Ion Exchange Chromatography: Principles and Methods

Ion Exchange
Chromatography
Principles and Methods
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Collection
18-1114-21
Edition AA
Ion Exchange
Chromatography
Principles and Methods
ISBN 91 970490-3-4
Contents
1.
Introduction ............................................................................................9
2.
Ion exchange chromatography .........................................................10

The theory of ion exchange .................................................................10
The matrix.....................................................................................11
Charged groups .............................................................................13
Resolution in ion exchange chromatography .................................13
Capacity factor ........................................................................15
Efficiency.................................................................................16
Selectivity.................................................................................17
Capacity ........................................................................................18
3.
Product Guide .......................................................................................20

MonoBeads ...................................................................................20
MiniBeads .....................................................................................20
SOURCE .......................................................................................20
Sepharose High Performance ion exchangers .................................21
Sepharose Fast Flow ion exchangers ..............................................21
Sepharose Big Beads ion exchangers...............................................21
STREAMLINE ion exchangers ......................................................21
DEAE Sepharose CL-6B and CM Sepharose CL-6B .......................22
DEAE Sephacel..............................................................................22
Sephadex ion exchangers ...............................................................22
Bulk quantities...............................................................................22
Equipment.....................................................................................22
4.
MonoBeads and MiniBeads ..............................................................23

MonoBeads.....................................................................................23
Properties ......................................................................................24
Chemical stability ....................................................................24
Physical stability ......................................................................25
Flow rate..................................................................................27
Capacity ..................................................................................27
Recovery..................................................................................28
Reproducibility ........................................................................29
Availability ....................................................................................30
MiniBeads .......................................................................................30
Properties ......................................................................................31
Availability ....................................................................................33
5.
SOURCE ................................................................................................34
Properties ......................................................................................37
Flow rate..................................................................................38
Capacity ..................................................................................40
Recovery..................................................................................40
Availability ....................................................................................41
6.
Sepharose based ion exchangers .......................................................42

Chemical stability ..........................................................................42
Physical stability ............................................................................43
Sepharose High Performance ion exchangers.........................43
Properties ......................................................................................44
Capacity ..................................................................................44
Flow rate..................................................................................46
Availability ....................................................................................46
Sepharose Fast Flow ion exchangers ........................................46
Properties ......................................................................................47
Capacity ..................................................................................47
Flow rate..................................................................................49
Availability ....................................................................................50
Sepharose Big Beads ion exchangers .........................................50
Properties ......................................................................................51
Physical properties ...................................................................51
Capacity ..................................................................................51
Flow rate..................................................................................51
Availability ....................................................................................51
STREAMLINE SP and STREAMLINE DEAE ......................52
Properties ......................................................................................53
Capacity ..................................................................................53
Availability ....................................................................................54
DEAE Sepharose CL-6B and CM Sepharose CL-6B .............54
Properties ......................................................................................54
Capacity ..................................................................................55
Flow rate..................................................................................56
Availability ....................................................................................57
7.
DEAE Sephacel .....................................................................................58

Properties ......................................................................................58
Capacity ..................................................................................59
Flow rate..................................................................................60
Availability ....................................................................................60
8.
Sephadex ion exchangers ...................................................................61

Properties ......................................................................................61
Physical stability ............................................................................62
Swelling ...................................................................................62
Ionic strength dependence ........................................................62
pH dependence ........................................................................62
Capacity ..................................................................................62
Availability ....................................................................................64
9.
Experimental design ............................................................................65

Choice of ion exchanger ..............................................................65
Specific requirements of the application .........................................65
Column separation, batch separation or...................................65
expanded bed adsorption
The scale of the separation .......................................................65
The required resolution ............................................................65
The required throughput ..........................................................66
Scaleability...............................................................................66
Economy .................................................................................67
The molecular size of the sample components ................................67
Choice of exchanger group ............................................................68
Determination of starting conditions .......................................69
The isoelectric point .................................................................69
Test-tube method for selecting starting pH ...............................69
Electrophoretic titration curves (ETC) .....................................70
Chromatographic titration curves (retention maps) ..................74
Choice between strong and weak ion exchangers ...........................76
Choice of buffer.............................................................................76
Choice of buffer pH and ionic strength.....................................76
Choice of buffer substance .......................................................77
Test-tube method for selecting starting ionic strengths..............79
10. Experimental Technique.....................................................................80

Column chromatography ............................................................80
Choice of column...........................................................................80
Column design .........................................................................80
Column dimensions .................................................................81
Quantity of ion exchanger .............................................................81
Preparation of the ion exchanger ...................................................81
Pre-swollen ion exchangers ......................................................81
Pre-packed ion exchange media ...............................................81

Sephadex ion exchangers .........................................................82
Alternative counter-ions ...........................................................82
Decantation of fines .................................................................82
Packing the column........................................................................82
Column Packing Video Film.....................................................82
Checking the packing ...............................................................83
Equilibrating the bed ...............................................................84
Sample preparation........................................................................85
Sample concentration...............................................................85
Sample composition .................................................................85
Sample volume.........................................................................85
Sample viscosity .......................................................................85
Sample preparation ..................................................................86
Sample application ........................................................................87
Sample application with an adaptor .........................................87
Other methods of sample application.......................................89
Sample application onto a drained bed .....................................89
Sample application under the eluent .........................................89
Elution ..........................................................................................90
Change of pH ..........................................................................90
Change of ionic strength ..........................................................91
Gradient direction....................................................................91
Choice of gradient type ............................................................91
Resolution using a continuous gradient ....................................93
Choice of gradient shape ..........................................................94
Sample displacement ................................................................95
Gradient generation.......................................................................96
Gradient formation with two pumps or a single pump .............96
in combination with a switch valve
Gradient Mixer ........................................................................96
Batch separation ............................................................................97
Expanded bed adsorption ...........................................................98
Expanded bed technology ..............................................................99
Basic principle of operation............................................................99
STREAMLINE adsorbents ..........................................................100
STREAMLINE columns ..............................................................100
Auxiliary equipment ....................................................................100
Regeneration ................................................................................101
Cleaning, sanitization and sterilization procedures ............101
Cleaning ......................................................................................101
Sanitization .................................................................................101
Sterilization .................................................................................101
Protocols for cleaning-in-place (CIP),...........................................102
sanitization and sterilization
SOURCE and Sepharose Based ion exchangers......................102

MonoBeads and MiniBeads columns......................................102
DEAE Sephacel and Sephadex based ion exchangers..............103
Storage of gels and columns......................................................103
Prevention of microbial growth..............................................103
Storage of unused media ........................................................104
Storage of used media ............................................................104
Storage of packed columns.....................................................104
Determination of the available and dynamic capacities .....104
Calculation ............................................................................106
11. Process considerations .....................................................................107

Defining the purpose ..................................................................108
The strategic focus ......................................................................109
Capture .......................................................................................109
Intermediate purification .............................................................111
Polishing......................................................................................111
Selection of chromatography media .......................................112
Base matrix properies and derivitization chemistry.................113
Bead size ................................................................................113
Documentation and technical support....................................113
Regulatory support ................................................................113
Vendor certification ...............................................................114
Delivery capacity ...................................................................114
Method design and optimization ............................................114
Binding conditions.......................................................................114
Elution ........................................................................................115
Sample load .................................................................................116
Flow rate .....................................................................................117
Selecting a column ......................................................................118
Aspects of column design .............................................................119
Flow distribution system ........................................................119
Material resistance and durability ..........................................119
Sanitary design.......................................................................119
Pressure vessel safety..............................................................120
Regulatory support ................................................................120
Ergonomics............................................................................120
Packing large scale columns......................................................120
Column configuration .................................................................120
Packing the column......................................................................121
Scale-up .........................................................................................121
12. Applications ........................................................................................124

The design of a biochemical separation ........................................124
Application examples ..................................................................127
Enzymes ................................................................................127
Isoenzymes ............................................................................128
Immunoglobulins...................................................................129
Nucleic acid separation ..........................................................129
Polypeptides and polynucleotides...........................................130
Antisense phosphorothioate oligonucleotides .........................132
Areas of application.....................................................................133
Purification of a recombinant Pseudomonas ...............................136
aeruginosa exotoxin A, PE553D
Strategy..................................................................................141
13. Fault-finding chart .............................................................................143

14. Ordering information .......................................................................151
15. References ............................................................................................155
BioProcess
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BioProcess Media are designed, manufactured and supported for

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Scaleable performance from bench top to production hall.
Compatible large scale columns and equipment.
Well documented cleaning and sanitization methods.
Media shown to perform well in real downstream applications from Capture to
Polishing, from synthetic oligonucleotides to recombinant proteins.
High and reliable productivity in the production hall.
Media that fulfill the above described criteria are labelled with the BioProcess Media
symbol in Chapter 3.
1. Introduction
Adsorption chromatography depends upon interactions of different types between
solute molecules and ligands immobilized on a chromatography matrix. The first
type of interaction to be successfully employed for the separation of macromolecules was that between charged solute molecules and oppositely charged moieties
covalently linked to a chromatography matrix. The technique of ion exchange
chromatography is based on this interaction.
Ion exchange is probably the most frequently used chromatographic technique for
the separation and purification of proteins, polypeptides, nucleic acids, polynucleotides, and other charged biomolecules (1). The reasons for the success of ion
exchange are its widespread applicability, its high resolving power, its high capacity, and the simplicity and controllability of the method.
This handbook is designed as an introduction to the principles of ion exchange
chromatography and as a practical guide to the use of the media available from
Pharmacia Biotech. The handbook is illustrated with examples of different types
of biological molecules which have been separated using ion exchange chromatography and different ways the technique can be used. For information on specific
separations, the reader is recommended to consult the original literature.
2. Ion exchange chromatography

The theory of ion exchange
Separation in ion exchange chromatography depends upon the reversible adsorption of charged solute molecules to immobilized ion exchange groups of opposite
charge. Most ion exchange experiments are performed in five main stages. These
steps are illustrated schematically below.
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Fig. 1. The principle of ion exchange chromatography (salt gradient elution).
The first stage is equilibration in which the ion exchanger is brought to a starting
state, in terms of pH and ionic strength, which allows the binding of the desired
solute molecules. The exchanger groups are associated at this time with exchangeable counter-ions (usually simple anions or cations, such as chloride or sodium).
The second stage is sample application and adsorption, in which solute molecules
carrying the appropriate charge displace counter-ions and bind reversibly to the
gel. Unbound substances can be washed out from the exchanger bed using starting
buffer.
In the third stage, substances are removed from the column by changing to elution
conditions unfavourable for ionic bonding of the solute molecules. This normally
involves increasing the ionic strength of the eluting buffer or changing its pH. In
Figure 1 desorption is achieved by the introduction of an increasing salt concentration gradient and solute molecules are released from the column in the order of
their strengths of binding, the most weakly bound substances being eluted first.
10
The fourth and fifth stages are the removal from the column of substances not eluted under the previous experimental conditions and re-equilibration at the starting
conditions for the next purification.
Separation is obtained since different substances have different degrees of interaction with the ion exchanger due to differences in their charges, charge densities
and distribution of charge on their surfaces. These interactions can be controlled
by varying conditions such as ionic strength and pH. The differences in charge
properties of biological compounds are often considerable, and since ion exchange
chromatography is capable of separating species with very minor differences in
properties, e.g. two proteins differing by only one charged amino acid, it is a very
powerful separation technique.
In ion exchange chromatography one can choose whether to bind the substances
of interest and allow the contaminants to pass through the column, or to bind the
contaminants and allow the substance of interest to pass through. Generally, the
first method is more useful since it allows a greater degree of fractionation and
concentrates the substances of interest.
The conditions under which substances are bound (or free) are discussed in detail
in the sections dealing with choice of experimental conditions, Chapter 9. In addition to the ion exchange effect, other types of binding may occur. These effects are
small and are mainly due to van der Waals forces and non-polar interactions.
Ion exchange separations may be carried out in a column, by a batch procedure or
by expanded bed adsorption. All three methodologies are performed in the stages
of equilibration, sample adsorption etc. described previously.
The matrix
An ion exchanger consists of an insoluble matrix to which charged groups have
been covalently bound. The charged groups are associated with mobile counterions. These counter-ions can be reversibly exchanged with other ions of the same
charge without altering the matrix.
It is possible to have both positively and negatively charged exchangers (Fig. 2).
Positively charged exchangers have negatively charged counter-ions (anions) available for exchange and are called anion exchangers. Negatively charged exchangers have positively charged counter-ions (cations) and are termed cation exchangers.
The matrix may be based on inorganic compounds, synthetic resins or polysaccharides. The characteristics of the matrix determine its chromatographic properties
such as efficiency, capacity and recovery as well as its chemical stability, mechanical
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Fig. 2. Ion exchanger types.
strength and flow properties. The nature of the matrix will also affect its behaviour towards biological substances and the maintenance of biological activity.
The first ion exchangers were synthetic resins designed for applications such as
demineralisation, water treatment, and recovery of ions from wastes. Such ion
exchangers consist of hydrophobic polymer matrices highly substituted with ionic
groups, and have very high capacities for small ions. Due to their low permeability
these matrices have low capacities for proteins and other macromolecules. In addition, the extremely high charge density gives very strong binding and the hydrophobic matrix tends to denature labile biological materials. Thus despite their
excellent flow properties and capacities for small ions, these types of ion exchanger are unsuitable for use with biological samples.
The first ion exchangers designed for use with biological substances were the cellulose ion exchangers developed by Peterson and Sober (2). Because of the hydrophilic nature of cellulose, these exchangers had little tendency to denature proteins.
Unfortunately, many cellulose ion exchangers had low capacities (otherwise the
cellulose became soluble in water) and had poor flow properties due to their irregular shape.
Ion exchangers based on dextran (Sephadex), followed by those based on agarose
(Sepharose CL-6B) and cross-linked cellulose (DEAE Sephacel) were the first ion
exchange matrices to combine a spherical form with high porosity, leading to
improved flow properties and high capacities for macromolecules. Subsequently,
developments in gel technology have enabled this macroporosity to be extended to
the highly cross-linked agarose based media such as Sepharose High Performance,
Sepharose Fast Flow and Sepharose Big Beads, and the synthetic polymer matrices,
MonoBeads, and SOURCE. These modern media enable fast, high capacity, high
resolution ion exchange chromatography to be carried out at both analytical and
preparative scales. Non-porous polymer matrices, e.g. MiniBeads, are available
for extremely high resolution micropreparative or analytical separations.
12
Charged groups
The presence of charged groups is a fundamental property of an ion exchanger.
The type of group determines the type and strength of the ion exchanger; their
total number and availability determines the capacity. There is a variety of groups
which have been chosen for use in ion exchangers (3); some of these are shown in
Table 1.
Table 1. Functional groups used on ion exchangers.
Anion exchangers
Functional group
Diethylaminoethyl (DEAE)
-O-CH2-CH2-N+H(CH2CH3)2
Quaternary aminoethyl (QAE)
-O-CH2-CH2-N+(C2H5)2-CH2-CHOH-CH3
Quaternary ammonium (Q)
-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3
Cation exchangers
Functional group
Carboxymethyl (CM)
-O-CH2-COO-
Sulphopropyl (SP)
-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2SO3-
Methyl sulphonate (S)
-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2SO3-
Sulphonic and quaternary amino groups are used to form strong ion exchangers;
the other groups form weak ion exchangers. The terms strong and weak refer to
the extent of variation of ionization with pH and not the strength of binding.
Strong ion exchangers are completely ionized over a wide pH range (see titration
curves on page 49) whereas with weak ion exchangers, the degree of dissociation
and thus exchange capacity varies much more markedly with pH.
Some properties of strong ion exchangers are:
Sample loading capacity does not decrease at high or low pH values due to loss
of charge from the ion exchanger.
A very simple mechanism of interaction exists between the ion exchanger and
the solute.
Ion exchange experiments are more controllable since the charge characteristics
of the media do not change with changes in pH. This makes strong exchangers
ideal for working with data derived from electrophoretic titration curves. (see
Chapter 9)
Resolution in ion exchange chromatography

This section discusses the main theoretical parameters which affect the separation
in ion exchange chromatography. For more in-depth information the reader is
referred to standard works on the subject (4, 5).
The result of an ion exchange experiment, as with any other chromatographic
separation, is often expressed as the resolution between the peaks of interest.
13
The resolution (Rs) is determined from the chromatogram as shown in Figure 3.

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Fig. 3. Determination of the resolution (Rs) between two peaks.
The resolution is defined as the distance between peak maxima compared with the
average base width of the two peaks. Elution volumes and peak widths should be
measured with the same units to give a dimensionless value to the resolution.
Rs is a measure of the relative separation between two peaks and can be used to
determine if further optimization of the chromatographic procedure is necessary.
If Rs = 1.0 (Fig. 4) then 98% purity has been achieved at 98% of peak recovery,
provided the peaks are Gaussian and approximately equal in size. Baseline resolution requires that Rs 1.5. At this value purity of the peak is 100%.
Note: A completely resolved peak is not equivalent to a pure substance. This peak
may represent a series of components which are not resolvable using the selected
separation parameter.
The resolution achievable in a system is proportional to the product of the selectivity, the efficiency and the capacity of the system, the three most important parameters to control in column chromatography. The analytical expression for Rs is:
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Fig. 4. Separation results with different resolutions.
Capacity factor
The capacity or retention factor k is a measure of the retention of a component
and should not be confused with loading capacity (mg sample/ml) or ionic capacity (mmol/ml).
The capacity factor is calculated for each individual peak. For example k for peak
1 in Figure 5 is derived from the equation:
VR1 - Vt
capacity factor k =
Vt
In the equation for Rs, k is the average of k1 and k2.
Adsorption techniques such as ion exchange chromatography can have high
capacity factors since experimental conditions can be chosen which lead to peak
retention volumes greatly in excess of Vt (Vt is also often denoted Vm). This can
15
be seen in contrast with the technique of gel filtration where capacity is limited
since all peaks must elute within the volume (Vt - V0).
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Fig. 5. Hypothetical chromatogram. V0 = void volume, VR1 = elution volume for peak 1,
VR2 = elution volume for peak 2, Vt = total volume, wb1 = peak width for peak 1, wb2 =
peak width for peak 2.
Efficiency
The column efficiency is related to the zone broadening which occurs on the
column and can be calculated from the expression:
N = 5.54
VR1 2
where wh is the peak width
wh
at half peak height
( )
and is expressed as the number of theoretical plates (N) for the column under specified experimental conditions. Efficiency is frequently stated as the number of
theoretical plates per metre chromatographic bed, or expressed as H (height equivalent to a theoretical plate, HETP), which is the bed length (L) divided by the
plate number.
H = L/N
Since the observed value for N depends on experimental factors such as flow rate
and sample loading, it is important that comparisons are done under identical conditions. In the case of ion exchange chromatography, efficiency is measured under
isocratic conditions, using a substance which does not interact with the matrix,
e.g. acetone.
16
One of the main causes of zone broadening in a chromatography bed is longitudinal diffusion of the solute molecules. The effect is minimized if the distances available for diffusion, in both the mobile phase and stationary phase, are minimized.
In practice this is achieved by using small uniform bead sizes and important developments in ion exchange chromatography have been the introduction of 10 m
and 15 m diameter particles such as MonoBeads and SOURCE, to give high efficiency preparative media. The highest efficiency is achieved with the non-porous,
3 m diameter MiniBeads, designed for analytical and micropreparative
applications.
After bead size, the second major contributory factor to efficiency is good experimental technique. Badly, unevenly packed chromatography beds and air bubbles
will lead to channelling, zone broadening and loss of resolution. Good separations
require well packed columns and the importance of column packing increases in
direct proportion to the performance required.
Selectivity
The selectivity (a) defines the ability of the system to separate peaks i.e. the distance between two peaks. The selectivity factor can be calculated from the chromatogram (Fig. 5) using the expression
a=
k2
k1
VR2 - V0
VR2
VR1 - V0
VR1
Good selectivity is a more important factor than high efficiency in determining

resolution (Fig. 6) since Rs is linearly related to selectivity but quadratically related
to efficiency. This means that a four fold increase in efficiency is required to double the resolution under isocratic conditions.
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Fig. 6. The effect of selectivity and efficiency on resolution.
17
Selectivity in ion exchange chromatography depends not only on the nature and
number of the ionic groups on the matrix but also on the experimental conditions,
such as pH and ionic strength. It is the ease and predictability with which these
experimental conditions, and thus the selectivity, can be manipulated which gives
ion exchange chromatography the potential of extremely high resolution.
Capacity
The capacity of an ion exchanger is a quantitative measure of its ability to take up
exchangeable counter-ions and is therefore of major importance. The capacity
may be expressed as total ionic capacity, available capacity or dynamic capacity.
The total ionic capacity is the number of charged substituent groups per gram dry
ion exchanger or per ml swollen gel. Total capacity can be measured by titration
with a strong acid or base.
The actual amount of protein which can be bound to an ion exchanger, under defined experimental conditions, is referred to as the available capacity for the gel. If
the defined conditions include the flow rate at which the gel was operated, the
amount bound is referred to as the dynamic capacity for the ion exchanger. Available and dynamic capacities depend upon:
The properties of the protein.
The properties of the ion exchanger.
The chosen experimental conditions.
The properties of the protein which determine the available or dynamic capacity
on a particular ion exchange matrix are its molecular size and its charge/pH relationship. The capacity of an ion exchanger is thus different for different proteins.
On a porous matrix used for ion exchange chromatography, molecules which are
small enough to enter the pores will exhibit a higher available capacity than those
molecules which are restricted to the charged substituents on the surface of the gel.
Similarly, since the interaction is ionic, the proteins charge/pH relationship must
be such that the protein carries the correct net charge, at a sufficiently high surface
charge density, to be bound to a particular ion exchanger under the chosen buffer
conditions.
The properties of the ion exchange matrix which determine its available capacity
for a particular protein are the exclusion limit of the matrix, and the type and
number of the charged substituents. High available capacity is obtained by having
a matrix which is macroporous and highly substituted with ionic groups which
maintain their charge over a wide range of experimental conditions. Non-porous
18
matrices have considerably lower capacity than porous matrices, but higher efficiency due to shorter diffusion distances.
The experimental conditions which affect the observed capacity are pH, the ionic
strength of the buffer, the nature of the counter-ion, the flow rate and the temperature. The flow rate is of particular importance with respect to dynamic capacity,
which decreases as the flow rate is increased. These conditions should always be
taken into consideration when comparing available capacities for different ion
exchangers.
Methodologies for determining the available and dynamic capacities for an ion
exchanger are given in Chapter 10.
19
3. Product Guide
Pharmacia Biotech manufactures a wide range of ion exchange media suitable for
analytical, micropreparative, small scale preparative, and process scale applications. The product range is summarized below.
MonoBeads (page 23)

Mono Q and Mono S are strong ion exchangers based on MonoBeads, monodisperse 10 m hydrophilic polymer particles. Mono Q and Mono S are the established standards for high performance ion exchange separations and are best suited
for analytical and small scale preparative applications.
MiniBeads (page 30)

MiniBeads, a non-porous matrix of monodisperse 3 m hydrophilic polymer particles, is the base for two strong ion exchangers, Mini Q and Mini S. Both media
are available pre-packed in Precision Columns 3.2/3, for micropreparative chromatography in SMART System. With a specially designed column holder, these
columns can also be used in FPLC and HPLC systems.
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SOURCE (page 34)
SOURCE 15Q, SOURCE 15S, SOURCE 30Q and SOURCE 30S are strong ion
exchangers based on the same type of rigid polymer matrix as MonoBeads, polystyrene/divinyl benzene beads. SOURCE 15Q and SOURCE 15S are based on
15 m monodisperse particles while SOURCE 30Q and SOURCE 30S are based
on 30 m mondisperse particles. SOURCE ion exchange media are designed for
high performance applications at both research and industrial scales. They provide
high capacity at high flow rates and at a minimum of back-pressure, thus allowing
short cycle times, high productivity and scaleability.
SOURCE 15 matrices are ideal for purification when very high resolution (efficiency) is required. SOURCE 30 matrices gives, in comparison with SOURCE 15
matrices, slightly less resolution (lower efficiency) but at much lower back-pressure. This makes SOURCE 30 ideal for purification with more complex samples and
larger volumes. Using SOURCE 30, a higher degree of purification can be obtained with high productivity. Typically working flow rate ranges for ion exchangers
based on SOURCE 15 and SOURCE 30 are 30-600 cm/h and 300-1000 cm/h
respectively.
20
Sepharose High Performance ion exchangers

(page 43)
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Q and SP Sepharose High Performance are strong ion exchangers based on a 34

m highly cross-linked agarose matrix, providing high physical and chemical stability. These media are ideal for intermediate and final purification. They should
be used when resolution is the main objective. As resolution and efficiency are
maintained with increasing column diameter and sample load, separations using
these media are easy to scale up. Typical working flow rates are 50-150 cm/h.
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Sepharose Fast Flow ion exchangers (page 46)
Sepharose Fast Flow ion exchangers are based on 90 m highly cross-linked 6%

agarose beads of high chemical and physical stability. The range consists of the
weak exchangers DEAE Sepharose Fast Flow and CM Sepharose Fast Flow as well
as the strong exchangers Q Sepharose Fast Flow and SP Sepharose Fast Flow. The
exceptional flow characteristics make these ion exchangers the first choice for
separating crude mixtures early in a purification scheme. Here, fast removal and a
combination of good resolution and high flow rate are essential. Typical working
flow rates for these media are 100-300 cm/h. Sepharose Fast Flow ion exchangers
are ideal for purifications with high demands on productivity.
BioProcess
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Sepharose Big Beads ion exchangers (page 50)
Q and SP Sepharose Big Beads are strong ion exchangers designed for industrial
applications. They are based on 100-300 m highly cross-linked 6% agarose
beads. The large particle size combined with high physical stability of the base
matrix ensures rapid processing, even for viscous samples. Sepharose Big Beads is
therefore the choice at the beginning of a purification scheme, where viscosity and
back-pressure may limit the throughput attainable with ion exchangers based on
smaller bead sizes, such as Sepharose Fast Flow ion exchangers. The medium
should be chosen when large volumes are handled and fast adsorption is required
and when resolution is of less importance.
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STREAMLINE ion exchangers (page 52)
STREAMLINE adsorbents, available as STREAMLINE DEAE and

STREAMLINE SP, are specially designed for use in STREAMLINE columns for
expanded bed adsorption. Together they enable the high flow rates needed for
high productivity in industrial applications of fluidized beds. STREAMLINE
adsorbents, based on cross-linked 6% agarose beads with a mean particle size of
200 m, are designed to handle samples directly from both fermentation homogenates and crude samples from cell culture/fermentation at working flow rates of
typically 200-400 cm/h.
21
DEAE Sepharose CL-6B and CM Sepharose CL-6B

(page 54)
DEAE and CM Sepharose CL-6B ion exchangers are based on 90 m cross-linked
6% agarose beads. These two gels are the traditional agarose based ion exchangers from Pharmacia Biotech. Their performance has been demonstrated in several
hundred applications for the separation of proteins, polysaccharides, nucleic
acids, membrane components and other high molecular weight substances.
Sepharose CL-6B based ion exchangers are typically used with working flow rates
of up to 60 cm/h.
DEAE Sephacel (page 58)

DEAE Sephacel is a beaded cellulose ion exchanger for separations over a wide
molecular weight range (up to l x 106 for globular proteins). DEAE Sephacel is the
medium of choice when a cellulose ion exchanger is needed for standard chromatography of proteins, nucleic acids or other biopolymers.
Sephadex ion exchangers (page 61)

Sephadex ion exchangers are bead-formed media based on cross-linked dextran.
They are available as strong and weak ion exchangers covering the pH range 2-10.
Sephadex ion exchanger are suitable for batch-type applications.
Bulk quantities
All Pharmacia Biotech ion exchangers are available in larger pack sizes or larger
pre-packed columns. Contact your local Pharmacia Biotech supplier for further
information.
Equipment
Pharmacia Biotech also supply a full range of equipment for operating all of the
ion exchangers covered in this handbook. Information regarding specific equipment is available upon request from Pharmacia Biotech.
22
4. MonoBeads and MiniBeads

MonoBeads
MonoBeads are unique, highly efficient, pH stable ion exchange media, specifically designed for high resolution separations of proteins, peptides, and oligonucleotides. An example of the type of separation which can be achieved is shown in
Figure 7.
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Fig. 7. Characterization of venom from the White Faced Hornet by cation exchange chromatography (6).
Conditions: Venom (7 mg) dissolved in 50 mM BICINE, pH 8.4 (buffer A); Column,
Mono S HR 5/5; Buffer B, 0.35 M NaCl in Buffer A; Gradient, 0-100% B in 40 ml; flow
rate, 1 ml/min; detection, 280 nm at 0.05 AUFS.
MonoBeads ion exchangers are based on a 10 m beaded hydrophilic polystyrene/divinyl benzene resin which has been substituted with quaternary amine groups
to yield the strong anion exchanger, Mono Q, or with methyl sulphonate groups
to yield the strong cation exchanger, Mono S.
Note: Substitution with the same ionic groups as Polybuffer Exchanger PBE 94
gives Mono P - the matrix used for high resolution chromatofocusing. For further
information on the technique and media for chromatofocusing the reader should
contact Pharmacia Biotech.
23
The name MonoBeads is derived from the unique monodisperse nature of the
matrix. This monodispersity (Fig. 8) was accomplished through a process developed by Professor John Ugelstad of SINTEF, Trondheim, Norway.
Fig. 8. An electron micrograph of MonoBeads showing their distinct monodispersity.
The resolution which can be achieved on any chromatographic matrix is a result

of a combination of the efficiency and selectivity of the system. Maximum efficiency is obtained through the use of small, perfectly spherical, monodisperse particles, optimally packed in a well designed column. All pre-packed MonoBeads
columns have efficiencies at about 25 000 plates per metre. High efficiency, coupled with the excellent selectivity of the Q and S substituents, results in high resolution separations.
Scale-up to SOURCE Q and S (see Chapter 5), Q and SP Sepharose High
Performance and Q and SP Sepharose Fast Flow (see Chapter 6) is simple, since
these gels have similar selectivities to MonoBeads based media.
Properties
Chemical stability
The gels are stable for continuous use in the pH range 2-12, although pH values as
high as 14 can be used during cleaning and sanitizing procedures. MonoBeads can
be used with solutions of most buffers used in biochemical separations of biomolecules and in water-alcohol (C1 - C4) and acetonitrile-water solutions.
The resistance of the MonoBeads matrix to organic solvents allows complete cleaning and the use of conditions necessary for the solubilization of very hydrophobic
samples. An example of the use of MonoBeads with organic solvents is given in
Figure 9, which shows the analysis of the peptide bacitracin on Mono S using
lithium chlorate as the eluting salt and 90% methanol as the liquid phase (7).
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Fig. 9. Separation of the peptide bacitracin on Mono S.

(Work by Pharmacia
Biotech, Uppsala, Sweden.)
Dimethylsulphoxide (DMSO) and similar solvents can be used, but will change the
separation properties of the gels. Aqueous solutions of urea, ethylene glycol and
similar compounds can be used but will increase the back-pressures due to their
higher viscosities. Non-ionic detergents, zwitterionic detergents or detergents with
the same charge as the ion exchange groups may be used. Oxidizing agents should
be avoided.
Physical stability
MonoBeads are based on highly rigid beads which means that they can be used at
high flow rates. As a consequence of the monodisperse nature of the matrix these
high flow rates do not result in high back-pressures. For example, an HR 5/5
column (5 mm inner diameter and 50 mm bed height) packed with a MonoBeads
matrix normally generates a back-pressure of 1.0-1.5 MPa (10-15 bar) when operated at a flow rate of 1 ml/min (300 cm/h).
Note: These back-pressures are beyond the operating limits of standard laboratory
peristaltic pumps.
25
A summary of the characteristics of MonoBeads is shown in Table 2.

Table 2. Characteristics of MonoBeads.
Properties
Mono Q
Mono S
Type of gel
strong anion exchanger
strong cation exchanger
Charged group
-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH -CHOH-CH SO -
Total ionic capacity (moles/ml gel)
270-370
140-180
Thyroglobulin (MW 669 000)
25
N.D.
HSA (MW 68 000)
65
N.D.
a-lactalbumin (MW 14 300)
80
N.D.
IgG (MW 150 000)
N.D.
75
Ribonuclease (MW 13 700)
N.D.
75
Typical protein recoveries (%)
90-100
90-100
Typical enzyme activity recoveries (%)
>80
>80
Average particle size (m)
10 0.5
10 0.5
MW range (proteins)
up to 107
up to 107
working pH range*
3-11
3-11
pH stability**
long term
2-12
2-12
short term
2-14
2-14
Total protein binding capacity (mg/ml gel)
N.D. = Not determined

Solvent restrictions: The ion exchangers are stable in alcohol/water solutions (C1-C4). 100% dimethyl
sulphoxide, dimethylformamide, and formic acid can change the separation properties of the gel.
Avoid oxidizing and reactive reagents. Detergents can be used if they are non-ionic or have the same
charge as the gel.
* working pH range refers to the pH range over which the ion exchange groups remain charged and
maintain consistently high capacity.
** pH stability, long term refers to the pH interval where the gel is stable over a long period of time
without adverse effects on its subsequent chromatographic performance.
pH stability, short term refers to the pH interval for regeneration and cleaning procedures.
26
Flow rate
The rigid monodisperse nature of the media enables high flow rates to be used on
MonoBeads columns. Normal recommended flow rates for high resolution separations are in the range 150 to 600 cm/h for HR 5/5 columns. Higher flow rates
can be used during column washing and regeneration.
In addition, the absence of buffering capacity means that buffer exchange and
re-equilibration can be executed quickly and with small amounts of buffer. Details
of the recommended flow rates to be used on the different columns are given in
Table 3.
Capacity
The high substitution levels coupled with the large pore size of the matrix, the
exclusion limit for globular proteins is 107, give MonoBeads exchangers high
capacities for large proteins as well as for smaller polypeptides and peptides.
Typical saturation capacities are in the range of 60 mg protein per ml of gel and
typical sample loading capacities are in the region of 25 mg of protein per ml of
gel. Data on the saturation capacities for some specific proteins are given in
Table 2.
Table 3. Chromatographic properties of pre-packed columns of MonoBeads.
Properties
PC 1.6/5
HR 5/5
HR 10/10
HR 16/10
BioPilot Column
35/100
60/100
Column volume (ml)
0.1
20
100
300
Column dimensions
i.d. x bed height (mm)
1.6x50
5x50
10x100
16x100
35x100
60x100
0.01-0.40
0.5-2.0
up to 6
up to 10
up to 32
up to 94
Number of theoretical
plates per meter (N/m)
25 000
25 000
25 000
25 000
25 000
25 000
Normal separation
times (min)
5-20
5-20
40
40
60-90
60-90
Recommended working
flow rate range (ml/min)
Max operating
pressure (MPa)
27
The titration curves for Mono Q and Mono S (Fig. 10) show no buffering capacity which means that the loading capacity does not vary with pH over the working
range of the gel.
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Fig. 10. Titration curves for Mono Q and Mono S. (Work by Pharmacia Biotech,
Uppsala, Sweden.)
Recovery
Non-specific interactions to the MonoBeads matrix are very low and consequently recoveries are high. Recoveries of protein mass are typically 90-100% and of
protein activity greater than 80%. Examples of protein activity recoveries are
shown in Table 4.
Table 4. Protein activity recoveries (%) from MonoBeads columns.
Protein
Mono Q
Mono S
b-Glucuronidase
b-Glucosidase
Phosphodiesterase
Creatine Kinase
Enolase
Lactate Dehydrogenase
Aldolase
106
N.D.
80
90
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
93
N.D.
N.D.
95
102
94
28
Reproducibility
The stability of the MonoBeads matrix together with controlled synthesis and
column packing procedures ensure very reproducible separations both over time
and from column to column. Figure 11 shows the reproducibility of a separation
performed on three different Mono S columns.
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Fig. 11. Reproducible separations on three Mono S HR 5/5 columns. (Work by

Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)
29
Availability
Mono Q and Mono S are available pre-packed in columns HR 5/5, HR 10/10
and HR 16/10, containing 1, 8 and 20 ml of gel respectively. The media are also
available in BioPilot Columns 35/100 and 60/100 containing respectively 100 and
300 ml bed volumes, for chromatography at BioPilot scale. MonoBeads ion
exchangers are also available as Mono Q PC 1.6/5 and Mono S PC 1.6/5, prepacked columns specially designed for micropurification on SMART System.
These columns can also be used in other high performance chromatography systems by using a column holder for Precision Columns. For further information
about the column holder, please contact your Pharmacia Biotech representative.
For ordering information, see Chapter 14.
MiniBeads
MiniBeads is the base matrix for 3 m high resolution ion exchange media. This
non-porous matrix, consisting of monodisperse hydrophilic polymer beads is substituted with Q and S functional groups to give Mini Q and Mini S. Both media
are packed in Precision Columns 3.2/3 (3.2 mm inner diameter and 30 mm bed
height) for micropreparative chromatography on SMART System. With a specially designed column holder, these columns can also be used in FPLC and HPLC systems.
MiniBeads are highly efficient pH-stable adsorbents designed for high performance micropurification of proteins, peptides and polynucleotides. The monodispersity permits the use of high flow rates at relatively low back-pressures. The main
properties are listed in Table 5.
Due to the smaller particle size, Mini Q and Mini S give faster separations with
higher resolution of peaks than ion exchangers based on MonoBeads, see
Figure 12. This resolution is crucial for success when separating complex samples
in the pg to g micropreparative scale.
30
Sample:
Chymotrypsinogen A, Ribonuclease A, Cytochrome C,

Lysozyme (6:10:6:5), 25 g/ml gel (6 g Mini S,
2.5 g Mono S )
Buffer A:
20 mM acetic acid, pH 5.0
Buffer B:
Buffer A with 0.5 M lithium chloride
Gradient:
0100% B in 20 col. vols. (6 min Mini S, 10 min Mono S).
Flow rate: 10 cm/min (800 l/min Mini S, 200 l/min Mono S)
Instrument: SMART System with Peak Monitor
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Fig. 12. Comparison of (A) Mini S PC 3.2/3 and (B) Mono S PC 1.6/5. Mini S PC 3.2/3
gives a faster separation and a better resolution of the peaks. Similar results have been
found with Mini Q PC 3.2/3 and Mono Q PC 1.6/5. (Work by Pharmacia Biotech,
Uppsala, Sweden.)
Properties
Chemical stability
MiniBeads may be used in aqueous solutions and nearly all organic solutions commonly used in chromatography of proteins, oligonucleotides and peptides. As
examples, the matrix is stable to 100% acetonitrile, 75% acetic acid, 2 M NaOH
and 1 M HCl. Dimethylsulphoxide (DMSO), dimethylformamide, and formic acid
and similar solvents will change the separation properties of the gels. Aqueous
solutions of urea, ethylene glycol and similar compounds can be used but will
increase the back-pressure due to their higher viscosities. Non-ionic detergents,
zwitterionic detergents or detergents with the same charge as the ion exchange
groups may be used. Oxidizing agents should be avoided.
31
Physical stability
The combination, non-porous and monodisperse beads gives MiniBeads very high
physical stability. It has better flow kinetics and can withstand higher back-pressure
(up to 10 MPa) than MonoBeads.
Note: These back-pressures are beyond the operating limits of standard laboratory
peristaltic pumps.
Table. 5. Main properties of Mini Q PC 3.2/3 and Mini S PC 3.2/3.
Properties
Mini Q PC 3.2/3
Mini S PC 3.2/3
Type of gel
strong anion exchanger
strong cation exchanger
Charged group
-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2SO3-
Total ionic capacity (moles/ml gel)
60-90
16-30
Column dimensions i.d. x bed height (mm) 3.2 x 30
3.2 x 30
Column volume (ml)
0.24
0.24
Average particle size (m)
3 m
3 m
a-amylas (MW 49 000)
1.4
N.D.
Trypsin inhibitor (MW 20 100)
1.4
N.D.
N.D.
1.3
Lysozyme (MW 14 300)
N.D.
1.3
Binding capacity (mg/column)
Max loading capacity (mg/column)
1-1.5
1-1.5
Practical loading capacity (g/column)
200
200
Typical protein recoveries (%)
70-90
70-90
working pH range*
3-11
3-11
pH stability**
long term
3-11
3-11
short term
1-14
1-14
Maximum flow rate (ml/min)
1.0
1.0
Operational pressure limit (MPa)
10
10
Normal separation times (min)
5-20
5-20

32
Reproducibility
Figure 13 shows a long life test and reproducibility test on Mini S PC 3.2/3. Long
life and reproducibility are a result of the stabile nature of MiniBeads together
with controlled synthesis and column packing procedures.
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Column:
Sample:
Mini S PC 3.2/3
Chymotrypsinogen A, Ribonuclease A,
Lysozyme 6 mg in proportions 1:3:1
20 mM acetic acid, pH 5.0
20 mM acetic acid, pH 5.0 with 0.4 M NaCl
400 ml/min
0100% B in 12 min
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Fig. 13. Long life test on Mini S PC 3.2/3. The chromatograms show the 1st, 5th and 201st
separation of a series run on the same column. The same consistently good stability and
reproducibility have been confirmed on Mini Q PC 3.2/3 (data not shown here). (Work by
Availability
Mini Q and Mini S are available pre-packed in Precision Columns 3.2/3. For
ordering information, see Chapter 14.
33
5. SOURCE
SOURCE ion exchangers are high performance media for fast and high resolution
separations of biomolecules such as proteins, peptides and oligonucleotides.
Examples are given in Figure 14, 18 and Figure 19.
SOURCE media are available in two
particle sizes, 15 and 30 m, and as
Column: RESOURCE S 1 ml
6.4 mm diam x 30 mm bed height
anion and cation exchangers. The
Sample: Snake venom 4 mg/ml, 0.1 ml
Flow rate: 5 ml/min (180 cm/h
strong anion exchangers SOURCE
Buffer A: 20 mM sodium phosphate, pH 6.8
Buffer B: Buffer A + 0.4 M NaCl
15Q and 30Q are produced by substiGradient: 0 - 100% buffer B, 20 ml (20 col. vol.)
System: FPLC System
tution of the base matrices with
quaternary amino groups. For the
strong cation exchangers, SOURCE
15S and 30S, the matrices have been
substituted with methyl sulphonate
groups. Table 6 summarizes the
general properties of SOURCE ion
exchangers.
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Fig. 14. An example of a fast and high

resolution separation on SOURCE.
(Work by Pharmacia Biotech, Uppsala,
Sweden.)
SOURCE is based on monodisperse, hydrophilized and rigid polystyrene/divinyl

benzene beads with controlled pore structure. The beads have a uniform size distribution, see Figure 15, and allow perfect packing of stable chromatography
beds. Monodispersity together with the absence of broken beads and fine particles
give low operating back-pressures.
Fig. 15. Light microscope

photograph of SOURCE.
Note the uniform size
distribution and absence of
broken beads and bead
fragments.
34
Table 6. Characteristics of SOURCE 15Q and 15S, and SOURCE 30Q and 30S.
Properties
SOURCE 15Q
SOURCE 30Q
SOURCE 15S
Type of gel
strong anion exchangers
strong cation exchangers
Charged group
-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH -CHOH-CH SO -
Matrix
Polystyrene/divinyl benzene
Bead form
Rigid, spherical, porous monodisperse
Mean particle size (m)
15
SOURCE 30S
30
15
30
N.D.
80
80
Dynamic binding
capacity* (mg/ml gel)
Lysozyme (MW 14 500) N.D.
45
45
N.D.
N.D.
MW range (proteins)
BSA (MW 67 000)
up to 107
up to 107
up to 107
up to 107
working pH range**
2-12
2-12
2-12
2-12
pH stability***
long term
2-12
2-12
2-12
2-12
short term
1-14
1-14
1-14
1-14
Maximum flow rate (cm/h)
1800
2000
1800
20002
Recommended working
flow rate range (cm/h)
30-600
300-1000
30-600
300-1000
4-40
4-40
4-40
Operating temperature (C) 4-40

Solvent restrictions: SOURCE is stable in alcohol/water solutions (C1-C4). 100% dimethyl sulphoxide,
dimethylformamide, and formic acid can change the separation properties of the gel. Avoid oxidizing
and reactive reagents. Detergents can be used if they are non-ionic or have the same charge as the gel.
* Determined by frontal analysis at a flow rate of 300 cm/h, using a 5.0 mg/ml solution of protein in 20
mM sodium phosphate buffer, pH 6.8 (lysozyme) and 20 mM BIS TRIS PROPANE buffer, pH 7.0
(BSA).
** working pH range refers to the pH range over which the ion exchange groups remain charged and
*** pH stability, long term refers to the pH interval where the gel is stable over a long period of time
1) Maximum flow rate to be applied, will depend on the pressure specification of the chromatographic
system used. A linear flow rate of 1800 cm/h will give a pressure drop of approximately 10 MPa at a
bed height of 3 cm.
2) Maximum flow rate to be applied, will depend on the pressure specification of the chromatographic
system used. A linear flow rate of 2000 cm/h will give a pressure drop of approximately 10 MPa at a
bed height of 10 cm.
A uniquely wide pore size distribution and a large specific surface area offer excellent resolution and capacity for a wide range of molecules; from small peptides
and oligonucleotides up to large proteins. The performance is well maintained at
high flow rates and high sample loads. This is illustrated in Figure 16 and 17,
which show separations of model protein mixtures on SOURCE 30Q.
35
Column:
Sample:
Sample load:
Eluent A:
Eluent B:
Flow rate:
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Gradient:
SOURCE 30Q, 10 mm i.d. x 50 mm (4 ml)

Mixture of lactoglobulin B and amyloglucosidase
1 mg/ml bed volume
20 mM BIS-TRIS PROPANE, pH 7.0
0.5 M sodium chloride, 20 mM BIS-TRIS PROPANE, pH 7.0
a) 4 ml/min (300 cm/h)
b) 13 ml/min (1000 cm/h)
0-100% B, 20 column volumes
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Fig. 16. The influence of increasing flow rate on resolution. (Work by Pharmacia Biotech,
Uppsala, Sweden.)
Column:
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20 mM sodium phosphate, pH 6.8
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Fig. 17. The influence of increasing sample load on resolution. (Work by Pharmacia
SOURCE 15 and SOURCE 30 ion exchangers are designed for research and
industrial applications, with emphasis on high performance, high capacity, high
reproducibility, and easy scaleability.
In comparison with media based on SOURCE 15 matrix, SOURCE 30 gives
slightly less resolution (lower efficiency) but at much lower back-pressure. This
makes SOURCE 30 ideal for purifications with more complex samples and larger
volumes. Using SOURCE 30, a high degree of purification can be obtained with
36
high productivity. SOURCE 15 matrices are ideal for purification when very high
resolution (efficiency) is required.
SOURCE 15 media are available in pre-packed RESOURCE columns. These
columns are convenient for lab research applications and method development.
Properties
Chemical stability
The hydrophilized polymeric matrix has high chemical stability and can be used
over a wide pH range allowing flexibility in the choice of conditions for separation.
The wide pH stability range, 1-14, allows cleaning and sanitization with harsh
agents like 1 M NaOH. Additionally, in applications such as the purification of
synthetic oligonucleotides, the wide pH stability also allows use of a high pH buffer to prevent aggregation, see Figure 18.
Column:
Sample:
Sequence:
Eluent A:
Eluent B:
Flow rate:
Gradient:
System:
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a) 800 moles synthesis of 19 mer DNA oligo, load 5 mg
b) As a), load 820 mg
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10 mM NaOH pH 12
A + 1.5 M NaCl
a) 1.6 ml/min (300 cm/h), b) 385 ml/min (300 cm/h)
0.25-0.75 M NaCl in 30 column volumes
a) FPLC, b) BioProcess 6 mm, controlled by UNICORN
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Fig. 18. Purification of 19 mer DNA oligonucleotide on RESOURCE Q 1 ml scaled up to

BioProcess Special column 100 mm diameter. Separation optimized for sample load, yield
and purity of product. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)
37
Flow rate
SOURCE media are based on highly rigid beads which allows use at high flow
rates. As a consequence of the monodisperse nature of the matrix, these high flow
rates do not result in high back-pressures. The back-pressure from SOURCE
media is much lower than for other media of the same particle size range. The low
back-pressure offers the advantage of being able to run at very high flow rates on
medium pressure equipment, as well as with acceptable flow rates on low pressure
equipment. As an example, when a RESOURCE 1 ml column is used at the maximum flow rate of FPLC or HPLC systems (about 10 ml/min, 1800 cm/h) separations are completed in less then 3 minutes, see Figure 19. At flow rates of 1
ml/min (180 cm/h) the extremely low back-pressures (typically around 0.1 MPa,
1 bar, 15 psi) allow high resolution separations in about 20 minutes with systems
based only on a peristaltic pump, see Figure 20.
Column:
RESOURCE Q 1ml
Pancreatin 5 mg/ml, 0.2 ml
9.6 ml/min (1800 cm/h)
20 mM BIS TRIS PROPANE, pH 7.5
Buffer A + 0.5 ml NaCl
0 - 80% buffer B, 20 ml (20 col. vol.)
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Flow rate:
Buffer A:
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Gradient:
System:
Fig. 19. Separation of pancreatin (Sigma) on RESOURCE Q 1 ml at 9.6 ml/min (1800

cm/h). System: FPLC. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)
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Sample:
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Buffer B:
Gradient:
System:
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Snake venom 4 mg/ml, 0.1 ml
1 ml/min (180 cm/h)
Buffer A + 0.4 ml NaCl
0 - 100% buffer B, 20 ml (20 col. vol.)
GradiFrac with Peristaltic Pump P-1
Fig. 20. Separation of snake venom (Sigma) on RESOURCE S 1 ml at 1.0 ml/min (180
cm/h). System: GradiFrac equipped with Peristaltic Pump P-1. Although high performance
separations with RESOURCE Q and S do not put special demands on the pump, resolution
obtained on the column can be lost through mixing in dead spaces. Low dead volumes,
accurate gradient generation, and a good detector and fraction collector are also essential
for good results. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)
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Fig. 21. Pressure versus flow rate curves that can be expected with SOURCE media. Curve
in a) shows that RESOURCE 1 ml columns can be used with high pressure equipment or
peristaltic pumps. The curves in b) are from a large scale column packed with SOURCE 15
media to 4 different bed heights. Curve c) shows the flow characteristics of the monosized
SOURCE 30 matrix compared with polysized media with mean diameters of 35 and 50 m
respectively. The pressure flow data were determined in a 100 mm i.d. column with a bed
height of 10 cm. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)
POROS is a registred trademark of Perseptive Biosystems.
S HyperD F is a registred trademark of BioSepra.
39
Recommended flow rates for high resolution separations are in the range 30 to
600 cm/h for SOURCE 15Q and 15S and 300 to 1000 cm/h for SOURCE 30Q
and 30S.
Figure 21 shows pressure versus flow rate characteristics of SOURCE 15 and
SOURCE 30.
Capacity
SOURCE ion exchangers have high capacities for large proteins as well as for
smaller polypeptides, peptides and oligonucleotides. This is a result of an optimized pore size distribution, a high substitution level and a large binding surface
area. Figure 22 shows breakthrough curves at different flow rates on RESOURCE
Q and RESOURCE S.
SOURCE Q and S retain their charge and can therefore be used over a wide pH
range, 2-12, without variation in loading capacity.
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Fig. 22. Breakthrough curves at different flow rates (superimposed).

a) RESOURCE Q 1 ml. Sample: Bovine serum albumin (Sigma), 5 mg/ml.
b) RESOURCE S 1 ml. Sample: Lysozyme, 5 mg/ml (Sigma).
(Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)
Recovery
The recovery of protein mass is typically 90-100%. In the application described in
Chapter 12, purification of exotoxin A, the recovery in the SOURCE 30Q step
was 91%.
40
Reproducibility
Emphasis during development has been on quality, reproducibility and scaleability, features which are particularly important for industrial applications under
strict regulatory control. Through the combination of high quality assurance standards and a patented manufacturing process, the particle structure is consistent
both bead-to-bead and batch-to-batch. Modal particle diameter varies between
batches within 1 m for SOURCE 15 and 2 m for SOURCE 30. The reproducibility of a separation of a standard protein mixture performed on four different
production batches of SOURCE 30S, see Figure 23, is an example that reflects the
reproducible qualities of SOURCE media.
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SOURCE 30S, 4 separate batches,

7.5 mm i.d. x 50 mm (2.2 ml)
Mixture of chymotrypsinogen,
cytochrome C and lysozyme
0.32 mg/ml bed volume
0.5 M sodium chloride,
2.2 ml/min (300 cm/h)
0 - 100% B, 20 column volumes
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Fig. 23. Quality control evaluation of 4 production batches of SOURCE 30S. (Work by
Availability
SOURCE 15Q and 15S are available in pack sizes of 10 ml, 50 ml, 200 ml, 500 ml
and 1 litre. SOURCE 30Q and 30S are available in pack sizes of 10 ml, 50 ml,
200 ml, 1 litre, and 5 litres.
RESOURCE Q and S are pre-packed columns with SOURCE 15Q and 15S respectively. They are available in 1 and 6 ml sizes, packed to a bed height of 3 cm. For
ordering information please refer to Chapter 14.
41
6. Sepharose based ion

exchangers
Pharmacia Biotech offers a range of ion exchange media based on agarose, which
is cross-linked to produce Sepharose High Performance, Sepharose Fast Flow,
Sepharose Big Beads, Sepharose CL-6B and STREAMLINE base matrices.
Exchanger groups are attached to the gels by stable ether linkages to the monosaccharide units to give the final ion exchange gels.
The polysaccharide chains of Sepharose based ion exchangers are arranged in
bundles (Fig. 24). These bundles are further strengthened by different degrees of
intra-chain cross-linking which provide a high matrix rigidity. The resulting structure is macroporous and the capacity of the gels very good for globular proteins
up to 106 in molecular weight.
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The gels, particularly the most highly

cross-linked forms, e.g. Sepharose Fast
Flow and Sepharose High Performance ion
exchangers, have good flow properties and
stable bed volumes that are largely insensitive to changes in ionic strength and pH.
They also show extremely low non-specific
adsorption of macromolecules (8).
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Fig. 24. Structure of cross-linked agarose gels.
Chemical stability
Sepharose ion exchangers tolerate extreme working conditions of temperature,
pH and chemical agents. They are stable in water, salt solutions, and organic solvents. Details on the pH stability range for each gel is given in the appropriate section below.
The ion exchangers can be used in solutions of non-ionic detergents such as
Triton X-100 and with strongly dissociating solvents such as 8 M urea and 6 M
guanidine hydrochloride (9). The Sepharose based ion exchangers also tolerate
1 M acetic acid, 30% isopropanol, 30% acetonitrile, 70% ethanol and 1 M
NaOH. Under oxidizing conditions, limited hydrolysis of the polysaccharide
chains may occur.
The gel-forming fibres of agarose are stiff bundles of polysaccharide chains rather
than flexible single chains (10). For this reason the water in the gel can be replaced
by other solvents with relatively little effect on pore size. Sepharose ion exchangers
Triton is a registred trademark of Rohm and Haas Co.
42
can be used in polar organic solvents and in aqueous/organic mixtures. The gel
matrix is stable in a wide variety of solvents including ethanol, dimethylformamide, tetrahydrofuran, acetone, dimethylsulphoxide, chloroform, dichloromethane,
dichloroethane and dichloroethane/pyridine (50:50).
Sepharose is very resistant to microbial attack due to the presence of the unusual
sugar, 3,6-anhydro-L-galactose. However, most buffers can support bacterial
growth and so a antimicrobial agent should be used in storage (see page 103).
Physical stability
The highly cross-linked structure of the modern Sepharose based ion exchangers,
e.g. Sepharose Fast Flow and Sepharose High Performance, not only gives them
increased chemical stability but also results in improved physical stability. This
improves flow properties enormously compared to Sepharose CL-6B gels. Crosslinking prevents fluctuations in bed volume under conditions of increasing ionic
strength. Thus Sepharose ion exchangers can be regenerated and re-equilibrated
repeatedly in the column. Repacking between experiments is thus eliminated,
improving reproducibility.
Sepharose ion exchangers can be used at temperatures up to 70 C and can be sterilized repeatedly in the salt form by autoclaving at 121 C, pH 7, for 30 minutes.
Sepharose High Performance ion

exchangers
Sepharose High Performance ion exchange media are based on 34 m highly
cross-linked agarose beads. The small bead size gives the media high efficiency,
which in combination with high selectivity offers the possibility of high resolution
standard chromatography separations.
In addition, the use of identical functional groups to those used in Q and
SP Sepharose Fast Flow, Mono Q and Mono S and SOURCE Q and SOURCE S
media, at comparable substitution levels (i.e. same selectivity), simplifies scaling
up from FPLC and up to BioPilot and BioProcess scales.
43
Properties
Physical stability
The high degree of cross-linking of Sepharose High Performance renders the
media extremely stable physically. The high rigidity of the cross-linked agarose
matrix eliminates volume variations due to changes in pH or ionic strength.
Capacity
As is the case with all ion exchangers, the capacity depends upon the accessibility
of the charged groups and their number. Sepharose High Performance gels have
an exclusion limit of approximately 4 x 106 and are highly substituted with strong
ion exchange groups. Thus they remain charged and maintain consistently high
capacities for proteins over a broad working pH range (Table 7). This allows the
selection of a pH value and buffer that best suit the properties of the sample.
Titration curves for Q and SP Sepharose High Performance are similar to those
for Q and SP Sepharose Fast Flow, which are shown in Figure 26.
Capacity varies from case to case depending on protein properties and flow rate.
As an example, the dynamic capacity for human serum albumin on
Q Sepharose High Performance is approximately 70 mg per ml gel at 150 cm/h
(start buffer 20 mM Tris, pH 8.2). The dynamic capacity for ribonuclease on
SP Sepharose High Performance has been estimated to 55 mg/ml gel at 150 cm/h
(start buffer 0.1 M sodium acetate, pH 6.0). The characteristics of the media are
shown in Table 7. Characteristics specific for HiLoad, HiTrap and BioPilot
columns pre-packed with Q and SP Sepharose High Performance are shown in
Table 8.
44
Table 7. Characteristics of Q and SP Sepharose High Performance.

Product
Q Sepharose
High Performance
SP Sepharose
High Performance
Type of gel
strong anion
strong cation
Total ionic capacity (mol/ml gel)
140-200
140-200
BSA (MW 67 000)
70
N.D.
Dynamic binding capacity* (mg/ml gel)

N.D.
55
Recommended working
up to 150
up to 150
Approx. mean particle size (m)
34
34
Particle size range (m)
24-44
24-44
working pH range**
2-12
4-13
pH stability***
short term
1-14
3-14
long term
2-12
4-13

* The dynamic binding capacity was determined at a linear flow rate of 150 cm/h using a 10.0 mg/ml
solution of BSA in 20 mM Tris buffer, pH 8.2 and a 5.0 mg/ml solution of ribonuclease in 100 mM
sodium acetate, pH 6.0.
Table 8. Characteristics of HiLoad, HiTrap and BioPilot columns pre-packed with Q and
SP Sepharose High Performance.
Product
HiLoad
16/10
26/10
HiTrap
1 ml 5 ml
BioPilot Column
35/100
60/100
Column dimensions (mm)

16x100 26x100
(inner diameter x bed height)
7x25
16x25 35x100
60x100
Bed volume (ml)
53-58
100
300
Maximum flow rate* (ml/min) 5
13
20
25 70
Recommended working
up to 5
up to 13
up to 24 (for SP) up to 70 (for SP)

up to 16 (for Q) up to 47 (for Q)
Max pressure* (MPa)
0.3
0.3
0.3
plates per meter** (N/m)
>12 000 >12 000
20-22
N.D.
N.D.
0.31.1
1.1
>10 000
>10 000
* Max. pressures and flow rates should not be used routinely.

** Determined with acetone.
45
Flow rate
The rigidity of Sepharose High Performance based ion exchangers together with
the small particle size distribution of the 34 m beads confers excellent flow properties. Flow rates achievable with Sepharose High Performance media and prepacked columns are given in Table 7 and 8.
Availability
Q and SP Sepharose High Performance are available in packs of 75 ml, 1 and
5 litres.
To ensure optimal performance and reproducibility Sepharose High Performance
media are also available in pre-packed HiLoad columns with dimensions 16 and
26 mm in internal diameter and 10 cm in bed height.
Q and SP Sepharose High Performance are also available in pre-packed, ready-touse 1 ml and 5 ml columns, HiTrap Q and HiTrap SP respectively. They are designed for method scouting, group separations, sample clean-up or sample concentration.
For pilot scale separations, Q Sepharose High Performance is available in prepacked BioPilot columns of 100 ml (35/100) and 300 ml (60/100).
SP Sepharose High Performance pre-packed in BioPilot columns 35/100 and
60/100 are available on request. For ordering information, please refer to
Chapter 14.
Sepharose Fast Flow ion exchangers

Sepharose Fast Flow ion exchangers are based on 90 m agarose beads. A higher
degree of cross-linking, compared to Sepharose CL-6B based ion exchangers, is
used to give the media greatly improved physical and chemical stability. This high
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Fig. 25. Partial structure of Sepharose Fast Flow ion exchange media.
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stability allows the gels to be used at the higher flow rates required for modern
laboratory separations as well as meeting the throughput and cleaning-in-place
requirements of process scale chromatography.
To give a complete range of ion exchange media Sepharose Fast Flow is available
with the weak exchanger groups, DEAE and CM and the strong exchanger groups
Q and SP. Figure 25 shows the partial structures of these media. Characteristics of
the different ion exchangers based on Sepharose Fast Flow is listed in Table 9.
Table 9. Characteristics of Q, SP, DEAE and CM Sepharose Fast Flow.
Product
Q Sepharose SP Sepharose
Fast Flow
Fast Flow
DEAE Sepharose
Fast Flow
CM Sepharose
Fast Flow
Type of gel
strong anion
strong cation
weak anion
weak cation
Total ionic capacity

(mol/ml gel)
180-250
180-250
110-160
90-130
Recommended
working flow rate
range (cm/h)
100-300
100-300
100-300
100-300
Approx. mean
particle size (m)
90
90
90
90
45-165
45-165
45-165
45-165
working pH range*
2-12
4-13
2-9
6-10
pH stability**
short term
1-14
3-14
1-14
2-14
2-12
4-13
2-13
4-13
long term
Properties
Physical stability
Sepharose Fast Flow ion exchangers are supplied pre-swollen and ready for packing or in pre-packed columns. The highly cross-linked nature of the matrix means
that the bead size and bed volumes do not change with changes in ionic strength
or pH.
Capacity
As is the case with all ion exchangers the capacity is dependent upon the accessibility of the charged groups and their number. Sepharose Fast Flow ion exchangers
are highly substituted and have an exclusion limit of approximately 4 x 106 giving
47
high capacity for proteins. Capacity data for Fast Flow ion exchange media are
given in Table 10. Characteristics specific for pre-packed columns with Q and SP
Sepharose Fast Flow, HiLoad columns, are shown in Table 11.
Table 10. Capacity data for Sepharose Fast Flow ion exchangers.
Ion Exchanger
Q Sepharose SP Sepharose DEAE Sepharose CM Sepharose

Fast Flow
Fast Flow
Fast Flow
Fast Flow

(mol/ml gel)
180-250
180-250
110-160
90-130
Dynamic binding capacity*

(mg/ml gel)
N.D.
3.1
N.D.
HSA (MW 68 000)
120
N.D.
110
N.D.
110
N.D.
100
N.D.
IgG (MW 160 000)
N.D.
50
N.D.
15
Bovine COHb (MW 69 000)
N.D.
50
N.D.
30
N.D.
70
N.D.
50

*Capacities were determined using the method described in Chapter 10 at a flow rate of
75 cm/h. For anion exchangers (DEAE and Q) the starting buffer was 0.05 M Tris, pH 8.3
and for cation exchangers (CM and S) 0.1 M acetate buffer, pH 5.0. Limit buffers were the
respective start buffers containing 2.0 M NaCl.
Table 11. Characteristics of HiLoad columns pre-packed with Q and

SP Sepharose Fast Flow.
Product
HiLoad 16/10
HiLoad 26/10
Bed volume (ml)
20-22
53-58
Maximum flow rate* (ml/min)
10
26
Recommended working
up to 7
up to 18
Max pressure* (MPa)
0.3
0.3
plates per meter** (N/m)
>3000
>3000
* Max. pressures and flow rates should not be used routinely.

** Determined with acetone.
Q Sepharose Fast Flow and SP Sepharose Fast Flow are highly substituted with
strong ion exchange groups. These groups remain charged and maintain consistently high capacities over broad working pH ranges of 2-12 and 4-13 respectively. This allows the selection of a pH value and buffer that best suit the properties
of the sample. Titration curves for both gels are shown in Figure 26. The working
pH ranges for DEAE Sepharose Fast Flow and CM Sepharose Fast Flow are 2-9
and 6-10 respectively.
48
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Fig. 26. Titration curves; approximately 5 ml Q and SP Sepharose Fast Flow in

50 ml 1 M KCl. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)
Flow rate
The optimal cross-linking of Sepharose Fast Flow confers excellent flow properties on the matrix. This is illustrated in Figure 27 which shows the relationship between flow rate and operating pressure for DEAE Sepharose Fast Flow.
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Fig. 27. Flow rate as a function of pressure drop of DEAE Sepharose Fast Flow.
Column: Pharmacia XK 50/30 fitted with 1/4 inch tubing. Gel bed height 15 cm.
Gel volume 294 ml. Eluent 0.1 M NaCl. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)
49
Flow rates achievable with Fast Flow media are above 300 cm/h at 0.1 MPa
(1 bar) in an XK 50/30 column packed with a 15 cm high bed of gel. In laboratory
separations where the best possible separation is frequently a major consideration
this flow rate is frequently traded off against improved resolution. In industrial
processing, the high throughput properties of Sepharose Fast Flow ion exchangers
give significantly reduced cycle times and improved productivity.
Availability
DEAE and CM Sepharose Fast Flow are available in packs of 500 ml, 10 and 60
litres. Q and SP Sepharose Fast Flow are available in packs of 25 ml, 300 ml, 5
and 60 litres and are also available pre-packed in HiLoad 16/10 and 26/10
columns. Q, DEAE and CM Sepharose Fast Flow are supplied in 20% ethanol and
SP Sepharose Fast Flow in 20% ethanol with 0.2 M sodium acetate. For ordering
information, please refer to Chapter 14.
Sepharose Big Beads ion exchangers

Sepharose Big Beads ion exchangers are based on 100-300 m agarose beads. A
higher degree of cross-linking, compared to Sepharose CL-6B based ion exchangers, is used to give the media greatly improved physical and chemical stability.
Due to its excellent physical stability and large bead size, Sepharose Big Beads can
be run at high flow rates even with viscous samples. Table 12, gives the characteristics of Q and SP Sepharose Big Beads.
Table 12. Characteristics of Q and SP Sepharose Big Beads.
Product
Q Sepharose Big Beads
SP Sepharose Big Beads
Type of gel
strong anion
strong cation
180-250
180-250
Recommended working
1200-1800
1200-1800
200
200
100-300
100-300
working pH range*
2-12
4-13
pH stability**
short term
2-14
3-14
2-12
4-13
long term
50
Properties
Physical stability
Sepharose Big Beads ion exchangers are supplied pre-swollen and ready for packing. The average bead diameter is 200 m with a bead size distribution of 100300 m. The highly cross-linked nature of the matrix means that the bead size and
bed volumes do not change with changes in ionic strength or pH.
Capacity
Q and SP Sepharose Big Beads are highly substituted with strong ion exchange
groups. These groups remain charged and maintain consistently high capacities
over broad working pH ranges of 2-12 and 4-13 respectively. This allows the
selection of a pH value and buffer that best suit the properties of the sample.
Figure 28 shows typical binding capacities of SP Sepharose Big Beads.
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Fig. 28. Typical binding capacities

of SP Sepharose Big Beads media.
The binding capacity was measured
with frontal analysis in acetate
pH 5 for bovine serum albumin
and format pH 4.1 for b-lactoglobulin at linear flow rates of 12
and 300 cm/h. (Work by Pharmacia
Flow rate
Because of its flow characteristics, Q and SP Sepharose Big Beads is the choice for
initial purification when high viscosity precludes the use of ion exchangers with
smaller bead size, e.g. Sepharose Fast Flow ion exchangers. Even with viscosities
as high as 2.5 times water a high flow rate (500 cm/h) is maintained in industrial
column operation.
Availability
Q and SP Sepharose Big Beads are available in packs of 1 and 10 litres. For
ordering information, please refer to Chapter 14.
51
STREAMLINE SP and
STREAMLINE DEAE
STREAMLINE adsorbents are specifically developed for expanded bed adsorption, see page 98 for details, and are based on a modified Sepharose matrix, crosslinked 6% agarose.
STREAMLINE adsorbents have been designed with a well-defined density distribution, which is required in expanded bed adsorption. This is achieved through
inclusion of inert crystalline quartz material in the base matrix. Mean particle
density is approximately 1.2 g/ml drained gel. The porosity is comparable to
Sepharose Fast Flow ion exchangers, with an exclusion limit of 4 x 106 for
globular proteins.
Table 13. Characteristics of STREAMLINE ion exchange adsorbents.
Product
STREAMLINE SP
STREAMLINE DEAE
Type of gel
strong cation
weak anion
170-240
130-210

Lysozyme (MW 14 500)
70
N.D.
N.D.
55
Recommended working flow rate range (cm/h)

- sample application
200-400
200-400
- elution
50-150
50-150
200
200
100-300
100-300
working pH range**
4-13
2-9
pH stability***
short term
3-14
1-14
long term
4-13
2-13
BSA (MW 67 000)

*The binding capacity was determined in STREAMLINE 50 column at a linear flow rate of 300 cm/h
using a 2.0 mg/ml solution of protein in phosphate buffer, pH 7.5 (lysozyme) and 50 mM Tris-HCl
buffer, pH 7.5 (BSA).
52
Properties
Physical stability
STREAMLINE adsorbents are supplied pre-swollen and ready for use. The average bead diameter is 200 m with a bead size distribution of 100-300 m. The
highly cross-linked nature of the matrix means that the bead size and bed volumes
do not change with changes in ionic strength or pH.
Capacity
As is the case with all ion exchangers the binding capacity of STREAMLINE
adsorbents are dependent on each different molecules size and pI, the flow rate
etc. In general, the adsorption characteristics of STREAMLINE adsorbents are
similar to those of a packed bed in chromatography, a direct result of the stability
of the expanded bed during feed application. This is illustrated in Figure 29 which
compares the breakthrough curves for a model protein with STREAMLINE
DEAE in packed mode and expanded mode at two scales of operation.
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Fig. 29. Breakthrough capacity curve comparisons. Running conditions: BSA in 50 mM

Tris-HCl, pH 7.5, linear flow rate 300 cm/h. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala,
Sweden.)
STREAMLINE SP and STREAMLINE DEAE are highly substituted with ion

exchange groups. These groups remain charged and maintain consistently high
capacities over the working pH ranges of 4-13 and 2-9 respectively. This allows
the selection of a pH value and buffer that best suit the properties of the sample.
53
Availability
STREAMLINE SP and DEAE are available in packs of 300 ml and 7.7 litres.
For ordering information, please refer to Chapter 14.
DEAE Sepharose CL-6B

and CM Sepharose CL-6B
DEAE Sepharose CL-6B and CM Sepharose CL-6B are macroporous bead-formed
(mean particle size of 90 m diameter) ion exchangers derived from the crosslinked agarose gel Sepharose CL-6B. DEAE or CM groups are then attached to the
gel by ether linkages to the monosaccharide units to give the final ion exchange gel
(Fig. 30).
DEAE Sepharose CL-6B and CM Sepharose CL-6B have good chemical and physical stability and can be used to advantage in the ion exchange chromatography of
proteins, polysaccharides, nucleic acids, membrane components and other high
molecular weight substances.
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Fig. 30. Partial structure of Sepharose CL-6B ion exchangers.
Properties
Physical stability
DEAE and CM Sepharose CL-6B are supplied pre-swollen and ready for packing.
As stated earlier, the cross-linked nature of the matrix means that the bed volume
changes very little with changes in ionic strength or pH (approximately 2% change when the pH is reduced from 10 to 4).
54
Capacity
Since DEAE and CM Sepharose CL-6B are weak ion exchangers, the number of
ligand groups which are charged and hence the capacity for macromolecules is
dependent upon pH. This dependency is illustrated by the titration curves for
DEAE and CM Sepharose CL-6B (Fig. 31).
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Fig. 31. Titration curves; Approximately 5 ml DEAE and CM Sepharose CL-6B both in
50 ml 1 M KCl. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)
The working pH ranges for the media are 2-9 for DEAE Sepharose CL-6B and
6-10 for CM Sepharose CL-6B.
DEAE and CM Sepharose CL-6B have exclusion limits of approximately
4 x 106. Capacity data for Sepharose CL-6B ion exchangers are summarized in
Table 14.
55
Table 14. Characteristics of Sepharose CL-6B ion exchangers.

IgG (160 000)
CM Sepharose CL-6B
130-170
100-140
2.0
N.D.
N.D.
9.5
Bovine COHb (MW 69 000)
N.D.
75
HSA (MW 68 000)
170
N.D.
150
N.D.
N.D.
120
Recommended working flow rate range (cm/h) up to 60
up to 60
90
90
45-165
45-165
working pH range**
2-9
6-10
pH stability***
short term
2-14
2-14
long term
3-12
4-13

*Capacities were determined using the method described in Chapter 10 at a flow rate of 75 cm/h. For
the anion exchanger (DEAE) the starting buffer was 0.05M Tris, pH 8.3 and for the cation exchangers
(CM) 0.1 M acetate buffer, pH 5.0. Limit buffers were the respective start buffers containing 2.0 M
NaCl.
Flow rate
The cross-linked structure of Sepharose CL-6B ion exchangers allows flow rates of
up to 100 cm/h to be used. Figure 32 illustrates the variation of flow rate with
pressure drop for DEAE and CM Sepharose CL-6B.
56
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Fig. 32. Flow rate as a function of pressure drop in columns (5x10 cm bed volume) of
DEAE and CM Sepharose CL-6B. pH 7.0; Ionic strength 0.02. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)
As in all types of chromatography, resolution is dependent on flow rate (5). Therefore in applications where resolution is critically important high flow rates should
be avoided or an exchanger based on Sepharose High Performance used.
For applications where high flow rates and large throughput of material are required, ion exchangers based on Sepharose Fast Flow or Sepharose Big Beads should
be used since these forms have been specially developed with these criteria in
mind.
Availability
DEAE and CM-Sepharose CL-6B are available in packs of 500 ml and 10 litres.
The gels are supplied in 20% ethanol. For ordering information, please refer to
Chapter 14.
57
7. DEAE Sephacel
DEAE Sephacel is a bead-formed cellulose ion exchanger produced from high
purity microcrystalline cellulose. Cellulose is a naturally occurring polymer consisting of b(1-4) linked glucose units. In the native state, adjacent polysaccharide
chains are extensively hydrogen bonded, forming microcrystalline regions. These
regions are interspersed with amorphous regions with less hydrogen bonding.
Limited acid hydrolysis results in preferential loss of the amorphous regions and
gives so-called microcrystalline cellulose.
During the production of DEAE Sephacel the microcrystalline structure is broken
down and the cellulose is regenerated to give a bead-formed (40-160 m) gel. The
gel is strengthened by cross-linking with epichlorohydrin, although the main structure-forming bonds are still hydrogen bonds. Functional groups are attached
during the synthesis by ether linkages to glucose units of the polysaccharide chains
to give the structure shown in Figure 33.
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Fig. 33. Partial structure of DEAE Sephacel.
Properties
Chemical stability
DEAE Sephacel is stable in aqueous suspension within the range pH 2-12. Hydrolysis may occur in strongly acidic solutions and the macromolecular structure is
broken down in strongly alkaline solutions. The free base form of the DEAE
group is inherently unstable at high pH values. Strong oxidizing agents should be
avoided.
DEAE Sephacel is susceptible to microbial attack, especially in the presence of
phosphates, and should therefore be stored in the presence of antimicrobial agents
when not in use (see page 103). Samples containing enzymes capable of hydrolysing b-glucosidic linkages should be purified on MonoBeads, MiniBeads,
SOURCE, Sepharose or Sephadex based ion exchangers.
58
Physical stability
The cross-linked bead form of DEAE Sephacel gives it increased physical stability
compared to ordinary microgranular celluloses. It has a stable bed volume over a
wide range of ionic strengths (approx. 5% change between I = 0.05 and I = 0.5)
and pH values and can therefore be re-equilibrated in the column.
DEAE Sephacel can be sterilized by autoclaving at pH 7 for 30 minutes at 121 C.
During autoclaving, minute quantities of carbohydrate are released; these can be
washed away with sterile buffer solution.
Capacity
DEAE Sephacel is macroporous and has an exclusion limit for proteins with molecular weights of approximately 1 x 106. The binding of substances with molecular
weights substantially greater than 1 x 106 will be restricted to charged groups on
the surface of the beads. Capacity data for DEAE Sephacel is summarized in
Table 15.
Table 15. Capacity data for DEAE Sephacel.
DEAE Sephacel
(mol/mg gel)
(mol/ml gel)
Dynamic binding capacity*

(mg/ml gel)
albumin
thyroglobulin
130-150
100-140
160
10
*Capacity was determined using the method described in Chapter 10 at a flow rate of 75 cm/h. The
starting buffer was 0.05 M Tris, pH 8.3 Limit buffer was start buffer containing 2.0 M NaCl.
The adsorption kinetics for bead-formed cellulose ion exchangers are substantially
the same as for conventional cellulose ion exchangers (11). As with other weak ion
exchangers the capacity varies with pH. The titration curve for DEAE Sephacel is
shown in Figure 34.
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Fig. 34. Titration of 1 g DEAE Sephacel

in 1 M KCl. (Work by Pharmacia
59
Flow rate
As with other ion exchangers, resolution decreases with increasing flow rate. Flow
rates of 10 cm/h are usually suitable for the resolution of protein mixtures on
DEAE Sephacel. Figure 35 illustrates the variation of flow rate as a function of
pressure drop for DEAE Sephacel. For applications requiring higher flow rates
SOURCE or Sepharose based ion exchangers should be used.
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Fig. 35. Flow rate as a function of the pressure drop across beds of DEAE Sephacel.
0.1 M Tris-HCl buffer solution pH 7.6. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)
Availability
DEAE Sephacel is supplied in packs of 500 ml as a suspension in 20% ethanol.
For ordering information, please refer to Chapter 14.
60
8. Sephadex ion exchangers

Sephadex ion exchangers are produced by introducing functional groups onto
Sephadex, a cross-linked dextran matrix. These groups are attached to glucose
units in the matrix by stable ether linkages.
Sephadex is suitable as a base for an ion exchanger matrix since it is hydrophilic
and shows very low non-specific adsorption.
Sephadex ion exchangers are derived from either Sephadex G-25 or
Sephadex G-50 and swell readily in aqueous solutions. Ion exchangers based on
Sephadex G-25 are more tightly cross-linked than those based on Sephadex G-50
and therefore swell less and have greater rigidity. Ion exchangers based on
Sephadex G-50 are more porous than those based on Sephadex G-25 and therefore have a better capacity for molecules with molecular weights larger than 30 000.
The full range of Sephadex ion exchangers is shown in Table 16. Anion and cation
exchangers are designated as A-25 or A-50 and C-25 or C-50, respectively, depending on the matrix porosity.
Table 16. Sephadex ion exchangers.
Types
Description
Functional groups
Counter ion
DEAE
Sephadex
A-25
A-50
Weakly basic
anion exchanger
Diethylaminoethyl
Chloride
QAE
Sephadex
A-25
A-50
Strongly basic
anion exchanger
Diethyl-(2-hydroxypropyl)aminoethyl
Chloride
CM
Sephadex
C-25
C-50
Weakly acidic
cation exchanger
Carboxymethyl
Sodium
SP
Sephadex
C-25
C-50
Strongly acidic
cation exchanger
Sulphopropyl
Sodium
Properties
Chemical stability
Sephadex ion exchangers are insoluble in all solvents. They are stable in water, salt
solutions, organic solvents, alkaline and weakly acidic solutions. In strongly acidic
solutions, hydrolysis of the glycosidic linkages may occur and thus pH values
below 2 should be avoided, particularly at elevated temperatures. Sephadex ion
exchangers can also be used in the presence of denaturing solvents which can be
important when substances are to be separated on the basis of their electrostatic
properties alone (12, 13, 14).
Exposure to strong oxidizing agents or dextranases should be avoided. During
regeneration, the ion exchanger can be exposed to 0.2 M NaOH for a short time
61
without appreciable hydrolysis. Sephadex ion exchangers are susceptible to attack

by dextranases and should be stored in the presence of an antimicrobial agent (see
page 103).
Physical stability
Swollen Sephadex ion exchangers can be sterilized by autoclaving for up to 30 min
at 121 C, at neutral pH in the salt form. During autoclaving, minute quantities of
carbohydrate are released; these can be washed away with sterile buffer.
Swelling
The swelling properties of Sephadex ion exchangers are related to those of the
parent Sephadex G-types, those based on 50-types swelling more than those based
on 25-types. Due to the presence of charged groups in the matrix, the swelling
varies with ionic strength and pH.
Ionic strength dependence

At low ionic strengths, repulsion between groups carrying the same charge on the
matrix is maximal, and swelling of the gel is at its greatest. The degree of swelling
decreases with increasing ionic strength.
Note: Sephadex ion exchangers should not be swollen in distilled water since the
bead structure may be broken down due to strong ionic interactions.
pH dependence
The degree of dissociation and hence the extent to which an ion exchanger is charged is dependent on pH. Repulsion between charged groups is greatest at pH values where the ion exchanger is fully dissociated, and decreases at pH values close to
the pK of the charged groups.
Note: QAE Sephadex and SP Sephadex have swelling properties quite independent
of pH since they are charged over a very wide pH range.
Capacity
Due to differences in swelling characteristics, ion exchangers based on Sephadex
G-25 have a much higher ionic capacity per ml gel than those based on Sephadex
G-50. (Table 17).
62
Table 17. Total ionic capacity data for Sephadex based ion exchangers.
Ion exchanger
DEAE
A-25
Sephadex
A-50
QAE
A-25
Sephadex
A-50
CM
C-25
Sephadex
C-50
SP
C-25
Sephadex
C-50

(mol/mg dry gel)
(mol/ml wet gel)
3.5 0.5
500
175
3.0 0.4
500
100
4.5 0.5
550
170
2.3 0.3
300
90
Thus for smaller biomolecules (MW < 30 000) the A-25 and C-25 types have a
higher available capacity. In the molecular weight range 30 000 to 100 000 however, the A-50 and C-50 exchangers have higher available capacities due to their
larger pore size.
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Fig. 36. Titration of 0.1 gram of Sephadex ion exchangers in 50 ml 1 M KCl. (Work by
63
If working with larger molecules (MW > 100 000), a higher available capacity is
frequently observed with the A-25 and C-25 types since at these molecular weights
binding is only occurring on the bead surface and the higher ionic capacity can be
used to advantage.
As capacity also depends upon the number of substituent groups which are charged under given buffer conditions, it will also vary with pH. The variation of the
charge on Sephadex ion exchangers with pH is illustrated by their titration curves
(Fig. 36).
Dynamic capacity data for Sephadex ion exchangers are given in Table 18.
Table 18. Dynamic capacity (mg/ml wet gel) data for Sephadex ion exchangers
Protein
(MW)
Thyroglobulin
(669 000)
HSA
(68 000)
a-lactalbumin
(14 300)
IgG
(160 000)
Bovine COHb
(69 000)
Ion exchanger
A-25
1.0
30.0
140.0
N.D.
N.D.
Sephadex A-50
DEAE
2.0
110.0
50.0
N.D.
N.D.
A-25
1.5
10.0
110.0
N.D.
N.D.
Sephadex A-50
QAE
1.2
80.0
30.0
N.D.
N.D.
C-25
N.D.
N.D.
N.D.
1.6
70.0
Sephadex C-50
CM
N.D.
N.D.
N.D.
7.0
140.0
SP
C-25
N.D.
N.D.
N.D.
1.1
70.
Sephadex C-50
N.D.
N.D.
N.D.
8.0
110.0

Capacities were determined using the method described in Chapter 10 at a flow rate of 75 cm/h. For
anion exchangers (DEAE and QAE) the starting buffer was 0.05M Tris, pH 8.3 and for cation
exchangers (CM and SP) 0.1 M acetate buffer, pH 5.0. Limit buffers were the respective start buffers
containing 2.0 M NaCl.
Availability
Sephadex ion exchangers are supplied as dry powders in packs of 100 g and 500 g.
Bulk quantities of 5 kg or more are available on request. For ordering information, please refer to Chapter 14.
64
9. Experimental design
Choice of ion exchanger
No single ion exchanger is best for every separation. The choice of matrix and
ionic substituent depends on:
1. The specific requirements of the application
2. The molecular size of the sample components
3. The isoelectric points of the sample components
Specific requirements of the application

Column separation, batch separation or expanded bed adsorption
If the separation is to be carried out using a batch separation technique rather
than column chromatography, the flow and packing characteristics of the matrix
are of minor importance. The economy and high capacity of Sephadex based ion
exchangers make them a natural choice.
In large scale applications, capturing proteins from crude samples containing particulate matter, expanded bed adsorption using STREAMLINE has proven to be
effective and cost efficient.
The scale of the separation

The amount of sample to be processed is an important parameter when choosing
an ion exchange medium. For laboratory scale separations, any of the Pharmacia
Biotech range of ion exchangers can be used. However for large scale separations,
which must satisfy the throughput and cleaning-in-place (CIP) requirements of
industry, the choice of a BioProcess Media such as SOURCE, Sepharose High Performance, Sepharose Fast Flow, Sepharose Big Beads or STREAMLINE adsorbent
is indicated.
The same reasoning applies to experiments designed as method scouting for eventual scale-up since such procedures should be developed using the gel which will
eventually be used at the larger scale. SOURCE media and Sepharose Fast Flow
based exchangers are extremely well suited to this type of method optimization as
well as routine laboratory separations.
The required resolution

When choosing an ion exchanger it is important to decide the degree of resolution
required from the separation. Normally analytical or semi-analytical separations
65
place high demands on resolution. In contrast, resolution is frequently traded off

against capacity and speed in the case of preparative work.
Resolution in ion exchange chromatography depends upon the selectivity and efficiency of the media. Maximum selectivity is often obtained by choosing one of the
gels carrying the strong exchanger groups Q or S/SP, since strong ion exchangers
can be used at any pH tolerated by the sample molecules.
Maximum efficiency is obtained by choosing a gel based on a small particle size
matrix. The media in order of their particle sizes and potential efficiencies are
MiniBeads (3 m) > MonoBeads (10 m) > SOURCE 15 (15 m) > SOURCE 30
(30 m)> Sepharose High Performance (34 m) > Sepharose Fast Flow/ Sepharose
CL-6B/ Sephacel (90 m) > Sephadex (40-125 m in dry form) > STREAMLINE
adsorbents/Sepharose Big Beads (200 m).
The media thus offering the highest degree of resolution are MiniBeads,
MonoBeads and SOURCE 15 exchangers for high resolution in SMART, FPLC
and HPLC systems and SOURCE 30 and Sepharose High Performance exchangers
for high resolution standard chromatography.
The required throughput

How much material which can be processed in a defined time is determined
amongst other things by the capacity, the flow characteristics of the media and the
size of the column. All of the ion exchangers available from Pharmacia Biotech
have high capacities for macromolecules but differ considerably in their flow properties. The media which have optimal flow characteristics are MiniBeads for
micropreparative chromotography in SMART System, MonoBeads and SOURCE
15 for high performance, FPLC separations, and SOURCE 30, Sepharose High
Performance, Sepharose Fast Flow and Sepharose Big Beads media for laboratory
and process scale preparative separations.
The uniform size distribution of beads in SOURCE media provides comparatively
low pressure drops over packed beds and thus makes SOURCE ion exchangers
also ideal for scaling up in industrial applications such as the separation of closely
related product variants.
Scaleability
Frequently ion exchange separations are carried out initially on a small scale to
optimize conditions before committing the sample to full scale separations. It is
thus important to choose an ion exchanger which will allow simple and convenient scale up so that methods established on a small column can be applied more or
less directly to the larger column. Detailed information on scaling up ion exchange
separations is given in Chapter 11.
66
Reproducibility
Reproducibility is obtained when the characteristics of the chromatography bed
remain unchanged during the course of the separation and during regeneration of
the column. The more rigid varieties of Pharmacia Biotech ion exchangers, such as
MiniBeads, MonoBeads, SOURCE, Sepharose High Performance, Sepharose Fast
Flow and Sepharose Big Beads, show no changes in bed size with changes in pH
and ionic strength and can thus be washed and regenerated in the columns providing additional reproducibility.
The use of media which are supplied pre-packed and tested, such as MiniBeads,
MonoBeads, RESOURCE, HiTrap columns pre-packed with Sepharose High Performance and HiLoad columns pre-packed with Sepharose High Performance or
Sepharose Fast Flow assures reproducibility since variability in column packing is
eliminated.
Economy
Column or batch procedures in which the ion exchanger is used once and thrown
away, as well as applications requiring large amounts of gel, may make economy a
major consideration. Sephadex A-50 and C-50 ion exchangers are the least expensive in terms of bed volume, followed by Sephadex A-25 and C-25 ion exchangers.
Using expanded bed adsorption, STREAMLINE product line, reduces the number
of operations in a process by fusing the function clarification, concentration and
adsorption into one operation. It offers process developers the selectivity afforded
by chromatography, the throughput of ultra-filtration and the convenience of
small scale centrifugation.
The molecular size of the sample components

The accessibility of the sample components to the charged groups will determine
the available capacity of the ion exchanger for those particular substances. All of
the ion exchange media supplied by Pharmacia Biotech, with the exception of
Sephadex based media, have exclusion limits for globular proteins in excess of
1 x 106.
Steric factors only affect the separation of charged solutes via their influence on
the available capacity for each substance. When choosing ion exchangers it is
unnecessary to consider the possibility of gel filtration effects on the sample. Sample molecules, although always larger than those of the eluent buffer, cannot
migrate ahead of the eluting buffer since they then encounter conditions which
favour their re-binding to the matrix. Only uncharged solutes will be fractionated
according to size as in gel filtration. These uncharged molecules will normally be
removed during the initial isocratic elution phase which proceeds the application
of the gradient.
67
The exclusion limits for the different media and subsequent effects on available
capacity are given in the relevant sections covering each gel type.
When working with samples of unknown molecular weight the use of
MonoBeads, SOURCE and Sepharose based ion exchangers is recommended since
they are particularly easy to handle and have good capacities over a large molecular weight range.
Choice of exchanger group

Substances are bound to ion exchangers when they carry a net charge opposite to
that of the ion exchanger. This binding is electrostatic and reversible.
In the case of substances which carry only one type of charged group the choice of
ion exchanger is clear-cut. Substances which carry both positively and negatively
charged groups, however, are termed amphoteric and the net charge which they
carry depends on pH (Fig. 37). Consequently at a certain pH value an amphoteric
substance will have zero net charge. This value is termed the isoelectric point (pI)
and at this point substances will bind to neither anion or cation exchangers. The
pH ranges in which the protein is bound to anion or cation exchangers and an
arbitrary range of stability are shown in Figure 37.
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Fig. 37. The net charge of protein as a function of pH.
The pH of the buffer thus determines the charge on amphoteric molecules during
the experiment. In principle therefore, one could use either an anion or a cation
exchanger to bind amphoteric samples by selecting the appropriate pH. In practice
however, the choice is based on which exchanger type and pH give the best separation of the molecules of interest, within the constraints of their pH stability.
68
Methods for determining the optimum pH and corresponding ion exchanger type
are discussed later in this chapter.
Many biological macromolecules become denatured or lose activity outside a certain pH range and thus the choice of ion exchanger may be limited by the stability
of the sample. This is illustrated in Figure 37. Below its isoelectric point a protein
has a net positive charge and can therefore adsorb to cation exchangers. Above its
pI the protein has a net negative charge and can be adsorbed to anion exchangers.
However, it is only stable in the range pH 5-8 and so an anion exchanger has to be
used.
In summary:
1. If the sample components are most stable below their pIs, a cation exchanger
should be used.
2. If they are most stable above their pIs, an anion exchanger should be used.
3. If stability is high over a wide pH range on both sides of pI, either type of ion
exchanger can be used.
Determination of starting conditions

The isoelectric point
The starting buffer pH is chosen so that substances to be bound to the exchanger
are charged. The starting pH should be at least 1 pH unit above the isoelectric
point for anion exchangers or at least 1 pH unit below the isoelectric point for
cation exchangers to facilitate adequate binding. Substances begin to dissociate
from ion exchangers about 0.5 pH units from their isoelectric points at ionic
strength 0.1 M (15).
There are comprehensive lists of isoelectric points determined for proteins (16, 17)
which can be useful in the design of ion exchange experiments.
If the isoelectric point of the sample is unknown, a simple test can be performed to
determine which starting pH can be used.
Test-tube method for selecting starting pH

1. Set up a series of 10 test-tubes (15 ml).
2. Add 0.1 g Sephadex ion exchanger or 1.5 ml Sepharose or Sephacel ion
exchanger to each tube.
3. Equilibrate the gel in each tube to a different pH by washing 10 times with
10 ml of 0.5 M buffer (see page 78 for choice of buffers for ion exchange). Use a
range of pH 5-9 for anion and pH 4-8 for cation exchangers, with 0.5 pH unit
intervals between tubes.
69
4. Equilibrate the gel in each tube at a lower ionic strength (0.05 M for Sephadex
or 0.01 M for Sepharose and Sephacel ion exchangers) by washing 5 times with
10 ml of buffer of the same pH but lower ionic strength.
5. Add a known constant amount of sample to each tube.
6. Mix the contents of the tubes for 5-10 minutes.
7. Allow the gel to settle.
8. Assay the supernatant for the substance of interest. The results may appear as
shown in Figure 38 (a).
The pH to be used in the experiment should allow the substance to be bound, but
should be as close to the point of release as possible. If too low (or high) a pH is
chosen, elution may become more difficult and high salt concentrations may have
to be used. In Figure 38 the buffer chosen should be pH 7.0.
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Fig. 38. Test-tube methods for selecting ion exchange conditions.
Electrophoretic titration curves (ETC)

While information on the pI of the sample components gives valuable indications
concerning the choice of starting conditions, it does not give a picture of how the
charge on the molecules varies with pH (Fig. 37), nor indicate at what pH or on
which exchanger type maximum resolution could be expected.
Electrophoretic titration curves (Fig. 39) enable the determination of the charge
pH relationship for the molecules present across a continuum of pH and are a particularly useful way of predicting suitable conditions for an ion exchange separation (18).
An electrophoretic titration curve is obtained by electrophoresis of the sample at
right angles to a pH gradient in a horizontal slab gel of agarose or polyacrylamide
(19, 20). The pH gradient is established in the gel by isoelectric focusing prior to
70
sample application. A schematic

description of the various steps is
shown in Fig. 40. A detailed description
of the method using PhastSystem electrophoresis systems is available upon
request from Pharmacia Biotech.
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Fig. 39. The electrophoretic titration curve

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Electrophoretic mobility
of component B at pH
values 5 and 9 correlates
with its net charge
Fig. 40. The major steps in making electrophoretic titration curves.
Electrophoresis of the sample perpendicular to the pH gradient produces a series

of curves, unique for each component, since the relative electrophoretic mobility
of each component will be different depending on its net charge at given pH values. The pH value where each curve intersects the line of sample application represents the pH at which that particular component has a zero net charge, the pI for
that component.
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Fig. 41. Column selection

based on electrophoretic
titration curve analysis.
Maximum resolution can be expected at a pH where there is maximum separation

between the titration curves for individual solutes, using the ion exchanger type
indicated by the charge of the molecules at that particular pH. At this pH the difference in electrophoretic mobilities and hence net charges between the species is
greatest. This principle is illustrated in Figure 41. The proteins stability at the indicated pH must be taken into consideration before applying these conditions to the
separation.
72
If maximum separation is observed at a pH where the sample molecules are positively charged, i.e. below their isoelectric points, maximum resolution will be obtained using a cation exchanger such as Mono S, SOURCE S or SP Sepharose Fast
Flow.
If the largest difference in electrophoretic mobility is found at a pH where the
components of interest are negatively charged, i.e. above their isoelectric points,
an anion exchanger such as Mono Q, SOURCE Q or Q Sepharose Fast Flow
should be chosen.
If maximum separation of the curves occurs at the position of sample application
i.e. at the isoelectric points of the molecules, then maximum resolution may be
achieved using the technique of chromatofocusing. Further information on techniques and media for chromatofocusing is available on request.
Measurement of pH can be done using a surface electrode or by running pI calibration proteins as a narrow band at the top or bottom of the slab gel during the
first dimension electrophoresis as the pH gradient is established in the gel. This
section of the gel is removed and stained before the sample is applied for the
second dimension electrophoresis and then afterwards replaced to estimate pH
values.
Staining the titration curve with a general protein stain such as Coomassie Blue
does not give any information about the charge/pH relationship for specific proteins unless they can be clearly identified by their isoelectric points. To gain positive identification it is necessary to use a specific detection technique such as zymographic analysis or immunofixation as illustrated in Figure 42.
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In addition to information regarding

optimal starting conditions, the electrophoretic titration curves also
reveal important information which
will assist the interpretation of the
chromatogram after the run.
Fig. 42. The electrophoretic titration

curve of chicken breast muscle using
zymogram detection for creatine kinase.
(19)
73
Since the lines on the ETC reflect the degree of charge of the components at different pHs, the curves may be used to predict the order in which the components
will be eluted from the column. The molecular species with the lowest electrophoretic mobility at a certain pH has logically the lowest charge at that particular pH
and should be the first substance eluted from the column in the gradient. Similarly
the species showing highest electrophoretic mobility will be the most strongly
retained on a column of opposite charge and should be eluted last. The order in
which solutes are eluted cannot be predicted with 100% certainty from the titration curve since electrophoretic mobility depends on the total net charge on a
molecule and ion exchange chromatography depends on the net charge on the
solutes surface.
Chromatographic titration curves (retention maps)

For those ion exchanger types which allow rapid separations, optimal starting pH
and choice of anion or cation exchanger can be determined using chromatographic
titration curves (18).
In a specified salt gradient, the retention of particular molecular species is dependent upon the molecules net charge and charge density. These in turn depend upon
the pH of the eluent. The chromatographic titration curve is based on this relationship between retention and buffer pH.
The methodology is extremely simple. The sample is analysed in a series of rapid
separations, carried out on a cation exchanger (Mono S) or an anion exchanger
(Mono Q), using the same salt gradient but over a range of pHs.
A plot is then made, for each separated peak, of elution salt concentration, elution
time or elution volume against pH. This will produce a series of curves as illustrated in Fig. 43.
An analysis of this composite plot for the point of maximum separation will indicate at what pH and on which type of exchanger maximum resolution between
any two or more components can be expected.
The conditions used (column type, buffers, pH, etc.) during the rapid runs for the
generation of the chromatographic titration curves can be directly applied when
developing the final optimized procedure.
74
A 280nm
A 280nm
a)
Mono S
pH 3.0
A280nm
b)
Mono S
pH 5.0
f)
Mono Q
pH 11.0
Elution ionic
strength
Data from seven chromatograms plotted as chromatographic

titration curves - A, B, C.
Elution conc.
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Mono Q
Fig. 43. Chromatographic titration curves.
75
Choice between strong and weak ion exchangers

Having selected a suitable starting pH to use on a cation or anion exchanger, it is
necessary to choose between a strong and weak ion exchange group. In those cases
where maximum resolution occurs at an extreme of pH and the molecules of interest are stable at that pH, the choice is clearly to use a strong exchanger. The majority of proteins however, have isoelectric points which lie within the range 5.5 to
7.5 and can thus be separated on both strong and weak ion exchangers. Some
advantages in using a strong ion exchanger are discussed in Chapter 2.
Choice of buffer
As with the choice of ion exchanger, there are a number of variables which have to
be considered. These include:
1. The choice of buffer pH and ionic strength.
2. The choice of buffering substance.
3. The price of the buffer if it is to be used in production process.
Choice of buffer pH and ionic strength

The choice of buffer pH has been discussed in the previous section. It should be
pointed out, however, that in many applications the optimum separation may be
achieved by choosing conditions so that major and troublesome contaminants are
bound to the exchanger while the substance of interest is eluted during the wash
phase (21). This procedure is sometimes referred to as starting state elution.
Note: Concentration of sample does not occur with starting state elution.
The highest ionic strength which permits binding of the selected substances and
the lowest ionic strength that causes their elution should normally be used as the
starting and final ionic strengths in subsequent column experiments (i.e. the starting and limiting buffers for gradient elution). A third and higher ionic strength
buffer is frequently employed as a wash step before column regeneration and
re-use.
The required concentration of the start buffer will vary depending on the nature of
the buffering substance. A list of some suitable buffers and suggested start concentrations is shown in Table 19. In the majority of cases a starting ionic strength of at
least 10 mM is required to ensure adequate buffering capacity.
Salts also play a role in stabilizing protein structures in solution and so it is important that the ionic strength should not be so low that protein denaturation or precipitation occurs. A major advantage of using Pharmacia Biotech ion exchangers is
that they have excellent capacities and so the initial ionic strength of the buffer can
be quite high without significantly affecting capacity for sample.
76
In the case of pre-packed ion exchangers and columns which can be run conveniently quickly, trial experiments using salt gradients will allow the determination of
an optimal starting ionic strength.
In the case of Sephadex based exchangers for batch applications or where column
running times are prohibitively long, a simple test-tube technique is recommended
as a test for a suitable ionic strength.
Choice of buffer substance

If the buffering ions carry a charge opposite to that of the functional groups of the
ion exchanger they will take part in the ion exchange process and cause local disturbances in pH. It is preferable, therefore, to use buffering ions with the same
charge sign as the substituent groups on the ion exchanger. There are of course
exceptions to this rule as illustrated by the frequency with which phosphate buffers are cited in the literature in connection with anion exchangers. In those
instances when a buffering ion which interacts with the ionic groups on the matrix
is used, extra care must be taken to ensure that the system has come to equilibrium
before application of sample.
In cases where substances purified by ion exchange chromatography have to be
freeze dried it is advantageous to use volatile buffer systems. Examples of such systems are shown in Table 20.
77
Table 19. Buffer tables.

Buffer substances for cation exchange chromatography
pKa
pH
(25C) interval
Substance
Conc.
(mM)dT
2.00
2.88
3.13
3.81
*3.75
*4.21
*4.76
*5.68
*7.20
1.5-2.5
2.38-3.38
2.63-3.63
3.6-4.3
3.8-4.3
4.3-4.8
4.8-5.2
5.0-6.0
6.7-7.6
Maleic acid
Malonic acid
Citric acid
Lactic acid
Formic acid
Butanedioic acid
Acetic acid
Malonic acid
Phosphate
20
20
20
50
50
50
50
50
50
*7.55
*8.35
7.6-8.2
8.2-8.7
HEPES
BICINE
50
50
dpKa/
(C)
Counter-ion
Comments
Dicarboxylic acid
Dicarboxylic acid
Dicarboxylic acid
-0.0028
Na+
Na+/Li+
Na+
Na+
Na+/Li+
Na+
Na+/Li+
Na+/Li+
Na+
-0.0140
-0.0180
Na+/Li+
Na+
Dicarboxylic acid
Often needs
purification
before use
Zwitterionic
Zwitterionic
Comments
-0.0024
+0.0002
-0.0018
+0.0002
Buffer substances for anion exchange chromatography

pKa
pH
(25C) interval
Substance
Conc.
(mM)dT
dpKa/
(C)
Counter-ion
*4.75
4.5-5.0
20
-0.015
Cl-
*5.68
*5.96
*6.46
*6.80
*7.76
5.0-6.0
5.5-6.0
5.8-6.4
6.4-7.3
7.3-7.7
N-methyl
piperazine
Piperazine
L-histidine
bis-Tris
bis-Tris propane
Triethanolamine
20
20
20
20
20
-0.015
*8.06
7.6-8.0
Tris
20
-0.028
Cl-/HCOOClClClCl-/
CH3COOCl-
*8.52
8.0-8.5
N-methyldiethanolamine
50
-0.028
SO2-/Cl-/
CH3COO-
*8.88
8.4-8.8
Diethanolamine
-0.025
Cl-
*8.64
8.5-9.0
20 at pH 8.4
50 at pH 8.8
20
-0.031
Cl-
20
20
20
-0.029
-0.026
-0.026
ClClCl-
20
20
-0.031
-0.026
ClCl-
*9.50
*9.73
*10.47
11.12
12.33
1,3-diaminopropane
9.0-9.5
Ethanolamine
9.5-9.8
Piperazine
9.8-10.3 1,3-diaminopropane
10.6-11.6 Piperadine
11.8-12.0 Phosphate
-0.017
-0.020
* Recommended on the basis of experiments performed in our laboratories.
78
Often needs
purification
before use and
especially
sensitive to
temperature
change.
Table 20. Volatile buffer systems.

pH
Substance
Counter-ion
2.0
Formic acid
H+
2.3-3.5
Pyridine/formic acid
3.0-5.0
Trimethylamine/formic acid
HCOOHCOO-
3.0-6.0
Pyridine/acetic acid
CH3OO-
4.0-6.0
Trimethylamine/acetic acid
6.8-8.8
Trimethylamine/HCl
CH3COOCl-
7.0-8.5
Ammonia/formic acid
HCOO-
8.5-10.0
Ammonia/acid
7.0-12.0
Trimethylamine/CO2
CH3COOCO -
7.0-12.0
Triethylamine/CO2
CO3-
7.9
Ammonium bicarbonate
8.0-9.5
Ammonium carbonate/ammonia
HCO3CO -
8.5-10.5
Ethanolamine/HCl
Cl-
8.9
Ammonium carbonate
CO3-
Test-tube method for selecting starting ionic strengths

1. Set up a series of tubes with ion exchanger as detailed on page 69.
2. Equilibrate the gel in each tube with 0.5 M buffer at the selected
starting pH (10 x 10 ml washes).
3. Equilibrate the gel in each tube to a different ionic strength, at constant
pH, using a range from 0.05 M to 0.5 M NaCl for Sephadex ion
exchangers and from 0.01 M to 0.3 M NaCl for Sephacel and
Sepharose ion exchangers. This will require 5 x 10 ml washes. Intervals
of 0.05 M NaCl are sufficient.
4. Add sample, mix and assay the supernatant to determine the maximum
ionic strength which permits binding of the substance of interest and the
minimum ionic strength required for complete desorption.
In the hypothetical example shown in Figure 38 (b) the ionic strength for sample
binding (start buffer) would be at most 0.15 M and for elution at least 0.3 M.
79
10. Experimental Technique

There are three ways of performing an ion exchange separation: by column chromatography, by batch methods, and by expended bed adsorption. This section will
mostly deal with column chromatography.
Column chromatography
Choice of column
Good results in column chromatography are not solely dependent on the correct
choice of gel media. The design of the column and good packing technique are also
important in realising the full separation potential of any gel. These factors are
built into the pre-packed columns supplied by Pharmacia Biotech and should be
considered before packing a chromatography column in the laboratory.
Column design
The material used in the construction of the column should be chosen to prevent
destruction of labile biological substances and minimize non-specific binding to
exposed surfaces. The bed support should be designed so it is easily exchangeable
to restore column performance whenever contamination and/or blockage in the
column occurs. Bed supports made from coarse sintered glass or glass wool cannot
be recommended because they soon become clogged, are difficult to clean and
cause artifacts (22). Dead spaces must be kept to a minimum to prevent re-mixing
of separated zones.
The pressure specifications of the column have to match the back-pressure generated in the packed bed when run at optimal flow rate. This is particularly important
when using high performance media with small bead size.
Pharmacia Biotech has developed a series of standard columns suitable for ion
exchange chromatography. All are easy to dismantle and reassemble to allow thorough cleaning, which is a particularly important aspect when handling biological
samples.
Further information on the full range of Pharmacia Biotech chromatography
columns are available upon request.
Larger chromatography columns, specially designed for pilot and process scale
chromatography are also available. Some aspects regarding process scale columns
are described in Chapter 11.
80
Column dimensions
As for most adsorptive, high selectivity techniques, ion exchange chromatography
is normally carried out in short columns. A typical ion exchange column is packed
to a bed height of 5-15 cm. Once the separation parameters have been determined,
scale-up is easily achieved by increasing the column diameter.
Quantity of ion exchanger

The amount of ion exchanger required for a given experiment depends on the
amount of sample to be chromatographed and on the available or dynamic capacity of the ion exchanger for the sample substances. For the best resolution in ion
exchange chromatography, it is not usually advisable to use more than 10-20% of
this capacity, although this value can be exceeded if resolution is adequate. The
capacity data given for each specific ion exchanger in respective product Chapter
serves as a guideline for calculating the required amount of ion exchanger needed
for a given experiment.
Preparation of the ion exchanger

Having chosen the appropriate ion exchanger and starting buffer it is essential
that the exchanger is brought to equilibrium with start buffer before sample application. Preparation of Sephadex ion exchangers, which are supplied as powders,
differs somewhat from the other ion exchangers available from Pharmacia Biotech, which are supplied pre-swollen and/or pre-packed.
Pre-swollen ion exchangers

SOURCE, Sepharose based, and DEAE Sephacel ion exchange media are supplied
ready to use. To prepare the gel, the supernatant is decanted and replaced with
starting buffer to a ratio of approximately 75% settled gel to 25% buffer.
If large amounts of ion exchangers are to be equilibrated with a weak buffer, the
ion exchanger should first be equilibrated with a 10 times concentrated buffer
solution at the correct pH, and then with a few volumes of starting buffer.
Pre-packed ion exchange media

MiniBeads and MonoBeads are supplied pre-packed in PC and HR columns
respectively. SOURCE 15 are available pre-packed and ready to use in
RESOURCE columns, 1 or 6 ml. Pre-packed HiLoad columns are XK Columns
pre-packed with Sepharose Fast Flow and Sepharose High Performance ion
exchangers. Sepharose High Performance ion exchangers are also available prepacked in HiTrap columns, 1 and 5 ml. For pilot scale applications, Mono Q,
Mono S and Q Sepharose High Performance are available in pre-packed BioPilot
81
Columns of 100 ml(35/100) and 300 ml (60/100). SP Sepharose High Performance pre-packed in BioPilot Columns are available on request. For the above mentioned pre-packed columns, the preparation consists of washing out the 20% ethanol
packing solution with 5 column volumes of start buffer.
Sephadex ion exchangers

Sephadex ion exchangers should be swollen at the pH to be used in the experiment. Complete swelling takes 1-2 days at room temperature or 2 hours (at pH 7)
in a boiling water bath. Swelling at high temperature also serves to de-aerate the
gel. Vigorous stirring (e.g. with a magnetic stirrer) and swelling in distilled water
should be avoided due to the risk of damaging the beads.
The required amount of ion exchanger should be stirred into an excess of starting
buffer. Remove the supernatant and replace with fresh buffer several times during
the swelling period. Instead of decantation, the ion exchanger can be washed
extensively on a Bchner funnel after the initial swelling.
Alternative counter-ions
If ion exchangers are to be used with counter-ions other than those supplied (i.e.
other than sodium or chloride) then the following procedure should be used.
Suspend the required amount of ion exchanger in and excess of 0.5-1.0 M solution
of a salt of the new counter-ion. After sedimentation and decantation, re-suspend
the ion exchanger in the buffer to be used in the experiment. Decant and re-suspend
the ion exchanger in this buffer several times.
Decantation of fines
Decantation of fines is not necessary with any Pharmacia Biotech ion exchangers.
Packing the column

As with any other chromatographic technique, packing is a very critical stage in an
ion exchange experiment. A poorly packed column gives rise to poor and uneven
flow, zone broadening, and loss of resolution.
Detailed packing instructions are to be found in the instructions supplied with
respective media.
Column Packing Video Film

A video film describing the correct methodologies for packing laboratory columns
is available and can be ordered from your local distributor of Pharmacia Biotech
products.
82
Checking the packing

The bed should be inspected for irregularities or air bubbles using transmitted
light from a lamp held behind the column. Be careful in the choice of any dye substances used for checking beds as many of them are strongly charged. For example, Blue Dextran 2000 binds strongly to anion exchangers.
Testing the bed is easily done by injecting a test substance on the column and calculating the number of theoretical plates (N) or the height equivalent to a theoretical plate (H).
Choose a test substance which shows no interaction with the media and which has
a low molecular weight, to give full access to the interior of the beads.
Acetone at a concentration of 1% (v/v) can be used with all kinds of chromatographic media and is easily detected by UV-absorption. Keep the sample volume
small to ensure a narrow zone when the sample enters the top of the column. For
optimal results, the sample volume should be 0.5% of the column volume for a
column packed with a medium of approximately 30 m bead diameter and 2%
of the column for a column packed with a medium of approximately 100 m bead
diameter. Keep the linear flow rate low to reduce zone spreading due to non-equilibrium at the front and rear of the zone. For 30 m media the flow rate should be
between 30-60 cm/h and for 100 m media, 15-30 cm/h. Use the following equations to calculate the number of theoretical plates (N) and the hight equivalent to a
theoretical plate (H).
VR
()
N = 5.54 x
wh
H = L/N
where
VR is the volume eluted from the start of sample application to the peak maximum
and wh is the peak width measured as the width of the recorded peak at half of the
peak height, see Figure 44. L is the height of the packed bed.
Measurements of VR and wh can be made in distance (mm) or volume (ml) but
both parameters must be expressed in the same unit.
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Fig 44. A UV trace for acetone

in a typical test chromatogram
showing the HETP and As
value calculations.
As a general rule of thumb, a good H value is about two to three times the mean
bead diameter of the gel being packed. For a 90 m particle packing, this means
an H value of 0.018-0.027 cm.
Another useful parameter for testing the packed bed is the symmetry factor (As)
As =
b
a
where
a = 1st half peak width at 10% of peak height. (see Figure 44)
b = 2nd half peak width at 10% of peak height. (see Figure 44)
As should be as close as possible to 1. A reasonable As value for a short column
such as an IEX column is 0.80-1.80. (For longer gel filtration columns it will probably fall within 0.70-1.30).
An extensive leading edge is usually a sign that the gel has been packed too tightly
and extensive tailing is usually a sign that the gel has been packed too loosely.
Equilibrating the bed

Run at least two bed volumes of buffer through the ion exchange bed to allow the
system to reach equilibrium. Counter-ion concentration, conductivity, and pH of
the eluent should be checked against the ingoing solution. It is often sufficient just
to measure the pH of the effluent.
84
Sample preparation
Sample concentration
The amount of sample which can be applied to a column depends on the dynamic
capacity of the ion exchanger and the degree of resolution required. For the best
resolution it is not usually advisable to use more than 10-20% of this capacity
(23). Information on the available capacities for the different exchangers is given
in the relevant product sections. Methods for determining available and dynamic
capacities are given later in this chapter.
Sample composition
The ionic composition should be the same as that of the starting buffer. If it is not,
it can be changed by gel filtration on Sephadex G-25 using e.g. Pharmacia Biotech
Disposable Column PD-10, Fast Desalting Column HR 10/10 or HiTrap Desalting
Columns, dialysis, diafiltration or possibly by addition of concentrated start buffer.
Sample volume
If the ion exchanger is to be developed with the starting buffer (isocratic elution),
the sample volume is important and should be limited to between 1 and 5% of the
bed volume. If however, the ion exchanger is to be developed with a gradient, starting conditions are normally chosen so that all important substances are adsorbed
at the top of the bed. In this case, the sample mass applied is of far greater importance than the sample volume. This means that large volumes of dilute solutions,
such as pooled fractions from a preceding gel filtration step or a cell culture supernatant can be applied directly to the ion exchanger without prior concentration.
Ion exchange thus serves as a useful means of concentrating a sample in addition
to fractionating it.
If contaminants are to be adsorbed, and the component of interest is allowed to
pass straight through, then the sample volume is less important than the amount
of contaminant which is present. Under these conditions there will be no concentration of the purified component, rather some degree of dilution due to diffusion.
Sample viscosity
The viscosity may limit the quantity of sample that can be applied to a column. A
high sample viscosity causes instability of the zone and an irregular flow pattern.
The critical variable is the viscosity of the sample relative to the eluent. A rule of
thumb is to use 4 cP as the maximum sample viscosity. This corresponds to a protein concentration of approximately 5%. Approximate relative viscosities can be
quickly estimated by comparing emptying times from a pipette.
85
If the sample is too viscous, due to high solute concentration, it can be diluted
with start buffer. High viscosity due to nucleic acid contaminants can be alleviated
by precipitation with a poly-cationic macromolecule such as polyethyleneimine or
protamine sulphate. Nucleic acid viscosity can also be reduced by digestion with
endonuclease. Such additives may however be less attractive in an industrial process since they will have to be proven absent from the final product.
Sample preparation
In all forms of chromatography, good resolution and long column life time depend
on the sample being free from particulate matter. It is important that dirty samples are cleaned by filtration or centrifugation before being applied to the column.
This requirement is particularly crucial when working with small particle matrices, such as MiniBeads (3m), MonoBeads (10 m), SOURCE (15 and 30 m) and
Sepharose High Performance (34m).
The grade of filter required for sample preparation depends on the particle size
of the ion exchange matrix which will be used. Samples which are to be separated
on a 90 m medium can be filtered using a 1 m filter. For 3, 10, 15, 30 and 34 m
media, samples should be filtered through a 0.45 m filter. When sterile filtration
or extra clean samples are required, a 0.22 m filter is appropriate.
Samples should be clear after filtration and free from visible contamination by
lipids. If turbid solutions are injected onto the column, the column lifetime, resolution and capacity can be reduced. Centrifugation at 10 000 g for 15 minutes can
also be used to prepare samples. This is not the ideal method of sample preparation but may be appropriate if samples are of very small volume or adsorb nonspecifically to filters.
Note: The latter may indicate that the substance in question may also adsorb
strongly to chromatography matrices. Care should therefore be taken and perhaps
a buffer additive such as glycerol or a detergent used.
Crude samples containing lipids, salts, etc. can be passed through a suitably sized
column of Sephadex G-25 e.g. Pharmacia Biotech Desalting Column PD-10, Fast
Desalting Column HR 10/10 or HiTrap Desalting Column. Preliminary sample
clean-up can be achieved simultaneously in this way.
In expanded bed adsorption sample preparation is not as crucial as for column
chromatography. Samples can be applied directly to the expanded bed without
prior sample preparation, e.g. filtration, centrifugation etc. (Expanded bed
adsorption is described in detail on page 98.)
86
Sample application
There are a number of ways to apply the sample.
Sample application with an adaptor

This is the recommended method for all ion exchange media with the exception of
Sephadex based media and is always the method used with pre-packed columns or
when upward elution is employed. The sample may be applied to the column via
the adaptor in one of the following ways.
Sample loops are a convenient way of
applying small samples in a reproducible
manner without interrupting the liquid
flow on the column. Sample loops can be
used in conjunction with LV-4 or SRV-4
valves (Fig. 45) or in conjunction with the
manual valves V-7 and IV-7 or the motorized valves MV-7 and IMV-7 (Fig. 46).
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SA-5
SRV-1
To column
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Fig. 45. Sample application using an SA-5 in a

sample loop system.
From pump
Sample applicators SA-5, SA-50. These are reservoirs which, used in combination
with a suitable valve, e.g. SRV-4, allow the sample to be introduced via a closed
sample loop system using a pump (Fig. 45). As well as their large capacity (up to 6
ml for the SA-5 and 45 ml for the SA-50) the sample applicator offers the advantage of serving as a pulse damper and bubble trap.
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Fig. 46. Sample application using V-7, IV-7 or motorized MV-7 or IMV-7 valves.
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Superloops can be used together with the manual valves V-7 and IV-7 or the motorised valves MV-7 and IMV-7 when larger volumes of sample have to be applied
(Fig. 47). Superloops are available with capacities of 10, 50 and 150 ml. (The 150
ml Superloop is most often used in BioPilot System.)
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Fig. 47. Sample application using a Superloop.
Syringe method (Fig. 48). The valves LV-3 and LV-4 can be used as syringe holders
to give a very simple method for the application of small samples in standard chromatography. Using this method the sample is allowed to run onto the column
under gravity.
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88
Fig. 48. Sample application using a

syringe.
Sample reservoir (Fig. 49). In a similar way, a sample reservoir (e.g. R9, RK 16/26)
can be connected via a 3-way valve to apply larger samples.
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Fig. 49. Sample application

using a reservoir. This is also an
example of upward elution.
Other methods of sample application

The following methods can be used with Sephadex based ion exchangers where it
is not recommended to use an adaptor due to the variability of the bed height.
They are not recommended for the more rigid ion exchanger types.
Sample application onto a drained bed

This method requires the least equipment but is very difficult to do well. Allow
eluent to drain to the bed surface, then pipette the sample onto the gel surface and
allow it to drain into the gel. When all the sample has entered the bed, the top of
the column is washed with aliquots of starting buffer and is connected up for elution. The drawback with this system is that disturbances to the bed surface result
in uneven sample application and band skewing.
Sample application under the eluent

Here excess eluent is left on top of the column. Some very thin capillary tubing is
attached to a syringe and the free end is flared by gentle heating. The syringe is
filled with sample which is then layered on top of the bed by positioning the end of
89
the tubing just above the surface and slowly pressing out the sample. Note that the
sample must be denser than the eluent or made denser by the addition of a sugar,
e.g. glucose (24). The column can then be connected for elution.
Elution
If starting conditions are chosen such that only unwanted substances in the sample
are adsorbed, then no change in elution conditions is required since the substance
of interest passes straight through the column. Similarly no changes are required if
sample components are differentially retarded and separated under starting conditions. This procedure is termed isocratic elution, and the column is said to be developed under starting conditions. Isocratic elution can be useful since no gradient
apparatus is required for the run and, if all retarded substances elute, regeneration
is not required.
Normally, however, separation and elution are achieved by selectively decreasing
the affinity of the solute molecules for the charged groups on the gel by continuously changing either buffer pH or ionic strength or possibly both. This procedure
is termed gradient elution.
Change of pH
As shown in Figure 37 on page 68, the net charge on a molecule depends on pH.
Thus altering the pH towards the isoelectric point of a substance causes it to lose
its net charge, desorb, and elute from the ion exchanger. Figure 50 shows use of a
decreasing pH gradient in separation of haemocyanin fractions (25).
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Fig. 50. Elution pattern

of whole stripped
haemocyanin on
DEAE Sepharose CL-6B.
Sample applied in 0.1 M
sodium phosphate buffer
pH 6.8 and eluted with
decreasing pH gradient
(25). (Reproduced by kind
permission of the authors
and publisher.)
Since many proteins show minimum solubility in the vicinity of their isoelectric
points, care and precautions must be exercised to avoid isoelectric precipitation on
the column. The solubility of the sample components at the pH and salt concentrations to be used during separation should always be tested in advance.
90
Change of ionic strength

At low ionic strengths, competition for
charged groups on the ion exchanger is
at a minimum and substances are bound
strongly. Increasing the ionic strength
increases competition and reduces the
interaction between the ion exchanger
and the sample substances, resulting in
their elution. Figure 51 shows the elution of mouse IgM on SP Sepharose Fast
Flow using a concentration gradient of
NaCl.
Fig. 51. Isolation of mouse IgM on

SP Sepharose Fast Flow. (Courtesy of Dr.
H. F. J. Savelkoul, Erasmus University,
Rotterdam, The Netherlands.)
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Gradient direction
Guidelines for the choice of ascending or descending gradients are given in
Table 21.
Table 21. Choosing the direction of the gradient for elution.
Ion exchanger
Direction of
pH gradient
Direction of
ionic strength gradient
Anion exchanger
decreasing
increasing
Cation exchanger
increasing
increasing
Choice of gradient type

The components in the sample usually have different affinities for the ion
exchanger and so variations in the pH and ionic strength of the eluent can cause
their elution at different times and thus their separation from each other. One can
choose to use either continuous or stepwise gradients of pH or ionic strength.
Stepwise pH gradients are easier to produce and are more reproducible than linear
pH gradients. In the case of weak ion exchangers the buffer may have to titrate the
ion exchanger and there will be a short period of re-equilibration before the new
pH is reached. Gradients of pH can be also used in combination with ionic
strength gradients.
91
Stepwise ionic strength gradients are produced by the sequential use of the same
buffer at different ionic strengths. Stepwise elution is technically simple and offers
the potential of high resolution in preparative applications. Care must be exercised in the design of the steps and the interpretation of results since substances eluted by a sharp change in pH or ionic strength elute close together. Peaks tend to
have sharp fronts and pronounced tailing since they frequently contain more than
one component. Tailing may lead to the appearance of false peaks if a buffer change is introduced too early. For these reasons a first separation using a continuous
gradient is always recommended as a means of characterising the sample and an
indication of suitable steps. The differences between continuous and stepwise gradient elution are shown in Figure 52.
Continuous pH gradients are difficult to produce at constant ionic strength, since
simultaneous changes in ionic strength, although small, also occur. Linear pH gradients cannot be obtained simply by mixing buffers of different pH in linear volume ratios since the buffering capacities of the systems produced are pH dependent.
A relatively linear gradient can be produced over a narrow pH interval (Max.
2 pH units) by mixing two solutions of the same buffer salt adjusted, respectively,
to 1 pH unit above and 1 pH unit below the pKa for the buffer.
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Fig. 52. Continuous and stepwise gradient elution of b-galactosidase from Escherichia coli
on Mono Q HR 5/5 (26). (Reproduced by kind permission of the authors and publisher.)
92
Continuous ionic strength gradients are the most frequently used type of elution in
ion exchange chromatography. They are easy to prepare and very reproducible.
Two buffers of differing ionic strength, the start and limit buffers, are mixed together and if the volume ratio is changed linearly, the ionic strength changes linearly.
The limit buffer may be of the same buffer salt and pH as the start buffer, but at
higher concentration, or the start buffer containing additional salt e.g. NaCl.
Gradient elution generally leads to improved resolution since zone sharpening
occurs during elution. In all forms of isocratic elution, a limiting factor with
regards to achievable resolution is zone broadening as a result of longitudinal diffusion. In gradient elution, the leading edge of a peak is retarded if it advances
ahead of the salt concentration or pH required to elute it. In contrast the trailing
edge of the peak is exposed to continuously increasing eluting power. Thus the
trailing edge of the peak has a relatively higher speed of migration, resulting in
zone sharpening, narrower peaks and better resolution.
Gradient elution also reduces zone broadening by diminishing peak tailing due to
non-linear adsorption isotherms.
Resolution using a continuous gradient

To optimize a separation it is important first to consider the objectives of the experiment, since the desired features of a separation i.e. speed, resolution and capacity, are often mutually exclusive. In the case of ion exchange separations the speed
of separation is not solely related to the flow rate used in the experiment but also
to the steepness or slope of the gradient applied.
Novotny (27) has shown that the retention of charged molecules on an ion
exchange column is related to the volume of the column and the molarity difference across it. This means that long shallow gradients will give maximum separation
between peaks but that the separation time will be longer and peak broadening
larger. In contrast short steep gradients will give faster separations and sharper
peaks but the retention differences between peaks will be reduced. The effect of
gradient slope on resolution is illustrated in Figure 53.
It should be remembered that the sample loading also has a major influence on
resolution since the width of the peaks is directly related to the amount of substance
present.
In practice it is recommended that trial experiments be carried out to allow the
selection of optimal run parameters in terms of gradient shape and length.
As a general rule a gradient of 0.05 to 0.5 M salt over a volume of 10 to 20
column volumes at the flow rate recommended for the medium (see individual
media sections) can be used for initial investigative separations.
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Fig. 53. Effect of gradient slope on resolution. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala,
Sweden).
Choice of gradient shape

Linear Gradients. It is strongly recommended that initial experiments with a new
separation problem be carried out using linear gradient elution. The results obtained can then serve as a base from which optimization can be planned. If better
resolution is required then the separation can be improved by altering the shape or
slope of the gradient.
Convex gradients can be used to improve resolution in the last part of the gradient
or to speed up a separation when the first peaks are well separated and the last few
are adequately separated.
94
Concave gradients can be used to improve resolution in the first part of the gradient or to shorten the separation time when peaks in the latter part of the gradient
are more than adequately separated.
Complex gradients can be generated to use the maximum resolution offered by
isocratic resolution when required combined with steeper gradient portions where
resolution is adequate or unnecessary (Fig. 54). Complex gradients offer the maximum flexibility in terms of combining resolution with speed during the same separation. A knowledge of the chromatographic behaviour of the sample obtained
from previous separations using simpler gradients is essential.
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Fig. 54. Anion exchange chromatography of a mixture of pyridine

nucleotides on Mono Q (28):
Sample, 100 l of 100 M NAD,
100 M NADH, 250 M NADP
and 250 M NADPH; column,
Mono Q HR 5/5; buffer A,
20 mM triethanolamine, pH 7.7;
buffer B, buffer A with 1.0 M
KCl; gradient, 0% B for 2 ml,
0-20% B in 15 ml, 20-100% B in
5 ml, 100% B for 3 ml; flow rate,
1 ml/min.
Sample displacement
When a sample of solutes, such as proteins, is applied to the top of an ion
exchange column the species with the highest charge density will bind at the top,
displacing more weakly bound species or preventing such from binding.
In effect a degree of separation occurs on the column during sample loading, with
the solutes stacked on the column in order of their relative charges and strengths
of binding.
On application of a gradient the increasing salt concentration will cause the most
weakly bound molecules to migrate and leave the column first. For this reason
reverse flow elution should never be used in the ion exchange separation of
complex mixtures. Under such conditions early desorbing substances would have
to migrate through all other bound species, possibly displacing them, and lead to
lost resolution.
95
Gradient generation
Accurate and reproducible pH and ionic strength gradients are best formed using
purpose designed equipment. The choice of gradient generating system will
depend upon the type of ion exchange media and the required complexity of the
gradient.
Gradient formation with two pumps or a single pump in combination with a switch valve
Maximum flexibility in terms of gradient production is achieved by using two
separate pumps for start and limit buffers or a single pump in combination with a
switch valve.
Using gradient programmers, e.g. GP-250 Plus or LCC-501 Plus, or using chromatography systems which are controlled via a controlling software, e.g. UNICORN
and FPLCdirector, the proportions of the start and limit buffers which constitute
the eluent being supplied to the column are programmed for specific times or volumes during the separation. The relative amounts of start and limit buffer then
increase or decrease in a linear fashion between two such breakpoints to produce the gradient. The more breakpoints which have been programmed the more
complex the gradient.
Further information on controlling software, gradient programmers and related
pump systems is available from Pharmacia Biotech.
Gradient Mixer
The Pharmacia Gradient Mixer GM-1
can be used to make linear ionic strength
or pH gradients of up to 500 ml in
volume (Fig. 55). The mixing chamber
should contain the starting buffer and
the other chamber the limiting buffer.
Although the Gradient Mixer GM-1 will
not produce linear pH gradients it can be
used to form reproducible continuous
pH gradients from two solutions of
different pH and similar ionic strength.
Fig. 55. Gradient elution system using the

Gradient Mixer GM-1.
96
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An example of a decreasing pH gradient produced by the Gradient Mixer GM-1

is shown in Figure 56. The gradient was produced from 0.1 M solutions of Tris
(free base), pH 10.5 and Tris-HCl, pH 7.5.
Usually changes in pH also produce small changes in ionic strength.
These can be estimated by monitoring conductivity.
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Fig. 56. Gradient from pH 10.5 to 7.5 in 400 ml produced using the Gradient Mixer GM-1.
pH , conductance - - -. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)
Batch separation
There is essentially no difference in separation procedure between a column developed by stepwise elution and a batch procedure. Either the substance of interest
or contaminants may be attached to the ion exchanger.
Although batch procedures are less efficient than column techniques they may
offer advantages in particular cases. When very large sample volumes with low
protein concentration have to be processed, the sample application time on a
column can be very long and filtration of such a large sample can also be rather
difficult to perform. Binding the sample in batch mode will be much quicker and
there will be no need to remove particulate matter.
A batch procedure can also be an attractive approach if high sample viscosity
generates high back-pressure in a column procedure or if high back-pressure is
generated by contaminants such as lipids, which may cause severe fouling and
clogging of the column.
Batch separation is a very rapid technique and no technical difficulties are caused
by the swelling or shrinkage of Sephadex ion exchangers. The shrinkage may even
be an advantage in some applications.
97
When working with batch ion exchange, the starting conditions are selected in the
same way as in column chromatography, i.e. choose buffer pH an ionic strength to
bind the substance of interest but to prevent as many contaminants as possible
from binding.
To maximize recovery, the starting conditions should be selected so that the protein of interest binds much stronger than is usual in column chromatography.
Unless the proteins adsorbs to 100%, losses during subsequent washing will be
inevitable, especially if the volume of liquid is large compared to the volume of
adsorbent. To keep recovery high, the pH in a batch experiment may have to be
several units away from the isoelectric point of the protein.
Batch separation is carried out by stirring the ion exchanger previously equilibrated in the appropriate buffer with the solution to be treated until the mixture has
reached equilibrium. This usually takes about one hour. The slurry is then filtered
and washed with the buffer solution. In cases of incomplete adsorption this procedure should be repeated on the filtrate with a new batch of ion exchanger. Then
elution buffer is added (1-2 times the volume of the sedimented gel) and stirred
until desorption is complete, which can take up to 30 minutes or more. Finally,
suction is used to filter the buffer containing the desorbed product of interest from
the adsorbent. The gel can also be packed in a column after the washing step and
be eluted stepwise in the same way as during normal column chromatography.
Resolution will however be lower for such a combined batch and column procedure compared with a normal column procedure, since the sample is bound uniformly throughout the gel slurry and the subsequent chromatographic bed.
Under these conditions stepwise elution is recommended since gradient elution
will give broad bands and poor resolution.
Batch chromatography is very useful for concentrating dilute solutions and separating the substances of interest from gross contaminants during the initial stages
of a purification scheme.
Note: Fines will be generated if the ion exchangers are stirred too vigorously. This
will increase the time required for filtration.
Expanded bed adsorption

Expanded bed adsorption is a unit operation that uses STREAMLINE adsorbents
and columns for recovering proteins directly from crude samples. Proteins are
recovered in a single pass without the need for prior clarification. STREAMLINE
has proven effective in purification proteins from fermentation or cell culture in
extracellular processes, and has demonstrated its suitability when used with broth
from cell lysis and homogenization in intracellular processes with soluble proteins.
STREAMLINE reduces the number of operations in a process by fusing the functions of clarification, concentration and capture (see page 109) in one operation.
98
It offers the selectivity afforded by chromatography, the throughput of ultra-filtration and the convenience of small scale centrifugation.
Crude feed from the fermentor containing the desired product and undesired cells,
cell debris and particulates is applied to the expanded bed. Target products are
bound by the adsorbent while particulates and contaminants pass through unhindered. The desired molecule is then eluted as in packed bed chromatography.
Expanded bed technology

Expanded bed adsorption is based on fluidization. The sedimented bed begins to
expand as the adsorbent particles are raised by an upward liquid flow. The difference between a fluidized bed and expanded bed is that in an expanded bed the
adsorbent particles display very little back-mixing. This is achieved through the
unique design of the column and the adsorbents. The column has a special flow
distributor at the bottom, the adsorbent particles have a well-defined size and density distribution. The particles are kept in suspension by the balance between
upward flow rate and particle sedimentation velocity. As the bed expands with the
upward liquid flow, the movement of any given particle is very small. This creates
a stable, homogeneous expanded bed and a liquid flow which is characterized by a
constant velocity profile, i.e. plug flow. The stability of the expanded bed give
STREAMLINE characteristics that are similar to those of a packed bed in
chromatography.
Basic principle of operation

1. STREAMLINE adsorbent is poured into STREAMLINE column and allowed
to sediment (Fig. 57 a).
2. An upward liquid flow of equilibration buffer is applied to the column and
STREAMLINE adsorbent particles are suspended in the flow, creating a stable
fluidized bed (Fig. 57 b).
3. The sample, a mixture of soluble proteins, contaminants, cells, or cell debris,
is passed upwards through the expanded bed. The target proteins are bound
on STREAMLINE adsorbent while particulates and contaminants pass
through the expanded bed unrestricted. Loosely bound material is washed out
with the upward flow of the buffer (Fig. 57 c).
4. The liquid flow is reversed to downward flow. By using suitable buffer
conditions, the bound proteins are eluted from STREAMLINE adsorbent in a
sedimented bed mode. The eluate contains the target proteins, increased in con
centration, free from particulates and ready for further purification (Fig. 57 d).
99
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Eluate
Fig. 57. The principle of

operation of expanded
bed adsorption.
STREAMLINE adsorbents
STREAMLINE adsorbents are described in detail in Chapter 6.
STREAMLINE columns
STREAMLINE columns are designed to suit the different stages of process development. STREAMLINE 50 column is designed for method optimization. A set-up
with this column can handle 1-20 l from the fermentor at a throughput of 6 l/h. A
set-up with STREAMLINE 200 column, for pilot scale and verification of the
optimized methods, can handle 50-300 l of sample at a throughput of 100 l/h.
STREAMLINE CD column, custom designed for industrial manufacturing, can
handle production volumes of samples at a throughput of several thousands of
litres per hour.
Auxiliary equipment
To operate expanded bed adsorption in method optimization some auxiliary equipment is needed. For example, a peristaltic pump, manual valves, UV, pH and
conductivity monitors and a recorder, all standard laboratory equipment.
For production installations STREAMLINE is engineered to your specifications.
100
Regeneration
After each cycle, bound substances must be washed out from the column to restore the original function of the media. Ion exchange adsorbents can normally be
regenerated after each run by washing with a salt solution until an ionic strength
of about 2 M has been reached. This should remove any substances bound by
ionic forces. The salt should contain the counter-ion to the ion exchanger to facilitate equilibration.
To prevent a slow build up of contaminants on the column over time, more rigorous cleaning protocols may have to be applied on a regular basis, see below.
Cleaning, sanitization and

sterilization procedures
Cleaning
Cleaning-in-place (CIP) is the removal from the purification system of very tightly
bound, precipitated or denatured substances generated in previous purification
cycles. In some applications, substances such as lipids or denatured proteins may
remain in the column bed instead of being eluted by the regeneration procedure. If
contaminants accumulate on the column over a number of purification cycles,
they may affect the chromatographic properties of the column. If fouling is severe,
it may also block the column, increasing the back-pressure and reducing the flow
rate.
A specific CIP protocol should be designed according to the type of contaminants
that are known to be present in the sample. NaOH is a very efficient cleaning
agent that can be used for solubilizing irreversibly precipitated proteins and lipids.
NaOH can effectively be combined with solvent or detergent based cleaning methods.
Sanitization
Sanitization is the inactivation of microbial populations. When a packed column
is washed with a sanitizing agent, the risk of contaminating the purified product
with viable micro-organisms is reduced. The most commonly used sanitization
method in chromatography today is to wash the column with NaOH. NaOH has
a very good sanitizing effect and also has the addition advantage of cleaning the
column.
Sterilization
Sterilization, which is not synonymous with sanitization, is the destruction or elimination of all forms of microbial life in the system.
101
Protocols for cleaning-in-place (CIP),

sanitization and sterilization.
Suggested protocols for cleaning-in-place (CIP), sanitization and sterilization that
can be applied to each specific ion exchanger from Pharmacia Biotech are
summerized below.
SOURCE and Sepharose based ion exchangers

CIP, sanitization and sterilization protocols for SOURCE and Sepharose based ion
exchangers media are summarized in Table 22.
Table 22. Suggested CIP, sanitization and sterilization protocols for SOURCE 15 and 30,
and Sepharose based ion exchangers media from Pharmacia Biotech.
Purpose
Procedure
Removal of precipitated proteins
4 bed volumes of 0.5-1.0 M NaOH at 40 cm/h

followed by 2-3 bed volumes of water.
Removal of strongly bound

hydrophobic proteins, lipoproteins and lipids
4-10 bed volumes of up to 70% ethanol or

30% isopropanol followed by 3-4 bed volumes
of water.
or
1-2 bed volumes of 0.5% non-ionic detergent
(e.g. in 1 M acetic acid) followed by 5 bed
volumes of 70% ethanol to remove the detergent,
and 3-4 bed volumes of water.
Sanitization
0.5-1.0 M NaOH with a contact time of 30-60

min.
Sterilization
Autoclave the medium at 121 C for 15 min.
MonoBeads and MiniBeads columns

Due to the small particle size of MonoBeads and MiniBeads, they are more sensitive to particulate matter such as precipitated proteins from the sample or buffer
solutions than the larger bead size matrices. Preventative measures to ensure cleanliness of the sample and buffers are essential to ensure long column life. Sample
preparation procedures are described earlier in this Chapter. Should precipitated
material be present, as indicated by a decrease in performance or an increase in
back-pressure, the columns may be cleaned using the detailed instructions included with the column.
102
DEAE Sephacel and Sephadex based ion exchangers

Due to the relatively large volume changes of Sephadex based gels in different solvents, we recommend cleaning and washing with organic solvents on a Bchner
funnel, since the gel needs to be repacked after such treatment.
Remove ionically bound proteins by washing the column with 0.5-1 bed volume
of a 2 M NaCl solution.
Remove precipitated proteins, hydrophobically bound proteins and lipoproteins
by washing the column with 0.1 M NaOH solution, contact time 1-2 hours, followed by binding buffer until free from alkali. Alternatively, wash the column with
2 bed volumes of 6 M guanidine hydrochloride.
Strongly hydrophobically bound proteins, lipoproteins and lipids can be removed
by washing the gel with up to 70% ethanol or 30% isopropanol. Alternatively,
wash the gel with 2 bed volumes of a non-ionic detergent in a basic or acidic solution. Use for example, 0.1-0.5% non-ionic detergent (e.g. Triton X-100) in 0.1 M
acetic acid. After treatment with detergent always remove residual detergents by
washing with 5 bed volumes of 70% ethanol.
Re-equilibrate the ion exchanger with starting buffer.
Storage of gels and columns

Prevention of microbial growth
As well as endangering the sample, bacterial and microbial growth can seriously
interfere with the chromatographic properties of ion exchange columns and may
obstruct the flow through the bed. During storage an antimicrobial agent should
always be added to the ion exchanger. Antimicrobial agents may be eluted from
the columns during equilibration before starting a run.
Recommended antimicrobial agents for anion exchangers:
Equilibrate the column with 20% ethanol in 0.2 M acetate.
Recommended antimicrobial agents for cation exchangers:
Equilibrate the column with 20% ethanol or 0.01 M NaOH.
103
Storage of unused media

Unused media should be stored in closed containers at +4 C to +25 C. Note that
it is important that the media are not allowed to freeze as the structure of the
beads may be disrupted by ice crystals. This disruption will generate fines.
Storage of used media

Used media should be stored at a temperature of +4 C to +8 C in the presence of
an antimicrobial agent, e.g. 0.01 M NaOH or 20% ethanol according to the
recommendation given above. Note that it is important that the media are not
allowed to freeze as the structure of the beads may be disrupted by ice crystals.
This disruption will generate fines.
Storage of packed columns

Packed columns should be stored at a temperature of +4 C to +8 C in the presence of an antimicrobial agent, e.g. 0.01 M NaOH or 20% ethanol according to the
recommendation given above. For long-term storage, the packed column should
be thoroughly cleaned before equilibration with the storage solution. Recycling
the storage solution through the column or flushing the column once a week with
fresh storage solution is recommended to prevent bacterial growth.
Determination of the available and

dynamic capacities
The available capacity of an ion exchanger can be determined by a batch test-tube
method similar to that used for the determination of suitable buffer pH and binding and elution ionic strengths, see page 70 and Figure 38. In this case a series of
solutions with different concentrations of the protein are added to a known quantity of ion exchanger, equilibrated at a suitable binding pH and ionic strength.
Assaying the supernatants after mixing will show the maximum protein concentration which can be bound per ml of ion exchanger.
For a more realistic and useful measurement of the available capacity of an ion
exchanger, a dynamic method is recommended (see page 18 for definition of available and dynamic capacity). The type of equipment necessary for this determination is shown in Figure 58. FPLC System can also be used for this determination.
104
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Fig. 58. Experimental

set-up for the determination of the dynamic
capacity of an ion
exchanger.
A defined amount of gel is introduced into the column (Normally a quantity of gel
to give a bed volume of approximately 1 ml is sufficient). The gel is packed and
equilibrated until the eluate is of the same pH as the starting buffer. The exact
volume of gel is calculated from the known column diameter and the measured
bed height. In the case of a pre-packed column the amount of gel is already predetermined.
The protein solution (1 to 5 mg/ml in start buffer) is applied to the column by
switching the sample application valve. To ensure that the column is fully loaded,
105
sample application is not interrupted until the recorder shows 50% full scale
deflection, FSD, (0% = starting buffer; 100% = the protein solution in starting
buffer).
Sample application is stopped by re-setting the valve to allow passage of start buffer. Washing is continued until 0% full scale deflection is approached (Fig. 59).
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Fig. 59. Graph obtained with the setup in Figure 58 used in the determination of dynamic capacity.
After the wash phase, adsorbed protein is eluted with a stepwise change in ionic
strength (e.g. 2 M NaCl) or pH. Fractions are collected as long as the UV-absorption is above 2% FSD. These fractions are pooled and the UV-absorption of the
pool is measured.
Calculation
The maximum amount of protein that can be bound to the column (A) at the chosen flow rate is:
A=CxV
C = The protein concentration in the pooled fractions (mg/ml).
V = volume of pooled fractions.
C = A280/ E
A280 = absorbance of solution at 280 nm in 1 cm cell.
E = absorbance of standard solution (1 mg/ml) at 280 nm in
a 1 cm cell.
The protein capacity is calculated as:
A/gel volume
This calculation assumes that the recovery of bound protein from the column is
100%. This can be checked by comparison with the quantity of protein applied to
the column.
106
11. Process considerations

When an ion exchange step is to be part of a purification sequence for a manufacturing process (in contrast to analytical chromatography or small scale preparative applications), method development work has to find conditions which give the
highest throughput with the highest yield and the lowest possible cost.
What kind of application will the product be used in?
What are the purity issues in relation to the source material and intended
use of final product? What has to be removed?
What kind of starting material do I have?
What are the major Headaches?
What final scale am I thinking of?
What consequences will this have for the technical approach?
What is my purification strategy?
First, CAPTURE
What will be the major purpose for the initial chromatographic step? Is my
proposal rational?
Then, INTERMEDIATE PURIFICATION
What will be the major purpose with each subsequent chromatographic step?
Finally, POLISHING
What will be the major purpose of the polishing stage? Looking back upstream, does
the overall balance and sequence of techniques appear logical?
How do I get the most out of my process?
Will my process be more productive, safe, robust, economic and easier to use than
one which our competitors could do?
Will I arrive at the final process faster than our competitors?
Fig. 60. Questions that must be addressed to assure a rational process design
The design must ensure that the purity requirements of the final product are met,
and also considering the special safety issues involved in production of biopharmaceuticals, such as infectious agents, pyrogens, immunogenic contaminants and
tumorigenic hazards. In general, the purity issues must be addressed in relation to
the nature of the source material and the intended use of the final product. It is
important to define the impurities and contaminants which have to be removed
from the source material during downstream processing.
107
Another important aspect of process development is to assure that scaleability,

robustness and consistency are designed into the process from the very beginning.
This is secured by careful selection of appropriate chromatography media, by the
way a particular chromatographic step is optimized and by an early identification
of different sources of variation and how they can be eliminated or controlled
during processing.
To assure a rational process design, a number of questions must be adressed.
These questions are summerized in Figure 60 and will be discussed below.
Defining the purpose

To reach the targets for yield and purity in as few steps as possible, and with the
simplest possible design, it is not efficient to add one step to another until the purity requirements have been fulfilled. Instead a specific purpose is assigned to each
step which is included in the complete scheme. The specific purification problem
associated with a particular step, will depend greatly on the characteristics of the
ingoing feed material to be processed in the step. Thus, the purpose of a particular
step depends on if it is placed at the beginning, to handle a crude feed stock, in the
middle, after partial purification or at the end when final purity is achieved.
The different stages in downstream processing can be divided into capture, intermediate purification and polishing (Fig. 61).
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Fig. 61. Different stages in downstream processing
When ion exchange chromatography is applied in capture, the purpose will be to

adsorb the protein of interest quickly from the crude feed stock and isolate it from
critical contaminants such as proteases and glycosidases. The product should be
concentrated and transferred to an environment which will conserve potency/acti-
108
vity. At best, significant removal of other critical contaminants can also be

achieved.
In polishing, on the other hand, most impurities have already been removed except
for trace amounts or closely related substances such as microheterogeneous structural variants of the product. When ion exchange chromatography is applied in
such a step the purpose will be to reduce these variants and trace contaminants to
a level that will be acceptable for final product quality by applying scaleable high
resolution ion exchange chromatography techniques.
When ion exchange chromatography is applied in intermediate purification, i.e.
steps performed on clarified feed between capture and polishing, the purpose is to
remove most of the significant impurities such as proteins, nucleic acids, endotoxins and viruses down to safe levels.
The strategic focus

In any chromatographic step there are four main performance properties to adjust
to reach a fully optimized procedure (Fig. 62), resolution, speed, capacity and
recovery.
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Fig. 62. The optimal process must be defined within

the context of competing
goals.
In general, optimization of any of these can only be realized at the expense of the
others. The relative priority of these parameters will vary depending on whether a
particular chromatographic step is for capture, intermediate purification or polishing. This will steer the optimization of the critical processing parameters in any
particular step, as well as the selection of the most suitable chromatography
matrix to be used in the step.
Capture
In a typical capture situation, throughput (i.e. capacity and speed) will be very
important for processing of large sample volumes, keeping the scale of equipment
109
as small as possible and giving the shortest possible cycle time. Binding capacity
for the product in the presence of the impurities will be one of the most critical
parameters to reduce the scale of work as much as possible.
High speed may be required to reduce sample application time, particularly if
proteolysis or other destructive effects occur. The characteristics of the feed and
the anticipated final scale of work will form the basis for the balance between
capacity and speed in a capture situation (Fig. 63).
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Fig. 63. In a typical capture situation the strategic planning will

focus on capacity and speed. If
scale of work is the main problem, binding capacity will have
higher priority than speed, i.e. it
will be more important to utilize
the total binding capacity of the
bed than to apply very high flow
rates during sample application.
If time is the main problem,
speed will have higher priority
than binding capacity, i.e. it will
be more important to apply
high flow rates, even if this
means that a somewhat larger
bed volume is needed for processing of a specific amount of feed.
In capture, an important factor impacting capacity is the selectivity during sample

adsorption. Typically binding conditions are selected to avoid binding contaminating substances so that more binding sites are available for the protein of interest.
This also allows stepwise elution of the product in concentrated form.
Recovery is another parameter that will be of great concern in any preparative
situation, especially for production of a high value product. Recovery generally
becomes more important further downstream because of the increased value of
the purified product. Recovery is influenced by destructive processes in the sample
and unfavourable conditions on the column.
Resolution of similar components is not of greatest concern in a typical capture
situation. However, there is usually significant resolution and purification from
molecules with gross physicochemical difference from the product.
In principle, a capture step is designed to maximize capacity and/or speed at the
expense of some resolution. The separation from impurities is usually achieved
during binding of the product which can simply be eluted, in concentrated form,
by a step.
110
Intermediate purification
In intermediate purification steps, achieving resolution of similar components will
be more and more important further downstream. Capacity will still be important
to maintain productivity, i.e. amount of product produced per volume of chromatography media and time unit.
As in a capture step, selectivity during sample adsorption will be important, not
only to achieve high binding capacity, but also to contribute to the purification by
achieving a degree of separation already during sample application. However, in
contrast to a capture step, selectivity during sample desorption from the column
becomes important as we go downstream. This is usually achieved by applying a
more selective desorption principle, such as a continuos gradient or a multi-step
elution procedure.
Hence, the delicate problem in an intermediate purification step will be to decide
on the optional balance between capacity and resolution (see Fig. 64). Speed will
usually be less critical in a typical intermediate purification step due to the fact
that impurities causing proteolysis and other destructive effects should have been
removed in the capture step and also due to the fact that sample volume has been
reduced at this stage.
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Fig. 64. In a typical intermediate

purification situation the strategic
planning will focus on resolution
and capacity. The requirements
for resolution must be defined in
context with the nature of the feed
and the purity requirements in the
final product. Capacity must also
be considered to ensure a high
productivity. The optimal balance
must be defined which then will
decide how selectivity parameters
should be optimized during sample application to achieve the
requirements for resolution (purification) and capacity in the
system.
Polishing
In a polishing step the prime issue will be resolution, since this is the last chance to
reach the required quality of the product by removal of trace contaminants such
as host proteins, structural variants of product, reagents, leachables, endotoxins,
nucleic acids and viruses.
111
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Fig. 65. In a typical polishing situation the strategic planning will

focus almost entirely on resolution.
However, since more expensive,
high resolution media will be used,
it will also be important to verify
that the high resolution achieved
during the scouting experiments at
laboratory scale can be maintained
also when preparative loadings are
applied in the final production
scale.
Selectivity during sample desorption from the column will be very important and
can be maximized by working on the shape and slope of a continuos gradient elution technique. The resolution required may not be achieved by working on the
selectivity alone, but high efficiency media with small bead size usually have to be
used in a typical polishing situation (see Fig. 65).
Selection of chromatography media

When chromatography media are to be selected for use in an industrial process
there are a number of important selection criteria to take into consideration to
assure a safe and smooth transfer from research phase to routine production.
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Fig. 66. Pre-selection of separation media.
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The number of separation media on the market is quite enormous and it will not
be possible to include all different alternatives in the initial media screening. The
number of media have to be reduced to cut down time and effort spent on the
method scouting phase of process development. Only those media supporting the
issues of scaleability and suitability for the different stages in a process, listed inside the filter in Figure 66, should be considered for testing.
Base matrix properties and derivitization chemistry

Base matrix properties and derivitization chemistry govern the chemical and physical stability of the chromatography media and are very closely related to the scaleability of the complete process. The design in of scaleability by selection of suitable media will assure that the media can be packed in large scale columns without
change in performance and flow/pressure characteristics and that efficient maintenance procedures can be applied to secure a long media life time. The possibility of
any toxic substances leaking from the media into the product stream is also closely
related to the properties of the base matrix and the chemistry used for coupling
spacers and ligands to the matrix.
Bead size
The particle size and the range of particle size distribution may also have an
impact on scaleability in the sense that particle size is closely related to the backpressure generated in the column during a chromatographic run. The optimal
bead size in any particular chromatographic step will depend on the characteristics of the feed and the degree of purification required in this step. In a final polishing step, for instance, there will be a need for smaller beads, i.e. high efficiency, to
accomplish separation of closely related compounds. In such a step, media with a
narrow particle size distribution will help to give a lower back-pressure at a given
bed height and flow rate compared to media with a wider particle size
distribution.
Documentation and technical support

Comprehensive documentation is required for chromatography media to be used
in industrial processes, to facilitate the work with setting up and validating the
complete process. Chromatography media used in production processes are treated as raw materials. As with any type of raw material, acceptance criteria have to
be established and every new batch of media has to be subjected to tests before it
can be brought into production.
Regulatory support
Information on possible extractable compounds and what kind of methods to use
to quantify these compounds should be provided by the vendor. Leakage data on
the most relevant extractable compounds should be available.
113
Vendor certification
Vendor certification programmes should be initiated for all vendors of critical
chemicals or materials and should certainly include the chromatography media
supplier. Such programmes should be implemented to assure a long term, reliable
supply of chromatography media of high quality and consistency.
Delivery capacity
The delivery capacity of the vendor is an important issue during the vendor certification phase to secure timely deliveries of large quantities of media when the purification process is scaled up. The largest batch size that the vendor can provide
should be discussed and put in relation to the column size that will be used in the
final production scale. The stock situation and lead times should be discussed to
estimate the consequences for continuity in production in case of an urgent need
for a new batch of media.
Long-term contracts, based on forecasts provided by the user, should be discussed
to secure future timely deliveries. Long-term delivery guarantees should also be
discussed to assure that the same quality of chromatography media can be delivered during the entire life cycle of the product to be purified.
Method design and optimization

The main purpose of optimising a chromatographic step is to reach the pre-defined purity level with highest possible product recovery by choosing the most suitable combination of the critical chromatographic parameters. In process chromatography, in contrast to analytical or small scale preparative chromatography, this
also has to be accomplished as quickly, cheaply and easily as possible. The method
must be designed carefully to be robust despite variations in feed stock and other
conditions in the production hall.
The following sections will give some guidelines for optimising the critical operational parameters which affect the maximum utilization of an ion exchange chromatography step to be used in a production process.
Binding conditions
Selectivity during adsorption to an ion exchanger is optimized by careful selection
of pH and ionic strength of the start buffer. A pH far away from the isoelectric
point of the molecule of interest will give stronger binding and increased capacity
but may also have a negative impact on selectivity due to increased binding of contaminating molecules. If retention of the molecule of interest is low at selected
start conditions, due to the pH being very close to the isoelectric point, it will start
to elute from the column during sample application (isocratic elution) when the
sample volume is increased in a preparative situation. The choice of optimal pH
114
will always be a balance between selectivity and capacity which in turn depends
on the purpose and strategic focus of any particular chromatographic step.
The buffer system should be selected to give maximum buffering power at the
least possible ionic strength to ensure high binding capacity of the molecule of
interest. To achieve this, the pKa of the buffer should ideally not be more than
0.5 pH units away from the pH being used. Generally, 10 mM of a buffer is the
minimum desirable level. Ideally, one of the buffering species should also be
uncharged, and so not contribute to the ionic strength. In large scale applications,
economic considerations often limit the choice to acetate, citrate, phosphate, or
other inexpensive components.
The pH and conductivity in the binding buffer can sometimes cause aggregation/
precipitation in the sample when it has been equilibrated to start conditions. If
aggregates are formed they may be excluded by the beads and lost in the flow
through fraction with loss of recovery as a consequence. The extent of aggregates/precipitate formation depends on the pre-column residence time, after sample
has been transferred to start conditions. This problem is often recognized as a
scale-up problem since the pre-column residence time may increase considerably
upon scale up.
Elution
Elution from ion exchangers is usually accomplished by applying a continuos or
stepwise increase of the ionic strength of the eluting buffer, thereby weakening the
electrostatic interaction between the bound molecule and the adsorbent.
Depending on the purpose and strategic focus, as previously outlined, different
desorption principles can be applied to achieve the objectives of any particular
chromatographic step in the most optimal way.
Stepwise elution
Gradient elution
Isocratic elution
Stepwise elution is often preferred in large scale applications since it is technically
more simple than elution with continuos gradients. Stepwise elution will also
decrease buffer consumption, shorten cycle times and allow the molecule of interest to be eluted in a more concentrated form.
Single-step elution and two-step elution can be characterized as being a group
separation technique. This type of elution is usually applied in initial chromatographic steps (capture) where the purpose is to remove bulk impurities and substances differing greatly from the product. In a large scale initial chromatographic
step, using a crude feed material, media with a large bead size are favoured to
avoid problems with high back-pressure and reduced media life time due to high
viscosity and severe fouling during sample application. In such an application it
will be very difficult, unless the selectivity is extremely high, to resolve closely rela-
115
ted contaminants from the molecule of interest, even when applying very shallow
gradients. The strategy will be to resolve the group of substances that the molecule of interest belongs to from group(s) containing the contaminating substances. This can most conveniently be achieved by eluting one group at a time by
applying one or several steps with increasing eluting strength.
In later purification steps however, applying feed material that has been partly
purified and using chromatography media with higher resolving power, it will be
easier to resolve closely related substances by applying multi-step or gradient elution techniques. Resolution is maximized by working on the shape or slope of a
gradient or the eluting strength of different steps in a multi-step procedure. Such
eluting techniques can be characterized as being fine separation techniques as
opposed to the group separation refered to above.
In final purification steps (polishing), where the main focus will be to reach the
predefined purity of the molecule of interest, resolution is maximized by applying
shallow gradients or even isocratic elution using high resolution media with small
bead size.
When stepwise elution is applied, one has to keep in mind the danger of getting
artefact peaks when a subsequent step is administered too early after a tailing
peak. For this reason it is recommended to use continuos gradients in the initial
experiments to characterize the sample and its chromatographic behaviour.
Elution by pH gradients is not generally applied. This is because, changing the pH
by applying a pH gradient is frustrated by the buffering power of the molecules
adsorbed on the column and, in case of weak ion exchangers, the buffering of the
adsorbent groups themselves. For stepwise applications, pH elution can be quite
successful. The pH change will be delayed compared with the new buffer front
because of these titrations, but eventually the bound molecule is desorbed, coincident with a rapid pH change.
Sample load
When the selectivity parameters have been defined to achieve the most optimal
balance between resolution, capacity, speed and recovery, in ion exchange chromatography, as for most other adsorption techniques, there are then basically two
alternative routes to follow for optimization of sample load and flow rate to achieve highest possible productivity in the system.
I. In a typical capture situation the sample will be applied to the column, nonbound substances will be washed out from the column and the compound of interest will be eluted from the column with a simple step elution procedure. The difference in eluting strength, between the different steps will usually be large, i.e. it
will be possible to elute one group of compounds while the others are still retained
on the column. In this mode, the entire bed volume can be utilized for sample bin-
116
ding and the prime consideration when optimising for highest possible productivity is to define the highest possible sample load over the shortest possible sample
application time with acceptable loss in yield.
The dynamic binding capacity for the protein of interest should be determined by
frontal analysis, i.e. by continuously applying sample on the column up to the
point where the compound of interest starts leaking off at the column outlet.
PAGE, ELISA or other appropriate techniques are used for the determination of
the break-through profile of the compound of interest.
II. In many intermediate purification steps, and always in a polishing step, the
requirements for resolution will set the limit for the amount of sample that can be
applied to the column. Sample is mainly bound in the upper part of the bed since
there will be a need for a certain bed height to achieve separation between closely
related substances moving down the column with different velocities in a shallow
gradient of elution buffer.
Maximum sample loading is defined by running a series of experiments with gradually increased sample load. Optimal conditions will be the maximum sample
load that provides a resolution still high enough to meet the pre-defined purity
requirements.
Flow rate
The maximum flow rate that can be applied in any particular ion exchange chromatography step will differ between different parts of the chromatographic cycle.
Since low molecular weight substances show high diffusion rates, i.e. are transported rapidly between the mobile phase and stationary phase, the flow rate during
equilibration, washing and regeneration procedures is limited primarily by the
rigidity of the chromatography media and by system constraints regarding pressure specification. Larger molecules, i.e. the substances to be separated during the
chromatographic run, show a lower diffusion rate which will limit the flow rate
that can be applied during sample adsorption and desorption.
In a typical capture situation, the flow rate during sample application has to be
controlled so that the residence time in the column allows for a complete binding
without leakage in the flow through fraction. Maximum flow rate is defined by
running the frontal analysis test (break-through) refered to above at a number of
different flow rates. Optimal conditions will depend on the requirements for speed
and capacity in the system. If speed, i.e. sample application time, is critical due to
proteolysis or other detrimental effects in the feed material, a higher flow rate may
have to be used on the expense of the binding capacity in terms of amount of sample that can be applied per volume of media. If speed is not a big issue, binding
capacity can be increased on the expense of flow rate which will reduce the scale
of work in the final production process. Occasionally, high back-pressure, due to
117
the viscosity and crude nature of the feed, may set the limit for maximum flow
rate during sample application.
During elution, the flow rate will affect resolution between compounds to be
separated and also the concentration of these compounds in the product pool.
When there is a need for high concentration in the product pool, a lower flow rate
may have to be applied to minimise the volume (dilution) of the eluted
product/fractions. This is particularly important in a step preceding a gel filtration
step, where the sample volume is limiting for loading capacity.
Selecting a column
When a chromatographic step is being developed to be a part of a manufacturing
process and the time has come for scaling up, the next crucial step in ensuring a
reliable product quality and maximum production economy is the decision about
which column to use. Information on large scale columns from Pharmacia Biotech
is available upon request. Different demands are put on a column for production
compared with one used for the initial laboratory scale and scale-up experiments.
Flexibility, which is needed in laboratory scale and scale-up is achieved by using a
column with a movable adaptor. In production, consistency in performance and
safety of the end product are the main concerns. Here the column packing has to
be reproducible, materials of construction have to be well characterized for leakage and the design mechanically stable.
A number of criteria have to be considered. These criteria are more dependent on
the scale of operation than on the media and are thus very similar in their importance for ion exchange, hydrophobic interaction, gel filtration and affinity chromatography. Their ranking and importance change when moving through a chromatographic process is shown in Figure 67.
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Fig. 67. In the initial

capturing, handling
large volumes at high
flow rates is important.
When moving towards
the final steps, the
demand for low dead
volume columns and
systems to achieve high
resolution becomes
more and more important.
Aspects of column design

Flow distribution system
The most important factor in process column construction is to design the flow
distribution system to give as even a flow distribution as possible at the column
inlet and outlet. The aim is to retain HETP values of the same order as in the laboratory column. This is usually achieved by a construction where the radial backpressure is negligible compared to the axial back-pressure at the column inlet, see
Figure 68. The simplest method is to place a coarse mesh net between the column
end piece and the finer mesh net retaining the bed, to create channels for radial
distribution. This may be combined with multiple inlet/outlet ports depending on
column diameter. Depth filters are more easily clogged due to the relatively large
filter surface. This may be a severe disadvantage in continuous operation.
Column inlet
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Column lid
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Packed bed
Fig. 68. Radial and axial backpressure in a column distribution

system.
Material resistance and durability

Wetted components must be constructed from materials with high chemical resistance against the harsh chemicals which are frequently used for cleaning-in-place
(CIP) and sanitization procedures such as 1 M NaOH, salts, acids, etc.
Stainless steel of high grades is most commonly used for very large columns.
However, stainless steel does not always have sufficient corrosion resistance when
high salt concentrations in acidic solution are used. In this case fluoroplastic coated stainless steel is recommended. Materials should be chosen to minimize leakage and be tested for toxicity.
Sanitary design
Effective cleaning and sanitizing of packed columns depends on the total column
design, including the absence of threaded fittings and the smoothness of wetted
surfaces. It is important to minimize dead volumes in the column to hinder bacterial attachment and facilitate cleaning. Columns constructed from calibrated
borosilicate glass allow the use of thin O-rings in the adaptor and end piece and
119
give minimum dead volumes. Borosilicate also has a smooth and durable surface
which facilitates cleaning. Plastic columns are usually less expensive but most
plastics do not meet pharmaceutical industry demands for chemical resistance,
hygienic design and in-line cleaning. They may however be well suited for scale-up
experiments.
Pressure vessel safety

Large scale columns should be regarded as pressure vessels even if the actual working pressures usually are kept low. Large volumes of organic solvents may be
handled during cleaning which calls for explosion proof equipment. The column
design has to meet local regulations to be approved.
Regulatory support
Regulatory support for process scale columns should be available from the
column supplier to provide information on materials necessary for registration of
the process including chemical stability, toxicological tests, physical data and
column construction.
Ergonomics
For easy handling of process columns it is important that they are constructed in a
stable way and are easy to pack and clean. Large columns should preferably have
lockable wheels.
In laboratory columns, the bed height can easily be adjusted using moveable adaptors. In large columns, adaptors may be impractical and too heavy to handle.
Therefore, columns with fixed end pieces are selected in many applications.
Valves should be easy to reach and remove when the column is taken apart.
Packing large scale columns

Column configuration
Process columns with a moveable adaptor are essentially packed in the same way
as laboratory columns with adaptors. In essence, this means that the gel slurry is
compressed by a flowing liquid until the bed height has stabilized, at which point
the flow is stopped and the adaptor is lowered onto the gel surface and secured in
place.
Large scale columns are, however, frequently supplied with fixed end pieces. This
calls for a different packing technique. An extension tube is fitted on top of the
column as a reservoir for the gel slurry. When the bed has been packed and settled
at the join between the extension tube and the column, the extension tube is removed and the top column lid is secured in place. With this method it is important to
120
calculate the exact amount of media that is required to get the appropriate bed
height.
Packing the column

Detailed packing instructions for ion exchange media in process columns will not
be given here. Please refer to the instructions supplied with respective media and
respective column.
Scale-up
When the IEX step has been optimized at laboratory scale, the method can be scaled-up. Provided that scaleability has been designed-in during the development
phase, scale-up to final production scale should be straightforward.
Design-in of scaleability has to do with how the chromatographic step has been
designed and optimized (robustness, simplicity, costs, capacity etc.) and the choice
of appropriate chromatography media (chemical stability, physical stability, bead
size, cost etc.).
Some general guidelines for scaling up are outlined in Table 23.
Table 23. Scale-up guidelines.
Maintain
Increase
Check system factors
Bed height
Column diameter
Distribution system
Linear flow rate
Volumetric flow rate
Wall effects
Sample concentration
Gradient volume/bed volume
Sample load
Extra column zone

spreading
Increasing the bed volume by increasing the column diameter and increasing volumetric flow and sample load accordingly, will ensure the same cycle time as in the
laboratory scale method development. The column bed height, linear flow rate,
sample concentration and ratio of sample to gel, all optimized at laboratory scale,
will be kept the same. If a gradient is used for elution, the ratio of gradient volume
to bed volume will remain constant and, therefore, the time required for the gradient to develop and the effect on resolution, will remain the same on the larger
column. The same principle is applied for the volume of each step in a step elution
procedure.
Different system factors may affect performance after scale-up. If the large scale
column has a less efficient flow distribution system, or the large scale system introduces large dead volumes, peak broadening may occur. This will cause extra dilution of the product fraction or even loss of resolution if the application is sensitive
to variations in efficiency (plate number) in the system used.
121
scaling up to a larger diameter column means that most of the bed support generated by the friction against the column wall is lost. This can give increased bed
compression and poorer flow/pressure characteristics.
If all the above aspects are taken into consideration, chromatographic variability
is normally not a major issue when scaling up.
Non-chromatographic factors may have a more significant effect on performance
during scaling up. These factors include: changes in sample composition and concentration that often occur as the fermentation scale increases, precipitation in the
feed stock due to longer holding times when large volumes are handled, nonreproducibility of the buffer quality due to inadequate equipment for consistently
preparing large quantities of buffer solutions, and microbial growth in feed-stock
or buffers due to increased handling and longer holding times.
Figure 69 shows a 700-fold scale up of a model protein separation on SOURCE
30S going from a 2.2 ml column to a 1.57 liter column in one step.
122
Column:
Sample:
Sample load:
Eluent A:
Eluent B:
Flow rate:
Gradient:
System:
SOURCE 30S, a) 7.5 mm i.d. x 50 mm (2.2 ml)

b) 200 mm i.d. x 50 mm (1.57 l)
Mixture of chymotrypsinogen, cytochrome C and lysozyme
0.32 mg/ml bed volume
20 mM sodium phosphate + 0.5 M NaCl, pH 6.8
300 cm/h ; a) 2.2 ml/min b) 1.57 l/min
0-100% B; 20 column volumes
a) FPLC System
b) BioProcess Engineering System
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litre production scale FineLINE 200 column. (Work by Pharmacia
123
12. Applications
Ion exchange has proven to be one of the major methods of fractionation of labile
biological substances. From the introduction of the technique in the 1960s to the
development of modern high performance media, ion exchange chromatography
has played a major role in the separation and purification of biomolecules and
contributed significantly to our understanding of biological processes. The examples given in the following section have been drawn from the published literature
as well as from work in our own laboratories.
For detailed information on specific subjects the reader is referred to the original
work.
The design of a biochemical separation

Ion exchange chromatography, in common with other separation techniques in
the life sciences, is rarely sufficient as the sole purification stage in the separation
or analysis of complex biological samples. Ion exchange is frequently combined
with other techniques which separate according to other parameters such as size
(gel filtration), hydrophobicity (hydrophobic interaction chromatography or
RPC) or biological activity (affinity chromatography).
Popularity of fractionation techniques
90
80
Homogenization
70
60
50
Precipitation
40
GF
IEX
AC
30
20
10
5
6
7
Stage in purification scheme
Fig. 70. Frequency of use

of fractionation techniques (1). (Reproduced by
kind permission of the
authors and publisher.)
Not only is the choice of techniques important. The order in which they are
employed will also play a role in determining the speed, the convenience and the
overall yield for the purification.
124
Sample loading, sample dilution and impurity contamination are usually maximal
at the beginning of a separation scheme. At this stage the high capacity, high selectivity and concentrating effect of ion exchange makes the technique ideal.
This suitability is reflected in Figure 70 which shows the frequency of use of different fractionation techniques in published protein purification schemes (1).
The use of multi-dimensional chromatography with ion exchange as a first step is
well illustrated by the separation of monoclonal IgG2b from cell culture medium
(Fig. 71). An initial purification and concentration of the antibody from 500 ml
cell culture medium by cation exchange chromatography on SP Sepharose High
Performance was followed by a second fractionation by gel filtration using
Superdex 200 prep grade.
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Marker proteins HMW kit

Starting material (crude cell culture medium)
Pooled material after cation exchange chromatography
Pooled material after gel filtration
Native electrophoresis using PhastSystem with PhastGel 8-25 and

silver staining
Fig. 71. Purification of rat monoclonal IgG2b from cell culture supernatant. (Work by
Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.
The sample composition with regards to ionic strength and pH should be taken
into consideration when designing the separation scheme. In ion exchange chro125
matography solutes bind to the gel at low ionic strength and are eluted from the
column at a higher ionic strength. The converse situation occurs in hydrophobic
interaction chromatography. Thus if these two techniques are to be used in a separation scheme it is logical to have them adjacent to each other. This principle is
illustrated in Figure 72 which shows the purification of human a2-macroglobulin
from Cohn Fraction III.
After initial purification by affinity chromatography on Blue Sepharose CL-6B to
remove albumin, the sample was applied to a Q Sepharose High Performance
column and eluted with an increasing salt concentration gradient. Relevant fractions were then pooled and a2-macroglobulin was purified to homogeneity by
hydrophobic interaction chromatography on a Phenyl Sepharose High
Performance column.
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Lane M: Marker proteins HMW-kit

Lane 1: Cohn fraction III, 5% in 20 mM bis-Tris propane and 35 mM
sodium sulphate
Lane 2: Flow-through fraction from Blue Sepharose CL-6B.
6.5 mg protein.
Lane 3: Pooled fractions from Q Sepharose High Performance.
2.4 mg protein.
Lane 4: Purified a2-M from Phenyl Sepharose High Performance.
80 g protein.
Lane 5: 3 incubated 2 hours with 200 mM methylamine, pH 8.0
Native PAGE using PhastSystem with PhastGel 4-15 and silver staining.
Fig. 72. Purification of human a2-macroglobulin. (Work by Pharmacia Biotech,

Uppsala, Sweden.)
126
Towards the end of a separation scheme the complexity and the volume of sample
to be handled is smaller, but in most cases the need for higher resolution is increased. Ion exchange chromatography, particularly with MonoBeads, SOURCE, or
Sepharose High Performance media can also be used at this stage (Fig. 73).
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Application examples
Ion exchange chromatography has been used successfully to separate all classes of
charged biological molecules. The following are some representative examples.
Enzymes
In the purification of biologically active proteins such as enzymes the recovery of
biological activity is usually as important as the recovery of protein mass or degree
of homogeneity. Ion exchange chromatography has played a role in the purification of thousands of enzymes, and using modern matrices with optimized separation conditions gives extremely high recoveries. This is exemplified by the separation of enzymes from chicken breast muscle on Mono Q (Fig. 74). The recovery of
creatine kinase in this separation was 89%.
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Isoenzymes
Normally the isoforms of an enzyme have approximately the same molecular
weight. This makes their separation impossible by gel filtration. However, the
small differences in charge properties resulting from altered amino acid composition enable the separation of isoenzymes using ion exchange chromatography.
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128
N-Acetyl b-D-glucosaminidases have been

widely investigated in the diagnosis of haematological malignancies. In the case of
common acute lymphoblastic leukaemia,
an isoenzyme, referred to as Intermediate
1 Form has been reported (29). Using high
resolution ion exchange chromatography
(Fig. 75) this previously single peak has
been resolved into a number of component
isoenzymes which had previously only been
detectable using isoelectric focusing.
Fig. 75. Separation of Leukaemic cell N-Acetyl

b-D-glucosaminidase isoenzymes by anion
exchange chromatography on Mono Q. NA-Glu
activities associated with distinct peaks (Ia-IXa)
are indicated in relation to the NaCl gradients
(29). (Reproduced by kind permission of the
authors and publisher.)
Immunoglobulins
Ion exchange is frequently used for the purification of immunoglobulins. Figure
71 shows the purification of rat monoclonal IgG2b from cell culture supernatant.
As illustrated in Figure 76 the technique can also be applied to the purification of
monoclonal immunoglobulin from ascites fluid.
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Nucleic acid separation

Nucleic acids, being charged molecules, can also be fractionated and purified
using ion exchange chromatography. A recent application of the technique in this
area is the purification of plasmids from bacterial cultures. This process is traditionally done by centrifugation using CsCl gradients. Figure 77 shows the separation
of plasmid HB101 (pBR322) by anion exchange chromatography on Q Sepharose
High Performance. Subsequent analysis showed the electrophoretic purity of the
plasmid to be equivalent to that obtained by centrifugation, as was its behaviour
in ligation and transformation assays. The time, however, required for the preparation was 1 hour using the chromatographic method and approximately 8 hours
using centrifugation.
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Lane 1: Crude alkaline lysate of HB 101 (pBR322)

Lane 2: Fraction 1-20 (hydrolyzed RNA)
Lane 3: OC-peak (chromosomal DNA)
Lane 4: CCC-peak (supercoiled DNA)
Lane 5: pBR 322 purified by CsCl gradients
Electrophoresis in horizontal 0.8 % agarose gels (GNA-100).
DNA was vizualized by ethidiumbromide staining and
illumination with UV light.
Fig. 77. Ion exchange purification of plasmid DNA. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala,
Sweden.)
Polypeptides and polynucleotides

Ion exchange chromatography is not limited in its application to macromolecules
such as proteins and nucleic acids. The technique can be used in the separation
ofpeptides as illustrated by the separation of cyanogen bromide fragments of collagen (Fig. 78).
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130
In peptide mapping applications ion exchange chromatography can be used

advantageously as a complement to reverse phase chromatography since both
offer high resolution but separate according to different parameters (30).
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Fig. 79. Ion exchange separation of DNA restriction fragments form pBR322 cleaved by
HaeIII (31). (Reproduced by kind permission of the authors and publishers.)
Analogously, ion exchange can be used to separate oligonucleotides such as

restriction fragments of DNA (31) (Fig. 79) and even individual nucleotides (32,
33, 34) (Fig. 80).
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Fig. 80. Ion exchange separation of nucleotides. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala,
Sweden.)
131
Antisense phosphorothioate oligonucleotides

Phosphorothioate analogs of DNA have been identified as promising candidates
for oligonucleotide therapy, a major advantage being their in-vivo resistance to
degradation by nucleases.
Technology for automated gram-scale synthesis of phosphorothioate DNA oligomers has developed rapidly in recent years. In contrast, the large scale purification
technology for therapeutic or diagnostic oligonucleotides has received little attention, and has largely been based on scaling up methods suitable for analysis or
research.
In this application example, a novel method* for purifying synthetic phosphothioate oligonucleotides in large scale using SOURCE 30Q is shown. The method
includes adsorption of trityl-on oligonucleotide on SOURCE 30Q, washing with
10 mM NaOH and 2 M sodium chloride to remove non-tritylated failure sequences, on-column cleavage of the trityl groups using 0.4% trifluoroacetic acid, washing with 10 mM NaOH and eluting the oligonucleotide with a sodium chloride
gradient to further purify it from shorter sequences. After elution, SOURCE 30Q
is regenerated with 30% isopropanol in 2 M sodium chloride to wash away the
adsorbed trityl-groups.
A 25-mer phosphorothioate oligonucleotide produced on OligoPilot II DNA/RNA
Synthesizer was purified with this method. A 25% ammonia solution containing
the crude oligonucleotide mixture obtained after synthesis was applied directly
onto a 0.8 liter SOURCE 30Q column. The chromatogram from the gradient elution is shown in Figure 81. Analysis of the pool revealed a yield of 1.56 g product
with a purity of 97% as determined by capillary electrophoresis, see Fig 82. The
overall recovery was approximately 70%. The complete process (cleavage and
purification) took less then three hours.
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*patent pending
132
Fig. 81. Preparative purification of 25-mer phosphorothioate oligonucleotide on

SOURCE 30Q. (Work by
Pharmacia Biotech, Uppsala,
Sweden.)
Samples:
Capillary:
Buffer:
Running conditions:
Data collection:
All samples were desalted on NAP 10 Columns

a) Pool
b) Fraction 4
c) Fraction 10
PAGE (5% T, 5% C), capillary length: 40 cm (J&W Scientific, FISON)
Tri-borate and urea buffer (J&W Scientific, FISON)
8 kV, 10 s (sample) 16 kV, 30 min (run)
FPLCdirector
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Fig. 82. Capillary electrophoresis of the pool and side fractions from the preparative purification of 25-mer phosphorothioate oligonucleotide shown in Fig. 81. (Work by
Areas of application
In the preceding chapters the examples which have been used to illustrate the
principles and practice of ion exchange chromatography have mostly been based
on analytical and preparative applications from the research laboratory.
Ion exchange chromatography also has many important applications in the field
of industrial and pilot scale preparations. Many blood products such as albumin
and IgG (35) as well as the products of recombinant DNA technology, such as
growth factors and pharmaceutically important enzymes (Fig. 83), are purified
using this technique.
An example of a pilot scale purification of a recombinant protein using ion
exchange chromatography is given at the end of this chapter. For further information on the application of ion exchange chromatography at pilot and process scales the reader is advised to contact Pharmacia Biotech.
Analytical applications of ion exchange chromatography are to be found in diverse areas such as quality control of purified products or process monitoring in biotechnology. Figure 84 shows the use of cation exchange in monitoring a fermentation process for the production of -galactosidase.
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Fig. 84. Monitoring the production

of b-galactosidase (36).
Other areas of application include food research where FPLC ion exchange can be
used in the study of wheat varietals (Fig. 85) and in clinical research where ion
exchange chromatography has been used in studies such as the relationship between post-partum depression and b-endorphin secretion (Fig. 86) and the correlation of proteinuria with different renal conditions (Fig. 87).
A chromatogram of the urine from patients exhibiting tubular proteinuria, due to
acute pyelonephritis, severe burns or renal transplants, shows distinct peaks corresponding to b2-microglobulin, retinol binding protein and a1-acid glycoprotein.
The disappearance of these peaks could be correlated with the reversal of their
causal lesion (39).
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Fig. 85. Protein profiles of wheat varietal gliadins (37).

Absorbance,
) 280 nm MM (
Proportion of buf
fer B (
1 23
A
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
b-endorphin immunoreactivity
,
) pg/tube
1 23
Sample.
B
10 100
Column:
90
9
Flow rate:
Buffer
A.
80
8
70
7
Buffer B.
60
6
Gradient:
50
5
40
4
Detection:
Fraction size:
30
3
0.2
20
0.1
10
10 20
30 40 50 Fraction No.
10
20 30
2 ml plasma from pregnant

woman in labour
Mono S HR 5/5
1.2 ml/min
0.05 M NH4 Ac, pH 5.5,
20% acetonitrile
0.05 M NH4 Ac, pH 5.5,
20% acetonitrile
2 min 0% B,
0-100% in 17 min
280 nm and RIA
0.6 ml
40 50 Fraction No.
Cation exchange FPLC of a 2-ml plasma sample collected from a pregnant woman in labour
. A. The elution pattern (
) of
UV-absorbing material and the concentration of buf
fer B (---). B. Elution ofb-endorphin immunoreactivity: the position of
elution of referenceb-endorphin in (1). 125
[ ] b-endorphin (2) andb-lipotropin are shown by the vertical lines.
Fig. 86. Cation exchange of chromatography by plasma b-endorphin (38).
135
A280nm
b2 m
ALB
RBP
+
TSF
Sample:
Column:
Flow rate:
Buffer A:
Buffer B:
Gradient:
Detection:
0.5 ml desalted urine

Mono Q HR 5/5
2 ml/min
6.25 mM Bis-Tris propane, pH 7.5
BufferA + 0.35 M NaCl, pH 9.5
0-100% in 25 ml
280 nm, 0.05AUFS
AGP
+
a1m
10
20
30 Vol (ml)
Urine protein chromatogram from a renal-transplant patient, illustrating the

distinct peaks of the low MW proteins.
The retinal-binding proteins (RBP) is
contaminated with a small amount of transferrin (TSF).
b2m = b2 -microglobulin,AGP =a1-acid glycoprotein,a1m = a1 -microglobulin,
ALB = albumin. Diagonal line illustrates gradient from ferA
buf to buffer B.
Fig. 87. Anion

exchange of urine in
renal proteinuria
(39).
Purification of a recombinant
Pseudomonas aeruginosa exotoxin A, PE553D
This application shows a purification process for a genetically modified recombinant Pseudomonas aeruginosa exotoxin A (MW 55 000) expressed in the periplasm of E. coli. The process was developed for large scale production of modified toxin, conjugation to a polysaccharide and use as a vaccine. The purification
strategy used chromatography media differentiated to tackle the problems of capture, intermediate purification and polishing (for further information please refer
to Chapter 11.)
The result was a highly purified exotoxin A from crude cell homogenate using
only four chromatography steps, and taking less than half the time of a more conventional approach.
Exotoxin A was captured directly from unclarified E. coli homogenate by expanded bed adsorption using STREAMLINE DEAE adsorbent in a STREAMLINE
200 column (Fig. 88). The following intermediate purification step was hydrophobic interaction chromatography (HIC) on Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high
sub) packed in a BPG 200 column (Fig. 89). This step removed a substantial part
of the UV absorbing material (including nucleic acids) that could interfere with
the following steps. The second intermediate purification step on SOURCE 30Q,
packed in FineLINE 100 column, removed the majority of the remaining contaminants (Fig. 90). The polishing step was HIC on SOURCE 15PHE (Fig 91). The
process resulted in a pure protein, according to PAGE and RPC analysis (Fig 92
and 93), and the overall recovery was 51 % (Table 24).
136
Column:
Medium:
Sample:
Buffer A:
Buffer B:
Flow rate:
System:
STREAMLINE 200 (i.d. 200 mm)

STREAMLINE DEAE, 4.7 l
4.7 kg of cells were subjected to osmotic shock and suspended
in a final volume of 180 litres 50 mM Tris buffer, pH 7.4 before
application onto the expanded bed.
50 mM Tris buffer, pH 7.4
50 mM Tris, 0.5 M sodium chloride, pH 7.4
400 cm/h during sample application and wash
100 cm/during elution
BioProcess Modular
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Column:
Medium:
Sample:
A:
B:
C:
Flow rate:
Fig. 88. Capture by expanded bed adsorption on

STREAMLINE DEAE.
BPG 200/500 (i.d. 200 mm)

Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub), 4.7 L (150 mm bed height)
4.5 L of the previous pool were adjusted to 0.6 M ammonium
sulphate and applied onto the column
50 mM phosphate, 0.7 M ammonium sulphate, pH 7.4
20 mM phosphate, pH 7.4
Distilled water
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Fig. 89. Intermediate purification by hydrophobic interaction chromatography on

Phenyl Sepharose 6 Fast
Flow (high sub).
137
Column:
Medium:
Sample:
Buffer A:
Buffer B:
Gradient:
Flow rate:
FineLINE 100 (i.d. 100 mm)

SOURCE 30Q, 375 ml (50 mm bed height)
from the previous pool, diluted 1 to 3 with distilled water
1.5 l/cycle were applied
20 mM phosphate, pH 7.4
Buffer A + 1.0 sodium chloride
0 to 50% B, 20 column volumes
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Medium:
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Buffer A:
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Gradient:
Flow rate:
35 mm i.d.
SOURCE 15 HPE
from the previous step, adjusted to 1.0 M ammonium sulphate,
0.5 l/cycle was applied
1.0 M ammonium sulphate, 50 mM phosphate, pH 7.4
50 mM phosphate
0-45%B, 15 column volumes
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138
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Fig. 91. Polishing by hydrophobic interaction chromatography on SOURCE 15PHE.
a
Lane 1 LMW markers
Lane 2 pool from
SOURCE 15 PHE
Lane 3 pool from
SOURCE 30Q
Lane 4 pool from
Phenyl Sepharose 6
Fast Flow (high sub)
Lane 5 LMW markers
Lane 1 pool from Phenyl Sepharose 6

Lane 2 pool from SOURCE 30Q
Lane 3 pool from SOURCE 15PHE
Fig. 92. a) SDS-PAGE on PhastGel Gradient 8-25

b) Native PAGE on PhastGel Gradient 8-25
Table 24
Purification step
Volume, litre
Total protein, gram
Exotoxin A, gram*
Step recovery*
Bacterial extract
STREAMLINE
DEAE
Phenyl Sepharose 6
180
351
10.8
13.5
140
8.54
79
11.4
41
6.60
77
SOURCE 30Q
SOURCE 15PHE
30.2
12.2
12.6
n.d.
6.04
5.5
91
91
*Activity was determined with a radial immunodiffusuin assay using Goat anti-exotoxin A antibodies
(List, USA).
139
Column:
Sample:
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?@?@?
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@??@f?B@@e@?
3=C5e?/KC@@=C5?
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a)
Sample load:
A:
B:
Gradient:
Flow rate:
System:
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@??@e?@@@@@e@?
3=C5f?@V'=C5?
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RPC C2/C18, SC 2.1/10

a) pool from Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub)
b) Pool from SOURCE 30Q
c) Pool from SOURCE 15 PHE
50L
0.1% trifluoroacetic acid (TFA) in water
0.1% TFA in acetonitrile
25-75% B over 47 minutes
150 L/min
SMART System
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N1he?B@H
??
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Fig. 93. Reversed phase chromatography analysis of pools obtained after the purification
steps.
140
Strategy
The starting point for developing the purification strategy was experience from a
successful downstream process for purification of another modified Pseudomonas
aeruginosa exotoxin, LysPE38 (Fig. 94). Refinements included reducing the number of steps by the introduction of STREAMLINE DEAE for capture, and achieving high flow rates through the use of high performance SOURCE media for late
intermediate purification and polishing.
Fig. 94. Comparison of the two purification schemes.
141
This approach of using media designed for different stages in a downstream process speeded up process development and shortened the production schedule.
Comparison with the earlier process for purification of a similar exotoxin demonstrates the dramatic savings in time achieved.
Interestingly, the use of ion exchange at more than one stage is a common characteristic of large-scale processes. Note that the role and mode of use of the ion
exchanger is very different in the different stages. In the example shown, the
anion exchanger, STREAMLINE DEAE, is used for expanded bed adsorption of
the product from the crude, unfiltered E. coli lysate. STREAMLINE is optimised
to handle such crude feedstocks. Particles, the bulk of the impurities and much of
the water are removed in a group separation. Sample application conditions are
optimised to achieve maximum selectivity during capture of the product and the
stepwise elution conditions achieve maximum concentration during elution.
Later in the process, anion exchange is again used, but this time to remove proteins which have very similar characteristics to the product. This time SOURCE
30Q is used with gradient elution. The uniform, small diameter particles help to
achieve good resolution with excellent flow rates and low back-pressures. The
linear salt gradient further improves resolution. Note also that a different pH has
been chosen to increases the binding strength of the product and further improve
the resolution during elution.
In other examples ion exchange can be used repeatedly in the same process under
even more divergent conditions, in one step to bind only impurities and allow the
product to pass through and later to bind the product. Furthermore, anion and
cation exchange can be combined in the same scheme or pH and salt gradient elution can be alternated to achieve removal of different impurities. All of this is an
indication of why ion exchange is such a useful technique in industrial purification.
142
13. Fault finding chart

Problem
Cause
Column is clogged. Presence of lipoproteins

or protein aggregates.
No flow through
the column
Reduced or poor
flow through the
column.
Remedy
Prior to chromatography,
precipitate with 10%
Dextran Sulphate or 3%
polyvinylpyrrolidone.
Precipitation of proteins
in the column caused by
removal of stabilizing
agents during
fractionation.
Modify the eluent to

maintain stability.
Filter is clogged.
Replace the filter. Always

filter samples and buffer
before use.
Microbial growth
has occurred in the
column.
Microbial growth rarely

occurs in columns during
use, but steps should
always be taken to prevent
infection of packed
columns, buffers and gel
suspensions. Store gel in
the presence of 20%
ethanol or an antimicrobial
agent, see page 103.
Outlet closed.
Open outlet.
No flow from pump.
With peristaltic pumps

check the condition of the
tubings. Check for leaks at
all connections.
Clogged end-piece or
adaptor or tubing.
Remove and clean,

if possible.
Bed surface blocked

by precipitated
proteins.
Clean using recommended

methods.
143
Problem
Cause
Remedy
Reduced or poor
flow through the
column.
Bed compressed.
Repacking the column may

be necessary.*
Microbial growth.

occurs in columns during
use, but steps should
always be taken to prevent
infection of packed
suspensions. Store gel in
the presence of 20%
ethanol or an antimicrobial
agent, see page 103.
Fines.
Do not use a magnetic stirrer; it

can break the beads.
Back pressure
Turbid sample has been
increases during a applied to the column.
run or during
successive runs.
Improve sample solubility

by the addition of
monoethylene glycol,
detergents or organic
solvents.
Clogged column filter.
Prefilter buffers and

samples. Change filter.
Precipitation of protein
in the column filter and/
or at the top of the gel bed.
Clean the column and

exchange or clean the
filter.
Change pH and/or add urea.
Develop a procedure with detergents.
Additives which were used
for initial sample solubilization
should be included in the solutions used for chromatography.
* Does not apply for pre-packed MonoBeads, MiniBeads, RESOURCE, HiTrap, HiLoad and BioPilot
columns.
144
Problem
Cause
Remedy
Back-pressure
Precipitation of
increases during a lipoproteins at increased
run or during
ionic strength.
successive runs.
Lipoproteins may be
precipitated prior to
chromatography by the
addition of 10% dextran sulphate and1 M calcium chloride
to final concentrations of
0.2% and 0.5 M respectively.
The protein does

not elute in the
salt gradient.
Incorrect buffer pH.
Use a buffer pH closer

to the pI of the protein.
Ionic strength too low.
Use a more concentrated

limit buffer.
The protein does

not elute.
Solutions have wrong pH.
Calibrate your pH meter,

prepare new solutions and
try again.
Protein elutes in
the wash phase.
Ionic strength of start

buffer is too high.
Decrease ionic strength

of start buffer.
The ionic strength of the

sample is too high or the
pH is wrong.
Buffer exchange on sample.
The column is not

properly equilibrated.
Repeat or prolong the

equilibration step.
Ionic detergents or other

additives are adsorbed to
the column.
Clean the column.
The gradient slope

is too steep.
Use a shallower gradient

or a plateau in the gradient.
Microbial growth has

occurred in the column.
See above.
Flow rate is too high.
Run the separation at a

lower flow rate.
The resolution
obtained is less
than expected.
145
Problem
Cause
Remedy
The resolution
obtained is less
than expected.
Proteins or lipids have

precipitated on the
column.
Clean and regenerate the

column.
Improper filtration of
the sample before
application to the
column.
Regenerate the column,

filter the sample and repeat
the chromatography step.
Aggregate formation of
proteins in sample and
strong binding to gel.
Use urea or zwitterions,

betaine up to 10% or
taurine up to 4%.
Column is poorly packed.
Check the packing by running a

coloured compound and observing the band. Repack the
column if necessary.*
Too much sample mass

has been loaded onto
the column.
Decrease the sample load.
The column is dirty.

column.
Detector cell volume is

too big.
Change the flow cell.
Large mixing spaces in

or after column.
Reduce all post column

volumes.
Overloaded column.
Decrease the sample load

and repeat the run.
Leading or very
rounded peaks
observed in the
chromatogram.
columns.
146
Problem
Cause
Remedy
Leading or very
rounded peaks
observed in the
chromatogram.
Column is poorly packed.
Check the packing by

running a coloured
compound and observing
the band. Repack the
column if necessary.*
Column needs
regeneration.

column. If this does not help
replace with a new one.
Tailing of the peak Sample too viscous.

is observed in the
chromatogram.
Previous elution
profile cannot be
reproduced.
Previous elution
profile cannot be
reproduced.
Reduce the amount

of protein.
Precipitation of protein
in the column filter and/
or at the top of the gel bed.
Remove nucleic acids.

Clean the column and
exchange or clean the
filter.
Incorrect buffer pH
and ionic strength.
Prepare new solutions.
The sample has altered

during storage.
Prepare fresh sample.
Proteins or lipids have

precipitated on the
column.

column.
Sample has not been

filtered properly.
Regenerate the column,

filter the sample carefully
and repeat this step.
Incomplete equilibration.
Equlibrate until
conductivity is constant.
Aggregate formation of
proteins in sample and
strong binding to gel.
Use urea or zwitterions,

betaine up to 10% or
taurine up to 4%.
columns.
147
Problem
Cause
Remedy
Low recovery of
activity while
normal recovery
of protein.
Sample substance may

not be stable in the
elution buffers and is
therefore inactivated.
Determine the pH and

salt stability of the protein.
Enzyme separated from

co-factor or similar.
Test by pooling fractions

and repeating the assay.
Microbial growth.

occurs in columns during use,
but steps should always be taken
to prevent infection of packed
suspensions. Store gel in the presence of 20% ethanol or an antimicrobial agent, see page 103.
Protein amount in The protein may have

the eluted fractions been degraded by
is much less than proteases.
expected.
Adsorbtion to filter
during sample
preparation.
Use another type of

filter or use detergents.
Microbial growth has

occurred in the column.
Microbial growth rarely occurs

in columns during use, but steps
should always be taken to prevent infection of packed
columns, buffers and gel suspensions. Store gel in the presence
of 20% ethanol or an antimicrobial agent, see page 103.
Protein amount in Non-specific adsorption.

the eluted fractions
is much less than
expected.
148
Add protease inhibitors

to the buffers to prevent
proteolytic digestion.
Try adding ethylene glycol

(e.g. 10%) to the buffers to
prevent any hydrophobic
interactions.
Sample precipitates.
May be caused by removal

of salts or sample dilution.
Hydrophobic proteins.
Chaotropic salts may be

used for elution.
Problem
Cause
Remedy
More activity is
recovered than
was applied to
the column
Different assay
conditions have been
used before and after the
chromatographic step.
Use the same assay

conditions for all the assays
in your purification
scheme.
Removal of inhibitors
during separation.
Replace if necessary.
Wrong sensitivity range

on detector.
Adjust.
Sample absorbs poorly

at the chosen wavelength.
Use a different wavelength.
Recorder range
incorrectly set.
Adjust.
Excessive zone
broadening
Check the column packing

and re-pack if necessary.
Peaks too small.
Bubbles in the bed. Column packed or stored

at cool temperature and
then warmed up.
Eluent not properly

de-gassed.
Small bubbles can often be

removed by passing well
de-gassed buffer upwards
through the column. Column
may need to be re-packed. Take
special care if buffers are used
after storage in a fridge or coldroom. Do not allow column
to warm up due to sunshine
or heating system. A waterjacket is a good safeguard.
Use de-gassed buffers.
De-gas the eluent
thoroughly.
Cracks in the bed. Large air leak in column.
Check all connections for

leaks. Repack the column*.
Distorted bands as Air bubble at the top

sample runs into of the column or
the bed.
in the inlet adaptor.
Re-install the adaptor

taking care to avoid
air bubbles.
columns.
149
Problem
Cause
Remedy
Distorted bands
as sample runs
into the bed.
Particles in eluent or
sample.
Filter or centrifuge the

sample. Protect eluents
from dust.
Clogged or damaged net

in upper adaptor.
Dismantle the adaptor, clean

or replace the net. Keep particles
out of samples and eluents.
Distorted bands as Column poorly packed.

sample passes
down the bed.
Gel suspension too thick or

too thin. Bed packed at a
temperature different from
run. Bed insufficiently packed
(too low packing pressure, too
short equilibration). Column
packed at too high pressure.
Negative peaks at Refractive index effects.

solvent front.
Buffer exchange the sample

to start buffer.
Strange peaks in
chromatogram.
Buffer impurities.
Clean the buffer by running it

through precolumn. Use high
quality reagents.
Peaks on blank
gradients.
Incomplete elution.
Wash the column according

to recommended method.
Spikes in
chromatogram.
Air bubble trapped

in UV cell.
Use de-gassed solutions.
UV baseline rises
with gradient.
Salt concentration,
micelle formation.
Work well below or above

the CMC or change the
gradient so that the increase in
UV absorption does not occur
while the samples are eluting.
Impurities in buffers.
Use high quality reagents.
150
14. Ordering information

Product
MonoBeads
Mono Q, PC 1.6/5
Mono Q HR 5/5
Mono Q HR 10/10
Mono Q HR 16/10
Mono Q 35/100
Mono Q 60/100
Mono S, PC 1.6/5
Mono S HR 5/5
Mono S HR 10/10
Mono S HR 16/10
Mono S 35/100
Mono S 60/100
Quantity/Pack Size
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Code No.
17-0671-01
17-0546-01
17-0556-01
17-0506-01
17-1001-01
17-1002-01
17-0672-01
17-0547-01
17-0557-01
17-0507-01
17-1021-01
17-1022-01
MiniBeads
Mini Q, PC 1.6/5
Mini S, PC 1.6/5
Precision Column Holder
1
1
1
17-0671-01
17-0671-01
17-1455-01
SOURCE Q
RESOURCE Q 1 ml
RESOURCE Q 6 ml
SOURCE 15Q
SOURCE 15Q
SOURCE 15Q
SOURCE 15Q
SOURCE 15Q
SOURCE 30Q
SOURCE 30Q
SOURCE 30Q
SOURCE 30Q
SOURCE 30Q
1
1
10 ml
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500 ml
1l
10 ml
50 ml
200 ml
500 ml
1l
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SOURCE S
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RESOURCE S 6 ml
SOURCE 15S
SOURCE 15S
SOURCE 15S
SOURCE 15S
SOURCE 15S
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SOURCE 30S
SOURCE 30S
SOURCE 30S
SOURCE 30S
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500 ml
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200 ml
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151
Product
Quantity/Pack Size
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5 x 5 ml
1
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1
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17-0719-10
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17-0719-60
Q Sepharose High Performance

HiTrap Q
HiTrap Q
HiLoad 16/10 Q Sepharose HP
HiLoad 26/10 Q Sepharose HP
BioPilot Column Q Sepharose HP 35/100
BioPilot Column Q Sepharose HP 60/100
SP Sepharose High Performance
HiTrap SP
HiTrap SP
HiLoad 16/10 SP Sepharose HP
HiLoad 26/10 SP Sepharose HP
BioPilot Column SP Sepharose HP 35/100
BioPilot Column SP Sepharose HP 60/100
Q Sepharose Fast Flow

HiLoad 16/10 Q Sepharose Fast Flow
HiLoad 26/10 Q Sepharose Fast Flow
SP Sepharose Fast Flow
HiLoad 16/10 SP Sepharose Fast Flow
HiLoad 26/10 SP Sepharose Fast Flow
DEAE Sepharose Fast Flow
CM Sepharose Fast Flow
152
Product
Quantity/Pack Size
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1l
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17-0989-05

1l
10 l
17-0657-03
17-0657-05
STREAMLINE DEAE
STREAMLINE DEAE
300 ml
7.5 l
17-0994-01
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STREAMLINE SP
STREAMLINE SP
300 ml
7.5 l
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500 ml
10 l
500 ml
10 l
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500 ml
10 l
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DEAE Sephadex A-25

DEAE Sephadex A-25
DEAE Sephadex A-25
DEAE Sephadex A-25
100 g
500 g
5 kg
40 kg
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DEAE Sephadex A-50

DEAE Sephadex A-50
DEAE Sephadex A-50
DEAE Sephadex A-50
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QAE Sephadex A-25

QAE Sephadex A-25
QAE Sephadex A-25
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QAE Sephadex A-50

QAE Sephadex A-50
QAE Sephadex A-50
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CM Sephadex C-25
CM Sephadex C-25
CM Sephadex C-25
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on request
Sepharose Big Beads
STREAMLINE
Sepharose CL-6B
CM Sepharose CL-6B
CM Sepharose CL-6B
Sephacel
DEAE Sephacel
DEAE Sephacel
Sephadex
153
Product
Quantity/Pack Size
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CM Sephadex C-50
CM Sephadex C-50
CM Sephadex C-50
100 g
500 g
5 kg
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SP Sephadex C-25
SP Sephadex C-25
SP Sephadex C-25
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on request
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SP Sephadex C-50
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100 g
500 g
5 kg
17-0240-01
17-0240-02
17-0240-03
154
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Chew, C.S., Brown, M.R.
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proteins. J.M. Curling, ed., Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden. (1983) 51-58.
Berglf, J.H., Eriksson, S., Suomela, H., Curling, J.M.
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and cerebrospinal fluid. Clin. Chem., 29 (1983) 1635-1640, Cooper, E.H. et al.
156
Before any part of this handbook is reproduced, please request permission of

Pharmacia Biotech. The following designations are trademarks owned by
Pharmacia AB: Sephadex, Sephacel, Sepharose, STREAMLINE, HiLoad, HiTrap,
MonoBeads, MiniBeads, SOURCE, RESOURCE, FPLC, FPLCdirector,
UNICORN, SMART, OligoPilot II, FineLine, BPG, BioPilot, BioProcess,
PhastSystem, PhastGel.
157
158
159

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Ion Exchange

Ion exchange chromatography .........................................................10

Product Guide .......................................................................................20

MonoBeads and MiniBeads ..............................................................23

Sepharose based ion exchangers .......................................................42

DEAE Sephacel .....................................................................................58

Sephadex ion exchangers ...................................................................61

Experimental design ............................................................................65

10. Experimental Technique.....................................................................80

Pre-packed ion exchange media ...............................................81

SOURCE and Sepharose Based ion exchangers......................102

11. Process considerations .....................................................................107

12. Applications ........................................................................................124

13. Fault-finding chart .............................................................................143

BioProcess Media are designed, manufactured and supported for

2. Ion exchange chromatography

Fig. 1. The principle of ion exchange chromatography (salt gradient elution).

Fig. 2. Ion exchanger types.

Quaternary aminoethyl (QAE)

Quaternary ammonium (Q)

Methyl sulphonate (S)

Resolution in ion exchange chromatography

The resolution (Rs) is determined from the chromatogram as shown in Figure 3.

Fig. 3. Determination of the resolution (Rs) between two peaks.

Fig. 4. Separation results with different resolutions.

where wh is the peak width

at half peak height

Good selectivity is a more important factor than high efficiency in determining

Fig. 6. The effect of selectivity and efficiency on resolution.

MonoBeads (page 23)

MiniBeads (page 30)

SOURCE (page 34)

Sepharose High Performance ion exchangers

Q and SP Sepharose High Performance are strong ion exchangers based on a 34

Sepharose Fast Flow ion exchangers (page 46)

Sepharose Fast Flow ion exchangers are based on 90 m highly cross-linked 6%

Sepharose Big Beads ion exchangers (page 50)

STREAMLINE ion exchangers (page 52)

STREAMLINE adsorbents, available as STREAMLINE DEAE and

DEAE Sepharose CL-6B and CM Sepharose CL-6B

DEAE Sephacel (page 58)

Sephadex ion exchangers (page 61)

4. MonoBeads and MiniBeads

Fig. 8. An electron micrograph of MonoBeads showing their distinct monodispersity.

The resolution which can be achieved on any chromatographic matrix is a result

Fig. 9. Separation of the peptide bacitracin on Mono S.

A summary of the characteristics of MonoBeads is shown in Table 2.

strong anion exchanger

strong cation exchanger

Total ionic capacity (moles/ml gel)

Thyroglobulin (MW 669 000)

HSA (MW 68 000)

a-lactalbumin (MW 14 300)

IgG (MW 150 000)

Ribonuclease (MW 13 700)

Typical protein recoveries (%)

Typical enzyme activity recoveries (%)

Average particle size (m)

Total protein binding capacity (mg/ml gel)

N.D. = Not determined

Column volume (ml)

N.D. = Not determined

Fig. 11. Reproducible separations on three Mono S HR 5/5 columns. (Work by