Metode de

analiz a genelor

Expresia genelor
ADN ARNm Protein Caracter
5-ATTGCAAGATTACCATGT-3 Catena codogen (netranscris)
3-TAACGTTCTAATGGTACA-5 Catena anticodogen (transcris)
Transcripie
5-AUUGCAAGAUUACCAUGU-3

ARNm

Translaie
Leu Ala Arg Leu Pro Cys
Maturizare
Caracter fenotipic normal

polipeptid

Expresia genelor
ADNmut ARNmmut Proteinan Caracteran
5-ATTACAAGATTACCATGT-3 mutaie G4A
3-TAATGTTCTAATGGTACA-5
Transcripie
5-AUUACAAGAUUACCAUGU-3

ARNmmut

Translaie
Leu Thr Arg Leu Pro Cys
Caracter fenotipic anormal

polipeptidan

Analiza genelor
ADN

ARN

Proteine

Secveniere

Northern-blot

Western-blot

PCR

RTPCR

Secveniere

Southern-blot

Hibridare in situ

Analiza funciei

Hibridare in situ

Analiza
histochimic

Obinerea FR fragmentelor de restricie prin

aciunea specific a ER (enzimelor de restricie)

RFLPs polimorfismul FR la dou persoane X i Z

12 kb
10 kb

10 kb
8 kb

2,5 kb
10 kb

6 kb

6 kb

5 kb

6 kb

4 kb

5 kb

2,5 kb
2 kb

+
M

Etapele tehnicii PCR

A. Pregtirea amestecului cu toate componentele reactante

B. Repetarea automat a procedurilor de denaturarerenaturare-elongare de 30-35 ori
Denaturarea ADN la 96oC
Rcirea pn la temperatura de renaturare a primerilor
Elongarea catenelor ADN la 72oC
C. Analiza produilor PCR
- electroforeza
- colorarea
- interpretarea rezultatelor

Extragerea ADN

Electroforeza
produilor PCR

Pregtirea
componentelor pentru
PCR

Colorarea i
vizualizarea produilor
PCR

Amplificarea
ADN-int

Interpretarea
rezultatelor

Identificarea inseriilor / deleiilor

Identificarea mutaiilor punctiforme

Identificarea agenilor infecioi

Stabilirea paternitii (filiaiei)

Optimizarea
condiiilor
de
desfurare
a
PCR
Concentraiile critice ale substanelor pentru inhibarea activitii Taq-polimerazei
Substana

Concentraia critic

SDS

>0.005% (m/v)

Fenol

>0.2% (v/v)

Etanol

>1% (v/v)

Isopropanol

>1% (v/v)

CH3COONa

>5 mM

NaCl

>25 mM

EDTA

>0.5 mM

Dependena cantitii de produse amplificate de concentraia ADN genomic utilizat n PCR.

S-a utilizat ADN n cantitate de: 1 0,5 g, 2 0,25 g, 3 0,1 g, 4 0,02 g

Optimizarea condiiilor de
desfurare a PCR
Caracteristica primerilor utilizai n PCR
Gena

ACE
AT1 R
NOS

Secvena

Lungimea, baze

% G+C

Tm, oC

5-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3

24

54

59

5-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3

25

48

58

5-CTGGCTCCTTGCTGGTGTGG-3

20

65

58

5-GGGCAAGCGTATATTTTCTGGTG-3

23

48

55

5'-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA-3'

22

55

57

5'-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA-3'

24

54

59

Dependena cantitii produselor PCR de temperatura de renaturare a primerilor.

n condiiile PCR s-a utilizat: 1 toC optimal -5oC; 2 toC optimal; 3 toC optimal +5oC.

Optimizarea condiiilor de desfurare a PCR

Dependena cantitii produselor PCR de concentraia ionilor Mg2+.

Concentraia utilizat de MgCl2: 1 2,5mM; 2 5mM.

Dependena cantitii de ADN amplificat de numrul de cicluri PCR.

1 30 cicluri; 2 35 cicluri; 3 40 cicluri.

Analiza polimorfismului I/D pentru gena ACE

I
D

Analiza electroforetic n gel de agaroz de 2% a produselor PCR rezultate

din amplificarea ADN uman cu primeri corespunztori genei ACE.
M marcher al lungimii; 1 genotip I/D; 2 genotip D/D; 3 genotip I/I.

Analiza polimorfismului G/T pentru gena NOS

M

G
T

Rezultatele amplificrii ADN uman cu primeri corespunztori genei NOS.

M marcher al lungimii; 1 genotip G/G; 2 genotip T/T; 3 genotip G/T.

Analiza polimorfismului A/C pentru gena AT1 R

A
C
Rezultatele amplificrii ADN uman cu primeri corespunztori
genei AT1 R digerate cu ajutorul enzimei Dde I.
M marcher al lungimii; 1 genotip A/A; 2 genotip A/C

Tehnica Real-time-PCR

ARMS-PCR

Tehnica Southern-blot

Extragerea ADN

Denaturarea i
transferul ADN
pe membrane

Restriia ADN

Electroforeza ADN

Hibridare cu sonda

Autoradiografia

Vizualizarea i
interpretarea
rezultatelor

RFLPs i analiza genotipului

Alela Normal cu 3 SR

Alela mutant cu 2 SR, mutaie n SR2

C (mm)
B (Nm)
A (NN)
Electroforeza FR a 3 persoane A,B i C

Tehnica Northern-blot

Extragerea ARN

Electroforeza ARN

Hibridare cu sonda
Transferul ARN
pe membrane

Autoradiografia

Vizualizarea i
interpretarea
rezultatelor

Identificarea nivelului
de expresie i a variantei
de splicing

5-ATTACAAGATTACCATGT-3 catena codogen

3-TAATGTTCTAATGGTACA-5 catena anticodogen (matri)
3-TAATGTTCTAATGGTACA-5
5-ATTAC-3
3-TAATGTTCTAATGGTACA-5
5-ATTACA-3

5-ATTA -- primer marcat P32

pentru ADN-polimeraz

3-TAATGTTCTAATGGTACA-5
5-ATTACAA-3

A, T, C, T dNTP (2-dNTP)

3-TAATGTTCTAATGGTACA-5
5-ATTACAAG-3

A, T, C, T ddNTP (2,3-ddNTP)

3-TAATGTTCTAATGGTACA-5
5-ATTACAAGA-3
3-TAATGTTCTAATGGTACA-5
5-ATTACAAGAT-3
3-TAATGTTCTAATGGTACA-5
5-ATTACAAGATT-3

pentru sinteza noilor catene

pentru stoparea sintezei

5-ATTACA-3
5-ATTACAA-3

A 5-ATTACAAGA-3
5-ATTACAAGATTA-3
5-ATTACAAGATTACCA-3
5-ATTACAAGAT-3

5-ATTACAAGATT-3
5-ATTACAAGATTACCAT-3
5-ATTACAAGATTACCATGT-3

5-ATTACAAG-3
5-ATTACAAGATTACCATG-3
5-ATTAC-3

C 5-ATTACAAGATTAC-3
5-ATTACAAGATTACC-3

+
5-ATTACAAGATTACCATGT-3

(+) 5' TAAATGGCTA.......3'(-)

Metoda automat

Hibridarea in situ pentru

depistarea secvenelor ADN

Hibridarea in situ cu
utilizarea preparatelor
de cromozomi metafazici

Hibridarea in situ cu
utilizarea preparatelor
cu nuclei interfazici

Hibridarea in situ
pentru depistarea
secvenelor ARN

Hibridarea in situ cu
utilizarea probei sens (stnga)
i antisens (dreapta)

Analiza
histochimic
identificarea
proteinelor n esut