebuie identificate sau raportate, reprezentate de: streptococi viridans
(-hemolitici), tulpini de Neisseria spp. nepatogene, Moraxella (anterior Branhamella) catarrhalis (considerat
patogen n anumite cazuri), stafilococi (S. aureus, S. epidermidis), difteromorfi, Haemophilus spp., levuri
(Candida spp.) n cantitate redus, diferite tulpini strict anaerobe, spirochete i forme filamentoase,
Enterobacteriaceae (E. coli, Klebsiella spp., etc.) i bacili Gram-negativi nonfermentativi (Acinetobacter spp.,
Pseudomonas spp.) la pacienii vrstnici, malnutrii i imunodeprimai, la care pot fi de asemenea identificate n
cantitate mare S. aureus, Candida spp. sau alte specii de fungi (REMIC; 2008, Buiuc i Negu, 2009). n acest ultim
caz, chiar dac aceste specii nu produc faringit, dect pe fondul unei granulocitopenii, totui trebuie raportate
clinicianului, datorit posibilitii apariiei unei ITRI.
Recoltarea exsudatului nazal este recomandat pentru diagnosticul rinitelor sau sinuzitelor.
Rinitele sunt n majoritate virale sau nemicrobiene (alergice, mecanice, medicamentoase etc.). Rinita microbian
const n inflamaia mucoaselor nazale cu edeme i secreii, produs de bacterii (stafilococi, streptococi,
Enterobacteriacee, bacilul piocianic) i levuri din genul Candida. Examenul direct poate orienta asupra tipului de
rinit. Sinuzita este inflamaia mucoasei sinusale, cel mai adesea de natur bacterian (Str. pneumoniae, Str.
pyogenes, H. influenzae, mai rar neisserii, Moraxella catarrhalis, S. aureus i bacili Gram-negativi). n sinuzitele
26

cronice apar infecii mixte aero-anaerobe. Recoltarea se realizeaz de ctre medicul specialist prin puncionarea
sinusurilor.
Recoltarea exsudatului nazal sau faringian poate servi, de asemenea, pentru detectarea purttorilor de S.
aureus metocilino-rezistent (MRSA), N. meningitidis, Str. pyogenes i C. diphtheriae.
n cazul investigrii portajului de MRSA se efectueaz testarea sensibilitii doar pentru penicilin
(identificarea tulpinilor productoare de penicilinaz) i cefoxitin sau oxacilin (identificarea tulpinilor meticilinorezistente).

Fig. 323. De la stnga la dreapta: tulpin de S. aureus sensibil la Penicilin (P) i Meticilin (determinat cu ajutorul discului de cefoxitin
-FOX), R la P, MRSA i R la P, MRSA.

Prelevarea i transportul probelor:

Se realizeaz nainte de orice tratament local sau general cu antibiotice.
Prelevarea se realizeaz cu apstorul de limb, cu ajutorul tamponului, de pe amigdale (sau amigdal n
cazul amigdalitei unilaterale), de pe vlul palatin i partea posterioar a faringelui (fig. 324, 325).
- n cazul existenei unei ulceraii sau a unui exsudat prelevarea se face direct de la nivelul leziunilor;
- n cazul anginei difterice sunt prelevate i membranele false;
- Pentru Candida recoltarea se face de pe mucoasa lingual, a palatului i a feei interne a obrajilor.
n cazul n care se recomand realizarea unui frotiu (leziuni ulcerative) se folosesc dou tampoane: unul
pentru etalarea pe lam, iar al doilea pentru nsmnare.
Dac nsmnarea nu se realizeaz n maxim 2 ore, se folosete un mediu de transport tip Stuart sau Amies.
Recoltarea exsudatului bazal se face cu cte un tampon nmuiat n ser fiziologic pentru fiecare fos nazal.

Fig. 324. Recoltarea exsudatului nazal

Examenul
scop:
-

Fig . 325. Recoltarea exsudatului faringian .

microscopic al frotiului colorat Gram, realizat NUMAI LA CEREREA CLINICIANULUI are drept
Semnalizarea prezenei sau absenei leucocitelor, indicatori ai inflamaiei;
Evidenierea asociaiei fuso-spirochetale caracteristic anginei Vincent (fig. 326);
Eventualul sumar al microbiotei (calitativ i cantitativ);
Evidenierea levurilor.

27

Fig. 326. Imagine microscopic a unui frotiu realizat din ulceraie faringian n angina Vincent. Sgeile indic prezena
spirochetelor.

nsmnarea tamponului se realizeaz pe:

- geloz snge sau geloz snge cu inhibitori, incubat n atmosfer de 10% CO 2 sau anaerobioz, pentru
o mai bun evideniere a -hemolizei produs de streptococi. Pentru Arcanobacterium haemolyticum
(bacil Gram-pozitiv corineform) incubarea trebuie prelungit cu 24-48 ore;
- geloz cu snge tratat termic sau geloz chocolat mbogit cu factori de cretere pentru H. influenzae
(M. catarrhalis se dezvolt mai bine pe acest mediu dect pe cele uzuale), incubat n atmosfer de
10% CO2 cu sau fr bacitracin;
- geloz chocolat mbogit cu factori de cretere i inhibitori (tip VCAT) pentru N. gonorrhoeae;
- mediu Loeffler sau Tinsdale modificat pentru C. diphtheriae;
- mediu Sabouraud cu cloramfenicol sau gentamicin incubat la 30 0C pentru C. albicans.
Pentru o bun evideniere a -hemolizei, mediul de baz nu trebuie s conin glucoz, sau concentraia
trebuie s fie redus, deoarece acidifierea mediului rezultat n urma fermentrii glucozei blocheaz producerea
hemolizinelor (WHO; 2003).
Grosimea stratului de mediu trebuie s fie de 4-5 mm, iar sngele poate proveni de la diferite specii,
inclusiv de la donori umani, ns sngele de berbec este de preferat, deoarece poate evidenia activitatea hemolitic
a tulpinilor comensale de Haemophilus, dar nu i hemoliza produs de varianta zymogenes a speciei Enterococcus
faecalis (WHO; 2003). Recunoaterea coloniilor -hemolitice poate fi mbuntit prin neparea mediului n
profunzime cu ansa n timpul nsmnrii sau prin adugarea unui disc de cotrimoxazol la care S. pyogenes este
rezistent i a unui disc de bacitracin de concentraie joas diect pe striul de nsmnare a tamponului. Coloniile de
Str. pyogenes sunt mici (0.52 mm), nconjurate de o zon clar de -hemoliz i apar dup 18-24 de ore (fig. 327).
Identificarea de certitudine se realizeaz prin testarea sensibilitii la bacitracin de 0.020.05 IU (apariia
oricrei zone de inhibiie a creterii n jurul discului). Pentru identificare nu se folosesc discuri de 10U.
Confirmarea serologic se realizeaz prin aglutinare. Raportarea este semicantitativ (colonii rare, +, + +,
sau + + +). La purttori, numrul de colonii este sub 20, n timp ce la pacienii cu faringit sunt foarte frecvente.
Coloniile mici care aglutineaz cu serul anti-A nu sunt considerate ca aparinnd speciei Str. pyogenes i nu sunt
asociate cu infecii grave.

28

Fig. 327. Cultur de Streptococcus pyogenes pe geloz snge.

Fig. 328. Cultur de H. influenzae pe geloz chocolat i satelitism pe geloz snge, n proximitatea culturii de S. aureus.

Pentru streptococii -hemolitici nu se recomand antibiograma. Tratamentul de elecie n cazul infeciei cu

Str. pyogenes, indiferent de cantitatea n care se regsete, este benzilpenicilina sau eritromicina. n cazul H.
influenzae i M. catarrhalis se recomand detecia rapid a -lactamazelor.

29

15.4. ANALIZA BACTERIOLOGIC A PROBELOR DIN TRACTUL RESPIRATOR INFERIOR

Infeciile tractului respirator inferior (ITRI) sunt localizate la nivelul traheei, bronhiilor, sau n esutul
pulmonar (traheit, bronit, abces pulmonar, pneumonie). Uneori, n pneumonie, sunt afectate i membranele
adiacente rezultnd pleurezia, nsoit uneori de acumulare de lichid n cavitatea pleural (efuziune pleural). O
form special a ITRI este tuberculoza pulmonar. Muli pacieni cu ITRI prezint tuse nsoit de secreii
purulente, sputa fiind n general verde sau glbuie. Alterori, secreiilor sunt n cantitate mic sau este absent, ca n
cazul legionelozei (Legionella pneumophila), pneumoniei produse de Mycoplasma pneumoniae ("pneumonie atipic
primar") i Chl. pneumoniae. Aceste etiologii necesit pentru confirmare tehnici speciale (serologie i izolare pe
medii speciale).
La pacienii cu bronit acut (consecutiv, de regul, unei infecii virale acute), nu se recomand analiza
microbiologic a sputei dect n cazurile n care nu se observ semne clinice de ameliorare.
n cazurile de bronit cronic de lung durat, din sputa care este de obicei gri, cu aspect mucoid se
izoleaz patogenii respiratori clasici (H. influenzae, Str. pneumoniae, sau mai rar, Moraxella (Branhamella)
catarrhalis).
n abcesele pulmonare, rezultate dup inhalarea corpilor strini, a coninutului gastric sau a secreiilor
tractului respirator superior (pneumonie de aspiraie), se poate analiza sputa sau puroiul de abces. n acest caz, pot fi
izolate bacterii anaerobe: Prevotella melaninogenica (fost Bacteroides melaninogenicus) i Peptostreptococcus
spp.
Pneumonia acut lobar afecteaz de obicei un singur lob pulmonar i este aproape ntotdeauna cauzat de
Str. pneumoniae, i mai rar, de Klebsiella pneumoniae.
Bronhopneumonia (asociat cu apariia zonelor de infiltraie i de inflamaie n unul sau n ambii plmni)
este produs de virusuri sau bacterii. Etiologia bacterian este reprezentat de Str. pneumoniae, H. influenzae, S.
aureus, E. coli, K. pneumoniae i Ps. aeruginosa. n caz de pleurezie, lichidul pleural trebuie examinat microscopic
i cultivat.
Sputa pacienilor cu tuberculoz pulmonar nu este de obicei foarte purulent, dar trebuie etalat pe frotiu
pentru coloraia Ziehl-Neelsen. Dac frotiul este pozitiv pentru BAAR, sputa este decontaminat i cultivat pe
mediu Lowenstein-Jensen.
Procedurile bacteriologice pentru diagnosticul infeciilor piogenice respiratorii, cum ar fi bronita i
pneumonia, sunt fundamental diferite de cele pentru tuberculoz, motiv pentru care vor fi tratate separat.
Recoltarea sputei
Se realizeaz dup o tuse forat, ntr-un recipient steril cu gur larg, dup cltirea gurii cu ap distilat,
petru a evita contaminarea cu bacterii din microbiota orofaringelui. O prob de "sput" constnd din saliv i resturi
alimentare nu trebuie examinat. Recipientul nchis etan se trimite imediat la laborator i se examineaz fr
ntrziere pentru a evita multiplicarea bacteriilor comensale prezente n prob.
Evaluarea macroscopic
Aspectul macroscopic al sputei trebuie nregistrat, iar posibilele descrieri includ:
Aspecte revelatoare pentru infecie pulmonar: purulent/verde, purulent/galben, mucopurulent / cu
urme de snge / cu flocoane verzi;
Spute cu aspecte necorespunztoare pentru examenul bacteriologic, care nu trebuie examinate n
infeciile non-tuberculoase: gri, mucoid/ gri, lipsit de coninut / alb, mucoid/ alb, lipsit de coninut
/alb, mucoid, cu resturi alimentare /apos (saliv) / apos, cu resturi alimentare.
Examinarea microscopic
Din sputele corespunztoare macroscopic se realizeaz frotiuri colorate Gram, din zonele semnificative (ex.
poriuni purulente).
Dac pe frotiul colorat Gram se observ celule scuamoase, celule epiteliale, frecvent acoperite cu bacterii
aderente, acest aspect este caracteristic pentru secreiile orofaringiene i proba nu trebuie cultivat. Pentru cultivare,
se respinge orice produs care conine mai puin de 10 neutrofile polimorfonucleare pentru o celul epitelial.
n schimb frotiul realizat din spute purulente poate orienta rapid diagnosticul ITRI, evideniind:
diplococi Gram-pozitivi capsulai (S. pneumoniae);
coccobacili mici Gram-negativi (H. influenzae);
diplococi Gram-negativi, intracelulari i extracelulari (Moraxella catarrhalis);
coci Gram-pozitivi n ciorchine (S. aureus);
bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae sau Pseudomonas spp.);
levuri Gram-pozitive i/sau micelii (Candida spp.).
30

Cultivarea sputei
Pentru cultivare se selecteaz poriunile semnificative care se nsmneaz pe:
geloz snge, cu un striu de S. aureus pentru a facilita creterea coloniilor satelite de H. influenzae i cu un
disc de optochin plasat n mijlocul striului de nsmnare pentru evidenierea Str. pneumoniae;
geloz chocolat;
agar MacConkey;
agar manitol (n cazul suspiciunii de S. aureus);
agar Sabouraud (n cazul suspiciunii de Candida sp.).
Geloza snge i chocolat se incubeaz la 36 oC n atmosfer de CO2 (exsicator), iar placa de MacConkey n
aerobioz.
Plcile se examineaz iniial la 18 ore, apoi se reincubeaz pentru alte 24 de ore, dac se constat cretere
microbian insufucient.
Pe mediile de cultur pot fi observate:
colonii plate, transparente, cu centrul concav i zone de -hemoliz, precum i o zon de inhibiie a creterii n
jurul discului optochin (S. pneumoniae);
colonii fine, transparente, convexe, cu cretere satelit n vecintatea striului de S. aureus, nehemolitice i
colonii mult mai mari pe geloz chocolat (H. influenzae, confirmat prin evidenierea dependenei de factorii X
i V);
colonii uscate, friabile, alb-gri, intens oxidaz pozitive (M. catarrhalis);
colonii mijlocii, cu pigment auriu (S. aureus, se recomand efectuarea testului coagulazei, i fermentaiei
manitolului);
creterea pe MacConkey indic prezena unor tulpini de Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. sau
Acinetobacter spp;
colonii albicioase, rotunde, mate (C. albicans).
Raportarea creterii este semicantitativ:
(+) = cteva colonii;
+ = cretere uoar;
+ + = cretere moderat;
+ + + = cretere abundent.
Dac numrul de colonii este redus, acestea provin din microbiota normal comensal a tractului respirator
sau sunt rezultatul colonizrii, nefiind relevante pentru managementul pacientului, motiv pentru care trebuie s fie
raportate ca microbiot colonizatoare sau deloc.
15.5. EXAMENUL CITOBACTERIOLOGIC AL URINII (ECU)
Urina este produsul biologic analizat cu cea mai mare frecven n laboratorul de microbiologie. Cele mai
frecvente infecii ale tractului urinar (ITU) sunt cele ale vezicii urinare (cistite) i ale uretrei. Din aceste situsuri,
infecia poate evolua ascendent la nivelul ureterelor (ureterit) i ulterior, la nivelul rinichilor (pielonefrite). Femeile
sunt mai predispuse la ITU dect brbaii. La ambele sexe infecia poate fi asimptomatic, acut sau cronic. ITU
acut este mai frecvent la femeile de diferite vrste i tratat n ambulatoriu. ITU cronic este prezent att la
brbai, ct i la femei de diferite vrste, fiind asociat de obicei cu o afeciune primar (pielonefrita, prostatita,
anomalii congenitale ale tractului genito-urinar) i necesit internare (WHO, 2003). Indiferent de tipul ITU, sunt
implicate bacteriile enterice, n special E. coli alturi de Proteus mirabilis i mai rar P. vulgaris, Serratia
marcescens, K. pneumoniae, Enterobacter aerogenes, enterococi, Ps. aeruginosa, stafilococi coagulazo-negativi, S.
aureus, S. saprophyticus (la femeile tinere), iar la pacienii imunodeprimai, Corynebacterium urealyticum (vechiul
grup D2), Candida spp. (C. albicans i C. glabrata), Oligella urethralis, Aerococcus urinae i Lactobacillus spp.
(REMIC, 2008).
Prezena a dou sau mai multe tipuri de microorganisme diferite ntr-o urocultur semnific recoltarea /
manipularea necorespunztoare a probei i necesit repetarea recoltrii, cu excepia pacienilor cateterizai unde pot
fi adesea obinute culturi polimicrobiene din urin.
Pentru realizarea corect a diagnosticului citobacteriologic al urinii este necesar respectarea urmtoarelor condiii:
- recoltarea aseptic a urinii i transportul corect la laborator;
- cunoaterea principalelor specii microbiene care produc ITU;
- cunoaterea etapelor ECU;
- interpretarea rezultatelor;
- efectuarea unei antibiograme corecte.
31

Recoltarea se realizeaz diferit, n funcie de circumstanele anatomo-clinice: caz general, pacient sondat, sugar,
analiza pentru micobacterii, ureterostomie neo-vezical (Bricker):
- n general, se recolteaz prima urin de diminea, dup igienizarea minilor i toaleta local cu spun sau
antiseptic. Se elimin primul jet (20 ml) de urin apoi se recolteaz proba ntr-un flacon steril, fr a se atinge
partea superioar a recipientului. Flaconul este nchis ermetic, etichetat i dus imediat la laborator nsoit de fia
i ora recoltrii. Dac acest lucru nu este posibil, proba se poate menine cteva ore la +4 0C;
- pacient cateterizat: puncionarea pungii de colectare a urinii dezinfectat n prealabil, cu o sering sau cu un
sistem de aspiraie cu vid i transferul urinii recoltate ntr-un flacon steril;
- sugar: este folosit un colector steril specific, de unic utilizare care poate fi instalat pentru maximum o or.
Dac n acest interval copilul nu a urinat, dispozitivul este nlocuit cu unul nou. Urina poate fi recoltat i din
zbor, ntr-un flacon steril, n cursul miciunii spontane;
- identificarea micobacteriilor: acest examen trebuie efectuat din toat cantitatea de urin colectat la prima
miciune de diminea, dup restricie hidric, timp de trei zile.
Circumstane particulare:
- urina din primul jet (dup un eventual masaj prostatic) este analizat n cazul suspiciunii de infecie
uretral sau prostatic cu Mycoplasma sau Chl. trachomatis;
- prelevarea urinii direct din vezic prin puncie suprapubian;
- prelevarea din cateter ureteral permite obinerea probelor separate de urin din cei doi rinichi.
Examenul citologic al urinii este realizat prin metode cantitative, pe sedimentul urinar obinut prin centrifugarea
probei de urin timp de 5 min. la 1800 rpm, cu ajutorul unei camere de numrare a celulelor (n condiii fiziologice
urina conine sub 10 000 leucocite i 5 000 hematii per ml; n cazul infeciei urinare procesul inflamator se traduce
cel mai adesea prin prezena a peste 50 000 leucocite/ml mai mult de 10000 hematii/ml i prezena celulelor
uroteliale) sau calitative (prin examinarea frotiurilor realizate direct dintr-o pictur de urin necentrifugat,
omogenizat, depus pe o lam de sticl i lsat s se usuce).
Examenul calitativ:
- permite observarea eventualelor microorganisme prezente i alegerea mediilor de cultur n funcie de
morfologia i afinitatea lor tinctorial;
- prezena uneia sau mai multor bacterii n cmpul microscopic examinat cu imersie nseamn >10 5 CFU/urin;
- prezena uneia sau mai multor leucocite poate indica o infecie urinar;
- prezena mai multor celule squamoase cu sau fr asocieri de microorganisme semnific contaminare vaginal,
iar dac rezultatul nu este urgent, se recomand repetarea probei.
Alternativ, prezena leucocitelor n urin poate fi apreciat prin evideniarea rapid a activitii esterazei leucocitare.
nsmnarea probei pentru realizarea examenului bacteriologic (urocultura) necesit o metod care s
permit determinarea numrului de microorganisme i evaluarea cantitativ a bacteriuriei (diluarea urinii,
nsmnarea cu ansa calibrat, metoda lamei sau hrtiei de filtru imersate n urin i amprentate apoi pe mediu cu
lactoz timp de 2-3 secunde) (329-332).

Fig. 329. nsmnarea probei de urin cu ansa calibrat (se utilizeaz ansa de 1 l, cu care se traseaz mai nti un striu longitudinal, apoi
striuri transversale perpendiculare pe striul iniial, traseul de nsmnare avnd aspect de brad)(WHO, 2003).

Mediile utilizate sunt mediul lactozat (CLED, MacConkey, brom crezol purpur etc) (pentru izolarea
bacililor) i geloz snge (pentru izolarea cocilor) sau mediu cromogen, care permite diferenierea coloniilor
aparinnd diferitelor specii pe baza morfologiei i a culorii acestora (fig. 333).
32

Fig. 330. Intepretarea cantitativ a bacteriuriei prin metoda lamei imersate.

Fig. 331. Interpretarea cantitativ a bacteriuriei pe mediu cromogen (Uriselect 4 Biorad).

Fig. 332. Interpretarea cantitativ a bacteriuriei prin folosirea unei benzi de hrtie de filtru steril imersat n proba de urin i amprentat pe
mediul de cultur timp de 2-3 sec., n duplicat (metoda Leigh i Williams).

Fig. 333. Diferenierea coloniilor aparinnd diferitelor specii pe mediu cromogen.

33

Dup incubare timp de 24 ore sau dup caz, 48 de ore, se continu diagnosticul cu identificarea
micoorganismelor pe baza aspectului coloniilor (dac s-a utilizat mediu cromogen) sau prin realizarea testelor
oxidazei i catalazei, care vor orienta alegerea galeriilor de identificare (teste individuale - indol, -glucuronidaz
-Killian i Borrow, 1976, TDA, sisteme multitest sau galerii API).
Tabelul 37. Interpretarea calitativ a creterii pe medii de cultur (REMIC, 2008).
Cretere
snge

pe

gelozCretere
lactozat

pe

mediu

Rezultat

Un singur tip de
colonii

BGN, levuri

Un singur tip de
colonii

CGP, corineformi

Un singur tip de
colonii

Bacterii fastidioase, intracelulare,

urocultur steril

Dou sau mai multe

tipuri de colonii

Contaminare: Nu se lucreaz !!!

Excepie: pacieni cateterizai.

n funcie de criteriul bacteriologic (nivelul bacteriuriei), interpretarea clinic a uroculturii este:

- bacteriurie <103 UFC/ml absena infeciei;
- bacteriurie >105 UFC/ml posibil infecie;
- ntre 103 i 104 UFC/ml incertitudine (se repet).
Interpretarea rezultatelor ECU combin parametrii clinici, citologici i bacteriologici (tabelele 37, 38, 39).
Tabelul 38. Interpretarea rezultatelor ECU (REMIC, 2008).
Diagnostic microbiologic
Bacteriurie
Piurie
Colonizare
+
Infecie asimptomatic
+
+
Infecie simptomatic
+
+
Inflamaie fr infecie
+
Simptome fr infecie
-

Simptome
+
+

Tratament
+*
+

n unele circumstane particulare

Tabelul 39. Interpretarea bacterio-clinic a uroculturii (REMIC, 2008).

Categorii clinice
Criterii microbiologice
Infecie urinar acut fr complicaii la femeie
10 000 leucocite/ml
103 UFC/ml uropatogeni recunoscui
Pielonefrita acuta simpl
10 000 leucocite /ml
104 UFC/ml uropatogeni recunoscui
ITU cu risc sau complicate
10 000 leucocite /ml
105 UFC/ml uropatogeni recunoscui
Bacteriurie asimptomatic (controlat prin 2 ECU)
10 000 leucocite /ml
105 UFC/ml
Antibiograma se realizeaz pentru orice tulpin izolat.

34

15.6. EXAMENUL BACTERIOLOGIC AL SECREIILOR I EXSUDATELOR ANO-GENITALE se

realizeaz n urmtoarele scopuri:

Izolarea microorganismelor patogene din microbiota genital normal, n special la femei;

Diagnosticul infeciilor de tract genital i al vaginozelor (datorate proliferrii anaerobilor sau a bacteriilor
de tip Mobiluncus sp.) (tabelul 40);
Diagnosticul infeciilor cu transmitere sexual;
Stabilirea unei antibioterapii intite, alegerea antibioticelor, supravegherea tratamentului i a vindecrii;
Prevenirea bolilor cu transmitere sexual (BTS).
n funcie de prezena/absenei microbiotei, uterul i trompele uterine sunt normal sterile, n timp ce vulva,
vaginul i exocolul uterin se colonizeaz imediat dup natere. Microbiota vulvar este bogat i variat, fiind
reprezentat n special de microbiota tegumentar a regiunii perineale i depinde de igiena local individual.
Microbiota vaginal sufer modificri n raport cu vrsta, depinznd de secreia de hormoni ovarieni i de
activitatea sexual. Astfel, n perioada de activitate sexual, secreia de estrogeni determin depozitarea
glicogenului n celulele epiteliale ale mucoasei vaginale. Dintre speciile normal prezente n microbiota genital,
doar bacilii Dderlein fermenteaz lactic glicogenul, ce determin un pH acid al vaginului (3,8-4,2) (fig. 334).
n condiiile de pH acid, numeroasele specii din vagin se afl ntr-un echilibru optim, dei unele sunt virulente:
specii de Clostridium, Bacteroides, enterococi, stafilococi, Gardnerella, levuri, E. coli, dar acestea nu
prolifereaz (stare de echilibru sau eubioz).
Dac valoarea pH se modific, se instaleaz disbioza i apar vaginozele. Ecosistemul vaginal poate fi
perturbat fie de microbiota endogen, fie de un microorganism exogen. n cazul disbiozei, lactobacilii sunt n
minoritate (frotiu colorat Gram sau Giemsa). Examenul microscopic poate face diferena ntre vaginoze i
vaginite, ntre o colonizare i o infecie cu Candida sau o infecie cu Trichomonas. La pubertate i dup
menopauz, lactobacilii sunt nlocuii cu alte specii.
Dintre organele tractului genital masculin, prostata, canalele ejaculatoare, veziculele seminale, epididimul,
testiculele sunt fiziologic sterile. Uretra, datorit poziiei sale, reprezint principala cale de acces a infeciei nu
numai ctre tractul urinar proximal, ci i ctre tractul genital. Propagarea infeciei se face predominant ctre
organele genitale i mai puin ctre cele urinare, principalele microorganisme implicate fiind cele transmise pe
cale sexual.
Secreia uretral poate fi discret sau abundent. n mod normal secreia uretral conine un numr mic de
celule descuamate i bacterii Gram-pozitive (coci i difteroizi). Sub raport etiologic, uretritele pot fi gonococice
i nongonococice. Prezena unei secreii purulente, cu numeroase PMN, dar fr microorganisme pe frotiu i
culturi negative, sugereaz o etiologie cu Mycoplasma, Chlamydia, virus herpetic, Trichomonas sau chiar
nemicrobian: medicamentoas, alergic, traumatisme mecanice etc.
Tabelul 40. Semnificaia clinic a microorganismelor prezente la nivelul cilor genitale sau transmise pe cale
sexual (adaptat dup van Dyck et al., 1999; WHO, 2003; REMIC, 2008).
Microorganisme ntotdeauna Sindromul clinic
Microorganisme comensale Microorganisme
patogene
condiionat patogene
nepatogene
Neisseria gonorrhoeae
Gonoree
Candida
albicans- Lactobacillus
Bartolinit, cervicit, balanoprostatite,
corio-amnionit,
vulvovaginite
conjunctivit,
infecii
gonococice
generalizate
(artrit,
dermatit,
tenosinovit),
endometrite,
epididimit, sterilitate,
35

Chlamydia trachomatis

Trichomonas vaginalis
Herpes virus

Calymmatobacterium
Granulomatis
Haemophilus ducreyi
Treponema pallidum
Cytomegalovirus (CMV)
HBV
HIV

faringit,
vaginit
prepubertal,
perihepatite,
proctite,
prostatite,
salpingite, uretrite.
Limfogranulomatoza
Gardnerella
vaginalisveneric (serotipurile
uretrite, vaginite
L1-L3)
Bartolinit, cervicita,
conjunctivita la sugari,
endometrite,
epididimit,
(serovar D-K)
pneumonie la sugari,
sterilitate, otit medie
la sugari, boala
inflamatorie pelvic
(PID), perihepatite,
vaginite prepubertale,
proctite, sindrom
Reiter, salpingita,
uretrite.
Trichomonoza
Mobiluncus
spp.

vaginoze
Herpesul genital i Mycoplasma, Ureaplasmaorolabial, meningite, uretrite
herpes
neonatal,
proctite
Granuloma inguinale Staphylococcus aureus
(donovanoz)
ancrul moale
Streptococcus spp.
Sifilis
Bacterii strict anaerobe
Infecii congenitale
Enterobacterii
Hepatita B
Papillomavirus - veruci
virale, neoplazie cervical.
SIDA

Corynebacterium

Neisseria. Alte specii dect

N. gonorrhoeae
Staphylococcus non
aureus

Tabelul 41. Metode de recoltare a produselor de tract genital (adaptat dup REMIC, 2008).
Recoltarea produselor de tract Recoltarea produselor de tract Recoltarea produselor de tract
genital la ambele sexe
genital feminin
genital masculin
Uretrite:
Vulvo-vaginite - recoltarea cu Epididimite, prostatite - tampon
Prelevat endo-uretral cu tamponul a secreiilor din orificiul uretral, prelevarea spermei sau
vaginal i vestibulul vaginal recoltarea primului jet de urin.
tamponul.
Prostatite - recoltarea secreiilor
Pentru Chlamydia, raclaj posterior.
Bartolinite
aspirarea
cu
seringa
prostatice dupa eventualul masaj al
endo-uretral sau recoltarea
din canal sau prelevarea cu prostatei i/sau primul jet de urin.
primului jet de urin.
tamponul.
Orhite puncionarea abcesului cu
Ulceraii ano-genitale:
Cervicite
recoltare
cu
tamponul
seringa (de ctre chirurg). Agentul
recoltarea serozitilor de la
din
endocol.
infecios poate fi regsit i n
nivelul bazei sau marginii
Endometrite
prelevat
din
endocol
sperm.
ulceraiei cu vaccinostil,
i
eventual
aspirarea
transcervical
chiuret sau tampon.
biopsie
sau
puncia prin cateter.
Anexite - lichidul de abces este
ganglionului satelit.
prelevat cu seringa i celulele tubo Pustule:
36

 colectarea coninutului cu peritoneale prin raclaj n cursul

interveniei chirurgicale.
seringa sau tamponul.
Prelevat anal sau faringian:
diagnosticul BTS.
n toate cazurile se recolteaz dou sau trei probe (examinare direct i nsmnare).
Dac prelevrile nu sunt efectuate n laborator, probele trebuie transportate rapid pe medii de transport adecvate
(pentru gonococ, Chlamydia, Mycoplasma, virus).
Secreia ataat pe suprafaa valvelor de recoltare, poate servi la efectuarea a 2 teste preliminarii: determinarea
valorii pH (pH > 5 este ntlnit n infecia cu Trichomonas i n vaginoze) i testul aminelor volatile.
Pentru diagnosticul vaginitei cu Trichomonas, se execut rapid examinarea preparatului proaspt lam-lamel, pe
care protozoarul are forma i mobilitatea caracteristice. Protozoarele i pierd mobilitatea pe tamponul de vat.
Al doilea tampon este folosit pentru executarea unui frotiu Gram, care permite aprecieri cantitative sau calitative ale
microbiotei vaginale.
Al treilea tampon, n cazul unei secreii purulente, este utilizat pentru nsmnare pe medii de cultur adecvate.
Datele clinice i epidemiologice, aspectul leziunilor i localizarea lor, observate n cursul prelevrii (tabelul 41) sunt
indispensabile pentru orientarea diagnosticului bacteriologic. Ele condiioneaz valoarea rezultatului care se obine
dup examinarea citobacteriologic direct (tabelul 42) urmat, dup caz, de cultivare (tabelul 43), tehnici de
biologie molecular i examen serologic.
Tabelul 42. Examenul microscopic al secreiilor tractului genital
Ulceraii

Microscop cu fond negru (ob. 10x)

imunofluorescen
direct
(IF),
impregnare argentic sau coloraia
Vago.
Coloraia May-Grundwald-Giemsa
IF

Granulom inghinal

Uretrite,
cervicite
vaginite / secreie
vaginal.

Coloraia May-Grundwald-Giemsa pe
frotiuri fixate cu aceton.

Coloraia Gram

Preparat proaspt n KOH 10% i

vizualizare cu contrast de faz.
Coloraia
May-Grundwald-Giemsa
sau Papanicolaou.

IF

T. pallidum
NB: pacienii pozitivi la examinarea
direct pot fi serologic negativi,
pozitivarea serologic putnd aprea n
cteva sptmni.
Haemophilus ducreyi (fig. 336)
ulceraii externe de tip herpetic asociat
cu Chlamydia (boala Nicolas-Favre)
sau cu Mycoplasma.
Corpii lui Donovan
(reprezentai de Calymmatobacterium
granulomatis sau donovani, bacili
capsulai, internalizai n histiocite (van
Dyck et al., 1999) (fig. 338).
N. gonorrhoeae
C. albicans
Studiul microbiotei vaginale: scor de la
I la IV (scor I microbiot echilibrat,
scor II, III- dezechilibrul microbiotei
cu lactobacili prezeni, scor IV
microbiot complet substituit n
favoarea anaerobilor sau Gardnerella
vaginalis, lactobacili abseni).
C. albicans
T. vaginalis
Clue-cells din vaginoz
T. vaginalis
Incluzii intracelulare infecii cu Chl.
trachomatis.
Chl. trachomatis

37

Sperm

Alte produse

Preparat proaspt

Levuri
T. vaginalis
Rar ou de Schistosoma

Frotiu colorat Gram

N. gonorrhoeae
Levuri (C. albicans)
Coci Gram-pozitivi
Bacili Gram-negativi
Prezena sau absena leucocitelor.
N. gonorrhoeae
C. albicans
Chl. trachomatis

Preparat proaspt sau frotiu examinat

Gram sau cu IF

Tabelul 43. Cultivarea produselor de tract genital

Mediu de cultur
Ageni patogeni izolai
Geloz snge
Str. agalactiae
S. aureus
Gardnerella vaginalis (considerat patogen atunci cnd este
dominant numeric sau cnd este asociat cu bacterii anaerobe
Mobiluncus spp).(fig. 335, 337).
Geloz
snge
incubat
n Prevotella (endometritele postpartum sau infecii asociate
anaerobioz.
dispozitivelor intrauterine).
Mediu lactozat
Bacterii Gram-negative (n special enterobacterii).
Geloz chocolat
N. gonorrhoeae
Rar, Haemophilus ducreyi
Culturi celulare
Chl. Trachomatis
Medii artificiale mbogite cu ser Mycoplasma hominis
bovin i extract de levuri.
Ureaplasma urealyticum
Medii speciale pentru micobacterii. M. tuberculosis (endometrite, epididimite).

Fig. 334. Frotiu vaginal normal.

Fig. 335. Vaginoz (clue cells celule epiteliale acoperite de cocobacili Gram variabili/ Gardnerella vaginalis).

38

Fig. 336. Aspectul Haemophilus ducreyi pe frotiul colorat Gram (G. Hammond, Public Health Image Library, CDC, 1978).

Fig. 337. Morfologia celulelor de Mobiluncus pe frotiul colorat Gram.

.

Fig. 338. Bacili capsulai, intracelulari - Calymmatobacterium granulomatis (frotiu colorat Giemsa) (OFarrell, 2002).

Antibiograma se realizeaz sistematic pentru microorganismele izolate din infeciile tractului genital
superior, pentru cele patogene, pentru tulpinile de gonococ cu determinarea productorilor de -lactamaze, i nu se
realizeaz pentru bacteriile care colonizeaz n mod normal tractul genital inferior n special la femeie, excepie
fcnd Str. agalactiae (-hemolitic de grup B) izolat n cursul celui de-al treilea semestru de sarcin, tratat pentru a
se preveni posibilitatea unei infecii neonatale.
15.7. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC AL MATERIILOR FECALE. COPROCULTURA
Infeciile enterice bacteriene (diareea, dizenteria i febrele enterice) sunt factori de risc importani pentru
sntatea public n ntreaga lume. Diareea infecioas constituie a doua cauz de deces la nivel mondial dup bolile
cardiovasculare, mai ales n populaia infantil. n rile n curs de dezvoltare, boala diareic provoac 1,5 milioane
de decese anual la copiii de 1-4 ani (riscul de mbolnvire la aceast categorie de vrst fiind de 600 ori mai mare n
rile n curs de dezvoltare dect n rile dezvoltate). n rile n curs de dezvoltare, copiii sufer de zece sau mai
multe episoade de diaree pe an, find frecvent infectai concomitent cu mai multi ageni enteropatogeni, uneori chiar
i n absena simptomatologiei. Odat cu creterea prevalenei HIV / SIDA i a chimioterapiei imunosupresoare, a
39

crescut numrul de cazuri de boal diareic la pacienii imunocompromii. Infeciile enterice bacteriene identificate
la pacienii cu HIV / SIDA sunt produse de Campylobacter, Salmonella (salmoneloza este de 20 de ori mai
frecvent la aceti pacieni), Shigella i micobacterii (WHO, 2003).
Coprocultura se recomand n cazul n care scaunul este lichid sau moale, mucilaginos sau hemoragic sau la
indicaii foarte precise, pentru cele solide.
Diareea poate fi acut sau cronic, nsoit sau nu de o stare febril. Nu toate episoadele diareice sunt de
natur infecioas sau cu etiologie bacterian, paraziii, virusurile i levurile putnd fi de asemenea isolate (tabelele
44, 45).
Tabelul 44. Etiologia infecioas a bolii diareice (WHO, 2003; REMIC, 2008).
Principalele microorganisme care determin diaree
Bacterii
Salmonella, Sh. dysenteriae, Sh. flexneri, Sh.boydii, Sh. sonnei,
Campylobacter jejuni, C. coli, Yersinia enterocolitica, EPEC, ETEC,
EHEC, EIEC, DAEC, EaggEC, V. cholerae, V. fluvialis, V. hollisae, V.
mimicus, Aeromonas hydrophila, A. sobria, A. caviae, S. aureus, B.
cereus, Cl. difficile, Cl. perfringens, Cl. botulinum.
Virusuri
Rotavirus, Adenovirus, Astrovirus, Calicivirus, Coronavirus, virusul
Norwalk.
Protozoare
Entamoeba, Giardia, Isospora, Cryptosporidium, Balantidium.
Helmini
Schistosoma, Strongyloides, Ancylostoma, Necator, Trichuris, Trichinella.
Levuri
Obiectivul principal al coproculturii const n determinarea microorganismelor patogene care produc
diaree, prin izolarea acestora dintr-o microbiot complex, de o mare densitate i diversitate, care conine 10 9
1011 bacterii/ gram de coninut intestinal i este reprezentat de peste 400 specii diferite, dintre care marea majoritate
sunt strict anaerobe. Enterobacteriile reprezint 5-10% cu predominana E. coli. Enterococii, streptococii,
stafilococii, lactobacilii i levurile sunt prezente ntr-un numr mai mic.
Prelevarea i transportul probelor
Scaunele sunt prelevate ntr-un recipient corespunztor (coprorecoltor), curat, de unic utilizare, fiind
interzis utilizarea recipientelor artizanale de tipul cutiilor de chibrituri; se va recolta cel puin un volum de 3-5 cm 3,
egal cu o nuc, cu ajutorul unei spatule sau a unui recipient cu lopic i apoi este transferat ntr-un recipient
ermetic nchis. Cnd acestea exist, se recolteaz poriunile muco-purulente sau sanguinolente.
Recoltarea cu ajutorul unui tampon rectal sau cu sonda Nelaton este utilizat mai ales n cazul sugarilor i al
copiilor mici, n shigelozele cronice sau la investigarea purttorilor de Shigella i Salmonella (cu excepia celor de
S. typhi). Dup prelevare, produsul patologic se introduce n tuburi sterile cu mediu de conservare.
Biopsiile mucoasei rectale sau colice realizate prin endoscopie sunt analizate ca i materiile fecale, cu
excepia examenului specific pentru micobacterii.
Prelevatul trebuie s fie imediat transportat la laborator sau conservat maxim o noapte la +4 0C pentru a se
evita desicarea i proliferarea bacteriilor i levurilor comensale. Pentru aceasta se folosete un mediu de transport
adecvat (Stuart, Amies, Cary Blair, ap peptonat, soluie TRIS tamponat etc.).
Pentru izolarea virusurilor, se folosesc recipiente sterile, cu 5-10 cm 3 materii fecale. Proba se refrigereaz
pn n momentul examinrii.
Tabelul 45. Contexte care necesit realizarea unei coproculturi (WHO, 2003; REMIC, 2008).
Context
Indicaii
pentru Ageni
patogeni Cultivare
coprocultur
identificai
Adult sau copil peste Coprocultur standard
Salmonella
spp. Mediu de mbogire pentru
doi ani i context bine
Identificarea pn la Salmonella i Shigella (Muellerdefinit.
nivel de serovar se Kauffmann, Selenit).
justific doar n scop Mediu selectiv de izolare (geloz
epidemiologic
SS, XLD, DCL, Hektoen).
Shigella spp.
Se recomand repicarea de pe
Campylobacter spp.
mediu de mbogire pe mediu
Yersinia enterocolitica
selectiv dup 3-6 ore de incubare la
40

EIEC.

Copil sub 2 ani

Coproculturi standard
+
cu accent pe E. coli E. coli enteropatogen EPEC pe
enteropatogen.
(EPEC), Rotavirus,
Drigalski.
La aceast categorie de Adenovirus.
vrst
predomin
etiologia viral.
Meconiu
L. monocytogenes
E. coli K1
Str. agalactiae (grup B).

Nou nscui

Contexte
epidemiologice
clinice particulare

370C.
Identificare biochimic.
Confirmare serologic.
Medii specifice pentru
Campylobacter spp. (Karmali,
Skirrow sau Buztler). Culturile
sunt incubate minim 48 ore la
42oC, n microaerofilie, cu 10%
CO2.
Yersinia enterolitica nsmnare
pe mediu de mbogire (mediu
Rapport), incubare 24-48 ore la
+40C i repicare pe medii specifice
pentru Yersinia mediu Wauters
(geloz
SS
mbogit
cu
dezoxicolat) sau mediu Irgasancefsulodin i novobiocin incubate
timp de 48 ore la 300C.
EMB

sau

Pacieni HIV /SIDA

i

Bacterii enteropatogene.
Virusuri (CMV, HSV,
HIV).
Protozoare (Entamoeba
histolytica,
Isospora
belli,
Giardia
intestinalis,
cryptosporidii,
microsporidii.
Determinarea strii de Persoanele din anturajul
purttor la personalul unui pacient,
cu risc
Ps. aeruginosa la nounscui.
Detectarea colonizrii Enterococ rezistent la
de
bacterii vancomicin sau
multirezistente
enterobacterii
productoare de lactamaze cu spectru
larg.
Sindrom
hemolitic E. coli 0157 i alte
uremic
tulpini de E. coli
productoare
de
verotoxine.
Sindrom holeriform
V. cholerae, ETEC

+
mediu

41

Izolare VRE pe geloz bil

esculin cu 6 mg/l vancomicin
ESBL pe mediu Drigalski cu 0,51 mg/l cefotaxim.
Izolarea de E. coli pe geloz
MacConkey cu sorbitol, coloniile
sorbitol (-) sunt confirmate prin
latex aglutinare.
V. cholerae mbogire n apa
peptonat alcalin repicat la
fiecare 3 ore pe mediu gelozat

specific (de ex. TCBS).

Identificare biochimic.
Confirmare serologic.
Bolnavi
aflai
sub
tratament cu antibiotic
Colit
pseudomembranoas

Cl. difficile, C. albicans

S. aureus, K. oxytoca,
Ps.
aeruginosa,
C.
albicans, Cl. perfringens
productor
de
enterotoxine.

Toxiinfecie alimentar S. aureus

colectiv cu perioad B. cereus
scurt de incubare (14h).
Toxiinfecie alimentar
colectiv cu perioad
de incubare scurt (1272 ore)
Diaree
serosangvinolent toxic cu
lipsa
elementelor
polinucleare la
examinarea direct
consecutiv ingestiei de
ap i alimente.
Voiaj
ntr-o
ar
tropical
Intoxicaie alimentar

Salmonella spp. Yersinia

enterococlitica,
Cl.
botulinum,
Cl.
perfringens.
Aeromonas hydrophila
Plesiomonas
shigelloides.

Suspiciune de botulism

Evidenierea toxinei B n filtratul

de materii fecale
Determinarea ECP pe culturi
celulare
(fibroblaste, celule Vero, MRC-5,
Mac Coy).
Determinarea toxinei A prin
tehnica ELISA.
Evidenierea toxinelor n filtratul
de materii fecale, lichid de
vrstur, aspirate gastrice, serul
bolnavului (toxina botulinic).

Aeromonas spp. - geloz snge cu

adaos de ampicilin.

Tipizarea
toxinei
din
serul
bolnavului i din alimentele
suspectate.

Identificarea agenilor patogeni izolai presupune att evidenierea unor caractere biochimice, ct i
confirmarea serologic, n cazul unor specii (fig. 339-343).

42

Fig. 339. Cheie dichotomic de identificare a enterobacteriilor pe baza unor caractere biochimice (fermentarea lactozei, producerea de H 2S,
prezena lizin/decarboxilazelor - Lys, fenilalanin/dezaminazelor - FAD, ureazei URE; producerea de indol - Ind, producerea
ornitindecarboxilazelor Orn, fermentarea unor zaharuri) (WHO, 2003).

Fig. 340. Shigella sonnei pe medii lactozate (CLED, MacConkey) (colonii lactozo-negative).

Fig. 341. S. tiphymurium pe mediu lactozat (CLED) (colonii lactozo-negative) i K. pneumoniae pe medii lactozate (CLED, MacConkey)
(colonii lactozo-pozitive, mucoase).

43

Fig. 342. Cheie dichotomic de identificare a BGP, catalaz-negativi, pe baza unor caractere biochimice (hemoliza, producerea indolului Ind, ureazei URE, fermentarea unor zaharuri Lac, manitol, prezena nitrat-reductazei NTR, invazia pe mediu solid repartizat n plci,
producerea catalazei Cat) (WHO, 2003).

Fig. 343. Cheie dichotomic de identificare a BGN anaerobi, catalaz-negativi, pe baza unor caractere de cultur i biochimice (WHO, 2003).

44

Fig. 344. Antibiograma unei tulpini de Klebsiella pneumoniae productoare de ESBL.

Fig. 345. Confirmarea prin E-test a producerii de ESBL la o tulpin de K. pneumoniae.

Fig. 346. Testul Hodge modificat, pentru evidenierea producerii de carbapenemaze la o tulpin de K. pneumoniae (aspectul treflat al zonei de
inhibiie indic producerea de carbapenemaze).

45

Fig. 347. Tulpin de E. faecium izolat din coprocultur, rezistent la vancomicin, confirmat prin E-test.

Antibiograma este recomandat pentru toi agenii patogeni izolai i imperativ necesar pentru
Salmonella, Shigella, E. coli, V. cholerae (fig. 344-347).

46

15.8. HEMOCULTURA
Sngele este cultivat pentru detectarea i identificarea bacteriilor sau a altor microorganisme cultivabile
(levuri, fungi filamentoi) prin metode clasice sau automate de detectare a creterii microbiene. Prezena unor astfel
de organisme n snge se numete bacteriemie sau fungemie i este de obicei patologic, deoarece sngele este n
mod normal steril, cu cteva excepii: bacteriemia tranzitorie care apare la scurt timp dup: extracii dentare sau
tratamentele stomatologice, intervenii chirurgicale la nivelul mucoaselor contaminate, contaminare intravenoas pe
cale iatrogen, bronhoscopie, sau cateterizare uretral. Bacteriemia tranzitorie poate aprea n infeciile localizate,
precum artrita, escarele, colecistit, enterocolit, meningit, osteomielit, peritonit, pneumonie, pielonefrit,
infecii traumatice sau ale plgilor chirurgicale. Acest tip de bacteriemie tranzitorie se remite de obicei spontan,
dup fagocitarea bacteriilor comensale. Septicemia este un termen clinic utilizat pentru a descrie bacteriemia
nsoit de manifestri clinice care apare n infeciile severe, cu frisoane, febr, stare de ru general, toxicitate,
hipotensiune arterial, forma extrem fiind ocul toxic produs de toxinele bacteriilor Gram-negative (LPS) sau ale
cocilor Gram-pozitivi (acizi teichoici, superantigene) (Mihescu, 2000; Mihescu i colab., 2005; 2007).
Bacteriemia persistent apare n bruceloz, leptospiroz, febr tifoid, endocardite, anevrisme infectate i
tromboflebit.
O stare septicemic se caracterizeaz prin trecerea repetat a microorganismelor n snge. Febra de origine
necunoscut, mai ales dac este acompaniat de semne clinice evocatoare ale unei infecii, necesit efectuarea unei
hemoculturi (tabelul 46).
Tabelul 46. Criterii predictive ale bacteriemiei (Bates, 1990).
Factor de predicie
Temperatura >38,30C
Maladie rapid fatal
Maladie terminal
Prezena frisonului
Toxicomanie pe cale venoas
Abdomen chirurgical acut
Factor de co-morbiditate major a
a
- coma sau moartea cerebral, perforare digestiv, multitraumatisme, stop cardiorespirator,
insuficien hepatic acut sau cronic
Risc crescut de bacteriemie
Risc sczut de bacteriemie

Punctaj
3
4
2
3
4
3
3
scor 6
scor 2

Datele epidemiologice arat c S. aureus i E. coli sunt speciile cel mai des izolate din hemoculturi pozitive.
S. aureus, E. coli, enterobacteriile, Ps. aeruginosa i C. albicans sunt n 90% cazuri patogene. Interpretarea
hemoculturilor pozitive este de asemenea, dificil n cazul streptococilor de grup viridans, Enterococcus i SCN.
Frecvena izolrii SCN a crescut considerabil n ultimul timp, dar doar 10-20% din aceste izolate au semnificaie
clinic, majoritatea SCN izolai din hemoculturi fiind contaminani. Bacillus, Corynebacterium i
Propionibacterium produc bacteriemii semnificative n mai puin de 5% din cazuri. Frecvena anaerobilor rmne
sczut, mai ales la copii.
Varietatea microorganismelor ce pot fi regsite n snge crete la pacienii imunocompromii. Speciile n
cauz sunt numeroase i cu exigene nutritive variate, ceea ce duce la dificultatea izolrii acestora (tabelul 47).
Tabelul 47. Ageni patogeni implicai n etiologia bacteriemiilor i fungemiilor (WHO; 2003).
Bacterii Gram-negative
Bacterii Gram-pozitive i fungi
E. coli
Klebsiella spp.
Enterobacter spp.
Proteus spp.
S. typhi
Salmonella spp. alte specii dect S. typhi

Streptococi viridans
S. aureus
S. epidermidis
Str. pneumoniae
E. faecalis (grup D)
Str. agalactiae (grup B)
47

Ps. aeruginosa
L. monocytogenes
N. meningitidis
Cl. perfringens
H. influenzae
Peptostreptococcus spp. (anaerobi)
Bacteroides fragilis (anaerobe)
Str. pyogenes (grup A)
Brucella spp.
M. avium-intracelulare (complexul Mac) la pacieni
Burkholderia (Ps.) pseudomallei (n anumite zone SIDA.
geografice)
M. kansasii
M. tuberculosis
C. albicans
C. glabrata
C. krusei
C. tropicalis
C. parapsilosis.
Histoplasma capsulatum
Cryptococcus neoformans
Malassezia furfur
Fusarium
Penicillium.
Bacterii cu cretere lent i dificil
Brucella
Campylobacter
Legionella
Mycoplasme Ureaplasma
Leptospira
Grupul HACEK - Haemophilus aphrophilus, A. actinomicetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella
corrodens i Kingella kingae
Streptococi deficieni (Abiotrophia)
Bartonella (Rochalimaea)
Recoltarea probelor
Aseptizarea zonei de recoltare
Asepsia pielii se face succesiv cu alcool 70%, apoi cu un produs iodat (tinctura de iod 2% sau polividona
iodat 10%) sau clorhexidin 0.5%, care este lsat s acioneze 1-2 minute pentru obinerea efectului aseptic.
Activitatea bactericid a tincturii de iod este mai rapid dect a polividonei. Dup puncia venoas, produsul iodat
potenial iritant trebuie ndeprtat cu alcool 70%.
Dezinfecia capului flaconului de hemocultur se face cu alcool 70% sau cu produs iodat.
Chiar i dup o dezinfecie atent, unele bacterii persist n straturile mai profunde ale pielii i pot
contamina proba (ex. S. epidermidis, Propionibacterium acnes, spori de Clostridium). Pseudobacteriemia
(hemocultur fals-pozitiv) poate rezulta i din utilizarea soluiilor antiseptice, seringilor sau acelor contaminate.
Izolarea repetat a unui microorganism neobinuit (de exemplu, Burkholderia (Ps.) cepacia, Pantoea
(Enterobacter) agglomerans sau Serratia spp.) n acelai spital indic suspiciunea unei infecii nosocomiale i
necesitatea unei anchete epidemiologice. O alt surs de contaminare este contactul acului cu dopurile flacoanelor
nesterilizate (sau cu soluii nesterile), n cazul n care aceeai sering este folosit iniial pentru recoltarea de snge
pentru analize chimice sau VSH.
Recoltarea prin puncie venoas
Puncia venoas este singura metod fiabil pentru prelevarea sngelui n vederea hemoculturii. Recoltarea
prin cateter crete riscul contaminrii.
Densitatea bacteriilor prezente n snge este n general foarte sczut la adult (mai mic de 1 UFC/ml). Un
volum de 20 ml de snge asigur un procent de pozitivitate a hemoculturii cu 30% mai mare, comparativ cu un
volum de 10 ml care este minimum necesar la adult.
La copii, densitatea bacteriilor n snge este mai mare dect la adult, un volum de 1-2 ml fiind considerat
suficient. Acest volum poate fi crescut n funcie de vrst (2-5 ml).
Datorit caracterului intermitent sau tranzitoriu al bacteriemiei, se recomand recoltarea a 2-3 hemoculturi
(la un interval optim de 30-60 minute). Momentul optim de recoltare este n timpul frisoanelor sau al episoadelor
termice maxime. Recoltarea mai multor hemoculturi permite de asemenea demonstrarea implicrii unor
48

microorganisme comensale n etiologia bacteriemiei i excluderea posibilitii contaminrii probei n timpul

recoltrii.
Chiar n condiii ideale de recoltare a sngelui pentru hemocultur, n 3-5% din culturi pot crete
contaminani de pe piele (S. epidermidis, Propionibacterium acnes, Clostridium spp., difteroizi) sau din mediul
nconjurtor (Acinetobacter spp., Bacillus spp.). Aceste microorganisme se pot comporta uneori ca ageni patogeni
i pot cauza endocardita.
O infecie adevrat este suspectat n cazurile n care:
- acelai organism crete n ambele flacoane de hemocultur recoltate n acelai timp;
- acelai organism crete n dou flacoane recoltate la intervale diferite;
-creterea este rapid (n 48 de ore), ceea ce nseamn o densitate bacterian iniial mare;
-dou tulpini izolate aparinnd aceleiai specii au acelai biotip i profil de sensibilitate la antibiotice.
Toate rezultatele hemoculturii trebuie raportate clinicianului, inclusiv contaminanii, cu menionarea statutului
respectiv (de exemplu, P. acnes comensal cutanat, S. epidermidis probabil contaminant). Pentru contaminani nu
trebuie efectuat antibiograma. Identificarea a dou sau mai multe specii sau tulpini poate indica o bacteriemie
polimicrobian, care poate s apar n cazul pacienilor imunodeprimai sau o bacteriemie cu anaerobi (de exemplu,
asocierile multispecifice dintre anaerobi i aerobi apar n bacteriemiile fulminante severe asociate cu traumatisme
severe sau cu intervenii chirurgicale care implic intestinul gros).
nsmnarea probelor
Se nsmneaz 2 flacoane, pentru incubare n condiii de aerobioz i anaerobioz (pe lng bacteriile
strict anaerobe, streptococii i enterococii se dezvolt mai rapid n condiii de anaerobioz).
Sngele conine numeroase substane cu activitate antimicrobian (complement, lizozim, celule fagocitare
i antibiotice), motiv pentru care, pentru hemocultur sngele este diluat 1/10 n mediul de cultur.
Mediul de cultur conine de asemenea un anticoagulant (polietanol sulfonat de sodiu - SPS), utilizat la o
concentraie de 0,025-0,05%, ce favorizeaz creterea majoritii microorganismelor, prin inhibarea activitii
bactericide a serului (inhib fagocitoza, inactiveaz complementul, neutralizeaz lizozimul i antibioticele din clasa
aminoglicozidelor). SPS poate avea efect inhibitor asupra unor specii de Neisseria, Peptostreptococcus anaerobius
sau de Streptobacillus moniliformis. Adugarea de gelatin n mediu la o concentraie de 1,2% poate neutraliza
efectul inhibitor al SPS. Mediul de cultur conine de asemenea rini schimbtoare de ioni, cu efect neutralizant
fa de antibiotice. Se recomand realizarea prelevrilor la distan fa de perioada de administrare a
antibioticelor.
Incubarea probelor
Flacoanele de hemocultur sunt incubate timp de 7 zile la 35 0C, iar n cazul sistemelor automate, 5 zile.
Peste aceasta perioad, bacteriile detectate sunt n general contaminani care au fost prezeni n prelevat n cantitate
mic. Un timp de incubare mai lung poate fi necesar pentru microorganisme particulare: levuri, fungi, bacterii din
grupul HACEK, Brucella sau Legionella i pentru pacienii suspectai de endocardite, la care prelevatele au fost
realizate sub tratament cu antibiotice.
Examinarea probelor
n cazul sistemelor convenionale, flacoanele se examineaz zilnic sau de 2 ori/zi, n vederea observrii
semnelor unei creteri vizibile.
Tabelul 48. Examinarea macroscopic a flacoanelor de hemocultur.
Aspect macroscopic
Etiologie posibil
Turbiditate
Bacili Gram-negativi aerobi, stafilococi, Bacteroides
Hemoliz
Streptococi, stafilococi, Listeria, Clostridium, Bacillus
Producere de gaz
Bacili Gram-negativi aero-anaerobi
Coagulare
S.aureus.
Dac la examinarea microscopic (tabelul 48) se evideniaz stafilococi sau bacili Gram-negativi,
hemocultura poate fi utilizat ca inocul pentru realizarea unei antibiograme nestandardizate rapide, care poate fi
citit dup 6 ore, pentru a grbi decizia terapeutic.
Detectarea precoce a creterii microbiene n sistemele convenionale poate fi mbuntit prin:
- agitarea flacoanelor aerobe n timpul primelor 24 ore de incubare;
- aerarea flacoanelor aerobe cu un dispozitiv adaptat care favorizeaz creterea Pseudomonas;
- detectarea prezenei bacteriene pe frotiuri;
49

- repicarea sistematic precoce (ntre 6 i 24 ore) a flaconului de anaerobioz pe geloz chocolat incubat n
aerobioz la 350C;
- utilizarea sistemelor difazice, ce permit creterea precoce a coloniilor pe mediul gelozat;
- concentrarea microorganismelor (centrifugare timp de 30 minute la 3000g) nainte de nsmnare pe mediul
gelozat i liza elementelor figurate cu ajutorul unui agent de liz (ex. saponin). Sistemul centrifugare-liz este
folosit pentru izolarea microorganismelor fastidioase, micobacteriilor, levurilor, fungilor filamentoi.
n funcie de tipurile morfologice observate se aleg mediile de repicare a hemoculturii:
- pentru bacili Gram-negativi: agar MacConkey, mediu TSI, MIU, citrat Simmons;
- pentru cocobacili Gram negativi: geloz snge;
- pentru stafilococi: geloz snge, agar manitol sare;
- pentru streptococi: geloz snge cu discuri de optochin, bacitracin, telurit;
- geloz cu snge de berbec pentru testul CAMP;
- agar bil esculin pentru enterococi.
Bacteriile tip Neisseria, Haemophilus i Campylobacter modific slab sau deloc turbiditatea, iar
pneumococii sufer autoliza care antreneaz clarificarea mediului lichid de cultur. n acest caz se face un pasaj orb
pe geloz chocolat, la 18-24 de ore de incubare sau dup 7 zile de incubare, dac hemocultura rmne negativ, n
bulion cu tioglicolat care se urmrete timp de 3 zile.
Evidenierea bacteriilor cu cretere lent i dificil
Brucella. Unele tulpini sunt exigente pentru atmosfera de CO 2. Sngele este inoculat n flacon difazic tip
Castaneda i incubat 6 sptmni la 370C.
Se fac subculturi pe geloz tripticar soia cu 5% ser de bou sau pe agar Brucella incubat n atmosfer de 5%CO2.
Campylobacter. Cultivare la 370C n microaerofilie (atmosfer 5% CO2) pe mediu Skirrow, Butzler sau
Karmali incubate 72 ore.
Legionella. Cultivare pe mediu BCYE, incubare la 370C cu 5% CO2, examinate timp de 10 zile.
Mycoplasme Ureaplasma. Cultivare n bulion PPLO sau geloz A3, incubare n microaerofilie la 37 0C i
observate timp de 3 zile.
Leptospira. Snge recoltat pe heparin i nsmnat pe mediu Tween-Albumin sau EMJH, incubare la
300C la ntuneric; examinarea sptmnal a culturii la microscopul cu fond ntunecat, timp de 2 luni.
Grupul HACEK - Haemophilus aphrophilus, Actinobacillus actinomicetemcomitans, Cardiobacterium
hominis, Eikenella corrodens i Kingella kingae necesit incubare timp de 14 zile.
Streptococi deficieni (Abiotrophia) necesit piridoxal (vitamina B6) pentru cretere.
Bartonella (Rochalimaea) - sedimentul dintr-un tub de liz este nsmnat pe geloz cu snge de iepure
sau de oaie, incubat n atmosfer de 5% CO 2 timp de 6 sptmni. Se poate identifica prin metode moleculare
bazate pe PCR.
Metodele de detectare automat permit semnalizarea flacoanelor pozitive prin msurarea direct sau indirect a
cantitii de CO2 produs n flaconul de cultivare (detectare spectrofotometric a CO 2 - Bio Argos, sensor de CO2 de
culoare verde, separat de bulion printr-o membran semipermeabil care las s treac CO 2, determin scderea
valorii pH i modificarea culorii de la verde la galben/emitere de fluorescen, nregistrat prin
reflectometrie/fotodiod - BacT/Alert, Bactec 9240, introducerea n flacoane a unor molecule fluorescente care
emit fluorescen n prezena fenomenelor biologice determinate de creterea microbian, att producerea CO2, ct
i variaia pH i modificrile potenialului oxido-reductor Vital).
n endocarditele infecioase, hemoculturile pot rmne negative n mai mult de 10% din cazuri, chiar dac
au fost prelevate nainte de antibioterapie. n aceast situaie, infecia cu Chlamydia, Coxiella burnetti sau
Bartonella se poate identifica serologic. Incubarea n sistem automat de 5-7 zile este insuficient pentru dezvoltarea
tulpinilor cu creterea lent i dificil, fiind recomandat prelungirea timpilor de incubare sau repicarea flacoanelor.
n absena tratamentului cu antibiotice din zilele precedente, este recomandat realizarea unei prime serii de
3 hemoculturi, ntr-un interval de 24 ore, timpul minim dintre 2 hemoculturi fiind de o or.
n ziua urmtoare, dac hemoculturile rmn sterile, este recomandat efectuarea a 2-3 hemoculturi,
diversificnd mediile i tehnicile pentru a favoriza creterea microorganismelor fastidioase. De exemplu liza
elementelor figurate permite eliberarea microorganismelor intracelulare, concentrarea i creterea anselor de
cretere pe medii de cultur. Acest sistem este indicat pentru izolarea levurilor, a fungilor filamentoi i a
bacteriilor cu cretere dificil ca Bartonella (Rochalimea). Pentru bacteriile patogene intracelulare ca Coxiella
burnetti, tuburile pot fi trimise la centrele de referin.
Dac pacientul a primit antibiotice, este recomandat utilizarea mediilor ce conin rini absorbante.
50

n cazul hemoculturilor negative este recomandat:

- ncepnd din a 3 a zi de incubare realizarea unei coloraii Gram i a unei repicri din flacoanele aerobe i
anaerobe pe mediu gelozat Chocolat Isovitalex, pentru cultivarea bacteriilor de grup HACEK i pe mediu gelozat
Columbia suplimentat cu 5% snge de berbec pentru streptococi, cu striu de S. aureus pentru creterea satelit a
coloniilor de Str. adjacens i Str. defectivus.
Mediile se incubeaz 2-5 zile n atmosfer de CO 2 pentru mediile repicate din flacoanele aerobe i n condiii de
anaerobioz pentru cele repicate din flacoanele anaerobe. Poate fi realizat o subcultur pe mediu lichid, de
exemplu, pe bulion cord-creier, iar n a 7-a zi de incubare se poate realiza o coloraie Gram i o repicare pe mediu
gelozat Chocolat Isovitalex, pentru creterea bacteriilor de grup HACEK, incubat timp de 5 zile n atmosfer de
5-10 % CO2 sau n anaerobioz, n funcie de flaconul de origine.
Dac hemoculturile sunt negative la 3 zile de la incubare, pentru Chlamydia psittaci, Chl. pneumoniae, Chl
trachomatis, Brucella, Legionella, Mycoplasma pneumoniae, Bartonella, Candida, Aspergillus, Coxiella burnetii
este recomandat examenul serologic.
Pentru diagnosticul endocarditelor se poate realiza analiza microbiologic a valvelor cardiace.
n acest scop, valva va fi recoltat ntr-un vas steril care nu conine nici un lichid i va fi transmis
laboratorului. Valva este depus ntr-un mojar sau alt vas steril, se examineaz macroscopic, se fotografiaz, dup
care se realizeaz 3 amprente pe lam. Lamele sunt uscate i fixate cu etanol. Se poate efectua coloraie Gram,
Ziehl-Neelsen, Giemsa sau acridin-orange. Aceste coloraii permit punerea n eviden a majoritii bacteriilor,
inclusiv a micobacteriilor. Fragmentul destinat anatomopatologului poate fi plasat ntr-un fixator (formol diluat
1/10). Fragmentul destinat bacteriologului este mojarat ntr-un ml bulion creier-cord. Din amestec se realizeaz un
frotiu colorat Gram i se nsmneaz pe:
- geloz-chocolat suplimentat cu Isovitalex, care se incubeaz n atmosfer de 5% CO 2 (sau sistem Gaspak)
timp 10 zile. Pentru a rezista la desicare mediul se poate repartiza nclinat n tub;
- geloz-chocolat suplimentat cu Isovitalex, care se incubeaz n atmosfer de 5% CO 2, timp de 45 de zile
ntre 28-320C pentru a favoriza creterea Bartonella;
- 2 medii gelozate cu 5% snge incubate una n atmosfer de O 2, alta n atmosfer de 5% CO2 timp de 10 zile
pentru streptococi. Aportul de CO2 favorizeaz creterea Str. mutans, S. anginosus i S. constellatus;
- mediu geloz Columbia cu 5% snge cultivat timp de 10 zile n anaerobioz pentru creterea unor
streptococi i bacterii anaerobe;
- geloz BCYE suplimentat cu 10 % ser fetal bovin incubat n atmosfer de CO 2 la 35-370C timp de 10 zile
(serul fetal bovin favorizeaz creterea Legionella micdadei i L. bosemanii);
- mediul Lowenstein i Middlebrook conservat 6 sptmni la 35-37 0C pentru cultivarea micobacteriilor;
- un mediu lichid uor reductor, mbogit i uor gelozat (de exemplu, mediul cord-creier, gelozat 1% i
mbogit cu 1-3% Isovitalex/ bulion glucozat tamponat cu ficat i mbogit cu 1-3% Isovitalex, mediu
Schaedler semigelozat mbogit cu 1-3% Isovitalex). Aceste medii sunt incubate timp de o lun la 35-37 0C.
15.9. EXAMENUL BACTERIOLOGIC AL DISPOZITIVELOR INTRAVASCULARE
(CATETERE, CAMERE IMPLANTABILE)
Inseria cateterelor cardiovasculare are drept obiective asigurarea unui acces vascular permanent pentru
administrarea medicamentelor i a soluiilor parenterale, msurarea unor parametri hemodinamici i accesul la
diferite situsuri anatomice.
Inseria cateterelor prin piele expune aceste dispozitive la riscul colonizrii cu microorganisme ale
microbiotei cutanate rezidente, care pot iniia o infecie asociat dispozitivului protetic. Examenul bacteriologic al
acestor dispozitive este justificat n cazul unor infecii generalizate i/sau locale i are ca obiective:
evidenierea colonizrii microbiene a unui cateter (tabelul 49);
diferenierea unei colonizri de contaminarea ce are loc n general la scoaterea dispozitivului (tabelul 50):
se poate recurge la metode cantitative, semicantitative sau calitative (care constau n imersarea
dispozitivului n medii de cultur lichide);
documentarea unei stri septice: se realizeaz sistematic hemoculturi periferice pentru evidenierea
bacteriemiei i pentru excluderea unui alt focar infecios n afara cateterului colonizat;
luarea unei decizii privind instaurarea unui tratament local sau general cu un anumit antibiotic sau
ndeprtarea cateterului.
51

Microorganismele cel mai frecvent ntlnite sunt reprezentate de rezideni ai microbiotei normale: S.
epidermidis (i ali stafilococi coagulazo-negativi), S. aureus, Ps. aeruginosa, Acinetobacter ssp., enterobacterii,
Enterococcus ssp., bacterii corineforme, Candida sp. Studiul bacteriilor anaerobe nu este necesar n acest context.
Tabelul 49. Metode de analiz bacteriologic a dispozitivelor intravasculare in situ
Metoda centrifugare-liz (Isolator Metoda liza Isolator 1,5
Hemocultura n sistem automat
10)
Se recolteaz 2 hemoculturi (10
ml de snge fiecare), prima de la
periferie, la distan de dispozitiv i
a doua de la nivelul acestuia (dup
ndeprtarea primilor 20 ml de
snge).
nsmnarea
sedimentului
rezultat dup centrifugare din
fiecare tub, pe 2-3 placi cu geloz
snge.
Incubare timp de 72 ore n
atmosfer cu 5% CO2.
Numrarea coloniilor (UFC/ml).
Rezultatul este semnificativ dac
nr. UFC/ml obinut din cateter > 5x
nr. UFC/ml obinut din sngele
periferic.

Aceleai etape;
fr centrifugare;
volume mai mici de 1,5 ml;
se utilizeaz n pediatrie.

Se recolteaz 2 hemoculturi (10

ml de snge fiecare), prima de la
periferie, la distan de dispozitiv i
a doua de la nivelul acestuia (dup
ndeprtarea primilor 20 ml de
snge).
Probele se plaseaz n automat.
Se noteaz momentul pozitivrii
celor 2 hemoculturi prelevate de pe
material.
Rezultatul este semnificativ dac
timpul de pozitivare al hemoculturii
recoltate de pe cateter este mai mic
dect cel al hemoculturii periferice.

Tabelul 50. Metode de analiz bacteriologic a dispozitivelor intravasculare dup scoaterea din organism
Se lucreaz pe fragmente de 5 cm provenite de la extremitatea distal pentru cateterele lungi, sau pe toat
lungimea cateterului pentru cateterele scurte.
Metoda
Maki

semicantitativ Metoda cantitativ Cleri

Se ruleaz cateterul pe
suprafaa unei plci de
geloz-snge
sau
de
mediu lactozat cu
ajutorul unei pense sterile
sau al unei pipete Pasteur
(fig. 348);
-incubare 48 ore la 370C.
Cateterul este colonizat
daca nr. UFC/ml > 15 (5
dup unii autori)
Colonizarea se
raporteaz exclusiv la
suprafaa
extern
a
cateterului.
Prezint
sensibilitate
bun, dar specificitate
redus.

Metota
cantitativ Analiza
bacteriologic
Cleri
modificat dup scoaterea unei
(Brun Buisson)
camere implantabile
Se prinde cateterul cu o Cateterul este colectat Se recolteaz serozitile
pens
steril
i
se n 1 ml ser fiziologic de la nivelul camerei
repartizeaz prin orificiul steril;
ndeprtate din organism;
su 1 ml de bulion steril;
-vortexare 1 minut.
-se analizeaz cateterul
- se colecteaz bulionul i Se obine acelai prag printr-o
metod
cateterul ntr-un tub steril;
de pozitivitate ca n cantitativ (Cleri sau
- vortexare 30 secunde;
metoda precedent.
Brun-Buisson);
- nsmnare 10 l bulion
-se spal partea nchis a
pe geloz snge;
camerei i se analizeaz
- incubare 48 ore la 370C.
lichidul de splare printr-o
Cateterul este colonizat dac
metod cantitativ (Cleri
nr. UFC /ml >1000.
sau Brun-Buisson).
Colonizarea se raporteaz la
suprafaa
extern
a
cateterului i la orificiul
dispozitivului.
Prezint sensibilitate i
specificitate bune.

52

Fig. 348. Aspectul culturii obinute prin rularea unui cateter colonizat cu bacterii Gram-negative, lactozofermentative (CLED).

15.10. EXAMENUL CITOCHIMIC I BACTERIOLOGIC AL LICHIDULUI CEFALORAHIDIAN (LCR)

Examenul de laborator al LCR ajut la diagnosticul precoce al meningitei (tabelul 51) i la orientarea
tratamentului. Analiza LCR are caracter de maxim urgen i prioritate.
Meningitele se pot clasifica n: meningite comunitare (ambulatorii) stratificate pe 3 niveluri de vrst
(aduli i copii > 5 ani, sugari i copii < 5ani, nou-nscui) i meningite nosocomiale (care survin la pacienii
imunodeprimai sau cu boli neurochirugicale, fiind favorizate de un traumatism).
Tabelul 51. Etiologia meningitelor
Meningite comunitare
Aduli i copii > 5 ani

Meningite
neurochirugicale

Sugari i copii < 5ani

Str. pneumoniae
Str. pneumoniae
N. meningitidis
N. meningitidis
L. monocytogenes
H. influenzae
S. aureus sau S. epidermidis
Str. pneumoniae
Enterobacteriaceae
Pseudomonas

Nou-nscui
Str. agalactiae
E. coli
L. monocytogenes

Examenul macroscopic i citochimic al LCR (tabelele 52, 53) permite orientarea diagnosticului spre o
etiologie bacterian sau viral. Formula leucocitar nu se poate realiza pe un preparat ce conine sub 10 elemente
celulare/mm3 i este dificil de realizat sub 20 elemente celulare/mm 3.
Tabelul 52. Tipuri de LCR n funcie de caracteristicile macroscopice, citologice i biochimice.
LCR normal
LCR purulent
LCR limfocitar
LCR panache
LCR hemoragic
Aspect macroscopic
apa de stnc
(limpede).
Sub 5 elemente/
mm3 (NB: la nounscui
10-30
elemente/mm3 (50%
polinucleare
neutrofile).
Proteinorahie
normal (mai mic
0.4g/l) i glicorahie
normal (mai mic
de 60% fa de
glicemie).

Aspectul
macroscopic
orienteaz spre o
meningit purulent
(tulbure)
(200
leucocite/mm3).
Mai mult de 10
elemente/mm3
din
care
50%
polinucleare.
Proteinorahie
mai
mare de 0.4 g/l
- hipoglicorahie mai
mic de 40% fa de
glicemie.

Mai mult de 10
elemente/mm3
din
care 50% limfocite.
Proteinorahie
mai
mic de 0.4 g/l.
Hipoglicorahie
nsoit
de
hipoclorurorahie
(mai mic de 40%
fa de glicemie: se
suspecteaz
etiologie bacterian
cu Listeria, BK)
dac glicorahia este
mai mare de 50%
dect glicemia i mai
puin
de
100
elemente/mm3:
se
53

Mai mult de 10
elemente/mm3;
procene egale de
polinucleare
i
limfocite.
Proteinorahie
i
glicorahie normale.
Se poate suspecta:
listerioza, meningita
purulent sau o
meningit
limfocitar la debut,
abces cerebral

Contaminarea LCR
cu hematii se poate
datora
unui
traumatism aprut n
timpul
punciei
lombare sau unei
hemoragii
subarahnoidiene
(asociat
unei
pleiocistoze i uneori
cu hipoglicorahie).
Proteinorahie = 0.1
g/l.

suspecteaz etiologie
viral.
LCR trebuie transportat rapid la laborator (< 30 min), deoarece polinuclearele se lizeaz rapid (50% n 2h),
iar bacteriile sensibile i pierd viabilitatea (de exemplu, meningococul), nsoit de date clinice: vrsta, dignosticul
prezumtiv, tratamente cu antibiotice administrate anterior recoltrii.
Tabelul 53. Principalele caracteristici citologice, biochimice i microscopice ale LCR n funcie de etiologia
meningitei (WHO, 2003).
Parametrul

Tipul de meningit
Bacterian
Tuberculoas
Fungic
Formul leucocitar PMNN
Mononucleare
Mononucleare
modificat
cu
PMNN stadii
predominan:
iniiale
de
dezvoltare.
Glucoza
Foarte sczut 0.28 Sczut:
Sczut:
1.1mmol/l
1.12.2mmol/l
1.12.2mmol/l
Proteinorahie
Ridicat
Ridicat
Ridicat
Frotiu

Bacterii observate la Rareori pozitiv

Pozitiv
coloraia Gram.
(coloraia
Ziehl (Coloraie cu tu de
Neelsen).
China).

Viral
Mononucleare

Normal:
3.63.9 mmol/l
Uor ridicat n
stadiile iniiale ale
infeciilor.
Negativ.

Formula leucocitar se realizeaz din sedimentul obinut dup centrifugare n tuburi conice sterile, cu
ajutorul unei camere de numrare, urmat de o coloraie May-Grunwald-Giemsa sau eozin- albastru de metilen.
Examinarea frotiurilor colorate Gram permite orientarea rapid a diagnosticului etiologic (prezena de coci,
bacili, Gram +/- (fig. 349), prezena capsulei, localizarea intra-/extraleucocitar), corelat cu investigarea prezenei
antigenelor solubile n LCR prin metoda latexaglutinarii .

Fig. 349. Frotiuri colorate Gram din LCR recoltat din cazuri de meningit cu Str. pneumoniae, N. meningitidis, H. influenzae, L.
monocytogenes i respectiv coloraie cu tu de China pentru Cryptococcus neoformans (Tenover i Hirschmann, 1990).

Diagnosticul orientativ rezultat dup examinarea microscopic, biochimic i serologic este transmis
urgent clinicianului.
54

Evidenierea bacteriilor dupa coloraia Gram permite realizarea unei antibiograme utiliznd ca inocul direct
LCR (dac este n cantitate suficient).
Cultivarea
LCR se nsmneaz pe medii mbogite care permit creterea bacteriilor cu exigene nutritive: geloza
snge (pentru Listeria, coci Gram-pozitivi) sau geloza snge suplimentat cu factori de cretere, geloz snge cu
striu de S. aureus (pentru H. influenzae), cu disc de optochin (pentru Str. pneumoniae) incubate la 370C n atmosfer
de 5-10% CO2, medii pentru anaerobi, incubate la 37 0C n anaerobioz, bulion cu extract globular (facultativ) ce
permite diluarea antibioticului prezent n LCR, geloza Sabouraud (n meningita limfocitar la imunodeprimai
SIDA), mediu MacConkey (pentru enterobacterii i ali bacili Gram-negativi fr exigene nutritive).
Mediile vor fi observate dup 1848 ore de incubare la 37 0C i timp de 5 zile.
Examinarea morfologiei coloniilor, afinitii tinctoriale pentru coloranii Gram, testul oxidazei i catalazei
permit orientarea diagnosticului i alegerea galeriei de identificare, a tehnicilor de testare a antibiosensibilitii i a
metodelor de tipizare. Pentru bacilii Gram-negativi i S. aureus, se realizeaz antibograma. n cazul H. influenzae se
recomand investigarea -lactamazelor, pentru N. meningitidis investigarea -lactamazelor care poate aprea n
cazuri excepionale, investigarea sensibilitii sczute la penicilina G prin msurarea diametrului zonei de inhibiie
n jurul discului de oxacilin i prin determinarea CMI, serogruparea, trimiterea ctre un centru de referin, pentru
Str. pneumoniae detectarea rezistenei la -lactamice cu ajutorul discului de oxacilin i determinarea CMI la
penicilina G, amoxicilin, cefotaxim i ceftriaxon (fig. 350). Pentru L. monocytogenes i Str. agalactiae nu se
recomand antibiograma, datorit conservrii sensibilitii acestora la benzil-peniciline.
n cazul unui LCR limfocitar cu hiperproteinorahie, hipoglicorahie i hipoclorurahie se suspecteaz o
meningit tuberculoas i se urmrete investigarea BAAR prin examen microscopic, nsmnarea pe medii de
cultur specifice pentru M. tuberculosis i confirmare molecular.
Creterea pe medii de cultur poate rmne negativ n cazul unei meningite purulente aseptice, rezultat ce
se poate datora unui tratament cu antibiotice sau unei etiologii bacteriene cauzate de o bacterie fastidioas.
n cazul unui aspect i biochimii normale, prezena ctorva colonii izolate de coci Gram-pozitivi sugereaz o
contaminare a LCR n momentul prelevrii. Totui, aceste colonii se vor identifica i se vor raporta.
Pe baza indicaiilor clinice, se vor realiza examinri complementare privind: investigarea prezenei unor
amoebe libere (Naegleria fowleri) sau a unor protozoare flagelate (Tripanosoma) prin microscopie cu contrast de
faz sau pe frotiu colorat Giemsa, examinarea preparatului proaspt cu tu de China pentru evidenierea capsulei la
Cryptococcus neoformans, detectarea prin amplificare genic a bacteriilor cu cretere lent: M.tuberculosis,
Leptospira, Borelia.

55

Fig. 350. Testul sensibilitii la optochin la Str. pneumoniae, antibiograma difuzimetric, i determinarea CMI la penicilin prin E-test.

56

15.11. EXAMENUL BACTERIOLOGIC AL LICHIDELOR DE PUNCIE (LICHIDE PURULENTE,

SEROZITI)
Contaminarea microbian a lichidelor interne (lichid de puncie articular sau sinovial, lichid pleural,
lichid peritoneal, lichid de ascit, lichid pericardic, chisturi tegumentare) care n mod normal sunt sterile, determin
infecii cu un nivel ridicat de morbiditate i mortalitate.
n consecin, metodele de izolare i caracterizare a speciilor bacteriene izolate din aceste situri trebuie s
fie performante, rapide i eficiente, n vederea instituirii ct mai rapide a unui tratament intit.
Bacteriile izolate din aceste infecii pot fi aerobe, facultativ anaerobe sau strict anaerobe (tabelul 54).
Tabelul 54. Etiologia infeciilor cavitilor sterile ale organismului.
Supuraie hepatic
Enterobacteriaceae
Anaerobi
Str. milleri
S. aureus
Enterococcus sp.
Peritonita primar
Str. pneumoniae
E. coli
Peritonita secundar (infecie biliar sau abces)
Enterobacteriaceae
Streptococi
Anaerobi
Enterococcus spp.
Supuraie intestinal
Yersinia pseudotuberculosis
Y. enterocolitica
Salmonella spp
Str. milleri
Peritonita post-chirurgical
Enterobacteriaceae
Enterococcus spp
Anaerobi
Pleurezie
Str. pneumoniae
S. aureus
H. influenzae
Anaerobi
Osteomielita la copil
S. aureus
Osteomielita i spondilodiscita
S. aureus
Enterobacteriaceae
Ps. aeruginosa
Artrita profund
S. aureus
N. gonorrhoeae
Enterobacteriaceae
Streptococcus spp.
H. influenzae
Borrelia burgdorferi
Ps. aeruginosa
Infecii ale protezelor articulare
S. aureus
Stafilococi coagulazo-negativi
Peptostreptococcus.
Prelevarea i transportul probelor (tabelul 55)
Tabelul 55. Metode de recoltare i transport al lichidelor de puncie
Produs patologic

Prelevare

Transport

57

Observaii

Lichide interne (pericardic, Condiii anaerobe: cu seringa,

pleural, abdominal, articular, fr bul de aer i ermetic (
de puncie).
3ml), ntr-un tub steril pentru
examenul bacteriologic sau ntrun tub cu anticoagulant pentru
examenul citologic.
Este necesar recoltarea n
condiii aseptice pentru a evita
contaminarea
probelor
cu
microbiot comensal.
Uneori lichidul recoltat poate fi
utilizat.

Mai scurt de 30 min.,

la 200C.
Pentru investigarea
gonococului
se
folosete ca mediu de
transport
geloza
Stuart.

Hemoculturile
se
preleveaz nainte de
tratamentul
cu
antibiotice.
Trebuie obinut o
cantitate suficient,
deoarece densitatea
inoculului poate fi
redus.
Dac volumul de
lichid recoltat este
mic,
acesta
se
inoculeaz direct ntrun
flacon
de
hemocultur.

Examenul direct:
n situaia unei cantiti mici de lichid (sau n cazul punciei chitilor) se realizeaz un frotiu colorat Gram;
- n situaia unei cantiti suficiente de lichid se realizeaz un frotiu colorat Gram i formula elementelor
figurate.
Cultivarea
- concentrarea probei prin centrifugarea lichidelor interne la 1500g / 30 min. (prin expunere la O 2 exist
riscul distrugerii anaerobilor i al contaminrii probei);
- nsmnare n:
- bulion mbogit (tip cord - creier), incubare n anaerobioz la 37 0C (n medie 4 zile, iar pentru
lichidele articulare 10 zile), cu observare zilnic;
- bulion pentru anaerobi i geloz snge incubat n anaerobioz;
- geloza snge, mediu selectiv pentru bacterii Gram-negative, geloza chocolat incubat n atmosfer
de CO2 la 350C;
- n funcie de context:
- geloza BCYE pentru Legionella;
- mediu cu Tween pentru corinebacterii;
- mediu Sabouraud pentru levuri, Aspergillus (incubare la 22-300C);
- mediu pentru Mycobacterium (incubare 8 sptmni);
- mediu de cultur pentru Nocardia (10 zile).
Interpretarea creterii prespupune analiza comparativ a rezultatelor obinute prin cultivare n aerobioz i respectiv,
anaerobioz. Mediile solide sunt examinate la 24h i 48h. Mediile lichide sunt incubate timp de minimum 10 zile
(pozitivarea culturii demonstreaz existena unei infecii, dar absena culturii se poate datora existenei bacteriei n
cantiti reduse/necultivabile n produsul recoltat).
Prezena unei culturi mixte (>3 specii microbiene, nici unul nefiind predominant) impune identificarea tuturor
speciilor izolate, realizndu-se o corelaie cu simptomatologia pacientului.
Se recomand realizarea antibiogranei pentru speciile izolate i determinarea valorii CMI moleculele folosite
frecvent n tratamentul acestor infecii.
15.12. ANALIZA MICROBIOLOGIC A EXSUDATELOR PURULENTE, A SECREIILOR DE PLAG
I A ABCESELOR
Unul dintre procesele cele mai frecvent asociate bolilor infecioase este producerea unei secreii purulente
(uneori seropurulente) ca rezultat al invaziei bacteriene ntr-o cavitate, esut sau organ (tabelul 56). Exsudatul este
format din leucocite, predominant polimorfonucleare, microorganisme, limf i fibrin.
Comunicarea ntre clinician i microbiolog este deosebit de important n diagnosticul i tratamentul
pacienilor cu infecii supurative. Microbiologul trebuie s colaboreze cu medicul pentru a asigura prelevarea
corect a produsului patologic i transportul rapid la laborator. Dac este posibil, tampoanele de bumbac ar trebui s
fie evitate.
58

Tabelul 56. Etiologia infeciilor supurative cu diferite localizri

Situsul anatomic
Etiologii posibile
Cavitatea peritoneal
Bacterii Gram-negative enterice
Enterococi
Bacili
Gram-negativi
anaerobi
(Bacteroides fragilis)
Clostridii.
Abcese nchise
Coci Gram-pozitivi
Bacili Gram-negativi
Bacterii anaerobe
Amoebe.
Abcese fesiere la locul injectrii Mycobacterium fortuitum-chelonei.
profunde intramusculare a
preparatelor injectabile.
Ganglioni limfatici.
Mycobacterium tuberculosis
Alte micobacterii
Stafilococi
Streptococci
Enterobacterii
Micoze sistemice sau cutanate
(histoplasmoza, sporotricoza).
Abcese subcutanate
Streptococci
Stafilococi.
Ulcer de decubit
Enterobacterii

Ulcere cutanate
Arsuri de gradul II i III

M. ulcerans
M. marinum
Ps. aeruginosa
Stafilococi

Plgi traumatice, mpucate, Cl. tetani

njunghiate,
mucturi
de Cl. botulinum
animale, zgrieturi.
B. anthracis
Pasteurella multocida
Plgi operatorii.
S. aureus
E. coli
Bacteroides fragilis
Cl. perfringens
Infecii postoperatorii (intervenii Actinomicoza (puroi cu aspect de
chirurgicale
stomatologice, granule de sulf).
ORL).

Produs patologic
Produs recoltat chirurgical

Puroi recoltat chirurgical

sau prin puncionare cu
seringa.

Biopsii, aspirate

Exsudate recoltate ntr-o

sering sau ntr-un recipient
steril.
Biopsie.
Exsudate recoltate ntr-o
sering sau ntr-un recipient
steril.
Secreii plag recoltate ntro sering sau ntr-un
recipient steril.
Secreii plag, lichid de
drenaj
recoltate
ntr-o
sering sau ntr-un recipient
steril.
Secreii plag, lichid de
drenaj
recoltate
ntr-o
sering sau ntr-un recipient
steril.

Examinarea macroscopic
Se examineaz aspectul leziunii, prezena gazului, culoarea puroiului care variaz de la verde-galben la maro-rou
(snge sau hemoglobin). Aspiratul dintr-un abces primar hepatic amoebian are o consisten gelatinoas i culoare
maro nchis glbui. Puroiul din rnile postoperatorii sau traumatice poate fi albastru-verde datorit pigmentului
piocianin produs de Ps. aeruginosa.
Consistena puroiului poate varia de la lichid tulbure la una foarte vscoas i lipicioas. Puroiul provenit din
sinusuri trebuie inspectat pentru prezena granulelor galbene, mici, cu aspect de "sulf", care sunt formate de
filamentele de Actinomyces israelii. Prezena granulelor mici de diferite culori (alb, negru, rou, sau maro) este
59

tipic pentru micetom i tumori granulomatoase. Puroiul din leziunile TBC are consisten cazeoas. Mirosul
neplcut, fetid este revelator pentru infecii cu bacterii anaerobe sau pentru infeciile mixte aerobe-anaerobe.
Examinarea microscopic
Examinarea frotiurilor colorate Gram este obligatorie. n cazuri speciale, sau la cererea clinicianului, se examineaz
frotiuri colorate Ziehl-Neelsen.
Frotiurile se fac prin prelevare cu ansa a materialului reprezentativ sau prin descrcarea uoar a tamponului fr
presare excesiv sau frecare.
Se examineaz:
- prezena i cantitatea (apreciere semicantitativ +, ++, +++, ++++) urmtoarelor componente:
- granulocitele polimorfonucleare;
- coci Gram-pozitivi aranjai n grmezi - stafilococi;
- coci Gram-pozitivi n lanuri - streptococi sau enterococi;
- bacili Gram-negativi (E. coli, Klebsiella, Proteus, Serratia, Pseudomonas spp, Bacteroides spp.);
- bacili mari, drepi, Gram-pozitivi cu capete ptrate Cl. perfringens, B. anthracis;
- microbiot mixt anaerob;
- Candida sau alte levuri, pseudofilamente sau filamente miceliene.
La cerere se poate executa i un preparat proaspt lam/lamel n KOH 10% n cazul suspiciunii unei infecii
fungice sau parazitare.
nsmnarea produselor patologice
Se nsmneaz o bucl de ans sau cteva picturi de produs patologic pe:
- o plac de geloz snge pentru izolarea de stafilococi i streptococi;
- o plac de agar MacConkey pentru izolarea bacteriilor Gram-negative;
- un tub de bulion, care poate servi ca mediu de mbogire att pentru aerobi, ct i pentru anaerobi (de exemplu,
bulion tioglicolat);
- agar manitol pentru streptococci;
- disc de bacitracin pentru Str. pyogenes;
- agar Sabouraud pentru fungi;
- mediu Lowenstein-Jensen pentru probele BAAR pozitive;
- puroiul
de
la
pacienii
cu
artrit,
pleurit,
osteit,
sau
celulit,
n
special
de la copiii sub 5 ani, este inoculat pe o geloz chocolat pentru izolarea H. influenzae;
- incubarea plcilor la 35oC, n exicator sau n anaerobioz strict dac aspectul microscopic este de microbiot
mixt anaerob, timp de minimum 48 de ore i maximum 1-2 sptmni.
Dac se obine cretere doar n bulionul de mbogire, frotiurile colorate Gram vor orienta alegerea mediilor de
cultur folosite pentru repicare. Din fiecare tip de colonie se face un frotiu i se coloreaz Gram, care se examineaz
microscopic.
Stafilococii formeaz pe geloz - snge colonii opace, alb-crem, cu diametrul de 1-2 mm, catalaz pozitive.
Speciile de stafilococ de importan medical, S. aureus, S. epidermidis i S. saprophyticus se difereniaz pe baza
testului coagulazei, acidifierii manitolului, producerii de pigment i sensibilitii la novobiocin.
Pasteurella multocida se prezint sub forma unor cocobacili foarte mici, Gram-negativi, imobili care se
dezvolt bine pe geloz snge la 35 oC, dar este complet inhibat de sruri biliare coninute de agarul MacConkey.
Dup incubare peste noapte, formeaz pe geloz snge colonii mici, nehemolitice, translucide i mucoide.
Fermenteaz glucoza fr producere de gaz, este slab pozitiv pentru reacia oxidazei, catalaz pozitiv, reduce
nitraii la nitrii, este ureazo-negativ, indol-pozitiv.
Bacillus anthracis este un bacil aerob, sporulat, Gram-pozitiv care produce pe geloz snge colonii mari,
plate, gri, de pn la 5 mm n diametru, cu o textur rugoas i margini neregulate, cu aspect de cap de meduz.
Spre deosebire de alte specii saprobionte, este nehemolitic, foarte sensibil la benzilpenicilin i imobil.
Administrarea substanelor antimicrobiene nu este suficient pentru tratamentul infeciilor supurative,
tratamentul chirugical (incizie, drenaj i debridare) fiind, n general, mai important. Testarea sensibilitii la
antibiotice nu este necesar pentru microrganismele cu sensibilitate la peniciline, cum sunt streptococii, Pasteurella
i Actinomyces, dar se recomand pentru Enterobacteriaceae, bacili Gram-negativi non-fermentativi i stafilococi.
15.13. EXAMENUL BACTERIOLOGIC AL LICHIDULUI DE DREN
60

Analiza bacteriologic a unui lichid de dren se poate practica n scopul supravegerii unui situs n mod
natural steril. Aceast practic este curent, dar nevalidat clinic, fiind de un interes discutabil. Abordarea permite
analiza produselor recoltate din sisteme de drenaj nchise, diferenierea colonizrii dispozitivului de contaminarea
ce are loc la situsul de inserie sau pe traseul drenului (prin analiza comparativ calitativ i cantitativ a
microbiotei obinute cu cea de la nivelul situsului de colectare).
Dac proba este pozitiv trebuie demonstrat natura infeciei: localizat sau generalizat (n acest ultim caz
hemoculturile sunt pozitive).
Lichidele de dren se examineaz direct pe frotiuri colorate Gram realizate din produsul patologic sau dup
concentrare prin centrifugare i se nsmneaz pe geloz-snge incubat n aerobioz. Antibiograma nu este
obligatorie.
15.14. EXAMENUL BACTERIOLOGIC AL PRELEVATELOR OCULARE
Scopul analizei microbiologice a acestor produse (tabelul 57) este diagnosticul etiologic al infeciilor
oculare prin izolarea agentului etiologic i prevenirea infeciilor post-operatorii prin studiul microbiotei
conjunctivale.
Infeciile oculare pot afecta diferite structuri ale ochiului, fiind localizate la nivelul segmentului anterior:
conjunctivite, keratite (supurative, micotice), uveite anterioare/iridociclite; posterior: corioretinite, retinite,
endoftalmite, panoftalmite sau pot fi infecii perioculare.
Etiologia infeciilor oculare poate varia n funcie de vrst, status imunitar (imunodeficien) i zona
geografic.
Examenul pre-operator previne apariia infeciilor postoperatorii cu bacterii comensale sau patogene
prezente n microbiota conjunctival (tabelul 58). Microbiota normal conjunctival cuprinde: stafilococi
coagulazo-negativi~94%, corinebacterii, neisserii nepretenioase, streptococi, hemofili, fungi saprobioni, S. aureus.
Infeciile preo-operatorii sunt produse n proporie de 25-30% de bacterii patogene, cele mai frecvente fiind cele
Gram-pozitive (75-80%) (tabelul 59).
Tabelul 57. Recoltarea i transportul produselor oculare (adaptat dup REMIC, 2008; Buiuc i Negu, 2009).
Tipuri de infecii
Momentul
Recoltarea probelor
Transportul probelor
prelevrii
Prelevate
Preoperator,
Cu tampoane umectate n ser Transport: 2 h la
conjunctivale
nainte
de fiziologic steril sau micropipete de pe temperatura camerei.
intervenia
suprafaa conjunctivei si/sau din n
cazul
n
care
chirugical.
unghiul intern al ochiului.
examinarea prelevatelor
nu se poate realiza
Pentru
Se recolteaz cel puin 2 tampoane imediat se folosesc medii
diagnostic,
(pentru frotiu i nsmnri).
de transport:
nainte de toaleta
mediu pentru Chlamydia,
local.
Blefarite
1-2 cruste palpebrale, cu pensa steril mediu Stuart pentru alte
Orgelet
Puroiul se preleveaz cu un ac de specii bacteriene.
sering steril.
Dacriocistit
Puroiul se preleveaz de la nivelul
(inflamaia glandelor
glandelor lacrimale palpebrale, prin
lacrimale, cu
presarea sacilor lacrimali.
obstrucia canalelor
lacrimale.
Ulcer corneean
Cu tampon dup efectuarea unei
anestezii locale.
Examenul direct
Nu se realizeaz pentru produsele recoltate pre-operator !
Pentru produsele recoltate n scopul diagnosticului unei infecii:
1.
frotiu colorat Gram permite descrierea microbiotei dominante;
o absena microorganismelor pledeaz pentru o etiologie viral (adenovirusuri, virusuri herpetice,
virusul Epstein Barr);
- frotiu colorat Giemsa permite descrierea aspectelor citologice (prezena polimorfonuclearelor);
61

- imunofluorescen pentru evidenierea bacteriei Chl. trachomatis;

- preparat proaspt pentru evidenierea amibelor libere la pacienii purttori de lentile de contact.
Cultivare
n contextul general se utilizeaz geloza snge/ chocolat incubat n atmosfer de CO 2, la 350C.
n contexte clinice i epidemiologice particulare:
culturi de celule pentru izolarea Chl. trachomatis;
bulion /geloz snge incubate n anaerobioz;
mediu Sabouraud pentru levuri i Aspergillus, incubare la 22-300 C;
medii de cultur specifice pentru Mycobacterium i Nocardia (incubare 8 sptmni n
atmosfer de CO2 la 350C);
medii de cultur pentru amibe libere.
Antibiograma
Att n cazul produselor recoltate pre-operator, ct i n cazul celor recoltate n scop diagnostic, antibiograma se
realizeaz numai pentru bacteriile cu potenial patogen (tabelul 58).
Tabelul 58. Principalele specii bacteriene cu potenial patogen izolate din prelevatele conjunctivale pre-operatorii
(REMIC; 2008).
Potenial patogene
S. aureus, Str. pneumoniae,
Enterococcus faecalis
Bacterii Gram-pozitive
Comensale
S. epidermidis, Corynebacterium sp.
Propionibacterium acnes, Streptococcus spp.
Predomin la pacieni imunodeprimai.
Potenial patogene
Enterobacterii
(Serratia,
Klebsiella,
Proteus,
Enterobacter), Ps. aeruginosa, Haemophilus,
Bacterii Gram-negative
Moraxella, Acinetobacter. Predomin la purttorii de
lentile de contact.
Comensale
Moraxella catarrhalis, Neisseria spp.
Tabelul 59. Principalii ageni etiologici ai infeciilor oculare (adaptat dup REMIC, 2008; Buiuc i Negu, 2009).
Localizare
Context general
Context particular
Conjunctivita
S. aureus, Str. pyogenes, Str. Adult imunodeprimat: Pseudomonas,
(Inflamaia conjunctivei).
pneumoniae, H. influenzae, N. enterobacterii, levuri.
gonorrhoeae,
Moraxella
spp., Persoane vrstnice i copii: N.
enterobacterii.
gonorrhoeae, S. aureus, Str. pyogenes, Chl.
trachomatis, Ps. aeruginosa.
Africa i ri n curs de dezvoltare: M.
tuberculosis, C. diphtheriae,
N. gonorrhoeae, Haemophilus aegyptius,
Chl. trachomatis (trachom-serotipurile A,
B i C i conjunctivit cu incluzii
serotipurile D i K).
Celulite profunde
S. aureus, Str. pyogenes,
Copii <5ani : H. influenzae
(inflamaia tegumentului i Str.pneumoniae, Ps. aeruginosa.
Imunodeprimai sau diabetici: bacterii
a esutului subcutanat
anaerobe i levuri.
adiacent cu localizare
periorbitar).
Celulite cronice.
S. aureus, Str. pyogenes,
Str. pneumoniae, Ps. aeruginosa,
Mycobacterium, Nocardia,
Actinomyces, Aspergillus.
Dacrioadenite i
Profunde: S.aureus, S. pyogenes, Cronice: M. tuberculosis, M. leprae
dacriocistite
S.pneumoniae, H.influenzae
Nocardia, T. pallidum, levuri.
62

Canaliculite
(infecii
cronice
ale
orificiului lacrimal i ale
canalelor lacrimale).
Blefarite
(inflamaia marginii libere
a pleoapelor).
Keratite
(inflamaia corneei)

Endoftalmite
(inflamaii ale esuturilor
intraoculare).

Propionibacterium propionicus

S. aureus, S. epidermidis, uneori Demodex

Moraxella spp.
S. aureus, Str. pneumoniae,
Purttori de lentile de contact: amoebe
Ps. aeruginosa, Klebsiella,
libere, Acanthamoeba, Naegleria.
Enterobacter, Serratia,
Citrobacter,
Proteus,
uneori
micobacterii
atipice,
levuri,
Aspergillus.
Aceleai microorganisme ca i n
cazul keratitelor, la care se adaug:
N. meningitidis, Bacillus cereus,
enterococi, SCN i levuri.

15.15. EXAMENUL BACTERIOLOGIC AL PRELEVATELOR PERINATALE

Contaminarea perinatal se poate produce in utero, la natere sau imediat dup natere.
n cursul dezvoltrii intrauterine, ftul este contaminat pe cale transplacentar, dac mama prezint
bacteriemie cu specii care pot traversa placenta (de exemplu, L. monocytogenes, T. pallidum), consecinele fiind
ntotdeauna severe (avort, natere prematur, malformaii, sindrom infecios congenital).
Infeciile neonatale sunt contactate n timpul naterii, la trecerea prin cile genitale ale mamei. Colonizarea
masiv cu specii patogene sau comensale din microbiota genital a mamei (Chlamydia, N. gonorrhoeae, T.
pallidum, Str. agalactiae grup B, E. coli K1, H. influenzae biotip 4, H. haemolyticus, S. aureus, Streptococcus spp,
Enterococcus spp, enterobacterii, Gardnerella vaginalis, specii strict anaerobe, Mycoplasma, Ureaplasma) poate
conduce la apariia unor procese infecioase severe, manifestate mai ales la nivelul tractului respirator. La etiologia
bacterian, se adaug cea viral (virusuri herpetice, virusuri hepatitice).
Infeciile post-natale sunt dominate de semne meningeene, fiind rezultatul contaminrii n primele 8 ore
dup natere cu microorganisme din mediu sau din microbiota mamei.
Prognosticul infeciilor nou-nscutului este dependent de rapiditatea administrrii tratamentului.
Decizia terapeutic se ia la natere, sau uneori chiar nainte, pe baza unor argumente anamnestice, clinice,
biologice i bacteriologice (tabelul 60).
Tabelul 60. Produse patologice analizate pentru diagnosticul sau prevenirea infeciilor nou-nscutului.
Aspirat gastric

Probe din
orificii i
cutanate

Meconiu

Placent

Lichid amniotic

Endocol

Civa ml de
lichid gastric
prin aspiraie cu
ajutorul
unei
sonde gastrice
nr. 8 montat pe
o sering de 10
ml.

1-3
tampoane
din
situsuri
cutanate
i
orificii
(pliuri
bucale, nas i
conduct auditiv)
, transportate la
temperatura
camerei, pe
mediu de
transport tip
Stuart.
Str. agalactiae,

Recoltat n
primele 24
de ore de la
natere, cu
ajutorul unei
spatule
sterile
(civa ml).

Prelevare cu
ajutorul unui
scalpel steril
dintr-o zon cu
aspect
macroscopic
anormal.

n caz
de
rupere precoce
a apei.
Considerat un
prelevat
din
situs steril.
Recoltare dup
curarea
corect a
exocolului
(0,5 ml).

Str.

Str. agalactiae,

Enterobacterii,

Prelevat
de
endocol realizat
corect
(fr
contaminare
vaginal)
la
ultimul consult
nainte de
data naterii.
Recoltare dup
curarea
exocolului
cu
tampon i AFS.
Diagnosticul
Str.

Str. agalactiae,

63

LCR
Hemocultur
Urin
Secreii
vaginale
Vezi
capitolele
dedicate
produselor
patologice
respective.

E. coli (K1), H.
influenzae, L.
monocytogenes

E. coli (K1),
H.influenzae, L.
monocytogenes

agalactiae,
E. coli (K1),
H.influenzae

E. coli (K1), H.
influenzae, L.
monocytogenes

L.
monocytoge
nes

streptococi,
Listeria,
Haemophilus,
Gardnerella,
alte
bacterii
aerobe
i
anaerobe
comensale ale
cilor genitale.

infeciilor
corioamniotice
ascendente:
Str. agalactiae, E.
coli (K1), H.
influenzae,
L.
monocytogenes

agalactiae,
E. coli
(K1), H.
influenzae,
L.
monocytogen
es.

Transportate la temperatura ambiant n maxim o or de la natere.

nsoite de detalii clinice, ora naterii i a prelevrii probei.
Examinarea direct
frotiuri colorate Gram informative n cazul produselor sterile (aspirat gastric, meconiu);
o prezena unei microbiote monomorfe pledeaz pentru o infecie;
o prezena unei microbiote abundente i polimorfe pledeaz pentru contaminare n timpul recoltrii sau
transportului.
Cultivare
- mediu mbogit (geloz cu snge tratat termic);
- mediu selectiv pentru streptococi i Listeria (geloza snge i acid nalidixic-colistin sau ANC);
- mediu selectiv pentru bacili Gram-negativi;
- mediu solid pentru strict anaerobi din lichidul gastric.
Mediile sunt incubate 48 ore la 370C, iar n cazul mediului cu snge, n atmosfer de 5-10% CO 2.
Antibiograma
Se recomand pentru bacteriile patogene:
- E. coli K1: fenotipuri de rezisten dobndit;
- Str. agalactiae: rezistena la macrolide i cicline;
- H. influenzae: prezena de -lactamaze;
- Listeria: rezistena natural la cefalosporine, rezistena dobndit la macrolide, fluoroquinolone, cotrimoxazol.
Observaii:
Trebuie identificate speciile cu risc, considerate patogene.
Prezena unei specii dominante n 2 prelevate din situsuri diferite este considerat semn de infecie.
Tulpinile de Listeria sunt trimise la centrul de referin.
Determinarea grupului capsular K1 de E. coli se face prin aglutinare pe lam.
15.16. IZOLAREA I IDENTIFICAREA BACTERIILOR ANAEROBE
n patologia infecioas cu bacterii anaerobe etiologia este reprezentat de specii anaerobe rezidente ale
esutului cutanat (Eubacterium, Propionibacterium, Peptostreptococcus), ale cavitii bucale (Porphyromonas,
Bacteroides, Peptostreptococcus, Fusobacterium, Veillonella, Actynomyces, Bifidobacterium), tractului respirator,
mucoasei vaginale (Lactobacillus +++, Prevotella sp., Prevotella pigmentes, Prevotella disiens,
Peptostreptococcus ssp.), colonului (Bacterioides grup fragilis +++, Bilophila wadworthia, Peptostreptococcus
ssp., Clostridium spp., Bifidobacterium spp., Eubacterium spp.) (tabelul 61). Ea include abcese cerebrale, infecii
oculare, sinuzite, infecii bucale i dentare, complicaii ale anginei Vincent, actinomicoze, infecii pleuropulmonare,
endocardite, abces hepatic, septicemie (5-10% din hemoculturi sunt pozitive pentru anaerobi), infecii
intraabdominale, colite pseudomembranoase, peritonite, infecii de tract genital, mionecroze, supuraii nchise (cu
miros fetid), infecii situate n vecintatea mucoaselor (bucal, anal, genital), cu supuraie cu aspect granular de
culoare galben, infecii secundare aprute dup mucturi, injecii intramusculare, traumatisme, intervenii
chirurgicale la nivelul tractului digestiv, cilor genitale, de ortopedie, toxiinfecii sau intoxicaii. n mai mult de
80% din cazuri, infeciile sunt mixte, cu bacterii aerobe sau aero-anaerobe i strict anaerobe. Cea mai mare parte
dintre aceste bacterii se dezvolt lent.
Tabelul 62. Frecvena de izolare a diferitelor specii de anaerobi n supuraiile mixte.
64

Supuraii
abdominale

Secreii
purulente
genitale

Pneumonie
ab ingestis

Abcese
pulmonare,
pleurezii
purulente
+
+

Infecii
supurative
n sfera
ORL
(+)
(+)

esuturi
moi

Bacteroides fragilis +++

(+)
/
+
Bacteroides
grup ++
(+)
(+)
+
fragilis
Prevotella bivia
/
+++
/
0
0
Prevotella oralis
/
+
+++
+++
++
+
Porphyromonas spp. /
+
(+)
(+)
+
++
Fusobacterium
/
+
++
+++
++
/
nucleatum
Fusobacterium
/
/
/
/
++
/
necrophorum
Peptostreptococcus
+
++
++
++
++
++
spp.
Actinomyces spp.
/
++
+
++
++
(+)
Cl. perfrimgens
++
/
+
/
0
+
+++ tulpini izolate n majoritatea cazurilor din produsele patologice respective;
+ i ++20-80%;
(+)10-20%.
Prelevarea produselor patologice pentru diagnosticul bacteriilor anaerobe
Recoltarea trebuie precedat de dezinfecie cu iod, apoi cu alcool 70%, urmat de puncionarea focarului de infecie
cu sering sau pipet Pasteur, sau cu chiureta n profunzime, evitnd formarea bulelor de aer; recoltarea este de
preferat s se fac n laborator, n caz contrar, proba se introduce ntr-un flacon cu mediu de transport pentru
anaerobioz (mediu ce conine un gaz fr O 2, mediu gelozat - Portagerm, TGVanaerob, Port A Cul sau soluie
tampon care permite supravieuirea bacteriilor n anaerobioz mai mult de 48 de ore i un indicator de anaerobioz,
de exemplu, rezasurina) sau ntr-o sering nchis la ambele extremiti. Recoltarea cu tamponul este interzis.
n laborator, anaerobioza poate fi asigurat cu mai multe dispozitive: gaz-vacuum (2 ore), saci de
anaerobioz, din plastic, nchii ermetic, jar cu anaerobioz (15 minute), camer cu anaerobioz (cu atmosfer
5:15:80/H2:CO2:N2 sau cu catalizator de Pd). Este necesar verificarea anaerobiozei cu un indicator oxido-reductor
(band de hrtie de filtru impregnat cu albastru de metilen sau rezasurin).
Etapele diagnosticului microbiologic
La examenul macroscopic se poate constata supuraie (abces submaxilar sau cervical, pleurezii purulente,
peritonite, abcese genitale), cu aspect de granule de S, cu miros neplcut datorit produilor finali de metabolism,
fluorescen roie, esuturile sunt necrotice datorit pigmenilor produi de bacilii Gram-negativi pigmentai.
La examenul microscopic coloraia Gram variabil este sugestiv pentru o infecie cu bacterii anaerobe.
Examenul microscopic al frotiului realizat direct din produsul patologic evideniaz microorganisme sporulate sau
un polimorfism accentuat, iar culturile incubate n aerobioz ramn sterile.
n funcie de morfologie i afinitatea tinctorial, diagnosticul poate fi orientat ctre diferite genuri i/sau
specii:
- cocobacili Gram-negativi: Prevotella, Prophyromonas, Haemophylus;
- bacili Gram-negativi fini efilai: Fusobacterium, Capnocytophaga;
- bacili foarte lungi, Gram-negativi, cu un capt punctat, iar cellalt ptrat: Leptotrichia;
- coci de dimensiuni mici, Gram-negativi: Veillonella;
- bacili Gram-pozitivi, sporulai: Clostridium;
- bacili Gram-pozitivi, nesporulai: Actinomyces, Propionibacterium, Bifidobacterium, Eubacterium.
Izolarea necesit medii gelozate, cu numeroi factori de cretere i selectivitate ridicat, datorat adaosului
de antibiotice. nsmnarea produsului patologic se realizeaz pe:
- mediu Schaedler cu snge, vancomicin (7,5 mg/l) i neomicin (75mg/l). Acest mediu permite izolarea
Bacteroides grup fragilis, Prevotella, Fusobacterium;
- geloz Columbia cu snge i feniletilalcool (4,2g/100ml), specific pentru bacteriile Gram-pozitive i
Porphyromonas;
65

pentru Clostridium: TSN, geloz cu glbenu de ou i neomicin, respectiv Columbia cu snge,

cicloserin i cefoxitin pentru C. difficile;
- ntotdeauna trebuie asociat un mediu lichid pentru anaerobi, repicat dup 48-72 de ore pe geloz
selectiv.
Toate mediile pentru anaerobi trebuie regenerate (pentru eliminarea O 2) nainte de utilizare pe baie Marie, la
100o C, timp de 20 minute.
Gelozele repartizate n coloan nalt se incubeaz n aerobioz.
Jarurile de anaerobioz se deschid la cel puin 24 de ore de incubare, iar n unele cazuri la 48 de ore.
De obicei, pe mediile de anaerobi apar colonii cu caractere diferite, care uneori reprezint forme disociate
ale aceleiai specii. Coloniile au miros fetid, adesea sunt pigmentate i sunt diferite i n general mult mai
mari dect cele crescute pe mediile incubate n aerobioz.
Se face examenul microscopic pentru fiecare morfotip n parte.
Morfotipurile se nsmneaz pe medii lichide mbogite cu vitamina K1 i hemin de pe care se
realizeaz testul indolului, catalazei, ureazei i aerotoleranei (cretere n atmosfer de CO 2 5%).
Dac la examenul microscopic se observ bacili, se realizeaz o serie de teste enzimatice: pentru producerea
de hemolizine, fosfolipaze (lecitinaz), lipaze, proteaze, fermentarea glucidelor, hidroliza esculinei,
seroneutralizare i toxinotipie i stabilirea tipului fermentativ, dup incubare timp de 48 de ore n mediu
TGY, urmat de extracia alcoolilor i acizilor volatili cu eter etilic i analiza cromatografic i respectiv,
prin esterificarea i extracia compuilor nevolatili.
Din fiecare morfotip se realizeaz o preidentificare cu ajutorul unei miniantibiograme: vancomicin,
colistin, metronidazol, verde briliant, sruri biliare, SPS (sodiu polietanol sulfat) (tabelul 62).
Tabelul 62. Miniantibiograma folosit n diferenierea genurilor de bacterii anaerobe.
Vancomicin
Kanamicin Colistin Rezisten SPS
Metronidazol
5 g
10 g
10 g
la
bil
4 g
bovin 2
%
Grup B. fragilis
R
R
R
+
S
Prevotella
R
R
V
S
Porphyromonas
S
R
R
S
B. meolitycum
R
S
S
S
Fusobacterium
R
S
S
V
S
Weillonella
R
S
S
S
Pepstostreptococcus
S
R
R
V
S
S
anaerobius
Pepstostreptococcus sp. S
S
R
V
R
S
Clostridium
S
S
R
V
S
Eubacterium
S
S
R
+
S
Actinobacterium
S
S
R
R
Bifidobacterium
S
S
R
+
R
Propionibacterium
S
S
R
V
R
Diferenierea anaerobilor facultativi aparinnd clasei Actinobacteria (Actinomyces, Actinobacterium,
Arcanobacterium, Bifidobacterium, Propionibacterium, Eubacterium) se realizeaz cu ajutorul testelor API pentru
anaerobi.
Sensibilitatea la antibiotice
Bacterioides grup fragilis sunt rezistente la numeroase antibiotice. Unele specii sunt secretoare de lactamaze, altele sunt rezistente la metronidazol. Antibioticele recomandate a fi testate pentru diferite specii sunt
prezentate n tabelul 63.
Tabelul 63. Antibiotice studiate pentru bacterii anaerobe
Bacterioides grup fragililis
Amoxicilin,
66

amoxicilin+acid

clavulanic,

Ali bacili Gram-negativi (Prevotella, Fusobacterium)

Coci Gram+ i bacili Gram+ nesporulai
(Propionibacterium, Actinomyces)
Clostridium

cefoxitin, cefotaxim, imipenem, clindamicin,

metronidazol.
Amoxicilin, amoxicilin+acid clavulanic,
metronidazol.
Penicilin,
metronidazol,
vancomicin,
ofloxacin (pentru Propionibacterium)
Ampicilina,
amoxicilina+acid
clavulanic,
metronidazol, vancomicin, clindamicin.

15.17. DIAGNOSTICUL INFECIILOR CU MICOBACTERII

n ultimele decenii, pandemia global HIV, mbtrnirea populaiei, degradarea condiilor socio-economice,
au determinat creterea incidenei tuberculozei. Imunodepresia datorat SIDA a favorizat apariia infeciilor cu M.
avium, dar i cu multe alte micobacterii nontuberculoase, cunoscute sau descoperite cu ocazia infeciilor sistemice
aprute la pacienii imunodeprimai. Dei tratamentul mpotriva tuberculozei i-a dovedit eficacitatea, apariia
tulpinilor multirezistente i dezvoltarea infeciilor sistemice provocate de micobacteriile nontuberculoase, necesit
descoperirea unor noi molecule de antibiotice. Risc crescut de mbolnvire prezint persoanele vrstnice, pacienii
imunodeprimai, persoanele cu situaie economic precar, imigranii din ri cu endemie tuberculoas, deinuii,
personalul medical n contact cu pacienii TBC.
Speciile de micobacterii cel mai frecvent ntlnite n diferite tipuri de infecii sunt:
infecii pulmonare: M. avium - intracellulare, M. kansasii, M. xenopi, M. malmoense;
infecii ganglionare: M. avium - intracellulare, M. kansasii, M. scrofulaceum;
infecii cutanate: M. marinum, M. ulcerans, M. chelonae, M. leprae;
supuraii i ulceraie: M. avium-intracellulare, M. kansasii, M. xenopi, M. abcessus, M. chelonae;
infecii sistemice: M. avium - intracellulare, M. kansasii, M. xenopi, M. haemophilum, M. gevanense.
Recoltarea produselor patologice
Sputa
Reprezint 80 - 85% din numrul probelor analizate pentru infecie cu micobacterii. Sputa se recolteaz
dimineaa (2-5 ml), dup cltirea cavitii bucale i un efort de tuse pentru eliminarea secreiilor acumulate n timpul
nopii. Produsul recoltat este trimis rapid la laborator i conservat la +4C. Pstrarea la frigider 24 sau 48 ore nu
influeneaz calitatea rezultatului final. Pacienii care nu pot s expectoreze vor fi ajutai de un maseur
kinetoterapeut sau se va recurge la tubaj gastric, care permite prelevarea direct din stomac a secreiilor bronice
nghiite involuntar n timpul somnului.
Lichidul gastric aspirat dimineaa, pe nemncate, este centrifugat la 3000 rpm, timp de 20 minute.
Sedimentul obinut (2 ml) va fi tratat pentru decontaminare.
La pacienii intubai (din reanimare) se recolteaz secreiile traheale prin introducerea unei sonde de
aspiraie, produsele fiind manipulate i tratate ca i sputa.
Fibroscopia permite recoltarea produselor direct din zona cu leziuni sub forma de:
- aspirat bronic diluat n ap distilat steril, tratat ulterior ca i sputa;
- raclaj endobronic obinut cu ajutorul unei mici perii care va fi plasat n lichidul de transport (1ml),
tratat ca i sputa;
- lichid de lavaj bronho-alveolar (obinut prin inundarea segmentului pulmonar cu 200 ml AFS i
reaspirarea lichidului); dup centrifugare, sedimentul (2 ml) este tratat ca o sput.
Urina se recolteaz pe parcursul unei zile, dup restricie hidric n seara precedent, este centrifugat la
1600-2000 g (30000 rpm), iar sedimentul va fi decontaminat.
LCR
Sedimentul rezultat dup o centrifugare de 20 minute, 1600 g, este etalat pe lam pentru colorare.
Lichidele pleurale, de ascit i articulare, puroiul de abces sunt utilizate direct (dac lichidul este
tulbure, purulent) sau dup centrifugare (lichid clar, limpede) pentru colorare i nsmnare pe medii adecvate.
nsmnarea const n inocularea tuburilor cu mediu cu ou, fr alte tratamente, la o diluie a produsului 5/6 pri
ADS.
La pacienii imunodeprimai cu infecii generalizate, micobacteriile pot fi evideniate n hemoculturi,
mieloculturi, materii fecale.
67

Biopsia de endometru permite izolarea micobacteriilor care produc tuberculoza genital la femei.
Fragmentele de organe recoltate steril de ctre chirurg sunt mojarate, omogenizate i folosite pentru
nsmnarea mediilor speciale.
Probele se recolteaz nainte de nceperea tratamentului sau dup minimum 3 zile de la ncetarea acestuia.
Deoarece emisiile bacilare sunt discontinue, trebuie realizate 3 recoltri n 3 zile succesive.
Pentru izolarea micobacteriilor nu se folosesc produsele fixate cu formol.
Examenul microscopic
Se realizeaz pe frotiuri din produsul patologic sau din sedimentul de centrifugare obinut dup
fluidificarea-decontaminarea produsului patologic contaminat. Se utilizeaz coloraia Ziehl-Neelsen i coloraia cu
auramin. n tehnica Ziehl-Neelsen, bacilii acido-alcoolo rezisteni (BAAR) apar roii pe fond albastru. Citirea se
face la obiectivul cu imersie (x 100).
Frotiul colorat cu auramin este examinat la microscopul de fluorescen (x 25. B.A.A.R apar fluoresceni,
strlucind pe fondul negru al preparatului).
Citirea frotiului este cantitativ:
Numr de BAAR
Rspuns
<1 bacil/100 cmpuri
Negativ
1-9 bacili/100 cmpuri
+ suspect se repet
10-99 bacili/ 100 cmpuri
++
1-9 bacili/ cmp
+++
10-99 bacili/ cmp
++++
> 100 bacili/ cmp
+++++
nsmnarea produselor patologice
Obinerea unei culturi este foarte important pentru diagnosticul bacteriologic, pentru c teoretic, toi bacilii
vii dau natere unei descendene.
Prelevatele care sunt n mod normal sterile (LCR, lichid pleural, pericardic, auricular, mduva osoas,
snge) sunt inoculate direct pe mediu de cultur fr un alt tratament prealabil, n timp ce produsele contaminate
sunt supuse decontaminrii (tratamentul cu baze, acizi, detergeni, permite eliminarea microbiotei comensale cu
conservarea micobacteriilor, iar fluidificarea probei prin lichefiere permite eliberarea micobacteriilor).
Mediile de cultur
Mediul Lovenstein-Jensen, cu ou, este mediul de referin recomandat de UICTMR (Uniunea Internaional
Contra Tuberculozei i a Maladiilor Respiratorii). Dac este mbogit cu piruvat, permite o cretere mai bun a
micobacteriilor disgonice (M. bovis).
Mediul gelozat Middlebrook 7H10-7H11 este utilizat pentru antibiogram.
Mediile lichide Middlebrook 7H9-7H12-7H13, Dubos i Kirchner, sunt medii de mbogire, ce conin
antibiotice (polimixin, amfotericin, acid nalidixic, trimetoprim, azlocilin, vancomicin).
Mediile 7H12 i 7H13 utilizate n metoda Bactec 460 conin acid palmitic marcat cu carbon 14.
Metabolizarea acidului palmitic de ctre micobacterii este corelat cu apariia 14CO2 dozat printr-o cifr care
reprezint Indicele de Cretere (IC).
O serie de metode moleculare (hibridizarea in situ, PCR) sunt utilizate n prezent pentru diagnosticul infeciilor cu
micobacterii, n special M. tuberculosis.
Identificarea micobacteriilor
Prima etap a identificrii const n verificarea caracterului de acido-alcoolo-rezisten a bacteriilor prin
coloraia Ziehl-Neelsen.
Se noteaz de asemenea, timpul de apariie al coloniilor sau detecia unui IC suficient.
Pentru culturile obinute pe mediul solid, se verific existena unui singur tip de colonii. M. avium poate
forma 2 tipuri de colonii.
Se examineaz caracterele de colonie (dimensiune, caracterul neted sau rugos, pigmentaie la ntuneric,
dup expunerea la lumin sau absena pigmentului), care permit orientarea diagnosticului spre complexul
tuberculosis, sau spre o specie non tuberculosis.
Astfel, pe culturile dezvoltate pe mediu solid, coloniile complexului tuberculosis sunt nepigmentate. Pentru
diferenierea speciilor complexului tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, BCG), se recurge la
68

metode clasice biochimice: se pune n eviden producerea de acid nicotinic (testul niacinei), existena unei nitratreductaze, influena piruvatului asupra culturii, creterea sau inhibiia creterii n prezena TCH, pirazinamid,
cicloserin (tabelul 64).
n mediul lichid, dac IC atinge sau depete 300 se realizeaz hibridizare cu sonde specifice.
Tabelul 64. Caractere difereniale ntre diferite specii de micobacterii tuberculoase.
Specia
Cretere n TCH
PZA
CS
Nitrat*Testul
prezena
2mg/l 200mg/l 30mg/l reductaza
niacinei
piruvatului
M.
R
S
S
+
+
tuberculosis
M.africanum
+
S(v)
S
S
- (v)
(v)
M. bovis

M. bovis var.
BCG

Metoda Virtanen, TCH hidrazida acidului tiofen 2 carboxilic; PZA pirazinamida; CS cicloserina; v- variabil; R- rezistent; S sensibil.

Micobacteriile non tuberculosis

M. avium-intracellulare formeaz colonii nepigmentate, de 2 tipuri: i) netede, transparente i ii) opace,
rugoase, formate din cocobacili acido-alcoolo-rezisteni.
M. kansasii formeaz colonii fotocromogene, cu cretere eugonic, rugoase, constituite din bacili groi.
M. gordonae formeaz colonii scotocromogene (pigmentate la ntuneric), groase, netede, constituite din
bacili de dimensiuni medii.
M. xenopi formeaz colonii mici, cu cretere lent, favorizat de piruvat, constituite din bacili lungi,
filiformi.
Dac aspectul coloniilor nu este evocator, se realizeaz identificarea biochimic (fig. 351). Testele
biochimice sunt realizate i interpretate cu dificultate, necesitnd tulpini de referin care trebuie ntreinute.
Cromatografia acizilor micolici extrai din peretele micobacteriilor se face prin HPLC, permind obinerea
profilului caracteristic speciei.

69

2 tuburi LJ
nvelite n hrtie de
aluminiu

nlturarea hrtiei
de pe un tub

Pigment
Lipsa pigmentului
Tulpini
scotocromoge
ne

Expunerea la lumin
natural 2 ore

Grup II
Runyon

Tulpini
necromogen
e

Pigment
+/Galeria de
Identificare
Nitrat reductaz
Citrat de sodiu
Manitol
Inozitol

70

Galeria de
Identificare

Tulpini
fotocromogene

Nitrat reductaz

Grup III Runyon

Hidroliza Tween
Ureaz
Fosfataz acid
Sensibilitate la
antibiotice

Grup I Runyon
Galeria de
Identificare

Galeria de

Nitrat reductaz

Identificare
Nitrat reductaza
Hidroliza Tween

Hidroliza Tween
Ureaz
Fosfataz acid

Ureaz
Fosfataz acid
Sensibilitatea la
antibiotice

Catalaz
Sensibilitate la
antibiotice

Grup IV Runyon corespunde micobacteriilor cu cretere rapid

(colonii care apar n mai puin de 7 zile)

Fig. 351. Schema de tipizare a micobacteriilor non-tuberculoase

Tipizarea tulpinilor se realizeaz prin tehnica RFL, n care, dup digestia enzimatic a moleculei de ADN
cromosomal sunt obinute fragmente al cror numr i dimensiune variaz n funcie de tulpina analizat i de
enzima utilizat. Fragmentele obinute sunt separate prin electroforez. Metoda care const n identificarea
numrului de secvene IS 6110, ce variaz n funcie de tulpin, permite, dup migrarea electroforetic i transferul
pe o membran de nylon, realizarea unei hibridizri cu o sond specific.
Studiul sensibilitii la antibiotice
Pentru micobacteriile complexului tuberculosis, realizarea antibiogramei prin metoda proporiilor este
standardizat (Canetti, Rist, Grosset) i se poate realiza pe mediu solid sau lichid.
Pe mediu solid
a. Metoda proporiilor const n determinarea pentru tulpina de studiat a proporiei de mutante rezistente
la un antibiotic, obinute dup cultivarea pe medii solide ce conin concentraii critice de antibiotice i comparate cu
numrul bacteriilor viabile din acelai inocul nsmnate pe medii fr antibiotice.
b. Antibiogramele sunt realizate n mediu cu ou impregnat nainte de coagulare cu patru antibiotice de
baz (tuberculostaticele majore): izoniazida, rifampicina, etambutolul, streptomicina. Dac este vorba de
micobacterii izolate n timpul unei recidive, sau de tulpini rezistente, antibiograma se completeaz cu studiul
activitii antibioticelor din a doua categorie (de rezerv): pirazinamida, amikacina, cicloserina, etionamida,
ofloxacina, sparfloxacina.
c. Pe mediul de cultur cu antibiotice se pot nsmna: sedimentul de centrifugare al produsului patologic
sau diluiile suspensiei microbiene.
71

d. Citirea se face la 21 zile i const n compararea proporiilor obinute pentru tulpina de studiat cu
proporiile critice standardizate (1%). Astfel, cnd proporia observat cu tulpina de studiu este mai mic de 1%,
tulpina este sensibil, n caz invers, este rezistent.
n mediu lichid
a. Se utilizeaz aceeai metod a proporiilor, dar stabilite prin metoda radiometric care msoar
cantitatea de 14CO2 produs n prezena i n absena antibioticului. Dac IC msurat n flaconul cu antibiotic este
1% din cel al flaconului martor, tulpina este considerat sensibil.
Pentru micobacteriile non tuberculoase, metoda de studiu este mai puin standardizat.
Pentru
micobacteriile cu cretere lent (M. avium, M. kansasii, M. xenopi) sunt testate rifampicina, rifabutina,
claritromicina sau azitromicina, ofloxacina / sparfloxacina, amikacina, iar pentru cele cu cretere rapid ( M.
fortuitum, M. marinum, M. chelonae, M. abcessus): rifampicina, rifabutina, claritromicina sau azitromicina,
doxiciclina sau minociclina, imipenem.
Detectarea rapid, n 24 de ore a rezistenei la rifampicin a micobacteriilor din complexul
tuberculosis se bazeaz pe amplificarea prin PCR a genei rpo B, urmat de hibridizare pentru evidenierea
mutaiilor specifice (tehnica LIPA - Line Probe Assay).
15.18. EVIDENIEREA POTENIALULUI DE PATOGENITATE I VIRULEN PRIN TESTE
IN VITRO
Determinarea capacitii de aderen i invazie a tulpinilor bacteriene la un substrat celular
Modelul utilizeaz ca substrat celular sensibil liniile celulare HEp-2 (Human Epithelioma), HeLa (carcinom
de col uterin) sau CaCo-2 (linie de celule intestinale, de origine tumoral - Carcinom Colonic). Pentru cultivarea
acestei ultime linii este necesar adugarea la mediul pentru culturi celulare a unui supliment nutritiv numit I.T.S.
(Insulin Transferrine Selenium)- Sigma, care permite obinerea unui monostrat cu confluen 80% pentru
realizarea testului de aderen n 48 de ore, aceste celule avnd n mod normal o cretere foarte lent in vitro.
Celulele sunt cultivate n mediu Eagle MEM (EMEM) (Gibco), cu adaos de 10% ser fetal de viel, glutamin 1%,
soluie penicilin-streptomicin 1%, soluie fungizon 1%, ITS 1%. Se utilizeaz culturi de 18 ore n bulion nutritiv
din care se prepar suspensii bacteriene n TFS, cu densitate optic D.O. = 2 (msurat spectrofotometric la =
600 nm), care corespunde densitii celulare de 1 x 10 9 U.F.C./ml (Lazr, 2003).
Determinarea calitativ a capacitii de aderen
Se adaug cte 1 ml de suspensie bacterian peste monostratul celular, dup ndeprtarea mediului de
cretere suplimentat cu antibiotice i splarea (de 3 ori) cu mediu fr antibiotice.
Dup repartizarea suspensiilor bacteriene peste monostratul celular, plcile se incubeaz la 37C, pentru 2
ore, timp n care bacteriile ader la suprafaa celulelor substratului; se spal monostratul celular infectat, cu TFS
(3x); se fixeaz cu metanol (5 min.); se coloreaz celulele aderate cu soluie Giemsa- 20 min; se spal godeurile cu
ap de robinet; se usuc i se examineaz la microscop cu O.I., determinndu-se pattern-ul de aderen (localizat,
difuz sau agregativ) (fig. 352) i indicele de aderen (numrul de celule cu bacterii aderate /100 celule numrate).

72

Fig. 352 a. Imagine de microscopie optic care evideniaz aderena de tip localizat a unei tulpini de Staphylococcus
aureus la celulele HeLa (coloraie Giemsa, x1000).

Fig. 352 b. Imagine de microscopie optic care evideniaz aderena de tip agregativ a unei tulpini de Staphylococcus
aureus (stg.) i respectiv Ps. aeruginosa (dr.) la celulele HeLa (coloraie Giemsa, x1000).

Fig. 352 c. Imagine de microscopie optic care evideniaz aderena de tip difuz a unei tulpini de Streptococcus
pyogenes (stg.) i respectiv Ps. aeruginosa (dr.) la celulele HeLa (coloraie Giemsa, x1000).

Determinarea cantitativ a capacitii de aderen i invazie

Fiecare tulpin de testat se va inocula n 2 godeuri cu monostrat celular. Dup primele 2 ore de incubare se
adaug cte 1 ml de mediu cu gentamicin ntr-unul din cele 2 godeuri. Adugarea gentamicinei are rolul de a omor
toate bacteriile din mediul extracelular, supravieuind doar bacteriile care au invadat celulele substratului. n
godeurile fr gentamicin se va determina numrul total de bacterii aderate i invazive.
Plcile se incubeaz la 37C, timp de o or; se ndeprteaz mediul i se spal monostratul celular cu TFS
(3x), pentru ndeprtarea bacteriilor neaderate; se adaug n toate godeurile cte 1 ml Triton X-1% n TFS/godeu i
se incubeaz 5 minute la 37C pentru eliberarea bacteriilor aderate i a celor invadante intracelulare; se fac diluii
zecimale din suspensiile din fiecare godeu (pn la diluia 1/10 8) n ap fiziologic steril (AFS), care se
nsmneaz n triplicat (cte 10 l din diluiile obinute), pe geloz nutritiv repartizat n plci, pentru
determinarea U.F.C./ml (se face media numrului de colonii crescute pentru cele trei replici ale fiecrei diluii
nsmnate).
n godeurile fr gentamicin se determin numrul de celule aderate i invadante, iar n cele cu
gentamicin se determin numrul de celule invadante (internalizate). Interpretarea rezultatelor se bazeaz pe
compararea ordinelor de mrime ale numrului de celule viabile (U.F.C./ml) din suspensiile utilizate ca inocul
pentru fiecare tulpin bacterian testat i din suspensiile celulare din compartimentele plcilor multi-well, dup
realizarea celor dou modele experimentale pentru aprecierea capacitii de aderen + invazie i respectiv invazie.
Determinarea capacitii de aderen la substratul inert - testul producerii de slime (pelicul)
Factorul slime (exopolizaharid hidrofil secretat de unele tulpini care mediaz aderena celulelor bacteriene
la suprafee inerte, abiotice) este un indicator al gradului de rezisten i al capacitii de supravieuire a tulpinilor
bacteriene n mediul extern i poate constitui un factor de virulen, n cazul infeciei unui organism gazd, prin
73

blocarea procesului de fagocitoz. Tulpinile bacteriene sunt cultivate pe geloz cu snge de berbec, incubat timp de
24 h la 37oC. Pentru fiecare tulpin se obin din cte o colonie, dou suspensii bacteriene identice n ap peptonat
(repartizat cte 1 ml n tuburi de diametru de 12 mm), incubate timp de 24 h la 37 oC. Dup incubare, tuburile sunt
golite de cultura bacterian, splate de 3 ori cu ap de robinet, uscate la temperatura camerei, colorate cu soluie
alcoolic de safranin 1% - 30 min, splate de 2 ori cu ap de robinet i uscate. Prezena inelului rou pe pereii
interiori ai tuburilor se nregistreaz ca rezultat pozitiv, iar absena inelului rou ca rezultat negativ (fig. 353).

Fig. 353. Evidenierea semicantitativ a producerii de slime.

Evidenierea cantitativ a gradului de aderen la substratul inert se poate realiza prin metoda
microtitrrii. n acest scop, suspensiile microbiene de densitate cunoscut se nsmneaz n mediu lichid repartizat
n plci cu 6/12/24/96 de godeuri, se incubeaz la 24 h la 37 oC. Dup incubare plcile sunt golite de cultura
bacterian, splate de 3 ori cu ap de robinet, fixate cu metanol rece timp de 5 min, colorate cu cristal violet 1% - 15
min, splate cu ap de robinet, resuspendate cu acid acetic 33%. Intensitatea culorii suspensiei colorate, direct
proporional cu capacitatea de aderen la substratul inert, se msoar spectrofotometric (A490 nm) (fig. 354 ).

Fig. 354. Evidenierea cantitativ a producerii de slime pirn metoda microtitrrii.

Evidenierea hemolizinelor. Hemolizinele sunt enzime extracelulare care acioneaz n patogeneza

diferitelor specii bacteriene ca toxine formatoare de pori. Bacteriile produc mai multe tipuri de hemolizine,
evideniate prin diferite teste: hemoliza hematiilor de berbec (evidenierea factorul hemolitic Kanagawa) sau teste
de sinergism pentru evidenierea hemolizinelor incomplete, solubile, termostabile, de tip factori CAMP-like
74

(Christie, Atkins, Munch-Petersen, 1944, Munch-Petersen i Chirsite, 1947) , care produc hemoliza hematiilor doar
n prezena unei sfingomielinaze C (toxina beta) produse de o tulpin de S. aureus. Dintre hemolizine, cea de tip
Kanagawa are rol de enterotoxin, a crei aciune toxic a fost demonstrat n teste de patogenez experimental
(determin acumularea de lichid n ansa ligaturat de iepure, ceea ce demonstreaz inducerea formrii porilor n
enterocite i alterarea pattern-ului secretor al acestor celule).
Detectarea producerii de hemolizine se evideniaz prin nsmnarea bacteriei de cercetat pe geloz
repartizat n plci Petri cu adaus de 5% snge de berbec sau snge de iepure (evidenierea hemolizinelor
Kanagawa). Dup incubare la 370C timp de 24 h se vizualizeaz apariia zonelor de hemoliz n jurul coloniilor, sub
forma unui halou transparent, clar, caracteristic pentru tulpinile -hemolitice (care realizeaz o hemoliz complet,
n care hemoglobina eliberat din hematii sub aciunea -hemolizinelor este degradat total pn la produi finali de
metabolism) sau verzui/roz, caracteristic tulpinilor -hemolitice care realizeaz o hemoliz parial, n care
hemoglobina este degradat parial de ctre bacterii, la methemoglobin). Zona de hemoliz poate fi accentuat prin
pstrarea plcilor la frigider cteva ore nainte de citirea rezultatelor (fig. 355).

Fig. 355 a. Colonii beta-hemolitice de Str. pyogenes (stg.) i S. aureus (dr.).

Fig. 355 b. Cultur alfa-hemolitic de Str. pneumoniae (stg.) i nehemolitic de S.epidermidis (dr.).

Testul de evideniere a factorului CAMP i a factorilor CAMP-like

Unele bacterii posed hemolizine incomplete, care pot induce formarea porilor n membrana eritrocitelor
doar n prezena unei enzime solubile denumite sfingomielinaza C, secretat de tulpini de S. aureus -hemolitice.
Pentru detectarea acestor factori CAMP sau CAMP-like, tulpinile de cercetat se nsmneaz n striuri paralele pe
geloz-snge, iar perpendicular pe aceste striuri, la 2 mm distan, se o tulpin de S. aureus -hemolitic ATCC
25923. Prezena factorului CAMP este indicat de apariia unei zone sinergice, mrite, de hemoliz complet la
extremitatea striurilor din vecintatea tulpinii de S. aureus -hemolitic, cu aspect de sgeat, n timp ce pe restul
lungimii striului de cultur se observ hemoliz incomplet sau chiar absena acestui caracter (Pasteur Inst., 2000).
Testul CAMP este utilizat pentru identificarea tulpinilorlor de Str. agalactiae i Listeria monocytogenes,
productoare de factori CAMP (Murphy, 1952; Groves i Welshimer, 1976; Wilkinson, 1977). Tulpinile de Str.
agalactiae pot fi utilizate pentru confirmarea tulpinilor de Clostridium perfringens n testul numit CAMP inversat,
n care factorul CAMP produs de streptococul de grup B permite evidenierea sfingomielinazei produse de
Clostridium (Gubash, 1978; Hansen i Elliot, 1980; Buchanan, 1982) (fig. 356).

75

Fig. 356a. Reprezentarea schematic a tehnicii de realizare a testului CAMP.

Fig. 356b. Evidenierea factorului CAMP la tulpini de Stretpococcus agalactiae i Vibrio cholerae.

Lecitinazele i lipazele sunt enzime implicate n patogeneza unor tulpini bacteriene prin capacitatea lor de a
induce formarea porilor n membrana celulelor eucariote, prin alterarea coninutului lipidic al acesteia. Astfel, n
cursul infeciei aceste enzime pot aciona ca toxine formatoare de pori, fiind responsabile de simptome ca diareea
apoas caracteristic infeciei holerice. Pentru evidenierea producerii de lecitinaz, tulpinile sunt nsmnate n
spot pe mediu solid cu glbenu de ou i incubate la 37 o C pn la 7 zile. Prezena unei zone transparente n jurul
ariei de cretere indic producerea lecitinazei (fig. 357a). Pentru evidenierea producerii lipazei tulpinile sunt
nsmnate n spot pe mediu solid cu adaos de Tween 80 n concentraie final de 1% i incubate la 37 o C pn la 7
zile. Prezena unei zone opace (de precipitare) in jurul ariei de cretere indic producerea de lipaz (fig. 357b).

Fig. 357a. Evidenierea lecitinazelor pe mediu cu glbenu de ou (stg.) i respectiv, pe mediu cu lecitin (dr.).

76

Fig. 357b. Evidenierea lipazelor, pe mediu cu TWEEN-80.

Proteazele sunt enzime extra-celulare cu specificitate sczut, care hidrolizeaz proteinele la peptide i
aminoacizi, implicate n distrugerea esuturilor gazdei i n progresia infeciei. Pentru evidenierea producerii
proteazelor, tulpinile sunt nsmnate n spot pe medii solide cu cazein sau cu gelatin, i incubate 24 h la 37 oC.
Prezena unei zone de precipitare/clarificare n jurul ariei de cretere indic proteoliza cazeinei/gelatinei (prezena
cazeinazei/gelatinazei).

Fig. 358. Evidenierea cazeinazei pe mediu cu cazein (stg.) i respectiv a gelatinazei pe mediu cu gelatin (dr.) .

Producerea DNA-azei: tulpinile sunt nsmnate n spot pe geloz cu ADN i meninute timp de 24 h la 37 o
C. Dup incubare, peste culturile n spot se adaug cteva picturi de soluie HCl 1N, clarificarea zonei n jurul ariei
de cretere fiind nregistrat ca reacie pozitiv (Fig. 359).
Nucleazele stafilococice sunt enzime termorezistente, elaborate de tulpinile patogene coagulazo-pozitive n
proporie de 90-95%.

77

Fig. 359. Evidenierea DN-azei pe mediu cu ADN, dup inundarea plcii cu HCl.

Mucinaza joac un rol foarte important n virulena unor tulpini bacteriene i reprezint un complex
enzimatic care scindeaz mucina gastric, favoriznd accesul microorganismelor la receptorii specifici de pe
suprafaa celulelor epiteliale. n acelai timp produii de hidroliz ai mucinei ,,tapeteaz celulele bacteriene i le
protejeaz de aciunea nociv a pH acid i a altor molecule implicate n aprarea anti-infecioas la nivelul
mucoaselor. Pentru evidenierea producerii mucinazei tulpinile sunt nsmnate n spot pe mediu cu mucina din
stomac de porc i incubate la 35 oC pn la 7 zile, activitatea enzimatic fiind determinat prin prezenta unui halou
transparent n jurul ariei de cretere, accentuat dup inundarea plcii cu soluie Lugol 1:2:300 (fig. 360).

Fig. 360. Evidenierea mucinazei pe mediu cu mucin de porc.

Hidroliza esculinei. Esculina este hidrolizat la glucoz + esculetol. n prezena citratului de Fe (FeC 6H5O7)
(FeIII) din mediu, esculetolul eliberat sub aciunea unei -galactozidaze genereaz formarea unui precipitat negru
de esculetin feric, compus cu Fe, fenolic cu structur chimic incert. S-a demonstrat c esculetolul poate fixa
chelatorii de fier (de tipul transferinei), furniznd astfel ionii de Fe necesari celulelor bacteriene pentru activarea
unor gene i exprimarea unor factori de virulen (n spe, toxina holeric). Rolul esculetolului este foarte
78

important la bacteriile patogene extracelulare, deoarece n mediul extracelular, cantitile de Fe liber sunt foarte
reduse, majoritatea ionilor de Fe circulnd n forma legat.

Esculetol

Bibliografie
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.

Van Dyck E., Meheus A.Z., Piot P. 1999. Laboratory diagnosis of sexually transmitted diseases. Geneva,
World Health Organization
Leigh D.A., Williams J.D. 1964. Method for the detection of significant bacteriuria in large groups of patients. Journal of Clinical Pathology. 17:
498503.
Kilian M., Borrow P. 1976. Rapid diagnosis of Enterobacteriaceae. 1. Detection of bacterial
glycosidases. Acta Pathologica et Microbiologica Scandinavica, Section B 84:245251
O Farell N. 2002. Donovanosis. Sex Transm Infect;78:452-457
Begg N. 1994. Manual for the management and control of diphtheria in the European region. Copenhagen,
WHO Regional Office for Europe.
Tenover F. C., Hirschmann J. V. 1990. Interpretation of Gram stains and other common microbiologic slide preparations.
Hammond G. 1978. Public Health Image Library, CDC
Buiuc D., Negut M. 1999. Tratat de Microbiologie Clinica, Ed.Medicala, Bucureti
Mihescu Gr., Chifiriuc Carmen, Diu Lia Mara, 2007. Microbiologie general, Editura Universitii Bucureti
Mihescu Gr., Chifiriuc Carmen, Diu Lia Mara, 2007, Antibiotice i substane chimioterapeutice antimicrobiene, Editura Academiei Romne
Mihescu Gr., Chifiriuc Carmen, Ciugulea I., 2005, Toxine i substane potenial toxice, Editura Academiei Romne
Mihescu Gr. Microbiologie general i Virologie, 2000, Editura Universitii Bucureti.
Lazar V. 2003. Aderena microbian, Ed. Academiei Romne
Pasteur Institute. 2000. Cours de Bacteriologie Medicale. Travaux Pratiques. Milieux de culture et techniques, Institut Pasteur Centre de
lEnseignement,

Ordinul MSP 1301/2007 /MO 617/06.11.2007 privind aprobarea Normelor privind funcionarea laboratoarelor de analize medicale
Standardul 15189 - Laboratoare medicale. Cerine particulare pentru calitate i competen
Contract- cadru privind condiiile acordrii asistenei medicale n cadrul sistemului de asigurri sociale de snatte pentru anul
2009
Ordinul MSP 1301/20.07.2007; SECIUNEA a 9-a. Managementul calitii. Controlul intern de calitate i evaluarea extern a
calitii n laboratorul de analize medicale.
Blbie V. i Pozsgi N. 1985. Bacteriologie medical volumul I i II, Ed. medical
Buiuc D. i Negu M. 2009. Tratat de microbiologie clinic, ed. A III-a, Ed. medical
Murray P.M. 1998. Pocket guide to Clinical Microbiology; 2nd Ed. ASM-Press, Washington DC
Murray P.M. 2007. Clinical Manual of Microbiology
Isenberg H.D. 2004. Clinical Microbiology Procedures Handbook; Second Edition, vol. 1-3
CLSI. 2010. Performance Standards for Antimicribial Susceptibility Testing; Clinical and Laboratory Standard Institute
MICROBIOLOGICS. Asigurarea calitii microorganismelor. Pstrare Procesare ntreinere
WHO. 2003. Basic laboratory procedures in Clinical bacteriology, 2 nd Ed.
Hopkins B.T. 2005. Laboratory Notes. Guide to Laboratory and Diagnostic tests
REMIC. 2008. Refrentiel en Microbiologie mdicale, Socit Franaise de Microbiologie, Collection Vivactis plus ditions
BE EN ISO 8402/1995. Quality management and quality assurance. Vocabulary.
ISO Guide 30:1992. Terms and definitions used in connection with reference materials
EA- 04/10. 2002. Accrediation for microbiological laboratories
ISO/IEC 17025:2005. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories
OUG 65/2005. Ordonanta de urgenta privind modificarea si completarea Legii nr. 53/2003 - Codul muncii, oug nr. 65/2005
L53/2005. Proiect de Lege pentru aprobarea Ordonanei de urgen a Guvernului nr. 8/2005 privind modificarea i completarea
Legii nr.67/2004 pentru alegerea autoritilor administraiei publice locale
ISO/TS 11133-1:2009. Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Guidelines on preparation and production of culture
media -- Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory
USP US Pharmacopeia. Reference Standards
Brooks G.F., Caroll K.C., Butel J.S., Morse S.A. eds. 2007. Jawetz, Melnick, & Adelberg's Medical Microbiology, 24th Edition
http:// www.accessmedicine.com

79

42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.

Buchanan A. G. 1982. Clinical laboratory evaluation of a reverse CAMP test for presumptive identification of Clostridium
perfringens. J. Clin. Microbiol. 14:761762.
Christie N. E., Atkins N. E., Munch-Petersen E.. 1944. A note on a lytic phenomenon shown by group B Streptococcus. Aust. J.
Exp. Biol. Med. Sci. 22:193195.
Darling, J. F. 1975. Standardization and evaluation of CAMP reaction for the prompt, presumptive identification of Streptococcus
agalactiae (Lancefield group B) in clinical material. J. Clin. Microbiol. 1:171174.
Groves R. D., Welshimer H. J. 1977. Separation of pathogenic from apathogenic Listeria monocytogenes by three in vitro
reactions. J. Clin. Microbiol. 5:559563.
Gubash S. 1978. Synergistic hemolysis phenomenon shown by an alpha-toxin producing Clostridium perfringens and streptococcal
CAMP factor in presumptive streptococcal grouping. J. Clin. Microbiol. 6:480488.
Hansen M. V., Elliott L. F. 1980. New presumptive test for Clostridium perfringens: reverse CAMP test. J. Clin. Microbiol.
12:617619.
Munch-Petersen E., Christie R. 1947. The effect of the interaction of Staphylococcus b toxin and group B streptococcus substance
on red blood corpuscles and its use as a test for the identification of Streptococcus agalactiae. J. Pathol. Bacteriol. 59:367371.
Murphy J. M., Stuart O. M., Reed F. I.. 1952. An evaluation of the CAMP test for the identification of Streptococcus agalactiae
in routine mastitis testing. Cornell Vet. 42:133147.
Wilkinson H .W. 1977. CAMP-disk test for presumptive identification of group B streptococci. J. Clin. Microbiol. 6:4245.

80