Sunteți pe pagina 1din 32

Universitatea Babe-Bolyai

Facultatea de Fizic

Rezumatul tezei de doctorat

Nanoparticule de aur acoperite cu gelatin i


ncrcate cu medicamente pentru a ndeplini
funcii terapeutice i imagistice multimodale

Sorina-Maria Suran

Coordonator tinific
Prof. Dr. Simion Atilean

CLUJ-NAPOCA

2015

Cuprins
Prezentare general............................................................................................................ 3
Part I Introducere i Documentare Bibliografic
Capitolul 1: Documentare Bibliografic
1.1. Introducere ............................................................................................................................ 4
1.2. Metode de sintez a nanoparticulelor de aur ......................................................................... 4
1.3. Proprietile nanoparticulelor de aur ..................................................................................... 5
1.4. Aplicaii biomedicale ale nanoparticulelor de aur................................................................. 5
1.4.1. Nanoparticuelele de aur n aplicaii de biodetecie ........................................................ 5
1.4.2. Nanoparticulele de aur n imagistic .............................................................................. 6
1.4.3. Nanoparticulele de aur n livrarea medicamentelor ....................................................... 6
1.4.4. Alte aplicaii biomedicale ale nanoparticulelor de aur ................................................... 6
1.5. Nanoparticulele de aur n detecia, imagistica i tratamentul cancerului .............................. 6
Partea II Rezultate i Discuii
Capitolul 2: Bioconjugate gelatin-nanoparticule de aur: formare, stabilitate i ncorporare
de funcii terapeutice
2.1. Funcionalizarea nanoparticulelor de aur .............................................................................. 7
2.1.1. Caracterizarea bioconjugatelor gelatin@AuNPs .......................................................... 7
2.1.2. Analiza FT-IR a interaciunii gelatin-AuNPs ............................................................... 9
2.2. Bioconjugatele gelatin@AuNPs ca substrate active SERS ............................................... 10
2.3. Bioconjugatele gelatin@AuNPs ca substrate pentru ncrcarea inhibitorilor FLT3 ......... 11
Capitolul 3: Sinteza direct i controlat a nanoparticulelor de aur n prezena gelatinei
3.1. Biosinteza nanoparticulelor de aur ...................................................................................... 13
3.1.1. Ajustarea formei i dimensiunii AuNPs n funcie de concentraia de gelatin ........... 13
3.2. Creterea i caracterizarea nanoparticulelor de aur ............................................................. 14
3.2.1. Efectul concentraiei de gelatin asupra creterii i morfologiei AuNPs ..................... 14
3.2.2. Efectul temperaturii de sintez asupra creterii nanoparticulelor ................................ 15
3.3. Stabilitatea nanoparticulelor acoperite cu gelatin.............................................................. 17
3.3.2. Stabilitatea AuNPs n mediu fiziologic simulat i n mediu celular ............................ 17
Capitolul 4: Studiul biocompatibilitii i a efectelelor biologice ale nanoparticulelor de aur
nvelite n gelatin asupra celulelor Osteoblast
4.1. Internalizarea nanoparticulelor de aur n celulele osteoblast .............................................. 18
4.2. Efectul nanoparticulelor asupra proliferrii celulelor osteoblast ........................................ 19
4.3. Efectul nanoparticulelor de aur asupra diferenierii celulelor osteoblast ............................ 20
Capitolul 5: Realizarea i validarea in vitro a unui nou nano-sistem chimioterapeutic cu
eliberare controlat pH a agentului terapeutic Doxorubicin
5.1. Caracterizarea nano-sistemului chimioterapeutic ............................................................... 22
5.2. Eliberarea DOX din nano-sistemul chimioterapeutic ......................................................... 24
5.3. Efectul nano-sistemului chimioterapeutic asupra liniei celulare de cancer mamar MCF-7 24
5.3.1. nglobarea DOX-AuNPs@gelatin de ctre celulele MCF-7 ...................................... 24
5.3.2. Eliberarea intracelular a DOX din AuNPs@gelatin ................................................. 25
5.3.3. Citotoxicitatea in vitro a nano-sistemului chimioterapeutic DOX-AuNPs@gelatin.. 30
Capitolul 6: Concluzii finale i perspective
Partea III Anexe

Prezentare general
Scopul acestei teze este proiectarea unor noi structuri plasmonice de nanoparticule de aur
(AuNPs) ca ageni biomedicali multimodali eficieni. Ne-am axat pe dou aplicaii majore ale
AuNPs: n medicina regenerativ i n tereapia cancerului.
Teza mea este structurat n trei pri care conin ase capitole. Partea I, intitulat
Introducere i Documentare Bibliografic const din Capitolul 1 care prezint unele aspecte
generale legate de metode de sintez, proprieti i aplicaii biomedicale ale AuNPs.
Urmtoarele capitole din Partea II prezint rezultatele obinute n timpul cercertrii
doctorale la Centrul de Nanobiofotonic din cadrul Institutului de Cercetri Interdisciplinare n
Bio-nano-tiine al Universitii Babe-Bolyai, n colaborare cu Laboratorul de Radioterapie,
Radiobiologie i Biologie Tumoral din cadrul Institutului Oncologic "Prof. Dr. Ion Chiricu",
Cluj-Napoca, Romnia.
Capitolul 2 prezint o abordare ecologic pentru stabilizarea i biocompatibilizarea
AuNPs reduse n prezena citratului de sodiu n soluie apoas, cu scopul de a mbunti
proprietile i aplicaiile biomedicale ale acestora. Am obinut dou clase de bioconjugate: una
operaional ca substrat pentru amplificarea mprtierii Raman (SERS) i cealalt util ca
platforme de ncrcare a diferitor inhibitori FLT3, medicamente utilizate n tratamentul
leucemiei.
n Capitolul 3, cu scopul de a combina proprietile unice ale AuNPs cu funcionalitatea
gelatinei, dar fr a folosi ageni de reducere i stabilizare toxici, propunem o nou metod de a
biosintetiza AuNPs. Exploatnd avantajul biopolimerului gelatin de a funciona ca agent unic de
reducere, cretere i stabilizare n soluie apoas a HAuCl4, am reuit s controlm att
dimensiunea ct i forma nanoparticulelor, prin schimbarea parametrilor de sintez.
n continuare, n Capitolul 4 pentru a investiga interaciunea AuNPs cu celulele
osteoblast, am selectat cele mai mici AuNPs sferice sintetizate anterior, notate AuNPs@gelatin.
AuNPs standard acoperite cu citrat avnd form i dimensiuni similare au fost utilizate ca i
control. Rezultatele au artat faptul c att proliferarea ct i diferenierea celulelor osteoblast au
crescut n prezena concentraiilor mai ridicate de AuNPs@gelatin.
Capitolul 5 descrie fabricarea unui nou nano-sistem chimioterapeutic bazat pe
AuNPs@gelatin ncrcate cu medicamentul chimioterapeutic Doxorubicin. Am testat eficiena
in vitro a complexului DOX-AuNPs@gelatin obinut pe linia de celule de cancer mamar MCF-7
cu ajutorul microscopiei de mprtiere n cmp ntunecat, a microscopiei de fluorescen, de
fluorescen rezolvat temporal (FLIM), a spectroscopiei SERS i a testului MTT.
Ultimul capitol al tezei, Capitolul 6, cuprinde concluziile i perspectivele studiilor mele.
Partea III prezint anexele acestei teze.
Cuvinte cheie: nanoparticule de aur, gelatin, biosintez, terapia cancerului, Doxorubicin,
culturi celulare, plasmoni de suprafa, microscopie de fluorescen, FLIM, SERS
3

Part I
Introducere i Documentare Bibliografic
Capitolul 1
Documentare Bibliografic
1.1. Introducere
Avnd n vedere proprietile, uurina sintezei i funcionalizarea AuNPs, acestea sunt n
prezent considerate drept crmizi pentru multe materiale i dispozitive nanostructurate [1].
AuNPs permit dezvoltarea unor nanomateriale sofisticate, complexe ce combin proprietile
diferitelor materiale organice i anorganice care ulterior pot aciona ntr-o manier sinergic ntrun nano-sistem capabil s treac toate barierele din corpul uman [2] pentru a repara esuturile
deteriorate i a restabili funcia acestora. Aceste noi materiale au dat natere la un nou domeniu
nanomedicina axat n primul rnd pe dezvoltarea unor noi nano-sisteme care permit simultan
diagnosticul, imagistica i terapia [3], utile n special pentru tratamentul personalizat al
cancerului [4].
1.2. Metode de sintez a nanoparticulelor de aur
Cea mai popular metod de sintez a AuNPs sferice este metoda Turkevich care
presupune reducerea HAuCl4 cu citrat de sodiu n soluie apoas la temperatura de fierbere. n
funcie de aplicaia dorit, folosind aceast metod pot fi obinute nanoparticule de diferite
dimensiuni avnd diametrul cuprins ntre 10 i 150 nm, doar variind raportul celor doi reactani.
Printre alte metode pentru sinteza AuNPs se numr metoda Brust-Schiffrin utilizat
pentru a produce AuNPs foarte mici n lichide organice sau strategii ce utilizeaz ageni de
acoperire care sunt n msur s controleze ratele de cretere ale diferitor semine pentru a obine
nanoparticule de metal anizotrope, cum ar fi bastonae, triunghiuri, stele sau flori.
Dei aceste metode ofer nanoparticule de nalt calitate, acestea folosesc unii ageni
chimici (de exemplu, citratul de sodiu sau borohidrura de sodiu), cunoscui pentru poteniale
riscuri biologice, ce prezint doar o stabilitate limitat a AuNPs n medii biologice i care mai
mult necesit purificarea i biocompatibilizarea AuNPs, pentru a fi utilizate n aplicaii
biologice/biomedicale.
Cu toate acestea, protocoalele de "chimie verde" au ctigat din ce n mai mult interes n
domeniul sintezei NPs datorit materialelor ecologice folosite. De exemplu, protocoalele de
sintez care utilizeaz bacterii, ciuperci sau drojdii precum i aminoacizi, vitamine, biopolimeri,
plante vii sau extracte de plante sunt capabile nu numai s reduc ionii metalici n forme i
dimensiuni ale AuNPs bine definite dar ulterior acoper i protejaz NPs formate, n timp ce le
4

confer o suprafa funcionalizat [5], ntr-un singur pas. Prin urmare, biosinteza AuNPs
maximizeaz eficiena i sigurana reaciilor n timp ce reduce riscurile pentru mediu.
1.3. Proprietile nanoparticulelor de aur
n domeniul de scar nanometric, datorit ariei mari de suprafa sau a efectului cuantic,
proprietile fizice i chimice ale materialelor se modific drastic rezultnd unele proprieti
unice. Aceste caracteristici distinctive apar datorit oscilaiilor colective ale electronilor liberi n
urma excitrii, cunoscute sub numele de rezonane plasmonice de suprafa localizate (LSPR).
Banda LSPR a AuNPs este extrem de dependent de mrimea, chimia suprafeei i mediul local
din jurul AuNPs, fiind astfel o sond util pentru a monitoriza interaciunea nanoparticulelor cu
probe biologice. Aceste caracteristici unice pot fi reglate cu precizie pentru a interfera n mod
specific cu materia organic cu scopul de a facilita aplicarea acestora n domeniul biomedical.
O alt proprietate important a AuNPs este cmpul electromagnetic amplificat generat n
jurul suprafeei acestora. Acest cmp electromagnetic poate amplifica att fluorescena unei
molecule aflat n proximitatea unei nanoparticule ct i semnalul Raman al moleculelor de pe
suprafaa metalic.
1.4. Aplicaii biomedicale ale nanoparticulelor de aur
Avnd n vedere versatilitatea AuNPs care ofer materiale complexe, acestea au
numeroase aplicaii n nanomedicin, cum ar fi livrarea specific a medicamentelor i genelor, n
genomic, biosenzoristic, biodetecie sau bioimagistic optic.
1.4.1. Nanoparticulele de aur n aplicaii de biodetecie
Cea mai simpl metod de detecie bazat pe nanotehnologie este detecia colorimetric.
Aceasta are la baz interaciunea/legarea dintre AuNPs funcionalizate i analii, interaciune care
induce agregarea AuNPs i modificarea vizual ulterioar a culorii de la rou la albastru.
Biodetecia bazat pe modificarea benzii LSPR este o metod bazat pe schimbarea
intensitii i poziiei spectrale a benzii LSPR indus de o variaie n mediul local al AuNPs, n
urma interaciunilor biospecifice [6]. Acest metod este mai puin sensibil dect testele de
agregare, i avnd n vedere c orice molecul poate induce o schimbare n banda LSPR a
AuNPs, metoda este potrivit exclusiv pentru detecia analiilor cunoscui i numai atunci cnd
AuNPs sunt funcionalizate cu elemente de recunoatere molecular, cum ar fi anticorpii.
Pentru detecia i identificarea probelor necunoscute, spectroscopia Raman este cea mai
potrivit metoda, deoarece este o tehnic foarte specific, n msur s identifice specii
moleculare bazat pe amprenta lor unic de vibraie Raman. Semnalul Raman poate fi amplificat
drastic atunci cnd analiii sunt adsorbii pe suprafee metalice, efect cunoscut sub numele de
mprtiere Raman amplificat de suprafa. Pentru aplicaii de biodetecie eficiente este, prin
urmare, esenial substratul SERS. n soluie, AuNPs nanosferice agregate sau anizotrope
determin formarea de hot-spoturi ntre nanoparticulele interconectate care amplific substanial
5

semnalul Raman. La fel de important precum forma AuNPs este funcionalizarea i


biocompatibilitatea senzorilor care trebuie s permit adsorbia analiilor pentru un semnal SERS
eficient, stabil i reproductibil.
1.4.2. Nanoparticulele de aur n imagistic
Proprietile optice i electronice versatile ale AuNPs au permis imagistica celular cu o
varietate de tehnici, inclusiv mprtierea luminii n cmp ntunecat, tomografia coerent optic
(OCT), tomografia computerizat (CT), microscopia de for atomic (AFM), fluorescen,
microscopia electronic de transmisie i baleiaj (TEM, SEM) precum i spectroscopia SERS.
Unele dintre aceste tehnici utilizate n prezent permit chiar i imagistica la nivel unicelular.
1.4.3. Nanoparticulele de aur n livrarea medicamentelor
n funcie de funcionalizarea suprafeei, tipul medicamentelor i de aplicaiile dorite,
AuNPs pot fi uor ncrcate cu un singur sau mai multe medicamente sau alte molecule fie prin
interaciuni de conjugare covalente sau necovalente. ncrcarea de medicamente pe suprafaa
AuNPs mbuntesc stabilitatea i biodistribuia acestora n medii biologice avnd n vedere c
sunt protejate n agentul de transport care le confer n plus o via mai lung n sistemele
biologice i posibilitatea de a fi livrate fie prin metode specifice sau pasive ctre locul de aciune.
AuNPs permit ncrcarea unei mari cantiti de medicament datorit ariei mari de
suprafa i chimiei versatile a suprafeei. Mai mult dect att, activitatea sporit a
medicamentelor livrate de AuNPs face posibil reducerea dozei de medicament administrat i
implicit efectele secundare ale acestuia.
1.4.4. Alte aplicaii biomedicale ale nanoparticulelor de aur
n terapia fotodinamic (PDT) AuNPs sunt folosite pe scar larg drept ageni de transport
a fotosensibilizatorilor n zona de interes. Acolo, fotosensibilizatorului excitat poate produce o
specie de oxigen extrem de reactiv, cunoscut sub numele de oxigen singlet care distruge celulele
din apropiere.
AuNPs sunt, de asemenea, frecvent utilizate n terapia fototermic (PTT), datorit
interaciunii lor unice cu radiaia laser. AuNPs situate n interiorul sau n jurul celulelor int, n
urma iradierii cu laser absorb energia fotonic, care este transformat n energie termic i induc
astfel o cretere a temperaturii locale n jurul AuNPs i, prin urmare, deteriorarea acestora [7].
n plus, AuNPs pot fi aplicate pur i simplu ca ageni terapeutici sau antibacterieni
eficieni.
1.5. Nanoparticulele de aur n detecia, imagistica i tratamentul cancerului
Cu scopul de a obine rezultate maxime n detecia i tratamentul cancerului cu efecte
secundare minime este esenial ca agenii terapeutici s ajung la locul tumorii i n interiorul
celulelor maligne. Medicina convenional, implic de obicei chimioterapia pentru tratarea
cancerului, dar, din pcate, agenii chimioterapeutici nu sunt specifici celulelor canceroase i prin
6

urmare, distrug att celulele maligne ct i cele normale i este extrem de toxic, avnd multe
efecte secundare nedorite [8]. Nanomedicina, pe de alt parte, face uz de materiale
nanostructurate capabile s transporte i s elibereze medicamente chimioterapeutice specific
numai la esutul canceros.
n aceast seciune, sunt discutate pe scurt cele mai importante abordri pentru
tratamentul cancerului bazat pe AuNPs i medicamentul doxorubicin un agent
chimioterapeutic utilizat pe scar larg cu efecte dovedite mpotriva leucemiei, limfoamelor,
cancerului de sn, de ovar i a multor tumori solide.

Partea II
Rezultate i Discuii
Capitolul 2
Bioconjugate gelatin-nanoparticule de aur:
formare, stabilitate i ncorporare de funcii terapeutice
2.1. Funcionalizarea nanoparticulelor de aur
2.1.1. Caracterizarea bioconjugatelor gelatin@AuNPs
Formarea bioconjugatelor gelatin@AuNPs a fost realizat ntr-un singur pas prin simpla
amestecare a 100 l soluie de gelatin avnd diferite concentraii cu 1 ml de soluie de aur
coloidal. Ulterior, am notat ca 0.03gelatin@AuNPs i 10gelatin@AuNPs bioconjugatele
preparate n prezena unei concentraii de gelatin de 0.03 i respectiv 10 mg/ml. Probele au fost
centrifugate timp de 10 min la 12000 rpm pentru a ndeprta gelatina nelegat iar apoi au fost
redispersate n ap ultrapur.
Poziia i forma benzii LSPR au fost analizate pentru a deduce legarea stratului de
gelatin pe suprafaa AuNPs sintetizate prin reducerea cu citrat i a decide asupra stabilitii
bioconjugatelor gelatin@AuNPs.
n primul rnd, au fost comparate spectrele a dou eantioane reprezentative preparate cu
concentraii mici (Figura 2.1.A) i mari (Figura 2.1.B) de gelatin (probele 0.03gelatin@AuNPs
i 10gelatin@AuNPs). Am folosit pentru referin banda LSPR a AuNPs acoperite cu citrat
(Figura 2.1.A spectrul a) localizat la 520 nm, tipic pentru nanoparticule sferice cu diametrul de
182 nm obinut din msurtori TEM i diametru hidrodinamic de 25 nm.Prezena stratului de
citrat la suprafaa AuNPs de referin este confirmat de potenialul zeta de -31.5 mV.

Figure 2.1. A. Evoluia n timp a benzii plasmonice a 0.03gelatin@AuNPs i respectiv


B. 10gelatin@AuNPs. C.-D. imaginile TEM a 0.03gelatin@AuNPs i
E. 10gelatin@AuNPs, ce prezint structuri de tip lan scurt i inele, respectiv AuNPs
individuale acoperite cu gelatin
Figure 2.1.A prezint o selecie de spectre LSPR nregistrate succesiv n timpul procesului
de stabilizare a probei 0.03gelatin@AuNPs, care expune dou benzi i dezvluie un proces de
agregare controlat. Fenomenul de agregare prin care se formeaz agregate mici n soluie pe
cheltuiala AuNPs libere conduce la formarea unor ansambluri mici de nanoparticule, dup cum
confirm imaginile TEM din Figura 2.1.C-D.
n mod similar, am analizat modificrile spectrelor LSPR nregistrate la diferite intervale
de timp pe parcursul procesului de stabilizare a celei de a doua probe, notat ca
10gelatin@AuNPs (Figura 2.1.B). Prima observaie este c procesul de stabilizare este rapid,
dureaz nu mai mult de 15 minute, spre deosebire de aproximativ dou zile n cazul
0.03gelatin@AuNPs. Singura modificare observat este o deplasare spre rou de 5 nm (spectrele
i insertul din figura 2.1.B) de la 520 nm la 525 nm, cu aproape nici o schimbare n forma benzii,
indicnd n mod clar comportamentul nanoparticulelor individuale n soluie. Corobornd
dovezile din imaginea TEM (Figura 2.1.E), msurtorile de mprtiere dinamic a luminii (DLS)
(creterea diametrului hidrodinamic la 65 5 nm) i msurtorile de -potenial (creterea la +
6.442.4 mV) este confirmat prezena stratului de gelatin pe suprafaa AuNPs.
Am investigat, de asemenea, evoluia spectrelor LSPR pentru mai multe probe preparate
cu concentraii de gelatin variind de la 0.03 la 10 mg/ml. Toate probele prezint spectre stabile
LSPR (Figura 2.2), dup un timp mai scurt sau mai lung de incubare, constnd din amestecuri de
particule izolate i agregate mici ale cror raporturi pot fi controlate de concentraia de gelatin.

Figure 2.2. Spectrul LSPR al probei de referin (spectrul a) i bioconjugatele


gelatin@AuNPs formate n prezena a diferitor concentraii de gelatin: b) 0.03 mg/ml, c) 0.05
mg/ml d) 0.07 mg/ml e) 0.1 mg/ml f) 0.3 mg/ml g) 1 mg/ml h) 5 mg/ml i i) 10 mg/ml
Msurtorile DLS corespunztoare furnizeaz informaii suplimentare, confirmnd
prezena agregatelor cu diametru hidrodinamic mare la concentraie foarte sczut de gelatin i
descreterea diametrului acestora odat cu creterea concentraiei de gelatin. Sarcina de la
suprafaa bioconjugatelor, de asemenea variaz n funcie de concentraiile de gelatin pn cnd
ajunge la starea de echilibru la o valoare pozitiv + 6.44 2.4 mV la 10 mg/ml.
2.1.2. Analiza FT-IR a interaciunii gelatin-AuNPs
Lanul polimeric al gelatinei prezint att amine ct i grupri funcionale carboxil i
amide, gelatina fiind ncrcat pozitiv la pH fiziologic ceea ce faciliteaz adsorbia electrostatic
la suprafaa AuNPs acoperite cu citrat, ncrcate negativ.
Detaliile structurii moleculare i interaciunea specific a gelatinei cu AuNPs sunt
investigate prin spectroscopie FT-IR (Figura 2.3).
Banda amide I, sensibil la schimbrile conformaionale n lanul gelatinei [9] se
deplaseaz de la 1632 cm-1 la 1650 cm-1, ceea ce sugereaz faptul c structura secundar a
gelatinei s-a schimbat de la structuri -antiparalele la -helix, dup conjugarea cu AuNPs.
Mai mult, banda amide III observat n cazul gelatinei pure (n principal din cauza
vibraiilor de ntindere CN), dispare n urma legrii la suprafaa AuNPs. Acest comportament
indic blocarea vibraiilor de ntindere datorit coordinrii gruprilor funcionale NH2 din
gruparea amidic la suprafaa nanoparticulelor de aur.

Figure 2.3. Spectrul FT-IR al a) gelatinei i al


b) bioconjugatelor 10gelatin@AuNPs
Aceste rezultate sugereaz faptul c gruprile amide i carboxil pot fi mai ales site-uri
active pentru coordinarea cu suprafaa AuNPs, indicnd n mod clar c nanoparticulele au fost
ntr-adevr conjugate cu biopolimerul gelatin.
2.2. Bioconjugatele gelatin@AuNPs ca substrate active SERS
Dou probe de bioconjugate gelatin@AuNPs (individuale i interconectate) au fost
testate ca substrate SERS n soluie de concentraie 3,610-6 M Rose Bengal (RB) n urma
excitrii laser la 532 nm i 633 nm. Nici un semnal Raman nu a fost detectat n soluie de
concentraie identic RB (3.610-6 M) preparat fr bioconjugate (Figura 2.4 spectrul a) i,
pentru referin, am colectat un spectru Raman normal dintr-o soluie de concentraie mult mai
mare (10-2 M) sub excitaie laser cu linia 633 nm (Figura 2.4 spectrul b).
Msurtorile SERS dezvluie prezena moleculelor RB n bioconjugate. Mai exact, n
cazul bioconjugatelor individuale incubate cu RB gelatin@AuNPs (RB-10gelatin@AuNPs),
linia laser 532 nm, este n acelai timp n rezonan cu banda LSPR a AuNPs la 525 nm i cu
banda de absorbie electronic a RB la 548 nm, ceea ce permite nregistrarea unui spectru de
mprtiere rezonant Raman amplificat de suprafa (SERRS) (Figura 2.4 spectrul e) [10].
Contribuia RRS este evideniat n mod clar (Figura 2.4 spectrul e) de apariia a dou benzi
puternice situate la 1619 cm-1 i 1496 cm-1 atribuite vibraiilor moleculare specifice cromoforului
excitat. Acest rezultat sugereaz faptul c o parte din moleculele RB sunt ataate de polimer, nu
direct pe suprafaa metalic pentru a preveni stingere fluorescenei, dar nu prea departe de metal
pentru a nu compromite activitatea SERS. n cazul bioconjugatelor agregate incubate cu RB (RB0.03gelatin@AuNPs) banda LSPR de la 622 nm este situat departe de linia de excitaie laser la
532 nm. Drept urmare, doar o mic parte din bioconjugatele individuale existente n soluie n
prezena bioconjugatelor agregate sunt active SERS, ceea ce face ca fluorescena nregistrat s
se suprapun complet cu semnalul SERRS al moleculelor reporter RB.

10

Figure 2.4. Spectrul de referin Raman al RB liber la a) 3.6*10-6 M and b)10-2 M n soluie
nregistrat la 633 nm; spectrul SERS al c) RB-individual 10gelatin@AuNPs, d) RBinterconectate 0.03gelatin@AuNPs nregistrat la 633 nm i e) RB-individual gelatin@AuNPs
nregistrat la 532 nm.
n continuare am analizat spectrele SERS nregistrate din probele (0.03gelatin@AuNPs
i 10gelatin@AuNPs) sub excitaie cu linia laser 633 nm. Banda de absorbie electronic a RB
fiind situat la 548 nm nici un efect Raman rezonant nu contribuie la semnalul SERS. n cazul
probei 0.03gelatin@AuNPs linia laser este rezonant cu banda LSPR a agregatelor mici la 633
nm, ceea ce permite nregistrarea unui semnal SERS foarte bun (Figura 2.4 spectrul d).
Presupunem c o contribuie semnificativ a semnalului SERS provine de la numeroasele puncte
fierbini ce apar ntre golurile mici induse de agregare [11]. Pe de alt parte, n cazul probei
10gelatin@AuNPs, linia laser este n afara rezonanei bioconjugatelor ceea ce face semnalul
SERS extrem de slab (Figura 2.4 spectrul c).
2.3. Bioconjugatele gelatin@AuNPs ca substrate pentru ncrcarea inhibitorilor FLT3
Propunem aici o nou metod de a livra inhibitori ai Fms-ca tirozin kinazei 3 (inhibitori
FLT3), la celulele canceroase, prin utilizarea AuNPs individuale protejate ntr-un strat de gelatin
ca ageni de transport ai medicamentelor. Acest complex este capabil s ncorporeze concentraii
mari de medicament i s le transporte ntr-o manier controlat la celulele maligne, reducnd
astfel doza medicamentului n esuturile sntoase i efectele secundare severe care pun viaa n
pericol. Pentru studiul nostru am selectat patru inhibitori FLT3 diferii, i anume midostaurin
(MDS), sorafenib (SRF), lestaurtinib (LST) i quizartinib (QZR) cu scopul de a proiecta un
sistem nou AuNPs-medicament pentru tratamentul leucemiei acute mieloide (AML).
Patru seturi de spectre UV-Vis corespunztoare celor patru inhibitori FLT3 diferii (MDS,
SRF, LST i QZR) conjugatele cu gelatin@AuNPs sunt prezentate n Figura 2.5 A, B, C i
respectiv D. n fiecare caz, spectrul UV-Vis al gelatin@AuNPs (fr medicament) i al
medicamentelor libere este prezentat pentru referin.

11

Figure 2.5. ncrcarea inhibitorilor FLT3 (spectrele portocalii) pe gelatin@AuNPs (spectrele


roii) Spectrele albastre reprezint: A. gelatin@AuNPs-MDS, B. gelatin@AuNPs-SRF,
C. gelatin@AuNPs-LST i D. gelatin@AuNPs-QZR. Inserturile prezint structurile chimice
ale inhibitorilor FLT3
Probele gelatin@AuNPs purificate prezint o semntur plasmonic LSPR caracteristic
care are un maxim centrat la 526 nm (spectrul rou n fiecare cadran din Figura 2.5). n toate
cazurile, dup incubarea gelatin@AuNPs cu inhibitori FLT3, complexele prezint o band
LSPR deplasat spre rou mpreun cu semntura medicamentelor n regiunea UV, care poate fi
considerat ca fiind o prim dovad a interaciunii dintre inhibitorii FLT3 i AuNPs. Forma
benzii plasmonice indic faptul c complexele formate sunt dispersate individual n soluie i
prezint stabilitate.
ncrcarea inhibitorilor FLT3 pe gelatin@AuNPs este de asemenea susinut de
msurtorile de potenial zeta i mprtiere dinamic a luminii (DLS). Dup purificare,
gelatin@AuNPs poart o sarcin pozitiv de + 22.50.4 mV care provine de la stratul de
gelatin de la suprafaa AuNPs. Dup interaciunea cu medicamentele, potenialul zeta al
nanoparticulelor crete pn la +30.40.8 mV pentru gelatin@AuNPs-LST i chiar +32.40.4
mV pentru gelatin@AuNPs-QZR, confirmnd adsorbia medicamentelor pe suprafaa
particulelor. n plus, o valoare a -potenialului mai mare dect +30mV reprezint un semn major
de stabilitate a complexului. Caracterizarea DLS a gelatin@AuNPs purificate nainte i dup
interaciunea cu alte medicamente dezvluie creterea diametrului hidrodinamic dup ncrcarea
medicamentelor, confirmnd capacitatea stratului de gelatin la suprafa AuNPs de a ncorpora o
cantitate mare de medicament.

12

Totui, pentru a funciona ca nano-sisteme FLT3 inhibitoare eficiente n aplicaii in vitro


i in vivo un semn de ntrebare ridic stabilitatea gelatin@AuNPs ncrcate cu medicamente n
condiii biologice, unde acestea sunt predispuse la agregare. n acest sens, stabilitatea pe termen
lung a complexelor noastre cu diferite medicamente ncrcate a fost dovedit prin msurarea
rspunsului plasmonic al gelatin@AuNPs dup pstrarea n soluie PBS timp de o sptmn.

Capitolul 3
Sinteza direct i controlat a
nanoparticulelor de aur n prezena gelatinei
3.1. Biosinteza nanoparticulelor de aur
3.1.1. Ajustarea formei i dimensiunii AuNPs n funcie de concentraia de gelatin
Sinteza AuNPs a fost realizat ntr-un singur pas prin simpla amestecare a diferitor
concentraii ale soluiei de gelatin cu o soluie HAuCl4 de concentraie 3 mM ntr-un raport
volumic de 1:1 urmat de incubarea la 80 C timp de 6 ore. Am monitorizat formarea AuNPs
utiliznd att metode spectroscopice de absorbie n UV-Vizibil ct i imaginile TEM ale
nanoparticulelor sintetizate depuse pe grile pentru TEM. n prima serie de experimente am
examinat formarea AuNPs n urma incubrii unor cantiti identice de soluie de acid
tetraclorauric (HAuCl4) cu soluii de gelatin de diferite concentraii. Figura 3.1.A prezint
exemple tipice de spectre LSPR nregistrate din 5 soluii coloidale de AuNPs rezultate dup
incubarea soluiilor precursoare cu concentraii cresctoare de gelatin: 0.5%, 0.62%, 0.75%,
0.87% i 1%. Toate msurtorile s-au efectuat dup 6 ore de incubare la 80 C, atunci cnd
formarea nanoparticulelor a fost stopat prin rcirea soluiilor la temperatura camerei.

Figure 3.1. Spectre UV-Vis-NIR ale AuNPs sintetizate cu


A. concentraii mici de gelatin i B. concentraii mari de gelatin
13

n intervalul de concentraii menionate mai sus, spectrele prezint cel puin dou benzi de
extincie care evolueaz n funcie de concentraia de gelatin utilizat. Mai exact, poziia primei
benzi situat la aproximativ 530 nm rmne relativ stabil n timp iar intensitatea acesteia crete
constant, n timp ce a doua band se deplaseaz treptat din NIR (~ 1300 nm) spre vizibil (~ 650
nm), devenind mai ngust pe msur ce crete concentraia de gelatin. Potrivit literaturii cea de
a doua band poate fi atribuit rezonanei dipolare n-plan n timp ce prima band corespunde
rezonanei dipolare n afara planului a AuNPs triughiulare care se suprapune cu rezonana
plasmonic a AuNPs sferice [12]. Imaginile TEM confirm prevalena nanoparticulelor
triunghiulare (~ 69%) printre nanoparticule sferice (~ 31%) la concentraia cea mai mic de
gelatin i prevalena nanoparticulelor sferice (~ 78%) printre nanotriunghiuri extrem de
polidisperse (~ 22%) la o concentraie mai mare de gelatin. Deplasarea treptat a rezonanei
dipolare n-plan a nanotriunghiurilor din NIR spre vizibil odat cu creterea concentraiei de
gelatin este coroborat cu o scdere a laturii nanotriunghiurilor de la 23717 nm la 52.521 nm,
dup cum rezult din analiza TEM.
Prin contrast, n a doua serie de experimente realizate la concentraii cresctoare de
gelatin de 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5% i 5%, banda LSPR din NIR dispare complet i
banda rmas n vizibil se deplaseaz treptat de la 530 nm la 540 nm. Acest deplasare spre rou
nsoit de o scdere progresiv n intensitate a benzii, denot o cretere a dimensiunii
nanoparticulelor cu scderea concentraiei de nanoparticule formate (Figura 3.1.B). Din nou,
imaginile TEM confirm formarea AuNPs sferice cu diametrul mediu cuprins ntre 183.5 nm i
5710 nm.
3.2. Creterea i caracterizarea nanoparticulelor de aur
3.2.1. Efectul concentraiei de gelatin asupra creterii i morfologiei AuNPs
De asemenea, am monitorizat formarea AuNPs la 80 C pentru dou cazuri
reprezentative, mai exact la o concentraie de gelatin mare (1.5%) i respectiv mic (0,5%), n
funcie de timpul de incubare, prin msurarea spectrelor LSPR din soluii la diferite momente n
timpul sintezei. n primul caz, banda LSPR i schimbrile corespunztoare n culoarea soluiei
apar dup numai o or de incubaie (Figura 3.2.A). Banda LSPR apare la 540 nm i crete n
intensitate simultan cu o deplasare spre albastru progresiv la 530 nm dup aproximativ 6 ore.
Aceast deplasare poate fi explicat parial prin modificarea mediului dielectric al AuNPs care
poate fi datorat disocierii clusterelor de gelatin mici aprute atunci cnd creterea particulelor
este susinut de un proces de coacere controlat de difuzia Ostwald.

14

Figure 3.2. Evoluia intensitii i poziiei spectrale a benzii LSPR asociat cu sinteza AuNPs
asistat de gelatin la o A. concentraie de gelatin 1.5% iB. concentraie de gelatin 0.5%
(Spectrele nregistrate au fost translatate n Figura B pentru o mai bun vizualizare)
n ceea ce privete al doilea caz, incubarea ionilor de aur cu concentraie sczut de
gelatin (0.5%) la 80 C este asociat cu o evoluie mai complex a spectrului LSPR. Interesant,
banda LSPR caracteristic formrii AuNPs de forme triunghiulare apare la 1158 nm i pe msur
ce sinteza continu aceast band evolueaz n timp ctre 1200 nm, dup 6 ore (Figura 3.2.B),
indicnd creterea nanotrunghiurilor [13]. Prima banda LSPR situat la 553 nm care corespunde
rezonanei compuse dipolare n afara planului a nanotriunghiurilor i rezonanei plasmonice a
AuNPs sferice are un comportament similar cu cel discutat anterior n cazul sintezei nanosferelor.
Este de remarcat faptul c n ambele cazuri reacia de sintez a fost oprit iar forma i
dimensiunea nanoparticulelor formate a rmas neschimbat dup rcirea soluiei coloidale la
temperatura camerei.
3.2.2. Efectul temperaturii de sintez asupra creterii nanoparticulelor
Anterior, ne-am axat asupra formrii AuNPs acoperite cu gelatin la 80 C, dar avnd n
vedere c soluia de gelatin este susceptibil la degradare la temperaturi ridicate, am investigat
formarea AuNPs la temperaturi mai sczute, corobornd rezultatele cu datele obinute din
msurtorile de vscozitate.
Figura 3.3.A prezint secvena spectrelor LSPR nregistrate n primele 6 ore din trei
soluii identice incubate la temperaturi de 40 C, 60 C i 80 C. Este clar faptul c la temperaturi
puin peste sau la orice temperatur sub punctul de topire al gelatinei sinteza AuNPs nu este
fezabil.
Acest rezultat nu este surprinztor deoarece gelatina prezint vscozitate redus i o
conformaie cu bucle aleatoare deasupra punctului de topire (~ 35 C) i o vscozitate crescut cu
regiuni triplu helix sub acest punct (Figura 3.3.B) [14]. Vscozitatea crescut ncetinete sinteza

15

considerabil datorit transferului de electroni redus ntre gruprile amino ale gelatinei i ionii de
aur n timp ce o vscozitate redus a gelatinei faciliteaz o rat crescut a sintezei.

Figure 3.3. A. Evoluia n timp a intensitii benzii LSPR nregistrat n timpul sintezei AuNPs la
40 C, 60 C i 80 C; B. dependena vncozitii de temperatur pentru a) soluia pur de
gelatin nante de tratamentul termic; soluia pur de gelatin dup 6 ore de nclzire la b) 60 C
i respectiv c) 80 C i d) suspensia coloidal de AuNPs acoperite cu gelatin sintetizate la 80 C
Proba incubat la 80 C prezint banda LSPR atribuit AuNPs sferice la 530 nm n timp
ce proba incubat la 60 C prezint o banda LSPR similar, deplasat spre rou la 547 nm.
Intensitatea benzii LSPR n Figura 3.3 demonstreaz c sinteza realizat la 80 C este mult mai
rapid i furnizeaz o concentraie mai mare de nanoparticule. Mai exact, o temperatur mai
ridicat impune o etap de nucleaie rapid ceea ce duce ulterior la formarea unui numr mai
mare de particule de dimensiuni relativ mai mici, dup cum confirm imaginile TEM (Figura
3.4).
n plus, peste 60 C, n biopolimerul gelatin se observ o degradare termic i o disociere
a legturilor de hidrogen care impune formarea monomerilor de gelatin [15]. Monomerii de
gelatin expun mai multe grupri hidroxil, cunoscute ca ageni de reducere eficieni pentru ionii
de aur.

Figure 3.4. Imaginile TEM ale AuNPs bio-sintetizate la A. 40 C, B. 60 C i C. 80 C.


Scala arat 500 nm
16

Prin urmare, reducerea rapid a ionilor de aur n prezena gelatinei degradate este de
preferat [16]. Mai mult dect att, incubarea gelatinei la temperaturi ridicate promoveaz
creterea gradului de degradare care poate fi obvervat prin compararea curbelor de vscozitate
ale unei soluii de gelatin nainte (Figura 3.3 curba a) i dup tratamentul termic timp de 6 ore la
60 C i respectiv 80 C (Figura 3.3 curbele b i c). Aceste modificri ar putea influena, de
asemenea, indicele de refracie al gelatinei, care are un impact asupra deplasrii benzii LSPR.
Vscozitatea AuNPs biosintetizate n prezena biopolimerului gelatin, de asemenea,
scade ncet n timp ce temperatura crete, datorit modificrii vscozitii stratului de gelatin
care protejaz suprafaa acestora (Figura 3.3 curba d).
3.3. Stabilitatea nanoparticulelor acoperite cu gelatin
3.5.2. Stabilitatea AuNPs n mediu fiziologic simulat i n mediu celular
Pentru urmtoarele studii am selectat din marea varietate de nanoparticule obinute,
AuNPs sintetizat cu concentraia de gelatin 1.5% (denumit aici ca AuNPs@gelatin) deoarece
acestea sunt cele mai mici sferice obinute i cele mai monodisperse nanoparticule, cu o
dimensiune de 183.5 nm, dup cum reiese din imaginile TEM i histogramele corespunztoare.

Figure 3.5. A. Spectrul LSPR al AuNPs sintetizate/stabilizate cu gelatin a) dup


purificare b) la temperature fiziologic de 37 C i c) n soluie 0.9% NaCl.
B. Spectrul de extincie al AuNPs@gelatin nregistrat n a) ap ultrapur i b) mediu celular
Avnd n vedere utilizarea lor n aplicaii biomedicale, stabilitatea AuNPs a fost mai nti
demonstrat prin monitorizarea evoluiei spectrelor LSPR n condiii fiziologice simulate (adic
soluie 0,9% NaCl i 37 C) i n mediu celular DMEM/F12 la temperatura fiziologic. Nu s-a
observat nici un semn de agregare indus n banda LSPR. Aceste rezultate demonstreaz c
gelatina acioneaz ca un agent de acoperire i protecie eficient i ofer n plus garania c
AuNPs@gelatin sunt perfect stabile, att n mediu simulat ct i n mediu celular la temperatura
fiziologic (Figura 3.5).

17

Capitolul 4
Studiul biocompatibilitii i a efectele biologice ale AuNPs
nvelite n gelatin asupra celulelor Osteoblast
4.1. Internalizarea nanoparticulelor de aur n celulele osteoblast
Figura 4.1 prezint imaginile de microscopie n cmp ntunecat ale celulelor osteoblast
(OBL) tratate cu AuNPs@gelatin (Figura 4.1.B), mpreun cu celulele control tratate cu AuNPs
acoperite cu citrate AuNPs@citrat (Figura 4.1.C) i celule netratate (Figura 4.1.A). n celulele
control netratate sunt vizibile unele puncte albstrui ce provin din mprtierea caracteristic
intrinsec a organitelor celulare [17] n timp ce n interiorul celulelor tratate cu nanoparticule
apare o mprtiere puternic sub forma unor puncte glbui-portocalii care n mod evident
confirm internalizarea AuNPs@gelatin i AuNPs@citrat n OBL.

Figure 4.1. Imaginile de microsopie n cmp ntunecat ale A. celulelor OBL control netratate i
tratate cu B. AuNPs@gelatin i C. AuNPs@citrate. Scala indic 50 m.
n microscopia n cmp ntunecat se observ o diferen semnificativ ntre nternalizarea
AuNPs@citrat ncrcate negativ (-31.51.8 mV) i AuNPs@gelatin ncrcate pozitiv (+ 271.2
mV) cel mai probabil datorit interaciunii electrostatice ale nanoparticulelor cu membrana
celulara exterior care este n general ncrcat negativ. n plus, n cazul celulelor tratate cu
AuNPs@citrat, spre deosebire de celulele tratate cu AuNPs@gelatin, poate fi observat pe
substrat o cantitate mare de AuNPs@citrat agregate, sugernd o stabilitate redus a acestora n
absena unui strat protector la suprafa. Spectrele de mprtierea Rayleigh colectate din
interiorul celulelor tratate cu aceeai concentraie de AuNPs@gelatin i AuNPs@citrat confirm
aceast observaie, dovedind stabilitatea AuNPs@gelatin, care prezint spectrul lor tipic n timp
ce AuNPs@citrat prezint o band larg, deplasat spre rou, caracteristic spectrului
nanoparticulelor agregate.

18

Pentru o investigare mai exact a AuNPs internalizate, am utilizat microscopia DIC,


deoarece aceasta permite secionarea optic a unei celule cu mare precizie, oferind o imagine
complex att a organitelor celulare ct i a AuNPs internalizate.

Figure 4.2. Imaginile DIC ale celulelor OBL tratate cu AuNPs@gelatin pentru 24 ore
colectate de la diferite adncimi (A) - (F) Z=3-8 m
Imagistica celulelor OBL tratate cu AuNPs@gelatin prin focalizarea n diferite planuri
ale celulei n direcia Z (Figura 4.2) dezvluie localizarea AuNPs n ntreaga regiune
citoplasmatic la toate adncimile n celule. Imagini DIC confirm rezultatul microsopiei n cmp
ntunecat, indicnd localizarea AuNPs exclusiv n afara nucleului.
4.2. Efectul nanoparticulelor asupra proliferrii celulelor osteoblast
n continuare am investigat biocompatibilitatea/citotoxicitatea AuNPs@gelatin,
AuNPs@citrat i a biopolimerului gelatin in vitro folosind testul de citotoxicitate MTT asupra
celulelor osteoblast tratate. Celulele au fost expuse la diferite concentraiile de AuNPs@gelatin,
AuNPs@citrat i biopolimer gelatin (1-100 g/ml) timp de 24, 48 i respectiv 72 ore.
Dup cum se poate observa n Figura 4.3, celulele OBL tratate prezint o viabilitate
excelent, AuNPs@gelatin nu prezint efecte toxice la concentraii ridicate de nanoparticule i
nu inhib proliferarea. n schimb, probele tratate cu AuNPs@gelatin prezint rate mbuntite
de cretere i proliferare a celulelor comparativ cu celulele tratate cu AuNPs@citrat sau gelatin,
raportat la probele de control netratate. Proliferarea osteoblastelor a fost promovat progresiv n
prezena concentraiilor mai mari de nanoparticule (50-100 g/ml) chiar i la o expunere pe
termen lung (72 ore).
Prezena AuNPs stimuleaz creterea i proliferarea celulelor prin stingerea radicalilor
liberi formai n timpul creterii celulare i actioneaz ca ageni antioxidani. Mai mult dect att,
presupunem c celulele tratate cu AuNPs@gelatin prezint o rat crescut de proliferare datorit
efectului sinergic dintre AuNPs i stratul de gelatin care acoper suprafaa metalic.
19

Figure 4.3. Viabilitatea celulelor OBL tratate cu diferite concentraii de AuNPs@gelatin,


AuNPs@citrate i gelatin pentru (*) 24, (**) 48, i (***) 72 ore investigat prin testul MTT.
4.3. Efectul nanoparticulelor de aur asupra diferenierii celulelor osteoblast
Celulele OBL trarate cu AuNPs@gelatin prezint o proliferare remarcabil i mai
interesant un prim semn de difereniere cu formare de noduli osoi care dezvluie efectul
osteogenic al acestora (Figura 4.4.A).

Figure 4.4. A. Imaginea de microscopie n cmp ntunecat a celulelor OBL tratate cu


AuNPs@gelatin care prezint un prim semn de difereniere cu formare de noduli osoi. Scala
arat 50 m. B. Efectul dependent de doz al AuNPs@gelatin i AuNP@citrat asupra activitii
ALP a celulelor OBL dup 72 ore tratament.
Diferenierea osteoblatilor este un aspect esenial al formrii i remodelrii osoase, prin
urmare, efectul AuNPs@gelatin asupra diferenierii OBL a fost investigat prin analiza activitii
fosfatazei alcaline (ALP), de vreme ce apariia activitii ALP este un marker fenotipic timpuriu
al diferenierii osteoblatilor [18]. Activitatea ALP prezentat de celulele OBL tratate timp de 72
ore cu AuNPs@gelatin este semnificativ mai mare dect cea a celulelor tratate cu
AuNPs@citrat, n special la concentraii mai mari, adic 50, 100 g/ml. Ca i n cazul proliferrii
celulelor, tratamentul celulelor cu biopolimerul gelatin (100 g/ml) are un efect mai mic asupra
activitii ALP raportat la celulele tratate cu aceeai concentraie de AuNPs@gelatin.
20

Expresia proteinei fosfataz alcalin a fost de asemenea investigat prin colorarea


imunocitochimic a celulelor OBL tratate cu 100 g/ml AuNPs@gelatin. Tripla colorare (Figura
4.5) permite observarea adeziunii celulelor OBL i procesul de rspndire marcat de organizarea
fibrelor de actina-F (colorate rou cu faloidin TRITC), nucleelor celulare (colorate albastru cu
DAPI) i expresia ALP evideniat prin colorare verde cu FITC. Aceste rezultate sunt n
concordan cu rezultatele MTT i confirm nc o dat proliferarea i diferenierea osteoblatilor
n prezena concentraiilor mai mari de AuNPs@gelatin.

Figure 4.5. Imaginile de fluorescen reprezentnd activitatea fosfatazei alcaline (ALP)


A. fibrele de actin-F sunt vizualizate aplicnd coloraia cu faloidin-TRITC (rou). B. Nucleii
celulelor sunt vizualizai aplicnd coloraia DAPI (albastru) C. expresia proteinei ALP este
evideniat prin coloraia vrede cu FITC D. Imaginile suprapuse A., B. i C. Scala arat 50 m.
Prin urmare AuNPs@gelatin n afar de proprietile intrinseci plasmonice deosebite
care faciliteaz imagistica celular pot deveni promitoare n medicina regenerativ datorit
amplificrii creterii, proliferrii i diferenierii celulare.

21

Capitolul 5
Realizarea i validarea in vitro a unui nou sistem chimioterapeutic cu
eliberare controlat pH a agentului terapeutic Doxorubicin
5.1. Caracterizarea nano-sistemului chimioterapeutic
Nano-sistemele chimioterapeutice au fost realizate ntr-o singur etap prin amestecarea
soluiilor de doxorubicin (DOX) la pH 5.5 i pH 10.5 cu o soluie coloidal purificat
AuNPs@gelatin ntr-o concentraie final de 230 M medicament. Ulterior, am notat ca
5.5DOX-AuNPs@gelatin i 10.5DOX-AuNPs@gelatin sistemele preparate n prezena soluiei
DOX la pH 5.5 i respectiv pH 10.5.

Figure 5.1. a) Spectrul de absorbie al DOX la A. pH 5.5 i B. pH 10.5; Spectrul de extincie al


b) AuNPs@gelatin biosintetizate, c) DOX-AuNPs@gelatin imediat dup amestecul lor i d)
dup 24 ore incubare. Inserturi: spectrul normalizat al b) AuNPs@gelatin,
DOX-AuNPs@gelatin c) la momentul iniial i d) dup incubare.
Spectrul de absorbie al DOX la pH 5,5 arat dou benzi majore centrate la 290 i 485 nm,
care corespund tranziiilor polarizate * de-a lungul axei scurte i respectiv lungi a moleculei
DOX [19]. Banda principal de la 485 nm (Figura 5.1.A spectrul a) este foarte sensibil la
modificrile aprute n structura moleculei i prin urmare, la pH alcalin i n prezena
AuNPs@gelatin (Figura 5.1.A i B) aceast band este deplasat spre lungimi de und mai mari
i reflect interaciunea, ncrcarea medicamentelor i formarea complexelor 5.5DOXAuNPs@gelatin i 10DOX-AuNPs@gelatin la pH 5.5 i respectiv pH 10.5. Pentru a asigura un
timp suficient pentru interaciune, medicamentul i AuNPs au fost incubate la temperatura
camerei timp de 24 ore.
Rezultatul LSPR (Figura 5.1) nu este surprinztor avnd n vedere c n condiii puin
acide (pH 5.5), moleculele DOX sunt aproape complet protonate i interacioneaz doar cu
22

puinele grupri carboxil ale stratului de gelatin de la suprafaa nanoparticulelor, ncrcate


negativ. Pe de alt parte, n mediu alcalin la pH 10.5, moleculele DOX sunt deprotonate, posed o
sarcin negativ confirmat de valoare potenial de -34.92.4 mV care promoveaz
interaciunea electrostatic cu stratul de gelatin de pe suprafaa AuNPs, ncrcat pozitiv. Mai
mult dect att, valoarea potenial pozitiv al AuNPs@gelatin (+27.721.2 mV) care provine de
la gruprile amino ale gelatinei trece la o valoare negativ de -24.50.8 mV dup interaciunea cu
DOX la pH 10.5, ceea ce confirm nc o dat ncrcarea mai eficient a medicamentelor n
mediu alcalin.
Cu scopul de a evalua calitatea sistemelor chimioterapeutice create, am calculat c doar
aproximativ 19% din totalul DOX a fost ncrcat pe AuNPs@gelatin n condiii acide, n timp ce
o ncrcare mult mai mare de ~ 70% DOX a fost realizat la pH 10.5. Prin urmare, deoarece
eficiena de ncrcare n mediul alcalin este semnificativ mai mare dect n condiii acide, n
studiile ulterioare vom investiga doar sistemul chimioterapeutic cu un coninut mai ridicat de
DOX, produs la pH 10,5, denumit simplu DOX-AuNPs@gelatin.

Figure 5.2. A. Spectrul LSPR al a) AuNPs@gelatin i b) al nano-sistemului chimioterapeutic


DOX-AuNPs@gelatin i B. spectrul LSPR al DOX-AuNPs@gelatin a) n apa ultrapur i b) la
temperatura fiziologic de 37 C n soluie 0.9% NaCl.
Avnd n vedere validarea nano-sistemului chimioterapeutic n studii celulare, dup
incubarea la temperatura camerei timp de 24 ore, complexul a fost purificat prin centrifugare
(8.000 rpm timp de 10 min) pentru a ndeprta medicamentul nelegat i apoi redispersat n ap
ultrapur. Complexul DOX-AuNPs@gelatin prezint o uoar deplasare a benzii LSPR spre
rou (3 nm), comparativ cu AuNPs@gelatin simple (Figura 5.2.A), fr alte modificri optice
ceea ce sugereaz stabilitatea i ncrcarea cu succes a AuNPs. Mai mult dect att, stabilitatea
DOX-AuNPs@gelatin a fost dovedit n condiii fiziologice simulate n soluie 0,9% NaCl i la
37 C (Figura 5.2.B).

23

5.2. Eliberarea DOX din nano-sistemul chimioterapeutic


Capacitatea pH-responsiv a nano-sistemului

nostru

chimioterapeutic

DOX-

AuNPs@gelatin a fost evaluat la pH 7.4, 5.3 i respectiv 4.6, pentru a imita att pH-ul
fiziologic i ct i mediul acid al organitelor celulare i al esutului tumoral. Pentru aceasta, o
cantitate mic de nanoparticule ncrcate cu medicament a fost expus la diferite soluii tampon i
meninute sub agitare blnd la 37 C. Cantitatea de DOX eliberat a fost msurat din emisia de
fluorescen a mediului de eliberare la intervale de timp predeterminate. Emisia fluorescent la
593 nm a fost nregistrat prin excitare la 485 nm i reprezentat grafic n funcie de timp pentru
a genera un profil de eliberare. Figura 5.3.A arat c rata i cantitatea de DOX eliberat din
DOX-AuNPs@gelatin sunt extrem de dependente de pH-ul mediului.

Figure 5.3. A. Efectul pH-ului asupra eliberrii DOX din AuNPs@gelatin la 37 C, B. emisia
de fluorescen a DOX recuperat dup 24 ore incubare n soluii tampon la a) pH 7.4, b) pH 5.3
i pH 4.6 i C. Efectul temperaturii asupra ratei de eliberare a DOX la pH 4.6.
Mai exact, dup 24 ore cantitatea de DOX eliberat cumulativ atinge aproximativ 80% la
pH 4.6, care este aproape de valoarea pH-ului tumorilor i numai 25% la pH 7,4, indicnd o
eliberare minim la pH fiziologic (Figura 5.3.A, B).
n continuare, pentru un anumit pH 4.6 impactul temperaturii asupra eliberrii DOX a
fost investigat n continuare la trei temperaturi diferite i anume temperatura camerei 22 C,
temperatura fiziologic 37 C i temperatura de hipertermie 45 C. Curbele de eliberare sunt
prezentate n Figura 5.3.C. Comparativ cu eliberarea la 22 C, se poate observa cu claritate c o
temperatur mai ridicat impune o eliberare mai rapid a DOX (Figura 5.3.C). Acest
comportament poate fi atribuit cu siguran componentei gelatin a nano-sistemului
chimioterapeutic, care permite o eliberare a DOX rapid la 37 C i 45 C, datorit dependenei
de temperatur a structurii conformaionale a acesteia, capabil s creasc mobilitatea local n
reeaua sa pe msur ce crete temperatura.
5.3. Efectul nano-sistemului chimioterapeutic asupra liniei celulare de cancer de sn MCF-7
5.3.1. nglobarea DOX-AuNPs@gelatin de ctre celulele MCF-7
Figura 5.4 prezint imaginile de microscopie n cmp ntunecat ale celulelor control
netratate i ale celulelor tratate cu DOX-AuNPs@gelatin timp de 1 or i respectiv 24 ore.
24

n celulele control apar unele puncte albstrui datorit mprtierii caracteristice intrinseci
a organitelor celulare (Figura 5.4.A) [17]. Dup 1 or de tratament, celulele prezint o mprtiere
limitat a luminii provenind din organitele celulare i din cteva AuNPs@gelatin ncrcate ce
pot fi observate mai ales pe membrana celular (Figure 5.4.B). Contrar, dup 24 ore din celulele
tratate apare o mpratiere puternic care prezint multe puncte luminoase portocaliu-roiatic
stralucitoare situate la nivel citosolic, n afara de nucleilor.

Figure 5.4. Imaginile n cmp ntunecat ale celulelor MCF-7 A. control netratate i tratate cu
DOX-AuNPs@gelatin timp de B. 1 or i respectiv C. 24 ore.
Este plauzibil ca nanoparticulele s penetreze membrana celulelor printr-un proces
cunoscut sub numele de endocitoz i s fie situate n interiorul veziculelor endocitotice, dar n
afara nucleelor. Petele strlucitoare observate confirm ntr-adevr internalizarea DOXAuNPs@gelatin n celulele MCF-7.
5.3.2. Eliberarea intracelular a DOX din AuNPs@gelatin

Figure 5.5. Imaginile de fluorescen ale celulelor tratate cu DOX-AuNPs@gelatin timp de


A. 1 or, B. 3 ore i C. 24 ore, i celulele tratate cu DOX timp de D. 1 or, E. 3 ore i F. 24 ore,
care arat localizarea DOX liber i DOX eliberat intracelular la diferite interval de timp.
25

Microscopia de fluorescen evideniaz diferene remarcabile n tiparul internalizrii


DOX libere sau ncrcat pe AuNPs@gelatin, aa cum se poate vedea comparnd Figura 5.5 A,
B, C i Figura 5.5 D, E, F. Semnalul de fluorescen din celulele tratate cu DOX liber apare
dup doar 1 or de tratament de vreme ce moleculele libere difuzeaz prin membrana celular i
devine tot mai puternic n timp datorit acumulrii medicamentului, care este aproape n
exclusivitate nuclear.
n contrast, celulele tratate cu DOX-AuNPs@gelatin timp de 1 or (Figura 5.5.A) nu
arat nici un semnal, n timp ce dup 3 ore se poate observa un semnal foarte slab. Dup 1 or de
incubare, nanoparticule de aur ncrcate cu medicamente nu au fost internalizate, cum cum arat
microsopia n cmp ntunecat. n schimb, la 3 ore dup incubare, unele AuNPs ncrcate cu
medicament au ptruns prin membrana celulelor prin endocitoz i poate fi observat o uoar
fluorescen roie provenit de la molecule DOX. Aceasta indic localizarea nano-sistemului
chimioterapeutic n interiorul celulelor, n compartimentele endocitare, unde ncepe eliberarea
medicamentului, declanat de pH-ul acid. Aici medicamentul se afl n dou stri: ataat la
suprafaa metalic i situat n stratul biopolimeric. Cu toate acestea, n acest moment, cele mai
multe molecule DOX sunt nc n imediata apropiere a suprafeei AuNPs avnd fluorescen
stins. Judecnd dup intensitatea fluorescenei DOX putem deduce distribuia medicamentelor n
celul avnd n vedere c DOX eliberat migreaz spre nucleu pentru a se lega de ADN. De
aceea, dup 24 de ore de tratament (Figura 5.5.C), intensitatea semnalului de fluorescen a DOX
eliberate a crescut, indicnd eliberarea continu a acesteia. DOX eliberat este rspndit n
principal prin ntreaga citoplasm dar un semnal de fluorescen poate fi observat n nucleul
celulelor, provenit de la DOX difuzat care a ajuns la nucleu.

Figure 5.6. Imaginile de fluorescen ale celulelor tratate cu DOX-AuNPs@gelatin i DOX


liber pentru 48 h, care evideniaz internalizarea diferit n nucleu a A. DOX eliberat
intracelular i D. DOX libere; B., E. nucleii colorai cu DAPI i C., E. imaginile suprapuse
26

Figura 5.6 arat distribuia DOX n celulele MCF-7 tratate timp de 48 de ore, fie cu DOX
liber sau DOX ncrcat pe AuNPs@gelatin, care corelate cu datele anterioare confirm
internalizarea i acumularea diferit a medicamentului. Celulele tratate cu DOX liber prezint
semnal de fluorescenta numai din nuclee, aa cum protocol de coloie DAPI confirm. n
contrast, celulele tratate cu nano-sistemul chimioterapeutic DOX-AuNPs@gelatin prezint un
semnal de fluorescen puternic n nuclee i un semnal slab n citoplasm. Cu toate acestea, n
comparaie cu celulele tratate timp de 24 de ore, raportul semnalului DOX n citoplasm/nuclee
este modificat dramatic, un semnal DOX mai intens fiind n nuclee. Aceast observaie dovedete
eliberarea n funcie de timp a medicamnetului dup un process mai lent de interaciune ntre
DOX-AuNPs@gelatin i celule, care conduce la o eliberare susinut a medicamentului, difuzia
i acumularea ulterioar a DOX n nucleele celulare.
Apoi, microscopia rezolvat temporar (FLIM) a fost folosit pentru vizualizarea asimilrii
DOX libere sau ncrcate pe AuNPs n celule, avnd n vedere c FLIM este foarte sensibil chiar
i la modificrile minore care apar n timpul de via al moleculelor. ns, mai nti a fost
investigat timpul de via fluorescent al DOX libere i ncrcat pe AuNPs@gelatin, n soluie.
A fost nregistrat o curb monoexponential a timpului de via cu o valoare de 1.0 ns din
soluia de DOX liber, iar o durat de via medie de 1.9 ns a fost determinat dup ncrcarea
DOX pe AuNPs@gelatin, datorat stratului de gelatin care protejeaz moleculele de
medicament mpotriva posibililor oxidani. Aceste diferene ntre timpul de via n soluie al
DOX ne permit s utilizm FLIM pentru a monitoriza n continuare eliberarea in vitro a DOX din
AuNPs@gelatin.

Figure 5.7. A. Imaginea FLIM a celulelor MCF-7 tratate cu DOX liber pentru 3 ore. Legenda
culorii prezint timpul de viat corespunzator ce variaz de la 1 ns la 5 ns. B. histograma
corespunztoare timpului de via al DOX n nucleul celulei i citoplasm
Ulterior, FLIM a fost efectuat pe celule MCF-7 de cancer mamar tratate cu DOX n stare
liber i DOX-AuNPs@gelatin pentru diferite perioade de timp (1, 3, 24 i 48 de ore). Figura
5.7.A prezint distribuia duratei de via fluorescent a DOX libere n celule MCF-7, dup 3 ore
de incubare. Mai exact, am observat c semnalul de fluorescen este aproape n ntregime
27

nuclear cu o valoare a timpului de via crescut de 1.6 ns (fa de timpul de via n soluie)
(Figura 5.7.A) atribuit intercalrii DOX-ADN [20], mpreun cu un semnal citoplasmatic slab cu
o valoare a timpului de via de 2.4 ns (Figura 5.7.B). La 48 de ore post-tratament, toate
moleculele libere DOX au migrat spre nucleii celulelor iar distribuia semnalului DOX de
fluorescen este exclusiv nuclear.
n cazul celulelor tratate cu DOX-AuNPs@gelatin, nu se poate detecta nici un semnal de
via dup o or de tratament. Dup acest timp, curbele semnalului citoplasmatic din celulele
tratate timp de 3 ore sunt bi-exponeniale, cu o durat de via medie de 4.2 ns. Curbele constau
dintr-o component a timpului de via lung corespunztor DOX ncrcate i o component
scurt, rapid atribuit medicamentului eliberat.

Figure 5.8. A. Valorile componentelor scurte i lungi din citoplasma celulelor tratate cu
DOX-AuNPs@gelatin pentru 3 ore, 24 ore i respective 48 ore. B. Curbele nregistrate din
celulele MCF-7 tratate cu DOX-AuNPs@gelatin la diferite interval de timp
Cu toate acestea, n urmtoarele cteva ore, componenta timpului de via citoplasmatic
lung (2) a fost redus oarecum de la ~ 62% la ~ 30% n favoarea componentei rapide (Figura
5.7). Pe de alt parte, celulele tratate timp de 24 i 48 de ore ilustreaz dou zone bine definite
care corespund nucleului i citoplasmei celulei (Figura 5.8). Dup 48 de ore de tratament,
raportul dintre timpul de via fluorescent variaz n citoplasm invers proporional cu durata
tratamentului, avnd n vedere c componenta timpului de via lent continu s scad n timp
ntruct crete componenta timpului de via rapid. Tendina observat reflect evident eliberarea
DOX din AuNPs@gelatin avnd n vedere faptul c componenta timpului de via scurt de 1.2
ns (atribuit DOX eliberate) crete n timp.
n paralel, aa cum am menionat anterior, nano-sistemul DOX-AuNPs@gelatin
ptrunde nti n celule, este localizat n organitele celulare acide unde este declanat eliberarea
medicamentului iar apoi medicamentul liber migreaz n nucleu unde se acumuleaz i se leag
de lanurile ADN. Intercalarea cu ADN-ul este confirmat de creterea timpului de via a DOX

28

la 2.4 ns n interiorul nucleelor dup 48 de ore de tratament. Prin urmare, am dovedit nc o dat
internalizarea celular pe ci diferite a DOX i DOX-AuNPs@gelatin folosind FLIM.

Figure 5.9. A. Imaginile FLIM ale celulelor tratate cu DOX-AuNPs@gelatin pentru 48


ore. Legenda culorii prezint timpul de viat corespunztor ce variaz de la 0 ns la 5 ns.
B. histograma corespunztoare timpului de via al DOX n nucleul celulei i citoplasm
Dei internalizarea DOX-AuNPs@gelatin n celule a fost demonstrat clar prin imaginile
de microscopie n cmp ntunecat, n urmtorul experiment am examinat dac poate fi colectat un
semnal amplificat Raman din celule i dac nanoparticulele pot fi utilizate ca ageni de contrast
pentru imagistica SERS intracelular.

Figure 5.10. A. Imaginea optic a celulei MCF-7 tratat cu DOX-AuNPs@gelatin 24 ore,


B. harta SERS a aceleiai celule, C. spectrul SERS colectat din diferite puncte ale celulei tratate
Figura 5.10 prezint harta SERS bidimensional a unei celule MCF-7 selectat incubat
cu DOX-AuNPs@gelatin timp de 24 ore. Imaginea spectral univariat n Figura 5.10.B.
obinut prin reprezentarea grafic a intensitii SERS n intervalul spectral de 600-1700 cm-1 se
aseamn ndeaproape cu structura celular vizualizat n imaginea microscopic n cmp
luminos (Figura 5.10.A). Punctele luminoase din imagine A. pot fi atribuite nanoparticulelor
metalice, cunoscute ca surse de mprtiere puternic a luminii n raport cu lumina de fundal
29

mprtiat de structurile subcelulare precum nucleul i mitocondriile. Figura 5.10.C. spectrul a.


i b. ilustreaz dou spectre SERS reprezentative nregistrate din locaii diferite n interiorul unei
singure celule MCF-7 incubate cu DOX-AuNPs@gelatin. Pentru comparaie, spectrele Raman
ale celulei MCF-7 i ale DOX solide sunt de asemenea prezentate n spectre c. i d. din aceeai
figur. Majoritatea benzilor vibraionale colectate n prezena DOX-AuNPs@gelatin, pot fi
atribuite semnalului Raman amplificat al componentelor celulare (spectrul a. din Figura 5.10.C
corespunztoare punctului a. n Figura 5.10.A). Este evident faptul c anumite benzi vibraionale
apar deplasate i avnd raportul intensitilor modificat n comparaie cu benzile Raman obinuite
(Figura 5.10.C. spectrelor a, b i d) datorit orientrii gruprilor biochimice relativ la suprafaa
metalic. Presupunem c AuNPs@gelatin agreg n interiorul celulelor datorit nveliului de
gelatin care este digerat de matricea metaloproteinazelor (MMP) secretat de celulele MCF-7
canceroase [21]. Prin urmare este favorizat formarea unor puncte fierbini ntre nanoparticulele
interconectate, puncte care sporesc semnificativ semnalul Raman al moleculelor biologice care
vin n imediata apropiere a acestora. Cu toate acestea, amplificarea SERS nu este limitat doar la
constituenii celulari din vecintatea nanoparticulelor ci este, de asemenea, resimit i de
moleculele DOX. Din regiunile fr nanoparticule nu s-a putut detecta nici un semnal Raman
(spectru b n figura 5.10.C corespunztoare locului b din figura 5.10.A)
5.3.3. Citotoxicitatea in vitro a nano-sistemului chimioterapeutic DOX-AuNPs@gelatin
In acest studiu, testul MTT a fost realizat pentru a testa citotoxicitatea DOX liber i
DOX ncrcat pe AuNPs@gelatin.

Figure 5.11. Viabilitatea celulelor MCF-7 tratete cu DOX and DOX-AuNPs@gelatin la


o concentratie final de medicament de 5 g/ml pentru 24 i 48 ore, mpreun cu celulele control
netratate i tratate cu AuNPs@gelatin, investigat prin testul MTT
Figura 5.11 prezint viabilitatea celulelor MCF-7 dependent de timpul tratamentului cu
DOX liber, AuNPs@gelatin i DOX-AuNPs@gelatin. Dup cum se poate observa, dup
tratamentul cu AuNPs@gelatin celule prezint o viabilitate excelent comparativ cu celulele
control netratate, ceea ce sugereaz faptul c nu au efect toxic. n schimb, dup tratamentul
30

chimioterapeutic cu DOX liber i DOX-AuNPs@gelatin ntr-o concentraie final de


medicament de 5 g/ml, concentraia inhibitorie (IC50) a DOX libere, viabilitatea celulelor a
sczut considerabil ntr-o manier dependent de timpul tratamentului.
Nu este surprinztor faptul c DOX liber prezint o citotoxicitate mai mare dect DOXAuNPs@gelatin, avnd n vedere cile diferite de internalizare ale acestora. AuNPs@gelatin
elibereaz lent i susinut DOX dup internalizarea n celule i numai atunci, DOX eliberat
difuzeaz spre nuclee n timp ce DOX liber ptrunde direct n membrana celulelor i difuzeaz
n nuclee, aa cum am artat anterior. Prin urmare, o citotoxicitate ridicat a nano-sistemului
chimioterapeutic DOX-AuNPs@gelatin in vitro este un alt indicator al eliberrii eficiente a
DOX.

Capitolul 6
Concluzii finale i perspective

Am stabilizat i funcionalizat nanoparticulele de aur standard acoperite cu citrat folosind


biopolimerul gelatin

Am sintetizat nanoparticule de aur cu diferite forme i dimensiuni folosind gelatina


Am demonstrat c AuNPs biosintetizate cu gelatin amplific proliferarea i diferenierea
celulelor Osteoblast

Am proiectat, fabricat i validat in vitro un nou nano-sistem chimioterapeutic bazat pe


AuNPs biosintetizate cu gelatin i medicamentul convenional Doxorubicin

Partea III
Anexe
O parte din echipamentele folosite n studiile mele sunt descrise n aceast parte.
References
[1] R. Asthana, A. Kumar, N.B. Dahotre, Butterworth-Heinemann, 2006.
[2] S. Krol, R. Macrez, F. Docagne, G. Defer, S. Laurent, M. Rahman, et al., Chem. Rev. 113 (2013) 18771903.
[3] J.L. Vivero-Escoto, Y.-T. Huang, Int. J. Mol. Sci. 12 (2011) 38883927. doi:10.3390/ijms12063888.
[4] W. Cai, T. Gao, H. Hong, J. Sun, Nanotechnol. Sci. Appl. 2008 (2008).
[5] M. Potara, D. Maniu, S. Astilean, Nanotechnology. 20 (2009) 315602.
[6] L. Dykman, N. Khlebtsov, Chem. Soc. Rev. 41 (2012) 22562282.
[7] L.A. Dykman, N.G. Khlebtsov, Acta Naturae. 3 (2011) 3455.
[8] A. Shalviri, G. Raval, P. Prasad, C. Chan, Q. Liu, et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 82 (2012) 587597.
31

[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
[14]
[15]
[16]
[17]
[18]
[19]
[20]
[21]

H.H. Mantsch, D. Chapman, Wiley-Liss, New York, 1996.


A.M. Gabudean, M. Focsan, S. Astilean, J. Phys. Chem. C. 116 (2012) 1224012249.
M. Potara, M. Baia, C. Farcau, S. Astilean, Nanotechnology. 23 (2012) 055501
A. Miranda, E. Malheiro, E. Skiba, P. Quaresma, P.A. Carvalho, et al., Nanoscale. 2 (2010) 22092216.
W. Wu, J. Huang, L. Wu, D. Sun, L. Lin, Y. Zhou, et al., Sep. Purif. Technol. 106 (2013) 117122.
V.H. Segtnan, T. Isaksson, Food Hydrocoll. 18 (2004) 111.
N.G. Parker, M.J.W. Povey, Food Hydrocoll. 26 (2012) 99107.
E. van den Bosch, C. Gielens, Int. J. Biol. Macromol. 32 (2003) 129138.
D. Watson, N. Hagen, J. Diver, P. Marchand, M. Chachisvilis, Biophys. J. 87 (2004) 12981306.
D. Liu, J. Zhang, C. Yi, M. Yang, Chin. Sci. Bull. 55 (2010) 10131019.
M.M. Fiallo, H. Tayeb, A. Suarato, A. Garnier-Suillerot, J. Pharm. Sci. 87 (1998) 967975.
J.S. Basuki, H.T.T. Duong, A. Macmillan, R.B. Erlich, L. Esser, et al., ACS Nano. 7 (2013) 1017510189.
J.-H. Xu, F.-P. Gao, L.-L. Li, H.L. Ma, et al., Microporous Mesoporous Mater. 182 (2013) 165172.

32