Controle Biolgico e Microbiolgico de Qualidade

de Medicamentos

Ensaios de pirognio in vivo e in vitro

Profa Giselle Fazzioni Passos

Pirognios
Substncias que induzem febre so chamadas pirognios. A
palavra pirognio relacionada palavra grega pyro, que
significa ardente ou fogo, uma descrio adequada para
substncias que produzem elevao da temperatura do
corpo.

Classificao dos Pirognios

Os pirognios so divididos em duas classes:
- Pirognios exgenos (originados fora do organismo)
Pirognios endgenos (produzidos pelo organismo em
- resposta
aos exgenos)

Embora a endotoxina (lipopolissacardeo) seja o mais

presente e importante pirognio exgeno, h outros de
constituio qumica diversa, que causam elevao de
temperatura quando injetados sob condies especficas.

Classes gerais de pirognios exgenos incluem bactria,

fungos e vrus, como tambm pirognios no microbianos,
por exemplo, alguns frmacos, esterides, e fraes do
plasma.

Exemplos de pirognios exgenos:

Produtos bacterianos, toxinas ou microorganismos inteiros.
Bactrias Gram- (vivas ou inativadas por calor)
Bactrias Gram+
Endotoxina - lipopolissacardeo (LPS) de Gram Toxinas bacterianas (enterotoxina de S. aureus)
Componentes de manana e glucana de fungos (C. albicans);
Componentes virais, como ds-RNA.

Endotoxina um lipopolissacardeo complexo que o principal componente da

membrana externa de gram negativos. Liberado pela bactria por multiplicao, 16
morte
ou lise (viva ou morta) . Ocupa a maior parte da superfcie da membrana externa.
LIPOPOLISSACARDEO
Cadeias laterais O-especficas
Polissacardeo
Lipdeo A
Fosfolipdeo
Protena
Lipoprotena
Peptdeoglicano
Espao periplsmico
Membrana interna
Citoplasma

FIGURA 1 Estrutura da parede celular de bactria Gram-negativa. (Fonte: Charles

River Laboratories)

LPS induo de resposta febril

Estimula centro termorregulador (hipotlamo)

Vasoconstrico perifrica, calor

Mecanismo da febre
Resposta febril mediada por molculas endgenas (pirognios
endgenos) que so liberadas por leuccitos a partir de estmulos de
pirognios exgenos.
PEs citocinas: TNF, IL-1, IL-6 e INFs. Atuam no SNC induzindo sntese de PG.

Vantagens do aumento da temperatura corporal

durante uma infeco:
Inibio do crescimento bacteriano;
Aumento da ao bactericida de neutrfilos e
macrfagos;
Sonolncia.

Controle de Qualidade x Niveis de

Pirognios
Os nveis de pirognio tornaram-se cruciais na liberao de produtos
farmacuticos.
Sob o ponto de vista de controle de qualidade, todos os injetveis,
bem como os acessrios para transfuso, infuso e todos os
dispositivos implantveis ou descartveis empregados em terapia
parenteral devem oferecer segurana ao paciente, sob o ponto de
vista de contaminantes pirognicos. Produtos injetveis de grande
volume e de pequeno volume, assim como produtos na forma de
aerossol, para uso respiratrio devem ser analisados.
O potencial de periculosidade maior quando se trata de injetvel de
uso exclusivo por via intravenosa. O risco ser ainda maior quando se
trata de produto com inoculao intratecal, em que a experincia
demonstrou ser a endotoxina 1000 vezes mais potente que na via
intravenosa (utilizar teste in vitro).

Controle de Qualidade x Niveis de Pirognios

Endotoxinas so complexos de alto peso molecular associados
membrana externa de bactrias Gram-negativas, sejam elas patognicas
ou no, e se constituem na mais significante fonte de pirognio para a
indstria farmacutica.
Apesar de a maior parte da endotoxina permanecer associada parede
celular at a desintegrao da bactria, quantidades nfimas de
endotoxinas so liberadas, na forma solvel, por culturas de bactrias
jovens ou tambm por bactrias Gram-negativas como E.coli, Salmonella,
Shigella, Pseudomonas, Neisseria, Haemophilus e outros agentes
patognicos, em crescimento.
Endotoxinas no purificadas podem conter lipdeos, carboidratos e
protenas. Como podem ser encontradas unidades no purificadas nas
fases em processo ou nos produtos farmacuticos terminados, prefere-se
utilizar a terminologia endotoxina. A denominao de lipopolissacardeo
(LPS) aplicada endotoxina purificada, para enfatizar a sua natureza
qumica.

Controle de Qualidade x Niveis de Pirognios

As endotoxinas so txicas maioria dos mamferos.
Estudos tm demonstrado que a injeo de bactrias
Gram-negativas vivas ou mortas, ou LPS purificado
causa uma srie de reaes:
febre
mudana na contagem de leuccitos (leucopenia seguida por
leucocitose)
coagulao intravascular disseminada
hipotenso
choque
morte
Por isso, de vital importncia aos pacientes a deteco e a
eliminao de pirognios em injetveis, equipos de transfuso,
infuso e todos os dispositivos implantveis ou de uso nico
empregados na terapia parenteral.

teste de segurana para os produtos injetveis, lquidos para infuso e perfuso,

Mtodos Oficiais - Ensaio de Pirognio

pelo Mtodo in vivo

materiais cirrgicos e descartveis em geral. (FIG. 2)[9]

FIGURA 2 Mtodo in vivo. (Fonte: Charles River Laboratories)

Objetivo: avaliar o risco de reaes febris no homem aps

administrao por via i.v.
Atividade
pirognica:
1.5.1
Histrico

capacidade de elevar a temperatura.

1-10ng/kg resposta pirognica febre

A maior parte da informao cientfica sobre pirognio foi adquirida nos

Pirognio in vivo
1 Mtodo (USPXII 1942)
3 coelhos adultos, sadios (M ou F) sistema
termorregulador semelhante ao humano
Peso mnimo 1,5 kg (equivalncia relacionada idade)
Termmetro clnico ou termoeltrico preciso 0,1oC
Temperatura 39,8oC
Reutilizao: 48h ou 2 semanas (se resultado for +)
Material: despirogenizado (30min 250oC ou 1h a 200oC)
Volume injeo 10mL/kg tempo mximo 4 min
Sesso de treino anterior ao ensaio

Teste de pirognio in vivo

Metodologia:
Imobilizar em gaiola de conteno 03 coelhos adultos
sadios;
Introduzir termmetro no reto de cada animal;
Registrar TC1 30 min e TC2 60 min aps introduo do
termmetro;
TC = (TC1+TC2)/2
Aps 30 min da obteno da TC, injeta-se a amostra
atravs da veia marginal da orelha do animal;
Aquecer amostra a 37 2oC antes da injeo;
Registrar a Tcorprea de cada animal, 1, 2 e 3 h aps a
administrao da amostra (ou registro contnuo);
Calcular diferena de temperatura de cada animal.

Ensaio de Pirognio pelo Mtodo in vivo

Ensaio aplicado aos produtos que podem ser tolerados pelo animal
em uma dose mxima de 10 mL por kg e envolve a medida do
aumento na temperatura em coelhos aps a injeo intravenosa
de uma soluo. So utilizados coelhos adultos e saudveis,
acomodados individualmente em uma rea com temperatura
uniforme entre 20 e 23 C e livre de distrbios que possam
excita-los.
Pelo critrio de interpretao atualmente empregado em pases
europeus, cada amostra deve ser avaliada em um grupo de trs
animais e quando a soma das elevaes trmicas individuais
mximas for inferior a 1,15 C a amostra ser aprovada e caso
seja superior a 2,65 C ser rejeitada. Quando o valor da
somatria estiver entre estes valores, a amostra ser injetada em
outros trs animais (mximo mais dois retestes = 12 coelhos
mx 6,6 C).

Ensaio de Pirognio pelo Mtodo in vivo

Pelo critrio adotado pela USP e FB, se nenhum coelho apresentar um
aumento individual de temperatura de 0,5 C ou mais, acima da
respectiva temperatura de controle, o produto atende aos requisitos
para ausncia de pirognio.
Se o aumento individual for 0,5 C ou mais, o ensaio deve ser
repetido em outros cinco coelhos. Se no mximo trs dos oito coelhos
mostrarem aumentos individuais de temperatura de 0,5 C ou mais,
e se a soma dos oito aumentos mximos individuais no exceder
3,3 C, o produto atende aos requisitos para ausncia de pirognio.
O ensaio de pirognio em coelhos, embora seja utilizado quando a
metodologia in vitro no aplicada, ainda mantido porque tem a
seu favor a situao do envolvimento de toda a reao fisiolgica do
animal, constituindo um teste de segurana para os produtos
injetveis, lquidos para infuso e perfuso, materiais cirrgicos e
descartveis em geral. DETECTA TODO O TIPO DE PIROGNIO

Teste de pirognio in vivo

Imunoterpicos: elevao permitida maior
Nos EUA: rejeio quando mais da metade dos animais
apresentar Tcrtica 0,6oC
No Brasil: Tcrtica 1,1oC (permitida para 1/3 dos animais) e
valor limite para DT (8) 5,5 oC, ao invs de 3,3 oC.
Avaliao dos resultados: os dados obtidos so
confrontados com a monografia adotada, possibilitando a
classificao final APIROGNICO, PIROGNICO ou
DUVIDOSO.

Teste de pirognio in vivo

Amostras:
Para controle de qualidade
Injetveis (de grande ou pequeno volume);
Material para infuso e transfuso;
Todos os dispositivos implantveis ou descartveis
empregados em terapia parenteral;
Limitaes do ensaio:
Produtos que contenham frmacos que atuem sobre os
sistema termorregulador;
Hipnticos, anestsicos, gluconato de clcio, esterides,
quimioterpicos, alguns antibiticos, radiofrmacos (provocam
natural na TC).

Teste de pirognio in vivo

Vantagens:
Possibilidade de deteco de outras substancias pirognicas alm
das endotoxinas
Segurana, envolve toda a reao fisiolgica do animal
(similar humana).
Desvantagens:
Teste-limite no permite determinao quantitativa;
Sensibilidade insuficiente de coelhos na deteco da presena de
endotoxinas (limite: 0,5 UE/ml) importante limitao para
produtos de uso intratecal;
Tolerncia endotoxina;
Nem todos os produtos farmacuticos podem ser avaliados neste
ensaio;
Estresse e/ou condies de sade;
Tempo;
Recursos humanos;
3 Rs.

Determinao de Endotoxinas Bacterianas pelo

Mtodo in vitro

Limulus polyphemus: lmulo ou caranguejo-ferradura, que

habita alguns locais na costa do Oceano Atlntico dos Estados
Unidos at o Golfo do Mxico.

Determinao de Endotoxinas Bacterianas pelo

Mtodo in vitro
Simples e amplamente utilizado.
O mtodo se baseia na reao entre os amebcitos e a
endotoxina, produzindo um gel opaco facilmente reconhecido.
Utiliza o reagente de LAL (lisado do amebcito do Limulus) que
um extrato aquoso dos amebcitos, que so as clulas
sanguneas da hemolinfa azul da espcie de caranguejo
ferradura Limulus polyphemus, composto de enzimas que
reagem em presena de pequenas quantidades de endotoxina
(reao concentrao-dependente).

Limulus Amebocyte Lysate Test - LAL

Mtodo laboratorial utilizado para deteco de endotoxinas
pirognicas e como uma alternativa ao teste de pirognios em
coelhos.
HISTRICO:
Infeco do L. polyphemus por Gram (-) resultava em coagulao
intravascular extensiva e morte (Bang, 1956);
Levin e Bang (1964) demonstraram que a coagulao extracelular da
hemolinfa do Limulus era causada por uma reao entre endotoxinas e
uma protena coagulativa em amebcitos circulantes na hemolinfa do
caranguejo;
Levin e cols. (1970) desenvolveram um ensaio sensvel para deteco de
endotoxinas em plasma humano utilizando o material lisado dos
amebcitos do Limulus;
Young, Levin e Prendergast (1993) isolaram, purificaram e descreveram
a protena coagulativa do LAL e provaram que a reao entre o lisado e
a endotoxina apresenta natureza enzimtica.

Determinao de Endotoxinas Bacterianas pelo Mtodo

in vitro
Teste de endotoxinas bacterianas LAL
(Lisado do amebcito do Limulus)
Endotoxina catalisa a ativao da pr-enzima no lisado (LAL). A coagulase
ativada hidrolisa ligaes especificas em uma protena coagulante
(coagulognio) tambm presente no LAL.

Endotoxina (LPS) + Ca2+

Derivado celulsico usado

raramente em injetveis
(1-3)-glucano

Fator C
ativado

Fator C

Fator B

Fator B
ativado

Fator G
ativado

Enzima
Procoagulante

Enzima
Coagulante

Coagulognio

Fator G

Coagulina
(Gel)

A formao de gel ocorre quando a enzima de coagulao dos amebcitos

ativada pela endotoxina, na presena de ctions divalentes, adicionada
protena coagulante (coagulognio)
Esquema 1 Representao da reao em cascata entre LAL e endotoxina.[2]

A reao entre o lisado de amebcito e a endotoxina dependente da

concentrao de endotoxina, temperatura e pH.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

Classificao legislativa do LAL:

Na edio da EP (Eur. Pharm., 3rd 1996) e no suplemento
2001 o teste de LAL mencionado como sendo de igual
valor ao ensaio in vivo, em coelhos.
O teste LAL classificado no mesmo nvel em outras
farmacopeias, como a USP XXIV (USP 24, 2000), a BP
(1999) e outras.

Mtodo farmacopeico oficial

LAL
6 mtodos oficiais descritos na EP:

A: Gel-clot method: limit test

B: Gel-clot method: semi-quantitative test
C: Turbidimetric kinetic method
D: Chromogenic kinetic method
E: Chromogenic end-point method
F: Turbidimetric end-point method
Mtodo cromognico: uso de substrato colorido, clivado com a ativao do
sistema enzimtico para produo de cor.

Farmacopeia brasileira: admite os mtodos acima. Necessrio

realizar validao para o mtodo de gelificao (teste de
sensibilidade do LAL utilizando padro de referncia de endotoxina
(PRE). Includo na 4 Edio da Farmacopeia (1996).

Determinao de Endotoxinas Bacterianas pelo

Mtodo in vitro
PROTOCOLO:
Volumes iguais de reagente LAL, da soluo a ser analisada ou
controle (endotoxina padro) so transferidos a tubos de
ensaio.
A mistura homogeneizada incubada em banho de gua a
37C/ 1h.
O ponto final da reao facilmente verificado pela remoo
dos tubos e inverso a 180.
A presena do gel que se mantm slido durante a inverso
considerada positiva para endotoxinas.
O ensaio se constitui em teste limite, levando-se em
considerao a sensibilidade do LAL empregado, que varia de
0,25 a 0,015 UE/mL. (UE = Unidade de Endotoxina ).
1 UE igual a 1 UI (unidade internacional).
Precaues:
Qualidade do material, assepsia, pH (6,5 a 8,0)

Metodologia
Preparo dos controles
Controles positivos
gua: soluo a 0,05 mg/mL de endotoxina padro em gua BET;
Amostra: soluo a 0,05 mg/mL de endotoxina padro em gua BET, contendo a
amostra.
Padro de Referncia de Endotoxina (10.000 UI/ampola). Um ng de endotoxina de
E.coli 055:B5 similar em potncia a 5 UE.
Controle negativo
gua BET (Bacterial Endotoxins Test): obtida por destilao tripla ou filtrao em
membrana.
Preparo do Reagente Pirogente: Reconstituir o lisado de amebcitos liofilizado
(kit) em 5,2 mL gua BET e dispensar 0,1mL em tubos de ensaio estreis.
Incubar com a amostra teste (0,1mL) e controles positivo e negativo.
Incubar a 37oC por 60min;
O resultado POSITIVO quando h formao de um gel firme capaz de se manter
ntegro quando o tubo invertido a 180;
O resultado NEGATIVO quando no h formao de um gel firme ou ainda
quando h formao de um gel viscoso que no se mantm preso ao tubo quando
invertido.

Ponto final de gelificao

Ensaio turbidimtrico

Mtodo cromognico

Curvas padro com mnimo de 3 concentraes

log (5; 0,5; 0,05 UE/mL), e controle positivo
com concentrao mdia da curva.
Sensibilidade maior: 0,005 UE/ml,
versus 0,25 a 0,015 UE/mL do teste de
gelificao

 a sensibilidade declarada do reagente LAL em UE/mL

So utilizadas 4 diluies do Padro de Referncia de Endotoxina
em quadruplicata, e incluir controles negativos.
Os resultados so considerados em conformidade se a mdia
geomtrica da concentrao do ponto final for 0,5 e < 2.
Pode-se fazer a comprovao tambm utilizando ensaios
turbidimtrico e cromognico.

Teste de inibio e exacerbao da amostra

A maioria dos medicamentos requer diluio para evitar interferncias
caracterizadas pela inibio (falha na recuperao do controle positivo) ou
por potencializao (recuperao do controle positivo maior que a esperada).

Caso seja detectada interferncia do produto no teste, devese calcular mxima diluio vlida (MDV).

Substituio do ensaio in vivo pelo LAL:

Possvel quando o limite de endotoxina definido para o material em
considerao.
Limites para endotoxina bacteriana (FDA):
Parenterais de grande volume: 0,5 UE/mL;
Drogas intratecais:0,2 UE/mL;
gua para injeo, gua estril para injeo e gua estril
para irrigao: 0,25 UE/mL;
gua bacteriosttica para injeo e gua estril para inalao:
0,5 UE/mL (USP - Suplemento 4a - 1984).
Drogas intratecais:0,2 UE/mL;
Correlatos at 0,5 UE/mL e correlatos intratecais 0,06 UE/mL.

Vantagens x Desvantagens do LAL

Vantagens:
quantidade de amostra;
Varias amostras podem ser testadas por dia;
1 operador treinado para realizar os testes;
Enconomia;
sensibilidade;
Metodologia padronizada;
Rapidez.
Desvantagens do LAL:
Reao pode ser inibida pela amostra (tensoativos, metais
pesados);
Quelantes de ctions divalentes (EDTA);
S detecta endotoxinas de bactrias gram negativas;
pH fora da faixa 6,5 a 8,0.

Despirogenizao
Diversas metodologias, mas importante ter produto final
apirognico ou com baixos nveis de endotoxina.
Despirogenizao: por inativao ou remoo das endotoxinas.
Por inativao da Endotoxina
Hidrlise cida ou alcalina (desativao do lipdio A)
separao do lipdeo A do resto da molcula ou
saponificao (materiais CIDA: HCl 0,05 N, 30 min,
100 C ou cido actico glacial 1%, 2 a 3 horas, 100 C;
ALCALINA: NaOH 0,25 N, 1 hora, 50 C);
Oxidao perxido de hidrognio 5% (mecanismo?),
usado em gua estril para injeo, salina e salinadextrose, mas pode oxidar produtos susceptveis;

Despirogenizao
Por inativao da Endotoxina
Alquilao (ex. uso de xido de etileno em materiais
termolbeis);
Processo trmico Autoclavao ineficaz.
Incinerao por tratamento com calor seco (250oC/ 30),
materiais termorresistentes como vidro e metal;
Radiao ionizante
riscos de toxicidade.

60Co,

uso limitado devido aos

Despirogenizao
Por remoo da Endotoxina
Lavagem - gua estril para injeo USP (vidrarias, tampas
e dispositivos);
Destilao mtodo mais antigo, durante a formao de
vapor a endotoxina separada por ter peso molecular
elevado;
Ultrafiltrao excluso por peso molecular (monmeros
de LPS de 20.000 daltons se agregam em vesculas de
300.000 a 1.000.000 daltons). Uso para frmacos e solues
de baixo a mdio peso molecular filtro que retm
molculas acima de 100.000 daltons);

Despirogenizao
Por remoo da Endotoxina
Osmose reversa membrana capaz de promover excluso
de ons ou excluso por tamanho til para produo de
gua estril para injeo;
Carvo ativo adsoro de endotoxinas (adsoro de
ingredientes ativos uma limitao);
Cromatografia troca inica - (etapa de purificao de
biotecnolgicos).
Mtodos devem ser sempre validados teste desafio que deve
mostrar contaminao reduzida em pelo menos 3 nveis
logartmicos (1000 UE/ml para 1 UE/ml)

Mtodos apresentam limitaes - melhor prevenir a

contaminao por pirognio do que ter que despirogenizar o
produto.
Cuidado com as matrias primas
GUA.