Bioseparari analitice

Curs 2

O serie de tehnici de bioseparare sunt acum disponibile.

Un proces de biosepare trebuie s combine doua caracteristici:

selectivitate (sau rezoluie) mare,

capacitate mare de separare (sau productivitate).

Este evident ca o singura tehnica nu permite atingerea acestor obiective
De aceea procesele de bioseparare tind s se bazeze fluxuri de tehnici multiple alese
astfel nct sa se obtina selectivitati si productivitati mari

Selectivitate
scazuta
+ Selectivitate mare + productivitate
productivitate mare
scazuta
Spargerea celulelor
Ultracentrifugare
Precipitare
Cromatografie
Centrifugare
Separarea pe baza de afinitate
Extracie lichid-lichid
Electroforez
Percolare
Filtrare
Extracia cu fluid supercritic
Microfiltrare
Ultrafiltrarea
Adsorbie

O schema RIPP (Recuperare, Izolare, Purificare i Conditionare) este schema

utilizata n mod obinuit n bioseparare. Aceast strategie implic utilizarea de
tehnici cu selectivitate mica (de exemplu, precipitare, filtrare, centrifugare, i
cristalizare) n primul rnd pentru recuperare i izolare a compusilor tinta
urmata de tehnici de inalta rezolutie (de exemplu, separari de afinitate,
cromatografia i electroforez) pentru purificare i conditionare.
Tehnicile de rezoluie joas sunt utilizate n primul rnd pentru a reduce n mod
semnificativ volumul i concentraia total a materialului de prelucrat.
Ulterior produsul obtinut este purificat si conditionat prin tehnici de
selectivitate ridicata

Schema RIPP
Pentru elaborarea unui proces de bioseparare ar trebui s fie luate in consideratie urmtoarele aspecte:
1. Natura materiei prime: de ex o suspensie de celule, un produs brut, soluie de protein
2. Locaia iniial a produsului int: de ex intracelular, extracelular, ncorporarea n materiale solide, cum
ar fi includerea in organisme
3. Volumul sau debitul materiei prime
4. Abundena relativ a produsului n materia prim, adic concentraie relativ fa de impuriti
5. Susceptibilitatea la degradare de exemplu stabilitatea la pH, sensibilitate la stres mecanic sau expunerea
la solveni organici
6. Forma fizic dorit a produsului final, de exemplu, este pulbere liofilizata, soluie steril, suspensie

7. Cerinele de calitate, de exemplu, puritate procentual, absena endotoxine sau agregate

8. Costuri

Purificarea anticorpilor monoclonali

Tendine actuale n bioseparare

Principalele dezavantaje ale utilizrii schemei RIPP sunt:
1. Costuri ridicate de capital

2. Costuri operationale ridicate

3. Recuperare nesatisfacatoare a produsului
Odat cu apariia proceselor de separare cu membran i alte noi tipuri de separaii, exist un potenial pentru
a evita schema RIPP convenionala. Procese pe baza de membrane prezinta un debit ridicat si pot fi reglate sau
optimizate pentru a se obine o selectivitate foarte mare. Utilizarea acestor noi tehnici poate reduce n mod
semnificativ n jos numrul de etape necesare pentru biosepararilor. Unele dintre aceste tehnici noi i
emergente sunt:
1. Procedee de membrane si cromatografia tip monolit
2. Cromatografia cu strat extins

3. Ultrafiltrare de mare rezoluie

4. Bioseparari hibride

Cromatografia tip monolit

Cromatografia cu strat extins

Mrimea moleculelor

n tabel sunt prezentate dimensiunile unor substane biologice.

Pentru macromolecule cum ar fi proteine i acizi nucleici mrimea molecular nu poate fi
ntotdeauna reprezentata n termeni cantitativi relativ la diametru, n special atunci cnd aceste
molecule nu sunt sferice de ex. moleculele elipsoidale sau au diverse forme.
Un mod universal de a exprima dimensiunea unor specii nonsferice este diametrul echivalent obtinut
dupa formula Stokes-Einstein. Acest model reprezinta diametrul unei molecule sferice sau particule
avnd aceeai difuzivitate
De exemplu o molecul de protein avnd un diametru Stokes-Einstein de 10 nanometri (nm) are
aceeai difuzivitatea ca o particula sferica cu aceeai densitate avnd un diametru de 10 nm. Acizii
nucleici cum ar fi ADN i ARN au molecule liniare, iar dimensiunile lor nu pot fi exprimate n termenii
diametrului Stokes-Einstein. In schimb dimensiunile lor sunt exprimate n functie de lungimea lor.

Dimensiunea unor molecule biologice

Structura moleculei de ADN

Alfa amilaz
Structura unei molecule de anticorp

In cazul macromoleculelor cum ar fi proteine i acizi nucleici, dimensiunea poate poate fi estimat
folosind metode indirecte.
Dispersia luminii laser funcioneaz destul de bine cu macromolecule mai mari i agregate
macromoleculare, cum ar fi anticorpi.

Cu toate acestea dimensiunilor moleculelor mici i mijlocii nu pot fi estimate n mod satisfctor prin
aceasta tehnica astfel ca se folosesc

tenici bazate pe cromatografia de excludere steric si

ultracentrifugare. Dimensiunea razei Stokes-Einstein a unei macromolecule poate fi estimat din datele
de difuzie folosind urmtoarea ecuaie:
Unde:
D = difuzivitatea (m2 / s)
p = viscozitate (kg / m s)
N =numrul lui Avogadro

Dimensiunea materialului biologic este importanta n procesele de separare cum ar fi filtrarea

convenional, separarea prin membran, sedimentarea, centrifugare, cromatografia de
excludere, electroforez n gel, cromatografia hidrodinamica. Mrimea pulberilor n
suspensie, cum ar fi celulele, resturile celulare i agregatele macromoleculare pot fi msurate
prin tehnici experimentale directe cum ar fi microscopia optic i electronic. Metodele
indirecte, cum ar fi dispersia luminii laser sunt folosite pentru determinarea dimensiunii
particulelor. Pentru particule dense, viteza de sedimentare prin depunere liber ntr-un fluid
care are o densitate mai mic poate fi folosita pentru msurarea mrimii particulelor.
Sedimentarea gravitationala este posibil numai pentru particulele mai mari de 5 microni n
diametru. Raza echivalent (re) a unei particule determinate prin sedimentare liber poate fi
estimat astfel:

m = vscozitate (kg / m s)
uT = viteza terminal (m / s)
rs = densitatea particulei (kg / m3)
rl = densitatea mediului lichid (kg / m3)

Masurarea dimensiunii moleculelor prin dispersia luminii

Greutate molecular
Pentru macromolecule i molecule mai mici, greutatea molecular este adesea corelata
cu marimea lor. Greutatea molecular este exprimat n mod tipic n Daltoni (Da) sau g
/ g-mol sau kg / kg-mol. In cazul acizilor nucleici, cum ar fi plasmidele i ADN-ul
cromozomial, greutatea molecular este frecvent exprimat ca numrul de perechi de
baze de nucleotide prezente (bp).

O pereche de baze este aproximativ echivalent cu 660 kg / kg-mol.

Greutatea molecular fiind legat de mrimea moleculelor este folosit ca marime
orientativa pentru separarea n tehnici ca filtrare in gel, cromatografia hidrodinamica i
separari membranare.
Greutatea molecular a unei substane influeneaz de asemenea si alte proprieti ale
materialului, cum ar fi sedimentarea, difuzia i mobilitatea ntr-un cmp electric ceeace
are un efect indirect n procese, cum ar fi ultracentrifugarea i electroforeza.

Greutile moleculare ale materialelorbiologice

Difuzivitatea

Difuzia se refer la micarea aleatorie a moleculelor din cauza coliziunilor

intermoleculare.
Chiar daca ciocnirile dintre moleculele sunt aleatoare n natur, migraia net a
moleculelor are loc de la un nivel ridicat concentratie ntr-o zon de concentraie
sczut. Difuzivitatea sau coeficientul de difuzie este o msur a tendinei
moleculelor de a difuza. Difuzivitate este un parametru important n majoritatea
proceselor de bioseparare deoarece afecteaz transportul de materie.

Difuzivitatea unor substane biologice.

Coeficientul de sedimentare

Tendina macromoleculelor i a particulelor s se depuna ntr-un mediu lichid este denumita

sedimentare.
Aceasta are la baza procese ca decantare, centrifugare i ultracentrifugare.
Depunerea poate avea loc din cauza gravitaiei ca n decantare sau este indusa artificial din
cauza unui camp gravitaional aplicat ca n cazul centrifugarii. Viteza de depunere depinde de
proprietile speciilor care sedimenteaza, ale mediului lichid, puterea cmpului gravitaional
care, n centrifugare depinde de geometria vasului, localizarea n interiorul vasului i de viteza
la care vasul este rotit. Coeficientul de sedimentarea a unei particule / macromolecule ntr-un

mediu lichid poate fi exprimat astfel:

Unde
v = viteza de sedimentare (m / s)
w = viteza unghiular de rotaie (radiani / s)
r = distana de la axa de rotaie (m)

sau
Unde
M = masa molecular (kg / kg mol)
nM volum molar specific (m3 / kg)
p = densitatea (kg / m3)
f = Factorul de frecare

Coeficienii de sedimentare ai materialelor biologice

Presiune osmotica

Dac o soluie apoas diluat este separat de o zona cu solutie concentrata

printr-o membran semipermeabil care permite numai trecerea apei, se
genereaza o diferen de presiune pe ntreaga suprafata a membranei datorit
tendinei apei s curg dinspre concentratia mica spre cea mare. Procesul are loc
pana cand coloana de lichid formata prin acumularea de lichid in zona
concentrate actioneaza cu o presiune ridicata asupra membrane siastfel nu se
mai produce transferal de solvent iar sistemul ramane in echilibru. Presiunea
produsa de coloana de lichid se numeste presiune osmotica. Acest fenomen se
numeste presiunea osmotic. Concept a fost descris pentru prima data de
fizicianul francez Jean-Antoine Nollet n secolul 18. Presiunea osmotic are un rol
important n bioseparari n special n procesele de separare pe baz de
membran. Presiunea osmotic poate fi corelat cu concentraia substanei
dizolvate. Pentru soluii diluate , ecuaia van't Hoff poate fi folosita pentru a
estima presiune osmotic:

Unde
R = constanta universal a gazelor
T = temperatura absolut (K)
c = concentraia solutului (kg-mol / m3)

Diferena de presiune osmotic printr-o membran

este dat de:
Unde
1 reprezint zona cu concentraie mai mare
2 reprezint zona cu concentraie mai mic

Trebuie remarcat faptul c presiunea osmotic acioneaz din zona concentraie mai
mic catre zona cu concentraie mai mare

Prin aplicarea unei presiuni in zona concentrate se poate realiza

concentrarea mediului biologic din care este necesara extragerea
produsului dorit

Incrcarea electrostatica

Ionii cum ar fi Na+ i CI- transporta sarcini electrostatice n funcie de valena lor.
Incrcarea electrostatic a compuilor chimici se datoreaz prezenei unor grupri
ionizate, cum ar fi -NH3+ si -COO -. Toi aminoacizii au cel puin o grupare COOH i o
grupare NH2. Unii aminoacizi au grupari suplimentare la caten lateral. Dac un
aminoacid este ncrcat sau nencrcat depinde de pH-ul soluiei deoarece acesta
influeneaz gradul de ionizare. In cazul proteinelor care sunt alcatuite dintr-un numr
mare de aminoacizii situaia este mai complex. ncrcarea electrostatic a unei
proteine depinde de pKa i pKb individuale ale aminoacizilor constitueni. n funcie de
pH-ul soluiei, o proteina ar putea avea un impact pozitiv net, neutru sau negativ, adic
este amfotera n natur. La o valoare a pH-ului cunoscut sub numele de punctul su
izoelectric, o protein are aceeai cantitate de sarcini pozitive i sarcini negative, adic
este neutru ntr-un sens global. Deasupra punctului izoelectric o protein are o sarcin
negativ net n timp ce sub aceast valoarea are o sarcin net pozitiv.

Punctele izoelectrice ale proteinelor

Coeficientul de partiie
Coeficientul de partiie este o msur a modului n care se distribuie un compus
ntre dou faze lichide i reprezint baza de separare n procese, cum ar fi
extracia lichid-lichid i cromatografie de partiie.
Raportul dintre concentraiile compusului intre cele dou faze n echilibru se
numete coeficientul de partiie. Pentru compui organici, se utilizeaz

coeficientul de partiie octanol / ap (Ko / w) ca parametru pentru a determina

dac compusul este hidrofil (iubitor de ap) sau hidrofob (respinge apa).

Absorbia luminii
Soluiile de substane absorb diferite lumina la diferite lungimi de und.
Lungimea de und la care un compus absoarbe cantitatea maxim de lumina este
denumit lmax. Moleculele care formeaz soluii colorate de obicei, absorb lumina
vizibil. Proteinele din soluii apoase absorb lumina ultravioleta, in special la 280 nm n
timp ce soluiile apoase de ADN prezinta maxim de adsorbtie la 254 nm. Absorbia
luminii se datoreaz prezenei unor grupuri specifice n aceste molecule numite

cromofori. Absorbia luminiinu este o proprietate care sa favorizeze separarea, ci un

parametru important prin care se monitorizeaza compuii n timpul unui proces de
separare de ex cromatografie de lichide

Unde
Ii Intensitatea luminii incidente
It intensitatea luminii transmise

n conformitate cu legea Beer-Lambert, care rmne valabila in

soluii diluate:

Unde
a = absorbana specific (m2 / kg)
C = concentraia (kg / m3)
L = drum optic (m)

Fluorescen
Anumii compui prezint fluorescen,
adic emit lumin dup ce absorb o radiatie
cu o frecven mai mare. Astfel de
substane
sunt
numite
substane
fluorescente. Exemplele includ proteine i
acizi nucleici. Compui specifici absorb i
emit lumin de lungimi de und specifice.
Fluorescena nu este o proprietate utila
pentru separare ci un parametru important,
prin care e monitorizeaza diferite substane
n timpul separrii de ex ca n cromatografia
lichid. De asemenea, este un instrument
important prin care concentraia i
puritatea substanelor poate fi determinat