Sunteți pe pagina 1din 13

Crioconservarea este un proces n cazul n care celule sau esuturi ntregi sunt conservate prin rcire, sub-zero

temperaturi sczute, cum ar fi (de obicei) 77 K sau -196 C (punctul de fierbere de azot lichid). La aceste
temperaturi sczute, orice activitate biologic, inclusiv reacii biochimice care ar conduce la moartea celulelor,
este efectiv oprit. Cu toate acestea, atunci cand solutiile crioprotector nu sunt utilizate, celulele fiind conservate
sunt de multe ori avariate din cauza congelarii n timpul abordarea la temperaturi sczute sau nclzirea la
temperatura camerei.
Temperatura
Deozitarea produselor criogenate la temperaturi foarte sczute presupune a oferi o durat nedeterminat, dac
nu chiar n apropierea de infinit, longevitatea la celule, dei real "termenul de valabilitate", este destul de dificil
de dovedit. n experimentele cu uscate, semine, cercettorii au constatat c nu a existat variabilitate
,deteriorare evident n cazul n care probele au fost inute diferit "ngheate" la temperaturi ultra-chiar i cele
rece. Temperaturi sub punctul de tranziie de sticl (Tg) de ap (n jur de minus 136 C), par a fi acceptate ca
limite n care activitatea biologic foarte substanial ncetinete, i minus 196 C (fazei lichide de azot lichid) este
temperatura preferat pentru depozitare a exemplarelor importante. n timp ce frigidere, congelatoare profund i
extra congelatoare rece adncime, toate similare cu cele interne, sunt utilizate pentru multe elemente, n general,
ultra rece de azot lichid la -196 C este necesar pentru conservarea cu succes a structurilor mai complexe
biologice pentru a opri aproape toate activitiile biologice.
Riscuri
Fenomene care pot cauza deteriorarea celulelor n timpul crioconservari au loc n principal n timpul etapei de
congelare, i includ: soluie de efecte, formarea extracelulara de ghea, deshidratare i formarea intracelular
de ghea. Multe dintre aceste efecte pot fi reduse prin cryoprotectants.
Atunci cnd au ajuns n faza de congelate, materialul este relativ conservat n condiii de siguran fata de
viitoarele daune(distrugeri). Cu toate acestea, estimri bazate pe acumularea de radiaii induse de deteriorarea
ADN-ului n timpul depozitrii criogenice au sugerat o perioad maxim de depozitare de 1000 de ani .

Efecte si soluii
Deoarece cristalele de ghea cresc dizolvarea substanelor n ap de congelare- sunt excluse,pt ca le
determin s devin concentrate n ap rmasa lichid. Concentraii ridicate din unele substane dizolvate poate
fi foarte duntoare.
Formarea extracelular de ghea
Atunci cnd esuturile sunt rcite lent, apa migreaz din celule i forme de ghea n spaiul extracelular. Prea
mult ghea extracelulara poate provoca leziuni mecanice membranei celulelor din cauza de zdrobire.
Deshidratarea
Migraia de ap care cauzeaz formarea extracelulara de ghea poate provoca, de asemenea, deshidratarea
celulelor. Asociate pe celul pot provoca daune n mod direct.
Formarea intracelular de ghea
n timp ce unele organisme i esuturi pot tolera ceva ghea extracelulara, orice ghea semnificativ
intracelulara este aproape ntotdeauna fatala n celule.
Prevenirea riscurilor
Vitez controlat-i congelare lent sunt bine stabilite tehnici de pionier la nceputul anilor 1970, care a permis
embrionului uman prima natere congelata (Zoe Leyland) n 1984. De atunci, mainile care congeleaza probe
biologice utiliznd paii programabili, sau ratele controlate, au fost utilizat n ntreaga lume pentru a oamenilor,
animalelor i biologiei celulare- "nghearea joasa" o prob pentru o mai bun pstrare, pentru decongelare n
cele din urm, nainte de a fi congelate, sau crioconservate, n azot lichid. Aceste maini sunt utilizate pentru
nghearea ovocitului, a pielii, a produselor din snge, embrionilor, spermei , celulelor stem i conservarea
general de esut n spitale,in practicile de uz veterinar iin laboratoarele de cercetare din ntreaga lume. Ca un
exemplu, estimrile au pus numrul de nateri vii de la lent ngheate ", la aproximativ 300.000 de la 400.000 sau
20 de embrioni congelai '% din cele aproximativ 3 milioane nateri din fertilizarea in vitro.
Letala este nghearea intracelulara, care poate fi evitat dac rcirea este destul de lenta pentru a permite

suficient apei de a prsi celula n timpul nghearii progresive a lichidului extracelular. Aceast rat difer
ntre celulele de diferite dimensiuni i o permeabilitate a apei: o rat tipic de rcire n jur de 1 C / minut este
adecvat pentru multe dintre celulele mamiferelor dup tratamentul cu crioprotectori, cum ar fi glicerolul sau
sulphoxidul de dimetil, dar rata nu este un optim universal.
Mai multe studii independente au furnizat dovezi c embrionii congelai stocati ,utiliznd tehnici de congelare
lent-ar putea, n anumite moduri s fie "mai buna" dect n stare proaspt a fertilizarii in vitro.Studiile au fost
prezentate Societatii Americane de Medicina Reproductiva la conferinta din San Francisco, SUA, 2008. Studiile
indic faptul c folosind embrioni congelai, mai degrab dect embrioni proaspei a redus riscul de ft mort i
natere prematur dei motivele exacte sunt nc explorate.
Vitrificarea
Cercettorii care au dezvoltat o nou tehnic, vitrificarea, din anul 2000 ca cerere pentru a oferi beneficiile de
crioconservare, fr deteriorri cauzate de formarea cristalelor de ghea. n crioconservarea clinica, vitrificarea
necesit de obicei adugarea de crioprotectori nainte de rcire. Crioprotectorii acioneaza ca antigel: la cele
mai mici temperaturi de congelare. Ei, de asemenea, crec viscozitatea. n loc de cristalizare, soluia siroposa
se transform ntr-o ghea amorfa, se vitrifica. Vitrificarea de ap este promovat prin rcirea rapid, i poate fi
realizata fr crioprotectori de ctre o cdere extrem de rapid a temperaturii (megakelvins pe secund). Rata
de care este necesar pentru a atinge starea sticlos n ap pur a fost considerat a fi imposibil pn n anul
2005.
Cele dou condiii de obicei necesare pentru a permite vitrificarea sunt o cretere a vscozitatii i-o depresiune
de temperatura de congelare. Multe substane dizolvate fac ambele, dar molecule mai mari, n general, au efect
mai mari, n special pe viscozitate. Rcirea rapid, de asemenea, promoveaz vitrificarea.
n stabilirea metodelor de crioconservare, substantele dizolvate trebuie s ptrund membrana celulelor, n
scopul de a realiza viscozitatea a crescut i deprim temperatura de congelare din interiorul celulei. Zaharurile
nu ptrund cu uurin prin membrana. Aceste substane dizolvate fac, cum ar fi sulfoxidul de dimetil, un
crioprotector comun,si sunt de multe ori toxice, n concentraie mare. Unul dintre compromisurile dificile cu care
se confrunt n crioconservarea este vitrificarea ,de a limita daunele produse de crioprotector insusi.
Tesuturi inghetate
n general, este mai uor de crioconservat pentru probe subtiri si tufe mici de celule individuale, pentru c
acestea pot fi rcite mai rapid i mai impun acest lucru doze mai mici de crioprotectori toxici. Prin urmare, scopul
de a crioconservare de ficat uman i inimii pentru depozitare i de transplant este nc la distan.
Cu toate acestea, combinaii adecvate de crioprotectori i regimuri de rcire i cltire n timpul nclzirii de
crioconservare permite de multe ori cu succes a materialelor biologice, suspensii special de celule sau probe de
esuturi subire. Exemplele includ:
Material seminal
Snge
Celule speciale pentru transfuzie
Celulele stem
Sngele ombilical din cordonul ombilical (mai multe informaii: Cord banca de snge # Crioconservare)
Probe de esuturi cum ar fi tumori i seciuni transversale histologice
Ou (ovocitelor) A se vedea crioconservarea ovocitului
Embrionii care sunt 2, 4 sau 8 celule cand sunt inghetate
esut ovarian
Semine de plante sau lstarilor poate fi crioconservati n scopuri de conservare.
n plus, eforturile sunt n curs de a pstra om criogenic, cunoscut sub numele de cryonics. n astfel de eforturi, fie
a creierului n cadrul cap sau ntregul corp pot fi supuse procesului de mai sus. Cryonics este ntr-o categorie
diferit de exemplele menionate anterior, cu toate acestea, n timp ce pentru nenumrate celule crioconservate ,
vaccinuri, esut i alte probe biologice au fost decongelate i folosite cu succes, acest lucru nu a fost nc cazul,
la toate pentru creier crioconservat sau organisme. n cauz sunt criteriile de definire a "victoriei". Sustinatorii
cryonics fac un caz care crioconservare folosind tehnologia actual, n special vitrificare a creierului, poate fi
suficient pentru pstrarea persoanelor ntr-o informare "teoretica", sensul, astfel nct acestea ar putea fi
renviat i a fcut foarte mult n ansamblu, prin avansarea tehnologiei in viitor

.
Material seminal
materialul seminal poate fi folosit cu succes practic la infinit, dup crioconservare. Cea mai lung raportate de
stocare de succes este de 21 de ani. El poate fi folosit pentru donarea de sperma n cazul n care beneficiarul
dorete tratament ntr-un timp diferite sau de loc, sau pentru barbatii care trec printr-o vasectomie, de a avea n
continuare posibilitatea de a avea copii.
Crioprotector mass-media pot fi completat cu glbenu de ou, fie sau lecitin de soia, cu cele dou care nu au
diferene semnificative statistic n comparaie cu reciproc cu privire la motilitate, morfologie, capacitatea de a lega
de Hialuronat in vitro, sau integritatea ADN-ului, dup decongelare.
ovocitelor
crioconservarea ovocitului la om
crioconservarea ovocitului este o tehnologie nou, n care oule unei femei (ovocitelor) sunt extrase, congelate
i depozitate. Mai trziu, cnd ea este gata s s rmnei gravid, oule pot fi decongelate, fertilizat, i
transferate n uter ca embrioni.

E Embrionii
Crioconservarea pentru embrionii sunt utilizate pentru depozitarea de embrioni, de exemplu, atunci cnd
fertilizarea in vitro a avut drept rezultat embrioni mai mult dect este necesar n prezent.
Sarcini au fost raportate de la embrioni stocate timp de 16 de ani. Multe studii au evaluat copiii nscui de la
embrioni congelai, sau "inghetati". Rezultatul a fost uniform pozitiv cu nici o cretere de malformaii congenitale
sau anomalii de dezvoltare.
De la 1 octombrie 2009 embrioni umani au permisiunea de a fi stocati timp de 10 ani din Marea Britanie, n
funcie de fertilizare a omului i Embriologie Actul 2008.
Datele utilizate mondial sunt greu de gasit, dar a fost raportat ntr-un studiu din 23 de ri care aproape 42000 de
embrioni congelai transferuri omului s-au efectuat n cursul anului 2001 n Europa.
Un studiu de mai mult de 11.000 crioprotectori de embrioni umani nu au artat nici un efect semnificativ de timp,
de stocare de pe supravieuire dupa dezghetare pentru fertilizarea in vitro sau cicluri donaiei ovocitului, sau
pentru embrioni congelai n etapele de pronuclear sau de clivaj. n plus, durata de stocare nu a avut nici efecte
semnificative asupra sarcinii clinice, avort spontan, implantare, sau rata natalitii n direct, fie de la fertilizarea in
vitro sau cicluri de donare a ovocitului. mai degrab, de vrst ovocitului, proporia de supravieuire, precum i
numrul de embrioni transferati sunt predictori ai rezultatului sarcinii.
tesutul ovarian
Crioconservarea de esut ovarian este de interes pentru femeile care vor s pstreze funcia lor de reproducere,
dincolo de limita naturala sau al cror potenial de reproducere este ameninat de terapie de cancer. copil mai
nti s fie nscui de o femeie dup un transplant de esut ovarian congelat, i n ciuda ca mama fiind ntr-o
stare de menopauza premature provocate de chimioterapie, a fost efectuat de profesorul Jacques Donnez i
echipa sa de la Cliniques Universitaires Saint-Luc, Belgia. O parte din ovar stnga a fost eliminat, iar tesutul a fost
lent congelat nainte de a fi depozitat n terapia de azot lichid n acelai timp, a fost realizat. esutul sase ani
mai trziu a fost implantat n apropiere de trompele uterine i ou au fost n scurt timp produse, care s permit
concepie normal s aib loc .
crioconservarea naturala
Apa poart (Tardigrada), organisme multicelulare microscopice, poate supravieui congelarii la temperaturi
sczute, prin nlocuirea cea mai mare parte a apei lor interne cu trehaloz de zahr. Zaharuri i a substanelor
dizolvate, altele care nu cristalizeaz uor au ca efect de limitare subliniaz faptul c prejudiciul membranelor
celulare. Trehaloz este un zahar care nu cristaliza uor. Amestecuri de dizolvate poate obine efecte similare.
Unele substanelor dizolvate, inclusiv srurile, au dezavantajul c acestea pot fi toxice la concentraii mari.
Istorie
Una dintre cele mai importante lucrri devreme pe teoria de crioconservarea a fost James Lovelock de faima
teoriei Gaia. Locul de munc Dr. Lovelock's a sugerat c deteriorarea celulelor roii din snge n timpul de
congelare s-a datorat subliniaz osmotic. Lovelock la nceputul anilor 1950 au sugerat, de asemenea, c

creterea concentraiilor de sare ntr-o celul n care se deshidrateaza pentru a pierde ap la ghea externe, ar
putea cauza daune la celul. Crioconservarea de esut n ultima vreme a inceput cu nghearea spermatozoizilor
de la psri, care, n 1957 a fost crioprotectori , de o echip de oameni de tiin n Regatul Unit, condus de Dr.
Christopher Polge. Procesul sa mutat n lumea uman n anii 1950, cu sarcini obinute dup inseminarea
spermei congelate. Cu toate acestea, imersiunea rapid a probelor n azot lichid nu a fcut-o, pentru unele dintre
aceste probe, cum ar fi tipurile de embrioni, mduvei osoase i celulele stem-produc viabilitatea necesare pentru
a le face mai uor de utilizat la decongelare. nelegerea sporit a mecanismului de prejudiciu congelare la celule
a subliniat importana controlarii sau lent de rcire pentru a obine maxim de supravieuire pe dezgheare a
celulelor vii. O rat de controlat a procesului de rcire, care s permit s se echilibreze probe biologice pentru a
optimza parametri fizici osmotici ntr-un crioprotector (o form de anti-blocare) nainte de rcire ntr-un
predeterminat, mod controlat dovedit necesar. Capacitatea de crioprotectorilor , n cazurile nceputul glicerol,
pentru a proteja celulele de la un prejudiciu de ngheare a fost descoperit accidental. Un prejudiciu de congelare
are dou aspecte-daune directe din cristale de ghea i daunele secundare, cauzate de creterea concentraiei
de substanelor dizolvate ca treptat mai mult de ghea se formeaz. n 1963 Peter Mazur, la Oak Ridge National
Laboratory din SUA, a artat c nghearea letalea intracelular ar putea fi evitate dac rcirea a fost destul de
lenta pentru a permite apei suficient pentru a prsi celula n timpul nghearii progresive a lichidul extracelular.
Aceast rat difer ntre celulele de diferite dimensiuni i o permeabilitate a apei: o rat de tipic de rcire n jur de
1 C / minut este adecvat pentru multe dintre celulele de mamifere dup tratamentul cu crioprotectori cum ar fi
glicerolul sau sulphoxide de dimetil, dar rata nu este un optim universal.

CURS VIII
CONSERVAREA RESURSELOR GENETICE VEGETALE
CONSERVAREA IN VITRO A GERMOPLASMEI
Metodele de conservare in vitro la plante vizeaz o diminuare sau chiar o stopare
temporar a proceselor vitale, cu meninerea nealterat a zestrei ereditare a inoculilor
stocai.
Inoculii cultivai pe medii aseptice (meristeme, apexuri, embrioni, calus, plantule,
celule, protoplai) pot fi conservai ntr-o anumit stare morfofiziologic, cu reluarea activitii
regenerative, dup trecerea lor n condiii normale, prin aplicarea a mai multor tipuri de
tehnici i anume:
1)
2)
3)

- Conservare la frig, crioconservare, criostocare;


- Conservare n condiii care s imprime inoculilor o cretere lent;
- Creterea inoculilor n presiune atmosferic sczut (hipooxic).
1. Crioconservarea

Prin crioconservare se are n vedere o oprire prin ngheare sau prin frig a
metabolismului, a funcionalitii celulare i a realizrii schimburilor dintre celul i mediu,
precum i a celor endocelulare.
Crioconservarea materialelor vegetale, cu pstrarea nealterat a viabilitii, respectiv
cu asigurarea relurii totale a funciilor vitale dup dezghe, se practic n diferite scopuri.
Crioconservarea materialului biologic vegetal, cultivat in vitro prezint numeroase
avantaje:
a)

b)

- posibilitatea stocrii, ntr-un spaiu mic, a unui numr mare de indivizi, fr a


exista pericolul de contaminare a lor cu ageni fitopatogeni sau duntori animali. Materialul
vegetal criostocat poate servi oricnd ca material iniial de propagare extrem de rapid a
clonelor criostocate. Se poate conserva integral, nealterat, zestrea genetic.
- pstrarea inoculilor la temperaturi foarte sczute poate fi fcut teoretic, pe
timp nelimitat.

c)

- inoculii cultivai in vitro pot fi transportai cu uurin de la o ar la alta,


evitndu-se restriciile impuse de ctre carantinele fitosanitare (fiind liberi de orice tip de
germeni, cu certificat de sntate).
Protejarea corespunztoare a celulelor mpotriva daunelor criogenetice prezint o
foarte mare importan. nghearea i dezghearea pot produce distrugeri prin:
- formarea de cristale de ghea mari, n interiorul celulelor, fapt care poate
provoca ruperea organitelor celulare sau sfierea ntregii celule;
- creterea concentraiei soluiilor n interiorul celulelor, pe msura ngherii
acestora, prin pierderea treptat a apei din structurile celulare, ceea ce produce o ridicare a
gradului de nocivitate a corpusculilor prezeni n celul, mediul endocelular devenind toxic.
Pentru protejarea celulelor mpotriva daunelor provocate de ctre congelri (nghe)
se adaug extracelular substane numite crioprotectori.
Crioprotectorii micorez mrimea cristalelor de ghea i diminueaz aciunea
negativ determinat de concentrarea soluiilor endo i extracelulare.
Prin protejarea corect a esuturilor, cu crioprotectori, cristalele de ghea formate
endocelular sunt foarte mici, iar membranele celulare, biostructurile i organitele, rmn
intacte.
n general criprotectorii trebuie s aib un grad mare de solubilitate i o toxicitate
sczut, s fie uor permeabil n celule. De obicei substanele crioprotectoare se dizolv n
mediul de cultur.
Substanele folosite frecvent: dimetilsulfoxidul (5-8%), glicerolul (10-20%), manitolul,
sorbitolul, polietilenglicol. Se recomand adugarea crioprotectorilor n mod gradat, n
decursul a 30-60 min, pentru a proteja celulele de ocul osmotic.
Pstrarea viabilitii celulelor este asigurat, n mai mare msur, atunci cnd se
folosete un amestec de crioprotectori, sau un amestec de crioprotectori cu glucide
(zaharoz), cu sorbitol, sau cu manitol.

Tipuri de criostocare
Sensibilitatea celulelor plantelor la temperaturi sczute variaz n funcie de specie i
natura esutului.
Modul de preparare al inoculilor n vederea criostocrii depinde de natura materialului
vegetal, de starea morfofiziologic a acestuia, de tipul de criostocare ales.
n principal exist trei modaliti de conservare prin frig a materialului biologic inoculat
in vitro.
1) criostocarea pe termen lung, la temperaturi sczute (-196o);
2) criostocare pe termen scurt, la temperaturi de -70-100o ;
3) criostocare temporar, la temperaturi coborte, dar pozitive (1-9o).
La temperatura azotului lichid activitatea vital a celulelor este complet blocat,
reaciile metabolice fiind stopate.

n ultimii ani, numeroase tipuri de inoculi au fost stocate n azot lichid, cu conservarea
deplin a viabilitii celulare i cu pstrarea totipotenialitii, adic a capacitii regenerative
de organogenez i de embriogenez somatic.
Conservarea materialului biologic n azot lichid se poate face pe o durat de timp
teoretic nelimitat (avnd grij s nu scad cantitatea de azot lichid din recipientele de
stocare, care trebuie completat periodic).

Metode de criostocare
1) Metoda ultrarapid de rcire i de congelare
Seibert (1976) a demonstrat posibilitatea stocrii n azot lichid a fragmentelor
detaate din tulpini de garoafe, tehnica constnd n turnarea azotului lichid peste inoculi,
dup care recipientele cu inoculi meristematici sunt depozitate n rezervoare speciale
coninnd azot lichid.
ntre temperatura de -10 i -70 oC, rata de rcire a explantelor este de 100 oC/ min.
Congelarea ultrarapid mpiedic formarea gheii n celule. Metoda ngherii ultrarapide se
practic la numeroase specii, ndeosebi la meristemele de garoafe, de cartof, etc.
2) Metoda frigului lent presupune o ngheare treptat a materialului vegetal, cu o
rat de rcire variabil, cel mai des utilizat fiind cea de 0,5 -1 oC/min. Rata de rcire se
aplic pn la temperatura de -100oC dup care materialul este plonjat direct n azot lichid.
Aceast tehnic depinde de mai muli factori i anume: rata de rcire; pretratamente
i folosirea crioprotectorilor; tipul i stadiul fiziologic n care se afl materilul vegetal.
Seibert (1977) a artat c meristemele de garoafe trebuie congelate cu o rat de
minimum 50 oC/ min.
Sakai (1980) a observat c plonjarea direct a fragmentelor de tulpini de garoaf n
azot lichid nu asigur o supravieuire corespunztoare a materialului biologic. n cazul n care
fragmentele au fost ngheate gradat, pn la temperatura azotului lichid s-a realizat
conservarea integral a capacitii regenerative a celulelor.
3) Metoda de stocare la frig, la temperaturi sczute pozitive (1-9oC)
n condiiile stocrii la frig, fr congelare, procesele vitale sunt mult ncetinite, dar nu
sunt stopate complet. De aceea este necesar operarea unor subculturi periodice pentru
remprosptarea calitilor mediilor de cultur.
Bannier i Steponkus (1976) au realizat un experiment referitor la stocarea calusului
de Chrysanthemum morifolium, pe un mediu de cultur mbogit cu 10% zaharoz, peste 28
de zile, la 3,5oC.
Clirea plantelor la frig, nainte de a explanta meristemele i de a criostoca este
necesar. Astfel, meristemele de garoafe, prelevate de la plante inute la 4 oC - cel puin trei
zile dup crioconservare au regenerat n procent de 100% (Seibert i Wetherbee,1977).

Un rol important l are durata de timp scurs din momentul inoculrii i pn n


momentul criostocrii. Aceast perioad de timp trebuie s fie scurt, dar att ct este
necesar pentru vindecarea suprafeelor rnite, n cursul prelurii i fasonrii explantelor.
n general s-a constatat c este mai uor de realizat crioconservarea celulelor izolate
sau chiar a protoplatilor n comparaie cu cea a meristemelor apexurilor sau a calusului.
Dezghearea
Dezghearea inoculilor se face brusc, prin cufundarea recipientelor scoase din
condiiile de criostocare direct n baia de ap, la 40 oC, timp de 1-2 min.
nc nu este cunoscut i neleas n totalitate starea fiziologic care se instaleaz
dup dezghearea celulelor, precum i efectele +/- exercitate de ctre factorii de mediu, la
inoculii dezgheai.
Practic nu se poate obine un procent de regenerare egal cu cel care se refer la
supravieuirea inoculilor dup dezghe. De exemplu, Seibert i Wetherbee au artat n 1977,
c la garoafe 90% din meristeme supravieuiesc la o sptmn dup dezghe, dar numai
cca. 70% dintre acestea genereaz plante. Cnd procentul de supravieuire a fost mai mic
de 60%, au fost obinute n final numai 17% plante regenerate.
Stocarea la frig prezint o mare importan n pepinierele industriale (create pentru
culturile in vitro) care utilizeaz tehnici de micropropagare i de producere n condiii
aseptice a materialului sditor.
Astfel, pentru perioade mai lungi sau mai scurte de timp, plantele stocate n camere
frigorifice pot fi distribuite pe pia n funcie de cerere, existnd astfel posibilitatea de a pune
la dispoziia consumatorilor cantiti mari de plante, care n mod normal sunt imposibil de
obinut prin tehnicile tradiionale.

2) Conservarea inoculilor prin impunerea unor condiii de cretere lent


Creterea lent este o alt metod de conservare a inoculilor cultivai in vitro, care
ns este mai puin practicat. n principal, se are n vedere meninerea culturilor n condiii
limit de temperatur (1-4oC sau peste 26oC), folosind o presiune sczut a O 2 n
recipiente i prin administrarea unor tratamente fitohormonale speciale.
Aceast tehnic poate fi comparat cu metoda tradiional japonez Bonsai, de
cretere a arborilor n vase mici, limitate ca volum, procesele de dezvoltare fiind frnate
prin combinarea n aa fel a condiiilor ambientale, astfel nct s se produc o reducere la
minimum a creterii.
La crizanteme au fost stocai minibutai, formai din cte un nod mpreun cu frunza
aferent la temperatura de 6-7oC la ntuneric.
Dup trei zile de la inoculare au fost trecui n regim de cretere lent. Dup stocarea
lor la frig timp de 2-3 luni, acetia au fost transferai la lumin, la temperatura de 25 oC i sa urmrit capacitatea lor regenerativ.

Procentul de regenerare a fost de 75%, iar regenerarea s-a produs fr formare de


calus, de la nivelul muguraului situat la axila frunzuliei.
3) Conservarea inoculilor prin creterea acestora n presiune atmosferic sczut sau
n lips de oxigen (hipooxie)
Metoda presupune coborrea presiunii atmosferice n jurul esuturilor cultivate in
vitro, printr-o scdere a presiunii pariale a tuturor gazelor atmosferei din recipientele de
cultur, respectiv a aerului cu care este n contact materialul vegetal.
Conservarea materialelor biologice la presiune sczut se practic n cazul
alimentelor, florilor, butailor, etc.
O alt metod de conservare a plantelor in vitro const n scderea parial numai
a oxigenului (hipooxic), nlocuind O2 cu un gaz inert, de exemplu azot. Scderea parial a
presiunii oxigenului, n jur de 50 mm Hg n recipientele de cultur, determin o reducere a
creterii.
Dup reluarea creterii n condiii normale, nu s-a observat nici o modificare
fenotipic, plantele difereniate din inoculi ajungnd la o maturitate complet.

ELABORAREA TEHNOLOGIILOR
MICROPAGULELOR

DE

CONSERVARE

Metodele moderne ale biotehnologiei permit, pe de o parte, conservarea


resurselor genetice sub forma de culturi in vitro, iar pe de alta parte, selectia
somaclonala, prin metode specifice, a insusirilor de adaptabilitate.
Aceste rezultate reprezinta premise pentru abordarea sistemica a problematicii
cunoasterii si conservarii diversitatii genetice, impreuna cu selectia somaclonala,
si prin utilizarea tehnicilor avansate de cultura in vitro.
Toate metodele de conservare in vitro a plantelor urmaresc o diminuare sau o
stopare temporara sau totala a proceselor vitale. In general sunt acceptate trei
modalitati de conservare in vitro cu ajutorul temperaturilor scazute a materialului
biologic:
conservarea materialului vegetal pentru o perioada scurta de timp (1-2 luni)
prin realizarea de subculturi repetate,
conservarea materialului vegetal pentru o perioada medie de timp (de la cateva
luni la cca. 3 ani) prin imprimarea la nivelul materialului vegetal a unei cresteri
lente,
conservarea materialului vegetal pentru o perioada nelimitata de timp, prin
mentinerea culturilor in regim de frig profund (in azot lichid -196C).
Urmatoarele categorii de material vegetal si metode specifice au fost
experimentate in vederea conservarii unor propagule de arbori si arbusti
ornamentali:

1. Embrioni somatici de molid argintiu, care au fost conservati atat prin


incapsulare in alginat de calciu si pastrare la 4gC, cat si prin crioprezervare,
utilizand metoda cu precongelare controlata, cu sau fara utilizarea criostatului,
2. Embrioni somatici destejar fastigiat, care au fost conservati printr-o metoda
combinata de incapsulare si crioprezervare. Numai embrionii foarte tineri
(precotiledonari) au fost conservati in azot lichid, in timp ce embrionii mai
avansati, in curs de maturare, au fost incapsulati si pastrati la 4oC pe perioade de
pana la 90 de zile. Deshidraterea partiala care s-a realizat in aceste conditii adus
la ameliorarea capacitatii de germinare.
3. Incapsularea si pastrarea la 4oC a meristemelor apicale extrase din muguri de
Magnolia. Acest procedeu a fost conceput nu numai pentru conservarea pe
termen mediu, ci si pentru a imbunatati viabilitatea inoculelor mici pentru
regenerarea prin microbutasire si a da posibilitatea inocularii domurilor
meristematice in locul mugurilor, eliminand astfel in mare masura riscul infectiilor
endogene.
In scopul bunei desfasurari a experimentelor, au fost testate, optimizate si
aplicate urmatoarele protocoale experimentale:
- protocol de selectie a embrionilor somatici in functie de scopul incapsularii
(crioprezervare, conservare pe termen mediu, deshidratare partiala, marirea
randamentului germinarii);
- protocol de incapsulare in alginat de calciu pentru agregate celulare
embriogene, embrioni precotiledonari si cotiledonari tineri (stadiile 1 si 2) si
embrioni cotiledonari avansati (stadiile 4, 5 si 6);
- protocol de incapsulare in capsule cu interior lichid (carboximetilceluloza-alginat
de calciu), pentru aceleasi tipuri de embrioni;
- protocol de crioprezervare a capsulelor continand embrioni somatici, cu imersie
gradata in azot lichid (fara utilizarea criostatului);
- tratamente de crioprotectie.
Incapsularea in capsule cu interior lichid: Pentru a realiza in interiorul capsulei un
mediu semilchid, propriu dezvoltarii embrionilor, a fost testata o noua metoda de
incapsulare, la care este utilizat pentru interiorul capsulei un polimer,
carboximetilceluloza, dizolvat de asemenea in mediu de cultura, dar cu
compozitia modificata pentru a contine o cantitate suficienta de clorura de calciu
dihidrata, pentru a permite intarirea crustei exterioare de alginat.
Picaturile continand embrioni in gel de polimer (aceleasi stadii si aceeasi
procedura de selectie ca si pentru metoda precedenta), au fost imersate intr.un
gel mai diluat de alginat de sodiu (10 min. pe agitator-rotator). La confluenta
dintre cele doua geluri se formeaza un strat dur de alginat de calciu, dar
interiorul capsulei ramane in stare semilichida.

Crioprezervarea maselor celulare embriogene de molid argintiu a dat bune


rezultate in cazul utilizarii criostatului pentru realizarea unui program de
congelare controlata pana la -35gC. Acest program se compune dintr-o faza
lineara de scadere a temperaturii de la 0gC la -10gC, in timp de 15 min., o faza
stationara de 5 min. la -10gC si apoi continuarea racirii lineare de la -10gC la
-35gC, in timp de o ora .
Intrucat pretul ridicat al criostatului ridica mult costul crioprezervarii, s-a incercat
elaborarea unei metode simple de conservare prin imersie directa in azot lichid,
fara congelare controlata.
In acest scop, a fost imaginat un procedeu de introducere gradata a criotuburilor
in butelia cu azot lichid, astfel incat scaderea temperaturii sa se produca intai in
atmosfera buteliei, in mod cat mai asemanator curbei de inghetare realizata de
criostat.
O alta alternativa la precongelarea in criostat este simularea partiala a
programului de precongelare, utilizind un congelator de laborator si medii
stabilizatoare reprezentate prin diferiti alcooli.
A fost evaluat efectul crioprezervarii asupra principalelor insusiri embriogene ale
PEM, comparand o linie embriogena cultivata pe parcursul a trei luni in trei
variante.
Crioprezervarea maselor celulare embriogene de molid a dat bune rezultate in
cazul utilizarii criostatului pentru realizarea unui program de congelare controlata
pana la -35gC.
Intrucat pretul ridicat al criostatului ridica mult costul crioprezervarii, s-a incercat
elaborarea unei metode simple de conservare prin imersie directa in azot lichid,
fara congelare controlata.
Pentru aceasta, a fost imaginat un procedeu de introducere gradata a
criotuburilor in butelia cu azot lichid, astfel incat scaderea temperaturii sa se
produca intai in atmosfera buteliei, in mod cat mai asemanator curbei de
inghetare realizata de criostat.
Prin incercari, a fost stabilita o scara de imersie cu 7 trepte, la care tija suportului
criotuburilor a fost coborata la intervale de 10 minute.
Metoda combinata de crioconservare-vitrificare, aplicata embrionilor de stejar
fastigiat, comporta urmatoarele etape: deshidratarea partiala a materialului
vegetal; tratarea cu substante crioprotectoare; precongelarea; imersia
criotuburilor in azot lichid; reconstituirea culturilor embriogene si regenerarea
plantelor.
Metoda combinata incapsulare-criostocare reprezinti o varianta de
crioconservare-vitrificare, aplicata embroinilor incapsulati.

Supravietuirea a cca 30% din embrionii crioprezervati a fost posibila chiar in


absenta inghetarii controlate, datorita combinarii procedeelor de incapsulare,
crioprotectie cu sucroza si imersie gradata in azot lichid.
Incapsularea a fost precedata de trierea embrionilor pe stadii: embrionii cei mai
tineri (stadiile 1-2) au fost crioconservati, cei avansati (stadiile 4-5) au fost
utilizati la conservarea pe termen mediu.
Au fost incapsulate, in vederea conservarii pe termen scurt si mediu, meristeme
de la mai multe specii de Magnolia. Prin incapsularea meristemelor in alginat de
calciu, s-a urmarit nu numai conservarea, ci si ameliorarea viabilitatii inoculelor
foarte mici utilizate in micropropagare, astfel incat sa poata fi introduse in
cultura, in locul mugurilor, meristemele care prezinta un risc mult mai scazut de
contaminare endogena.
Metoda utilizata a fost aceeasi ca si in cazul embrionilor somatici, iar materialul
vegetal a fost reprezentat prin domuri meristematice extrase in conditii aseptice
din muguri vegetativi in curs de activare (muguri de primavara).
Viabilitatea meristemelor conservate pe o durata de 14 zile la 4oC a fost
satisfacatoare, iar unele meristeme au prezentat crestere in interiorul capsulei, in
timpul conservarii.
Crioconservarea celulelor animale
Istoria crioconservarii
n 1776 omul de tiin italian Lazzaro Spallanzani a ncercat pentru prima dat crioconservarea spermei
n zapad i a observat c spermatozoizi erau mobili dup decongelare.
n 1938 Luyet i Hodapp au realizat vitrificarea spermei de broasca si stocarea n azot lichid.
In Anglia, Polge 1949 a reusit sa inghete cu succes sperma de cocos prin includerea de Glicerina si in
scurt timp a realizat ca acest procedeu poate fi folosit si pentru sperma de taur.
n 1985 (Luyet i Hodapp )au raportat vitrificarea cu succes a unor embrioni de oarece.
Din 1990 vitrificarea a fost aplicat i pentru ovocite i esut ovarian.
Crioconservarea este un proces n cazul n care celule sau esuturi ntregi sunt conservate prin
rcire, sub-zero temperaturi sczute, cum ar fi (de obicei) 77 K sau -196 C (punctul de fierbere de azot
lichid). La aceste temperaturi sczute, orice activitate biologic, inclusiv reacii biochimice care ar
conduce la moartea celulelor,este efectiv oprit. Cu toate acestea, atunci cand solutiile crioprotector nu
sunt utilizate, celulele fiind conservate sunt de multe ori avariate din cauza congelarii n timpul abordarea
la temperaturi sczute sau nclzirea la temperatura camerei
Riscuri
Fenomene care pot cauza deteriorarea celulelor n timpul crioconservari au loc n principal n
timpul etapei decongelare, i includ: soluie de efecte, formarea extracelulara de ghea, deshidratare i
formarea intracelularde ghea. Multe dintre aceste efecte pot fi reduse prin cryoprotectants.Atunci
cnd au ajuns n faza de congelate, materialul este relativ conservat n condiii de siguran fata
deviitoarele daune(distrugeri). Cu toate acestea, estimri bazate pe acumularea de radiaii induse de
deteriorareaADN-ului n timpul depozitrii criogenice au sugerat o perioad maxim de depozitare de
1000 de ani .

Crioprotectanii snt substane chimice cu greutate moleculara mai mica de 100 de Daltoni, care le
permite penetrarea prin membrana celulara, se dizolva n ap, scaznd punctual de nghe al acesteia.
Crioprotectanii cu aplicaie n criobiologie snt etilen glicolul, glicerol, propilen glicol, dimetilsulf oxid
(DMSO).
O celula sau un esut care va fi supus procesului de crioconservare, trebuie sa ndeplineasc cteva
condiii: sa fie o celula sau esut sntos, s nu fie contaminat cu microorganisme si s fie ntr-un
stadiu care s-i permit folosirea dup decongelare ( cu potenial de diviziune).
n reproducerea uman asistat se folosesc n mod curent dou metode de congelare
1.

Congelarea lenta ( Slow freezing) dupa cum i spune i numele congelarea se face lent, scaderea
punctului de nghe fcndu-se progresiv, volumul intracelular al apei ramnnd n echilibru cu cel
extracelular, deshidratarea celulei facndu-se sub 0C ( n timpul congelrii), la sfritul congelrii
celula fiind deschidratat sau ramnd un volum foarte mic de apa.

2.

Vitrificarea ( congelarea rapida) reprezint o metode de congelare rapid prin introducerea directa n
azot lichid. Concentraia crioprotectaniilor pentru vitrificare este mai mare dect n congelarea lenta, iar
timpul de expunere este mai mic. Diferena dintre congelarea lent i vitrificare const n faptul c
expunerea celulelor sau esutului la o concentraie mai mare de crioprotectani i introducerea directa n
azot lichid previne formarea cristalelor de gheata i astfel o supravieuire mai buna dup decongelare.

3.

Avantajele vitrificarii comparativ cu congelarea lent provin din faptul c nu necesit dotari speciale,
timpul alocat congelrii este mult redus de la 2 ore la 5-15 minute n funcie de materialul congelat i
mediul folosit, rata de supravieuire dupa decongelare este superioara fa de congelarea clasic .

Crioconservarea embrionilor
Crioconservarea embrionilor umani se refera la procesul de inghetare si stocare la o temperatura foarte joasa a
ovocitelor fecundate artificial, pentru a putea fi reutilizate in acelasi stadiu functional dupa un anumit timp.
Embrionii isi pastreaza viabilitatea datorita azotului lichid in care sunt depozitati, la -196 grade Celsius. Orice fel
de tesut viu poate sa fie crioconservat pe intervale temporale foarte lungi, ca apoi sa functioneze normal.
Multi ani de-a randul, procesul crioconservarii embrionilor a fost folosit cu succes in asistarea reproducerii
diverselor specii de animale. Abilitatea de a pastra intr-un mediu sigur embrioni de calitate permite transferul
ovulelor fecundate proaspete intr-un ciclu de reproducere, pastrand posibilitatea unei a doua sanse de a purta
o sarcina in viitor prin implantarea embrionilor viabili conservati.
Cum se realizeaza crioconservarea embrionilor?
Crioconservarea embrionilor umani se realizeaza intr-o maniera similara cu cea a spermei, in recipiente speciale
cu azot lichid. Inghetarea lor se face treptat, pana la expunerea temperaturii finale, astfel incat proprietatile
celulelor sa ramana intacte.
Embrionii umani pot fi crioconservati din prima zi a formarii lor pana in cea de-a cincea, cand inca se afla in
stadiul de blastocist. Intr-o eprubeta subtire si lunga numita "stick", asemanatoare unui pai, sunt depozitati
aproximativ 3-4 embrioni. Eprubetele sunt introduse apoi intr-un rezervor cu azot lichid, la -198 grade Celsius.
In momentul trasferului de embrioni, readucerea lor la temperatura normala a corpului poarta cu sine un risc de
deteriorare a 20% dintre specimene.
Crioconservarea de ovocite
Crioconservarea ovocitelor (congelarea ovulelor) este o procedura prin care o femeie isi poate prezerva ovule
sanatoase pentru o conceptie care are loc in viitor. Este o metoda utila de sporire sau conservare a fertilitatii pe
termen lung, asemanatoare criocenservarii spermei la barbati, in cazurile in care exista posibilitatea ca productia
de ovule sau functiile ovariene sa fie compromise.
Cum se face crioconservarea si in ce conditii?

Medicul va recolta ovulele sau ovocitele dupa ce iti administreaza medicamente pentru stimulare ovariana. Dupa
o zi si jumatate de la administrarea medicamentelor, medicul te va ruga sa revii pentru procedura de colectare a
ovocitelor ce urmeaza a fi criogenate.
Procesul prin care recolteaza ovocitele se numeste punctie foliculara. Se efectueaza prin vagin si necesita
anestezie locala. Medicul exploreaza cu acuratete zona prin imaginile oferite de o ecografie, care se face in
acelasi timp in care are loc recoltarea. Procedeul dureaza aproximativ 20 de minute.
Ovocitele sunt depozitate apoi in azot lichid la -196 grade Celsius. Pot fi tinute pe termen foarte lung, chiar ani de
zile, pana cand te hotarasti sa ramai insarcinata.
Dupa aceea, ovocitele scoase de la conservare sunt fertilizate in vitro in laborator, cu spermatozoizi de la
partenerul pe care-l alegi sa devina taticul bebelusului tau.
Rata de succes a acestui procedeu este aproximativ aceeasi ca la fertilizarea in vitro, cam de 20-25%.
Crioconservarea spermei
Crioconservarea presupune colectarea si depozitarea spermei la rece, in congelatoare speciale care respecta
anumite conditii, in vederea asigurarii viabilitatii ei dupa decongelare.
Specialistii sustin ca sperma umana poate fi congelata foarte multi ani la rand, cea mai lunga perioada de
conservare a spermatozoizilor prin criogenie fiind de 21 de ani. Sperma era perfect viabila si functionala dupa
aceasta perioada.

Cel mai comun crioprotector (agent de protejare folosit in prezervarea celulelor reproducatoare) este glicerolul, la
care se mai adauga si alte substante aditionale (zaharoza, di sau trizaharide). Mediul crioprotector poate fi
suplimentat si cu galbenus de ou sau lecitina de soia. Ambele substante ajuta in prezervarea spermei, fara a
pune in vreun fel in pericol motilitatea, morfologia sau integritatea ei.
Materialul seminal colectat si testat in prealabil de afectiuni si anomalii este congelat cu ajutorul unei metode
de racire lenta si controlat intr-un congelator biologic programabil. In acest fel, se obtine o rata de inghet scazuta.
In timpul racirii, celulele se deshidrateaza. Atunci cand inghetarea ajunge la -35 de grade Celsius, specialistii
trec la o racire brusca a lichidului seminal prin introducerea in nitrogen lichid la -196 de grade Celsius. Ei raman
depozitati in nitrogen pana la momentul la care se doreste dezghetarea si fertilizarea in vitro sau alte tehnici
dereproducere umana asistata, prin care sa se conceapa un bebelus.

S-ar putea să vă placă și