Capitolul 11

11
TEHNOLOGIA
ADN RECOMBINANT
Descifrnd enigmele structurii genelor, savanii au
nceput s se preocupe de izolarea i sinteza lor. n urm cu 30
de ani cei care credeau n reuita acestor deziderate erau puini i
nimeni nu bnuia explozia actual a ingineriei genetice i
consecinele cu adevrat extraordinare pe care le va avea.
Primii pai au fost fcui de Beckwith i Shapiro, care n
1969 au izolat i fotografiat operonul lactozei. Un an mai trziu
G. Khorana reuete sinteza artificial a primelor gene de
procariote. Cu aceeai tehnic se sintetizeaz gena ce codific
somatostatina un hormon hipofizar (1977). Dup descoperirea
transcriptazei inverse se reuete sinteza altor gene de mamifere
(pentru hemoglobin, ovalbumin, insulin etc.).
Genele
obinute nu erau ns active, deoarece nu aveau un sistem
propriu de replicare, nici secvenele necesare declanrii
transcripiei i apoi a sintezei proteinelor pe care le codific.
Aceste dificulti au fost depite, introducnd genele artificiale
n plasmidele unor bacterii sau virusuri. Pentru inseria genelor
n plasmide se folosesc enzime speciale care taie ADN n locuri
specifice enzime de restricie (Premiul Nobel, 1978).
Realizrile ingineriei genetice au un mare interes teoretic
i practic incontestabil. Izolarea sau sinteza genelor a dus la
obinerea artificial a unor produi naturali de mare valoare
(insulina, somatostatina, interferonul), dar speranele justificate
181

Capitolul 11

pe care savanii i le pun n acest domeniu sunt mult mai mari.

Nu este vorba numai de o nou industrie farmaceutic care s
produc antibiotice, hormoni, vaccinuri antivirale ci i de
posibilitile reale de a realiza o terapie cauzal terapie
genic, corectnd genele mutante sau nlocuindu-le i rezolvnd,
astfel, marea problem a incurabilitii bolilor genetice.
Actualmente exist toate posibilitile tehnice pentru
studierea direct sau indirect a acizilor nucleici purttori ai
mesajului ereditar. Gena de interes poate fi extras din
organism, supus unor modificri structurale, introdus n alt
organism, poate fi obinut produsul ei proteic. Toate procedeele
manipulrii acizilor nucleici se reunesc n termenul genetic
tehnica ADN recombinant.
Pentru studiul acizilor nucleici sunt necesare urmtoarele
procedee:
- extragerea i purificarea moleculelor de ADN (sau ARN)
din celule;
- izolarea fragmentului de ADN de interes;
- multiplicarea fragmentelor izolate;
- analiza secvenelor de interes (determinarea succesiunii
bazelor, determinarea expresiei, determinarea poziiei n
genom).
Izolarea acizilor nucleici
Pentru analiza ADN poate fi utilizat orice celul
nucleat, indiferent de esutul din care face parte (de ex., la om
pot fi folosite celulele dintr-o pictur de snge, din saliv, fire
de pr, esut epitelial, etc.).
Pentru izolarea fragmentelor de ADN se utilizeaz
metode biochimice care includ lizarea celulelor, denaturarea
proteinelor, nlturarea proteinelor prin prelucrarea cu proteaze,
centrifugarea difereniat, purificarea cu solveni organici.
182

Capitolul 11

Pentru izolarea unei anumite moleculele de ARNm se

utilizeaz celulele esuturilor n care are loc expresia genei
respective (de ex., ARNm pentru insulin poate fi izolat doar din
celulele ale pancreasului; ARNm pentru globine din celulele
eritroblatilor etc.).
Obinerea fragmentelor de interes
n ADN genomic secvenele codificatoare alterneaz cu
cele necodificatoare. Pentru izolarea fragmentului ADN de
interes pot fi aplicate dou ci:
- direct, prin clivarea enzimatic a moleculelor de ADN
genomic i selectarea fragmentelor de interes;
- indirect, prin obinerea ADN complementar (ADNc) pe baza
ARNm.
Restricia ADN
Clivarea enzimatic a moleculelor de ADN se efectueaz
cu ajutorul unor enzime de restricie (ER) care recunosc
secvene specifice dublucatenare, numite situsuri de restricie.

Fig. 11.1. Clivarea ADN cu enzime de restricie. Producerea

fragmentelor cu capete adezive i neadezive

183

Capitolul 11

ER sunt enzime ntlnite la procariote care, n natur,

sunt responsabile de clivarea ADN-ului exogen (de ex., ADN
virual). SR reprezint nite succesiuni specifice formate, de
regul, din 4-6-8 pb ce formeaz palindroame (fig. 11.1).
Secvenele respective n ADN-ul gazdei sunt metilate i nu pot
fi recunoscute de ER proprii.
Ca rezultat al aciunii diferitor ER se pot obine
fragmente de ADN cu capete monocatenare adezive (lipicioase)
sau cu capete neadezive.
ADN-ul din genomul eucariotelor (inclusiv genomul
uman) conine diferite SR dispersate la ntmplare de-a lungul
macromoleculei. Utiliznd ER pot fi obinute fragmente de
ADN cu lungimi diferite. Comparnd fragmentele de restricie
se poate construi harta de restricie a moleculei de ADN
localizarea SR pentru diferite restrictaze.
Sinteza ADNc
Din esuturi se izoleaz setul de ARNm specific. Pe baza
ARNm cu ajutorul reverstranscriptazei (ADN-polimerazaARN-dependent) se sintetizeaz molecule complementare de
ADN (ADNc). ADNc se deosebete de ADN genomic prin
lipsa intronilor i este identic cu secvena exonilor.
Sinteza ADN complementar include mai multe etape
(Fig. 11.2):
(1) izolarea ARNm;
(2) adugarea secvenelor oligo(dT) care servesc n calitate de
primer pentru polimerizare;
(3) enzima reverstranscriptaza sintetizeaz o caten
complementar de ADN pe baza matriei de ARN;
reverstranscriptaza formeaz o bucl la captul 3' al catenei
ADNc;
(4) hidroliza ARNm;
184

Capitolul 11

(5) sinteza catenei complementare a ADNc, bucla servind n

calitate de primer pentru ADN-polimeraz;
(6) nlturarea buclei cu ajutorul nucleazei S1.

Fig. 11.2. Obinerea ADNc

Clonarea ADN
Procesul de obinere a unui numr mare de copii a
secvenei ADN de interes cu utilizarea tehnicilor ADN
recombinant poart denumirea de clonare. Procesul poate fi
realizat att in vivo , ct i in vitro (PCR).
185

Capitolul 11

Clonarea ADN n vivo

Clonarea ADN n vivo const n izolarea unui fragment
de ADN, introducerea lui prin ligare ntr-un vector i
multiplicarea lui ntr-o celul gazd.
Vectorii de clonare sunt molecule de ADN care se
replic independent de cromozomul celular, chiar i atunci cnd
sunt introduse artificial n structura lor fragmente de ADN
strin. Pentru replicare vectorul are nevoie de dou elemente:
punctul ORI de iniiere a replicrii i gena pentru proteinele SSB
care pregtesc matria pentru replicare. n calitate de vectori se
utilizeaz plasmidele R, bacteriofagul , virusul simian SV-40,
cosmidele, cromozomii artificiali bacterieni (BAC), cromozomii
artificiali ai drojdiilor (YAC), etc. Selectarea vectorului de
clonare se face n funcie de dimensiunile fragmentului
multiplicat: fragmentele mici de pn la 15 kb pot fi clonate n
plasmide, fragmentele cu o lungime de pn la 50 kb n
cosmide i bacteriofagi, fragmentele mai mari de 300 kb pot fi
clonate n cromozomii artificiali BAC sau YAC.
n calitate de gazd de clonare sunt utilizate: celula
bacterian (pentru plasmide, cosmide, bacteriofagi, BAC),
celulele drojdiilor (pentru plasmide, YAC), celulele vegetale
(plasmide, virusuri), celulele animale (virusuri). Exist vectori
care se pot replica n mai multe gazde vectorii navet.
Moleculele hibride formate din ADN vector i ADN
pentru cercetare poart denumirea ADN recombinant. Obinerea
ADN recombinant necesit urmtoarele procese (fig. 11.3):
- izolarea ADN pentru clonare (o secven de ADN sau o
gen) i selecia vectorului de clonare;
- clivarea ADN de interes i a vectorului cu aceeai enzim de
restricie ce produce capete adezive;
- introducerea secvenei de ADN n vector prin ligarea
fragmentelor rezultate din digestia cu ER cu ajutorul enzimei
186

Capitolul 11

ADN-ligaza. ADN-ligaza unete complementar capetele

adezive ale fragmentelor prin legturi fosfodiesterice.

Fig. 11.3. Clonarea fragmentelor de ADN n vectori plasmidici

Moleculele recombinate se introduc n gazda de clonare.

Dup un anumit timp, datorit replicrii independente a
vectorului se obin copii numeroase ale genei de interes.
Moleculele recombinate sunt izolate din celula-gazd purificate,
dup care fragmentul de interes se extrage cu ajutorul aceleai
ER.
Clonele ADN obinute pot fi utilizate pentru
determinarea structurii primare, cartarea restrictiv, producerea
sondelor moleculare, analiza funciei genelor corespunztoare,
sinteza proteinelor solicitate (de ex., insulina, somatotropina,
interferonul etc.).

187

Capitolul 11

Amplificarea ADN in vitro

Reacia de polimerizare n lan (PCR Polimerase
Chain Reaction) reprezint tehnica de amplificare in vitro a
secvenelor de ADN aplicnd fenomenul de hibridare ADNADN i proprietatea de replicare semiconservativ. Hibridarea
se produce dup recunoaterea specific a unor fragmente
nucleotidice de pe o caten a ADN-ului de interes, de ctre nite
secvene scurte de ADN, numite primeri. Primerii iniiaz
sinteza catenelor complementare de ADN care se realizeaz cu o
ADN-polimeraz termorezistent (Taq-polimeraza).
PCR decurge prin succesiunea ciclic a urmtoarelor
etape (Fig. 11.4):
1. denaturarea ADN prin nclzire la o temperatur ~960C;
2. legarea primerilor la temperatura de renaturare ~500C;
3. elongarea fragmentelor complementare la temperatura
720C.
Aceste etape se repet de 25-35 ori. Produsele din ciclul
anterior servesc ca matrie pentru sinteza noilor catene (astfel n
I ciclu dintr-o molecul de ADN de interes se obin 2 molecule,
n ciclul II 4 molecule, n ciclul 3 8 molecule etc., dup 30
cicluri se obin peste 1 mlrd copii).
Biblioteci de ADN
Coleciile fragmentelor de ADN clonate dintr-o celul,
esut sau organism formeaz biblioteci de ADN. Acestea sunt
utile pentru identificarea genelor solicitate.
Biblioteca genomic
Colecia de clone ce conine cel puin o copie a fiecrei
secvene
de ADN al genomului se numete bibliotec
188

Capitolul 11

Fig. 11.4. Principiul PCR

189

Capitolul 11

genomic. O bibliotec genomic este util pentru a gsi i izola

o gen de interes prin screeningul cu sonde specifice.
Bibliotecile genomice se obin prin dou tehnici:
1. ADN genomic este digerat complet cu o enzim de
restricie, iar fragmentele rezultate sunt clonate fie printr-un
vector derivat din bacteriofagul , fie ntr-un vector cosmidic.
2. O alt cale este digestia parial cu ER, care recunosc
secvene de 4 pb. Prin digestie parial doar o parte din SR este
tiat de ER.
Biblioteci cromozomiale
Dimensiunea genomului uman este att de mare, nct
sunt necesare mii de clone pentru a reprezenta ntregul genom.
De aceea sunt obinute biblioteci ADN pentru fiecare cromozom
n parte biblioteci cromozomiale. Pentru om sunt necesare 24
de biblioteci diferite. Deci, dac o gen este localizat pe un
cromozom cunoscut cu metode genetice, cercetarea va fi limitat
la biblioteca acelui cromozom.
Izolarea cromozomilor este posibil datorit dimensiunii
i morfologiei diferite ale cromozomilor, care pot fi separai cu
ajutorul citometriei n flux. Acum sunt disponibile biblioteci
preparate din toi cromozomii umani.
Biblioteci de ADNc
Colecia de clone obinute pe baza ADN complementar
se numete bibliotec ADNc. Fiind sintetizat pe matria
moleculelor de ARNm, ADNc va corespunde numai genelor
aflate n stare de activitate transcripional, reproducnd doar
genele funcionale specifice celulei respective.
ADNc este
clonat n vectori plasmidici sau n vectori derivai din
bacteriofagul . Spre deosebire de fragmentele obinute prin
190

Capitolul 11

digestie cu ER, moleculele de ADNc nu posed capete adezive,

de aceea pentru introducerea n vector la moleculele de ADNc se
adaug adaptori care conin capete adezive.
Hibridarea acizilor nucleici
O proprietate natural a acizilor nucleici este capacitatea
de hibridizare. Hibridrile de acizi nucleici constau di unirea a
dou fragmente monocatenare n structuri bicatenare stabile n
condiii adecvate de temperatur, concentraie ionic i pH.
Hibridarea este condiionat de complementaritatea secvenelor
de baze azotate, componente ale celor dou catene. Din
complementaritate rezult i omologia de mperechere.
Tipuri de hibridare:
1. ADN ADN n care sonda este una dintre
monocatenele de ADN;
2. ARN ADN unde sonda este reprezentat de una din
cele dou catene ale heteroduplexului.
Una din cele mai importante aplicaii ale fenomenului de
hibridizare este obinerea
sondelor moleculare. Sondele
moleculare sunt fragmente de ADN sau ARN marcate sau nu
(radioactiv), care prin fenomenul de hibridare pot recunoate n
mod complementar fragmente de interes, pe o molecul de
acid nucleic destinat cercetrii.
Din punct de vedere aplicativ, sondele nucleare
reprezint cile de acces direct la nivelul ADN, acestea putnd
detecta unele gene mutante, chiar n stadiul prenatal.
Tipuri de sonde moleculare:
1. sonde calde marcate radioactiv cu izotopi de 32P sau 35S
care sunt foarte sensibile, dar au o durat scurt de via i
sunt periculoase pentru cei ce le manipuleaz; se
vizualizeaz prin autoradiografie (impresie pe filmul
fotografic);
191

Capitolul 11

2. sondele reci fragmente de acid nucleic, marcate cu un

produs chimic neutru: direct, cu enzime sau fluorocromi sau
indirect, cu biotin. Se vizualizeaz n funcie de tipul de
marcaj. Dei sunt mai puin sensibile, au avantajul de a fi
inofensive pentru cercettor.
Verificarea cunotinelor:
1. Definii noiunile: ADN recombinant, clonare, vector de
clonare, enzim de restricie, situs de restricie, ADNc,
bibliotec ADN, fragmente de restricie, sond molecular,
hibridare.
2. Care sunt etapele obinerii genei de interes dintr-o celul?
3. Ce proprieti au enzimele de restricie?
4. Ce vectori de clonare cunoatei? Prin ce se deosebesc?
5. Care sunt etapele obinerii ADNc?
6. Ce importan are clonarea ADN?
7. Care este destinaia bibliotecilor ADN?
8. n ce const hibridarea ADN?
9. n ce scopuri se utilizeaz sondele moleculare?

192