2

[MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR, CEPA / IMAPA,

ANUL II]

METODELE DE STERILIZARE UTILIZATE N

LABORATOARELE DE MICROBIOLOGIE
n majoritatea cazurilor, o prim condiie pe care trebuie s o ndeplineasc
materialele folosite pentru examinarea, cultivarea i pstrarea n laborator a diferitelor
microorganisme este sterilitatea. Operaiunea prin care este asigurat aceast condiie se
numete sterilizare. Ea const n distrugerea sau ndeprtarea microorganismelor dintr-un
spaiu sau de pe o suprafa dat.
Sterilizarea se efectueaz cu ajutorul agenilor fizici, mecanici i chimici.

STERILIZAREA PRIN AGENI FIZICI

I. STERILIZAREA PRIN CLDUR
Cldura sub form uscat i umed reprezint unul din cei mai importani ageni de
sterilizare.
Microorganismele n stare vegetativ sunt omorte n 10 minute la temperaturi de 500
60 C cldur umed i 6o-80 0 C cldur uscat, iar sporii bacterieni , dup 20 de minute la
temperaturi cuprinse ntre 100 -1200C cldur umed i 140 -1800C cldur uscat.
1. Sterilizarea prin cldur uscat
Cldura uscat omoar prin accelerarea reaciilor de oxidoreducere celular, asfixie,
coagularea proteinelor sau carbonizare (Boldizar E.i colab., 2002).
Microorgaismele n stare vegetativ sunt omorte de cldura uscat n aproximativ 10
minute la 60 -800 C.
Metodele de sterilizare cu ajutorul cldurii uscate sunt: flambarea, nclzirea la rou,
sterilizarea cu aer supranclzit i incinerarea.
1.1.
Flambarea - este cea mai simpl metod de sterilizare, ce const n trecerea
repetat prin flacra becului de gaz, la intervale scurte (3-4 secunde), a obiectului
de sterilizat.

[MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR, CEPA / IMAPA,

ANUL II]
Flambarea se folosete n mod curent pentru sterilizarea
suprafeei lamelor de sticl, a suprafeei pipetelor Pasteur, a gurii
eprubetelor, flacoanelor i altor recipiente din sticl n care urmeaz s
se efectueze nsmnri sau din care se recolteaz material microbian.
Se mai pot steriliza prin flambare suprafeele faianate sau
din inox, grilajul metalic al cutilor pentru animale etc.
1.2. nclzirea la rou (fig. 1) - const n inerea unui obiect
metalic n flacr, pn la nroirea acestuia. Aceast metod este
folosit pentru sterilizarea firului metalic al ansei de nsmnare, i a
spatulei de cauterizat suprafaa organelor.
1.3. Sterilizarea cu aer supranclzit
n acest scop se folosesc etuvele - cuptoare metalice variate ca
modele i denumiri (cuptor Pasteur, etuv, sterilizator Poupinel, cuptor
Arnold), nclzite electric (fig. 2).
Prin aceast metod se sterilizeaz sticlria de laborator (plcile
Petri, pipetele gradate, eava fuzibil din care se confecioneaz
pipetele Pasteur etc.), mojarele i alte obiecte din porelan, aparatele
de filtrat, instrumentarul metalic fr suduri n cositor.

Fig. 2 - Etuva de sterilizare cu aer

supranclzit

Obiectele din sticl i porelan destinate sterilizrii se spal, se usuc i se nvelesc n

hrtie alb de mpachetat, iar instrumentarul se introduce n casolete nchise. n prealabil,
eprubetele se inchid cu dop de vat nvelit n tifon sau cu capac metalic, pipetele gradate se
oblitereaz cu vat la extremitatea prin care se aspir, iar eava fuzibil, la ambele capete.
Materialele astfel pregtite se aeaz pe rafturile etuvei, lsnd spaii ntre ele pentru ca
aerul cald s poat circula i s asigure temperatura de sterilizare n toat incinta.
Sterilizarea prin etuvare se realizeaz de obicei la parametrii de 180 0 C , timp de 30 de
minute .
Culoarea brun i friabilitatea crescut a hrtiei constituie indicii c sterilizarea a fost
bine fcut.
1.4. Incinerarea se efectueaz n cuptoare speciale sau crematorii, avnd drept
scop distrugerea cadavrelor, a produselor organice contaminate (excreii, secreii), a
materialelor de unic folosin dup utilizare (seringi, mnui, pansamente etc.).

[MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR, CEPA / IMAPA,

ANUL II]

Toate cele patru metode de sterilizare prin cldur uscat asigur o

sterilizare complet, n sensul c distrug att microorganismele vegetative ct i
cele sub form de spori.
2. Sterilizarea prin cldur umed
Cldura umed este mai eficient dect cldura uscat deoarece este mai
penetrant.
2.1.
Sterilizarea prin fierbere
Sterilizarea prin fierbere se realizeaz n sterilizatoare electrice sau nclzite cu bec
de gaz, timp de 30 de minute din momentul n care apa atinge 100 0 C i d n clocot. Prin
fierbere se sterilizeaz de regul instrumentarul chirurgical, seringile i acele de inoculare.
Pentru protejarea instrumentelor metalice de aciunea nociv a srurilor din apa de robinet
se recomand fierberea n ap distilat, la care se poate aduga borax pentru a mpiedica
ruginirea. Adugarea boraxului sau a carbonatului de sodiu 2-3% ridic totodat punctul de
fierbere al apei la 104 0 C.
Fierberea reprezint o metod de sterilizare incomplet, deoarece nu asigur
distrugerea tuturor sporilor bacterieni. Pe acest considerent, obiectele sterilizate prin
fierbere pot fi utilizate numai n primele 24 ore de la ncheierea operaiunii. Folosirea dup
acest interval , presupune repetarea fierberii.
2.2. Sterilizarea cu vapori de ap sub presiune (autoclavarea) este cea mai
eficient metod de sterilizare. Aparatul necesar pentru aceast metod, capabil s reziste
la o presiune de cel puin 3 atmosfere, se numete autoclav i are urmtoarele pri
componente, indiferent de detaliile constructive (fig.3):
- cazanul metalic cu perei dubli (peretele extern este gros, iar cel intern mai subire
i prevzut cu orificii la partea superioar) ntre care se introduce ap distilat prin plnia de
umplere;
- un capac metalic masiv cu garnitur de cauciuc, care asigur nchiderea ermetic
prin nurubarea unor buloane;
- tubul de nivel confecionat din sticl, care funcioneaz pe principiul vaselor
comunicante, indicnd nivelul apei din autoclav ;
- robinetul de evacuare a aerului la nceputul autoclavrii i a vaporilor, la terminarea
ei;
- robinet de evacuare a apei din autoclav;
- manometru pentru msurarea presiunii din cazan;
- supapa de siguran care se deschide cnd presiunea vaporilor depete limita de
siguran;
- sursa de cldur (arztor de gaz sau rezistene electrice)

[MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR, CEPA / IMAPA,

ANUL II]

Fig. 3 - Autoclav clasic: A (schem) i B; Autoclav orizontal cu programare digital (C).

Legenda schemei: 1-capac, 2-buloane; 3-plnie de umplere; 4-corpul autoclavului; 5orificii; 6-tubul de nivel; 7-manometru; 8-supapa de siguran; 9-robinet de evacuare
vapori; 10-robinet de evacuare ap; 11-sursa de nclzire; 12-suport; 13 I 14-materiale
de sterilizat.

Autoclavele nu sunt prevzute cu termometru deoarece temperatura aburului din

cazan se coreleaz cu presiunea, aa nct n funcie de presiunea stabilit, exist trei
programe uzuale de autoclavare (Tabel 1).

Tabel 1
Programe de autoclavare

Nr.
progra
m
1
2
3

Presiunea(atm)

Temperatura (0 C)

Timpul de sterilizare(min)

0,5
1
2

115
121
134

90
30
10

[MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR, CEPA / IMAPA,

ANUL II]

n mod obinuit, autoclavarea se realizeaz folosind programul numrul 2.

Prin autoclavare se sterilizeaz toate materialele care nu sunt afectate de
temperatur, presiune sau umiditate. n laboratoarele de microbiologie se autoclaveaz:
majoritatea mediilor de cultur, serul fiziologic, aparatele din sticl cu garnituri din cauciuc,
infectele din laborator (placile din sticl i eprubetele ce conin culturi microbiene vechi,
pipetele Pasteur folosite i alte materiale contaminate nainte de refolosire sau distrugere).
Obiectele de sterilizat se introduc n autoclav, aezate n containere cu pereii perforai sau
n couri speciale din srm. Dopurile de vat ale recipientelor cu medii de cultur sau alte
lichide de sterilizat, trebuie protejate prin acoperire cu hrtie legat cu sfoar pentru a evita
ptrunderea vaporilor de ap sub presiune.
Etapele autoclavrii:
- se verific i, dac este cazul, se completeaz nivelul apei din cazan;
- se introduc containerele cu materialele de sterilizat i se nchide capacul;
- se pune n funciune sursa de nclzire lsnd deschis robinetul de evacuare a
aerului pn cnd vaporii din autoclav se elimin sub form de jet continuu;
- se nchide robinetul i se urmrete acul manometrului, care indic creterea
presiunii;
- se regleaz intensitatea sursei de nclzire n aa fel nct presiunea i temperatura
s se menin la parametrii corespunztori programului de autoclavare ales;
- dup epuizarea timpului de sterilizare, se ntrerupe sursa de cldur, iar cnd
indicatorul manometrului revine la poziia zero se deschide robinetul de evacuare a
vaporilor (deschiderea robinetului nainte ca presiunea s ajung la zero determin reluarea
brusc a fierberii lichidelor din recipiente, pe care risc s le sparg);
- se deschide capacul iar materialele se scot dup uscare i rcire (mai ales
flacoanele cu lichide care, n contact cu aerul rece, pot s explodeze).
La autoclavele moderne temperatura i timpul de sterilizare pot fi programate
electronic, facilitnd munca personalului din laboratoare.
Periodic, se impune controlul eficienei procesului de sterilizare, care se realizeaz
prin indicatori chimici la fiecare ciclu de sterilizare i indicatori biologici, pentru
verificarea sptmnal.
Indicatorii chimici sunt substane cu punctul de topire fix i apropiat de parametrii
termici ai sterilizrii prin etuvare i autoclavare (tabelul 2).
Tabelul 2

Indicatorii chimici pentru controlul sterilizrii

INDICATORI PENTRU ETUV

Substana
Punctul de topire
chimic
Tiouree
180 0 C
Sulfametoxipiridazi
180-182 0 C
n

INDICATORI PENTRU AUTOCLAV

Substana
Punctul de topire
chimic
Floarea de sulf
115 0 C
1,3,5-Tribromfenol

120 0 C

Acidul benzoic
Fenacetina

121-122 0 C
134 0 C

Aceste substane se introduc n tuburi de sticl, n amestec cu un colorant i se

[MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR, CEPA / IMAPA,

ANUL II]

distribuie n incinta aparatelor, printre materialele de sterilizat. La terminarea operaiunii se

verific tuburile, iar dac substana chimic s-a lichefiat nseamn c s-a atins temperatura
respectiv.
La ora actual, se gsesc n comer etichete de aplicat pe ambalaje, impregnate cu
substane chimice care, prin virajul culorii, dau informaii asupra respectrii ambilor
parametri: temperatura i timpul ct s-a meninut temperatura de sterilizare.
Ca indicator biologic al sterilizrii prin autoclavare se folosete o suspensie de spori
de Bacillus stearothermophilus (specia cu cel mai rezistent spor la cldura umed) n fiole
cu medii de cultur i o substan de culoare violet. Dup sterilizare, fiolele se incubeaz la
37 C, 24 de ore, mpreun cu o fiol martor, care nu a fost supus sterilizrii. Absena
cultivrii i meninerea culorii violet n fiolele sterilizate certific distrugerea sporilor. Virarea
culorii n galben, asemntor martorului, denot faptul c operaia nu a fost corect
executat.
2.3. Tindalizarea (sterilizarea prin nclzire fracionat)
Aceast metod preconizat de Tyndall n 1877, se utilizeaz pentru sterilizarea unor
produse biologice termolabile, care se denatureaz la 120: mediile de cultur cu glucide,
mediile cu ou i alte substane proteice , serul coagulat etc.
Tindalizarea se efectueaz n baia de ap sau n autoclav, dar fr a stnge capacul i
lsnd deschis robinetul de evacuare a aburilor.
Metoda asigur o sterilizare complet prin nclzirea produsului la temperaturi ntre
60 i 100C, timp de 30 de minute , repetnd aceast operaiune de nc dou ori la
intervale de 24 de ore. n intervalul dintre expuneri, produsele respective sunt meninute la
37 C sau la temperatura camerei
La prima nclzire se distrug doar formele vegetative; sporii eventual prezeni, rezist.
Umiditatea i condiiile termice optime permit germinarea sporilor pe parcursul celor 24 de
ore, formele vegetative care rezult fiind distruse la al doua nclzire. nclzirea din a treia zi
se face pentru a asigura sterilizarea, distrugnd forme vegetative rezultate din sporii care
au supravieuit dup cel de-al doilea tratament termic.
2.4. Pasteurizarea este un procedeu conceput de Pasteur pentru distrugerea
microbilor responsabili de degradarea vinurilor.

Fig. 4 - Pasteurizator SISTEMUL

HTST (temperatura ridicata in timp
scurt)

Fig. 5 - Tanc de pasteurizare lapte

[MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR, CEPA / IMAPA,

ANUL II]

Pasteurizarea const n nclzirea lichidelor la temperaturi ntre 55-95C, o singur

dat, perioada de expunere termic fiind invers proporional cu temperatura. n funcie de
parametrii utilizai, exist urmtoarele variante:
1. pasteurizarea joas: 60-65 C 30 minute;
2. pasteurizarea medie: 70-75 C 10-20 minute;
3. pasteurizarea nalt: 80-85 C cteva secunde.
Metoda este larg folosit n industria laptelui , n vinificaie, n industria berii i a
buturilor rcoritoare, viznd distrugerea microorganismelor patogene ce pot fi vehiculate
prin aceste produse i prelungirea perioadei de conservare.
Deoarece pasteurizarea este o metod de sterilizare incomplet, refrigerarea
imediat la 4C este necesar pentru inhibarea multiplicrii bacteriilor care au rezistat
expunerii termice i pentru evitarea germinrii sporilor.
n comparaie cu autoclavarea, metoda prezint avantajul c nu modific calitile
organoleptice ale alimentelor i nu depreciaz vitaminele i enzimele.
Ultrapasteurizarea (uperizarea) const n nclzirea instantanee la 150 C a
lichidului de sterilizat prin injectarea vaporilor de ap supranclzii. Este o meod de
sterilizare complet care se aplic n principal laptelui, berii i sucurilor din fructe. Produsele
sterilizate prin acest procedeu poart pe ambalaj inscripia UHT (Ultra High Temperature) i
au o perioad de valabilitate nelimitat.

II. STERILIZAREA PRIN RADIAII

1. Sterilizarea prin radiaii ultraviolete
Razele ultraviolete (U.V.) cu lungimi de und cuprinse ntre 2540-2800 A au un
puternic efect microbicid datorat aciunii lor asupra acizilor nucleici.
Sursele de radiaii UV sunt lumina solar i lmpile de UV, care genereaz radiaii cu
lungimea de und de 2357 A n urma descrcrilor electrice ntre doi electrozi plasai n
atmosfer de vapori de mercur.
Un dezavantaj major al acestor radiaii este slaba lor penetrabilitate, motiv pentru
care, lmpile cu vapori de mercur se folosesc doar pentru sterilizarea aerului i a
suprafeelor (mese, obiecte, console) din slile de operaie, boxele de nsmnare,
laboratoare.
2. Sterilizarea prin radiaii ionizante
Radiaiile a cror lungime de und este situat sub 2.000 A au un efect bactericid
foarte puternic, datorat puterii mari de penetrare. Ele acioneaz prin ionizarea apei cu
formare de radicali toxici hidroxil (OH-), care acioneaz asupra componentelor celulare, n
special ADN, provocnd dereglarea funciile vitale ale microorganismelor i moarte.
Principalele categorii de iradiaii ionizate sunt: radiaiile gamma, radiaiile alfa, beta, razele
X, razele cosmice.
La ora actual radiaiile ionizante, cum sunt cele emise de cobaltul radioactiv (Co 60)),

[MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR, CEPA / IMAPA,

ANUL II]

sunt utilizate la scar industrial pentru sterilizarea obiectelor din material plastic de unic
utilizare (serigi, sisteme de perfuzie, mnuI chirurgicale, plci Petri, pansamente etc.) i a
unor medicamente degradabile prin cldur.

STERILIZAREA PRIN AGENI MECANICI

FILTRAREA reprezint trecerea unui lichid sau gaz printr-un material poros. Este
metoda de sterilizare a unor lichide degradabile prin cldur (medii de cultur, ser sanguin,
soluii de antibiotice etc.) i de decontaminare a aerului.
Filtrelor cu pori de 0,22 m rein majoritatea bacteriilor (cu excepia unor bacterii
flexibile ca spirochtele sau micoplasmele), iar filtrele cu pori de 0,01 m sunt capabile s
rein inclusiv virusurile mici, realiznd o sterilizare perfect.
nafar de folosirea ca metod de sterilizare, filtrarea mai are i alte utilizri, cum
ar fi separarea toxinelor, enzimelor i a vitaminelor de microorganismele productoare, sau
separarea virusurilor de substraturile celulare care le-au multiplicat.
n funcie de materialul din care sunt confecionate i de diametrul porilor, filtrele
au o anumit denumire comercial i un indicativ.

Fig. 6 - Filtre bacteriologice clasice

Filtre Seitz: a-placa filtrant din azbest; b- armtur metalic constituit dintr-o pies
superioar i una inferioar; 2. Bujie filtrant (Berkefeld sau Chamberland)

Filtrele bacteriologice clasice - bujii filtrante din porelan (filtre Chamberland),

pmnt de infuzorii (filtre Berckefeld), plci filtrante din azbest impregnate cu caolin (filtre
Seitz) sau sticl poroas (filtre Schot) sunt nlocuite n prezent cu membrane din acetat de
celuloz (filtre Millipore) (fig. 7) sau mase plastice (filtre Sartorius) montate n dispozitive
care asigur filtrarea prin aspirare sau prin presiune pozitiv.

[MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR, CEPA / IMAPA,

ANUL II]

Fig. 7 Sterilizare prin membran filtrant (Millipore)

STERILIZAREA PRIN AGENI CHIMICI

Pentru sterilizarea prin ageni chimici este folosit n general termenul de
dezinfecie. n acest scop sunt utilizate substane chimice cu efect microbicid (omoar
microbii) sau microbiostatic (mpiedic multiplicarea microbilor fr a-i distruige) n funcie
de concentraie, cunoscute sub denumirea de dezinfectante i antiseptice. Acestea au o
toxicitate neselectiv (pentru microorganisme, dar i pentru celula animal) acionnd prin
lezarea membranelor celulare, alterarea acizilor nucleici, denaturarea proteinelor structurale
sau blocarea gruprilor funcionale ale enzimelor.
Diferena dintre cele dou categorii ine de utilizarea lor.
Dezinfectantele sunt puternic microbicide dar prezint toxicitate crescut pentru
esuturile organismelor superioare, fiind utilizate numai n distrugerea microbilor de pe
substraturi inerte (obiecte, pardoseli, mijloace de transport, surse de ap etc.)
Antisepticele au efect bacteriostatic i prezint o toxicitate relativ redus pentru
organismele vii, fapt care permite aplicarea lor pe tegumente i mucoase n scopul
prevenirii sau extinderii infeciilor.
Este posibil ca aceeai substan chimic s fie utilizat att ca antiseptic ct i ca
dezinfectant, n raport de concentraie.
Substanele chimice dezinfectante mai frecvent utilizate n laboratoarele de
microbiologie sunt menionate n tabelul 3:
Tabelul 3
Ageni sterilizani chimici de uz curent
Nr.
Crt
.
1.

2.
3.

Denumirea substanei
Soluia de clorur mercuric
(sublimat coroziv) 1
Amestecul sulfo-cromic (100g
bicromat de K +2000ml ap
distilat +1000g acid sulfuric
ethnic)
Alcool medicinal

Utilizare
- dezinfecia meselor, suprafeelor din sticl, faiant ,
material plastic.
- dezinfecia minilor.
- dezinfecia pipetelor i a lamelor ntrebuinate.
(la schimbarea culorii din rou-portocaliu n verde,
soluia se nlocuiete)
- dezinfecia curent a minilor.

4.

5.

6.
7.
8.
9.
10
.
11
.
12
.
13
.
14
.

[MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR, CEPA / IMAPA,

ANUL II]

Alcool etilic de 70(alcool

dublu rafinat de 96 +400 ml
ap distilat)

- dezinfecia curent a minilor.

- dezinfecia suprafeelor din sticl, faian, metal din

laborator (n con. de 5%).
- sub form de aerosoli: dezinfecia ncperilor(15ml
Formol soluie comercial 40% formol/m3 aer) i a boxelor de nsmnare (25ml formol/
m3 aer).
- inactivarea culturilor microbiene n vederea preparrii
unor vaccinuri (conc. 0,1-2%).
- dezinfecia diferitelor obiecte din sticl, porelan, metal
Fenol (acid fenic)
(sol. 5%).
Tinctur de iod
- dezinfecia locurilor de puncie
Ap oxigenat 3%
- dezinfecia mucoaselor
Soluia pemanganat de potasiu - dezinfecia minilor 1
- dezinfecia mucoasei bucale 1/5000
- splturi oculare 1/10000
- dezinfecia pipetelor i a lamelor n laboratorul care se
Acid acetic 1%
ocup cu studiul germenilor din genul Leptospira.
Hidroxid de sodiu (sod
- dezinfecia adposturilor de animale i a cutilor.
caustic) 2-4%
Cloramina B
- dezinfecia minilor (sol. 1%).
- dezinfecia meselor de laborator, cutilor de animale
(conc. 5%).
Clorura de var

- dezinfecia curent a grajdurilor.

Diferii detergeni (anionici,

cationici, iodofori)

- dezinfecia minilor (sol. 1%).

- splarea sticlriei.

n prezent se comercializeaz o gam foarte variat de noi dezinfectante i antiseptice, unii

reprezentnd un amestec de compui chimici, cu efect antimicrobian sporit, a cror utilizare
necesit respectarea indicaiilor productorului.

APLICAREA METODELOR DE STERILIZARE N INDUSTRIA ALIMENTAR

Clasificare a general a procedeelor de sterilizare (conservare) utilizate n industria
alimentar:
1. Eliminarea microorganismelor prin separare fizic:
microfiltrare;
ultracentrifugare.
2. Distrugerea microorganismelor (sterilizare) prin :
aciunea cldurii:
fierbere clasic (100C);
-pasteurizare 55-95C;
- pasteurizare UHT;
apertizare (sterilizarea conservelor n cutii prin imersarea acestora n

10

[MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR, CEPA / IMAPA,

ANUL II]

ap la temperatura de 110...140C);
radiaii ionizante (sterilizare la rece):
electroni accelerai;
raze i X;
radiaii ultraviolete;
folosirea antisepticelor lichide sau gazoase:
alcooli;
acizi;
conservani chimici.
3.Efect de oprire sau diminuarea multiplicrii microorganismelor (nu de eliminare):
utilizarea temperaturilor sczute:
refrigerarea prin scderea temperaturii la 0...3C
i refrigerare n vid;
congelare;
supracongelare;
reducerea coninutului de ap (eliminarea a 60-70% din apa de constituie):
uscare i uscare-afumare;
deshidratare;
liofilizare (uscare n vid, precedat de congelare);

11