UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

CAMPUS IV, TAPACHULA

LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA

PRACTICA

“FLOCULACION”

CATEDRATICO:
DRA. MARISOL ESPINOZA RUIZ

ALUMNO:
ANZUETO GARCIA MARGARITA ELIZABET
BARCENAS BALCAZAR VERONICA ESTHER
RODAS HERRERA MIGUEL ANGEL

SEMESTRE: 6° GRUPO: “A”

TAPACHULA CHIAPAS A 19 DE ABRIL DEL 2010

MARCO TEORICO
 Inmunización y preparación del antígeno
El proceso de inmunización es aquel en el que se inyecta al animal el
antígeno en condiciones adecuadas de cantidad, sustancias
acompañantes, y número de veces, que sean necesarias para conseguir
una buena respuesta inmune. En general se divide en dos fases:
inmunización primaria, en la cual se administra una determinada
cantidad de antígeno en presencia de adyuvante, e inmunización de
recuerdo ('booster'), en la que el antígeno es administrado en forma
soluble o bien con adyuvante. Existen numerosos protocolos de
inmunización, con una duración variable.
Cuando se inmuniza un animal con un antígeno y se provoca una respuesta
inmune aumenta notablemente en el suero del animal la cantidad de Ig
específicas del antígeno empleado. Esto es la consecuencia de la
selección clonal de los limfocitos B que producen anticuerpos contra el
antígeno. Como hemos visto un antígeno puede presentar diferentes
epítopes, y cada uno de ellos ser reconocido por un clon de linfocitos B
que producirá moléculas Ig con una secuencia característica. Por ello en
el suero de un animal inmunizado se acumulan un número desconocido,
posiblemente elevado, de diferentes moléculas de Ig específicas en
mayor o menor medida de nuestro antígeno. Se trata de un suero
producido por la acción de síntesis de numerosos clones de linfocitos B
y por ello se ha denominado policlonal.

Los anticuerpos son las moléculas de la inmunidad humoral específica y

una de sus principales funciones fisiológicas es la defensa contra los
microorganismos extracelulares y las toxinas producidas por los distintos
agentes microbianos. Aunque los blancos de los anticuerpos son
comúnmente bacterias extracelulares, hongos y parásitos extracelulares,
estas moléculas tienen también un papel muy importante en el control de
los procesos infecciosos producidos por los microorganismos
intracelulares obligados, tales como los virus, debido a que pueden
reconocerlos antes que ellos infecten las células o cuando son liberados
como viriones desde las células infectadas. Sin embargo, a pesar de su
alta especificidad por microorganismos y toxinas microbianas, los
anticuerpos requieren de otros mecanismos efectores, tales como el
 complemento, las células fagocíticas y las células citotóxicas para
eliminar los antígenos.

Los anticuerpos son producidos por los linfocitos B una vez reconocen el
antígeno y reciben señales accesorias por parte de los linfocitos T. Este
reconocimiento y activación de los linfocitos B ocurre en los órganos
linfoides secundarios, hasta donde llegan los antígenos sea en forma
libre o transportados por las células fagocíticas mononucleares. Una vez
ocurre la activación, los linfocitos B proliferan y un porcentaje de estas
células se convierte en células plasmáticas, las cuales son la principal
fuente de anticuerpos durante una respuesta inmune. Luego de ser
secretados, los anticuerpos entran al torrente circulatorio, difunden hacia
los tejidos extravasculares o pasan a las secreciones mucosas para
interactuar con los antígenos. Por lo tanto, aunque el reconocimiento
inicial de los antígenos ocurre en sitios precisos, la fase efectora de la
inmunidad humoral es sistémica.

Algunas de las células B que reconocieron el antígeno y fueron activadas,

migran a través del organismo para ubicarse en distintos órganos
linfoides, particularmente la médula ósea y el bazo. Dentro de esta
población de células, una parte importante continúa produciendo
 anticuerpos aun años después de que el antígeno es eliminado, pues
recibe los estímulos derivados de otras respuestas inmunes contra
diversos antígenos a los que se expone el individuo. Otra porción de
células B queda como células de memoria con una menor capacidad
para producir anticuerpos. De esta manera, si un antígeno o
microorganismo ingresa de nuevo al individuo, las células que
permanecen produciendo anticuerpos dan los niveles suficientes para
tener una protección inmediata contra la infección, mientras que por su
lado las células B de memoria se activan un poco más tardíamente para
proveer una respuesta mucho mayor de anticuerpos que proteja durante
un tiempo más prolongado.

La molécula básica de un anticuerpo está constituida por dos cadenas

pesadas idénticas entre sí y por dos cadenas livianas, también idénticas
entre sí; cada una de estas cadenas posee una región variable y una
región constante. De esta manera, cada molécula de anticuerpo tiene
dos regiones variables o de unión al antígeno, cada una de ellas
formada por la interacción entre la porción variable de las cadenas
pesadas y liviana. Por lo tanto, decimos que una molécula básica de
anticuerpo tiene una valencia de 2. Sin embargo, existen moléculas
multiméricas de anticuerpos; por ejemplo, la IgM circulante está
constituida por 5 moléculas de inmunoglobulinas (pentámero) y por lo
tanto tiene una valencia de 10, mientras que la IgA secretora tiene una
valencia de 4, debido a que está conformada por dos moléculas de IgA.

Las porciones variables, tanto de las cadenas pesadas como livianas, se

forman gracias a fenómenos de recombinación genética entre los varios
cientos de fragmentos genéticos que los codifican, proceso que ocurre
durante el desarrollo de cada célula individual que se generó a partir de
las células precursoras (ontogenia de los linfocitos B). Este mecanismo
genético asegura dos aspectos fundamentales para la respuesta
inmune:
• Primero, que exista en cada individuo toda la gama posible de anticuerpos
que pueden reconocer a todos los antígenos con los cuales se puede
encontrar en el transcurso de su vida.

• Segundo, que una vez el linfocito B se ha diferenciado y madurado ya

tiene la capacidad de responder de manera específica contra un
antígeno determinado.Esto implica que al nacimiento, los seres
vertebrados poseen células B con posibilidad de responder contra
cualquier antígeno.

Una vez el antígeno se une a las regiones variables de los anticuerpos se

producen una serie de cambios conformacionales en toda la molécula
que en última instancia también afectan a las regiones constantes; esto
permite que las regiones constantes de aquellos anticuerpos que están
unidos a los antígenos, puedan interactuar con otras moléculas como
receptores Fc o fracciones del complemento, y de esta manera
desencadenar los mecanismos efectores. Esto asegura que dichos
mecanismos efectores sólo se pongan en marcha cuando el anticuerpo
encuentra y se une específicamente a un antígeno.

Existen varios tipos de regiones constantes en las cadenas pesadas de los

anticuerpos, lo cual ha permitido definir los isotipos de inmunoglobulinas
(IgG, IgM, IgA, IgE e IgD) y las subclases de algunas de ellas (IgG1,
IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2). Debido a las diferencias existentes entre
estas regiones constantes, los distintos isotipos de inmunoglobulinas
cumplen con funciones efectoras distintas. Por ejemplo, algunas
subclases de IgG tienen la capacidad de unirse a receptores Fc y
promueven la fagocitosis de partículas recubiertas con anticuerpos; la
IgM y algunas subclases de IgG pueden activar el complemento; por su
parte, la IgE se une a receptores Fc específicos presentes en los
mastocitos y eosinófilos y desencadena la activación de estas células.
De lo anterior podemos concluir que dependiendo del tipo de
inmunoglobulina que se produzca durante una respuesta inmune se
podrán desencadenar distintos mecanismos efectores en respuesta a un
antígeno determinado. Por lo tanto, deben existir mecanismos que
 permitan a los linfocitos B producir anticuerpos de una clase particular
cuando éstos sean más efectivos.

Cuando un linfocito B termina su proceso de maduración en la médula ósea

tiene la capacidad de secretar IgM y expresa IgM e IgD en la membrana
plasmática. Una vez el linfocito B es activado por el encuentro con el
antígeno, recibe señales adicionales que le permiten cambiar el isótopo
de inmunoglobulina que puede producir. Estas señales son provistas
esencialmente por los linfocitos T y dependen de la interacción física
entre ambas células y de la producción de citoquinas por dichos
linfocitos T. La principal señal provista por la interacción entre las células
es la unión de la molécula CD40 presente en la membrana del linfocito B
con el ligando para CD40 (CD154) presente en los linfocitos T; una vez
estas moléculas interactúan se transmiten señales hasta el núcleo de la
célula B que inducen un cambio en el isotipo de inmunoglobulina, de
manera que ya puede sintetizar isótopos distintos a la IgM.

Por su parte, las citoquinas derivadas de los linfocitos T favorecen la

especialización en la síntesis de determinados isotipos de
inmunoglobulinas. Puesto que los linfocitos T ayudadores sufren un
proceso de diferenciación dependiendo de sí el antígeno es intra o
extracelular, ellos pueden producir citoquinas con actividades distintas,
lo cual las diferencia en células TH1 o TH2, las que a su vez inducen
efectos distintos en las células efectoras, incluyendo los linfocitos B. Por
ejemplo, los virus y las bacterias inducen la producción de isotipos de
IgG dependientes de células TH1, anticuerpos que pueden unirse a los
fagocitos y las células asesinas naturales (NK) y/o activar el
complemento; por su parte, parásitos tipo helmintos estimulan la síntesis
de IgE que depende de células TH2, la cual se une y activa los
eosinófilos, los que a su vez tienen una potente actividad helminticida.

INMUNIZACIÓN DE ANIMALES

INSTRUCCIONES GENERALES PARA INOCULAR ANIMALES:

✔ Equipamiento:

Hay que utilizar una aguja o lanceta esterilizada para pinchar la piel y el
vaso sanguíneo subyacente. No es recomendable utilizar una hoja de
escalpelo (bisturí) ya que su uso es impreciso y puede ocasionar una
mutilación accidental del animal o de la persona, si el animal no está
adecuadamente sujeto.

✔ Lugar:

Para familiarizarse con la ubicación de una vena, se recomienda

encarecidamente estudiar primero la anatomía correspondiente en los
animales muertos, para evitar tener que realizar repetidas entradas
fallidas a la hora de encontrar un vaso sanguíneo.

Un lugar habitual para practicar la punción venosa en un animal pequeño es

la vena coccígea o de la cola. En pequeños roedores, la extremidad de
la cola puede ser amputada y en el caso de los ratones- a diferencia de
las ratas- no parece implicar la eliminación de ninguna vértebra
coccígea.

El corte de la cola tiene que realizarse una sola vez o dos como máximo.
(En ratas topo desnudas se puede hacer pequeñas extirpaciones al final
de la cola, que vuelve a crecer en 4-6 semanas y entonces puede
realizarse de nuevo.)

En pequeños animales sin cola, como los cobayas y hámsteres, se puede

utilizar la vena yugular o la de la oreja, pero requiere gran habilidad; en
estos mamíferos, la punción cardiaca con anestesia general puede ser el
método más adecuado.

En animales grandes es más probable que una pequeña muestra se tome

directamente de una vena superficial. En las aves, puede practicarse la
punción en las barbas, crestas y moco, en el caso del pavo.

La utilización de las almohadillas plantares para la obtención de sangre no

es aceptable debido a la sensibilidad de la zona y el riesgo de infección,
 ya que los Animales de Laboratorio habitualmente se guardan cerca, o
en lechos contaminados por orina y heces. La infección puede causar
cojera y sufrimiento innecesario.

✔ Preparación Del Lugar

Es importante mantener una antisepsia completa a lo largo del muestreo, de

forma que todo pelo o resto de piel superficial de encima de la vena, sea
retirado.

El método para eliminar el pelo dependerá de la localización de la vena y de

la especie animal. El pelo se puede eliminar a tirones, con tijeras curvas
o con esquiladora.

Retirar el pelo a tirones puede realizarse fácilmente en los gatos y conejos

sin causar sufrimiento al animal. Las cremas depilatorias químicas
pueden aplicarse en zonas difíciles pero generalmente no se
recomiendan ya que pueden provocar reacciones en la piel y contaminar
las muestras.

Algunos animales tales como los gatos, pueden incomodarse con el ruido
producido por las esquiladoras eléctricas.

Hay que tener en cuenta también, que las pieles de algunos animales, por
ejemplo la de los conejos, son finas y sensibles. No es recomendable
afeitar con cuchilla, jabón y agua ya que causa más daño a la piel que el
esquilar.

Las excepciones dependerán de la experiencia del operador, de la soltura a

la hora de esquilar y el efecto que pueda causar en los animales y de la
calidad de la muestra requerida.

La zona rasurada o de la que se ha retirado el pelo a tirones deberá ser

limpiada con agua templada, a la que se le puede añadir un detergente o
desinfectante como la cetrimida. Estos agentes deberán ser
 posteriormente retirados con agua para evitar la contaminación de la
muestra.

El alcohol (etanol 70% en agua) desengrasará efectivamente la piel de

aquellas especies en las cuales la secreción de glándulas sebáceas sea
pronunciada (por ejemplo en las ovejas), pero puede contaminar una
muestra de sangre si no se le deja evaporar.

Es casi imposible producir una superficie estéril y una Limpieza excesiva

trastornaría el ecosistema bacteriano natural de defensa de la piel.

La preparación puede tener entonces el efecto posterior de causar irritación,

deshidratación de la piel e incomodidad del animal.

Para disminuir toda molestia asociada a la punción venosa, algunos

científicos han investigado recientemente el uso de cremas de anestesia
local aplicadas sobre la piel unos 30-60 minutos antes de tomar la
muestra.

Parecen ser beneficiosas en la reducción de las molestias en especies

como conejos, perros y gatos pero no son tan efectivas en ratas.

✔ La Toma De Muestra:

El animal debe estar suavemente sujeto por un manipulador experimentado

que, siempre que sea posible, deberá ser conocido por los animales. No
hay tampoco que sobre valorar el papel clave desempeñado por la
persona que sujeta al animal y evidencia la vena.

La vena debe localizarse claramente (si se tienen dudas, es mejor no

hacerlo y buscar ayuda) y la punción llevada a cabo decididamente
mejor que con vacilaciones. Puede que el animal muestre signos de
incomodidad (¡como nosotros!) por ejemplo, puede chillar, pero se le
debe tranquilizar, tratándole con suavidad y hablándole. Puede que se
necesite alguna presión próxima al lugar de oclusión del retorno venoso
con el fin de obtener suficiente volumen de sangre.
La gota de sangre formada puede retirarse con un tubo capilar o con una
micropipeta con punta de plástico.

Después de haber sacado la sangre, se debe mantener una presión suave

pero firme sobre el lugar durante unos 30 segundos, lo que detendrá
rápidamente cualquier sangrado. También hay varios preparados
hemostáticos de alginato de calcio, fibrillas de colágeno y esponja
gelatinosa que pueden servir de ayuda si persiste el sangrado.

CONEJO:

1. Los conejos no muerden con frecuencia pero pueden causar heridas con
las uñas de sus patas. Sujételo de forma tal que las patas traseras estén
lejos del cuerpo del operario. Sujetándolo por la piel sobre los hombros
con la cabeza en dirección al operario es el mejor método de sujeción
para un conejo. Cuando esté colgado, se debe sujetar la parte bajo del
cuerpo con la otra mano. Ver figura 5.

Figura 5.- Métodos para la sujeción y transportación de conejos y su

colocación y ajuste en la jaula de restricción para tomas de sangre e
inyecciones

2. Los conejos nunca deben ser levantados por las orejas. Si el conejo
comienza a moverse violentamente y en rotación, debe colocarse
rápidamente sobre una superficie plana y esperar a que se tranquilice.
Este movimiento violento y en forma circular puede traer como
consecuencia la fractura de una o más vértebras lumbares y daño fatal
en la espina dorsal.

3. Los conejos pueden ser llevados a un estado de hipnosis cuando se les

acaricia sobre su espalda y el abdomen. Durante la sujeción los conejos
pueden intentar escapar de forma violenta y pueden dañarse con la
aguja o cualquier otro instrumento pudiendo causar daños en el animal o
el operario. Por lo tanto la sujeción firme debe realizarse antes de iniciar
el procedimiento experimental.
 FLOCULACION

La floculación es otro mecanismo que sirve para evidenciar reacción

antígeno-anticuerpo in vitro y es considerada de interaccion secundaria
porque no necesita ningún reactivo o sustancia biológica adicional para
hacer visible la reacción.

Este tipo de interacion se distingue en 2 etapas: la reacción primaria, no

visualizable y la reacción secundaria, que sigue a la anterior,
caracterizada por la aparición de un fenómeno visible, como es la
floculación en este caso particular.

La característica lipidica del antígeno es la condición que la hace ser una

reacción de floculación. Los complejos antígeno-anticuerpo formados se
agregan y sedimentan en un rango muy estrecho de su relación; y en la
zona de exceso de antígeno y anticuerpo, solo se forman complejos
solubles.

La prueba de VDRL sirve para determinar los anticuerpos conocidos como

reaginas. Estos son hetrerofilos, es decir, anticuerpos no específicos
contra el treponem, quereacciona con antígenos lipidicos y que están
presentes en personas infectadas por el, y los cuales tienen la
capacidad de flocular frente al antígeno constituido por cardiolipina,
lecitina y colesterol.

Estos acnticuerpos se encuentran en el suero de personas que presentan

variadas entidades clínicas como sífilis, paludismo, TBC, enfermedades
del colágeno, y, además en sujetos normales, en condiciones de
embarazo y en pacientes de edad avanzada o recientemente
vacunados.
 OBJETIVOS

Aprender el proceso de inmunización, como también la técnica para la

realización de antígenos.

Manipular correctamente al conejo, inmunizarlo por via intravenosa,

extraerle sangre (oreja, arteria central).

Lograr crear anticuerpos contra el antígeno Salmonella, en el conejo

mediante diferentes inmunizaciones.

Conocer y aplicar el método de floculación

Observar la formación del floculo en la dilución de antígeno con suero

problema.
 METODOLOGIA
1.- Se toma al conejo, de manera que permita la extracción de suero
negativo, se toma la oreja con cuidado, se limpia con alcohol la parte de
la vena marginal , se introduce el bisel y se extrae la sangre.
2.- Esto se coloca en hielo, Se deja que se forme el coagulo, una vez
formado, se centrifuga a 2000 rpm durante 5 minutos, se extrae el suero
y se mete a refrigeración.
3.-Se prosigue ala preparación del antígeno.
• se toma con ayuda de una asa , una colonia de la cepa de salmonella sp
se coloca en un tubo de ensaye que contiene un volumen de 16 ml. De
solución salina estéril. Se disuelve hasta obtener una turbidez del tubo
número 2 de mc farland. Una vez obtenida la turbidez se esteriliza 15
min. A 15 libras. Se coloca 2ml de antígeno en cada uno de los viales,
se etiquetan y se guardan a -20 °C hasta su posterior uso.

4.-Se prosigue al protocolo de inmunización el cual se realiza de la siguiente

manera:
INYECCION N° TIEMPO (DIA) DOSIS (ml) VIA
1 0 0.5 IV
2 4 1.0 IV
3 8 2.0 IV
4 12 3.0 IV
SANGRADO 18

5.- Ya terminada la inmunización se prosigue a extraer el suero con

anticuerpos, se extrae de la siguiente manera, se toma la oreja del
animal, se limpia con una torunda, se introduce el bisel y se extrae la
sangre. Esto se realiza en hielo, Se prosigue a que se forme el coagulo
se centrifuga a 2000 rpm durante cinco minutos, se obtiene el suero , se
coloca en un tubo y se refrigera.

FLOCULACIÓN
 COLOCAR 1 GOTA(FLOCULACIÓN)
PROCEDIMIENTO DE ANTÍGENO + 1
GOTA DE SUERO PROBLEMA

AGITAR Y OBSERVAR EN EL
MICROSCOPIO

✔ a si mismo se realizo
la combinación de tífico “o” y tífico “h” con el suero, despositando 1 gota
de cada uno de ellos.

OBSERVACIONES
Durante todo el proceso de la práctica se observo lo siguiente:

 Al realizar el sangrado para obtener el suero negativo, fue

dificultoso obtenerlo ya que el conejo movía mucho la oreja, por lo
cual se obtuvo 1 ml. De sangre.
 Para inmunizar al conejo, en lo que fue la primera inmunización
fue dificultoso ya que como no teníamos práctica se nos complico
inmunizar al conejo.
 ´para lo que fue nuestro antígeno particulados, se tuvieron
algunos contratiempos con las cepas, pero esto fue resuelto.
 Durante el protocolo de inmunización se observo lo siguiente.
 Primer inyección: se le inyecto 0.5 ml al conejo después de esto,
el conejo presento fiebre, diarrea, además de que se puso triste.
 Segunda, tercera y cuarta inyección el animal se encontró bien.
 Para la obtención de suero final, también bien fue dificultoso
extraer sangre del conejo, únicamente se extrajeron 0.5 de suero.
 Al momento de realizar la reacción suero antígeno se observo la
formación floculos.

sin reactivo Tífico “

H”

Tífico “ O ”

RESULTADOS
Durante la realización de la práctica, se obtuvo 0.2 aproximadamente de
suero control. En la realización del antígeno, se obtuvieron 8 viales cada
uno con 2 ml. De antígenos (salmonella sp).
El suero negativo y los viales se guardaron el un refrigerador a -20°C, para
su conservación.
El día de la práctica se realizo en una placa de vidrio la reacción antígeno
anticuerpo para valorar si en sistema inmunológico del conejo produjo
anticuerpos para el antígeno (salmonella sp).
Al momento de colocar una gota de antígeno y un a de anticuerpo, se
observo la formación de floculos. Después se observo al microscopio
con el objetivo de 10 y se observo la aglutinación demostrándonos que
si hubo producción de anticuerpos.

Después se realizo la reacción del reactivo tífico “ O ” y tífico “H”, con una
gota de
anticuerpos, dándonos más afinidad hacia el tífico “ O ”.

DISCUSION

✔ De acuerdo a lo consultado en la literatura esta nos indica que ante la

presencia de un antígeno en el organismo nuestro sistema inmune
desencadena una serie de respuestas inmunes, provocando una
producción de anticuerpos de distinto isotipo. Esto se corroboro
mediante la inmunización de un antígeno ( salmonela sp.) en el conejo,
obteniendo un suero final el cual contenía anticuerpos específicos para
el antígeno inmunizado mediante reacción de floculación.

✔ Asi como también la bibliografía nos indica que los antígenos

particulados tienen la capacidad de formar flocuos al estar en contacto
con un anticuerpo especifico para él. Hubo formación de floculo debido a
la formación de complejos inmunes (antígeno-anticuerpo).

CONCLUSIONES
Terminada esta practica podemos decir fue un éxito, pues se obtuvieron los
resultados esperados. Además:

Aprendimos a inmunizar al conejo mediante vía intravenosa (oreja), y a

crear antígenos. Con ayuda de la escala de Mc Farland

Aprendimos a manipular de la forma mas adecuada a nuestro conejo, le

extrajimos sangre (oreja, arteria central). En dos ocasiones. Cabe
mencionar que este ultimo proceso si se nos dificulto un poco, pues que
el conejo presentaba mucha resistencia y brincaba, provocando así que
no lo sangráramos bien.

Se logró crear anticuerpos contra el antígeno Salmonella, puesto que si

observamos el floculo en el microoscopio mediante la disolución del
antígeno con el suero problema, es decir si se realizo de manera
correcta la inmunización.

Conocimos y aplicamos el método de floculación.

BIBLIOGRAFÍA
• http://www.secal:
Extracción de sangre de mamíferos y aves de laboratorio. Primer informe
del
grupo conjunto de trabajo sobre refinamiento. Laboratory Animals (1993) vol
27: 1 – 22

• http://meusite.com.br/COBEA

• Peter J. Delves, Ivan M. Roitt. The immune system (First of two parts). N
Engl J Med. 343(1): 37-49, 2000.
Peter J. Delves, Ivan M. Roitt. The immune system (Second of two parts). N
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Mark J. Walport. Complement (First of two parts). N Engl J Med. 344(14):
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