Universidad autónoma de

Chiapas
Facultad de ciencias químicas
Campus IV

LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA

PRACTICA NO. 1

“antibiograma”

CATEDRATICO:

Q.F.B. LUIS HUMBERTO ROSALES FURUKAWA

ALUMNO:
RIOS ROQUE FABIOLA
PEREZ NUÑES NANCY KARINA
ESPINOSA MARTINEZ GLADIS GUADALUPE
GODINES CITALAN NOE
RODAS HERRERA MIGUEL ANGEL

SEMESTRE: 6° GRUPO:
“A”

TAPACHULA CHIAPAS A 05 DE MARZO DEL 2010

1
 MARCO TEORICO
El diagnóstico y tratamiento de un paciente son muy complejos.
Desde su llegada a un establecimiento de salud hasta el alta reciben
la prestación de muchos profesionales. Esto a su vez genera
diferentes procesos, siendo el laboratorio uno de los más importantes.
Para que los resultados de laboratorio sean útiles en el manejo del
paciente, debemos asegurar la confiabilidad y validez de éstos. Es
necesario entonces, asegurar el cumplimiento adecuado de todos los
pasos involucrados, desde la solicitud del tipo de examen y muestra,
su transporte, procesamiento, la emisión de un resultado, y la
adecuada interpretación de éste. De un examen solicitado y mal
orientado, se obtendrá una muestra inadecuada y por tanto una
información errada.

La resistencia bacteriana es un tema de importancia en la salud

pública. Su extensión a nivel mundial, desarrollo de resistencia a
nuevos agentes antimicrobianos, así como su presencia en patógenos
relacionados con enfermedades prevalentes, como son la enfermedad
diarreica aguda, las infecciones respiratorias agudas y las infecciones
intrahospitalarias, le dan el carácter de problema prioritario. Por ello,
el conocimiento de los perfiles de susceptibilidad
Antimicrobiana debe orientar a la elaboración de esquemas de
tratamiento más eficaces y además, la información proporcionada por
la vigilancia debe servir de insumo para la elaboración de un
programa de uso racional de antibióticos.
El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad de
una cepa bacteriana que se sospecha es la responsable de una
infección a uno o varios antibióticos. En efecto, la sensibilidad in vitro
es uno de los requisitos previos para la eficacia in vivo de un
tratamiento antibiótico. El antibiograma sirve, en primer lugar, para
orientar las decisiones terapéuticas individuales.
El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolución de
las resistencias bacterianas. Gracias a este seguimiento
epidemiológico, a escala de un servicio, un centro de atención
médica, una región o un país, es como puede adaptarse la
antibioterapia empírica, revisarse regularmente los espectros clínicos
de los antibióticos y adoptarse ciertas decisiones sanitarias, como el
establecimiento de programas de prevención en los hospitales.
¿Cuándo realizar un antibiograma?

Siempre que una toma bacteriológica de finalidad diagnóstica haya

permitido el aislamiento de una bacteria considerada responsable de
la infección.

2
Establecer esta responsabilidad exige una colaboración entre el
bacteriólogo y el clínico. En efecto, en ciertas circunstancias, el
microbiólogo no podrá determinar con certeza que el aislamiento de
una bacteria exige un antibiograma, sin los datos clínicos que le
aporta el médico. Por ejemplo, una bacteria no patógena puede ser
responsable de la infección de un enfermo inmunodeprimido o en un
lugar determinado del organismo. La presencia de signos clínicos
puede ser también determinante para la realización de un
antibiograma (por ejemplo: la infección urinaria con un número
reducido de gérmenes).

Sensibilidad bacteriana a los antibióticos

La determinación de la Concentración Inhibidora Mínima (CIM) es la

base de la medida de la sensibilidad de una bacteria a un
determinado antibiótico. La CIM se define como la menor
concentración de una gama de diluciones de antibiótico que provoca
una inhibición de cualquier crecimiento bacteriano visible. Es el valor
fundamental de referencia que permite establecer una escala de
actividad del antibiótico frente a diferentes especies bacterianas.
Hay diferentes técnicas de laboratorio que permiten medir o calcular
de rutina, y de manera semicuantitativa, las CIM (métodos manuales
y métodos automatizados o semiautomatizados). Estos diferentes
métodos de rutina permiten categorizar una cierta cepa bacteriana en
función de su sensibilidad frente al antibiótico probado. Esta cepa se
denomina Sensible (S), Intermedia (I) o Resistente (R) al antibiótico.

Para un determinado antibiótico, una cepa bacteriana es, según la

NCCLS:

Sensible, si existe una buena probabilidad de éxito terapéutico en el

caso de un tratamiento a la dosis habitual.
Resistente, si la probabilidad de éxito terapéutico es nula o muy
reducida. No es de esperar ningún efecto terapéutico sea cual fuere el
tipo de tratamiento.
Intermedia, cuando el éxito terapéutico es imprevisible.

Cada antibiótico se caracteriza por un espectro natural de actividad

antibacteriana. Este espectro comprende las especies bacterianas
que, en su estado natural, sufren una inhibición de su crecimiento por
concentraciones de su antibiótico susceptibles de ser alcanzadas in
vivo. A estas especies bacterianas se les dice naturalmente sensibles
a dicho antibiótico. Las especies bacterianas que no se encuentran
incluidas dentro de dicho espectro se denominan naturalmente
resistentes.
Método base de dilución en caldo

3
 En los métodos de dilución en
caldo, de casi todos los métodos
utilizados en la actualidad, se
colocan concentraciones
decrecientes del agente
antimicrobiano, generalmente
diluciones 1:2, en tubos con un
caldo de cultivo que sostendrá el
desarrollo del microorganismo. El
caldo más comúnmente usado
para estas pruebas es el de Mueller-Hinton suplementado con los
cationes magnesio y calcio.
Los agentes antimicrobianos se preparan en "soluciones madre"
concentradas y luego se diluyen en caldo hasta obtener las
concentraciones apropiadas.
Un tubo de caldo se mantiene sin inocular como control negativo de
crecimiento. Luego de la incubación adecuada (usualmente de un día
para el otro) se observa la turbidez de los tubos que indicará
desarrollo bacteriano. El microorganismo crecerá en el tubo control y
en todos los otros que no contengan suficiente agente antimicrobiano
como para inhibir su desarrollo. La concentración de antibiótico que
presente ausencia de crecimiento, detectada por falta de turbidez
(igualando al control negativo), se designa como la Concentración
Mínima Inhibitoria (CMI).
Para medir la capacidad de un antimicrobiano para matar a un
microorganismo (CMB) se debe realizar la prueba de actividad
bactericida, que emplea el mismo sistema de dilución en caldo que
para medir la sensibilidad.
Al mismo tiempo que la suspensión inicial del microorganismo es
inoculada en los tubos de caldo, se toma una alícuota del tubo de
control de crecimiento, inmediatamente después de ser sembrado, y
se inocula también en una placa de agar para determinar el número
real de unidades formadoras de colonias (UFC) del inóculo. Este
número se obtiene al contar las colonias presentes luego de la
incubación de la placa de agar hasta el día siguiente y por
multiplicación por el factor de dilución. Por ejemplo, usando un asa
calibrada de 0,01 ml para sembrar la placa y contando unas 250
colonias, en 1 ml del tubo original habrá 250/0,01.
Una vez determinada la CMI, se siembra una cantidad conocida de
inóculo de cada uno de los tubos de caldo que no presentaban
turbidez en placas de agar (la pequeña cantidad del agente
antimicrobiano que es llevada junto con el inóculo se elimina por
dilución en el agar), y el número de colonias que crece en estos
subcultivos, después de incubar durante la noche, se compara con el
número de UFC/ml del cultivo original. Dado que incluso las drogas
4
bactericidas no siempre esterilizan totalmente una población
bacteriana, la mínima concentración del agente antibacteriano que
permite sobrevivir a menos de 0,1 % del inóculo original se denomina
concentración bactericida mínima (CBM) o concentración letal mínima
(CLM).
Método de difusión en agar
Una vez demostradas las grandes ventajas de las técnicas de dilución
en caldo, el paso siguiente, pensando sobre todo en poder realizar
fácilmente pruebas de sensibilidad de un microorganismo frente a
múltiples antibióticos a la vez, consistió en buscar la manera de
aplicar la idea directamente a las placas de agar.
Las primeras pruebas se realizaron inoculando la superficie de una
placa de agar con el microorganismo en estudio, colocando pequeñas
cubetas (de metal o vidrio) sobre el agar y agregando las soluciones
de los diferentes antimicrobianos dentro de dichas cubetas. Los
agentes antimicrobianos difundían en el medio en forma radial
alrededor de la cubeta e inhibían el desarrollo del microorganismo en
la zona donde su concentración era suficientemente alta. Las áreas
de inhibición grandes indicaban una actividad antimicrobiana más
efectiva.
Este método fue modificado en 1947 por Bondi y col. incorporando el
agente antimicrobiano a discos de papel de filtro. Fue un paso
adelante gigantesco ya que el uso de los discos de papel permitía
preparar un gran número de pruebas idénticas y almacenarlas para
uso futuro.
En 1966, después de los estudios realizados por Bauer, Kirby, Sherris
y Turk, ensayando diferentes cepas bacterianas, el empleo de los
discos de papel de filtro para las pruebas de sensibilidad fue
estandarizado y correlacionado definitivamente con las CMI
correspondientes.
Durante muchos años, y a pesar de ser una técnica puramente
cualitativa, el método de difusión por disco (o método Kirby-Bauer),
en función sobre todo de su comodidad, economía y fiabilidad, ha
sido, y aun es, uno de los más utilizados en los laboratorios de todo el
mundo.
El microorganismo a investigar se inocula en una o varias placas de
agar y sobre su superficie se disponen los discos correspondientes a
varios antibióticos. Se incuban las placas durante 16-24 horas a 35ºC
y al cabo de este tiempo se estudia el crecimiento en ellas. Se valora
el diámetro de la zona de inhibición que se forma alrededor de cada
disco y se compara con las referencias oportunas publicadas por el
NCCLS. Con esta referencia podemos informar si el microorganismo
es Sensible, Intermedio o Resistente (S, I, R) a cada uno de los
antibióticos ensayados en las placas.

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 Método de E-test
Es uno de los métodos más recientes que se han presentado en el
mercado y resulta de una curiosa combinación de características de
los métodos anteriores. Se trata de una técnica cuantitativa en placa
que permite obtener una lectura directa de CMI en µg/ml, ya que se
emplean tiras plásticas impregnadas en concentraciones crecientes
de antibiótico indicadas en una escala graduada sobre la propia tira.
Una de sus grandes ventajas, dadas sus características, es que
resulta un método ideal para estudiar cualquier tipo de
microorganismo, aerobio o anaerobio, incluyendo aquellos llamados
"fastidiosos" o los que tengan requerimientos especiales para crecer.
El microorganismo a investigar se inocula en una placa y sobre ella se
deposita la tira del antibiótico (o antibióticos) a ensayar. Tras la
incubación de 16-24 horas a 35ºC se observan las placas y se valora
la zona de inhibición, de forma elíptica, alrededor de cada tira. La CMI
se lee directamente observando el punto más bajo de la elipse que
presente crecimiento.
Antibiograma realizado por el método de E-test
En la fotografía de la izquierda se muestra una vista general de una
placa con crecimiento bacteriano y con dos tiras de E-test. La zona de
color más claro que ocupa la mayor parte de la placa es el
crecimiento bacteriano en las zonas no inhibidas. Las elipses más
oscuras que rodean la parte superior de las tiras E-test marcan las
zonas en que los respectivos antibióticos han inhibido, con mayor o
menor eficacia, el crecimiento del microorganismo a estudio.
La foto de la derecha, un plano más cercano de la mitad inferior de la
placa, permite observar con más detalle lo señalado en el párrafo
anterior. Se aprecia perfectamente como el pico de la zona más
estrecha de la elipse en la tira de MZ coincide, en la escala graduada,
con la franja entre las marcas de 1.5 y 2, lo que nos indicaría que la
CMI de este antibiótico (MZ) para este microorganismo sería de 2
µg/ml.

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OBJETIVO

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 ✔ Conocer a que antibiótico es sensible un determinado
microorganismo

PROCEDIMIENTO
✔ Muestra:
Exudado faríngeo: se procede a un legrado en el área de inflamación,
se recoge el exudado si existe; se debe evitar el contacto con la
saliva porque puede inhibir la recuperación de los estreptococos del
grupo A.

Muestras del tracto respiratorio superior:

La mayoría de las infecciones bacterianas de la faringe están
producidas por Estreptococos del grupo A. otras bacterias que pueden
producir faringitis son Corynebacterium diphteriae, B. pertusis,
Neisseria gonorrhoeae. Sin embargo, estas bacterias son
relativamente infrecuentes y se deben utilizar técnicas especiales
para aislarlas.

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Otras bacterias potencialmente patógenas como Staphylococus
aureus, S. pneumoniae, Haemophilus influenzae, enterobacterias y
Pseudomonas aeruginosa, pueden estar presente en la orofaringe,
pero rara vez producen faringitis.
Se debe utilizar un hisopo de Dacron o de alginato de calcio para
recoge las muestras faríngeas. Deben tomarse muestras de la zona
de las amígdalas, la faringe posterior y de cualquier exudado o zona
ulcerada. Se debe evitar la contaminación de la muestra con saliva
porque las bacterias de la saliva pueden experimentar un sobre
crecimiento o inhibir el crecimiento de los estreptococos del grupo A.

✔ Medios realizados:
Agar Estafilococos 110
Agar sal y manitol
Agar TSA
Tubos de caldo nutritivo
Para la realización de estos medios de cultivo se realizaron los
cálculos que venían inscritos en los frascos que lo contenían al igual
que el procedimiento para su realización

✔ Frotis:
Tinción de Gram:
Recoger muestras
Hacer el extendido
Dejar secar a temperatura ambiente
Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3
veces aprox.)
Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1
min. Todas las células Gram positivas y Gram negativas se tiñen de
color azul-purpura.
Enjuagar con agua.
Agregar lugol y esperar entre 30 segundos y 3 minutos
Enjuagar con agua.
Agregar acetona y/o alcohol y esperar entre 15 y 20s
Enjuagar con agua.
Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar
1-2 min Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias Gram
negativas.
Enjuagar con agua.
Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x
con aceite de inmersión

✔ Método base de dilución en caldo

1.- En este método se colocan concentraciones decrecientes del

agente antimicrobiano, generalmente diluciones 1:2, en tubos con un
caldo de cultivo que sostendrá el desarrollo del microorganismo.
9
2.- El caldo más comúnmente usado para estas pruebas es el de
Mueller-Hinton suplementado con los cationes magnesio y calcio pero
el que utilizamos nosotros fue el caldo nutritivo.
3.- Los agentes antimicrobianos se preparan en "soluciones madre"
concentradas y luego se diluyen en caldo hasta obtener las
concentraciones apropiadas.
4.- Un tubo de caldo se mantiene sin inocular como control negativo
de crecimiento. Luego de la incubación adecuada (usualmente de un
día para el otro) se observa la turbidez de los tubos que indicará
desarrollo bacteriano.
El microorganismo crecerá en el tubo control y en todos los otros que
no contengan suficiente agente antimicrobiano como para inhibir su
desarrollo.
5.- La concentración de antibiótico que presente ausencia de
crecimiento, detectada por falta de turbidez (igualando al control
negativo), se designa como la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI).
6.- Para medir la capacidad de un antimicrobiano para matar a un
microorganismo (CMB) se debe realizar la prueba de actividad
bactericida, que emplea el mismo sistema de dilución en caldo que
para medir la sensibilidad (la que explicamos a continuación en
placas de TSA)

✔ Sensibilidad a los antibióticos o antibiograma:

Método de difusión en agar

1.- el germen aislado, se distribuye en forma uniforme (inoculo
abundante) sobre un medio solido adecuado (TSA)
2.- los discos (unidiscos o multidiscos) se colocan sobre la placa
inoculada, con pinza estéril, dejando 2 cm., entre disco y disco, se
presionan suavemente con las pinzas. Se recomienda no poner más
de 9 discos por placa
3.- las placas se incuban, invertidas, en seguida o dentro de los 30
´siguientes a 37°C
4.- los resultados se leen cuando se tenga un crecimiento
satisfactorio, dentro de las 18 a 24 horas de incubación

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 OBSERVACIONES

Morfología de las colonias que se

desarrollaron en este medio:
redondas
pequeñas
blancas y amarillas
convexas

Este es el medio sal y manitol y en este

no hubo mucho crecimiento solo en
una placa que viro a color amarillo, lo
que significa que se fermento el
manitol. Los estafilococos coagulasa
(+) fermentan el manitol.

Estas son las placas del medio TSA que

se
utilizaron para el
antibiograma con los
multidiscos

Estos son los 11 tubos

de caldo nutritivo
que se Utilizaron para
suspender las
bacterias de nuestra
muestra
(Staphylococus aureus)

Aquí estamos realizando la tinción de

Gram para las muestras de frotis de
exudado faríngeo
11
 Estos son los frotis que se realizaron con
las tinciones de Gram:
Las colonias se agrupaban en forma de
racimos de uva, Gram positivos ya que se
tiñeron de color azul-purpura por tal
motivo ya tenemos los argumentos para
decir que nuestro m.o. aislado fue
estafilococos aureus.
Visto a 100x

Frotis realizado del Frotis realizado del

medio estafilococos medio sal y manitol
110

En el tubo 1 tenemos a las bacterias

resuspendidas en solución salina.
En el tubo 2 tenemos al tubo de Mc-
1 2 Farland No. 1.
La turbidez de las bacterias resuspendidas
en la solución salina tuvo que ser igual a
la del tubo de Mc-Farland.

Aquí podemos ver cuando estábamos

agregando 1 gota de la solución salina
con bacterias a cada uno de los 11 tubos 12
de caldo nutritivo
Aquí estamos realizando las diluciones en
serie del antibiótico amoxicilina en los 11
tubos de caldo nutritivo. La 1ra concentración
para llevar a cabo las diluciones en serie del
medicamento fue de 64mg/L.

Colocación

del

multidiscos

en las placas

de TSA

13
 CMI

32mg/L 16mg/L

antibiótico Radio (cm) Radio (cm) Radio (cm) Media

PER 1.3 1.2 1.2 1.23
CTX 1.4 1.3 1.4 1.36
CXM 0.7 0.7 0.8 0.73
SXT 0 0 0 0
AM 0.4 0.3 0.3 0.33
E 1 0.9 0.9 0.93
CF 1.4 1.3 1.3 1.33
PE 0 0 0 0
GE 0.9 0.9 0.9 0.9
TE 0.1 0.1 0.1 0.1
CAZ 0.5 0.5 0.5 0.5
DC O.3 0.3 0.3 0.3

14
 RESULTADOS

✔ CMI: fue el tubo que tenia la concentración de de 16mg/L de

nuestro antibiótico

✔ CMB: no tuvimos dicha concentración, ya que al resembrar las

bacterias contenidas en los tubos de caldo en concentraciones
de antibiótico de 32mg/L y 16 mg/L en placas de TSA hubo
crecimiento exagerado de m.o.

✔ Según los datos arrojados del antibiograma los antibióticos son:

Resistente a: SXT, PE, TE
Sensible intermedio: CXM, AM, GE, CAZ, DC
Sensible: PER, CXT, E, CF

DISCUSIONES

✔ En el método base de dilución en caldo, el tubo de ensaye que

mostro la CMI
(Concentración mínima inhibitoria) fue el tubo de ensaye que tubo la
concentración de 16mg/L del antibiótico (el antibiótico usado fue
amoxicilina).
Esta nos indica que esta concentración es la menor concentración de
nuestras diluciones de antibiótico que provoca una inhibición visible
15
de la bacteria, dicho de otra manera, este tubo fue el que tuvo la
menor concentración diluida de antibiótico en el que no se
presentaba una turbidez presente en los tubos anteriores a él, lo que
significa que no hubo crecimiento bacteriano visible.

✔ Después de haber obtenido la CMI, los tubos siguientes y el

tubo de la CMI
Se resembraron en placas de TSA para obtener la CMB (concentración
mínima bactericida).
La CMB es la capacidad que tiene un antimicrobiano para matar a un
microorganismo. En este caso los tubos que se resembraron en
placas de TSA fueron los tubos que tenían las concentraciones de
32mg/L y 16mg/L.
Al resembrar y dejar incubar las placas de TSA en la estufa a 35°C por
24 horas, dio como resultado crecimiento en las 2 placas lo que nos
da a entender este antibiótico no puede matar a nuestra bacteria,
además de crecimiento de otros tipos de microorganismos.
Al igual, pensamos que al dar este resultado nuestra estufa ha de
estar contaminada además de que no llega hasta la temperatura
adecuada que es de 37°C sino llega hasta 35°C, ya que todo el
procedimiento de resembrado se llevo a cabo en condiciones de
esterilidad.

✔ Corroboramos con la literatura de que el método de dilución en

caldo nos
da a conocer la CMI y la CMB, ya que nuestra concentración mínima
inhibitoria fue de 16 mg/L y la CMB no la llegamos a conocer ya que
este microorganismo es resistente a este antibiótico al grado de no
poder acabar con él.

✔ BETALACTÁMICOS: La resistencia a meticilina implica también

pérdida de
sensibilidad a este grupo de antimicrobianos, por lo que no tienen
cabida en el tratamiento del SARM, no obstante a esto, se están
desarrollando nuevas cefalosporinas que, en estudios de
experimentación animal, han demostrado una mejor actividad
bactericida que la vancomicina, planteándose incluso su uso en
terapias de combinación. Existen además nuevos carbapenémicos,
con una afinidad aumentada para las PBP2, que ya han demostrado
resultados positivos en las primeras fases de investigación. Por otro
lado, en algunos estudios se ha observado que la asociación de
vancomicina y cloxacilina o imipenem puede ser sinérgica.
Nosotros corroboramos la literatura con nuestra practica ya
que la penicilina al pertenecer al grupo de los betalactamicos no creo
halo de inhibición, por tal motivo estos medicamento ya no surten
ningún efecto contra estos microorganismos

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 CONCLUSIONES

✔ Gracias a esta práctica aprendimos a realizar todo el

procedimiento para conocer la sensibilidad de un
microorganismo a algún medicamento determinado, realizando
los procedimientos para encontrar la CMI y la CMB mediante los
métodos de dilución en caldo y de difusión en agar. También
supimos que al utilizar el método de dilución en caldo
encontramos tanto la CMI y la CMB y mediante la utilización de
multidiscos solo sabemos a qué tipo de medicamentos es
susceptible el microorganismo.

BIBLIOGRAFÍA
✔ Varios autores, 1989. Microbiología médica. Manual Moderno
(1990), México
Bailey Scott. Diagnóstico microbiológico. Editorial médica
panamericana (1989), Argentina
Regueiro García, B. Resistencia a la infección.
Varios autores. Guía de terapia antimicrobiana. Dade-Grifols
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioAntibioticos.htm

✔ secretaria de comercio y fomento industrial

Norma mexicana
Nmx-bb-012-1974
"multidiscos para antibiogramas"

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