DIAGNOSTIC SEROLOGIC IN INFECTIA HIV/SIDA

1. Teste de triaj = sensibilitate inalta

Rol: sa testeze cat mai multi oameni si sa obtina toate cazurile +
Risc: rezultate fals +
Exemple: ELISA, teste rapide
2. Teste de confirmare = specificitate inalta
Elimina rezultatele fals + => raman doar bolnavii infectati
Exemple: WESTERN BLOT (specificitate aproape 100%), IF indirecta, RIPA
(radioimunoprecipitare)
!!!ELISA si WESTERN BLOT testeaza prezenta Ac!!!
ELISA - testeaza amestecuri de Ac! (Ac anti-HIV)
Tehnica indirecta
- placuta cu godeuri:
Se pun Ag care se fixeaza pe baza godeului
Se spala
Se pune serul pacientului (cu Ac)
Incubare 1h la 37o
Se spala pt eliminarea altor Ac care ar putea da legaturi nespecifice
Pentru vizualizarea complexelor Ag-Ac, se foloseste o enzima + Ac secundar (Ac
anti IgG uman) care se leaga de serul pacientului = CONJUGAT
Incubare 1h la 37o
Se spala
Adaugare substrat enzima - incubare substrat 20-30 min la temperatura camerei
Enzima degradeaza substratul => reactie de culoare a mediului de reactie
Daca nu se coloreaza mediul => negativ
Daca se coloreaza mediul => pozitiv
Citire DO la spectrofotometru, conectat la calculator
Valoarea prag = CUT OFF = MN + DS (=1)
DS= deviatia standard data de kit
!!obligatoriu martor + si !!zona gri = o zona sub prag in care nu se poate spune exact daca rezultatul e +
sau WESTERN BLOT - HIV prezinta diferite gene structurale care codifica
proteine(gag) sau GP (env); se testeaza Ac decelati (impartiti) pe grupe antigenice
(specifici)
1. ELECTROFOREZA (SDS PAGE)
Migrarea Ag dupa GM
Gelul este foarte subtire si toxic, migrarea se realizeaza vertical
2. BLOT (transfer)
Se muta Ag din gel pe membrana; se prinde intr-un aparat pe o membrana de
celoloza

3. Detectia Ac
Se pune serul pacientului => incubare => spalare
Se pun Ac legati de o enzima => incubare => spalare
Se observa benzile in care Ag s-a legat de Ac
M+ => verificare toate Ag sunt bune? => toate benzile vizibile
M- => nici o banda vizibila
Test pozitiv = 2 benzi pt GP (2 env) + 1 banda pt prot (1 gag)
Test indeterminat (3 luni-9 luni de la infectie) = persoana nu sintetizeaza inca Ac
=> se face PCR pt a detecta prezenta de ARN viral (apare primul)
Test negativ => ELISA a fost fals + => persoane e neinfectata
DIAGNOSTIC MOLECULAR IN INFECTIA HIV/SIDA
Se refera strict la AN (ADN, ARN)
Se face o determinare calitativa, cantitativa
Amplificare tinta
1. PCR
2. NASBA(nucleic acid sequence based amplification)
Amplificare semnal
1. b-DNA - branched DNA, tehnica pomului de Craciun
Foloseste sonde moleculare care se leaga de secventa tinta
Nu creste cantitatea de ADN, ci amplifica semnalul
PCR = pt virusurile ADN
Amplifica tinta
Etape:
1. DENATURARE - 92-94o
2. LEGARE PRIMER (secventa scurta de baze complementare cu secventa de interes)
- 52-54o; exista 2 primeri: sens si antisens - se leaga la capatul 3
3. EXTENSIE CATENE - Taq polimeraza (temperatura optima 72o) = ADN
polimeraza care insera noi nucleotide complementare la catena
Se fac 30-40 de cicluri pt ca la mai multe cicluri pot aparea mutatii ale
ampliconilor
Obtinem ampliconi: 2n catene ADN identice cu secventa tinta
Master mix = solutia de lucru in PCR = Taq polimeraza, primeri (forward,
reverse), nucleotide noi (dNTP), Mg si Mn (stabilizeaza catenele noi)
Solutia se pune la 90 si se etanseizeaza pt a nu se evapora
RT-PCR = reverstranscriere + PCR = pt virusurile ARN (HIV, VHC)
ARN - molecula instabila, distrusa la temperaturi crescute
Se realizeaza reverstranscrierea ARN cu obtinere de ADN complementar, care
apoi este amplificat

REAL TIME PCR

Se realizeaza detectia ampliconului in timpul reactiei
In virusologie se foloseste pt a detecta viremia (nr copii ADN sau ARN/ ml
plasma)
Materiale = cele de la PCR + sonde moleculare (secvente scurte de nucleotide
complementare cu secventa tinta)
Etape:
1. Denaturare
2. Atasare primer
Intre cei 2 primeri, pe secventa tinta se leaga sonde moleculare
La capatul sondei sunt legate 2 molecule: una fluorescenta (Reporter Dye) si una
care blocheaza fluorescenta (Quencher Dye)
ADN polimeraza Taq insera noi nucleotide, dar cand intalneste sonda moleculara
o desprinde => aceasta ramane in mediu si emite fluorescenta (nu mai este
blocata)
Se cuantifica fluorescenta din mediu cu un detector; fluorescenta e direct
proportionala cu nr de catene ADN/ARN
Aparatul este conectat la un calculator => grafic (curba de amplificare - se
realizeaza cand fluorescenta depaseste limita de detectie)
Determina: incarcarea virala din sangele pacientului, mutatii in gene umane,
genotipare
DETECTIA AMPLICONULUI
1. Detectia calitativa (este sau nu ADN)
Electroforeza in gel de agar
Colorare cu bromura de ethidiu
Comparare cu markeri de GM cunoscuta
In proba poate exista sau nu amplicon: nu s-a amplificat sau persoana nu e
infectata viral
2. Detectia cantitativa
Hibridizare cu sonde moleculare
Ampliconul este pus im contact cu sonde moleculare maracte cu o enzima
Daca s-a legat de ADN, enzima degradeaza susbtratul
Se masoara cu spectrofotometru cantitatea de ADN
GENOTIPAREA VIRALA
Stabileste profilul de rezistenta (pt eficienta tratamentului)
Ex: HIV - rezistenta la antiretrovirale
1. LIPA (Line Probe Assay)
Foloseste o banda de nitroceluloza alba pe care sunt fixate de producator sonde
moleculare specifice pt un anumit genotip
Banda se pune in contact cu AN de la pacient
Se pune un indicator de culoare astfel incat banda unde s-a legat sa devina
vizibila

 Sondele au specificitate pt regiunile conservate din cadrul genotipului

Evidentierea profilului specific unui genotip prezenta in amplicon....
Daca pacientul este infectat cu un genotip pentru care nu este banda, nu este
recunoscut
2. RFLP
Extragere de ADN viral, amplificare
Are 2 enzime de restrictie, care se leaga si cliveaza genomul viral
Electroforeza (se obtin benzi de GM diferita in functie de cate ori s-a clivat
genomul)
3. Secventierea nucleotidica pt ampliconi din diferite zone geografice
Extragere si amplificare ADN viral = PCR
Se face al 2-lea PCR cu nucleotide marcate cu fluorocrom pt fiecare tip de
nucleotida (A rosu, T verde)
Fiecare nucleotida trece printr-un capilar unde este citita, pe baza culorii emise
Pe calculator este refacuta structura secventei
Aplicatii:
Pt genom nou
Mutatii
Ex: HIV - stabilirea profilului de rezistenta
Studiu de molec pt stabilirea etiologiei virale
FEREASTRA SEROLOGICA = persoana nu a sintetizat inca Ac la un virus
Utilizarea metodelor moleculare in infectia HIV:
Fereastra serologica
Nou-nascutii din mame seropozitive HIV
Initierea si monitorizarea terapiei antiretrovirale
Iv>5-10 000 corelat cu nr CD4 si status clinic
Iv>30-50 000 indiferent de nr CD4 si status clinic
Monitorizarea: reducerea iv sub 50 de copii ARN HIV/ ml la 24 saptamani