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CINTIQUE
ENZYMATIQUE
Athel CORNISH-BOWDEN
Marc JAMIN
Valdur SAKS
C
Grenoble Sciences
Grenoble Sciences poursuit un triple objectif :
raliser des ouvrages correspondant un projet clairement dfini, sans contrainte de
mode ou de programme,
garantir les qualits scientifique et pdagogique des ouvrages retenus,
proposer des ouvrages un prix accessible au public le plus large possible.
Chaque projet est slectionn au niveau de Grenoble Sciences avec le concours de referees
anonymes. Puis les auteurs travaillent pendant une anne (en moyenne) avec les membres
dun comit de lecture interactif, dont les noms apparaissent au dbut de louvrage. Celui-ci
est ensuite publi chez lditeur le plus adapt.
(Contact : Tl. : (33)4 76 51 46 95 - E-mail : Grenoble.Sciences@ujf-grenoble.fr)
Deux collections existent chez EDP Sciences :
la Collection Grenoble Sciences, connue pour son originalit de projets et sa qualit
Grenoble Sciences - Rencontres Scientifiques, collection prsentant des thmes de
recherche dactualit, traits par des scientifiques de premier plan issus de disciplines
diffrentes.
ISBN 2-86883-742-5
EDP Sciences, 2005
Portland Press, Ltd. London, 2004
This translation of portions of FUNDAMENTALS OF ENZYME KINETICS first
published in (1995, 2004) is published by arrangement with Portland Press, London
CINTIQUE ENZYMATIQUE
Athel CORNISH-BOWDEN
Marc JAMIN
Valdur SAKS
Ouvrages Grenoble Sciences dits par EDP Sciences
Collection Grenoble Sciences
Chimie. Le minimum savoir (J. Le Coarer) - Electrochimie des solides (C. Dportes
et al.) - Thermodynamique chimique (M. Oturan & M. Robert) - Chimie organomtallique
(D. Astruc) - De l'atome la raction chimique (sous la direction de R. Barlet)
Introduction la mcanique statistique (E. Belorizky & W. Gorecki) - Mcanique statistique.
Exercices et problmes corrigs (E. Belorizky & W. Gorecki) - La cavitation. Mcanismes
physiques et aspects industriels (J.P. Franc et al.) - La turbulence (M. Lesieur) - Magn-
tisme : I Fondements, II Matriaux et applications (sous la direction dE. du Trmolet de
Lacheisserie) - Du Soleil la Terre. Aronomie et mtorologie de lespace (J. Lilensten &
P.L. Blelly) - Sous les feux du Soleil. Vers une mtorologie de lespace (J. Lilensten &
J. Bornarel) - Mcanique. De la formulation lagrangienne au chaos hamiltonien (C. Gignoux
& B. Silvestre-Brac) - Problmes corrigs de mcanique et rsums de cours. De Lagrange
Hamilton (C. Gignoux & B. Silvestre-Brac) - La mcanique quantique. Problmes rsolus,
T. 1 et 2 (V.M. Galitsky, B.M. Karnakov & V.I. Kogan) - Analyse statistique des donnes
exprimentales (K. Protassov) - Description de la symtrie. Des groupes de symtrie aux
structures fractales (J. Sivardire) - Symtrie et proprits physiques. Du principe de Curie
aux brisures de symtrie (J. Sivardire)
Exercices corrigs d'analyse, T. 1 et 2 (D. Alibert) - Introduction aux varits diffrentielles
(J. Lafontaine) - Analyse numrique et quations diffrentielles (J.P. Demailly) - Mathma-
tiques pour les sciences de la vie, de la nature et de la sant (F. & J.P. Bertrandias) - Appro-
ximation hilbertienne. Splines, ondelettes, fractales (M. Attia & J. Gaches) - Mathma-
tiques pour ltudiant scientifique, T. 1 et 2 (Ph.J. Haug)
Bactries et environnement. Adaptations physiologiques (J. Pelmont) - Enzymes. Catalyseurs
du monde vivant (J. Pelmont) - La plonge sous-marine l'air. L'adaptation de l'organisme
et s e s limites (Ph. Foster) - Endocrinologie e t communications cellulaires (S. Idelman &
J. Verdetti) - Elments de biologie l'usage d'autres disciplines (P. Tracqui & J. Demongeot
Bionergtique (B. Gurin)
L'Asie, source de sciences et de techniques (M. Soutif) - La biologie, des origines nos
jours (P. Vignais) - Naissance de la physique. De la Sicile la Chine (M. Soutif) - Le rgime
omga 3. Le programme alimentaire pour sauver notre sant (A. Simopoulos, J. Robinson,
M. de Lorgeril & P. Salen) - Gestes et mouvements justes. Guide de l'ergomotricit pour
tous (M. Gendrier)
Listening Comprehension for Scientific English (J. Upjohn) - Speaking Skills in Scientific
English (J. Upjohn, M.H. Fries & D. Amadis) - Minimum Competence in Scientific English
(S. Blattes, V. Jans & J. Upjohn)
1.1. INTRODUCTION
Les enzymes sont des catalyseurs biologiques qui jouent un rle central dans le
monde vivant. Les ractions essentielles pour le fonctionnement d'un tre vivant
sont trop lentes et sans la prsence de ces catalyseurs, la vie telle que nous la
connaissons aujourd'hui ne serait pas possible. Qu'il s'agisse de ractions simples
comme la formation de bicarbonate partir d'eau et de dioxyde de carbone ou de
ractions complexes comme la rplication de l'ADN, chaque raction chimique se
droulant au sein d'un tre vivant est catalyse par un ou plusieurs enzymes
spcifiques. Les enzymes sont des macromolcules, des protines ou des ARN (les
ARN catalytiques sont plus correctement dnomms ribozymes), qui reconnaissent
spcifiquement certaines molcules et acclrent les ractions de transformation de
ces molcules suffisamment pour que leur vitesse devienne compatible avec le
fonctionnement de l'organisme. Un second rle essentiel jou par les enzymes est
d'assurer le couplage physique entre ractions endergoniques et ractions exer-
goniques et de permettre ainsi de maintenir les systmes biologiques dans des tats
hors d'quilibre, galement indispensables pour le maintien de la vie.
La comprhension du mcanisme molculaire des processus biologiques reste un
des objectifs majeurs de la biologie moderne. En particulier, l'tude des ractions
enzymatiques vise comprendre les mcanismes ractionnels mais aussi tablir
de manire quantitative comment un enzyme est capable d'acclrer spcifique-
ment une raction chimique. Puisque les enzymes agissent en modifiant la vitesse
des ractions, il est ncessaire d'tudier la cintique des ractions pour comprendre
leur mode d'action. Dans ce premier chapitre, nous allons commencer par rappeler
les conventions et les concepts de base de la cintique chimique, qui seront utiles
pour la comprhension de la cintique enzymatique : la vitesse de raction, les
notions de raction lmentaire, d'ordre et de molcularit d'une raction.
Une raction chimique est un processus au cours duquel une ou plusieurs substances
chimiques (molcules) se transforment en une ou plusieurs autres substances
chimiques, par un rarrangement des lectrons et des liaisons entre les atomes
8 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Constante
Sens de la d'quilibre Constante de vitesse
raction directe de la raction directe
Ractif K Coefficient
stchiomtrique
k1
Coefficient aA pP Produit
stchiomtrique
k1 Constante de vitesse
de la raction inverse
Sens de la [A]0 x x
raction inverse
Concentration Avancement
initiale de A de la raction
1.1 - Reprsentation schmatique d'une raction chimique et conventions d'criture
La vitesse d'une raction chimique est une mesure de la rapidit avec laquelle la
concentration des ractifs et des produits change au cours du temps. La vitesse de
la raction peut tre dfinie partir de la disparition des ractifs ou partir de
l'apparition du produit. Si la concentration d'un ractif, reprsente par [ A ] , varie
d'une quantit [ A ] pendant l'intervalle de temps D t, la vitesse est donne par
v = [ A ] t . En d'autres termes, la vitesse est la variation par unit de temps
de la concentration de l'une des substances initiales ou finales.
Si la variation est considre sur un temps infiniment court, nous obtenons la
vitesse instantane de la raction :
d[ A] d[ P ]
v = 1 = 1 [1.1]
a dt p dt
o a et p reprsentent les coefficients stchiomtriques de la raction limitant la
vitesse. Les deux variations de la concentration dfinissent la vitesse de la rac-
tion v, qui peut indiffremment tre dfinie en termes d'apparition des produits ou
de disparition des ractifs puisque chaque molcule de A consomme est convertie
en une molcule P. Si la raction implique plusieurs substrats ou plusieurs produits,
la vitesse de la raction peut tre dfinie vis--vis de chacun de ceux-ci.
L'objectif d'une tude cintique est de mesurer la vitesse de la raction considre,
et, pour cela, il est ncessaire de disposer d'une mthode qui permette de suivre
l'volution de la concentration au cours du temps d'au moins un des ractifs ou des
produits. Ces problmes pratiques seront discuts dans le chapitre 4. Malheureu-
sement, la mesure de la vitesse dans un seul ensemble de conditions exprimentales
n'est pas suffisante pour dterminer le mcanisme d'une raction. Pour mieux
comprendre les mcanismes ractionnels, il est ncessaire d'tablir les quations de
vitesse de la raction, c'est--dire d'tablir des quations qui rendent compte de la
dpendance de la vitesse vis--vis de la concentration des ractifs, [ A ] , et des
produits, [ P ] ou vis--vis de certains paramtres extrieurs comme la temp-
rature, T, la pression, p, ou le pH.
v = f [ A ] , [ P ] , T , p , pH K [1.2]
La condition ncessaire pour qu'une raction chimique se produise entre les ractifs
est que ces particules entrent en contact, c'est--dire qu'elles se rapprochent
suffisamment les unes des autres pour que la raction puisse se drouler. On
conoit aisment que la vitesse d'une raction soit proportionnelle au nombre de
collisions entre ces particules. Puisque le nombre de collisions est d'autant plus
lev que la concentration des ractifs est leve, la vitesse de la raction est
proportionnelle au produit des concentrations des ractifs. Ces considrations sont
1 PRINCIPES DE BASE DE LA CINTIQUE CHIMIQUE 11
Une raction chimique peut tre classe selon sa molcularit ou selon son ordre.
La molcularit fait rfrence au nombre de molcules altres au cours de la
raction. Une raction de type A P est unimolculaire (parfois appele mono-
molculaire), et une raction de type A + B P est bimolculaire. Les ractions
de molcularit suprieure deux sont extrmement rares, mais, si elle existait, une
raction de type A + B + C P serait dite trimolculaire (ou termolculaire).
L'ordre est une description de la cintique de la raction qui dcoule directement de
la loi d'action des masses ; il dfinit le nombre de termes de concentration qui
doivent tre multiplis pour obtenir l'quation de vitesse de la raction. Ainsi, dans
une raction de premier ordre, la vitesse est proportionnelle la concentration d'un
12 CINTIQUE ENZYMATIQUE
seul ractif, dans une raction de second ordre, elle est proportionnelle au produit
de deux concentrations ou au carr de la concentration d'un seul ractif, et ainsi de
suite.
Pour une raction simple qui consiste en une seule tape ou pour chaque tape l-
mentaire d'une raction complexe, l'ordre est gnralement identique la mol-
cularit. Toutefois, beaucoup de ractions impliquent une srie d'tapes unimol-
culaires ou bimolculaires, et la molcularit globale de la raction ne correspond
pas ncessairement l'ordre global de la raction. En fait, l'ordre d'une raction
complexe n'est gnralement pas significatif, puisque la vitesse ne peut pas
toujours tre exprime comme le produit de termes de concentrations. Comme nous
le verrons dans les prochains chapitres, cette situation est quasiment universelle
dans la cintique enzymatique, et mme la plus simple des ractions enzymatiques
ne possde pas d'ordre simple. Nanmoins, le concept d'ordre de raction est trs
important pour comprendre la cintique enzymatique, parce que les tapes
individuelles des ractions catalyses par des enzymes ont habituellement des
ordres simples ; elles sont de premier ou de second ordre. La fixation d'une
molcule de substrat sur une molcule d'enzyme est un exemple typique de raction
bimolculaire de second ordre, alors que la conversion du complexe enzyme-
substrat en produits ou en un intermdiaire est un exemple typique de raction
unimolculaire du premier ordre.
Pour une raction du premier ordre A P, la vitesse v est exprime par
l'quation suivante :
d[ P ]
v = = k [ A ] = k ([ A ]0 [ P ]) [1.5]
dt
dans laquelle [ A ] et [ P ] reprsentent respectivement les concentrations de A et P
n'importe quel temps t, et k reprsente la constante de vitesse de premier ordre.
Le second terme de l'quation spcifie que la raction est de premier ordre,
puisqu'il montre que la vitesse est directement proportionnelle la concentration du
ractif A leve la puissance 1. Finalement, si au temps initial de la raction, t = 0,
la concentration [ A ] = [ A ]0 , la stchiomtrie permet de relier les valeurs de [ A ]
et de [ P ] tout moment de la raction, en accord avec l'quation de conservation
[ A ] + [ P ] = [ A ]0 , et permet d'crire le dernier terme de l'quation.
L'quation [1.5] peut facilement tre intgre en isolant les deux variables [ P ] et t,
c'est--dire en plaant tous les termes en [ P ] dans la partie gauche de l'quation et
tous les termes en t dans la partie droite.
d[ P ]
= k dt [1.6]
[ A ]0 [ P ]
Aprs intgration, nous obtenons :
ln([ A ]0 [ P ]) = k t + a [1.7]
o a est une constante d'intgration.
1 PRINCIPES DE BASE DE LA CINTIQUE CHIMIQUE 13
Celle-ci peut tre value en considrant qu'il n'y a pas de produit P au dbut de la
raction, c'est--dire que [ P ] = 0 quand t = 0. Alors, a = ln([ A ]0 ) , et l'qua-
tion [1.7] peut tre rcrite :
[ A ]0 [ P ]
ln = kt [1.8]
[ A ]0
En prenant l'exponentielle des deux cts de l'quation, nous obtenons l'quation
[ A ]0 [ P ]
= e k t [1.9]
[ A ]0
qui peut tre rarrange pour donner :
[ P ] = [ A ]0 ( 1 e k t ) [1.10]
Il est important de noter que la constante d'intgration a est diffrente de zro et
qu'elle doit tre value et utilise pour obtenir les quations [1.8] [1.10]. Les
constantes d'intgration doivent toujours tre incluses et values lors de l'int-
gration des quations de cintique ; elles sont rarement nulles.
Le type le plus commun de raction bimolculaire est celui de la forme
A+B P + Q, dans lequel deux sortes de molcules, A et B, ragissent pour
donner des produits. Dans ce cas, il est commun que la vitesse soit donne par une
expression du second ordre de la forme :
d[ P ]
v = = k [ A ][ B ] = k ([ A ]0 [ P ])([ B ]0 [ P ]) [1.11]
dt
o k est la constante de vitesse de second ordre. Il faut noter que le symbolisme con-
ventionnel utilis pour les constantes de vitesse ne prvoit pas de distinguer l'ordre
de ces constantes. L'intgration est ralise en sparant les variables [ P ] et t :
d[ P ]
([ A ] [ P ])([ B ] [ P ]) = k dt [1.12]
0 0
On observe aussi quelques ractions d'ordre zro, c'est--dire des ractions qui ont
une vitesse constante, indpendante de la concentration de substrat. Une raction
peut tre d'ordre zro par rapport l'un des substrats, signifiant simplement que ce
ractif intervient dans la raction en aval de l'tape limitante. Cependant, quelques
ractions sont globalement d'ordre zro, c'est--dire qu'elles ne dpendent de la
concentration d'aucun ractif. Ce sont invariablement des ractions catalyses et
sont observes uniquement si chaque ractif est prsent en large excs de telle sorte
que le catalyseur a atteint son efficacit maximum. Les cintiques d'ordre zro sont
communment rencontres dans les ractions enzymatiques, lorsque la vitesse
approche sa valeur limite pour des concentrations leves de substrat.
0,2 0,2
Pente = 2 Pente = 1
0 0
0 0,2 0,4 log [A] 0 0,2 0,4 log [B]
1.2 - Dtermination de l'ordre de raction
Les droites sont traces pour une raction du second ordre (a) et du premier ordre(b),
impliquant que les pentes de ces droites valent respectivement 2 et 1.
Si aucune de ces alternatives n'est possible, la vitesse doit tre dtermine partir
de la pente au temps initial, c'est--dire dans des conditions de vitesses initiales.
Pratiquement, cette mthode est prfrable pour raliser les mesures cintiques de
ractions enzymatiques, car les courbes d'volution des ractions catalyses par des
enzymes n'obissent gnralement pas des quations simples de vitesse pour de
longues priodes de temps. La modlisation de la courbe complte d'volution
d'une raction enzymatique requiert souvent d'utiliser une quation plus complexe
que celle de la forme de l'quation intgre de vitesse pour des vitesses initiales, du
fait de la perte progressive d'activit de l'enzyme, d'inhibition par des produits ou
d'autres phnomnes.
L'analyse des quations aux dimensions est l'une des techniques les plus simples et
les plus fiables pour dtecter des erreurs algbriques et pour vrifier les rsultats
obtenus. Cette analyse dpend de quelques rgles simples qui rgissent la manire
de combiner des quantits de dimensions diffrentes, et son application repose sur
le fait que les erreurs algbriques conduisent frquemment des expressions dont
les dimensions sont inhomognes. On dfinit ainsi la dimension de concentration,
exprime en molarit (symbole M ou mol L1 ) et la dimension des vitesses de
raction (symbole M s1) Par consquent, dans une expression telle que v = k [ A ] ,
la constante de vitesse k doit tre exprime en s1 afin que les termes de gauche et
de droite de l'quation aient les mmes dimensions. Toutes les constantes de vitesse
du premier ordre ont des dimensions de temps1 , et par des raisonnements
similaires, on dmontre aisment que les constantes de vitesse du second ordre ont
les dimensions de concentration1 temps1 , que les constantes de vitesse de troi-
sime ordre ont les dimensions de concentration2 temps1 , et que les constantes
d'ordre zro ont les dimensions de concentration temps1 (tableau 1.1).
1 PRINCIPES DE BASE DE LA CINTIQUE CHIMIQUE
Ordre 0 Ordre 1 Ordre 2
Equation de vitesse v0 = k v0 = k.[A] v0 = k.[A]2
3.103 3.103
v (M1. s1)
v (M1. s1)
4
v (M1. s1)
2.10
Graphique v
en fonction de [A] 2,5.103 2,5.103
1,5.104 3
2.10 2.103
1.103 1.103
5.105 4
5.10 5.104
0 0
0.10 0 0,00006 0,0012 0.10 0 0,00006 0,0012 0.1000 0,00006 0,0012
[A] (M) [A] (M) [A] (M)
Dtermination de log v0 = log k log v0 = 1.log [A] + log k log v0 = 2.log [A] + log k
l'ordre de la raction
1 1 1
log v
log v
log v
Graphique log v 2 2 2
en fonction de log [A] 3 3 3
4 4 4
5 5 5
6 6 6
7 7 7
8 8 8
6,5 4,5 2,5 6,5 4,5 2,5 6,5 4,5 2,5
log [A] log [A] log [A]
Dtermination de [A]t = [A]0 k.t ln [A]t = ln [A]0 k.t 1/[A]t = 1/[A]0 + k.t
la constante de vitesse
1.103 6.10
0
1.103
[A] (M)
ln [A]
1/[A] (M1)
0
Linarisation 1.10
3 8.10 1.10
3
17
18 CINTIQUE ENZYMATIQUE
y La pente = Dy/Dx
a les dimensions de y/x
Dy
Dx
L'intersection avec l'axe
des x a les dimensions de x
L'ordonne l'origine
a les dimensions de y
x
1.3 - Application de l'analyse aux dimensions dans un graphique
ln ( k1 [ A ]0 ( k1 + k 1 )[ P ] )
Donc = t +a [1.24]
( k1 + k 1 )
ln( k1 [ A ]0 )
Si nous posons que [ P ] = 0 quand t = 0, nous obtenons que a = ,
( k1 + k 1 )
et l'quation suivante :
k [ A ]0 ( k1 + k 1 )[ P ]
ln 1 = ( k1 + k 1 )t [1.25]
k1 [ A ]0
En prenant l'exponentielle des deux cts, nous obtenons l'quation :
k1 [ A ]0 ( k1 + k 1 )[ P ]
= e ( k 1 +k 1 ) t [1.26]
k1 [ A ]0
20 CINTIQUE ENZYMATIQUE
De trs nombreuses ractions sont du premier ordre pour chacun des ractifs et,
dans ces cas, il est souvent possible de raliser les mesures dans des conditions de
pseudo-premier ordre en maintenant en large excs la concentration de tous les
ractifs sauf un. Ainsi, dans de nombreuses situations exprimentales, le problme
de la dtermination d'une constante de vitesse peut-il tre rduit au problme de la
dtermination d'une constante de vitesse de premier ordre. Nous avons vu dans
l'quation [1.10] que pour une raction simple de premier ordre :
[ P ] = [ A ]0 ( 1 e k t ) [1.28]
et dans l'quation [1.27], que dans le cas plus gnral d'une raction rversible :
[ P ] = [ P ] ( 1 e ( k 1 +k 1 ) t ) [1.29]
[ P ] [ P ]i = [ P ] e ( k 1 +k 1 ) t i [1.33]
( k 1 +k 1 )( t i +t )
[ P ] [ P ]i ' = [ P ] e [1.34]
Par soustraction, nous obtenons :
[ P ]i ' [ P ]i = [ P ] ( 1 e ( k 1 +k 1 ) t ) e ( k 1 +k 1 ) t i [1.35]
et en prenant les logarithmes, nous obtenons :
ln ([ P ]i ' [ P ]i ) = ln [ P ] + ln ( 1 e ( k 1 +k 1 ) t ) ( k1 + k 1 )ti [1.36]
que nous pouvons galement crire :
( k1 + k 1 )ti
log ([ P ]i ' [ P ]i ) = constante [1.37]
2 , 303
Ainsi, un graphique de log([ P ]i ' [ P ]i ) en fonction de t donne une droite dont la
pente vaut (k1 + k1)/2,303, comme illustr dans la figure 1.4. Ce graphique,
connu sous le nom de graphique de GUGGENHEIM, ne ncessite pas l'estimation de
[ P ] . Puisque le rapport k1/k1 est gal la constante d'quilibre, qui peut tre
estime indpendamment, les valeurs des constantes individuelles de vitesse k1 et
k1 peuvent tre calcules partir des deux combinaisons.
log ([P'i ] [Pi ])
1,6
Pente = (k1 + k1)/2,303
1,4
1,2
0,8
0,6
0,4
0 5 10 15 20 Temps (min)
1.4 - Le graphique de GUGGENHEIM
Ce graphique permet de dterminer la valeur d'une constante de vitesse de premier ordre
sans la ncessit de dterminer prcisment l'tat d'avancement de la raction l'quilibre
([ P ]). Les symboles sont dfinis comme suit : [ P ]i et [ P ]i', concentration du produit
respectivement, aux temps t et t + t, o t est une constante.
[P] (M) 35
30
25
20
15
10
0
0 1 2 3 4 5 Temps (s)
1.5 - Ajustement paramtrique non-linaire d'une courbe de [ P ] en fonction du temps
Un programme d'ajustement paramtrique utilisant la mthode des moindres carrs a t
utilis pour modliser les points exprimentaux sur l'quation [1.29]. Cette procdure a
fourni les paramtres suivants : [ P ] = 25,6 0,7 mM et k = 0,95 0,09 s1 qui ont t
utiliss pour tracer la ligne continue qui reprsente donc la meilleure courbe passant par
les points exprimentaux.
1 PRINCIPES DE BASE DE LA CINTIQUE CHIMIQUE 23
PROBLMES
1.1 - Les donnes du tableau suivant ont t obtenues pour la vitesse d'une
raction de stchiomtrie A + B P diffrentes concentrations de A
et de B. Dterminez l'ordre de la raction par rapport A et B et
suggrez une explication pour l'ordre observ pour A.
a nanmoins des limites ; elle ne nous informe ni sur la rapidit dune raction, ni
sur la manire dont une raction se droule (interactions molculaires). Pour
obtenir ces informations, il faut avoir recours des tudes cintiques dans
lesquelles on observe lvolution du systme au cours du temps. Les tudes
cintiques fournissent une mesure de la vitesse laquelle une raction sapproche
de son tat dquilibre ou sen carte si la raction est couple une seconde
raction. Les deux approches sont donc complmentaires et doivent tre exploites
conjointement dans ltude des ractions enzymatiques.
Dans toute tude, il est toujours ncessaire de dfinir lobjet qui est tudi.
En thermodynamique, la partie de lunivers qui est tudie est appele le systme,
alors que la partie restante est appele lenvironnement. Le systme est dfini en
fonction de ltude raliser et des objectifs recherchs. Un tre vivant ou une
cellule peuvent reprsenter un systme. Une cellule vivante renferme une grande
quantit denzymes diffrentes et donc, dans le cas de ltude de ractions
enzymatiques, la cellule constitue un systme dans lequel les ractions se droulent
dans un espace spar du reste du monde par la membrane plasmique de la cellule.
Le systme correspond lespace occup par les substrats, les enzymes et les
produits. Dans les tudes in vitro, le systme peut ainsi se rduire au tube essai ou
la cuve du spectromtre contenant la solution de substrat et denzyme.
La dfinition dun systme thermodynamique implique galement de dfinir les
proprits de ses frontires. La nature des changes entre le systme et son
environnement permet de distinguer diffrents types de systmes :
les systmes ouverts permettent des changes de matire et dnergie ;
les systmes ferms permettent des changes dnergie mais pas de matire ;
les systmes isols ne permettent aucun change.
Univers
Environnement
Systme
Ltat dun systme macroscopique lquilibre peut tre dfini par un nombre
restreint de proprits. Si le systme change dtat, son nouvel tat est caractris par
un nouvel ensemble de proprits et le passage dun tat lautre implique quune ou
plusieurs des proprits du systme varient. En thermodynamique, un processus est
dfini comme la variation dune des proprits du systme. Quand de la chaleur, du
travail ou de la matire sont changs entre le systme et son environnement, le
systme volue de son tat dquilibre initial vers un nouvel tat dquilibre.
Il faut distinguer les changements rversibles et les changements irrversibles. Un
processus rversible se droule en passant par une succession dtats dquilibre,
chacun diffrant du prcdent par une modification infinitsimale dune des
proprits du systme. Par contre, si le changement est opr de manire brutale et
entrane une grande variation dune des proprits, le processus est irrversible.
Considrons deux processus, lun rversible et lautre irrversible, caractriss par
les mmes tats initiaux et finaux. Dune part, ces deux processus sont similaires
puisque les proprits initiales et finales de chacun de ces systmes sont identiques.
Par contre, ils sont diffrents parce que les quantits changes de chaleur et de
travail au cours des ces deux processus sont diffrentes. La chaleur et le travail
dpendent du chemin suivi par le systme au cours de sa transformation. Si le
processus est rversible, le systme est constamment lquilibre et toutes les
proprits restent uniformes pendant la raction. Si le processus est irrversible,
certaines proprits, comme la temprature ou la pression, ne sont pas uniformes
28 CINTIQUE ENZYMATIQUE
dans le systme et nont pas de valeur bien dfinie jusqu ce que le systme ait
atteint sont nouvel tat dquilibre. De nombreux processus naturels sont
irrversibles dans le sens o le systme ne peut tre ramen son tat de dpart
quen fournissant de lnergie partir dun autre systme. Il faut noter que
lirrversibilit au sens thermodynamique ne signifie pas que le systme ne puisse
pas retourner son tat initial, mais simplement que ce retour ncessite un apport
dnergie.
E
Cp = [2.3b]
T p
2 LA THERMODYNAMIQUE ET LA THORIE DES VITESSES ABSOLUES 29
Pour un gaz parfait, ces deux paramtres sont relis par lquation suivante :
C p CV = n R [2.4]
o n est le nombre de moles et R est la constante des gaz parfaits.
Par convention, des valeurs positives sont attribues aux variations dq et dT lorsque
la chaleur est absorbe par le systme. Pour le travail, qui peut tre effectu par le
systme sur lenvironnement ou sur le systme par lenvironnement, dw est positif
lorsque le travail est effectu sur le systme par lenvironnement. Un travail positif
correspond ainsi un flux dnergie vers le systme. La diffrence majeure entre la
chaleur et le travail rside dans les chelles des mouvements travers la frontire
du systme. Le travail correspond des mouvements qui sont organiss lchelle
macroscopique alors que la chaleur correspond des mouvements lchelle
molculaire qui ne prsentent aucune organisation lchelle macroscopique.
Lquation [2.1] indique que lorsquil y a un dsquilibre entre travail et chaleur, le
systme volue dune faon mesurable. Par exemple, si le systme fournit plus de
travail quil ne reoit de chaleur, lnergie du systme est progressivement
consomme (E diminue). Inversement, si le systme reoit plus dnergie sous
forme de chaleur quil n'en dpense sous forme de travail, la temprature du
systme augmente. Une faon simple et courante dobtenir des informations sur les
variations dnergie dun systme consiste mesurer la variation de chaleur. Nous
avons vu que la variation dnergie dE est une diffrentielle exacte, cest--dire
quelle ne dpend que des tats initiaux et finaux du systme, alors que les
variations dq et d w sont des diffrentielles inexactes qui sont dpendantes de la
manire selon laquelle les modifications seffectuent. Dans des cas simples, il est
possible de montrer que la variation de chaleur dpend uniquement des tats
initiaux et finaux. Par exemple, si lon considre uniquement un travail mcanique
se droulant volume constant, la variation de chaleur est gale la variation
dnergie. Par contre, si la raction se droule pression constante, le travail est
donn par dw = pdV et lquation de conservation scrit :
dE = dq p dV [2.5]
Une nouvelle variable dtat, lenthalpie, est dfinie pour reprsenter la quantit de
chaleur change pression constante :
H = Q p = E + pV [2.6]
Le terme pdV na une grandeur significative que pour des ractions impliquant des
gaz ou pour des ractions seffectuant des pressions extrmement leves.
En biochimie, il est donc courant dassimiler dH dQp et puisquil est plus facile
de mesurer une variation de la quantit de chaleur pression constante plutt qu
volume constant, la variation denthalpie est une grandeur couramment utilise
pour suivre lvolution des systmes biologiques.
30 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Par contre, la chaleur et le travail ntant pas des variables dtats, la somme de ces
grandeurs ne doit pas obligatoirement tre gale zro, ce que nous pouvons
exprimer par les deux quations suivantes :
w 0 [2.8a]
cycle
q 0 [2.8b]
cycle
chaud vers un rservoir froid. Au cours de ce processus, une partie de la chaleur est
convertie en travail. Il peut tre dmontr que le rendement maximum dun moteur
est atteint si le transfert de chaleur se fait dans des conditions rversibles dun point
de vue thermodynamique et la variation dentropie pour chaque tape est alors
dfinie comme :
dq rev
dS = [2.10]
T
o dqrev reprsente la variation de chaleur si le processus se droule de manire
rversible. Lentropie est une proprit du systme, et donc la variation dentropie
au cours dun processus, comme la variation dnergie (quation [2.1]), dpend
uniquement de ltat initial et de ltat final du systme :
dS = S f S0 [2.11]
o S0 et Sf reprsentent respectivement lentropie du systme dans son tat initial et
dans son tat final.
1. Une relation peut galement tre tablie entre linformation contenue dans un
systme et son entropie. Linformation rduit lincertitude concernant la ralisation
dun vnement et donc constitue une forme dorganisation du systme. Par
exemple, linformation contenue dans un texte provient de la disposition prcise
des caractres. Linformation peut tre considre comme une forme dnergie que
lon appelle lentropie ngative ou ngentropie du systme (SCHRDINGER, 2000).
2 LA THERMODYNAMIQUE ET LA THORIE DES VITESSES ABSOLUES 33
Le systme volue spontanment vers ltat pour lequel lnergie de GIBBS est la
plus basse ; si dans le sens dfini de la raction la variation du DG est ngative, la
raction sera spontane dans ce sens. Par exemple, si DG = GP GA < 0, la raction
de la figure 1.1 volue spontanment de la gauche vers la droite. La mesure de la
variation dnergie de GIBBS fournit donc un critre de spontanit de la raction
dans des conditions donnes.
utilise jusqu prsent est une grandeur extensive, puisquelle dpend du nombre
de moles de la substance prsent dans lchantillon. Le potentiel chimique au
contraire est une grandeur intensive: il nous renseigne sur la faon dont lnergie
de GIBBS varie par mole de substance ajoute au systme.
En enzymologie, nous sommes principalement intresss par le comportement des
solutions. La thermodynamique des solutions est dtermine par la manire dont
lnergie totale de GIBBS ou les potentiels chimiques de chaque composant dpendent de
la composition. Il est habituel de dfinir une solution idale comme une solution pour
laquelle lnergie de GIBBS de chacun des soluts dpend de sa fraction molaire :
Gi = ni Gi + ni RT lnX i [2.22]
o Gi est lnergie de GIBBS molaire de la substance pure et Xi est sa fraction molaire.
Comme dans une solution suffisamment dilue, la fraction molaire est proportionnelle
la concentration, lnergie de GIBBS de chaque solut est donne par :
C
Gi = ni Gi + ni RT ln i [2.23]
C
o Gi est lnergie de GIBBS par mole dans ltat standard, cest--dire dans des
conditions dfinies de pression (1 atm), de temprature (298 K) et de concentration
(C = 1 mole par litre). Cette dernire quation indique que lnergie de GIBBS
dune substance dissoute dpend non seulement du nombre de moles n, mais
galement de la concentration C de la substance dissoute. Lquation [2.24],
obtenue en combinant les quations [2.20] et [2.23], montre que le potentiel
chimique dpend de la concentration :
C
mi = mi + RT ln i [2.24]
C
Dans cette quation, Ci est la concentration molaire du compos i et mi est son
potentiel chimique dans des conditions standard (Ci = 1 M).
Dans le cas de molcules portant des charges lectriques Z, on utilise le potentiel lectrique,
y, qui, combin avec le potentiel chimique, donne le potentiel lectrochimique, mi ,
C
m i = m i + RT ln i + ZFy [2.25]
C
o F est la constante de FARADAY dont la valeur est : 96 480 J mol1 V1.
Pour une raction chimique limite par un quilibre, comme par exemple la
raction disomrisation simple de A en P,
k1
A P [2.26]
k1
2 LA THERMODYNAMIQUE ET LA THORIE DES VITESSES ABSOLUES 35
20 000
Contenu en nergie de GIBBS G (J)
19 000
A
18 000
17 000
G <K G >K
16 000
15 000
0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000 G /K
2.2 - Evolution de lnergie de GIBBS en fonction du rapport daction de masse G
Comme nous lavons dj discut dans le premier chapitre au sujet du pH, il est
incorrect dattribuer une signification au logarithme dune quantit ayant une
dimension. Un second exemple est fourni par la dfinition des constantes
dquilibre. Pour toutes les ractions dans lesquelles le nombre de substrats est
diffrent du nombre de produits, il est habituel dcrire la constante dquilibre K
de la raction comme une grandeur qui a une dimension.
2 LA THERMODYNAMIQUE ET LA THORIE DES VITESSES ABSOLUES 37
Dans une raction limite par un quilibre, il est ncessaire de distinguer les
notions de vitesse initiale et de vitesse nette. Considrons le systme disomri-
sation simple de A en P prsent dans lquation [2.26]. La raction peut tre
divise en deux demi-ractions qui peuvent chacune tre dcrite par une quation
de vitesse. Ces deux quations de vitesse correspondent aux quations donnant la
38 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Ceq C 1,0
(units 0,9
arbitraires)t Produit
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
Ractif
0,1
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Temps (s)
a - Reprsentation de lvolution au cours du temps des concentrations du ractif et du
produit. Aprs un temps infini, les concentrations ont atteint leur valeur dquilibre.
Ceq Ct 1,0
(units 0,8
arbitraires)
0,6
0,4
Produit
0,2
0,0
0,2
Ractif
0,4
0,6
0,8
1,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Temps (s)
b - Reprsentation de lvolution au cours du temps de lcart des concentrations de
produit et de ractif par rapport aux concentrations lquilibre
2.3 - Evolution dune raction simple disomrisation vers son tat dquilibre
Ltude des systmes hors dquilibre est beaucoup plus difficile que celle des
systmes lquilibre, nanmoins la description de tels systmes est grandement
facilite si ceux-ci se trouvent dans un tat stationnaire ou au moins sils sen
approchent suffisamment pour tre correctement reprsents par lapproximation
de ltat stationnaire.
Une situation de non-quilibre se caractrise par une vitesse nette non-nulle et par
une variation dnergie de GIBBS du systme non-nulle :
vnette 0 [2.51a]
DG 0 [2.51b]
Dans une telle situation, il est plus difficile de dcrire quantitativement la manire
dont lapparition du produit dpend de la concentration de substrat : le systme
change au cours du temps. Une premire solution consiste utiliser une forme
intgre de lquation de vitesse. Cette dmarche est simple pour les ractions
simples comme celle dcrite dans lquation [2.26], mais pour des ractions
plus complexes impliquant la formation successive de plusieurs intermdiaires
(comme celle de lquation [2.47]), qui sont rgulirement observes dans les
42 CINTIQUE ENZYMATIQUE
a - quilibre
b - tat stationnaire
2.4 - Illustration de la diffrence entre (a) une situation dquilibre et
(b) une situation dtat stationnaire dans le cas de lcoulement dun fluide
0,0010
Concentration (u. a.)
0,0008
A
0,0006
0,0004 P
0,0002
X
0,0000
0,0002
0 0,03 200 400 600 800 1000
Temps (s)
2.5 - Variations de la concentration des diffrents ractifs
et intermdiaires au cours dune raction
Dans le premier chapitre, nous avons exprim la vitesse dune raction lmentaire
en terme de constante de vitesse, qui est un paramtre exprimental utilisable pour
dcrire quantitativement la vitesse dune raction chimique ou biochimique. Nous
allons maintenant essayer de comprendre ce qui dtermine la grandeur de la
constante de vitesse. Il est clair que la constante de vitesse dune raction dpend
des interactions molculaires qui ont lieu durant les rencontres entre molcules
individuelles et que la vitesse dune raction dpend avant tout de la frquence
avec laquelle les molcules se rencontrent dans la solution. La loi daction de
masses tablit clairement la relation entre la vitesse et la concentration des ractifs.
Toutefois, la vitesse des ractions ne dpend pas seulement de la frquence des
rencontres et toutes les rencontres ne donnent pas lieu une raction. Comme nous
allons le voir, la probabilit quune rencontre entre molcules conduise une
raction dpend de la variation dnergie de GIBBS qui se produit lorsque les
molcules se rencontrent. La premire tape de notre dmarche consiste donc
donner une reprsentation de la variation de lnergie du systme au cours de la
rencontre entre molcules ractionnelles.
qui est plus facilement accessible et qui suit gnralement un chemin tortueux
passant par un col. Le chemin suivi peut tre dcrit compltement sur une carte
deux dimensions, mais la progression du promeneur peut galement tre dcrite par
une seule variable correspondant la distance parcourue le long du chemin. La
variable quivalente utilise pour dcrire la progression dune raction chimique est
appele coordonnes de la raction. Le profil dnergie de GIBBS de la raction est
un graphique reprsentant lnergie de GIBBS du systme en fonction des
coordonnes de la raction.
Dans un tel profil, les substrats et les ractifs reprsentent des tats stables du
systme et correspondent donc des minima dnergie de GIBBS. Puisque le
passage des substrats aux produits ncessite de rompre ou de former de nouvelles
liaisons, le systme ractionnel passe travers un continuum dtats dnergie
lorsquil volue le long des coordonnes de la raction. A un certain stade de ce
processus, le systme doit passer par un tat dans lequel lnergie de GIBBS est
maximale, correspondant un point de selle de la surface dnergie de GIBBS. A ce
stade de la raction, lnergie de GIBBS est maximale le long des coordonnes
ractionnelles mais est minimale pour tout mouvement perpendiculaire ce
chemin. Les molcules au point de selle sont dites tre dans un tat activ, qui est
aussi appel ltat de transition. La variation dnergie entre les substrats et ltat
de transition est appele lnergie dactivation de GIBBS, qui peut, de la mme
faon, tre dfinie pour la raction inverse.
Ds les premires tudes de la vitesse des ractions, il est apparu clairement que les
constantes de vitesse variaient fortement avec la temprature. De ces observations
il dcoule que, dune part il est ncessaire de contrler la temprature lors des
mesures cintiques, mais dautre part des informations essentielles sur le
mcanisme de raction peuvent tre obtenues en mesurant leffet de la temprature
sur la vitesse de la raction. Les tudes de VANT HOFF (1884) et dARRHENIUS
(1889) constituent le point de dpart de toutes les thories modernes qui visent
expliquer la dpendance des constantes de vitesse vis--vis de la temprature.
HARCOURT (1867) avait pralablement not que la vitesse de nombreuses ractions
doublait approximativement pour chaque augmentation de 10 C de la temprature,
mais VANT HOFF et ARRHENIUS ont tent dtablir une relation plus exacte en
comparant les observations cintiques avec les proprits dj connues des
constantes dquilibre. Toute constante dquilibre K varie avec la temprature
absolue T, en accord avec lquation de VANT HOFF :
d lnK DH
= [2.58]
dT RT 2
o R est la constante des gaz parfaits et DH est la variation denthalpie libre
standard associe la raction.
2 LA THERMODYNAMIQUE ET LA THORIE DES VITESSES ABSOLUES 47
Puisque la constante dquilibre K est galement donne par le rapport k1/k1, nous
pouvons crire :
d ln ( k1 / k 1 ) d ln k1 d ln k 1 DH
= = [2.59]
dT dT dT RT 2
Sur base de cette galit, nous pouvons driver des expressions spares pour
chacune des constantes de vitesse, k 1 et k 1 :
d ln k1 DH1
= +l [2.60a]
dT RT 2
d ln k 1 DH 1
= +l [2.60b]
dT RT 2
o l est une grandeur au sujet de laquelle nous ne disposons daucune information,
si ce nest quelle a vraisemblablement la mme valeur dans les deux quations
[2.60a] et [2.60b]. Dans le cas contraire, elle ne disparatrait pas quand ces qua-
tions sont combines pour obtenir lquation [2.59]. Toutefois, il est impossible de
dmontrer exprimentalement lexistence du terme l dans ces quations et
ARRHENIUS a postul que l est gal zro. Ds lors, la dpendance la temprature
de toute constante de vitesse k peut tre exprime par une quation de la forme
d ln k EA
= [2.61]
dT RT 2
o EA est lnergie dactivation qui est relie lenthalpie standard de la raction,
DH, dans lquation de VANT HOFF. Lintgration de lquation [2.61] donne :
E
ln k = ln A A [2.62]
RT
o A est une constante dintgration. Cette forme de lquation de ARRHENIUS est
la plus approprie pour des reprsentations graphiques, puisquelle autorise de
tracer soit un graphique reprsentant ln k en fonction de 1/T caractris par une
droite dont la pente vaut EA /R, soit un graphique reprsentant log k en fonction de
1/T, caractris par une droite ayant une pente qui vaut EA /2,303R. Ce graphique
illustr dans la figure 2.6, est connu sous le nom de graphique dARRHENIUS, et
constitue une mthode simple dvaluation de EA.
Temprature (C)
70 60 50 40 30 20 10 0
log k 3,5
3
k/1000
2
3
1
Pente = EA / 2,303R
0
0 20 40 60
Temprature (C)
2,5
2
2,9 3 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6 3,7
1000 /T 1
(K )
2.6 - Graphique dARRHENIUS
Lnergie dactivation EA est calcule partir de la pente. Linsert montre les mmes
donnes avec une reprsentation linaire des coordonns.
G Etat de transition
X Etat de transition
DG intermdiaire
Energie de GIBBS
d'activation
A+B
Ractifs
Energie de GIBBS
de la raction DG P+Q
Produits
Coordonnes de la raction
2.7 - Profil ractionnel en accord avec la thorie de ltat de transition
Le diagramme le long de laxe des abscisses reprsente les coordonns de raction pour
une simple raction bimolculaire. L'insert montre le cas o la raction passe par un
intermdiaire.
50 CINTIQUE ENZYMATIQUE
v = B e RT [ A ][ B ] [2.78]
h
Dans le premier chapitre, nous avons vu que la loi empirique daction de masses
fournit lexpression suivante pour la vitesse dune raction de second ordre :
v = k [ A ][ B ] [2.79]
La comparaison des quations [2.78] et [2.79] montre que la constante de vitesse k
est donne par :
k T DG
k = B e RT [2.80]
h
Lquation [2.80] est lquation centrale de la thorie dEYRING de ltat de transition
et limine le mystre qui entoure la constante de vitesse : elle donne cette grandeur
une valeur qui dpend des constantes fondamentales de la mcanique quantique, kB et
52 CINTIQUE ENZYMATIQUE
doivent tre optimales dans ltat de transition. La difficult dans ltude de ltat
de transition est que sa structure ne peut pas tre dtermine directement. La
complmentarit entre lenzyme et ltat de transition de la raction ne peut tre
dmontre que de manire indirecte.
PROBLMES
3.1. HISTORIQUE
Les premires dmonstrations dune activit enzymatique dans des extraits naturels
remontent au XVIIe sicle, quand RAUMUR dabord et SPALLANZANI ensuite
montrent que le suc gastrique des oiseaux est impliqu dans la digestion de la
viande. Dans une exprience simple, SPALLANZANI nourrit des aigles avec des
morceaux de viande entours dun treillis mtallique quil peut ensuite extraire de
lestomac des oiseaux pour suivre lvolution de la digestion. La mise en vidence
de lactivit dautres enzymes se poursuit au XIXe sicle. En 1833, PAYEN et
PERSOZ isolent partir du malt une substance qui est responsable de la fermenta-
tion et quils nomment diastase. Ce terme sera par la suite utilis pour dsigner de
manire gnrale toutes substances responsables de fermentation. Plus tard, le
suffixe -ase a t conserv pour dsigner la macromolcule responsable dune
activit enzymatique. Par exemple, lamylase est un enzyme responsable de la
dgradation de lamidon. En 1836, alors quil tudie les processus digestifs,
SCHWANN isole la pepsine, une substance responsable de la digestion dans lesto-
mac et le premier enzyme obtenu partir dun tissu animal. Les dcouvertes se
succdent ensuite : lmulsine (WOHLER et LIEBIG, 1837), la lipase du pancras
(BERNARD, 1840), linvertase de la levure (BERTHELOT, 1860) et la trypsine du
pancras (KUHNE, 1877).
A cette poque, la nature de ces agents actifs est inconnue et fait mme lobjet dune
controverse. Dun ct, il y a ceux qui, derrire Louis PASTEUR, pensent que les
fermentations sont provoques par des microorganismes et que les agents
responsables, les ferments, ne peuvent tre dissocis de la prsence de cellules
vivantes. De lautre ct, il y a ceux, qui derrire Julius LIEBIG, pensent que les
ferments sont des substances dissociables des tres vivants. Les ferments sont donc
diviss en deux catgories, les ferments figurs qui sont visibles et impliquent la
prsence de cellules vivantes et les ferments solubles . Pour dsigner ces derniers,
KUHNE invente le mot enzyme qui signifie littralement dans la levure , mais
56 CINTIQUE ENZYMATIQUE
RAUMUR est surtout clbre pour la construction, sur la base des travaux de NEWTON, du
premier thermomtre alcool fiable et que nous utilisons toujours. Il publie ses travaux
dans un mmoire intitul Rgles pour construire des thermomtres. Il choisit comme
points extrmes de sa graduation les tempratures de fusion et dbullition de leau, mais
les fabricants divisent cette gamme en 80 degrs. Cest CELSIUS qui plus tard introduira la
division centsimale utilise jusqu nos jours.
Il fait de trs nombreuses dcouvertes dans le domaine des sciences naturelles. Il tudie
principalement les invertbrs qui, cette poque, sont gnralement dlaisss par les
autres naturalistes. Entre 1734 et 1742, RAUMUR publie six volumes de ses Mmoires pour
servir lHistoire des Insectes dans lesquels il prsente des observations rigoureuses
3 INTRODUCTION LA CINTIQUE ENZYMATIQUE - RACTIONS UN SUBSTRAT ET UN PRODUIT 57
En 1752, RAUMUR ralise des expriences dans lesquelles il dmontre que la digestion de
la viande par des oiseaux de proie rsulte de laction chimique du suc gastrique plutt que
dune action mcanique. Il fait avaler des rapaces des tubes contenant de la viande et
qui sont ferms leurs extrmits par un bouchon grillag. Lorsque les oiseaux
rgurgitent les tubes, il constate que la viande est partiellement digre. Dans son Second
mmoire sur la digestion (1752), il crit :
Ltude de la vitesse des ractions catalyses par des enzymes dbute dans la
seconde moiti du XIXe sicle, un moment o la cintique chimique est en plein
dveloppement. A cette poque la majorit des tudes taient ralises avec des
enzymes impliqus dans des processus de fermentation, en particulier linvertase 1,
qui catalyse lhydrolyse du saccharose figure 3.1.
Ltude de la cintique dhydrolyse du saccharose en prsence de diffrents acides
avait conduit au dveloppement des quations de vitesse et avait finalement amen
GULDBERG et WAAGE proposer en 1864 la loi daction de masses et ensuite
VANT HOFF dfinir la constante dquilibre dune raction rversible comme le
rapport des vitesses dans les directions directe et inverse. A la fin du XIXe sicle, les
fondements thoriques de la cintique chimique sont donc tablis et la question qui
intrigue les savants de lpoque est de savoir si la cintique des ractions catalyses
par les enzymes peut tre dcrite par les mmes lois. Les enzymes sont associs
des ractions du monde vivant et la dmonstration que ces composs obissent aux
mmes lois que les ractions chimiques a, lpoque, une porte beaucoup plus
profonde que la rsolution dun problme de cintique de raction.
CH2OH
H O H HOCH2 O H
H
HO
OH H o H HO CH OH
2
[a]D = + 66,5 H OH OH H
-D-fructofuranosyl--D-glucopyranoside
CH2OH
H O H HOCH2 O CH2OH
H
OH H H HO
HO OH H OH
[a]D = + 112,2 H OH OH H
-D-glucopyranose -D-fructofuranose
CH2OH
H O OH HOCH2 O OH
H
OH H H HO
HO H H CH2OH
[a]D = + 18,7 H OH OH H
-D-glucopyranoside -D-fructofuranose
3.1 - Lhydrolyse et la mutarotation du saccharose
La majorit des tudes ralises au XIXe sicle et au dbut du XXe sicle portaient sur des
enzymes impliqus dans les phnomnes de fermentation, et en particulier sur linvertase
qui catalyse lhydrolyse du saccharose. Lhydrolyse du saccharose par les acides ou par
linvertase est un modle important qui a servi aux premiers dveloppements de la cin-
tique chimique et de la cintique enzymatique. Lhydrolyse du saccharose, qui saccom-
pagne de la mutarotation du glucose et du fructose, tait suivie par polarimtrie. Le
pouvoir rotatoire spcifique []D correspond langle de rotation du plan de polarisation de
la lumire mesur 589,6 nm (la longueur donde de la raie D du sodium) rapporte pour
une cuvette dont le trajet optique a une longueur de 1dm et pour un chantillon dont la
concentration est gale 1 g mL1.
3 INTRODUCTION LA CINTIQUE ENZYMATIQUE - RACTIONS UN SUBSTRAT ET UN PRODUIT 59
Substrat (A)
Enzyme Groupe Groupe
catalytique 1 catalytique 2
Enzyme (E) Complexe (EA)
3.2 - Le concept cl-serrure propos par Emil FISCHER pour expliquer la spcificit
daction des enzymes suggrait lexistence dun complexe enzyme-substrat
3 INTRODUCTION LA CINTIQUE ENZYMATIQUE - RACTIONS UN SUBSTRAT ET UN PRODUIT 61
Dans leurs tudes menes sur linvertase, OSULLIVAN et TOMPSON ont remarqu
que la stabilit thermique de lenzyme augmentait en prsence de son substrat et ils
ont voqu lide de la formation dun complexe enzyme-substrat pour expliquer
cette variation des proprits de la protine.
Linvertase, quand elle est mise en prsence de sucre de canne (saccharose)
supporte une temprature de 25oC suprieure celle quelle supporte en son
absence. Cest un fait trs marquant et, autant que nous pouvons en juger, il y a une
seule explication cela, nommment que linvertase se combine avec le sucre.
Adolphe WURTZ (1880) est arriv une conclusion similaire pour expliquer lap-
parition dun prcipit lors de lhydrolyse de la fibrine catalyse par la papane ; il
suggre que le prcipit est un compos papane-fibrine qui agit comme un inter-
mdiaire dans lhydrolyse. Nanmoins, cest BROWN qui dmontre dfinitivement
que la formation dun complexe entre lenzyme et son substrat explique les dpen-
dances exprimentales de la vitesse de raction vis--vis des concentrations
denzyme et de substrat. En parallle avec dautres chercheurs, BROWN observe
que les vitesses des ractions catalyses par des enzymes dvient des cintiques de
second ordre (1892). Initialement, il a montr que la vitesse dhydrolyse du saccha-
rose dans la raction de fermentation par des levures vivantes semble tre dpen-
dante de la concentration de saccharose. Le conflit entre les rsultats de BROWN et
ceux de OSULLIVAN et TOMPSON na pas t apprhend srieusement, parce que
la catalyse par des enzymes isols est considre comme un phnomne
fondamentalement diffrent de la fermentation par des organismes vivants. Mais la
dcouverte par Eduard BUCHNER (1897), quun extrait de levure dpourvu de
cellule vivante peut catalyser la fermentation alcoolique, pousse BROWN (1902)
rexaminer ses rsultats. Aprs avoir confirm leur vracit, il montre que des
rsultats similaires peuvent tre obtenus avec linvertase purifie. BROWN (1892)
dfend lide du complexe enzyme-substrat dans un contexte purement cintique. Il
propose quun mcanisme impliquant un complexe enzyme-substrat impose une
limite sur la vitesse de raction qui peut tre atteinte par le systme. Si un
complexe existe pendant un bref laps de temps avant la libration du produit, alors
une vitesse maximale devrait tre atteinte lorsque la concentration de substrat est
suffisante pour convertir tout lenzyme en complexe enzyme-substrat, en accord
avec la loi daction de masses. Inversement, de plus faibles concentrations de
substrat, la vitesse laquelle le complexe est form devient significative et, en
consquence, la vitesse de raction est dpendante de la concentration de substrat.
Selon HENRI (1903), diverses tudes menes au moment o il entame son travail
font apparatre des diffrences entre laction des enzymes et celle des acides et
suggrent que les enzymes oprent par un mcanisme diffrent de celui des acides.
HENRI propose dentreprendre une tude exprimentale systmatique de la
cintique enzymatique en faisant varier les conditions dune manire aussi
complte que possible et danalyser les rsultats en se plaant de nouveau au point
de vue des lois de la chimie gnrale afin de dfinir un mode daction gnral pour
62 CINTIQUE ENZYMATIQUE
les enzymes qui sappuie uniquement sur la loi de laction de masses, sans avoir
recours des proprits sui generis qui seraient dues seulement aux diastases.
Dans son travail de thse, Victor HENRI tudie la cintique daction de trois
enzymes quil purifie lui-mme ou quil obtient sous la forme de prparations
commerciales : linvertase, lmulsine et lamylase. Pour linvertase, il observe que
la vitesse diminue au cours de la raction mais il prouve dfinitivement que cette
diminution est beaucoup moins rapide que ne le prdit une loi de premier ordre.
Pour expliquer cette diffrence, il mesure la variation de la vitesse avec la
concentration de saccharose et observe une variation complexe de la vitesse avec la
concentration de substrat. Ainsi, dans la figure 3.3 qui reproduit les donnes de
HENRI, la vitesse double pour une augmentation dun facteur quatre de la concen-
tration de substrat entre 0,025 M 0,1 M, mais la vitesse est peine trois fois plus
grande pour une augmentation dun facteur dix de la concentration de substrat entre
0,025 M et 0,25 M. Il dmontre que lenzyme nest pas modifi au cours de la
raction et que la diminution de la vitesse observe aux fortes concentrations de
substrat (montre dans la figure 3.3) est due laction inhibitrice des produits,
principalement du fructose (quil appelle lvulose). Finalement, en tudiant la
variation de la vitesse de la raction avec la concentration denzyme, il confirme la
proportionnalit directe entre la vitesse de la raction et la concentration denzyme.
6
Vitesse initiale
(quantits de saccharose interverties par minute)
0
0 0,4 0,8
Concentration de saccharose (M)
3.3 - Cintique dhydrolyse du saccharose par linvertase
Donnes prsentes par HENRI dans sa thse de doctorat. La ligne en trait continu montre
la courbe thorique dessine en utilisant lquation [3.2] et les valeurs suivantes des
paramtres : k = 72,25 s1 et m = 12,1 M1.
Sur la base de ces rsultats, il cherche tablir une quation de vitesse qui permette
de dfinir une constante de vitesse indpendante des concentrations denzyme et de
3 INTRODUCTION LA CINTIQUE ENZYMATIQUE - RACTIONS UN SUBSTRAT ET UN PRODUIT 63
substrat, qui soit drive partir dun mcanisme ractionnel dfini et qui soit en
accord avec la loi daction de masses. Ce travail lamne remettre en question le
modle daction enzymatique de BROWN qui impliquait un temps de vie fix pour
le complexe enzyme-substrat entre sa cration et sa dnaturation, et il propose pour
le remplacer un mcanisme qui, quoique conceptuellement similaire celui de
BROWN, est exprim en des termes mathmatiques et chimiques plus prcis. HENRI
propose que lenzyme interagisse de manire rversible avec le substrat et avec le
produit et que ce soit la rupture du complexe enzyme-substrat qui donne le produit.
Il conoit parfaitement que son modle repose sur deux hypothses et il en discute
les consquences :
des quilibres rapides stablissent entre lenzyme et le substrat et entre lenzyme
et le produit ;
il existe une grande diffrence de concentration entre le substrat et lenzyme.
A partir de ces considrations, il drive une quation de vitesse (quation [3.1]) qui
rend compte des dpendances de la vitesse aux concentrations de substrat, den-
zyme et de produit :
d[ P ] k ( [ A ]0 [ P ] )
v = = [3.1]
dt 1 + m ( [ A ]0 [ P ] ) + n[ P ]
Pour la vitesse initiale, cette quation se simplifie puisque [ P ] = 0 :
d [ P] k [ A ]0
v = = [3.2]
dt 1 + m[ A ]0
Dans ces quations, k, m et n sont des constantes caractristiques du systme
enzymatique tudi. Comme le note HENRI, cette quation prdit que pour une
concentration suffisamment leve de substrat la vitesse de la raction devient
indpendante de la concentration de substrat mais que, pour une concentration
faible de substrat, la vitesse est directement proportionnelle cette concentration.
A la fin du XIXe sicle, aucun enzyme ntait disponible sous une forme purifie et
les mthodes de mesure de lactivit de ces enzymes taient primitives. En dehors
de ces problmes, plusieurs critiques ont t faites au sujet du travail de HENRI.
Bien que lui et BROWN aient atteint des conclusions essentiellement correctes sur le
mode daction des enzymes, ils lont fait sur la base dexpriences qui ouvrent la
porte de srieuses objections. Premirement, la notion de pH qui est particu-
lirement importante pour ltude des ractions en solution na pas encore t
introduite, et HENRI nutilise pas de tampon pour contrler le pH de son chantillon.
Le concept de pH ne sera introduit par SRENSEN quen 1909. OSULLIVAN et
TOMPSON avaient ralis, sans pouvoir y apporter une solution, que la vitesse de la
raction dpendait fortement de lacidit du mlange ractionnel. Lorsque lacidit
est dans la proportion la plus favorable, ils obtiennent des rsultats reproductibles.
64 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Rfrences
C. DEBRU - 1991 - Victor HENRI, dans Dictionary of Scientific Biography Supplement II,
vol. 1 : 410-413
C. DEBRU - La photosynthse : Victor HENRI, Otto WARBURG, Rn WURMSER
J. DUCHESNE - 1967 - dans Liber Memorialis de lUniversit de Lige, tome II : 471-478
a b
OH H
H HO
H H OH OH
RO H
O H H
Les progrs dans ltude des mcanismes enzymatiques ont conduit au dveloppe-
ment dun second modle dcrivant linteraction entre le substrat et lenzyme. Le
premier, illustr dans la figure 3.2, a t introduit par FISCHER et repose sur
lexistence dune complmentarit entre le substrat et le site actif de lenzyme qui
peut tre compare celle existant entre une cl et une serrure. Le second modle,
propos ultrieurement par KOSHLAND, implique un changement de conformation
du site actif de lenzyme lors de la fixation du substrat.
Ce modle est connu sous le nom dajustement induit (induced-fit) et est illustr
dans la figure 3.5. Ce modle implique que lenzyme slectionne spcifiquement
son substrat, non sur la base dune complmentarit statique entre lenzyme et le
substrat, mais en agissant comme des pinces qui se renferment pour piger le
substrat. Lenzyme devient actif uniquement dans sa forme ferme impliquant une
rgulation de lactivit par la fixation du substrat.
Groupe
catalytique 3
Site actif
Substrat (A)
Enzyme
Groupe Groupe
catalytique 1 catalytique 2
Enzyme (E) Complexe (EA)
3.5 - Illustration du mcanisme dajustement induit propos par KOSHLAND
Ka k2
E+A EA E+P [3.3]
o A et P reprsentent respectivement le substrat et le produit, E lenzyme libre,
EA le complexe enzyme-substrat, et o Ka est la constante de dissociation du
complexe enzyme-substrat EA :
[ E ][ A ]
Ka = [3.4]
[ EA ]
Comme nous lavons dit, HENRI suppose lexistence dun quilibre rapide pour la
formation du complexe EA partir de lenzyme libre et du substrat libre et cest
partir de ce modle quil a obtenu lquation de vitesse prsente dans lqua-
tion [3.1]. Il est utile de se rappeler quen enzymologie, la constante dquilibre est
gnralement dfinie dans le sens de la dissociation du complexe, ce qui conduit
une constante dquilibre Ka exprime en units apparentes de concentration. Dans
le cas de ractions enzymatiques complexes, cette convention simplifie considra-
blement lquation de vitesse par rapport lutilisation de constantes dassociation.
La formulation mathmatique dun mcanisme enzymatique et lcriture de lqua-
tion de vitesse correspondante sont gnralement des tapes difficiles raliser par
les tudiants. A cette difficult sajoute le fait que le problme peut tre rsolu de
diverses manires et que souvent les ouvrages de rfrence se limitent au traitement
dtaill des cas simples, ne prsentant que lquation finale de vitesse pour les
mcanismes plus complexes. Nous prsentons ici une mthode gnrale et simple
pour lcriture des quations de vitesse qui repose sur lapplication successive de
trois rgles. Nous lappliquerons dabord au cas simple dune raction un seul
substrat dans des conditions irrversibles (quation [3.3]), mais nous appliquerons
systmatiquement cette mthode dans la suite de ce livre pour driver les quations
de vitesse de ractions plus complexes. Une autre mthode, mieux adapte au traite-
ment de systmes complexes, sera prsente dans le chapitre 6.
La premire rgle consiste appliquer la loi daction de masses pour dfinir la
vitesse de formation du produit P :
d[ P ]
v = = k 2 [ EA ] [3.5]
dt
La mesure de la concentration instantane du complexe [ EA ] est gnralement
difficile, souvent peu commode, et voire mme impossible. En utilisant lqua-
tion [3.4] qui peut scrire de la manire suivante :
[ E ][ A ]
[ EA ] = [3.6]
Ka
[ E ][ A ]
nous obtenons : v = k2 [3.7]
Ka
Puisque la concentration instantane denzyme [ E ] est aussi difficile mesurer
que celle du complexe EA, il serait prfrable dexprimer la vitesse en terme de
3 INTRODUCTION LA CINTIQUE ENZYMATIQUE - RACTIONS UN SUBSTRAT ET UN PRODUIT 69
v = k2
([ E ]0 D )[ A ] [3.11]
Ka
A ce stade, la vitesse de la raction nest dfinie que si la concentration instan-
tane de substrat libre, [ A ] , peut tre mesure, ce qui nous amne introduire
la troisime rgle.
La troisime rgle consiste imposer une contrainte sur le systme permettant de
connatre la concentration instantane de substrat libre partir de la concentration
initiale de substrat. En gnral, les enzymes sont tudis dans des conditions o la
concentration denzyme [ E ]0 est beaucoup plus faible que la concentration de
substrat [ A ]0 . Ainsi, lquation de conservation du substrat scrit comme suit :
[ A ]0 = [ A ] + [ EA ] [3.12]
o nous pouvons ngliger [ EA ] vis--vis de [ A ] . En se plaant dans des condi-
tions de vitesse initiale, nous pouvons donc assimiler la concentration instantane
de substrat la concentration initiale : [ A ]0 = [ A ] . Cette situation est valable
pour la majorit des tudes ralises in vitro, mais il est important de noter quin
vivo la situation o [ E ]0 [ A ] est trs courante. Dans ce cas, [ EA ] ne peut
plus tre nglig dans lquation [3.12], et lquation de vitesse prend une forme
plus complexe (voir ci-dessous).
En appliquant successivement ces trois rgles, nous obtenons lquation de vitesse
suivante :
[ E ]0 [ A ]0 [ A ]0 Ka
v = k2 = k 2 [ E ]0 [3.13]
D Ka 1 + ( [ A ]0 Ka )
70 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Etat stationnaire
d[EA]
= 0 P
dt
EA E
Temps
3.6 - Variations de [ A ], [ EA ], [ E ] et [ P ]
pour une raction enzymatique ltat stationnaire
3 INTRODUCTION LA CINTIQUE ENZYMATIQUE - RACTIONS UN SUBSTRAT ET UN PRODUIT 75
La courbe dfinie par lquation [3.36] et prsente dans la figure 3.7 a la forme
dune hyperbole rectangulaire passant par lorigine et ayant les asymptotes
suivantes : [ A ] = K m et v = V. En fonction de la concentration de substrat, trois
situations exprimentales peuvent tre distingues qui vont dfinir trois rgions
dans le graphique de v en fonction de [ A ] .
Situation o [ A ] << Km
Pour de faibles valeurs de [ A ] , largement infrieures Km , le dnominateur du terme
de droite des quations [3.35] et [3.36] est domin par Km ; en dautres termes, [ A ]
est ngligeable par rapport Km et la vitesse v est directement proportionnelle [ A ] :
k
v = 0 [ E ]0 [ A ] = V [ A ] [3.39]
Km Km
c'est--dire que la vitesse de la raction est approximativement dordre global deux,
mais dordre un par rapport au substrat. Il est instructif de raliser que k0 Km ne
reprsente pas uniquement le rsultat de la division de k0 par K m mais que ce
rapport correspond la constante de vitesse de second ordre pour la raction
E+A E + P mesure pour de faibles concentrations de substrat. Ce
3 INTRODUCTION LA CINTIQUE ENZYMATIQUE - RACTIONS UN SUBSTRAT ET UN PRODUIT 77
paramtre est appel la constante de spcificit pour des raisons qui seront
dveloppes dans la section [3.5], et peut tre symbolise par kA, o lindice
indique quel substrat il fait rfrence.
v = k A [ E ]0 [ A ] [3.40]
Le paramtre Km V , linverse du paramtre V Km , a les dimensions du temps et
peut tre appel le temps spcifique de la raction. Ce temps correspond au temps
qui serait ncessaire lenzyme pour consommer tout le substrat sil fonctionnait
en permanence dans des conditions de premier ordre et maintenait indfiniment la
mme vitesse (CORNISH-BOWDEN, 1987). Bien que cette dfinition soit particuli-
rement abstraite pour les conditions exprimentales habituelles, elle est trs utile
pour dfinir lactivit dans la cellule o de nombreux enzymes oprent dans des
conditions de premier ordre et maintiennent la mme vitesse pendant une longue
priode (parce que leur substrat est continuellement gnr) ; dans ces circons-
tances, le temps spcifique correspond au temps ncessaire pour consommer tout le
substrat.
v
V
Pente initiale = V/Km
0,83 V
0,75 V
0,67 V
0,5 V
0 1 Km 2 Km 3 Km 4 Km 5 Km [A]
3.7 - Dpendance de la vitesse initiale v vis--vis de la concentration [A]
pour une raction obissant lquation de MICHAELIS et MENTEN
Puisquaucun graphique de ce type na t utilis ou mme voqu par MICHAELIS et MENTEN,
il est inappropri de le nommer le graphique de MICHAELIS et MENTEN . Ils ont en ralit,
utilis un graphique de v en fonction de log [ A ] et ont utilis le fait quil a une pente
maximale gale 0,577 V (c'est--dire 0,25 V ln 10) comme moyen destimer la valeur de V
et, partir de celle-ci, obtenir la valeur de Km.
78 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Situation o [ A ] = Km
Si [ A ] est gal Km , lquation [3.36] se simplifie et donne :
V [ A] 1
v = = V [3.41]
2[ A ] 2
Cette quation fournit une dfinition oprationnelle de Km , qui sapplique quel que
soit le mcanisme cintique auquel lquation de MICHAELIS et MENTEN est
applique ; nommment, Km reprsente la concentration de substrat pour laquelle la
vitesse est gale la moiti de la vitesse limite.
Situation o [ A ] >> Km
Pour des valeurs leves de [ A ] , largement suprieures celle de Km , le dnomi-
nateur du terme de droite des quations [3.35] et [3.36] est domin par [ A ] , c'est-
-dire que Km est ngligeable par rapport [ A ] , et que lquation se simplifie :
v = k0 [ E ]0 = V [3.42]
Dans ce cas, la raction est approximativement dordre zro en [ A ] car lenzyme est
satur en substrat. Ce rsultat est lorigine de la dnomination de vitesse limite
pour V.
Comme nous venons de le voir, trois paramtres peuvent tre utiliss pour
caractriser lquation de MICHAELIS et MENTEN si la concentration denzyme est
connue : la constante catalytique k0, la constante de spcificit kA et la constante de
MICHAELIS Km. Puisquau minimum, deux de ces paramtres sont ncessaires pour
dcrire le systme et que ces trois paramtres sont relis entre eux par lidentit
k A k0 Km , lquation de MICHAELIS et MENTEN peut galement scrire en
fonction des paramtres kA et k0 :
k k [ E ]0 [ A ]
v = 0 A [3.43]
k0 + k A [ A ]
ou en fonction des paramtres kA et Km :
k A [ E ]0 [ A ]
v = [3.44]
1 + ( [ A ] Km )
est toutefois bon de se rappeler, quelle que soit la manire dont lquation est
crite, que les paramtres fondamentaux de lquation de MICHAELIS et MENTEN
sont k0 et kA, et que de nombreux aspects du comportement des enzymes sont plus
aisment apprhends en considrant les effets sur lun ou lautre de ces deux
paramtres. En consquence, il est prfrable de considrer kA comme un paramtre
fondamental plutt que comme un paramtre driv et inversement de considrer
Km comme le rapport k0 k A .
Quand nous avons driv lquation [3.52], nous avons trait [ A ] comme une
constante, une supposition qui nest pas strictement correcte puisque [ A ] change
au cours de la raction. Toutefois, condition que [ A ]0 soit beaucoup plus grand
que [ E ]0 , une condition gnralement satisfaite dans les expriences ralises
ltat stationnaire, la variation de [ A ] peut tre nglige. LAIDLER (1955) a driv
une quation similaire lquation [3.52] comme un cas particulier dun traitement
beaucoup plus gnral dans lequel il prend en compte une diminution de [ A ]
partir de sa valeur initiale [ A ]0 . Il a obtenu quun tat stationnaire est atteint pour
lequel :
V ([ A ]0 [ P ])
v = [3.53]
Km + [ A ]0 [ P ]
qui est similaire lquation [3.36] lexception du remplacement de [ A ] par
([ A ]0 [ P ]) . Il peut sembler contradictoire que nous parlions dun tat sta-
tionnaire dans lequel v doit dcrotre lorsque [ P ] augmente, mais cette diminution
de v est extrmement lente compare laugmentation rapide de v qui survient lors
la phase transitoire, c'est--dire la priode pour laquelle lquation [3.52] doit tre
utilise, avant que ltat stationnaire ne soit atteint. Largument de B RIGGS et de
HALDANE doit seulement tre lgrement modifi en remplaant lhypothse
d [ EA ] dt = 0 par lhypothse que d [ EA ] dt est trs petit : lquation [3.27] ne
peut alors plus tre considre comme une exactitude mais plutt comme une
bonne approximation. Comme WONG (1975) la fait remarquer, limportant nest
pas la grandeur absolue de d [ EA ] dt mais sa grandeur relative vis--vis de
k1 [ E ]0 [ A ] .
Lactivit dun enzyme est obtenue par une mesure de la vitesse de la raction quil
catalyse dans des conditions dfinies. Puisque la vitesse de la raction varie avec la
concentration denzyme, il est utile de dfinir une grandeur qui soit indpendante
de la concentration denzyme utilise. Lactivit spcifique est dfinie comme
lactivit de lenzyme rapporte un milligramme denzyme alors que lactivit
molculaire est dfinie comme lactivit rapporte une mole denzyme. Cette
dernire correspond donc au nombre de molcules de substrat transformes par
molcule denzyme et par unit de temps. Le passage de lactivit spcifique
lactivit molculaire ncessite de connatre la masse molculaire de lenzyme.
Pour des enzymes dont la concentration molaire ne peut tre dtermine, soit parce
que lenzyme na pas pu tre purifi, soit parce que sa masse molculaire est
inconnue, il est souvent utile de dfinir une unit dactivit catalytique. Diffrents
systmes dunits peuvent tre utiliss. Lunit internationale adopte actuellement
est le katal mais danciens systmes sont encore utiliss. Dans les premiers temps
de ltude des enzymes, il tait courant de dfinir une unit dactivit qui corres-
82 CINTIQUE ENZYMATIQUE
pondait une quantit de substrat transforme par unit de temps et qui pouvait
tre diffrente selon lenzyme tudi. En 1961, lUnion Internationale de Bio-
chimie a donn une dfinition standard de lunit dactivit enzymatique. Une unit
denzyme reprsente la quantit denzyme qui catalyse la transformation dune
micromole de substrat par minute dans des conditions standards. Dans ce cas, la
temprature devra tre mentionne et si possible tre de 25oC. Les autres condi-
tions, telles que le pH, la force ionique et la concentration de substrat devraient, si
cela est pratiquement possible, tre optimales. Lunit denzyme est aujourdhui
abandonne dans les publications scientifiques mais elle est encore parfois utilise
par certaines compagnies spcialises dans la production denzyme. Lunit
internationale (SI) accepte aujourdhui pour reprsenter lactivit enzymatique est
le katal qui est dfini comme la quantit denzyme suffisante pour catalyser la
conversion d1 mole de substrat en produit en 1 seconde dans des conditions
standards. Un argument gnralement voqu contre lutilisation de cette unit est
que 1 katal est une quantit excessivement grande : une activit enzymatique
typique dans un extrait cellulaire est de lordre de 1 unit mL1 ou de 20 kat L1.
Toutefois, des objections plus svres nont pas empch lutilisation du farad
comme unit de capacit bien que ses sous-multiples soient plus couramment
utiliss. Similairement, il existe des sous-multiples du katal, tout comme le kat,
gal 60 units ou le nkat, gal 0,06 units, qui pourraient tre aisment utiliss
au laboratoire.
v=V
[A]
[A] = Km
v 12
10 Vitesse limite, V
Hexokinase :
A
80
B
C
D ("glucokinase")
60
40
Gamme normale
de concentration
de glucose dans
20 les hpatocytes
0
6 5 4 3 2 1
log [Glucose (M)]
b - Dpendance de lactivit de quatre isoenzymes de lhexokinase
obtenues partir de foie de rat en fonction de la concentration de glucose
Lutilisation dune chelle logarithmique pour laxe des abscisses permet de visualiser sur le
mme graphique le comportement disoenzymes dont les proprits sont trs diffrentes.
Dessin partir de la figure 6.2 de CRDENAs (1995).
3.9 - Echelles logarithmiques
86 CINTIQUE ENZYMATIQUE
DOWD et RIGGS (1965) ont montr que le graphique en double inverse mini-
misait la mauvaise qualit des donnes, c'est--dire quil minimisait la divergence
des points exprimentaux, et ils ont suggr que cette proprit avait contribu le
rendre populaire parmi les biochimistes.
En principe, les problmes lis lutilisation du graphique en double inverse sont
limins en appliquant une pondration adquate sur les donnes, bien que cette
solution ne soit pas toujours satisfaisante. En effet, une telle procdure conduit
gnralement une droite ajuste qui, visuellement, reprsente mal les donnes.
Malgr ces aspects critiquables, aucun reproche ne peut tre formul lencontre
de LINEWEAVER et de BURK pour lusage inadquat du graphique en double
inverse, puisquils avaient reconnu ses limitations et prconisaient lutilisation
dune pondration des donnes. (LINEWEAVER et BURK, 1934 ; LINEWEAVER,
BURK et DEMING, 1934.)
1/v 1/v
a - v faibles
0
0 1/[A]
Pente = Km/V
1/v
b - v leves
0
1/V 0 1/[A]
1/Km 0 1/[A]
[ A] K
= m + 1 [ A] [3.56]
v V V
[ E ]0 [ A ]
= 1 + 1 [ A] [3.57]
v k A k0
Ces deux quations indiquent quun graphique de [ A ] v en fonction de [ A ] est
galement une droite dont la pente vaut 1 k0 [ E ]0 ( = 1 V ) , dont lordonne
lorigine vaut 1 k A [ E ]0 ( = Km V ) et dont lintersection avec laxe des abscisses
vaut k0 k A ( = Km ) (noter que les valeurs de la pente et de lordonne lorigine
sont inverses par rapport au graphique en double inverse). Ce graphique, que lon
appelle parfois graphique de HANES, est illustr dans la figure 3.11. Sur une large
gamme de concentrations de substrat, les erreurs sur [ A ] v refltent fidlement
les erreurs sur v, comme il est possible den juger par la taille des barres derreur
dans la figure 3.11 ; pour cette raison le graphique de [ A ] v en fonction de [ A ]
devrait tre prfr aux autres graphiques linaires.
[A]/v [A]/v
a - v faibles
0
0 [A]
Pente = 1/V
[A]/v
b - v leves
0
Km/V 0 [A]
Km 0 [A]
3.11 - Graphique de [A]/v en fonction de [A]
Les barres derreur sont gales 0,05 V, comme dans la figure 3.10. Ce graphique est
parfois appel le graphique de HANES ou le graphique de WOOLF. Les inserts ont la mme
signification que ceux de la figure 3.10.
avec laxe des abscisses vaut V Km . Ce graphique est couramment appel gra-
phique de EADIE-HOFSTEE et est illustr dans la figure 3.12. Ce type de reprsen-
tation donne de bons rsultats dans la pratique, bien que la prsence de la grandeur
mesure, la vitesse v, dans chacune des coordonnes signifie que les erreurs
commises sur la mesure de v provoquent des dviations le long des deux axes.
v v v
a - v faibles b - v leves
V
0 0
0 v/[A] 0 v/[A]
Pente = Km
Les barres d'erreurs
se prolongent
dans des directions
passant par l'origine
0
0 V/Km v/[A]
par lui. Lquation [3.56] a t publie pour la premire fois par HANES (1932),
bien quil ne lait accompagne daucune reprsentation graphique des rsultats.
Les diffrents graphiques et leur utilisation ont t populariss par les travaux de
LINEWEAVER et BURK (1934), EADIE (1942) et HOFSTEE (1952), ce qui explique
pourquoi ces noms leurs sont associs.
V V
V*
V*
v5
v4
v3
0 K*m Km
v2
v1
1/V 1/V
1/v1
1/V*
0
0 K*m /V* Km /V
1/V*
0
0 K*m /V* [A]1/v1 Km /V
Le graphique linaire direct prsente divers avantages sur les autres mthodes gra-
phiques (fig. 3.13) dcrites dans ce paragraphe, dont la plus apparente est que, dans
sa forme originelle, il ne ncessite pas de calcul. Ceci permet de lutiliser trs faci-
lement au laboratoire pendant que lexprience se droule, de sorte que nous pou-
vons visualiser immdiatement les valeurs probables des paramtres et adapter les
conditions de mesure pour permettre une dtermination prcise de ces paramtres.
Analyse des expriences de fixation : le graphique de SCATCHARD
A ct des ractions enzymatiques, de nombreux processus biologiques reposent
sur la fixation dune petite molcule sur une macromolcule ou sur une surface,
sans que cette fixation ne soit suivie dune raction chimique. Comme nous allons
92 CINTIQUE ENZYMATIQUE
le voir, le phnomne de fixation dun ligand peut tre dcrit par une quation qui a
une forme similaire celle de lquation de MICHAELIS et MENTEN, alors que la
fixation sur plusieurs sites indpendants peut tre reprsente par une quation qui
a la mme forme que lquation cintique pour un mlange denzymes catalysant la
mme raction. Bien quun traitement exhaustif de la fixation de ligands ne fasse
pas partie des objectifs de cet ouvrage, nous prsentons brivement le traitement de
ces systmes parce que les expriences de fixation complmentent souvent les
mesures cintiques dans ltude de systmes enzymatiques. La ressemblance entre
les quations de fixation et les quations de vitesse des systmes enzymatiques,
nous amne galement discuter de lutilisation du graphique de SCATCHARD,
notamment en raison de labondance derreurs associes avec lutilisation de ce
type de graphique.
En pratique, la fixation dun ligand est souvent mesure par dialyse lquilibre,
une exprience qui consiste tablir un quilibre travers une membrane semi-per-
mable (permable au ligand mais pas la protine), et mesurer la concentration
de ligand de part et dautre de cette membrane. Une fois lquilibre atteint, si nous
supposons que la concentration de ligand libre, [ L ]libre , est identique de chaque
ct de la membrane et quelle peut tre mesure directement dans le compartiment
qui ne contient pas de protine, la concentration de ligand fix la protine peut
alors tre dtermine en soustrayant la valeur connue de [ L ]libre de la concentra-
tion totale de ligand mesure dans le compartiment contenant la protine. A ce
stade, il est essentiel de prendre conscience dune caractristique essentielle des
mesures de dialyse lquilibre. Dans une exprience de cintique ltat station-
naire, cest lactivit cintique de lenzyme qui est mesure, et condition que
lactivit spcifique de cette enzyme soit suffisamment leve, une concentration
faible denzyme peut tre utilise sans affecter la prcision de la mesure. Inver-
sement, dans une exprience de dialyse lquilibre, la quantit mesure, [ L ]fix ,
ne peut jamais dpasser la concentration totale des sites de fixation et est obtenue
par soustraction ; il est important ds lors de sassurer que la concentration de la
macromolcule est du mme ordre de grandeur que la concentration du ligand.
Puisque les expriences de dialyse lquilibre et celles de cintique dans des
conditions dtat stationnaire sont ralises dans des conditions diffrentes, elles
peuvent dans certains cas conduire des rsultats apparemment inconsistants, si
par exemple lenzyme sassocie de hautes concentrations.
Sil existe un seul type de site de fixation de L sur E, le phnomne de fixation peut
tre reprsent par le modle suivant :
K
E + nL ELn [3.60]
Dans ce modle, K reprsente la constante individuelle de dissociation du ligand L
pour chaque site de fixation et n reprsente le nombre de sites de fixation :
[ E ][ L ]libre
K = [3.61]
[ EL ]
3 INTRODUCTION LA CINTIQUE ENZYMATIQUE - RACTIONS UN SUBSTRAT ET UN PRODUIT 93
qui aprs division par K [ L ]libre et rarrangement donne des formes linaires de
lquation de fixation connue comme lquation de SCATCHARD :
Y = n Y [3.69a]
[ L ]libre K K
[ L ]fix n[ E ]0 [ L ]fix
= [3.69b]
[ L ]libre K K
Un graphique de Y [ L ]libre en fonction de Y a la forme dune droite dont la pente
vaut 1 K , dont lordonne lorigine vaut n K et dont lintersection avec laxe
des abscisses vaut n.
94 CINTIQUE ENZYMATIQUE
classes de sites de fixation, c'est--dire que lon peut tracer des droites pour
diffrentes classes de sites et obtenir une courbe finale en calculant la somme le
long de droites passant par lorigine des contributions de chacune de ces classes.
v /[A] 1,5
ou
[A]fix /[A]libre
En principe toutes les ractions catalyses par des enzymes sont rversibles, et dans
la ralit de nombreuses ractions importantes en biochimie sont rversibles dans
le sens o des quantits significatives de substrat et de produit coexistent lqui-
libre. Il est vident, ds lors, que le mcanisme de MICHAELIS et MENTEN que nous
avons dcrit jusqu prsent est incomplet, et que la raction en sens inverse doit
apparatre dans le schma ractionnel. Le modle le plus simple consiste rendre
rversible la seconde raction comme indiqu dans le modle suivant :
k1 k2
E + A EA E + P [3.72]
k1 k2
[ E ]0 [ EA ] [ A] [ EA ] [P]
3 INTRODUCTION LA CINTIQUE ENZYMATIQUE - RACTIONS UN SUBSTRAT ET UN PRODUIT 97
lquilibre, par opposition avec la raction EA EP. Dans ce cas, nous pouvons
reprsenter le mcanisme ractionnel par lquation suivante :
k1 k2 k3
E + A EA EP E + P [3.82]
k1 k2 k3
[ E ]0 [ EA ] [ EP ] [ A ] [ EA ] [ EP ] [P]
Si, par souci de simplification, nous supposons que les tapes de fixation du
substrat et de libration du produit sont rapides par rapport la raction chimique
EA EP, nous pouvons dfinir les paramtres Km A = k 1 k1 et Km P = k3 k 3
comme les constantes de dissociation des complexe EA et EP. Dans ce cas,
lobtention de lquation de vitesse ncessite de trouver lquation pour la vitesse
nette :
vnette = v 2 v 2 [3.83]
d [ EP ]
o v 2 = vP = [3.84a]
dt
d [ EA ]
v 2 = vA = [3.84b]
dt
Lquation de vitesse peut aisment tre obtenue en appliquant les trois rgles
prcdemment tablies.
La loi daction de masses permet de dfinir la vitesse initiale pour chacun des
deux sens de la raction :
v 2 = k 2 [ EA ] [3.85a]
v 2 = k 2 [ EP ] [3.85b]
La vitesse nette est obtenue comme la diffrence :
vnette = k 2 [ EA ] k 2 [ EP ] [3.86]
En utilisant les deux quilibres :
[ A ][ E ]
Km A =
[ EA ]
[ E ][ A ]
[ EA ] =
Km A
[ P ][ E ]
Km P =
[ EP ]
[ P ][ E ]
[ EP ] = [3.87]
Km P
[ E ][ A ] [ E ][ P ]
nous obtenons : vnette = k 2 k 2 [3.88]
Km A Km P
100 CINTIQUE ENZYMATIQUE
kA k2 K m P [ P ]
K = = = [3.98]
kP k 2 K m A [ A ]
o K est la constante dquilibre de la raction. Cette quation constitue un rsultat
important, connu sous le nom de relation de HALDANE (HALDANE, 1930). Ces ga-
lits sont vrifies pour nimporte quel mcanisme dcrit par lquation [3.81] et
pas seulement pour le mcanisme simple deux tapes de MICHAELIS et MENTEN.
Les quations de vitesse plus complexes, telles que celles qui seront dcrites pour
des ractions plusieurs substrats, conduisent des relations de HALDANE plus
complexes, mais parmi ces quations il en existe toujours au moins une qui relie les
paramtres cintiques et la constante dquilibre globale de la raction.
Rfrence
R.W. CLARK - J.B.S. HALDANE, dans Dictionary of Scientific Biography, New-York, Scribners
En dpit de ces diffrents cas dans lesquels K m est quivalent une constante de
dissociation du substrat, en gnral il nest pas conseill de faire une telle
supposition, sauf si cette quivalence est confirme par une preuve vidente. Il est
plus raisonnable de considrer K m comme une quantit empirique qui dcrit la
dpendance de v vis--vis de [ A ] et non comme une mesure de la stabilit thermo-
dynamique du complexe enzyme-substrat.
Il peut tre utile de reprsenter le profil dnergie de GIBBS pour la raction dans
des conditions dtat stationnaire.
[AP]
G E
D2 D2
[EP]
[EA]
D3
D1
D1 DGint
EP D3
E+A EA
DG ext
E+P
Coordonnes de la raction
3.16 - Profil dnergie libre dune raction enzymatique
meilleur catalyseur dans une direction que dans lautre sans pour autant dsobir
aux lois de la thermodynamique. Ltude de la figure 3.17 confirme que la vitesse
lquilibre est nulle et que, dans tout autre tat davancement, la raction procde
en direction de lquilibre : cest la seule contrainte impose par la thermodyna-
mique ; aucune contrainte nimpose que les courbes soient symtriques autour du
point dquilibre ni que lquilibre doive tre approch avec une pente similaire
dans les deux sens de la raction.
v 1 v 1
0 0
1 1
0,01 0,1 1 10 100 0,01 0,1 1 10 100
[P]/[A] [P]/[A]
3.17 - Enzymes unidirectionnels
Les deux courbes sont calcules pour une constante dquilibre gale 1, c'est--dire pour
un quilibre o [P]/[A] = 1, mais o le rapport des constantes de MICHAELIS dans les
directions directe et inverse est diffrent dans les deux cas. Quand Km,P << Km A (a), la
courbe est trs pentue lorsque lquilibre est approch dans la direction directe, mais est
trs plate lorsquil est approch dans la direction inverse ; mais linverse est vrai quand
Km P >> Km A (b). Il faut noter que ces courbes nimpliquent aucune violation des principes de
la thermodynamique, parce que, quelles que soient les circonstances, la raction volue
toujours vers lquilibre.
Linhibition par le produit est un cas spcial dinhibition qui sera discut en dtail
dans le chapitre 5, mais parce quelle dcoule naturellement du paragraphe pr-
cdent, il est utile de la mentionner brivement ici. Quand lquation [3.81]
sapplique, la vitesse doit diminuer lorsque le produit saccumule, mme si la
diminution de la concentration du substrat reste ngligeable, parce que le terme
ngatif du numrateur augmente de plus en plus lorsque la raction sapproche de
lquilibre et parce que le troisime terme du dnominateur augmente avec [ P ] .
Dans nimporte quelle raction, le terme ngatif du numrateur devient significatif
uniquement si la raction est significativement rversible. Cependant, linhibition
par le produit est manifeste dans de nombreuses ractions qui sont essentiellement
irrversibles, comme dans lexemple classique de lhydrolyse du sucrose catalyse
par linvertase. Ce phnomne indique que le produit doit tre capable de se fixer
sur lenzyme et est compatible avec le mcanisme le plus simple deux tapes
uniquement si la premire tape est irrversible et que la seconde ne lest pas. Cette
situation semble particulirement improbable, du moins comme un phnomne
gnral. Dun autre ct, le mcanisme trois tapes prdit que linhibition par le
produit peut avoir lieu dans une raction irrversible si la seconde tape, c'est--
dire la transformation chimique, est irrversible. Dans un tel cas, laccumulation du
produit provoque la squestration de lenzyme sous la forme du complexe EP qui
nest donc plus disponible pour ragir avec le substrat. Pour une raction
irrversible, lquation [3.81] peut scrire comme suit :
k A [ E ]0 [ A ] k0 [ E ]0 [ A ]
v = = [3.105]
[ A] [ P ] [ P ]
1+ + Km A 1 + + [ A]
Km A Km P KP
Si la raction est irrversible, Km P peut tre lgitimement remplac par K P , c'est-
-dire par une constante dquilibre, parce que si k2 a une valeur approximative-
ment gale zro, elle est ngligeable vis--vis du terme ( k 1 + k 2 ) . Comme nous
le verrons dans le 5.2.1, lquation [3.105] a exactement la forme du type le plus
commun dinhibition qui est appel inhibition comptitive.
Bien videmment leffet du produit ajout devrait tre exactement le mme que
celui du produit qui saccumule au cours de la raction, et donc il est possible de
mesurer des vitesses initiales en prsence de diffrentes concentrations de produit.
Pour chaque concentration de produit, la vitesse initiale pour diffrentes concen-
trations de substrat obit lquation de MICHAELIS et MENTEN, mais avec des
[
valeurs apparentes k0 et Km ,A donnes par k0app = k0 et KmappA = Km A 1 + ( [ P ] KP ) ]
(comparer lquation [3.105] avec lquation [3.35]). Ainsi k0app est constant et gal
la valeur de k0 de la raction en absence dinhibition, mais KmappA est plus grand
que Km A et augmente linairement avec [ P ] .
108 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Comme nous en avons discut au dbut de ce chapitre, les premiers chercheurs qui
ont tudi la cintique enzymatique se sont heurts plusieurs difficults parce
quils suivaient la raction sur des temps trop longs et analysaient leurs donnes en
utilisant des quations intgres de vitesse similaires celles communment uti-
lises en cintique chimique. Ces difficults ont t limines lorsque MICHAELIS
et MENTEN (1913) ont montr que les enzymes pouvaient tre tudis plus
simplement en mesurant des vitesses initiales, c'est--dire dans des conditions o
laccumulation du produit et la disparition du substrat nont aucun effet. Une
consquence malheureuse de ces premiers dveloppements est que les biochimistes
sont devenus rticents utiliser les quations intgres de vitesse, mme quand
elles pouvaient tre utilises de manire approprie. Il nest pas toujours possible
de raliser une exprience dans des conditions dtat stationnaire dans laquelle la
courbe davancement de la raction (c'est--dire le graphique de [ P ] en fonction
du temps, t) soit essentiellement linaire pendant une priode de temps apprciable,
et, dans ces cas, lestimation de la pente initiale et donc de la vitesse initiale, est
subjective et susceptible dtre errone. Une grande partie de cette subjectivit peut
tre limine en utilisant une forme intgre de lquation de vitesse, comme nous
allons le dcrire.
Si lquation de MICHAELIS et MENTEN est crite sous la forme suivante (voir
quation [3.36]),
d[ P ] V [ A]
= [3.106]
dt Km + [ A ]
nous avons une quation trois variables, [ P ] , t et [ A ] . Dans cette forme, elle ne
peut pas tre intgre directement, mais une des trois variables peut tre limine
3 INTRODUCTION LA CINTIQUE ENZYMATIQUE - RACTIONS UN SUBSTRAT ET UN PRODUIT 109
Bien que lquation [3.112] soit une forme intgre de lquation de MICHAELIS et
MENTEN (quation [3.106]), lutilisation pratique de cette quation peut gnrer
des erreurs importantes sur les valeurs des paramtres cintiques, si certaines
prcautions ne sont pas prises. En effet, puisquil ne sagit pas de mesures ralises
dans des conditions de vitesse initiale, linhibition par le produit ne peut plus tre
nglige, puisque, quelle que soit la concentration initiale du produit, celui-ci
saccumule au cours de la raction. Dans le cas le plus simple, nous devons
remplacer lquation [3.107] par lquation qui tient compte dune possible
inhibition comptitive par le produit P qui est caractrise par la constante
dinhibition KP :
d[ P ] V ([ A ]0 [ P ])
= [3.113]
dt [ P ]
Km 1 + + [ A ]0 [ P ]
KP
110 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Cette quation a une forme algbrique similaire lquation [3.107], ce qui a deux
consquences importantes : premirement, il est impossible de dterminer partir
de donnes exprimentales en accord avec lquation [3.112] si lquation [3.107]
est le point de dpart correct plutt que lquation [3.113] ; deuximement, la
mme logique qui a permis dintgrer lquation [3.107] peut tre utilise pour
intgrer lquation [3.113]. Lquation obtenue de cette manire est la suivante :
Vt = [P ]+
[ ln
]
Km 1 + ( [ A ]0 KP ) [ A ]0
[3.114]
1 ( Km KP ) 1 ( Km KP ) [ A ]0 [ P ]
Dans ses tudes de linvertase, HENRI (1903) avait obtenu une quation quivalente
(voir quation [3.1]). Lquation [3.114] a exactement la mme forme que
lquation [3.112] et peut aussi scrire de la manire suivante :
[ A ]0
V app t = [ P ] + Kmapp ln [3.115]
[ A ]0 [ P ]
Kmapp =
[
Km 1 + ( [ A ]0 KP ) ] [3.117]
1 ( Km KP )
c'est--dire que lquation [3.112] a t crite en remplaant respectivement
V et K m par les valeurs apparentes V app et Kmapp . Notons que le dnominateur
1 ( Km KP ) est commun aux deux expressions [3.116] et [3.117] indiquant que
les valeurs apparentes peuvent diffrer de manire importante des valeurs relles
des paramtres de MICHAELIS et MENTEN, sauf si la fixation du produit peut tre
nglige. Nanmoins, les valeurs des paramtres apparents peuvent tre ngatives
si le produit se fixe plus fermement que le substrat (c'est--dire si la valeur de KP
est infrieure la valeur de K m ). Pour apprcier ce que signifie de ngliger la
fixation du produit dans ce contexte, nous pouvons imaginer que nous souhaitons
analyser un dcours complet de raction en utilisant [ A ]0 = 2 Km et que nous
dsirons que la valeur de Kmapp ne diffre pas de celle de K m de plus de 5%. En
remplaant de manire adquate les termes de lquation [3.117] nous obtenons
que K m doit tre au maximum gale 0,03 KP, c'est--dire que le substrat doit se
fixer au moins 33 fois plus fermement sur lenzyme que le produit. Cette situation
nest pas impossible, nanmoins, elle est suffisamment improbable pour autoriser
lutilisation de lquation [3.112] sans aucune prcaution.
V app [ A ]0
v0 = [3.118]
Kmapp + [ A ]0
Cette quation dcoule de lquation [3.115] par diffrenciation, sans gard pour la
signification de V app et de Kmapp .
En rarrangeant lquation [3.115], nous obtenons :
[P] Kmapp
t = 1app + [3.119]
[ A ]0 V [ A ]0 V app
ln ln
[ A ]0 [ P ] [ A ]0 [ P ]
[A]0 /v0
Pente = 1/Vapp
Kmapp/Vapp
Pente = 1/V
Km /V
Km 0 [A]0
[P]
ln{[A]0 /([A]0[P])}
3.18 - Dtermination des paramtres cintiques
partir des dcours complets de raction
t
Les valeurs de sont portes en graphique pour plusieurs
ln { [A]0 ([A]0 [P])}
concentrations initiales de substrat [A]0 lorsque le temps augmente en fonction de
[P]
et chaque ensemble de tels points ( ) est extrapol vers une
ln { [A]0 ([A]0 [P])}
valeur dabscisse gale [A]0 pour donner des points () qui se localisent sur une droite
de pente 1/V avec des intersections avec laxe des abscisses et celui des ordonnes qui
donnent respectivement les valeurs de Km et de Km /V.
Une mthode plus simple, ncessitant seulement des calculs triviaux (sans loga-
rithme), peut tre obtenue en utilisant une approximation du terme logarithmique.
Pour introduire celle-ci, il est utile de dmarrer avec lquation intgre de vitesse
pour une raction simple dordre un (quation [1.8]) et de noter quelle peut
scrire de la manire suivante :
[ ]
ln 1 ( [ P ] [ A ]0 ) = k t (3.120)
o [ P ] reprsente la concentration du produit au temps t, k la constante de premier
ordre et [ A ]0 la concentration du ractif au dpart. Pour des petites valeurs dune
grandeur x, lexpression 2 x ( 2 + x ) est une excellente approximation de ln( 1 + x) ,
correspondant des erreurs infrieures 0,1% et 1% pour des valeurs de x res-
pectivement infrieures 0,1 et 0,41. Ainsi, jusqu 40% de la raction, lquation
[3.120] peut scrire de la manire suivante avec une prcision suprieure 1% :
( 2[ P ] [ A ]0 )
= kt [3.121]
2 ( [ P ] [ A ]0 )
3 INTRODUCTION LA CINTIQUE ENZYMATIQUE - RACTIONS UN SUBSTRAT ET UN PRODUIT 113
A cause du troisime terme de la partie droite, cette quation ne dfinit plus une
droite, mais deux points importants doivent tre considrs. Premirement, ce
troisime terme est nul au dbut de la raction, de sorte quil na aucun effet sur
lordonne lorigine qui reprsente toujours la vitesse initiale de la raction.
Deuximement, il est en gnral suffisamment petit pour ne produire quune
dviation triviale de la linarit dans la premire partie de la raction, et en cons-
quence na quun effet limit sur lutilisation du graphique de [ P ] t en fonction
de [ P ] pour dterminer la vitesse initiale.
Un dcours complet publi par SCHNHEYDER (1952) fournit un excellent exemple
pour tester cette mthode (ou nimporte quelle autre) destimation de la vitesse
initiale, puisquil consiste en 25 mesures couvrant la gamme de 2,5% 98% de
compltion de la raction. Le graphique de BOEKER pour cet exemple est illustr
dans la figure 3.19, avec le dcours complet original prsent dans lencart. Notons
que dans lexemple de la figure 3.19, le graphique de BOEKER est linaire pendant
les 15 premires minutes, correspondant environ 40% de la raction. Notons
galement que bien que les erreurs systmatiques tendent vers zro lorsque le
temps tend vers zro, il nen est pas de mme pour les erreurs alatoires, parce que,
la limite de t = 0, la valeur de [ P ] t est gale 0 0 dont la valeur est indfinie.
La consquence pratique est que nous devons tracer la droite lil en attribuant peu
dimportance la dispersion des points correspondant aux temps les plus courts. Si
nous appliquons navement une rgression linaire de manire obtenir la
114 CINTIQUE ENZYMATIQUE
meilleure droite, il est probable que nous obtenions une droite qui est loin dtre la
meilleure parce quelle sera excessivement influence par les points les moins prcis.
[P] (%)
de l'axe sont sujets
d'importantes 80
Vitesse initiale erreurs alatoires
5 60
40
4 20
0
0 20 40 60
3
t (min)
PROBLMES
3.3 - Un test dactivit pour un enzyme doit tre mis au point afin que la
vitesse initiale mesure soit insensible aux petites erreurs commises sur
la concentration de substrat. Quelle doit tre la grandeur de [ A ] Km
pour quune erreur de 10% sur la concentration de substrat, [ A ] , se
traduise par une erreur infrieure 1% sur la valeur de v ? (supposer que
lquation de MICHAELIS et MENTEN est respecte).
3.4 - Dans une tude de la fumarase du cur de porc, les paramtres cin-
tiques suivants ont t obtenus pour la raction directe : Vm = 1,7 mM,
V = 0,25 mM1 s1, et Vm = 3,8 mM, V = 0,11 mM1 s1 pour la raction in-
verse. Estimer la constante dquilibre pour la raction entre le fuma
rate et le malate. Pour un chantillon de fumarase provenant dune
autre source, les paramtres cintiques suivants ont t obtenus :
Km = 1,6 mM, V = 0,024 mM1 s1 pour la raction directe et Km = 1,2 mM,
V = 0,012 mM1 s1 pour la raction inverse. Commenter la plausibilit de
ces rsultats.
116 CINTIQUE ENZYMATIQUE
T [ A ]0 = 1 [ A ]0 = 2 [ A ]0 = 5 [ A ]0 = 10 [ A ]0 = 20
1 0,095 0,18 0,37 0,56 0,76
2 0,185 0,34 0,71 1,08 1,50
3 0,260 0,49 1,01 1,57 2,20
4 0,330 0,62 1,29 2,04 2,88
5 0,395 0,74 1,56 2,57 3,50
6 0,450 0,85 1,80 2,87 4,12
7 0,505 0,95 2,02 3,23 4,66
8 0,555 1,04 2,22 3,59 5,24
9 0,595 1,12 2,40 3,92 5,74
10 0,630 1,20 2,58 4,22 6,24
3.6 - Si une raction est sujette une inhibition par le produit en accord avec
lquation [3.105], la courbe dvolution de la raction obit une
quation de la forme suivante :
K [ A ] [ A ]0
k0 [ E ]0 t = 1 mA ( [ A ]0 [ A ] ) + KmA 1 ln
KP KP [ A ]
o [ A ]0 est la valeur de [ A ] quand t = 0 et les autres symboles ont la
mme dfinition que dans l quation [3.105].
a - Montrer que lquation [3.105] est la forme diffrentielle de cette
quation.
b - Comparer lquation avec lquation [3.115] et crire les expressions
pour V app et K mapp (comme dfinies dans lquation [3.115]).
c - Dans quelles conditions V app et K mapp prendront-elles des valeurs
ngatives ?
3.7 - ATASSI et MANSHOURI (1993) ont rapport que des peptides synthtiques
(ou pepzymes ), symboliss par ChPepZ et TrPepZ, catalysaient
lhydrolyse du N-benzoyl-L-tyrosine thyle ester et du N-tosyl-L-arginine
mthyle ester avec des constantes cintiques comparables celles
respectivement de la chymotrypsine et de la trypsine, comme lindique
le tableau ci-aprs :
3 INTRODUCTION LA CINTIQUE ENZYMATIQUE - RACTIONS UN SUBSTRAT ET UN PRODUIT 117
Estimation partir
des cinq premiers points
10 Pente = 3,25
0
0 2 4 6 8
Temps (units arbitraires)
4.1 - Problmes lis lestimation de la vitesse initiale
La droite continue passant par lorigine montre la vraie tangente initiale, qui a une pente
suprieure de plus de 50% la droite en pointills qui a t dessine en traitant les cinq
premires valeurs exprimentales comme si elles faisaient partie dune phase linaire
hypothtique. En ralit, il ny a pas de phase linaire et lvolution de la raction est
courbe sur la totalit de la gamme de temps.
Puisque la vitesse dune raction catalyse par un enzyme est directement propor-
tionnelle la concentration de cet enzyme, une proprit qui est facilement vri-
fiable exprimentalement, il est impossible de modifier la courbure dun graphique
davancement en modifiant la concentration de lenzyme : il est uniquement
possible de modifier lchelle de temps sur laquelle se droule la raction et tout
autre changement apparent de la courbure nest quillusion. En effet, cette proprit
est la base du test de linactivation de lenzyme dcrit dans le 4.2. En pratique, il
est parfois avantageux de diminuer la concentration denzyme afin de diminuer la
quantit de produit form durant la priode entre le mlange des ractifs et le
122 CINTIQUE ENZYMATIQUE
dans laquelle lindice 2 indique que les valeurs de V2 et de Km2 sont les paramtres
cintiques de MICHAELIS et MENTEN pour la seconde raction (la raction
couple). Si v1 est une constante (comme cest approximativement le cas pendant la
priode initiale de la raction tudie), lquation [4.5] exprimant la vitesse de
variation de [ B ] avec le temps peut rapidement tre intgre (pour plus de dtails,
voir STORER et CORNISH-BOWDEN, 1974) :
d[ B ] V2 [ B ]
= v1 v 2 = v1 [4.5]
dt Km 2 + [ B ]
A partir de cette quation, nous pouvons conclure que le temps t requis pour que v2
atteigne une fraction spcifie de v1 est donne par une quation de la forme
suivante
f Km 2
t = [4.6]
v1
dans laquelle le paramtre f est un nombre sans dimension dpendant uniquement
des rapports v2/v1 et v1/V2. Les valeurs de f permettant la mise au point dun
systme coupl sont donnes dans le tableau 4.1. Le seul paramtre ajustable, V2,
(Km2 tant fix par le choix de lenzyme couple et des conditions de raction) doit
tre suffisamment grand pour que t reprsente une partie rduite du temps de
mesure. Les valeurs donnes dans le tableau ont t calcules en supposant que v2
devrait atteindre au moins 99% de v1, bien que pour certaines applications cette
condition ne soit pas rigoureusement ncessaire. Par exemple, si lon cherche dans
un processus de purification reprer les fractions actives au cours de llution
dune colonne de chromatographie, une valeur de 90% est largement suffisante.
Tableau 4.1 - Temps requis pour quun systme coupl atteigne un tat stationnaire
v1 /V2 f v1 /V2 f
0,0 0,00 0,5 6,86
0,1 0,54 0,6 11,7
0,2 1,31 0,7 21,4
0,3 2,42 0,8 45,5
0,4 4,12 0,9 141
Le tableau montre la valeur de f qui doit tre insre dans lquation [4.6] pour donner le
temps ncessaire pour que la vitesse v2 mesure avec un systme coupl atteigne 99% de
la vitesse cible v1. Par exemple, supposons que v1 soit de 0.1 mM min1, V2, la vitesse limite de
la raction couple, est de 0,5 mM min1 et Km2, la constante de MICHAELIS de lenzyme
coupl dans les conditions du test, est de 0,2 mM. Avec ces valeurs, le tableau donne
f = 1,31 ; ainsi, le temps ncessaire pour que la vitesse mesure atteigne 99% de
0,1 mM min1 est de 1,31 0,2/0,1 min ou 2,62 min. Le tableau est la version abrge de
celle prsente par STORER et CORNISH-BOWDEN (1974).
4 ASPECTS PRATIQUES DES TUDES CINTIQUES 125
0,04
0,02
V2 = 0,0313 mM min1
0
0 1 2 3 4 5
Temps (minutes)
4.2 - Phase dacclration dun test coupl
Les donnes sont celles de STORER et CORNISH-BOWDEN (1974) et correspondent au test de
lhexokinase en utilisant la glucose 6-phosphate dshydrognase comme enzyme coupl.
Les points exprimentaux prsentent (pour des duplica de dcours ractionnels chaque
valeur de V2) les concentrations de NADred, le produit de la raction couple, diffrents
temps aprs le dbut de la raction et pour 3 valeurs diffrentes de V2 comme indiqu. Les
trois courbes prsentes nont pas t ajustes sur les donnes mais elles ont t
calcules indpendamment partir des valeurs connues de V2, en accord avec la thorie
prsente dans le texte qui suit.
Dans certains cas, mme si la raction mesure peut tre suivie en direct, il est
parfois souhaitable de coupler la raction une seconde raction. Par exemple, si
un des produits de la premire raction est un puissant inhibiteur, ou si une raction
rversible est tudie dans le sens le moins favorable, de sorte que lquilibre est
atteint aprs quune faible partie du substrat ait ragit, la mesure prcise de la
vitesse initiale peut savrer difficile. Des problmes de ce genre peuvent tre
rsolus en couplant la raction une raction irrversible qui limine le produit
inhibiteur ou dplace lquilibre. Dans ces cas, les contraintes nonces
126 CINTIQUE ENZYMATIQUE
devraient tre superposables quelle que soit la valeur de [ E ]0 . Sils ne le sont pas,
lhypothse initiale selon laquelle la vitesse doit tre proportionnelle la concen-
tration initiale denzyme durant toute la raction, est incorrecte. La figure 4.3
montre deux exemples de ces graphiques, un dans lequel les rsultats sont ceux
attendus pour un test satisfaisant, lautre dans lequel les rsultats ne le sont pas.
5,6 g mL1
Avancement de la raction (%)
Glutamyl-ARN (pmol)
4 0,4 : 1 : 2 100
2,8 g mL1
2 50
La raison la plus simple pour laquelle le test de SELWYN peut tre ngatif comme
dans la figure 4.3b, est que [ E ]0 varie au cours de la raction en raison dune
perte dactivit de lenzyme. SELWYN (1965) a cependant rpertori dautres
causes possibles, qui expliquent que le test est insatisfaisant ou quil est compliqu
de manire telle quune tude supplmentaire est ncessaire avant que son
utilisation routinire ne soit possible.
Le test de SELWYN nest pas couramment utilis. Pendant les annes 1970 et 1980,
cela pouvait tre justifi par le dveloppement des moyens et des conditions dans
lesquelles les enzymes devaient tre utiliss pour viter leur inactivation.
Aujourdhui, le dveloppement des techniques de biologie molculaire permet de
produire des protines recombinantes modifies, qui, dans certains cas, sont moins
stables que la protine originale. Cela cre un rel besoin de tester linactivation de
ces enzymes pendant la raction, afin dviter de comparer les cintiques de
raction catalyse par un enzyme stable avec les cintiques de raction catalyse
par des variants moins stables susceptibles dintroduire certains artfacts.
4 ASPECTS PRATIQUES DES TUDES CINTIQUES 129
Le principe de base sur lequel repose le test de SELWYN tait dj bien connu aux
premiers temps de lenzymologie : les donnes prsentes dans la figure 4.3a sont
celles de MICHAELIS et DAVIDSOHN (1911) et des donnes similaires sont fournies
par HUDSON (1908) ; il est clair, de plus, selon la discussion donne par HALDANE
(1930) que de tels tests taient appliqus lpoque de nombreux enzymes. Ds
1890, OSULLIVAN et TOMPSON ont comment que le temps ncessaire pour
atteindre un pourcentage donn dinversion (cest--dire dhydrolyse du sucrose)
est inversement proportionnel la quantit prsente de matriel invers ; en
dautres termes, le temps est inversement proportionnel la quantit dagent
inversant. En dpit de cela, le test a t largement oubli jusqu ce que SELWYN
(1965) adapte le traitement donn par MICHAELIS et DAVIDSOHN (1911) et discute
les diverses raisons possibles de son chec. On peut se demander combien de
techniques aussi utiles restent caches dans la littrature ancienne.
il existe deux raisons pour lesquelles ceci nest pas toujours vrai. Premirement, le
respect de lquation de MICHAELIS et MENTEN peut ne pas tre absolu : beaucoup
denzymes se caractrisent par une inhibition par le substrat pour des valeurs
leves de [ A ] , et en consquence les valeurs de v mesures des concentrations
leves peuvent ne pas tre en accord avec les valeurs de Km et de V qui dfinissent
les cintiques des valeurs faibles et modres de [ A ] . Deuximement, mme si
lquation de MICHAELIS et MENTEN est prcisment respecte, lavantage
dinclure des valeurs de [ A ] suprieures 10 Km est faible et peut tre invalid par
le cot additionnel que ces mesures reprsentent. De plus, si le substrat est un ion,
il peut tre difficile dviter une variation de la force ionique lorsque des
concentrations excessives sont utilises.
Une limite sur la concentration maximale de substrat qui peut tre utilise est
souvent impose par labsorbance spcifique du substrat ou du produit utilis pour
la mesure dactivit. Par exemple, de nombreuses mesures dactivit enzymatique
sont bases sur labsorbance du NADred 340 nm, qui est denviron 0,9 dans une
cuve de 1 cm pour une solution de 0,15 mM. Ceci suggre que des mesures des
concentrations suprieures soient difficiles, bien que lutilisation dune cuve de
0,2 cm permette dtendre la gamme de concentration de substrat dun facteur 5.
Curieusement, les cuves de 1 cm de trajet optique sont devenues tellement
familires que certains utilisateurs semblent ignorer cette possibilit dutiliser
dautres longueurs de trajet optique. A loppos, des cuves de 5 ou 10 cm peuvent
tre utiles pour suivre des solutions qui absorbent trs peu, bien que celles-ci
puissent tre plus difficiles utiliser si leur utilisation ncessite la modification du
spectrophotomtre.
De la mme manire que la vitesse haute concentration de substrat est dtermine
par V, la vitesse faible concentration est dtermine par V/K m (voir 3.3). Ds
lors, pour que V/K m soit correctement dtermin, il est ncessaire de raliser des
mesures de v des valeurs de [ A ] infrieures K m . Il nest pas ncessaire de
chercher utiliser des valeurs de [ A ] aussi petites que possible, puisque la
condition v = 0 impose pour [ A ] = 0 fournit un point fixe par lequel le graphique
de v en fonction de [ A ] doit obligatoirement passer. Ds lors, il y a peu dintrt
mesurer des valeurs de v des valeurs de [ A ] infrieures 0,2 K m. Sil existe un
intrt quelconque, il dpend de la manire dont les erreurs sur v sont distribues :
si v a une dviation standard constante, une valeur optimale pour le bas de la
gamme des valeurs de [ A ] est environ 0,8 K m (la valeur exacte dpendant de la
valeur suprieure de la gamme), mais si v a un coefficient constant de variation, la
valeur optimale pour le bas de la gamme est zro (ENDRENYI, 1981). La valeur de
0,2 Km est un bon compromis, gnralement satisfaisant, entre ces deux situations.
La dtermination de Km ncessite des valeurs prcises aussi bien de V que de V/Km ;
donc la gamme de [ A ] devrait stendre de 0,2 K m jusqu 10 K m ou jusqu la
concentration de A la plus leve possible.
4 ASPECTS PRATIQUES DES TUDES CINTIQUES 131
Il est difficile de ne pas souligner que les remarques faites ci-dessus sont inhrentes
au respect du mcanisme de MICHAELIS et MENTEN, ou du moins que lon ne se
soucie pas du respect de ce modle en dehors de la gamme de lexprience. Si nous
nous intressons une raction dans des conditions physiologiques, il ny a pas de
raisons de nous soucier des dviations par rapport un comportement simple qui
peuvent survenir dans des conditions non-physiologiques ; nanmoins, si nous nous
intressons au mcanisme cintique de la raction, il est souhaitable dtendre
autant que possible la gamme de conditions utilises, puisque des dviations dans
le comportement de lenzyme dans les conditions extrmes peuvent tre utiles pour
ltablissement du mcanisme. HILL, WAIGHT et BARDSLEY (1977) ont discut le
fait que trs peu denzymes (si du moins ils en existent certains) obissent
rellement lquation de MICHAELIS et MENTEN. Ils pensent que le nombre limit
de conditions exprimentales, associ au manque de volont de rendre compte de
lobservation de faibles dviations vis--vis du comportement attendu, ont conduit
une supposition injustifie que les cintiques enzymatiques obissaient de
manire presque universelle lquation de MICHAELIS et MENTEN. Pratiquement,
tous les exemples standards et traditionnels de cintiques simples se sont rvls,
selon eux, plus complexes lorsque des tudes soigneuses ont t ralises.
Lquation de MICHAELIS et MENTEN reste sans nul doute utile en premire
approximation dans les tudes cintiques, mme si quelques fois des mesures
prcises conduisent son rejet. Cependant, il est toujours conseill de vrifier
labsence des dviations les plus communes. La vitesse initiale est-elle nulle en
absence de substrat (et denzyme) ? Si ce nest pas le cas, la dviation est-elle
suffisamment petite pour tre explique par les erreurs exprimentales ? Sil y a
une variation rsiduelle du signal en absence de substrat ou denzyme, est-il
possible de lliminer par purification ? La vitesse tend-elle vers zro pour des
concentrations de substrat largement diffrentes de zro ? Dans ce cas, il sera utile
de vrifier la cooprativit de la raction (voir chapitre 9). Existe-t-il une indication
de linhibition par le substrat ou par le produit, par exemple, une diminution de v
lorsque [ A ] augmente ? Mme si la vitesse ne diminue pas, une augmentation de
v avec une concentration [ A ] plus faible que celle prvue par lquation de
MICHAELIS et MENTEN peut indiquer une inhibition par le substrat.
Mme sil nest pas dans votre intention dtudier les dpendances de la raction
enzymatique au pH ou la temprature, il est ncessaire de bien choisir les
conditions dans lesquelles la raction est tudie. Pour de nombreuses applications,
il est appropri de travailler dans des conditions proches des conditions
physiologiques par exemple pH 7,5 - 37C et une force ionique de 0,15 M pour la
plupart des enzymes produites par des mammifres mais il existe aussi de
nombreuses bonnes raisons dutiliser dautres conditions dans ltude des
132 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Dans une tude cintique, il nest pas rare que le meilleur modle qui puisse tre
obtenu ne reprsente pas parfaitement chaque observation. La question se pose
alors de savoir si les diffrences observes peuvent tre attribues aux erreurs
exprimentales ou si elles traduisent la ncessit de recourir un modle plus
complexe. Pour rpondre cette question, il est ncessaire destimer la grandeur
des erreurs commises sur les mesures exprimentales. La manire la plus simple
destimer la valeur des erreurs consiste rpliquer les observations. Si les
observations rpliques sont plus en accord les unes avec les autres quavec la
courbe ajuste, cela peut indiquer que la courbe ajuste est rejeter et quil faut
introduire plus de termes dans lquation. Si, au contraire, les points exprimentaux
montrent autant de variation entre eux quavec la courbe ajuste, lquation utilise
pour lajustement peut tre accepte jusqu ce que des mesures plus prcises
soient obtenues.
4 ASPECTS PRATIQUES DES TUDES CINTIQUES 133
La thorie sur laquelle repose cette approche dpend du fait que cest uniquement
en rptant une exprience que nous pouvons dterminer si les donnes expri-
mentales sont en accord avec la courbe ajuste en l'absence derreurs alatoires.
Ds lors, une telle pratique mesure uniquement les erreurs alatoires, qui sont
galement appeles les erreurs pures pour, dans ce contexte, les distinguer du
mauvais ajustement qui peut rsulter de lutilisation dune quation inadapte dans
la procdure dajustement paramtrique. Nanmoins, le dsaccord entre les
observations et la courbe ajuste peut rsulter soit dune erreur de mesure, soit de
linadquation de la thorie et plus couramment encore dune combinaison des
deux ; cette procdure ne mesure donc pas des erreurs pures.
Lutilisation de rpliquas des mesures prsente galement certains inconvnients.
Pour donner un rsultat significatif, la diffrence entre deux rpliquas doit tre
rellement reprsentative de lerreur alatoire dans lensemble de lexprience.
Ceci sera vrai uniquement si les mesures rptes sont ralises exactement de la
mme manire que toutes les autres mesures et non de manire particulire. La
difficult peut tre mieux apprcie en examinant les trois cas prsents dans la
figure 4.4.
x x x
4.4 - Utilisation dobservations rpliques
Quand des observations sont proprement reproduites, la dispersion des points autour de
la courbe ajuste devrait tre irrgulire, comme dans lexemple (a). Une distribution
rgulire, comme dans les exemples (b) et (c), suggre que lexprience na pas t
correctement ralise, comme nous en discutons dans le texte.
Dans la figure 4.4a, les points sont distribus dans chacun des rpliquas de la mme
manire que les points sont distribus autour de la droite ajuste ; cest la situation
qui est attendue si lajustement est correct et si les rpliquas ont t correctement
mesurs. Dans la figure 4.4b, la distribution des rpliquas apparat plus troite que
la distribution des mesures autour de la droite, mme si la distribution des points de
part et dautre de cette dernire semble plus alatoire que systmatique. Il existe
diffrentes causes possibles cette situation insatisfaisante : la plus courante est
certainement la mesure successive des diffrents rpliquas dun mme point, de
sorte que le temps moyen entre deux de ces mesures est court par rapport au temps
moyen de lexprience. Si les mesures sont faites de cette manire, toute variation
lente des conditions au cours de lexprience peut produire des erreurs qui ne sont
pas rpercutes de manire approprie dans les rpliquas, par exemple une
134 CINTIQUE ENZYMATIQUE
lexprience et non localises dans le temps) et de doubler le reste. Si, dun autre
ct, il nest pas possible de raliser plus de 30 mesures, il faudra rduire le
nombre de rptitions. Il est stupide de dfendre une rgle stipulant que chaque
mesure doit tre effectue 3 fois, non seulement parce que cela simplifie le
problme, mais aussi parce que cela peut conduire des expriences dans
lesquelles trop peu de conditions sont tudies pour obtenir linformation attendue.
PROBLMES
t [ PA ] [ PB ]
0 0,0 0,0
2 10,5 4,3
4 18,0 8,3
6 23,7 11,7
8 27,9 14,5
10 31,3 16,8
12 34,0 19,0
5 INHIBITION ET ACTIVATION DES ENZYMES
Les substances qui, lorsquelles sont prsentes dans le mlange ractionnel, ralen-
tissent une raction catalyse par un enzyme sont appeles des inhibiteurs. Linhi-
bition peut intervenir de diverses manires et il existe donc divers types dinhibiteurs.
Notamment, deux grands types dinhibition sont distingus, les inhibitions rver-
sibles qui peuvent tre leves en liminant linhibiteur du milieu ractionnel et les
inhibitions irrversibles qui impliquent gnralement la modification covalente dun
groupe essentiel de lenzyme et qui ne peuvent tre leves par dialyse ou dilution.
Dans ce chapitre, nous discutons dabord brivement des inhibiteurs irrversibles ou
poisons catalytiques. Ceux-ci sont des substances qui, en se combinant avec len-
zyme, liminent compltement son activit. De nombreux enzymes sont empoi-
sonns par des traces de mtaux lourds, et pour cette raison, les tudes cintiques
sont couramment ralises en prsence dagents complexant comme lEDTA. Ceci
est particulirement important lors de la purification des enzymes : dans lextrait
brut, la concentration totale de protine est leve et les nombreuses protines
contaminantes squestrent la majorit des ions mtalliques qui sont prsents, mais
plus une prparation denzyme devient pure et moins ce dernier est protg par les
autres protines et donc plus il devient important dajouter des agents alternatifs de
complexation. Dans certains cas, ces inhibiteurs irrversibles peuvent aussi tre
utiliss de faon positive. Par exemple, lempoisonnement par les composs de
mercure (II) a souvent t utilis pour mettre en vidence limplication de groupes
sulfhydryles dans le site catalytique des enzymes.
plus rarement envisag (bien quil ne soit probablement pas aussi rare quil e s t
gnralement suppos) est celui o le complexe enzyme-inhibiteur conserve une
certaine activit catalytique : ce type dinhibition est dnomm inhibition partielle,
puisquune activit rsiduelle persiste quand lenzyme est entirement satur par
linhibiteur, ou il est dnomm inhibition hyperbolique par rfrence la forme des
courbes obtenues lorsque les paramtres apparents de MICHAELIS sont ports en
graphique en fonction de la concentration dinhibiteur.
Les cas dinhibition linaire aussi bien que ceux dinhibition hyperbolique peuvent
tre sous-classs en fonction des paramtres apparents de MICHAELIS qui sont
affects, mais en pratique ces dnominations font ordinairement rfrence aux cas
dinhibition linaire. Le type le plus commun est habituellement appel inhibition
comptitive bien que le terme inhibition spcifique soit plus appropri (parce quil
est neutre dun point de vue mcanique mais est descriptif dun point de vue
algbrique) ; il se caractrise par une diminution du paramtre apparent V Km sans
variation du paramtre apparent V. Parce que linhibition comptitive avait t
dcouverte avant quil nait t reconnu que les paramtres fondamentaux de
lquation de MICHAELIS et MENTEN sont V et V Km , ce type dinhibition est sou-
vent dcrit comme impliquant une augmentation de K m . Comme cela apparatra
plus clairement dans la suite du texte (voir tableau 5.1), la classification des
inhibiteurs est beaucoup plus simple et plus directe si elle est base sur les
paramtres V et V Km .
Les autres types dinhibition sont linhibition anti-comptitive ou inhibition cataly-
tique dans laquelle le paramtre apparent V diminue sans que le paramtre V Km
ne soit modifi, ce qui peut aussi tre exprim en disant que les paramtres appa-
rents V et Km diminuent par un facteur identique et linhibition mixte dans laquelle
les deux paramtres apparents, V et V Km , diminuent. Un dernier type, connu sous
le nom dinhibition non-comptitive pure dans laquelle le paramtre apparent V
diminue sans que K m ne soit modifi, a t considr par le pass comme un type
important dinhibition, mais il a ensuite t reconnu quil correspond simplement
un cas particulier de linhibition mixte. Tous ces types dinhibition sont dcrits plus
en dtails dans ce chapitre.
une structure trs proche de celle du succinate et il nest ds lors pas surprenant quil
puisse se fixer sur lenzyme, dans le site de fixation du substrat pour former un
complexe abortif, incapable de ragir.
A+E EA E+P
+
I 5.2 - Mcanisme dune inhibition comptitive
Lquation qui dfinit une inhibition linaire comptitive et qui sapplique non seu-
lement au mcanisme de la figure 5.2 mais tout autre mcanisme dinhibition
comptitive, est celle de lquation [5.3] :
V [ A]
v = [5.3]
[ I ]
Km 1 + + [ A]
Kic
5 INHIBITION ET ACTIVATION DES ENZYMES 143
1. Une dfinition oprationnelle exprime une observation, sans aucun gard vis--vis
de la manire dont le phnomne est interprt, alors quune dfinition mcanique
repose sur une interprtation. Les dfinitions mcaniques de comportements
cintiques sont trs couramment utilises, mais leur dsavantage est que des
observations ne peuvent tre dcrites qu partir du moment o elles ont t
interprtes, alors quen recherche, on est souvent amen dcrire les obser-
vations avant quune interprtation satisfaisante ne soit obtenue.
144 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Kmapp =
[
Km 1 + ( [ I ] Kic ) ] [5.9]
1 + ( [ I ] Kiu )
V app = V Km
[5.10]
Kmapp
1 + ( [ I ] Kic )
Le mcanisme le plus simple qui puisse expliquer ce comportement est celui dans
lequel linhibiteur peut se fixer la fois sur lenzyme libre pour donner un
complexe EI avec une constante de dissociation K ic, et sur le complexe enzyme-
substrat pour donner le complexe EAI avec une constante de dissociation Kiu,
comme montr dans le schma de la figure 5.3. Dans ce schma, les deux ractions
de fixation de linhibiteur sont considres comme des voies en cul-de-sac et sont
donc des quilibres ( 6.3.6.3), mais comme EI et EAI existent, aucune raison
mcanique vidente ne permettrait dexpliquer que A ne puisse pas se fixer sur le
complexe EI pour former EAI. Si cette raction est incluse dans le mcanisme,
lquation de vitesse est plus complexe et implique des termes en [ A ] 2 et [ I ] 2 .
De tels termes sannulent uniquement si toutes les tapes de fixation ont atteint
lquilibre, cest--dire si toutes les tapes de dissociation des substrats et des
produits sont rapides par comparaison avec ltape de conversion de EA en
produits, et aucune raison ne justifie une telle situation. Cependant, la dviation
prdite par rapport des cintiques simples est difficile dtecter exprimen-
talement et lobissance une cintique
simple nest pas une preuve irrfutable A + EI EAI
dmontrant que K m , K ic et Kiu sont de vraies
constantes dquilibre de dissociation. Kic Kiu
A+E EA E+P
+ +
5.3 - Mcanisme produisant une inhibition mixte I I
Bien quil soit pratique de dfinir linhibition mixte partir de la figure 5.3, ce type
dinhibition est souvent rencontr dans le processus dinhibition par le produit.
Si un produit est libr dans une tape qui gnre une forme denzyme diffrente
de celle qui fixe le substrat, les prdictions indiquent que linhibition par le produit
obit aux quations [5.8] [5.10]. Cette conclusion ne dpend pas des hypothses
dquilibre, cest--dire quelle est une consquence ncessaire du traitement
ltat stationnaire, comme il est facile de le dmontrer partir des mthodes qui
seront dcrites dans le 6.3. Le plus simple parmi divers mcanismes de ce type
est celui dans lequel le produit est libr dans la deuxime tape dun mcanisme
en comportant trois, comme dcrit dans la figure 5.4.
k1 k2
Dans ce mcanisme aucune des deux A+E EA E' + P
constantes dinhibition nest une k1 k2
vritable constante dquilibre. k3
5.4 - Mcanisme dinhibition mixte par le produit
146 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Des exemples plus complexes abondent dans les ractions impliquant plus dun
substrat ou dun produit, comme nous le verrons dans le chapitre 6. Dans ces cas,
lassimilation des constantes Kic et Kiu avec des constantes de dissociation nest pas
utile. Mme dans un exemple aussi simple que celui de la figure 5.4, dans lequel le
produit P agit comme un inhibiteur mixte plutt que comme un inhibiteur comptitif,
puisquil se lie une forme de lenzyme diffrente de celle qui fixe A, les constantes
( k + k )k (k +k )
dinhibition sont donnes par Kic = 1 2 3 et Kiu = 2 3 , dont aucune
k 1k 2 k 2
nest une vritable constante dquilibre sauf si k3 << k2.
La raret avec laquelle les authentiques inhibitions non-comptitives sont rencon-
tres a conduit quelques enzymologistes gnraliser ce terme pour englober tous
les cas dinhibition mixte. Il ne semble pas y avoir davantage procder de la
sorte : except quun terme court et non ambigu est remplac par un terme plus
long et ambigu, ne faisant quajouter de la confusion une nomenclature qui est
dj confuse. Pour viter toute ambigut, il est prfrable de rserver le terme
dinhibition non-comptitive pour les rares cas o lon souhaite faire rfrence
linhibition non-comptitive pure.
V app = V [5.11]
1 + ( [ I ] Kiu )
Km
Kmapp = [5.12]
1 + ( [ I ] Kiu )
V app = V [5.13]
Kmapp Km
La constante dinhibition anti-comptitive Kiu peut tre reprsente simplement par
Ki quand le caractre anti-comptitif est tabli, mais comme cela nest gnrale-
ment pas le cas, il est prfrable dutiliser le symbole le plus explicite. La compa-
raison des quations [5.11] [5.13] avec les quations [5.8] [5.10], montre que
linhibition anti-comptitive est un cas limite de linhibition mixte dans lequel Kic
2. Bien que le terme anti-comptitive soit galement utilis par les anglo-saxons,
ceux-ci prfrent gnralement utiliser le terme uncompetitive pour dnommer
ce type dinhibition. Cette dernire dnomination nayant pas de traduction
franaise simple et non-ambigu, nous avons choisi dutiliser ici le terme anti-
comptitive qui marque lopposition des effets sur V et V/Km vis--vis de
linhibition comptitive.
5 INHIBITION ET ACTIVATION DES ENZYMES 147
tend vers linfini ; cest--dire pour lequel [ I ] Kic est ngligeable quelle que soit
la valeur de [ I ] , et donc pour lequel ce terme disparat des quations [5.8]
[5.10]. Cest donc le contraire de linhibition comptitive qui reprsente lautre cas
limite de linhibition mixte o Kiu tend vers linfini.
Linhibition anti-comptitive est galement, du moins en principe, le pendant de linhi-
bition comptitive au point de vue du mcanisme ractionnel, puisque les mcanismes
prdits pour ce type dinhibition impliquent que linhibiteur se fixe sur le complexe
enzyme-substrat et non sur lenzyme libre. Un exemple dune grande importance
clinique est linhibition de la monophosphatase du myo-inositol par lion Li+. Cet ion
est utilis pour traiter certains cas de dpression et sa slectivit pour les cellules
prsentant une activit excessive de transduction du signal est consistante avec le
caractre anti-comptitif de linhibition (POLLACK et al., 1994). De tels mcanismes ne
sont cependant pas particulirement communs et linhibition anti-comptitive se
rencontre principalement comme un type dinhibition par le produit qui est commun
dans les ractions impliquant plusieurs substrats et plusieurs produits.
Le Comit de Nomenclature de lIUB (1982) a choisi dutiliser le terme uncompetitve
pour dnommer ce type dinhibition. Nanmoins, comme nous en avons discut
dans la note [2], ce terme na pas de traduction simple en franais. La dnomina-
tion anti-comptitive utilise ici, marque mieux le fait que ce type dinhibition
se trouve loppos de linhibition comptitive et de nombreux manuels en langue
anglaise, tel que celui de LAIDLER et BUNTING (1973), utilisent galement le terme
anti-comptitif . Toutefois, lappellation inhibition anti-comptitive nest
pas aussi fermement tablie que son oppose, et il y a de bonnes raisons de laban-
donner au profit du terme inhibition catalytique :
le terme anti-comptitif nest pas utilis dans le langage courant et en
pratique il est gnralement confondu avec le terme non-comptitif , lui-mme
utilis de diverses manires dans la littrature biochimique ;
linhibition anti-comptitive est beaucoup moins courante que linhibition com-
ptitive et donc le terme ne peut pas tre valid par un usage universel.
Les proprits des diffrents types dinhibition linaire sont rsumes dans le
tableau 5.1. Elles sont faciles mmoriser pour peu que les points suivants soient
pris en compte :
Les deux cas limites sont linhibition comptitive (spcifique) et linhibition anti-
comptitive (catalytique) ; linhibition non-comptitive pure est simplement un
cas spcial dinhibition mixte dans lequel les deux constantes dinhibition K ic et
Kiu ont la mme valeur.
Les effets des inhibiteurs sur V app Kmapp et sur V app sont simples et rguliers ; si
les grandeurs de ces paramtres sont diminues par la prsence de linhibiteur,
elles le sont respectivement par des facteurs 1+ ( [ I ] Kic ) et 1+ ( [ I ] Kiu ) .
148 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Les effets des inhibiteurs sur Kmapp sont confus ; ils sont le plus facilement
mmoriss en assimilant Kmapp V app ( V app Kmapp ) et non un paramtre part
entire.
Tableau 5.1 - Caractristiques des inhibitions linaires
V Km [ I ]
Comptitive V Km 1 +
1 + ( [ I ] K ic ) K ic
Mixte
V V Km [
K m 1 + ( [ I ] K ic ) ]
1 + ( [ I ] K iu ) 1 + ( [ I ] K ic ) 1 + ( [ I ] K iu )
V V Km
Non-comptitive pure 3 Km
1 + ( [ I ] K iu ) 1 + ( [ I ] K ic )
V V Km
Anti-comptitive
1 + ( [ I ] K iu ) Km 1 + ( [ I ] K iu )
Chaque graphique dcrit dans le 3.5 peut tre utilis pour diagnostiquer le type
dinhibition, puisque chacun fournit une estimation de la valeur apparente des
paramtres cintiques. Par exemple, si des graphiques de [ A ] v en fonction de
[ A ] sont tracs pour diffrentes concentrations dinhibiteur I, lordonne lori-
gine Kmapp V app varie avec [ I ] sil y a une composante spcifique dans linhibition,
alors que la pente 1 V app varie avec [ I ] sil y a une composante dinhibition
catalytique. Alternativement, si des reprsentations linaires directes de V app en
fonction de Kmapp sont ralises pour chaque valeur de [ I ] , le point dintersection
commun se dplace dans une direction qui est caractristique du type dinhibition :
pour linhibition comptitive, le dplacement sopre vers la droite ; pour linhibition
anti-comptitive, le dplacement sopre vers lorigine des axes ; pour linhibition
mixte, le dplacement est intermdiaire entre ces deux extrmes. Des exemples de
ces diffrentes possibilits sont prsents schmatiquement dans la figure 5.5, et un
exemple de rsultats exprimentaux est prsent dans la figure 5.6.
a V app b V app
V
Comptitive Mixte
0 Kmapp 0 Kmapp
c V app d V app
5.5 - Effets des diffrents types dinhibition sur la localisation du point dintersection
des droites dans le graphique linaire direct (voir figure 3.14)
V app (M min1) 16
12
non-inhib
8
inhib
Dautres graphiques sont ncessaires pour dterminer les valeurs relles des
constantes dinhibition. Lapproche la plus simple consiste estimer les constantes
150 CINTIQUE ENZYMATIQUE
1 ( Kic Kiu )
et ainsi, [ I ] = Kic et 1 v = au point dintersection.
V
5 INHIBITION ET ACTIVATION DES ENZYMES 151
et =
[
[ A ] Km 1 ( Kiu Kic )
.
]
v V
Les deux types de graphique sont reprsents schmatiquement pour les diffrents
types dinhibition dans la figure 5.7, et un exemple de rsultats exprimentaux est
prsent dans la figure 5.8.
Cette concentration [ I ] 0.5 nest gale aucune des constantes habituelles dinhi-
bition, except dans le cas dune inhibition non-comptitive pure, qui est trs rare-
ment rencontre dans la pratique (voir 5.2.2) pour constituer un exemple utile : en
gnral, il est plus prudent de dire que [ I ] 0,5 nest pas une constante dinhibition
et quil est ncessaire de connatre le type dinhibition pour la convertir en lune de
ces constantes. CHENG et PRUSOFF (1973) et BRANDT, LAUX et YATES (1987) ont
prsent des analyses dtailles de ces relations qui dcoulent de lquation
habituelle pour une inhibition mixte (quation [5.12]).
a 1/v b [A]/v
Comptitive Comptitive
1/V
1/v [A]/v
Mixte Mixte
Kiu
1/(1 Kiu /Kic)V
0 [I] 0 Km(1 Kiu /Kic)V [I]
Kic
1/v [A]/v
Anti-comptitive Anti-comptitive
Km/V
60
100
8,8
2,58
1,72 40
0,645
50 0,344
20
0
10 0 10 20 30 0 10 20 30
[Glucose 6-phosphate] (mM) [Glucose 6-phosphate] (mM)
5.8 - Inhibition de lhexokinase D par le glucose 6-phosphate
(STORER et CORNISH-BOWDEN, 1977) porte en graphique comme dans la figure 5.7
Les concentrations de MgATP2 sont 8,8 mM (), 2,58 mM (), 1,72 mM (), 0,645 () et
0,344 mM (). La combinaison des droites scantes dans le graphique (a) et des droites
parallles dans le graphique (b) indique une inhibition comptitive avec Kic = 11,5 mM.
Ce rsultat nest pas par lui-mme dune importance immdiate, mais si nous
ignorons le signe ngatif et substituons la valeur positive rsultante dans lquation
[5.14], le rsultat est une vitesse gale la moiti de la vitesse v0 en absence
dinhibiteur :
V [ A]
v = = 0 ,5 v0 [5.20]
2( Km + [ A ])
Il dcoule de cette quation que lintersection avec laxe des abscisse, dans un
graphique de DIXON ou dans un graphique de [A] v en fonction de [ I ] , est gale
[ I ] 0,5, et que laisser tomber le signe ngatif de lquation [5.19] montre la
dpendance exacte de [ I ] 0,5 vis--vis de la concentration de substrat et des autres
paramtres :
Km + [ A ]
[ I ]0 ,5 = [5.21]
( K m K ic ) + ( [ A ] Kiu )
Les tudes exprimentales des enzymes sont gnralement ralises avec un seul
substrat prsent dans le mlange ractionnel, cest--dire en absence de substrat
alternatif capable de subir la mme raction 4. En effet, la prsence de substrats en
comptition complique lanalyse sans apporter dinformation supplmentaire
celle obtenue en tudiant les deux substrats sparment. Cependant, ceci implique
une diffrence majeure entre la pratique exprimentale et les conditions physiolo-
giques dans lesquelles lenzyme fonctionne habituellement : la plupart des enzymes
ne sont pas parfaitement spcifiques pour un seul substrat et doivent souvent
choisir parmi les quelques-uns (et mme parfois quelques millions, comme dans
lexemple [5.10]) qui sont disponibles simultanment. Pour tre significative dans
le contexte physiologique, la spcificit dun enzyme doit tre dfinie en terme de
lefficacit avec laquelle lenzyme est capable de discriminer entre plusieurs
substrats prsents dans le mme mlange ractionnel. Ceci ne signifie pas quelle
ne peut pas tre dtermine partir des paramtres cintiques de lenzyme pour les
diffrents substrats individuels, mais cela signifie que ces paramtres doivent tre
interprts correctement.
Le cas le plus simple considrer est celui dans lequel sont en comptition deux
substrats qui individuellement donnent des cintiques de MICHAELIS et MENTEN
quand ils sont tudis sparment (figure 5.9). Il sagit dune version lgrement
k1 k2 simplifie du mcanisme qui sera dcrit
E+A EA E+P dans le 6.3.4.
k1
k'1 k'2
E + A' EA' E + P' 5.9 - Comptition entre substrats
k'1 pour le mme enzyme
V ' [ A' ]
d [ P' ] V ' [ A' ] K'm
v = = = [5.23]
dt [ A] [ A ] [ A' ]
K'm 1 + + [ A' ] 1 + K + K'
Km m m
k0 1
Substrat k0 (s1) Km (mM) Ki (mM) (s mM1)
Km
Fluorofumarate 2 700 0,027 100 000
Fumarate 800 0,005 160 000
Chlorofumarate 20 0,11 0,10 180
Bromofumarate 2,8 0,11 0,15 25
Iodofumarate 0,043 0,12 0,10 0,36
Mesaconate 0,023 0,51 0,49 0,047
L-Tartrate 0,93 1,3 1,0 0,72
Les donnes proviennent de mesures ralises 25C dans un tampon pH 7,3. Les
valeurs de la constante catalytique k0 (cest--dire V/E0, voir 3.3.3) et de Km ont t
mesures par des expriences cintiques conventionnelles. Les valeurs dans la colonne
intitule Ki sont des valeurs de Km, pour de mauvais substrats, mesures en traitant
ceux-ci comme des inhibiteurs comptitifs de la raction utilisant le fumarate comme
substrat. Le tableau est adapt daprs TEIPLE, HAAS et HILL (1968). La constante k0/Km
est aussi appele constante de spcificit (kA).
Un point plus important noter partir des quations [5.22] et [5.23], qui est
galement illustr par les donnes du tableau 5.2, est quelles fournissent les bases
pour une dfinition rigoureuse de la spcificit dun enzyme. Considrons les
paramtres pour le fluorofumarate et pour le fumarate. Si les deux ractions sont
considres isolment, la valeur de k0 pour le fluorofumarate est environ trois fois
plus leve que celle pour le fumarate. Cependant, la situation est inverse aux
faibles concentrations, parce que la valeur de k0 Km est environ 60% plus leve
pour le fumarate que pour le fluorofumarate. Lequel de ces rsultats est le plus fon-
damental, en dautres termes, quel est le substrat le plus spcifique ? La question
156 CINTIQUE ENZYMATIQUE
peut apparatre comme un simple problme de dfinition, mais une rponse claire
et satisfaisante ne peut tre apporte qui si nous ralisons quil est artificiel de
considrer les deux substrats isols lun de lautre. Afin de dterminer la spcificit
dans un contexte physiologique, nous devons considrer la proportion de la
raction impliquant chaque substrat lorsque ceux-ci sont mlangs, une information
qui peut tre dtermine en divisant lquation [5.22] par lquation [5.23] :
V k0
[ A] [ A]
v = d [ P ] = Km =
Km k [ A]
= A [5.24]
v' d [ P' ] V' k'0 k' A [ A' ]
[ A' ] [ A' ]
K'm K'm
Jusqu prsent lutilisation du nom constante de spcificit pour dsigner le
paramtre k A = k0 Km (introduit dans le 3.3.4) pouvait sembler arbitraire, mais
lquation [5.24] rvle que cest ce paramtre qui dfinit le rapport des vitesses
dans une situation o il y a une comptition entre substrats prsents simultanment
dans le mlange ractionnel, et que donc il exprime la capacit dun enzyme
discriminer les diffrents substrats. Ds lors, dans un mlange quimolaire de
fumarate et de fluorofumarate, quelle que soit leur concentration, la vitesse
dhydratation du fumarate catalyse par la fumarase est 60% plus rapide que celle
du fluorofumarate. Le fumarate est le substrat le plus spcifique.
A partir des quations [5.22] et [5.23], la vitesse globale vtot = v + v' pour les deux
ractions en comptition peut tre exprime de la manire suivante :
V V'
[ A]+ [ A' ]
Km K'm
vtot = v + v' = [5.25]
[ A ] [ A' ]
1+ +
Km K'm
Supposons maintenant que des concentrations de rfrence, [ A ] = [ A ]0 et
[ A' ] = [ A' ]0 , sont obtenues (exprimentalement) de telle sorte que :
V [ A ]0 V ' [ A' ]0
= = v [5.26]
Km + [ A ]0 K'm + [ A' ]0
cest--dire quil existe des concentrations de chacun des substrats qui donnent la
mme vitesse ( la mme concentration denzyme) lorsque lautre substrat est
absent. Si une srie de mlanges est prpare dans laquelle les concentrations sont
interpoles linairement entre zro et leur concentration de rfrence, cest--dire :
[ A ] = ( 1 r )[ A ]0
[5.27]
[ A' ] = r [ A' ]0
5 INHIBITION ET ACTIVATION DES ENZYMES 157
3. Les ractions sont antagonistes - Si les deux substrats ragissent sur des sites
diffrents mais que chacun se fixe plus fortement sur le mauvais site que sur le
bon, le graphique apparat comme une courbe passant par un minimum. Un tel
cas nest cependant pas trs couramment rencontr dans la pratique.
0 0,5 1 0 1 2
[Fructose] (mM) [Galactose] (mM)
0,4 0,4
v (M/s)
v (M/s)
0,2 0,2
a - Le glucose et le fructose b - Le glucose et le galactose
ragissent sur le mme ragissent sur des sites
site : la vitesse est iden- diffrents : la vitesse est
tique pour des substrats plus leve avec un mlange
purs ou pour un mlange. qu'avec les substrats purs.
0 0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
r r
5.10 - Graphiques de comptition
Les donnes de CHEVILLARD, CRDENAS et CORNISH-BOWDEN (1993) pour la phosphorylation
de mlanges glucose/fructose par lhexokinase de levure (a), et de mlanges glucose/galac-
tose pour un mlange dhexokinase et de galactokinase de levure (b). Dans les deux cas, les
mlanges sont construits de sorte que la vitesse mesure est la mme pour les substrats
purs (voir le texte pour plus de dtails). Si les deux substrats sont en comptition pour le
mme site, la vitesse est indpendante de la proportion des substrats, comme dans (a) ;
quand les ractions se droulent sur des sites distincts, avec peu ou pas dinhibition
croise, la vitesse pour les mlanges dintermdiaires devrait tre suprieure celle pour
les substrats purs comme dans (b).
Toute discussion de lactivation des ractions catalyses par des enzymes est
complique par le fait que ce terme a t utilis en enzymologie avec diverses
significations. Nous lutilisons ici comme le contraire de linhibition rversible : un
activateur est une espce molculaire qui, en se combinant avec lenzyme, a pour
160 CINTIQUE ENZYMATIQUE
effet daugmenter son activit, sans que lui-mme ne subisse de raction. Dautres
processus qui sont couramment qualifis dactivation sont repris ci-dessous, mais
ne seront pas discuts davantage dans ce manuel :
1. Plusieurs enzymes, principalement des enzymes cataboliques extracellulaires
comme la pepsine, sont secrts sous la forme de prcurseurs inactifs, aussi
appels zymognes, le pepsinogne dans le cas de la pepsine. Ces derniers sont
convertis en enzyme actifs par protolyse partielle, un processus qui est quel-
quefois appel activation des zymognes .
2. Plusieurs enzymes importants dans les rgulations mtaboliques, comme les
phosphorylases, existent dans la cellule dans des tats actif et inactif (dans ce
cas, respectivement phosphorylase a et phosphorylase b). Ces tats diffrent
gnralement par la prsence ou labsence dun groupement phosphate (voir
10.9.2). La conversion entre ces deux tats ncessite deux ractions spares,
le transfert dun groupe phosphate partir de lATP dans une direction et
llimination dun groupe phosphate par hydrolyse dans lautre : ces processus
ne correspondent videmment pas lactivation et linhibition telles quelles
sont dfinies dans ce livre.
3. De nombreuses ractions sont dites actives par un ion mtallique quand en
ralit, lion mtallique fait partie du substrat. Par exemple, presque toutes les
kinases ATP-dpendantes sont actives par le Mg2 +, non pas cause de
leffet du Mg2+ sur lenzyme lui-mme, mais parce que le vrai substrat est lion
MgATP2 et non lATP4 qui est la forme sans mtal la plus abondante en solu-
tion pH physiologique. Par exemple, bien que lhexokinase D de foie de rat
utilise MgATP2 comme substrat, le Mg2+ libre est en ralit un inhibiteur et non
un activateur, tout comme lATP4 est un inhibiteur et non un substrat (STORER
et CORNISH-BOWDEN, 1977). Bien que ce type de confusion soit comprhen-
sible, si nous considrons lATP comme un ractif dans des ractions qui
normalement impliquent MgATP2 , il est prfrable dviter ce type de pro-
blme en exprimant les rsultats en termes des espces rellement impliques et
en rservant lutilisation du terme activation pour dcrire les effets sur
lenzyme. De part limportance du MgATP2 dans les ractions mtaboliques,
nous avons consacr le 4.4 de ce livre la discussion des mthodes assurant le
contrle de sa concentration.
E
5.12 Mcanisme produisant une +
activation spcifique X
la fois pour lactivation et pour linhibition, quand les deux types deffets sont
considrs, mme si le terme plus familier dinhibition comptitive est conserv
lorsque lactivation nest pas considre.
Le type le plus simple dactivation qui soit plausible dun point de vue mcanique
est la contrepartie de linhibition mixte, comme prsent dans la figure 5.13. Dans
ce cas, lactivateur nest pas ncessaire
k'1 k'2 pour la fixation du substrat, mais seule-
A + EX EAX EX + P
k'1 ment pour la catalyse.
KX K'X
k1
A+E EA
+ k1 + 5.13 - Mcanisme produisant
X X une activation mixte
compliqu pour une prsentation lmentaire (mme sans se proccuper du fait que
ltape de fixation ne devrait pas tre strictement traite comme un quilibre).
Nanmoins les effets hyperboliques ne devraient pas tre oublis compltement et
la figure 5.14 reprsente un mcanisme trs plausible que nous devrions nous
attendre appliquer de nombreux cas rels. Le fait quextrmement peu
dexemples (spcialement dinhibition hyperbolique) aient t publis, reflte plus
probablement un manquement reconnatre ce type de comportement que
lauthentique raret de ce comportement. Les effets hyperboliques ne sont pas
difficiles reconnatre exprimentalement, mais les symptmes sont souvent
carts comme une complexit mal accueillie. Il est important dutiliser une
gamme suffisamment large de concentrations dinhibiteur ou dactivateur pour
dterminer si la vitesse de la raction tend vers zro aux concentrations leves
dinhibiteur ou aux concentrations faibles dactivateur. En particulier, il faut
vrifier que les graphiques linaires attendus sont en ralit des droites ; toute
courbure systmatique devrait tre vrifie et si elle est confirme, il est probable
quelle indique des effets hyperboliques.
ceux faits la fin du paragraphe 5.6.3. Le point essentiel consiste inclure des
valeurs de [ I ] qui soient suffisamment leves et nombreuses pour dterminer si la
vitesse tend ou non vers zro lorsque la concentration dinhibiteur approche de la
saturation.
Tableau 5.3 - Prparation des expriences dinhibition
[I] [I]
[ I ] 1+ 1+ Kmapp Valeurs de [A]
Kic Kiu
La majorit des informations dont nous disposons sur les proprits gnrales des
enzymes a t obtenue par ltude dun petit groupe denzymes, les enzymes
extracellulaires catalysant des ractions dhydrolyse, qui comprend la pepsine, le
lysozyme, la ribonuclase, et peut tre le plus notable, la-chymotrypsine. Bien que
cette situation soit moins manifeste quil y a 30 ans, la frquence avec laquelle
la-chymotrypsine est rencontre dans la littrature doit plus au fait que cet
enzyme est considr comme un enzyme typique , que par limportance biolo-
gique quil peut avoir. Ces enzymes partagent certaines proprits qui justifient
pleinement leur utilisation pour des tudes dtailles : ils sont trs abondants,
facilement cristallisables, ils sont stables, monomriques, non-spcifiques et
peuvent tre traits comme des enzymes un seul substrat, puisque le second
substrat est leau. Nanmoins, toutes ces qualits les disqualifient en tant que
reprsentant un enzyme typique , puisque les enzymes sont gnralement
5 INHIBITION ET ACTIVATION DES ENZYMES 167
AE
A est un substrat de la raction, mais en
plus de son mode correct de fixation qui Ki
produit le complexe EA dans lequel A subit
la raction de conversion en P, il peut gale- k1 k2
A+E EA E+P
ment se fixer incorrectement pour donner le + k1
complexe AE dans lequel A ne peut ragir. A
5.15 - Fixation non-productive
Ce schma est le mme que celui de linhibition linaire comptitive (figure 5.2)
dans lequel linhibiteur est remplac par le substrat, et lquation de vitesse est
analogue lquation [5.3] :
k 2 [ E ]0 [ A ]
v = [5.35]
k 1 + k 2 [ A ]
1 + + [ A]
k1 Ki
Si les valeurs recherches des paramtres cintiques sont dfinies comme les
valeurs que ceux-ci auraient si aucun complexe non-productif ntait form, cest-
-dire que V exp = k 2 [ E ]0 et Kmexp = ( k 1 + k 2 ) k1 (voir les constantes pH-
indpendantes dans le 8.3.3), alors lquation [5.35] peut tre arrange sous la
forme dune quation de MICHAELIS et MENTEN :
V [ A]
v = [5.36]
Km + [ A ]
avec les paramtres dfinis de la manire suivante :
V = V exp [5.37]
K exp
1+ m
Ki
168 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Kmexp
Km = [5.38]
K exp
1+ m
Ki
exp
V = V exp [5.39]
Km Km
Ainsi ce mcanisme obit lquation de MICHAELIS et MENTEN, et les cintiques
observes ne fournissent aucune indication sur limportance de la fixation non-
productive. Malheureusement, les valeurs qui ont un intrt pour lexprience, sont
gnralement celles qui concernent le chemin productif. Les valeurs mesures, V et
K m , peuvent tre plus petites, dune quantit inconnue et non-mesurable, que les
grandeurs recherches. Seul le paramtre V Km donne une mesure correcte des
proprits catalytiques de lenzyme.
Pour les enzymes hautement spcifiques, une fixation non-spcifique savre peu
plausible et peut donc tre exclue, mais pour les enzymes non-spcifiques, comme la
chymotrypsine, la comparaison des rsultats obtenus avec plusieurs substrats peut
parfois fournir une preuve de lexistence dun tel phnomne. Ainsi par exemple,
INGLES et KNOWLES (1967) ont mesur les vitesses dhydrolyse dune srie dacyl-
chymotrypsines, en mesurant des valeurs de k0 pour lhydrolyse catalyse par la
chymotrypsine des esters de p-nitrophnol correspondants, dans laquelle ltape de
dacylation, cest--dire dhydrolyse de lintermdiaire acyl-chymotrypsine, est ltape
qui limite la vitesse.
Tableau 5.4 - Complexes non-productifs dans la catalyse par la chymotrypsine
k0
Groupe acyle k0 (s1) kOH (M1 s1) (M)
kOH
Le tableau montre des donnes dINGLES et de KNOWLES (1967) pour lhydrolyse catalyse
par la chymotrypsine desters de p-nitrophnol de divers acides amins actyls. Pour
ces substrats, lhydrolyse des actyl-amino-acyl-chymotrypsines correspondantes limite
la vitesse, et donc les valeurs mesures de la constante catalytique k0 sont en ralit
des constantes de premier ordre pour cette raction dhydrolyse. Les valeurs sont
compares avec les constantes de vitesse de second ordre kOH pour lhydrolyse catalyse
par la base des esters de p-nitrophnol des drivs benzyloxycarbonyles des acides amins
correspondants.
5 INHIBITION ET ACTIVATION DES ENZYMES 169
Lanalyse des rsultats (tableau 5.4) est complique par le fait que les divers groupes
acyles nont pas la mme ractivit vis--vis des nuclophiles. INGLES et KNOWLES ont
donc mesur les constantes de vitesse pour lhydrolyse de ces diffrents esters,
catalyse par lion hydroxyde. En divisant la constante de vitesse pour la raction
catalyse par la chymotrypsine par la constante de vitesse pour la raction catalyse par
la base, un profile plus intressant est apparu : lordre de ractivit des substrats
spcifiques de type L tait exactement linverse de celui des plus mauvais substrats de
type D cest--dire : Ac-L-Trp > Ac-L-Phe >> Ac-L-Leu >> Ac-Gly >> Ac-D-Leu >>
Ac-D-Phe > Ac-D-Trp. Lexplication la plus simple est lexistence dune fixation non-
productive : pour les groupes acyles ayant la configuration correcte L, les chanes
latrales volumineuses et hydrophobes assurent une fixation ferme et rigide dans le
mode correct, liminant la possibilit de former des complexes non-productifs, mais
pour les groupes acyles de configuration D, les mmes chanes latrales favorisent une
fixation ferme et rigide dans des modes non-productifs.
La fixation non-productive nest habituellement pas voque dans le contexte de
linhibition des enzymes et nest mme gnralement jamais considre, mais elle
suit exactement le mme mcanisme que celui qui est le plus couramment
considr pour reprsenter linhibition comptitive. Il est donc important de tenir
compte de cette possibilit lorsque les rsultats obtenus avec diffrents substrats
sont compars dans le cas dun enzyme non-spcifique. Le terme inhibition par le
substrat est gnralement rserv pour lanalogue anti-comptitif de la fixation
non-productive dont nous allons discuter dans la section suivante.
Pour certains enzymes, il est possible quune seconde molcule de substrat se fixe
sur le complexe enzyme-substrat, EA, pour
donner un complexe inactif, AEA, comme AEA
prsent dans la figure 5.16.
Ksi
Le mcanisme est analogue celui qui est habituellement envisag pour expliquer
linhibition anti-comptitive ( 5.2.3), et lquation de vitesse a la forme suivante :
k 2 [ E ]0 [ A ] V' [ A ]
v = = [5.40]
k 1 + k 2 [ A] [ A ]2
+ [ A ] 1 + K'm + [ A ] +
k1 Ksi Ksi
o V ' et K'm sont dfinis respectivement comme k 2 [ E ]0 [ A ] et ( k 1 + k 2 ) k1 ,
cest--dire quils satisfont aux dfinitions habituelles des paramtres de MICHAELIS
et MENTEN pour le mcanisme simple deux tapes ( 3.3) ; nanmoins, ces
170 CINTIQUE ENZYMATIQUE
paramtres sont dsigns avec un prime parce quils ne sont pas des paramtres de
MICHAELIS et MENTEN, puisque lquation [5.40] nest pas une quation de
MICHAELIS et MENTEN. La prsence du terme en [ A ] 2 implique que la vitesse
tend vers zro et non vers V ' pour des valeurs leves de [ A ] , et que K'm nest
pas gal la concentration de A pour laquelle v = V ' 2 . La courbe de v en fonction
de [ A ] est reprsente dans la figure 5.17, avec les graphiques correspondants de
[ A ] v en fonction de [ A ] et de 1 v en fonction de 1 [ A ] ; ces deux derniers
graphiques ne sont pas des droites mais adoptent lallure respectivement dune
parabole et dune hyperbole. Toutefois, si K si est beaucoup plus grand que K'm
(comme cest habituellement le cas), ils sont suffisamment linaires aux faibles
valeurs de [ A ] pour que V ' et K'm soient estims partir de ceux-ci de la faon
habituelle.
v a 1/v b
1,0 Aucune inhibition 3
par le substrat
2
0,8
1
Effet de l'inhibition
0,6 par le substrat
1 0 1 2 1/[A]
0,4
[A]/v c
6
Maximun pour [A] = (K'mKsi )1/2
4
0,2
2
0
0 2 4 6 8 [A] 2 0 2 4 [A]
5.17 - Inhibition par le substrat
Les courbes en trait continu ont t calcules partir de lquation [5.40] en utilisant les
valeurs suivantes : K'm = 1, V' = 1 ; Ksi = 30. Les pointills ont t calculs partir de
lquation de MICHAELIS et MENTEN en utilisant les valeurs suivantes : Km = 1, V = 1, sans
inhibition par le substrat. (a) Dans le graphique direct de v en fonction de [A], le maximum
est obtenu quand [A] 2 = K'm Ksi. Les petits graphiques en insert montrent lapparence des
graphiques (b) de 1/v en fonction de 1/[A] et (c) de [A]/v en fonction de [A]. Limpression
selon laquelle le graphique (b) prsente linhibition plus clairement que le graphique (c) est
une illusion, provenant du fait que la courbe (b) se prolonge jusque 1/[A] = 0,167, cest--
dire une valeur de [A] = 60, alors que dans (c), elle sarrte une valeur de [A] = 5.
En gnral, la probabilit de reconnatre lexistence dune inhibition par le substrat dpend
plus de la gamme des donnes qui sont portes en graphique que du type de graphique
utilis.
5 INHIBITION ET ACTIVATION DES ENZYMES 171
Lidentification des groupes essentiels dun enzyme constitue une tape importante
dans la caractrisation du mcanisme catalytique et une pratique courante consiste
dduire la nature des groupes impliqus dans la catalyse enzymatique en dter-
minant si lactivit de lenzyme est affecte lorsque certains rsidus sont modifis.
Malheureusement, le fait quun rsidu particulier soit essentiel pour lactivit cata-
lytique ne garantit pas quil joue un rle quelconque dans le processus catalytique ;
il peut, par exemple, tre essentiel pour maintenir la structure active de lenzyme.
Il existe aujourdhui, deux manires de modifier spcifiquement certains rsidus.
La plus ancienne consiste le modifier chimiquement par raction avec un ractif
spcifique. Cette mthode a rendu de trs grands services dans lidentification des
rsidus essentiels des sites actifs et peut encore tre trs utile. De nombreux ractifs
sont disponibles pour modifier spcifiquement certains rsidus dacide amin
(MEANS et FEENEY, 1971), ainsi par exemple, de nombreuses protases extracellu-
laires comme la chymotrypsine ont un rsidu srine essentiel dans leur site actif qui
peut tre mis en vidence par raction avec le diisopropyl-fluoro-phosphate (DFP).
Aujourdhui cependant, grce aux dveloppements de lingnierie gntique, cette
approche a t largement supplante par la mutagense dirige qui permet de rem-
placer spcifiquement un acide amin par nimporte quel autre acide amin. De
nouvelles approches ont galement t dveloppes qui permettent lintroduction
dacides amins non-naturels dans les protines (LIU et SCHULTZ, 1999 ; CHIN
et al., 2003) et nous pouvons penser que le dveloppement commercial de ces
techniques ne devrait pas tarder, ce qui donnera encore plus de libert dans ce type
dexpriences.
TSOU (1962) a tabli les bases thoriques pour interprter les rsultats dexp-
riences de modifications chimiques, mais cet article nest pas suffisamment connu
et en pratique la logique utilise pour interprter ces expriences est souvent floue
ou inexistante. Le cas le plus simple qui puisse tre considr est celui dans lequel
172 CINTIQUE ENZYMATIQUE
unit naffecte pas lactivit des autres. En faisant ces hypothses, les enzymes
multimriques peuvent tre traits de la mme manire que les enzymes
monomriques, except que m reprsente alors le nombre de groupes essentiels par
sous-unit, mme si l, g et x sont toujours dfinis par monomre (NORRIS et
BROCKELHURST, 1976).
f 1/nessentiel
3 groupes non-essentiels nessentiel = 3
rapidement modifis
nessentiel = 2
nessentiel = 1
1
0,5
13 groupes
modifis
0
0 3 6 9 12 15
Nombres de groupes modifis
5.18 - Le graphique de TSOU pour la dtermination du nombre
de groupes essentiels dans un enzyme
Le graphique prsente les donnes de PATERSON et KNOWLES (1972) pour linactivation de la
pepsine par le trimethyloxonium fluoroborate, un ractif qui ragit spcifiquement avec les
groupes carboxyliques. La variable F reprsente la fraction de lactivit persistant aprs la
modification du nombre de groupes montrs, et est augmente une puissance 1/m, o
m = 1, 2 ou 3. La droite observe avec m = 2 indique quau moins 2 groupes carboxyliques
sont essentiels pour lactivit de la pepsine, parmi un total de 13 groupes modifis. La
droite horizontale au dbut du graphique indique quil y a trois groupes ragissant
rapidement qui ne sont pas ncessaires pour lactivit catalytique.
Les groupes importants du site actif peuvent galement tre mis en vidence dans
des expriences de protection par un substrat ou par un inhibiteur comptitif. En
effet, en prsence dun substrat ou dun inhibiteur comptitif une concentration
suffisamment leve pour que lenzyme existe essentiellement sous la forme de
complexe enzyme-substrat ou enzyme-inhibiteur, les rsidus du site actif sont pro-
tgs et la raction de modification par un agent chimique ne peut pas se drouler.
Dans le pass, la tentative didentification dun groupe modifi tait souvent suivie
par lhydrolyse partielle de la protine et le squenage du fragment peptidique
contenant le rsidu modifi, dans lespoir dobtenir des informations sur la
structure du site catalytique. Les techniques modernes dingnierie gntique ont
174 CINTIQUE ENZYMATIQUE
PROBLMES
5.1 - Les paramtres pour linactivation la plus rapide mesure dans les
expriences de KITZ et WILSON (1962) taient k2 = 5 103 s1 , Ki = 0,1 mM,
pour le mcanisme prsent dans lquation [5.1]. En supposant que K i
peut tre exprim comme ( k 1 + k 2 ) k1 , quelle grandeur devrait avoir k2
pour que cette expression soit suffisamment diffrente de la constante
dquilibre ( k 1 k1 ) suppos par KITZ et WILSON ? Quelle lumire est
apporte par le fait que les constantes de vitesse de second ordre pour la
fixation spcifique de petites molcules sur des protines ont typique-
ment des valeurs de lordre de 106 M1 s1 ou suprieures ?
5.2 - Les tudes initiales dune estrase utilisant un mlange racmique du
substrat ont rvl que lnantiomre L est le rel substrat, puisquil tait
entirement converti en produit alors que lnantiomre D pouvait tre
rcupr la fin de la raction. Sur la base de ce rsultat, les cintiques
de ractions ont t analyses en supposant que lnantiomre D na
aucun effet sur lenzyme, et une valeur de 2 mM a t estime pour la
constante de MICHAELIS de lnantiomre L. La suite du travail a tabli
quil aurait t plus raisonnable de considrer lnantiomre D comme
un inhibiteur comptitif avec K ic gal au K m pour lnantiomre L.
Comment lestimation originale de K m peut-elle tre rvise pour tenir
compte de cette information ?
5.3 - Les donnes suivantes montrent que les vitesses initiales (exprimes en
units arbitraires) mesures pour une raction catalyse par un enzyme
diffrentes concentrations respectivement dinhibiteur, [ I ] , et de
substrat, [ A ] .
[ I ] (mM) [ A ] = 1 mM [ A ] = 2 mM [ A ] = 3 mM
0 2,36 3,90 5,30
1 1,99 3,35 4,40
2 1,75 2,96 3,98
3 1,60 2,66 3,58
4 1,37 2,35 3,33
5 INHIBITION ET ACTIVATION DES ENZYMES 175
g a g a g a
0,0 1,000 23,0 0,957 27,0 0,547
2,0 1,000 24,0 0,896 27,5 0,442
4,0 1,000 25,0 0,853 28,0 0,353
18,0 1,000 25,5 0,799 28,5 0,198
20,0 1,000 26,0 0,694 29,5 0,104
22,0 0,982 26,5 0,597 30,0 0,011
5.5 - Les symboles Kis et Kii sont parfois utiliss pour reprsenter les constantes
dinhibition qui sont symbolises dans ce chapitre respectivement par Kic
et Kiu. Dans ce cas, les seconds indices s et i font respectivement rfrence
la pente (slope en anglais) et lintersection avec laxe (intercept en
anglais) puisque leur valeur sont obtenues en portant en graphique les
pentes ou les ordonnes lorigine obtenues dans lun des graphiques
dcrits dans le 3.5 en fonction de la concentration dinhibiteur.
a - A quel graphique primaire ceci fait-il rfrence ?
b - Quelle intersection (avec laxe des abscisses ou celui des ordonnes)
doit tre utilise ?
c - Sous quelle forme la constante dinhibition apparat-elle dans le
graphique secondaire ?
5.6 - Le potage traditionnel japonais Katsuobushi doit sont parfum caractris-
tique lacide 5-inosinique, un produit de dgradation de lARN qui
rsulte de la fermentation dun poisson par un champignon. Les tudes
dune nuclase provenant dune espce dAspergillus (ITO, MATSUURA et
MINAMIURA, 1994) ont fourni les paramtres cintiques suivants pour
lhydrolyse de diffrents monophosphates de dinuclotide :
176 CINTIQUE ENZYMATIQUE
6.1. INTRODUCTION
Des ractions plus complexes ont galement t identifies dans lesquelles quatre
ou cinq substrats peuvent tre impliqus, mais celles-ci peuvent tre la plupart du
temps tudies en gnralisant les principes tablis pour les ractions deux
substrats et deux produits. De plus, mme pour la raction apparemment simple de
l'quation [6.1], de nombreux mcanismes sont possibles et nous nous limiterons
au traitement de quelques cas importants plutt que de traiter exhaustivement ce
problme. Un traitement exhaustif des mcanismes enzymatiques plusieurs
substrats est impensable cause de l'invraisemblable multiplicit des cas rencontrs
dans la nature, mais il est galement inutile puisque le lecteur qui aura acquis les
mthodes de base permettant de traiter les cas simples pourra aisment les adapter
au mcanisme spcifique qu'il tudie.
Un grand nombre de ractions deux substrats et deux produits sont des ractions de
transfert de groupes et pour discuter des mcanismes possibles de cette raction, il est
prfrable de reprsenter la raction de faon plus explicite que dans l'quation [6.1] :
GX + Y X + GY [6.2]
Ainsi, en remplaant A par GX et B par Y, il apparat clairement que la raction
correspond au transfert du groupe G d'un donneur, GX, vers un accepteur, Y. Dans
la majorit des cas, la ncessit de satisfaire la valence des atomes implique qu'un
autre groupe soit transfr simultanment dans la direction oppose ; par exemple,
lorsque l'hexokinase catalyse le transfert d'un groupe phosphate de l'ATP vers le
glucose, un proton est transfr en sens inverse pour tre directement libr dans la
solution. Gnralement, ce second transfert n'est pas explicitement indiqu dans
l'quation reprsentant la raction. Le formalisme utilis dans l'quation [6.2] a t
introduit par WONG et HANES (1962) dans un article important qui a tabli les
fondements de la classification moderne des mcanismes cintiques. Bien que ce
formalisme soit plus commode pour dcrire les mcanismes, l'criture des ractions
peut devenir trs complexe et, dans la suite de ce manuel, nous continuerons de
reprsenter les substrats et les produits par une seule lettre.
En 1962, WONG et HANES ont montr que tous les mcanismes des ractions de
transfert pouvaient tre considrs comme des cas particuliers d'un mcanisme
gnral. Nanmoins, les enzymes qui ncessitent un mcanisme complet semblent
tre trs rares et, dans les quelques cas o cette situation t rencontre, comme
pour la pyruvate dcarboxylase, il est possible que les donnes aient t mal inter-
prtes (voir WARREN et TIPTON, 1974). En consquence, nous discuterons les
trois mcanismes les plus simples de transfert de groupe comme des cas spars.
6 RACTIONS PLUSIEURS SUBSTRATS 181
La division principale est faire entre les mcanismes qui impliquent la formation
d'un complexe ternaire, EGXY, ainsi dnomm parce qu'il rassemble l'enzyme et
les deux substrats en un seul complexe, et ceux qui procdent en passant par une
forme substitue de l'enzyme, EG, qui est constitue par l'enzyme et le groupe
transfrer mais aucun des substrats complets. Les premiers chercheurs, comme
WOOLF (1929, 1931) et HALDANE (1930) ont suppos que la raction passait par
un complexe ternaire, et que ce dernier pouvait se former partir de l'un ou l'autre
des complexes binaires EGX et EY. En d'autres termes, les substrats peuvent se lier
l'enzyme dans un ordre alatoire, comme illustr dans la figure 6.1. L'quation
d'tat stationnaire pour ce mcanisme est complexe, et inclut des termes en [ GX ] 2
et [ Y ] , mais GULBINSKY et CLELAND (1968) ont montr que la contribution de
ces termes dans la dfinition de la vitesse est souvent si faible que l'quation de
vitesse exprimentale ne peut tre distingue de celle drive en faisant l'hypothse
que toutes les tapes du mcanisme sont l'quilibre l'exception de la raction de
conversion de EXG-Y en EX-GY. Si cette hypothse est utilise, aucun terme de
concentration n'apparat au carr dans l'quation de vitesse. Par souci de simplicit,
nous adopterons cette hypothse de l'existence d'quilibres rapides pour discuter le
mcanisme de cette raction, bien qu'il soit important de souligner que cette
hypothse est habituellement incorrecte, mme si les observations exprimentales
ne permettent en gnral pas de la rfuter. L'tape de conversion entre EXG-Y et
EX-GY ne peut pas tre dtecte par des mesures l'tat stationnaire, mais il est
logique de la faire apparatre explicitement dans un mcanisme alatoire parce que,
dans la drivation de l'quation de vitesse, cette tape est traite comme l'tape
limitante.
EXG EGY
GX Y X GY
E EXG-Y EX-GY E
GX Complexes ternaires productifs
GY X
Y
EY Complexe ternaire EX
non-productif
X EXY Y
EXG
GX Y
E EXG-Y EX-GY E
Complexes ternaires productifs
GY
X
Complexe ternaire EX
non-productif
EXY Y
E-GX EG-X
X
EX GX X
Complexes binaires
non-productifs E EG
GY Y
EY Y
E-GY EG-Y
X Y X:
Y:
Y + EGX EGY + X
a - Raction dplacement unique : une seule inversion de configuration
X X:
B: B
E + GX EG + X
Y
B: B
:Y
E + GY EG + Y
b - Raction double dplacement : deux inversions de configuration
6.4 - Aspects strochimiques de la raction de transfert de groupe
Normalement chaque substitution entrane l'inversion de la configuration, et donc un
double dplacement se traduit par la restauration de la configuration originale : exprimen-
talement cela se traduit par la conservation de la configuration.
qu'aprs que le second substrat se soit fix mme si l'enzyme suit un mcanisme
enzyme modifi. Bien que ce genre de mcanisme semble improbable avec une
raction du type de celle catalyse par une transaminase telle qu'elle est montre
dans l'quation [6.3], o les quatre ractifs sont tellement similaires que l'on
s'attend ce qu'ils se fixent tous sur le mme site, il est moins facile de l'exclure
quand le groupe transfr est volumineux et que les quatre ractifs sont fortement
diffrents les uns des autres.
Bien que l'opration d'un mcanisme enzyme modifi puisse gnralement tre
dmontre par des arguments positifs, comme par l'isolement d'un intermdiaire o
l'enzyme est substitu (une procdure qui est facilement ralisable avec une trans-
aminase), l'opration d'un mcanisme impliquant un complexe ternaire est gnrale-
ment dduite partir d'arguments ngatifs, comme l'impossibilit d'isoler un com-
plexe o l'enzyme est substitu. SPECTOR (1982) suggre que cette conclusion est
toujours vraie (et pas seulement courante). Comme not ci-dessus, il fait remarquer
que les arguments strochimiques pour l'existence d'un mcanisme complexe
ternaire peuvent s'expliquer par un mcanisme impliquant un triple-dplacement, et
il considre comme nave la conclusion selon laquelle un mcanisme impliquant un
seul dplacement est plus simple que celle en impliquant trois ou cinq. De nom-
breuses tches, dans la vie de tous les jours, sont simplifies en les divisant en plu-
sieurs tapes et il est probable que cet argument s'applique galement la chimie
des enzymes (cela est certainement vrai pour les ractions mtaboliques, ou des
ractions difficiles comme le couplage de l'oxydation du palmitate avec la synthse
d'ATP, sont toujours dcomposes en une squence de ractions plus simples).
Conceptuellement, et chimiquement, le problme rencontr avec le mcanisme
complexe ternaire est que l'enzyme n'est pas qu'un simple spectateur. Dans la
figure 6.2, il a au minimum un travail de changement de conformation raliser,
alors que dans le mcanisme de la figure 6.1, l'enzyme ne fait rien de plus que
d'apporter quelques encouragements moraux aux ractifs. Inversement, dans un
mcanisme enzyme modifi (figure 6.3), l'enzyme apparat comme un participant
essentiel dans chaque tape de la raction et, sans l'enzyme, la raction ne serait pas
possible. Il serait erron de penser que la thse de SPECTOR a t gnralement
accepte ; en ralit elle a t reue essentiellement avec indiffrence et mme avec
hostilit. Cependant, nous n'avons pas connaissance de l'existence d'une analyse
srieuse de ses propositions qui justifierait de les carter, et nous pensons qu'elles
doivent recevoir plus d'attention qu'elles n'en ont eu jusqu' prsent. Bien
videmment, il n'est pas possible de rsumer un livre entier en quelques lignes et sa
discussion est bien plus dtaille que nous n'avons pu le mentionner ici.
A B P Q
k1 k1 k2 k2 k4 k4 k5 k5
k3
E E
EA EAB k3 EPQ EQ
a - Mcanisme squentiel ( complexe ternaire)
ordonn dans des conditions d'tat stationnaire
A B P Q
k1 k1 k2 k2 k6 k6 k7 k7
EA k5 EP
E E
EAB k5 EPQ
EB EQ
k3 k3 k4 k4 k8 k8 k9 k9
B A Q P
b - Mcanisme squentiel ( complexe ternaire)
alatoire dans des conditions d'tat stationnaire
A P B Q
k1 k1 k3 k3 k4 k4 k6 k6
k2 k5
E E
EA k2 FP F FB k5 EQ
c - Mcanisme ping-pong ( enzyme modifi) dans des conditions d'tat stationnaire
6.5 - Reprsentation schmatique des mcanismes enzymatiques selon CLELAND
6 RACTIONS PLUSIEURS SUBSTRATS 189
6.3.1. Introduction
En principe, quel que soit le mcanisme, l'quation de vitesse dans des conditions
d'tat stationnaire peut tre drive de la mme manire que pour le mcanisme
deux tapes de MICHAELIS et MENTEN. En pratique cette mthode peut devenir
extrmement fastidieuse et, sauf pour les mcanismes les plus simples, est sus-
ceptible de conduire des erreurs. KING et ALTMAN (1956) ont dcrit une mthode
schmatique, simple et s'appliquant n'importe quel mcanisme, qui consiste en
une srie de ractions entre diffrentes formes d'un enzyme. Elle n'est par contre
applicable ni aux ractions non-enzymatiques, ni aux mlanges d'enzymes, ni aux
mcanismes qui renferment des tapes non-enzymatiques. Nanmoins, elle est
applicable la majorit des situations rencontres dans la catalyse enzymatique et
est trs utile dans la pratique. Nous dcrivons et discutons brivement cette
mthode dans les paragraphes suivants.
La thorie sur laquelle repose la mthode de KING et ALTMAN, est beaucoup plus
complexe que son application pratique et puisqu'il n'est pas ncessaire de com-
prendre la thorie pour l'appliquer, nous nous contenterons ici de donner une
description de l'utilisation de cette mthode et nous renvoyons les lecteurs qui
seraient intresss par la thorie d'autres ouvrages (ENGEL, 1981).
k1
E + A EA
k 1
k2
EA + B EAB
k 2
k3
EPQ EQ + P
k 3
k4
EQ E + Q
k 4
Aucune constante de vitesse n'est indique pour la troisime raction parce que
nous supposons que la vitesse de conversion de EAB en EPQ est suprieure celle
des tapes de fixation. Cette simplification entrane que les mesures l'tat station-
naire ne fournissent aucune information sur les isomrisations entre intermdiaires
qui sont uniquement des ractions de premier ordre. Pour analyser l'quation d'tat
stationnaire, il est ds lors, ncessaire de traiter EAB et EPQ comme une seule et
mme espce, mme s'il peut s'avrer plus instructif en regard du mcanisme de les
considrer comme des espces distinctes.
La premire tape de la mthode de KING et ALTMAN consiste incorporer le
mcanisme dans un schma circulaire qui renferme l'ensemble des espces de
l'enzyme et qui indique les ractions entre ces espces, comme prsent dans la
figure 6.6a pour notre exemple de mcanisme ordonn complexe ternaire. Toutes
les ractions doivent tre traites comme des ractions de premier ordre, ce qui
signifie que les ractions de second ordre, comme la raction E + A EA,
doivent tre caractrises par des constantes de pseudo-premier ordre ; ainsi dans
notre exemple, la constante de second ordre k1 est remplace par la constante de
pseudo-premier ordre k1 [ A ] en incluant la concentration de A.
Dans une deuxime tape, un profil central (figure 6.6b) est dessin qui correspond
l'ossature du schma ractionnel, dans ce cas il s'agit d'un carr. Il est alors
ncessaire d'identifier l'ensemble des profils qui
sont constitus de lignes appartenant au profil central uniquement,
connectent chaque paire de formes de l'enzyme et
ne contiennent aucune boucle ferme.
Chacun de ces profils renferme une ligne de moins que le nombre de formes de
l'enzyme ; dans l'exemple choisi, il existe quatre profils de ce type qui sont
reprsents dans la figure 6.6c.
6 RACTIONS PLUSIEURS SUBSTRATS 191
k1[A]
E+A EA
k1
k4 k4[Q] k2 k2[B]
k3[P] EAB
EQ
k3 EPQ
a - Schma circulaire de la raction b - Profil central driv du schma
d - Exemples de profils qui ne satisfont pas les rgles exposes dans le texte
k1 k1 k1
k2 k4 k2 k4 k4 k2[B]
k3[P] k3 k3
e - Profils avec addition de flches de sorte que chacun se termine en E
et prcisant les constantes de vitesse
6.6 - La mthode de KING et ALTMAN pour driver les quations de vitesse
Chacun de ces profils orients correspond au produit des constantes de vitesse prsent
en dessous.
Dans cet exemple, l'application de ces rgles semble vidente, mais la situation
peut tre diffrente avec des mcanismes plus complexes et pour viter tout
malentendu il peut s'avrer utile de considrer trois profils errons, qui satisfont
uniquement deux rgles sur trois. Ces profils sont prsents dans la figure 6.6d.
Pour chaque forme de l'enzyme, des flches sont traces sur les lignes des profils
acceptables, de telle sorte que chaque profil conduit la forme considre de
l'enzyme sans considration pour l'endroit du schma o nous commenons. Ainsi,
pour la forme libre de l'enzyme E, les quatre profils de la figure 6.6c sont repr-
sents comme dans la figure 6.6e. Chaque profil est alors interprt comme un
produit de constantes de vitesse spcifies par les flches par rfrence au
192 CINTIQUE ENZYMATIQUE
mcanisme complet de la figure 6.6a, et l'ensemble des quatre profils est interprt
comme la somme de quatre produits de ce type. Par exemple, dans la figure 6.6e, le
premier profil donne le terme : k 1k 2 k 3 [ P ] , et l'ensemble complet des profils
conduisant E donne le terme : ( k 1k 2 k 3 [ P ] + k 1k 2 k 4 + k 1k3k 4 + k 2 k3k 4 [ B ]) .
Cette somme devient alors le numrateur d'une expression qui reprsente la
fraction de la concentration totale d'enzyme [ E ]0 qui existe sous la forme E
l'tat stationnaire :
[E] ( k 1k 2 k 3 [ P ] + k 1k 2 k 4 + k 1k3k 4 + k 2 k3k 4 [ B ])
= [6.5]
[ E ]0 D
En procdant exactement de la mme manire pour les trois autres formes de
l'enzyme, nous obtenons trois fractions supplmentaires :
[ EA ]
=
(k1k 2k 3 [ A ][ P ] + k1k 2k 4 [ A ] + k1k3k 4 [ A ] + k 2k 3k 4 [ P ][ Q ] ) [6.6]
[ E ]0 D
k1k 2 k 3 [ A ][ B ][ P ] + k1k 2 k 4 [ A ][ B ]
[ EAB ] + [ EPQ ] + k k k
1 3 4 [ P ][ Q ] + k k k
2 3 4 [ B ][ P ][ Q ]
= [6.7]
[ E ]0 D
[ EQ ]
=
(k1k 2k3 [ A ][ B ] + k 1k 2k 4 [ Q ] + k 1k3k 4 [ Q ] + k 2k3k 4 [ B ][ Q ] ) [6.8]
[ E ]0 D
Puisque ces quatre formes sont les quatre seules formes de l'enzyme, la somme de
ces quatre fractions doit tre gale 1, ce qui signifie que le dnominateur D dans
chacune des fractions doit tre la somme des numrateurs, c'est--dire la somme
des 16 produits obtenus partir des profils.
La vitesse de la raction est alors donne par (la somme des vitesses des tapes qui
gnrent un produit particulier) moins (la somme des vitesses des tapes qui
consomment le mme produit). Dans notre exemple, il existe une seule tape qui
gnre le produit P, (EAB + EPQ) EQ + P, et une seule tape qui consomme
P, EQ + P (EAB + EPQ), et donc :
d[ P ]
v =
dt
= k3 ( [ EAB ] + [ EPQ ] ) k 3 [ EQ ][ P ]
k1k 2 k3k 3 [ A ][ B ][ P ] + k1k 2 k3k 4 [ A ][ B ]
+ k 1k 3k3k 4 [ P ][ Q ] + k 2 k 3k3k 4 [ B ][ P ][ Q ]
[ E ]0
k k k k [ A ][ B ][ P ] k 1k 2 k 3k 4 [ P ][ Q ]
1 2 3 3
k 1k 3k3k 4 [ P ][ Q ] k 2 k 3k3k 4 [ B ][ P ][ Q ]
=
D
=
(k1k 2k3k 4 [ E ]0 [ A ][ B ] k 1k 2k 3k 4 [ E ]0 [ P ][ Q ] ) [6.9]
D
6 RACTIONS PLUSIEURS SUBSTRATS 193
Dans la plupart des cas, il est plus important de connatre la forme de l'quation de
vitesse dans des conditions d'tat stationnaire que de connatre son expression
dtaille en termes de constantes individuelles de vitesse. Il est donc commode
d'exprimer l'quation de vitesse sous la forme de coefficients qui permettent de
prdire directement les proprits exprimentales d'un mcanisme donn. Dans
notre exemple, l'quation de vitesse peut tre crite de manire simplifie :
[ E ]0 ( N1 [ A ][ B ] N 1 [ P ][ Q ])
v = [6.10]
D0 + D1 [ A ] + D2 [ B ] + D3 [ P ] + D4 [ Q ] + D5 [ A ][ B ] + D6 [ A ][ P ]
+ D7 [ B ][ Q ] + D8 [ P ][ Q ] + D9 [ A ][ B ][ P ] + D10 [ B ][ P ][ Q ]
o les coefficients prennent les valeurs suivantes :
N1 = k1k 2 k3k 4 ; N 1 = k 1k 2 k 3k 4 ; D0 = k 1( k 2 + k3 )k 4 ; D1 = k1( k 2 + k3 )k 4 ;
D2 = k 2 k3k 4 ; D3 = k 1k 2 k 3 ; D4 = k 1( k 2 + k3 )k 4 ; D5 = k1k 2 ( k3 + k 4 ) ;
D6 = k1k 2 k 3 ; D7 = k 2 k3k 4 ; D8 = ( k 1 + k 2 )k 3k 4 ; D9 = k1k 2 k 3 ; D10 = k 2 k 3k 4 .
k1[A] k1
Cette proprit a t gnralise par WONG et HANES (1962) sous la forme d'une
rgle structurale pour le numrateur de l'quation de vitesse. Initialement, le profil
194 CINTIQUE ENZYMATIQUE
La mthode de KING et ALTMAN comme nous l'avons dcrite est utile et facile
appliquer n'importe lequel des mcanismes les plus simples. Cependant, les
mcanismes complexes ncessitent souvent d'identifier un grand nombre de profils.
La drivation est alors trs laborieuse et susceptible de gnrer des erreurs, et nous
pouvons aisment interprter incorrectement un profil ou crire des termes incor-
rects. Bien qu'en principe, il soit possible de calculer le nombre total de profils
(KING et ALTMAN, 1956 ; CHOU et al., 1979), cette procdure est laborieuse, sauf
pour les mcanismes simples, parce que des corrections sont ncessaires pour tous
les cycles du mcanisme. De plus, connatre le nombre de profils attendus peut
s'avrer sans utilit pour les trouver et ne diminue en rien la quantit de travail
ncessaire pour crire ces termes. En gnral, il est prfrable, pour les
mcanismes complexes, de chercher simplifier la procdure. VOLKENSTEIN et
GOLDSTEIN (1966) ont tabli certaines rgles pour raliser cela, dont les plus
simples sont nonces ci-dessous :
1. Si deux ou plusieurs tapes impliquent la conversion de la mme paire de formes
de l'enzyme, ces tapes peuvent tre condenses en une seule en additionnant les
constantes de vitesse pour les tapes parallles. Par exemple, si le mcanisme de
MICHAELIS et MENTEN est reprsent selon le schma de KING et ALTMAN
(figure 6.8a), uniquement deux profils doivent tre considrs, et
. Puisque ces deux ractions connectent la mme paire de formes de
l'enzyme, celles-ci peuvent tre additionnes comme dans la figure 6.8b. Le
6 RACTIONS PLUSIEURS SUBSTRATS 195
profil central qui rsulte, devient le seul profil reprsentant le mcanisme et ainsi
les expressions pour [ E ] et [ EA ] peuvent tre drives immdiatement :
[E] k 1 + k 2
= [6.11]
[ E ]0 k 1 + k 2 + k1 [ A ] + k 2 [ P ]
[ EA ] k1 [ A ] + k 2 [ P ]
= [6.12]
[ E ]0 k 1 + k 2 + k1 [ A ] + k 2 [ P ]
k1[A]
6.8 - Collapsus d'une paire d'tapes k1 k1[A] + k2[P]
parallles (a) connectant la mme E EA E EA
paire de formes de l'enzyme en addi- k2[P] k1 + k2
tionnant les constantes de vitesse k2
pour donner une seule tape (b) a b
k1[A] 2 k1[A]
E EA E EA
k1 k1
k3[A]
EA EAA EA2
k3
b - Prise en compte de la symtrie
k4
2 k1[A] k3[A]
a - Mcanisme complet E EA EA2
k1 + k2 2 (k3 + k4)
c - Addition d'tapes parallles
6.9 - Simplification d'un modle complexe en utilisant les facteurs
statistiques pour remplacer des tapes identiques
Le mcanisme prsent en (a) est symtrique par rapport la ligne en pointills et
possde exactement les mmes proprits l'tat stationnaire que le mcanisme plus
simple prsent en (b).
196 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Les facteurs statistiques apparaissent toujours quel que soit l'avantage qui puisse
tre tir de la symtrie du profil central. Dans cet exemple, la raction E EA
peut se drouler de deux manires diffrentes, et donc la vitesse totale est la
somme de deux vitesses, donnant une constante de vitesse 2 k1 [ A ] qui corres-
pond au double de la constante de vitesse sur chacun des deux chemins indi-
viduels. La raction inverse EA E + A, d'un autre ct, peut se drouler
d'une seule manire et se caractrise par un facteur statistique de 1. Ainsi, sa
constante de vitesse reste k 1 .
3. Si le profil central consiste en deux ou plusieurs parties distinctes en contact au
niveau d'une seule forme de l'enzyme, il est commode de traiter sparment
chacune des parties. Un exemple simple de cette approche est fourni dans le cas
de substrats comptitifs (figure 6.10), dans lequel un seul enzyme catalyse
simultanment deux ractions distinctes avec des substrats diffrents.
EA' EA
k'1 k1[A]
6.10 - Mcanisme dans lequel
k'1[A'] k1
deux parties indpendantes
k'2 k'2 E k2 k2 sont connectes entre elles
k'3 k3[P] par l'intermdiaire d'une forme
k'3[P'] k3 unique de l'enzyme (dans ce
EP' EP cas, il s'agit de la forme E)
Dans ce cas, les expressions pour chacune des formes de l'enzyme sont le produit
des sommes correspondant aux moitis gauche et droite du profil central :
[E] ( k'1k'2 + k'1k'3 + k'2 k'3 )( k 1k 2 + k 1k3 + k 2 k3 )
= [6.14]
[ E ]0 D
[ EA ] ( k'1k'2 + k'1k'3 + k'2 k'3 )( k1k 2 [ A ] + k1k3 [ A ] + k 2 k 3 [ P ])
= [6.15]
[ E ]0 D
[ EP ] ( k'1k'2 + k'1k3' + k'2 k3' )( k1k 2 [ A ] + k 1k 3 [ P ] + k 2 k 3 [ P ])
= [6.16]
[ E ]0 D
[ EA' ] ( k1' k'2 [ A' ] + k1' k3' [ A' ] + k'2 k'3 [ P' ])( k 1k 2 + k 1k3 + k 2 k3 )
= [6.17]
[ E ]0 D
[ EP' ] ( k1' k'2 [ A' ] + k'1k'3 [ A' ] + k'2 k'3 [ P' ])( k 1k 2 + k 1k3 + k 2 k3 )
= [6.18]
[ E ]0 D
6 RACTIONS PLUSIEURS SUBSTRATS 197
Certains mcanismes sont assez importants pour justifier une analyse dtaille,
mais ils sont parfois tellement complexes que, mme en utilisant les mthodes
dcrites ci-dessus, ils gnrent des quations de vitesse trop compliques pour tre
manipules. Dans de tels cas, certaines simplifications doivent tre envisages et
des simplifications importantes peuvent souvent tre obtenues si certaines tapes,
telles les tapes de fixation de protons, sont supposes l'quilibre dans les con-
ditions d'tat stationnaire. Ces suppositions peuvent bien sr se rvler fausses lors
d'tudes plus approfondies, mais elles sont trs utiles en premire approximation.
CHA (1968) a dcrit une mthode pour l'analyse des mcanismes renfermant des
tapes l'quilibre qui est beaucoup plus simple que la mthode de KING et
ALTMAN parce que chaque groupe de formes de l'enzyme en quilibre peut tre
trait comme une seule espce. Par exemple, considrons le mcanisme de la
figure 6.11, pour un enzyme dans lequel la forme non-protonne E0 et la forme
protonne HE+ sont catalytiquement actives mais se caractrisent par des
constantes cintiques diffrentes (dans le traitement habituel de l'influence du pH
sur le comportement des enzymes que nous traiterons au chapitre 9, nous
supposerons qu'un seul tat de protonation de l'enzyme est actif, mais ici nous
supposons que EA0 et HEA+ peuvent ragir pour donner des produits sinon notre
exemple est trivial et ne peut tre utilis pour illustrer la mthode de CHA). Si
l'quilibre entre E0 et HE+ est maintenu au cours de l'tat stationnaire, les fractions
KE [H+]
des formes E0 et HE+ sont donnes respectivement par et
KE + [ H + ] KE + [ H + ]
de la forme composite E de l'enzyme, o [ H + ] reprsente la concentration d'ion
hydrogne et KE est la constante de dissociation de la fonction protonable sur la
forme libre de l'enzyme. La vitesse de fixation de A sur E0, qui est donne par
k [ E ][ A ] KE
k1 [ E 0 ][ A ] , peut alors s'crire sous la forme 1 et la fixation de A
KE + [ H + ]
k1' [ E ][ A ][ H + ]
sur EH+ peut de manire similaire s'crire ; la vitesse totale de
KE + [ H + ]
198 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Etapes l'quilibre
KE KEA KE
k1 k2
A + E0 EA0 E0 + P
+ k1 + +
H+ H+ H+
6.11 - Traitement des tapes l'quilibre
Si les tapes de fixation de protons (tapes verticales dans l'exemple donn) sont traites
comme des quilibres, le mcanisme peut tre simplifi en traitant les groupes de formes
d'enzyme l'quilibre comme des espces uniques.
Tout ceci semble compliquer l'analyse plutt que de la simplifier, mais la rsultante
est que le mcanisme original qui aurait ncessit l'emploi de la mthode de KING
et ALTMAN a t remplac par un mcanisme plus simple pour lequel nous
connaissons dj la solution, c'est--dire le mcanisme de MICHAELIS et MENTEN,
bien que les expressions pour les constantes de vitesse soient exceptionnellement
complexes. L'quation de vitesse peut donc tre crite immdiatement, en
k K + k1' [ H + ]
remplaant k1 dans l'quation [3.34] par 1 E et en procdant de la
KE + [ H + ]
mme manire pour k1 et k2.
La mthode de CHA est applicable tout mcanisme qui contient des tapes
l'quilibre. En gnral, n'importe quel nombre de formes d'enzyme en quilibre les
unes avec les autres peut tre trait comme une espce unique, et chaque constante
de vitesse ki pour un composant constitue un terme ki fi dans la somme donnant la
constante de vitesse pour l'espce composite, o fi reprsente la fraction du compo-
sant dans le mlange l'quilibre. Bien que la validit de cette mthode ait t mise
en question (SEGEL et MARTIN, 1988), TOPHAN et BROCKELHURST (1992) ont
dmontr que les objections mises n'taient pas fondes. L'analyse de ces auteurs
6 RACTIONS PLUSIEURS SUBSTRATS 199
a plus d'un intrt, puisque, comme ils le font remarquer, d'autres auteurs ont
commis des erreurs similaires et qu'il est important de comprendre comment les
viter. Le point essentiel est que ds qu'une srie de ractions forme des cycles, il
est ncessaire de tenir compte de toutes les routes parallles qui connectent chaque
paire d'espces dans le mcanisme. Plus gnralement, quelle que soit la constante
de vitesse suppose pour une des tapes du mcanisme, il est essentiel que le
produit de tous les rapports de constantes de vitesse directe et inverse pour les
tapes connectant une paire d'espces doivent correspondre la constante
d'quilibre pour le processus net. Il devrait tre superflu d'ajouter que cette
constante d'quilibre doit tre la mme pour chaque voie parallle correspondant
la mme raction. Il s'ensuit qu'un cycle qui ne produit aucun changement net, tel
que le cycle E0 HE+ HEA+ EA0 E0 dans la figure 6.11 doit
avoir une constante nette d'quilibre gale 1. Le dfaut de comprhension de ce
principe a produit quelques ides fausses concernant la manire dont la
cooprativit cintique peut apparatre avec un enzyme monomrique avant qu'un
modle valable, que nous dcrirons dans le 9.5, ne soit dvelopp.
Une mise en garde doit toutefois tre faite au sujet de l'utilisation de la mthode de
CHA dans le cas de mcanismes qui renferment des chemins parallles de fixation,
tels que les mcanismes dans lesquels deux substrats, A et B, peuvent se fixer dans
n'importe quel ordre pour former le complexe ternaire EAB. Puisque l'quation de
vitesse pour un tel mcanisme est souvent trop complique pour tre manipule
aisment, la pratique courante consiste utiliser des quations drives en suppo-
sant que les tapes de fixation sont l'quilibre. D'un point de vue mcanique, il
n'existe pas plus de fondement cette hypothse qu'il n'en existe pour les
mcanismes un seul substrat ( 3.3.2) mais les quations rsultantes sont souvent
en accord avec l'exprience. Le problme provient du fait que les termes addition-
nels prsents dans la forme rigoureuse de l'quation de vitesse l'tat stationnaire
peuvent tre numriquement trs petits ou qu'ils peuvent varier en proportion avec
d'autres termes, si bien qu'ils sont quasiment impossibles dtecter comme l'ont
discut GULBINSKY et CLELAND (1968) dans leur tude de la galactokinase. Il
s'agit d'un point d'importance gnrale pour l'application correcte de l'analyse
cintique : plus d'un ensemble d'hypothses peut conduire la mme quation de
vitesse ou une famille d'quations de vitesse qui ne sont pas distinguables
exprimentalement ; il n'est donc pas possible d'utiliser la concordance des rsultats
exprimentaux avec une quation de vitesse comme critre pour valider les
hypothses utilises pour driver cette quation.
Raisonnement topologique
Il est possible de penser en ralit, cela est tellement vident qu'il semble inutile
de le mentionner que le rle essentiel de la mthode de KING et ALTMAN dans
200 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Etape en cul-de-sac
k5 k3[P] EAB
6.12 - Mcanisme avec EBQ EQ EPQ
k5[B] k3
un complexe en cul-de-sac
Une simple rflexion montre que la conclusion n'est pas particulire au mcanisme
considr, mais qu'elle s'applique n'importe quel mcanisme qui renferme des
tapes en cul-de-sac, mme si celles-ci forment une srie, c'est--dire mme si plu-
sieurs tapes sont ncessaires pour connecter le complexe en cul-de-sac au reste du
mcanisme : dans un mcanisme donn, les ractions en cul-de-sac sont
l'quilibre dans les conditions d'tat stationnaire. Nous pouvons comprendre en
terme de mcanisme (c'est--dire sans avoir recours l'algbre) pourquoi cette
conclusion s'applique, en prenant conscience que la raison pour laquelle les
ractions ordinaires l'tat stationnaire ne sont pas l'quilibre rside dans le fait
que le flux de ractifs est un processus de dsquilibre perptuel : l'apport constant
202 CINTIQUE ENZYMATIQUE
E EA (EAB + EPQ) EQ
E Aucun k1 [ A ] Aucun k 4 [ Q ]
EA k 1 Aucun k2 [ B ] Aucun
(EAB + EPQ) Aucun k 2 Aucun k3
EQ k4 Aucun k 3 [ P ] Aucun
E? Cyclique ?
k 1 k 2 k 4 Oui Non
k 1 k 2 k 3 [ P ] Oui Non
k 1 k3 k 4 Oui Non
k 1 k3 k 3 [ P ] Oui Oui
k 2 [ B ] k 2 k 4 Oui Oui
k 2 [ B ] k 2 k 3 [ P ] Non Oui
k 2 [ B ] k3 k 4 Oui Non
k 2 [ B ] k3 k 3 [ P ] Non Oui
Au total, huit produits peuvent tre gnrs de cette faon, comme indiqu dans la
partie infrieure du tableau 6.1. Cependant, tous ceux-ci ne sont pas valables
puisque certains ne contiennent pas d'tape vers E et que certains sont cycliques.
En principe, il n'est pas ncessaire de vrifier si un produit renferme une tape vers
une espce cible puisque n'importe quel produit non-cyclique doit satisfaire cette
contrainte. Cependant, il est beaucoup plus facile de vrifier si le produit contient
une tape vers E que de vrifier si celle-ci est cyclique, puisqu'un produit qui
conduit E doit obligatoirement contenir au moins une constante de vitesse de la
colonne E. Il est donc prfrable d'liminer les produits qui ne renferment pas
une des constantes de vitesse de la colonne E avant de vrifier s'il n'y a pas de
produit cyclique. Dans le cas du tableau 6.1, la reconnaissance de produits
cycliques est triviale puisque le seul type de cycle possible dans ce mcanisme est
celui qui comprend la constante de vitesse caractristique de la direction directe et
de la direction inverse pour une mme tape, comme dans le terme k 1k3k 3 [ P ]
qui renferme les constantes de vitesse directe et inverse pour l'tape 3. Toutefois,
des cycles plus complexes peuvent faire partie de mcanismes plus compliqus, et
un programme devrait tre capable de les reconnatre.
204 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Conceptuellement, la manire la plus simple (mais peut tre pas la plus efficace) de
dterminer si un produit est cyclique consiste dmarrer tour tour avec chacune
des constantes de vitesse contenue dans le produit et suivre au moins n 1 tapes
jusqu' ce que l'espce cible soit atteinte. Par exemple, considrons k 2 [ B ]k3k 4 et
commenons avec k 2 [ B ] : ceci provient de la colonne (EAB + EPQ) et donc
nous devons trouver la constante de vitesse dans la ligne (EAB + EPQ) qui est
k3 ; celle-ci se situe dans la colonne EQ et donc nous cherchons la constante
de vitesse dans la ligne EQ qui est k4 ; celle-ci est dans la colonne E et
donc le processus est termin avec succs en 3 tapes (3 = n 1 dans notre
exemple). Comme les deux autres lments dans ce produit avaient t tests dans
la vrification de k 2 [ B ] , il n'est pas ncessaire de les tester nouveau. Cependant,
si nous avions dmarr avec k3 la vrification ne serait pas passe par k 2 [ B ] et il
aurait donc t ncessaire de le tester sparment.
Cette mthode de vrification pour les produits cycliques peut sembler fastidieuse
mais nous devons tre prudents et ne pas tre sduits par la possibilit de prendre
des raccourcis qui ne garantissent pas toujours l'obtention de rsultats corrects. Par
exemple, pour de nombreux mcanismes, tout produit qui renferme plusieurs fois
la mme constante de vitesse ou qui renferme la fois les constantes de vitesse
directe et inverse pour la mme tape, est cyclique. Cependant, nous ne pouvons
pas supposer que cela est toujours vrai parce que certains types de symtrie dans le
mcanisme enzymatique peuvent entraner l'apparition plusieures reprises d'une
ou de plusieurs constantes de vitesse comme par exemple dans la figure 6.9a.
Certaines des mthodes publies pour l'analyse des mcanismes par ordinateur
(pas parmi celles cites ci-dessus) n'intgrent pas les prcautions ncessaires et
fournissent des rsultats incorrects pour de tels mcanismes. Aprs limination
des produits incorrects, la somme des autres termes donne l'expression pour
[ E ] [ E ]0 , comme dans l'quation [6.5] :
[E]
=
(k 1k 2k 4 + k 1k 2k 3 [ P ] + k 1k3k 4 + k 2 [ B ]k3k 4 ) [6.19]
[ E ]0 D
La conversion de cette quation dans l'quation [6.6], c'est--dire l'expression
correspondante pour [ EA ] [ E ]0 , ncessite maintenant d'analyser chaque produit
dans la somme pour identifier le chemin de EA vers E qu'il renferme et de
retourner les constantes de vitesse pour cette partie du produit tout en laissant le
reste inchang. Dans le cas de k 1k 2 k 4 , par exemple, le chemin de EA E
ncessite juste k 1 , celui-ci est remplac par k1 [ A ] . Le produit k 2 k 4 est laiss
inchang et le produit dans sa totalit est remplac par k 1 [ A ]k 2 k 4 . En ralisant
cette opration pour chaque produit l'un aprs l'autre et ensuite pour (EAB + EPQ)
et (EQ) fournit des quations quivalentes aux quations [6.6] [6.8]. Cette
approche fournit la base d'une mthode de drivation par ordinateur quivalente
la mthode de KING et ALTMAN. Le numrateur peut tre trait en appliquant le
mme type de logique que celle comprise dans les rgles de WONG et HANES
( 6.3.3) et il est alors ais d'obtenir l'quation complte de vitesse.
6 RACTIONS PLUSIEURS SUBSTRATS 205
Les mesures cintiques dans des conditions d'tat stationnaire ont dmontr leur
incontestable valeur pour permettre de distinguer les diffrents mcanismes rac-
tionnels dans les ractions de transfert de groupe. Le dveloppement des mthodes
cintiques reprsente un travail considrable en raison du nombre de possibilits et
des diffrences minimes qui existent entre les divers mcanismes cintiques.
SEGAL, KACHMAR et BOYER (1952) ont t parmi les premiers reconnatre l'im-
portance d'une approche systmatique, et ils ont driv les quations pour plusieurs
mcanismes. Ensuite, ALBERTY (1953, 1958) et DALZIEL (1957) ont fait largement
progresser le champ des connaissances relatives aux ractions de transfert et ils ont
introduit la plupart des mthodes dcrites dans ce chapitre.
Puisque toutes les mthodes d'analyse cintique dans des conditions d'tat station-
naire qui permettent de distinguer les diffrents mcanismes reposent sur la compa-
raison des quations compltes de vitesse, nous allons commencer par introduire
brivement ces quations et la procdure suivre pour les obtenir, avant de discuter
des mthodes d'analyse proprement dites. L'quation pour un mcanisme ordonn
complexe ternaire est prsente en premier puisqu'elle a t drive dans le 6.3.2
en utilisant la mthode de KING et ALTMAN (quation [6.10]) :
[ E ]0 ( N1 [ A ][ B ] N 1 [ P ][ Q ])
v = [6.20]
D0 + D1 [ A ] + D2 [ B ] + D3 [ P ] + D4 [ Q ] + D5 [ A ][ B ] + D6 [ A ][ P ]
+ D7 [ B ][ Q ] + D8 [ P ][ Q ] + D9 [ A ][ B ][ P ] + D10 [ B ][ P ][ Q ]
Cette quation contient treize coefficients, mais ceux-ci sont dfinis partir de
huit constantes de vitesse, de sorte qu'il doit exister des relations entre les coeffi-
cients qui ne sont pas explicitent dans l'quation. De plus, les coefficients n'ont pas
de signification mcanique apparente. De nombreux systmes ont t utiliss pour
rcrire les quations de vitesse dans des termes plus significatifs ; celui que nous
utilisons dans ce manuel est celui prconis par l'IUBMB (IUB, 1982), et drive de
la classification des constantes selon trois types introduite par CLELAND (1963) :
les vitesses limites, les constantes de MICHAELIS et les constantes d'inhibition. En
gnral, une constante de MICHAELIS KmA pour un substrat A correspond au Km
dans une raction un seul substrat et une constante d'inhibition KiA est lie aux
valeurs de Kic et de Kiu obtenues quand le substrat A est utilis comme un produit se
comportant en inhibiteur de la raction inverse (mais n'est pas obligatoirement
identique l'un de ceux-ci). Dans certaines circonstances, les constantes d'inhi-
bition correspondent d'authentiques constantes de dissociation des substrats et
dans ces cas, il est possible de mettre cette caractristique en vidence en utilisant
un symbole du type KsA plutt que KiA Si les concentrations relles de l'enzyme
sont connues, les vitesses limites peuvent tre converties en constantes catalytiques
206 CINTIQUE ENZYMATIQUE
k1[A] k1[A] EA
E EA E E'P
k1 k1
k3 EAB E'B k3
EQ E'E
k3[P] EPQ EQ k3[P]
k3k 4 [ E ]0 k 2 k 4 [ E ]0
V1
k3 + k 4 k2 + k4
k 1k 2 [ E ]0 k 1k 3 [ E ]0
V1
k 1 + k 2 k 1 + k 3
k3k 4 ( k 1 + k 2 )k 4
K mA
k1( k3 + k 4 ) k1( k 2 + k 4 )
( k 2 + k3 )k 4 k 2 ( k 3 + k 4 )
K mB
k 2 ( k3 + k 4 ) ( k 2 + k 4 )k3
k 1( k 2 + k3 ) ( k 1 + k 2 )k 3
K mP
( k 1 + k 2 )k 3 ( k 1 + k 3 )k 2
k 1k 2 k 1( k 3 + k 4 )
K mQ
( k 1 + k 2 )k 4 ( k 1 + k 3 )k 4
k 1 k 1
K iA
k1 k1
k 1 + k 2 k 3
K iB
k2 k3
k 1 + k 4 k2
K iP
k1 k 2
k4 k4
KiQ
k 4 k 4
Le tableau montre les relations entre les paramtres qui apparaissent dans les quations
[6.21] et [6.23] et les constantes de vitesse pour les tapes individuelles des deux
principaux mcanismes ordonns pour les ractions de transfert de groupe. Bien que
l'quation [6.23] ne contienne pas le paramtre KiA , il peut tre obtenu partir de l'iden-
KiAKmB K K
tit suivante : = mA iB .
KiP KmQ KmP KiQ
208 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Selon cette supposition, KiA, KiB, KiP et KiQ sont respectivement les constantes de
dissociation des complexes EA, EB, EP et EQ ; KmP et KmQ sont respectivement les
constantes de dissociation pour la libration de P et de Q partir du complexe
EPQ. (Bien que KmA et KmQ n'apparaissent pas explicitement dans l'quation [6.22],
ils peuvent tre introduits puisque dans ce mcanisme A et B sont interchan-
geables, ainsi KmA K iB est identique KiA K mB et KiP K mQ est identique KmP KiQ. Ces
substitutions ne peuvent tre effectues dans l'quation [6.21] parce que le
mcanisme ordonn n'est pas symtrique vis--vis de A et de B ou vis--vis de P et
de Q, une complexit additionnelle qui explique la plus grande complexit de
l'quation [6.21]). Dans la limite des erreurs exprimentales, l'quation [6.22]
s'applique, que l'hypothse de l'quilibre rapide soit satisfaite ou non, et les
constantes de MICHAELIS ou les constantes d'inhibition ne peuvent donc pas tre
interprtes avec certitude comme des constantes de dissociation.
Bien que le tableau 6.2 montre comment les paramtres cintiques des deux mca-
nismes ordonns peuvent tre exprims en termes de constantes individuelles de
vitesse, il ne donne pas les relations inverses. Dans le cas du mcanisme enzyme
modifi, aucune relation inverse unique n'existe, c'est--dire qu'il n'est pas possible
de calculer les constantes de vitesse partir de la mesure des paramtres cintiques,
parce qu'il existe une infinit d'ensembles de constantes de vitesse capables de
donner les mmes paramtres cintiques. Toutefois, pour le mcanisme alatoire
6 RACTIONS PLUSIEURS SUBSTRATS 209
complexe ternaire une relation unique existe (CLELAND, 1963) qui est prsente
dans le tableau 6.3. Ces relations devraient cependant tre utilises avec prcaution
puisqu'elles supposent que la forme la plus simple du mcanisme s'applique, c'est-
-dire que cette approche ne tient pas compte de la prsence ventuelle de plus
d'tapes que ncessaire dans le modle minimum. Si l'un ou l'autre des complexes
binaires ou tertiaires s'isomrise, l'quation d'tat stationnaire a la mme forme,
mais l'interprtation des paramtres est diffrente et certaines des expressions du
tableau 6.3 ne sont plus valables.
Tableau 6.3 - Calcul des constantes de vitesse partir des paramtres cintiques
Ce tableau est obtenu en rarrangeant les dfinitions prsentes dans le tableau 6.1 pour
les paramtres cintiques du mcanisme ordonn complexe ternaire. Un rarrangement
analogue des dfinitions pour un mcanisme enzyme modifi n'est pas possible.
V1 [ B ]
[ A]
KmB ( kB [ B ])[ E ]0 [ A ]
v = = [6.26]
KiA + [ A ] KiA + [ A ]
Dans cette quation, kB = k0 KmB est la constante de spcificit pour B alors que,
de la mme manire, k A = k0 KmA est dfinie comme la constante de spcificit
pour A. Il dcoule que KiA est la constante vraie de dissociation de EA, parce que
quand [ B ] tend vers zro, la vitesse de la raction de B avec EA tend galement
vers zro ; il n'y a rien dans cette situation qui empche l'tape de fixation de A sur
E de s'approcher de l'quilibre et dans ce cas l'hypothse de MICHAELIS et MENTEN
d'un quilibre de fixation est entirement justifie. KiB n'apparat pas dans l'quation
[6.24] puisque B ne se lie pas l'enzyme libre. Ce paramtre apparat cependant
dans l'quation [6.21] pour le mcanisme rversible complet et sa grandeur
dtermine le rle inhibiteur de B sur la raction inverse. Bien que l'quation [6.24]
ne soit pas symtrique en A et B, puisque KiA KmB n'est pas gal KmA KiB, sa forme
est symtrique ; ds lors, la mesure des vitesses initiales en absence de produit ne
distingue pas A de B, c'est--dire qu'elle ne permet pas de dterminer lequel des
deux substrats se fixe en premier sur l'enzyme.
Il est intressant d'examiner les dfinitions des constantes de spcificit dans la
forme la plus simple d'un mcanisme enzyme modifi. A partir des dfinitions
donnes dans le tableau 6.2, la constante de spcificit pour A peut tre exprime
en fonction des constantes de vitesse de la manire suivante :
k1k 2
kA = [6.27]
k 1 + k 2
Il faut noter que cette dfinition inclut uniquement des constantes de vitesse de la
moiti de la raction qui implique A ; les constantes de vitesse pour les tapes qui
impliquent B sont absentes. De la mme manire, la constante de spcificit pour B
est indpendante des tapes qui impliquent A. En principe, donc, nous pouvons
penser que si le substrat B est remplac par un analogue B' dont la raction avec A
est catalyse par le mme enzyme, la valeur de kA sera inchange. Les tests appro-
pris ont t raliss avec trs peu d'enzymes, mais quand ils ont t raliss ces
tests n'taient en gnral pas en accord avec la prdiction. L'aspartate transaminase
(quation [6.3]), un des enzymes les plus tudis qui suit un mcanisme enzyme
modifi, et qui est parfois considr comme un archtype de ce type de mcanisme,
se comporte de la manire attendue (KATZ et WESTLEY, 1979), mais plusieurs
autres enzymes tudis par le mme groupe ne le font pas (JARABAK et WESTLEY,
1974 ; KATZ et WESTLEY, 1979, 1980). Avec d'autres enzymes, la variation de kA
avec la nature de B a souvent t considre comme une preuve que le mcanisme
enzyme modifi ne peut pas s'appliquer (par exemple, voir MORPETH et MASSEY,
1982).
212 CINTIQUE ENZYMATIQUE
[A]/v 1/v
0,5 0,5 1
2
1/KiA
1 10
0 1/[A]
1/V(1 KmA/KiA)
2
v
V
1 KmA/KiA)
10
10
KiA 0,5
0 [A]
(KmA KiA)/V V/(KmA KiA) 0 v/[A]
L'analyse secondaire des donnes permet de dterminer les valeurs relles des
diffrents paramtres. Puisque les quations [6.29] et [6.31] ont la forme d'qua-
tions de MICHAELIS et MENTEN, les graphiques de V app ou de V app Kmapp en
fonction de [ B ] dcrivent des hyperboles rectangulaires passant par l'origine, qui
peuvent tre analyses en utilisant les graphiques linaires habituels. Ces gra-
phiques sont alors appels graphiques secondaires puisqu'ils reprsentent un
traitement supplmentaire des paramtres apparents obtenus partir des graphiques
primaires. Par exemple, les pentes des graphiques primaires de [ A ] v en fonction
de [ A ] (ou des ordonnes l'origine des graphiques de 1 v en fonction de
6 RACTIONS PLUSIEURS SUBSTRATS 215
1/Vapp Kmapp/Vapp
(pente du graphique (ordonne l'origine du
primaire de [A]/v graphique primaire de
en fonction de [A]) [A]/v en fonction de [A])
Pente = Pente =
KmB/V KiAKmB/V
KmA/V
1/V
L'quation [6.30] pour Kmapp dcrit galement une hyperbole rectangulaire, mais la
courbe ne passe pas par l'origine. Dans ce cas, Kmapp approche KA lorsque [ B ] tend
vers zro et approche KB lorsque [ B ] devient trs grand. Il s'agit donc d'une
hyperbole trois paramtres, qui ne peut pas tre reprsente sous une forme
linaire. Comme dans d'autres cas, Kmapp est un paramtre moins commode
utiliser que KmA V1 .
216 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Il est galement possible de considrer B plutt que A en tant que substrat dont la
concentration est variable, et de tracer des graphiques de [ B ] v en fonction de
[ B ] diffrentes valeurs de [ A ] ; en effet, tant que l'ordre de fixation des
substrats n'a pas t dtermin, la dsignation des substrats est arbitraire. L'analyse
est identique et il n'est pas ncessaire de la dcrire une seconde fois. La seule
diffrence importante est que KiB n'apparat pas dans l'quation [6.24] mais que
KiA KmB KmA apparat chaque fois que KiB est attendu sur la base du simple
change entre A et B.
Pour les mcanismes enzyme modifi, la vitesse initiale en absence de produit est
donne par l'quation suivante :
V1 [ A ][ B ]
v = [6.34]
KmB [ A ] + KmA [ B ] + [ A ][ B ]
La caractristique la plus surprenante de cette quation est l'absence de constante
au dnominateur (le problme [6.4] la fin du chapitre explore l'origine de cette
absence). Cette caractristique induit un comportement aisment diffrentiable de
celui observ avec les mcanismes complexe ternaire lorsque la concentration
de l'un ou l'autre des substrats est modifie : par exemple, si [ A ] est modifie
pour une valeur constante de [ B ] , les valeurs apparentes des paramtres de
MICHAELIS et MENTEN sont les suivantes :
V1 [ B ]
V app = [6.35]
KmB + [ B ]
KmA [ B ]
Kmapp = [6.36]
KmB + [ B ]
V app = V1 [6.37]
Kmapp KmA
Bien que l'quation [6.35] soit identique l'quation [6.29], l'quation [6.36] est
plus simple que l'quation [6.30] et l'quation [6.37], contrairement l'quation
[6.31] ne montre aucune dpendance vis--vis de [ B ] . Cela signifie que, dans ce
cas, Vapp se comporte de la mme manire que pour les mcanismes complexe ter-
naire, mais que le paramtre V app Kmapp est indpendant de [ B ] et prend une valeur
constante V1 KmA . Les graphiques primaires de [ A ] v en fonction de [ A ] ou de
[ B ] v en fonction de [ B ] forment des sries de droites se coupant sur les axes de
[ A ] v ou [ B ] v comme le montre la figure 6.15. Le profil est aisment recon-
naissable par rapport celui des mcanismes complexe ternaire (figure 6.14) sauf
si KiA est beaucoup plus petit que KmA .
6 RACTIONS PLUSIEURS SUBSTRATS 217
[A]/v 0,5
1/v 0,5
1
5
1
Pente =
KmA /V
2
0 1/[A]
5 v
5
KmA /V
0,5
KmA /V
0 v/[A]
0 [A]
6.15 - Graphiques primaires pour un mcanisme enzyme modifi
(en absence d'inhibition par le substrat)
Les valeurs indiques sur les droites sont les valeurs correspondantes de [B] /KmB.
L'apparence de chacun des trois types courants de graphique linaire est prsente. Les
graphiques primaires sont qualitativement similaires quand [B] varie pour diverses valeurs
de [A].
Le seul graphique secondaire utile pour les mcanismes enzyme modifi est celui
de [ B ] V app en fonction de [ B ] qui a les mmes pente et ordonne l'origine
que le graphique correspondant dans le cas des mcanismes complexe ternaire
(figure 6.14).
L'analyse prsente dans le 6.5 n'est strictement valable que pour des concen-
trations faibles de substrat, puisqu'en effet, dans n'importe quel mcanisme raison-
nable, au moins un des quatre ractifs aura la capacit de se fixer fortement une
mauvaise forme de l'enzyme. Dans le mcanisme enzyme modifi, le substrat et
le produit qui ne possde pas le groupe transfr (respectivement dnomms Y et X
dans le symbolisme utilis prcdemment) pourraient se fixer la mauvaise forme
218 CINTIQUE ENZYMATIQUE
[B]
6.16 - Effet de l'inhibition par le substrat (avec KsiB = 10KmB) sur les graphiques
primaires pour les mcanismes complexe ternaire
0,5
2 1
5
10 2
5
[B] 10
0 [A] 0 [B]
6.17 - Effet de l'inhibition par le substrat (avec KsiB = 10KmB) sur les graphiques
primaires pour les mcanismes enzyme modifi
L'inhibition par le substrat peut premire vue apparatre comme une complication
inutile dans l'analyse des donnes cintiques. En ralit, elle est trs informative,
puisqu'elle accentue la diffrence de comportement prdite entre les mcanismes
complexe ternaire et les mcanismes enzyme modifi et qu'elle est gnralement
simple interprter. Comme, en principe, un substrat se fixe plus fortement la
bonne forme de l'enzyme qu' la mauvaise, l'inhibition par le substrat est rarement
suffisamment importante pour perturber l'analyse dcrite dans le 6.5. L'inhibition
par un substrat obtenue pour une concentration faible de l'autre substrat fournit une
preuve positive de l'existence d'un mcanisme enzyme modifi. Par contre,
l'observation d'une valeur de V app Kmapp qui soit indpendante de la concentration
de l'autre substrat (q. [6.37]) ne constitue qu'un argument ngatif pour l'existence
d'un mcanisme enzyme modifi, puisqu'un tel comportement est galement
observ dans un cas spcial de mcanisme squentiel o la variation attendue
V app Kmapp n'est pas dtecte.
Dans un mcanisme ordonn complexe ternaire, l'inhibition par le substrat permet
d'identifier le substrat qui se fixe en second sans avoir recours des tudes
d'inhibition par le produit.
6 RACTIONS PLUSIEURS SUBSTRATS 221
Les tudes d'inhibition par le produit font partie des mthodes les plus utiles pour
la dtermination de l'ordre de fixation des substrats et de l'ordre de libration des
produits, puisqu'elles sont la fois trs informatives et faciles comprendre.
A condition qu'un seul des produits soit ajout au mlange ractionnel, le terme du
numrateur qui correspond la raction inverse doit tre gal zro (except dans
les ractions un seul produit, qui ne sont pas courantes). Le seul effet d
l'addition du produit, est l'augmentation de la valeur du dnominateur de l'quation
de vitesse, qui se traduit par une inhibition de la raction directe.
La question de savoir si un inhibiteur particulier agit comme un inhibiteur comp-
titif, anti-comptitif ou mixte n'a pas de rponse absolue, puisque cela dpend du
substrat dont la concentration est considre comme une variable. Une fois que ce
choix est ralis, cependant, la rponse est directe : le dnominateur de l'quation
de vitesse peut tre spar en termes constants et variables, selon que ceux-ci
contiennent ou non la concentration du substrat variable ; l'expression de V app
dpend des termes variables, alors que l'expression de V app Kmapp dpend des
termes constants, comme dans le 6.5. Comme nous l'avons dcrit dans le 5.2 et
rsum dans le tableau 5.1, les diffrents types d'inhibition sont classs selon qu'ils
affectent V app Kmapp (inhibition comptitive), V app (inhibition anti-comptitive) ou
les deux (inhibition mixte). Ainsi un produit se comporte comme un inhibiteur
comptitif si sa concentration apparat seulement dans les termes constants, comme
un inhibiteur anti-comptitif si elle apparat dans les termes variables et comme un
inhibiteur mixte si elle apparat dans les termes constants et variables. Si le produit
ne peut se combiner qu'avec une seule forme de l'enzyme, uniquement des termes
linaires en concentration sont possibles, et donc l'inhibition est linaire ; mais
l'inhibition non-linaire devient possible si le produit peut galement se fixer sur
une mauvaise forme de l'enzyme pour donner un complexe de type cul-de-sac.
Ces principes peuvent tre illustrs en utilisant comme exemple un mcanisme
ordonn complexe ternaire dans des conditions o P est ajout au mlange
ractionnel en absence de Q, et o A est le substrat dont la concentration est
variable. L'quation complte de vitesse est l'quation [6.21], mais elle peut tre
simplifie en liminant les termes qui renferment [ Q ] , et en rarrangeant le
dnominateur D de sorte que les termes qui contiennent [ A ] soient spars des
autres termes. Une fois cela ralis, le dnominateur peut tre crit de la manire
suivante :
KmA [ B ] KmQ [ P ] [ A ] [ B ] KmQ [ P ] [ B ][ P ]
D = 1+ + + 1+ + + [6.40]
KiA KmB KmP KiQ KiA KmB KmP KiQ KmB KiP
Type d'inhibition
Produit Substrat variable Complexe ternaire Enzyme modifi
P A Mixte Mixte
(anti-comptitive) (pas d'inhibition)
Mixte Comptitive
P B (mixte) (comptitive)
Comptitive Comptitive
Q A (comptitive) (comptitive)
Mixte Mixte
Q B (anti-comptitive) (pas d'inhibition)
Ce tableau montre le type d'inhibition attendu pour chaque combinaison de produit et de
substrat variable. Les descriptions entre parenthses montrent comment le type d'inhibition
est modifi lorsque le substrat constant est prsent une concentration saturante.
Pour des concentrations leves du substrat constant, ces types d'inhibition par
le produit sont modifis parce que les termes de l'quation de vitesse qui ne
contiennent pas la concentration du substrat constant deviennent ngligeables. La
partie constante de l'quation [6.40], par exemple, ne contient aucun terme en
[ B ][ P ] , et donc devient indpendante de [ P ] si [ B ] est grande ; la partie
variable, d'un autre ct, contient un terme en [ B ][ P ] et en consquence reste
dpendante de [ P ] lorsque [ B ] est grande : ceci implique que lorsque A est le
substrat dont la concentration est modifie, l'inhibition par le produit P devient une
simple inhibition anti-comptitive lorsque la fixation de B s'approche de la
6 RACTIONS PLUSIEURS SUBSTRATS 223
La mise au point d'une exprience pour tudier une raction deux substrats en
absence de phnomne d'inhibition repose sur des principes similaires ceux
utiliss pour l'tude des inhibitions simples ( 5.7). Les valeurs des constantes de
MICHAELIS et des constantes d'inhibition pour les diffrents substrats ne sont
videmment pas connues l'avance, et des tests prliminaires doivent tre raliss.
Quelques expriences ralises dans des conditions o la concentration d'un des
substrats est modifie pour deux concentrations donnes de l'autre substrat, une
aussi grande que possible et une aussi faible que possible, devraient permettre de
dterminer la gamme de concentrations dans laquelle se situe la valeur du Km pour
le premier substrat. Une fois cette gamme connue, des concentrations de substrats
224 CINTIQUE ENZYMATIQUE
A B P Q
K1 K2 K6 K7
EA k5 EP
E E
EAB k5 EPQ
EB EQ
K3 K4 K8 K9
B A Q P
6.18. Mcanisme ractionnel de la cratine kinase
La cintique des ractions catalyses par la cratine kinase peut tre dcrite par un
mcanisme complexe ternaire squentiel o la fixation des substrats et des produits est
alatoire et en tat de quasi-quilibre. Le schma est dessin selon la procdure introduite
par CLELAND. L'hypothse du quasi-quilibre simplifie la drivation des quations de vitesse.
Dans le cas o les quilibres de dissociation des substrats et des produits sont en
quilibre rapide, nous pouvons utiliser les lois de la thermodynamique pour simpli-
fier l'criture de l'quation de vitesse. En effet, dans un systme l'quilibre, la
226 CINTIQUE ENZYMATIQUE
variation d'nergie libre entre deux tats du systme ne dpend pas du chemin
ractionnel suivi et correspond la somme des variations d'nergie libre des diff-
rentes tapes se succdant sur un chemin donn. Les parties gauche et droite du
mcanisme de la cratine kinase, correspondant aux tapes de fixation des substrats
et des produits, peuvent tre considres comme deux systmes l'quilibre et nous
pouvons crire :
DG + DG = DG + DG
1 2 3 4 [6.43]
qui peut aussi s'crire :
RT ln K1 + RT lnK 2 = RT ln K3 + RT ln K 4 [6.44]
Aprs simplification, nous obtenons l'quation suivante :
ln ( K1 K 2 ) = ln ( K3 K 4 ) [6.45]
et finalement : K1 K 2 = K3 K 4 [6.46]
Cette dernire quation est trs utile pour crire l'quation de vitesse. Si, par souci
de simplification, nous considrons que [ P ] = [ Q ] = 0 , l'quation de conservation
de l'enzyme peut s'crire comme suit :
[ E ]0 = [ E ] + [ EA ] + [ EB ] + [ EAB ]
[ A ] [ B ] [ A ][ B ]
= [ E ] 1 + + + [6.47]
K1 K3 K1 K 4
= [ E ]D
[ A ] [ B ] [ A ][ B ]
o D = 1 + + + [6.48]
K1 K3 K1 K 4
La vitesse de la raction s'crit :
v = k5 [ EAB ]
[ E ][ A ][ B ]
= k5 [6.49]
K1 K 4
[ E ]0 [ A ][ B ]
= k5
D K1 K 4
Si nous dfinissons la vitesse limite de la raction directe comme V1 = k5 [ E ]0 ,
nous pouvons crire :
V [ A ][ B ]
v = 1 [6.50]
D K1 K 4
A partir de cette quation de vitesse, il est alors possible d'analyser la cintique de
la raction en utilisant par exemple la linarisation selon la mthode introduite par
LINEWEAVER et BURK ( 3.5.2.1) :
1 = 1 K1 K 4 D = 1 K1 K 4 + K 4 + K1 + 1 [6.51]
v V1 [ A ][ B ] V1 [ A ][ B ] [ B ] [ A ]
6 RACTIONS PLUSIEURS SUBSTRATS 227
[B]
[B]2
[B]3
[B]4
1 0 1/[A]
K1
6.19 - Reprsentation du graphique primaire en double inverse
pour diffrentes concentrations de B
1 0 1
K4 [B] 6.20 - Graphique secondaire
La cratine kinase et les diffrents enzymes utiliss pour la ralisation des systmes
coupls, sont des enzymes disponibles commercialement. Ces expriences peuvent
donc servir pour la ralisation de travaux pratiques pour les tudiants. L'tude des
ractions catalyses par la cratine kinase permet de se familiariser avec les sys-
tmes enzymatiques complexes, mais galement avec l'utilisation de systmes
coupls. En effet, la raction catalyse par la cratine kinase, n'implique pas de
variation de signal spectroscopique facilement exploitable pour suivre la cintique
de la raction. La solution ce problme consiste utiliser un systme coupl qui
va lier la raction de conversion ATP/ADP la conversion NADred /NADox. La
conversion NADred /NADox donne lieu une variation importante de l'absorbance
340 nm caractrise par un M = 6 200M1 cm1 (voir 4.1.1) qui peut donc facile-
ment tre suivie par spectrophotomtrie.
Le systme coupl choisi pour suivre la raction directe implique deux enzymes
qui catalysent deux ractions successives. La pyruvate kinase utilise l'ADP et le
phosphonolpyruvate pour former du pyruvate et de l'ATP. Ensuite, la lactate
dshydrognase rduit le pyruvate en lactate et oxyde le NADred en NADox. Les
6 RACTIONS PLUSIEURS SUBSTRATS 229
substrats de ces deux enzymes doivent tre utiliss des concentrations finales de
l'ordre de 1 mM pour le phosphonolpyruvate et de 0,3 mM pour le NADred. Le
systme coupl ne doit pas limiter la vitesse de l'ensemble du systme. L'ADP doit
tre converti en ATP aussitt qu'il est produit et ne doit donc pas s'accumuler. Il en
va de mme pour le NADred qui doit tre consomm simultanment la production
d'ATP. De plus la raction doit tre suffisamment rapide pour permettre une
mesure aise de la vitesse initiale. Il faut donc vrifier l'efficacit du systme
coupl et dterminer sa vitesse afin de choisir la quantit adquate d'enzyme. La
concentration de cratine kinase doit tre aussi leve que possible dans les limites
de saturation du systme coupl. Il faut que la vitesse de disparition du NADred soit
proportionnelle la quantit de cratine kinase prsente dans le mlange
ractionnel.
Pour obtenir des graphiques primaires et secondaires interprtables, il est nces-
saire mesurer la vitesse initiale de la raction directe pour des concentrations de
cratine allant de 1 20 mM pour diffrentes concentrations d'ATP allant de 1,5
12 mM. Les mesures de vitesse sont toutes effectues 25C, dans un tampon
50 mM Tris/HCl pH 7,1 contenant 5 mM d'actate de magnsium (le Mg2+ est
ncessaire au fonctionnement de la cratine kinase, car les substrats de l'enzyme
sont les complexes MgATP et MgADP (voir 4.4)), 0,5 mM de dithiothreitol (qui
permet la rduction de la fonction thiol dans le site actif de la cratine kinase) et
0,5 mM d'EGTA (un agent chlateur des mtaux lourds, en particulier du Zn2+, qui
sont des inhibiteurs de l'enzyme).
Pour tudier la raction inverse, il est ncessaire d'utiliser un second systme
coupl. Dans ce cas, l'ATP produit par la cratine kinase est utilis, d'abord par
l'hexokinase. En prsence de glucose, cet enzyme convertit l'ATP en ADP et trans-
forme le glucose en glucose 6-phosphate. Le glucose 6-phosphate est alors utilis
par un second enzyme, la glucose 6-phosphate dshydrognase qui l'oxyde en
6-phosphogluconate tout en rduisant le NADox en NADred. Ce second systme a
l'avantage d'utiliser le mme signal spectroscopique que le premier. L'utilisation de
ce systme ncessite les mmes mises au point que celles dcrites pour le systme
pyruvate kinase/lactate dshydrognase. Pour obtenir des graphiques primaires et
secondaires interprtables, il est ncessaire de mesurer la vitesse initiale de la
raction directe pour des concentrations de phosphocratine, allant de 0,25
5,0 mM pour diffrentes concentrations d'ADP allant de 0,05 1,0 mM.
Les mthodes pour l'tude des ractions impliquant plus de deux substrats sont une
extension logique de celles dcrites dans les paragraphes prcdents ; elles ne
ncessitent donc pas une prsentation aussi dtaille que celle faite pour les
ractions deux substrats. Les ractions de ce type ne sont ni rares, ni ngligeables
en biochimie elles comprennent par exemple le groupe des ractions catalyses
230 CINTIQUE ENZYMATIQUE
de sorte que deux molcules de substrats peuvent se fixer pour former un complexe
ternaire partir duquel un premier produit est libr avant que le troisime substrat
ne puisse se fixer. Par exemple, avec la plupart des aminoacyl-ARNt synthtases,
l'acide amin et l'ATP ragissent avec l'enzyme pour librer du pyrophosphate et
former un complexe ternaire compos de l'enzyme, de l'acide amin et de l'AMP ;
ce complexe ragit alors avec l'ARNt pour terminer la raction. Dans le cas de la
thronyl-ARNt synthtase, l'isolement d'un tel complexe (ALLENDE J.E. et al.,
1964) a permis de raliser une analyse cintique qui a confirm l'interprtation
initiale (ALLENDE C.C. et al., 1970). Depuis lors, de nombreuses tudes similaires
ont t ralises avec d'autres enzymes du mme groupe.
Il est clair que le nombre de mcanismes possibles est trs grand, et mme si
certains peuvent tre exclus parce qu'ils ne sont pas plausibles chimiquement (une
limination qui n'est pas toujours faite) il reste encore environ dix huit mcanismes
possibles trois substrats et trois produits (dont la liste t tablie par WONG et
HANES, 1969) sans considrer les complications possibles de formation de com-
plexes non-productifs et d'isomrisation. Il est donc particulirement important de
prendre en compte la plausibilit chimique des mcanismes dans l'tude cintique
des ractions trois substrats. De plus, condition que la vitesse semble obir
l'quation de MICHAELIS et MENTEN pour chacun des substrats considrs spar-
ment, la pratique habituelle consiste utiliser des quations de vitesse drives en
supposant que toutes les parties alatoires du mcanisme sont dans un tat de
quasi-quilibre et que toutes les parties ordonnes sont l'tat stationnaire. Ceci
empche videmment l'apparition de termes d'ordre lev dans l'quation de vitesse
et fournit un argument pour l'utilisation de la mthode de CHA ( 6.3.6).
D'un point de vue cintique, les diffrents types de mcanisme gnrent des qua-
tions de vitesse comparables l'quation [6.58] mais qui diffrent entre elles par
l'absence de certains termes au dnominateur, comme l'a fait remarquer en premier
FRIEDEN (1959). Par exemple, pour le mcanisme illustr dans la figure 6.21 il est
vident que la constante et les termes en [ A ] et [ B ] sont absents du dnomi-
nateur de l'quation de vitesse (parce qu'il est impossible de trouver un profil de
KING et ALTMAN qui ne contienne aucun terme de concentration ou qui contienne
uniquement [ A ] ou uniquement [ B ] : voir 6.3.6). Ainsi l'quation de vitesse
pour ce mcanisme s'crit comme suit :
V1 [ A ][ B ][ C ]
v = [6.59]
K AB [ C ] + KmC [ A ][ B ] + KmB [ A ][ C ] + KmA [ B ][ C ] + [ A ][ B ][ C ]
Pour n'importe quelle concentration de substrat variable et dans des conditions o
la concentration des deux autres substrats est maintenue constante, cette quation a
la forme d'une quation de MICHAELIS et MENTEN, avec des constantes apparentes
qui sont prsentes dans le tableau 6.5. Comme d'habitude, le comportement de
Kmapp est trop complexe pour tre utilis directement, mais celui des deux autres
paramtres est trs informatif.
232 CINTIQUE ENZYMATIQUE
R B
E EA
a ER EAB
E'P
Q
E'C
E'
ECQ P
A B P C Q R
b
commun : elle a lieu avec au moins une paire de substrat-produit dans tous les
mcanismes ordonns. Pour les mcanismes que nous venons de discuter, par
exemple, Q doit tre un substrat anti-comptitif vis--vis de A et de B, parce que,
en absence de P et de R, tous les profils de KING et ALTMAN prsentant une dpen-
dance en [ Q renferment galement le produit [ A ][ B ] . De manire similaire, R
doit tre un substrat anti-comptitif vis--vis de C.
Cette brve discussion de quelques points importants dans l'tude des mcanismes
d'enzymes trois substrats, ne peut tre considre autrement que comme une
simple introduction au vaste sujet que ces mcanismes constituent. Pour plus
d'information, nous vous renvoyons des revues spcialises comme celle de
WONG et HANES (1969) et celle de DALZIEL (1969). DIXON et WEBB (1979)
discutent de l'utilisation d'change d'isotopes ( 6.7) dans le cas de ractions trois
substrats, bien que les commentaires de DALZIEL (1969), concernant des sources
possibles d'erreur, doivent tre pris en compte.
L'analyse des ractions quatre substrats a t introduite par ELLIOTT et TIPTON
(1974). Elle suit des principes similaires celle des ractions trois substrats.
Tableau 6.5 - Constantes apparentes pour un exemple
de mcanisme trois substrats
Substrat V
app V app K mapp
variable K mapp
V1 [ B ][ C ] V1 [ B ] ( K AB + K mA [ B ] ) [ C ]
A
K mC [ B ] + K mB [ C ] + [ B ][ C ] K AB + K mA [ B ] K mC [ B ] + K mB [ C ] + [ B ][ C ]
V1 [ A ][ C ] V1 [ A ] ( K AB + K mB [ A ] ) [ C ]
B
K mC [ A ] + K mA [ C ] + [ A ][ C ] K AB + K mB [ A ] K mC [ A ] + K mA [ C ] + [ A ][ C ]
V1 [ A ][ B ] V1 K mC [ A ][ B ]
C
K AB + K mB [ A ] + K mA [ B ] + [ A ][ B ] K mC K AB + K mB [ A ] + K mA [ B ] + [ A ][ B ]
Ce tableau donne les expressions pour les valeurs apparentes des paramtres de l'quation
de MICHAELIS et MENTEN pour une raction trois substrats qui obit l'quation [6.59]
PROBLMES
6.4 - La vitesse d'une raction catalyse par un enzyme deux substrats est
mesure en fonction de la variation des concentrations de [ A ] et de [ B ]
tout en gardant le rapport [ A ] [ B ] constant. Quelle sera la forme atten-
due du graphique de [ A ] v en fonction de [ A ] si la raction obit :
a - un mcanisme complexe ternaire,
b - un mcanisme enzyme modifi ?
6.5 - Quelle sera le profil d'inhibition par le produit attendu pour un enzyme
qui obit un mcanisme complexe ternaire alatoire en quilibre
rapide ?
6.6 - Considrer une raction deux substrats A et B qui suit un mcanisme
enzyme substitu. Sans driver l'quation de vitesse complte, dter-
miner le type d'inhibition attendu dans le cas d'un inhibiteur qui se fixe
dans une raction en cul-de-sac la forme libre de l'enzyme qui fixe B
mais qui n'affecte pas l'autre forme de l'enzyme libre (on suppose
qu'aucun des produits n'est prsent).
6.7 - Les symboles de DALZIEL (1957) sont encore utiliss assez souvent dans
la littrature. Dans ce systme, l'quation serait crite sous la forme
suivante :
6 RACTIONS PLUSIEURS SUBSTRATS 235
[ E ]0 f f f
= f 0 + 1 + 2 + 12
v S1 S 2 S1S 2
dans laquelle [ E ]0 et v ont la mme signification que dans ce livre, S1 et
S 2 reprsentent [ A ] et [ B ] respectivement et f 0 , f 1 , f 2 et f 12 sont
des constantes qui sont parfois appeles coefficients de DALZIEL. Quelles
sont les valeurs de ces constantes en terme de symboles utiliss dans
l'quation [6.8] ? A quel point (exprim en termes de coefficients de
DALZIEL) les droites obtenues en portant S1 v en fonction de S1 pour
diffrentes valeurs S2 se croisent-elles ?
6.8 - Considrer une raction trois substrats et trois produits :
A+B+C P+Q+R
qui obit un mcanisme complexe quaternaire dans lequel les
substrats se fixent et les produits sont relchs dans l'ordre indiqu dans
l'quation ci-dessus. La vitesse initiale en l'absence de produits peut tre
obtenue partir de l'quation [6.42] en supprimant un terme. Rpondre
aux questions suivantes (sans driver l'quation de vitesse complte) :
a - Quel terme de l'quation doit tre supprim ?
b - Quel produit, s'il y en a un, rappelle ce terme dans l'quation de
vitesse ?
c - Quel produit se comporte comme un inhibiteur anti-comptitif (en
absence des deux autres produits) indpendamment de la variation
de la concentration du substrat ?
d - Quel produit se comporte comme un inhibiteur comptitif quand A
est le substrat variable ?
7 UTILISATION D'ISOTOPES POUR L'TUDE
DES MCANISMES ENZYMATIQUES
manifestent par leur absence : bien que cette absence ait des consquences srieuses
pour l'tude du mtabolisme, elle est moins importante pour l'change d'isotope en
tant que sonde cintique des mcanismes enzymatiques, car presque toutes les mol-
cules offrent la possibilit de raliser le marquage d'un carbone ou d'un hydrogne
loign du site de la raction.
Tableau 7.1 - Utilisations cintique d'isotopes
k3 k3[P]
EA*B EAB
EP*Q EQ EPQ
k3[P*] k3
La raction d'change doit donc tre inhibe par des concentrations leves de A ou
de Q, puisque ces molcules sont en comptition avec A* pour se fixer sur E. Les
effets de B et P sont plus subtils : d'un ct, la raction d'change implique la fixation
de B sur EA*, et donc ncessite la prsence d'une concentration finie de B. D'un
autre ct, si B et P sont prsents des concentrations trs leves, l'enzyme existera
principalement sous la forme du complexe ternaire, (EAB + EPQ), et il n'y aura donc
plus de E libre pour fixer A*. On s'attend alors ce que des concentrations leves de
B et de P inhibent l'change, et il n'est pas difficile de montrer que cette prdiction se
vrifie. Les vitesses d'change des concentrations d'intermdiaires peuvent tre
crites de la faon habituelle et leur valeur fixe zro en accord avec l'hypothse de
l'tat stationnaire :
d [ EA*]
= k1 [ A*][ E ] ( k 1 + k 2 [ B ])[ EA*] + k 2 [ EA * B ] = 0 [7.1]
dt
d [ EA * B ]
= k 2 [ B ][ EA*] ( k 2 + k3 )[ EA * B ] + k 3 [ P*][ EQ ] = 0 [7.2]
dt
Celles-ci constituent une paire d'quations simultanes dont [ EA*] et [ EA * B ]
sont les inconnues. La solution pour [ EA * B ] , avec [ P*] fixe zro, est la
suivante :
k1 k 2 [ A*][ B ][ E ]
[ EA * B ] = [7.3]
k 1( k 2 + k3 ) + k 2 k3 [ B ]
La vitesse initiale d'change v* est donne par k3 [ EA * B ] :
k1 k 2 k3 [ A*][ B ][ E ]
v* = [7.4]
k 1( k 2 + k3 ) + k 2 k3 [ B ]
Cette dernire quation est indpendante de toute hypothse concernant l'effet des
ractifs marqus radioactifs sur la raction non marque, mais avant de pouvoir
l'utiliser, il est ncessaire d'obtenir une expression pour [ E ] qui puisse y tre
insre. Comme nous l'avons indiqu plus haut, le traitement est grandement
simplifi si nous supposons que les concentrations des ractifs non marqus ne sont
pas affectes par la prsence de faibles quantits des espces marques ; de cette
manire la valeur de [ E ] est la mme que s'il n'y avait pas de marquage. Si
l'exprience est ralise avec la raction non marque dans des conditions d'tat
stationnaire, l'expression pour [ E ] drive dans le 6.3.2 doit tre utilise, mais
l'utilisation de celle-ci conduit des expressions complexes et n'est heureusement
pas ncessaire. Il y a deux faons d'viter les complications : soit nous pouvons
tudier l'change d'isotopes avec la raction non-marque dans ces conditions
d'quilibre, comme nous en discutons dans le 7.3, ou, plutt que des vitesses
relles d'change, nous pouvons discuter des rapports de ces vitesses, comme il en
est question dans le 7.5.1. La mthode l'quilibre est de loin la meilleure
mthode connue et la plus largement utilise des deux, mais les deux mthodes
reprsentent des mthodes puissantes et utiles.
7 UTILISATION D'ISOTOPES POUR L'TUDE DES MCANISMES ENZYMATIQUES 241
Comme nous l'avons not ci-dessus, les quations de vitesse pour l'change d'iso-
topes deviennent trs compliques si la raction non-marque n'est pas maintenue
l'quilibre durant l'change. Nanmoins, il y a une bonne raison pour tudier des
ractions enzymatiques qui ne sont pas l'quilibre. A l'quilibre chimique il est
impossible de dmler les effets dus la fixation du substrat de ceux dus la
libration du produit, et, sauf si l'enzyme est capable de catalyser une demi-raction
( 7.4), nous sommes obligs de considrer la raction entire. L'change d'isoto-
pes hors d'quilibre, par contre, permet d'isoler et d'examiner sparment la partie
d'un mcanisme qui est responsable d'un change en particulier.
L'tape cruciale pour faire de la mthode d'change d'isotopes hors quilibre une
technique utile, sans se laisser attirer par une complexit sans espoir, a t franchie
par BRITTON (1966). Il a ralis que mesurer et comparer des transferts simultans
entre un ractif et deux autres limine en grande partie la complexit des expres-
sions de vitesse en divisant l'une par les deux autres. Cela s'explique par le fait que
244 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Celui-ci peut reprsenter une raction complte, avec (E' identique E) ou il peut
simplement reprsenter le fragment d'un schma plus large dont le reste peut tre
arbitrairement compliqu sans que cela n'affecte l'analyse, condition qu'il ne
comporte aucune voie alternative de conversion de A + B en P. Supposons main-
tenant que nous avons P* doublement marqu de faon telle qu'il soit possible de
mesurer simultanment la conversion de A* et de B. Puisqu'il n'est pas ncessaire
de mentionner explicitement les marqueurs pour driver les quations, ils seront
omis : il est suffisant de se rappeler que lorsque nous nous rfrons une
conversion unidirectionnelle de, par exemple, P en A, l'existence d'un marqueur
adquat est implicite. Dans ce contexte, il est conventionnel de considrer une
vitesse unidirectionnelle de ce type comme un flux, mais malheureusement cette
distinction entre vitesses et flux est assez diffrente (presque oppose) de celle
utilise dans l'analyse du contrle mtabolique ( 10.4). Pour cette raison, nous
utiliserons ici le terme plus long de flux chimique recommand par l'IUPAC (1981)
pour dsigner une vitesse unidirectionnelle, et nous utiliserons le symbole
F (X Y) pour reprsenter le flux chimique de X vers Y.
Le flux chimique de P vers E'P est clairement donn par v 3 = k 3 [ E' ][ P ] .
Nanmoins, cela ne reprsente pas le flux chimique de P vers B, et encore moins
celui de P vers A, parce que toutes les molcules de E'P produites par la fixation de
P sur E' ne continuent pas dans la mme direction de la raction et ne librent pas
B ; quelques-unes retournent pour rgnrer E' et P. En outre, certaines molcules
de EA produites par la libration de B partir de E'P retournent galement vers E'
et P (avec la capture d'une molcule diffrente de B) au lieu de librer A. Il est
immdiatement vident que si le mcanisme est celui illustr par le schma de la
figure 7.2, le flux chimique de P vers B est suprieur au flux chimique de P vers A,
mais nous pouvons placer cela sur une base quantitative en considrant les proba-
bilits chaque point du mcanisme de continuer dans la mme direction ou de
s'inverser. Pour une molcule E'P produite par la fixation de P sur E', cette proba-
bilit est donne par v 2 ( v 2 + v3 ) car il n'y a que deux solutions possibles, soit la
continuation vers EA + B ou le retour vers E' + P, qui se droulent respectivement
aux vitesses v2 et v3. Ainsi, le flux chimique de P vers B est :
F ( P E' P ) F ( E' P B ) v v k k [ E ][ P ]
F( P B ) = = 2 3 = 2 3 [7.10]
F ( P E' P ) + F ( E' P B ) v 2 + v3 k 2 + k3
7 UTILISATION D'ISOTOPES POUR L'TUDE DES MCANISMES ENZYMATIQUES 245
F (Glucose-6P ATP) 12
F (Glucose-6P Glucose) 10
a 8
0
0 1 2 3 4 5 6
[ATP] (mM)
F (Glucose-6P Glucose) 2
F (Glucose-6P ATP)
1
b
0
0 5 10 15 20 25 50
[Glucose] (mM)
7.3 - Mesures de flux chimiques pour l'hexokinase D
La figure montre les donnes de GREGORIOU, TRAYER et CORNISH-BOWDEN (1981) pour le
transfert simultan de 32P vers l'ATP et de 14C vers le glucose partir de glucose6-phos-
phate marqu avec le 14C et le 32P. La thorie prdit une variation du rapport des flux
chimiques avec la concentration du substrat qui se fixe en second dans une raction
ordonne, mais aucune variation avec le substrat qui se fixe en premier, comme le montrent
respectivement les parties (a) et (b) de la figure.
Nous pourrions supposer que les types les plus simples d'exprience cintique
seraient appropris avec les isomrases (qui incluent les mutases, les racmases, les
pimrases), puisque ces enzymes catalysent d'authentiques ractions un
substrat et un produit. Nanmoins, les isomrases prsentent une difficult spciale
qui est vidente quand elle est souligne, mais qui peut facilement tre nglige :
il est impossible de raliser des expriences conventionnelles d'inhibition par le
248 CINTIQUE ENZYMATIQUE
produit avec ces enzymes car une raction ne peut pas tre irrversible si la
solution contient simultanment le substrat et le produit. Par consquent, le terme
ngatif du numrateur dans l'expression de la vitesse ne peut pas tre nglig, et
l'hypothse cruciale qui permet de simplifier la plupart des quations cintiques
jusqu'au point de permettre l'utilisation des mthodes graphiques et statistiques
conventionnelles, est invalide.
Cette limitation est particulirement srieuse pour les isomrases cause d'une
caractristique mcanique importante de ces enzymes, qui peut tre plus raison-
nablement ignore avec d'autres enzymes. Dans chaque mcanisme, nous pouvons
postuler qu'il pourrait y avoir une tape obligatoire d'isomrisation de l'enzyme,
c'est dire que la forme libre de l'enzyme qui est libre la fin de la raction peut
tre diffrente de la forme implique dans la premire tape, de sorte qu'une iso-
mrisation de l'enzyme est ncessaire pour complter le cycle. Toutefois, dans une
raction impliquant plusieurs substrats et produits, il n'y a pas de raison particulire
pour supposer l'existence d'un tel phnomne : si nous examinons le mcanisme
enzyme modifi de l'quation [6.3], par exemple, il n'y a aucune de raison de
supposer que le processus chimique soit facilit par l'introduction d'une telle tape.
Par contre, dans le cas d'une isomrase, les avantages d'une telle tape sont plus
clairs. Par exemple, une mutase, c'est--dire un enzyme qui catalyse le mouvement
d'un groupe d'une position une autre dans la mme molcule, peut facilement tre
imagine comme une protine existant sous deux formes, chacune complmentaire
de l'un des deux ractifs, mais qui peut rapidement commuter entre ces deux tats.
Ainsi, une partie essentielle de l'tude mcanique d'une isomrase doit tre de
dterminer si celle-ci opre de cette manire ; dans leur argumentation ALBERY et
KNOWLES (1987) vont jusqu' dire qu'aucune investigation cintique d'un enzyme
ne peut tre considre comme complte tant que des expriences n'ont pas t
conduites afin de dterminer si les tapes limitantes dans des conditions de
saturation (par le substrat) dpendent de la modification du substrat ou de la
conversion de l'enzyme libre. Ce point de vue est certainement justifi avec les
isomrases, mme s'il peut paratre exagr avec d'autres enzymes.
Les cintiques conventionnelles ne permettent pas de rpondre cette question. Si
nous appliquons la mthode de KING et ALTMAN au mcanisme d'une raction un
substrat et un produit impliquant une isomrisation de l'enzyme :
P
k1 k2 k3
E+A EA E' E
k1 k2 k3 [7.14]
cela n'est pas immdiatement apparent, parce que l'quation de vitesse contient un
terme en [ A ][ P ] , qui pourrait tre dtectable par des techniques ordinaires :
k1 k 2 k3 [ E ]0 [ A ] k 1k 2 k 3 [ E ]0 [ P ]
v =
( k 1 + k 2 )( k 3 + k3 ) + k1( k 2 + k3 )[ A ] + ( k 1 + k 3 )k 2 [ P ] + k1 k 2 [ A ][ P ]
7 UTILISATION D'ISOTOPES POUR L'TUDE DES MCANISMES ENZYMATIQUES 249
[7.15]
Toutefois, la technique ordinaire en question est l'inhibition par le produit, qui,
comme nous l'avons mentionn plus haut, est impossible dans des conditions
d'irrversibilit de la raction avec un enzyme un seul produit. Le problme
semble toujours tre accessible l'analyse par des techniques ordinaires si nous
mesurons la vitesse en variant [ A ] et [ P ] dans un rapport constant, comme par
exemple en fixant [ P ] = r [ A ] ou r est une constante, car dans ce cas l'quation de
vitesse prend une forme simple avec un seul terme au numrateur :
( k1 k 2 k3 k 1k 2 k 3r )[ E ]0 [ A ]
v = [7.16]
[ ]
( k 1 + k 2 )( k 3 + k3 ) + k1( k 2 + k3 ) + ( k 1 + k 3 )k 2 r [ A ] + k1 k 2 r [ A ] 2
Cette quation n'a pas la forme standard pour une inhibition par le substrat (qua-
tion [5.38]), et, en principe donc, si l'isomrisation de l'enzyme a lieu, la vitesse
doit passer par un maximum quand elle est tudie en fonction des concentrations
des deux ractifs, varies dans un rapport constant. Toutefois, l'observation d'un
maximum dans une gamme accessible de concentrations, dpend des constantes de
vitesse. Un cas est vident : si k3 et k3 sont toutes les deux trs grandes, alors E et
E' ne sont pas distinguables cintiquement, de sorte que le mcanisme devient
quivalent au mcanisme ordinaire une tape de MICHAELIS et MENTEN, et le
terme en [ A ] 2 n'est pas dtectable.
BRITTON (1973), cependant, a mis en vidence une seconde possibilit qui est
moins vidente et qui reste surprenante et non-intuitive, mme aprs en avoir
vrifi l'algbre : le terme en [ A ] 2 devient galement indtectable si k1 et k2 sont
toutes deux trs grandes, ce qui signifie qu'il est impossible de dtecter si l'isom-
risation de l'enzyme libre limite la vitesse pour des concentrations leves de
substrat. Mme si elle est dtectable, BRITTON (1973) a montr que n'importe quel
ensemble particulier de paramtres observs est consistant avec deux ensembles
diffrents de constantes de vitesse, l'un donnant plus d'importance l'isomrisation
de l'enzyme que l'autre. En rsum, l'analyse de ce type de cintiques, exprimes
par les quations [7.15] et [7.16], reste ambigu sur l'importance de l'isomrisation
de l'enzyme. Cette analyse a rcemment t conteste par REBHOLZ et NORTHROP
(1993), qui affirment que BRITTON a fait plusieurs erreurs algbriques ; leur criti-
que est toutefois sans fondements (CORNISH-BOWDEN, 1994 ; BRITTON, 1994), et
ne doit pas tre considre davantage.
La perturbation par un traceur est une technique d'change d'isotope qui limine le
type de problmes d'interprtation discut dans le 7.5.2. Considrons une raction
d'isomrisation qui suit le mcanisme reprsent par l'quation [7.14]. Dans un
mlange l'quilibre entre des ractifs marqus A* et P*, E et E' existent dans de
telles proportions que les flux chimiques de A* vers P* et de P* vers A* sont
250 CINTIQUE ENZYMATIQUE
gaux. Si un large excs de A non marqu est ajout un tel mlange l'quilibre,
la raction rsultante de A vers P perturbera l'quilibre entre E et E', de telle faon
qu' la limite E disparat entirement du mlange ractionnel, ne laissant aucune
forme d'enzyme capable de ragir avec A*, alors que E' reste disponible pour ragir
avec P*. Ainsi, la seule direction possible pour la raction marque est de P* vers
A*. Il s'ensuit alors, que si l'isomrisation de l'enzyme survient comme dans l'qua-
tion [7.14], modifier le systme avec un ractif non-marqu dplacera la raction
entre ractifs marqus de l'quilibre dans une direction oppose celle dont il
dplacera la raction entre ractifs non-marqus. Une analyse similaire d'un mca-
nisme de MICHAELIS et MENTEN deux tapes sans isomrisation de l'enzyme ne
prsente pas un tel effet, parce que A et P ragissent avec la mme forme d'enzyme
libre, et qu'aucun quilibre entre des formes diffrentes de l'enzyme ne peut tre
perturb. Dans ce cas, l'addition de ractifs non-marqus n'a aucun effet sur
l'quilibre entre ractifs marqus.
Dans des cas plus complexes, l'isomrisation de l'enzyme peut provoquer un
dplacement de la raction entre ractifs marqus dans la mme direction que la
raction entre ractifs non-marqus. Nous avons tacitement suppos dans la
discussion des ractions d'isomrisation que le produit P rsulte du rarrangement
des atomes du substrat A en une structure diffrente. Cela n'est pas obligatoirement
le cas, et cela n'est mme pas probable. Avec une mutase, par exemple, E et E'
peuvent reprsenter des phosphoenzymes diffrents, de sorte que le complexe
enzyme-substrat est un biphosphate o le groupe phosphoryle qui apparat sur P
provient de E et non de A. Le transfert d'un groupe phosphoryle marqu de A
ncessite deux cycles catalytiques, de A vers E' au cours du premier cycle, et de E
vers P au cours du second. Puisque le second cycle ncessite la participation de A
non-marqu, le processus en entier peut uniquement se drouler dans la mme
direction que la raction entre ractifs non-marqus, quoique trs lentement,
cause du manque de E pour ragir avec A*. Il s'ensuit que si une exprience de
perturbation par un traceur est ralise en utilisant du 32P comme marqueur, il y
aura une perturbation faible dans la direction de la raction non marque, alors que
si le mme systme est tudi en utilisant du 1 4 C ou du 3H, il y aura une
perturbation plus importante dans la direction oppose. La phosphoglucomutase du
muscle de lapin se comporte exactement en accord avec ces prdictions (BRITTON
et CLARKE, 1976.)
Plus rcemment, la mthode de perturbation par un traceur a t utilise dans
des tudes dtailles des cintiques de la proline racmase (FISHER, ALBERY et
KNOWLES, 1986) et de la triose-phosphate isomrase (RAINES et KNOWLES,1987) ;
encore une fois, les rsultats constituent une preuve d'un effet important de
l'isomrisation de l'enzyme sur la cintique de la raction.
7 UTILISATION D'ISOTOPES POUR L'TUDE DES MCANISMES ENZYMATIQUES 251
Pour la plupart des applications, nous pouvons considrer que les diffrents iso-
topes d'un lment ont exactement les mmes proprits thermodynamiques et
cintiques. En effet, l'utilisation d'isotopes radioactifs comme traceurs, sur laquelle
une grande partie de la biochimie moderne, s'est construite, repose prcisment sur
cette hypothse. Nanmoins, elle n'est pas exactement correcte, et dans des rac-
tions o l'tape limitante implique la rupture d'une liaison entre l'hydrogne et un
atome plus lourd, les diffrences de proprits entre les isotopes d'hydrogne
deviennent suffisamment grandes pour tre l'origine de srieuses erreurs si celles-
ci ne sont pas prises en compte. Ce phnomne a des consquences positives et
ngatives. La consquence ngative est que lors de l'utilisation de 3H comme un
traceur radioactif, nous devons avoir la prudence de nous assurer que celui-ci est
loign du site de raction. En pratique, ceci est gnralement facile raliser, car
loign signifie simplement spar par au moins deux atomes ; nanmoins,
cette prcaution ne doit pas tre nglige.
4,8 kJ.mol1
La consquence positive des effets isotopiques sur les cintiques est qu'ils peuvent
tre utiliss pour obtenir des informations mcaniques qui seraient difficiles
obtenir d'une autre faon. A cause de cet aspect utile, nous donnerons une brve
description de leur origine dans cette section. Il sera invitablement simplifi, mais
des prsentations plus rigoureuses ont t faites par JENCKS (1969) et BELL (1973).
L'nergie d'une liaison C H en fonction de la distance sparant les deux atomes
dpend uniquement des nuages d'lectrons entourant les deux atomes et est la
mme pour tous les isotopes du carbone et de l'hydrogne. Cependant, comme la
liaison vibre, les nergies disponibles sont quantifies, et les niveaux quantiques
spcifiques disponibles pour une liaison dpendent des masses des atomes vibrants,
c'est dire que ceux-ci sont diffrents pour diffrents isotopes. Cela ne serait pas
important si la temprature tait suffisamment grande pour que les liaisons dans un
chantillon donn aient des nergies vibrationnelles distribues de manire ala-
toire entre les diffrents tats. A des tempratures ordinaires, quasiment toutes les
liaisons C H se trouvent dans leur tat vibrationnel fondamental, qui ne
correspond pas au minimum rel de la courbe d'nergie potentielle, mais l'nergie
au point zro de la liaison, qui reflte le fait que la vibration persiste mme au zro
absolu. Il en dcoule que l'tat fondamental pour une liaison C 2H se trouve un
niveau d'nergie environ 4,8 kJ mol1 plus bas (plus profond dans ce puits de
potentiel) que pour une liaison C 1H.
En premire approximation, nous pouvons supposer que lorsqu'une liaison C H
est rompue au cours de l'tape limitante d'une raction, l'tat de transition de la
molcule est celui dans lequel la liaison qui doit tre rompue, est tire jusqu'au
point o elle a perdu un degr de libert de vibration, mais o toutes les autres
liaisons sont dans leur tat fondamental. Ceci sous-entend que l'tat de transition
est le mme pour C 2H et pour C 1H mais, comme l'tat de base est plus bas pour
C 2H, il faut 4,8 kJ mol1 d'enthalpie d'activation en plus pour l'atteindre, comme
l'illustre la figure 8.2. En insrant cette valeur dans l'quation [1.45], nous obtenons :
DH
1
k 1H e 4 ,8 kJ mol
= e
RT
= ( DH + 4 ,8 kJ mol 1
[7.17]
k 2H ) RT
e RT
qui vaut environ 6,9 298 K (25C). Dans les limites o ce modle simple s'ap-
plique, nous prvoyons que les ractions impliquant la rupture de liaisons seront
peu prs sept fois plus lentes pour les liaisons C 2H que pour les liaisons C 1H.
Le type d'effet isotopique que nous venons de considrer est appel un effet isoto-
pique primaire et dans la thermologie communment utilise, nous pouvons dire
que les calculs nous amnent prvoir que l'effet isotopique primaire du deutrium
pour une liaison C H devrait tre d'environ 7. Des calculs similaires indiquent que
l'effet isotopique correspondant pour le tritium vis--vis du proton devrait tre
d'environ 16,5, et que tout les autres effets isotopiques primaires (comme par
exemple pour 17O compar 16O) devraient tre bien infrieurs. Ces calculs sont
7 UTILISATION D'ISOTOPES POUR L'TUDE DES MCANISMES ENZYMATIQUES 253
Essentiellement les mmes arguments s'appliquent aux effets isotopiques sur les
quilibres qu'aux effets isotopiques secondaires : les effets de substitutions iso-
topiques sur les niveaux d'nergie s'oprent dans des directions opposes sur les
254 CINTIQUE ENZYMATIQUE
deux cts d'un l'quilibre, et, bien qu'ils ne puissent pas exactement s'annuler
mutuellement, l'effet net est normalement faible, et les effets isotopiques sur les
quilibres sont typiquement proches de 1.
La mesure des effets isotopiques a trouv une utilisation croissante dans les tudes
d'enzymes comme moyen d'tude des mcanismes. La thorie essentielle est pr-
sente dans un article de NORTHROP (1977), et dans d'autres articles parus dans ce
mme ouvrage, et une application trs fournie de cette thorie l'tude de la triose-
phosphate isomrase a t dcrite par ALBERY et KNOWLES (1976.)
Bien que l'analyse dtaille puisse devenir trs complique, l'ide de base est
suffisamment simple pour tre rsume dans un texte lmentaire. Il peut tre
prsent en rfrence au mcanisme de MICHAELIS et MENTEN trois tapes de
l'quation [3.87], discut dans le 3.6, pour lequel les dfinitions de la constante
catalytique et de la constante de spcificit, dj introduite dans l'quation [3.99a,b]
sont les suivantes :
k 2 k3
k0 = [7.19]
k 2 + k 2 + k3
k1 k 2 k3
kA = [7.20]
k 1k 2 + k 1k3 + k 2 k3
avec des expressions similaires pour la raction inverse, donnes par les quations
[3.100a,b]. Puisque les expriences ralises dans des conditions d'tat stationnaire
permettent uniquement de dterminer les quatre paramtres de MICHAELIS et
MENTEN, alors que le mcanisme comprend six constantes de vitesse, il pourrait
sembler impossible de dterminer les contributions relatives des diffrentes cons-
tantes de vitesse prsentes dans les quations [7.19] et [7.20] partir de ces
expriences. Toutefois, la possibilit d'effectuer des mesures avec des ractifs
isotopiquement marqus permet de complter utilement ces rsultats. Si nous faisons
l'hypothse raisonnable qu'une substitution isotopique faite dans une liaison qui est
rompue lors de la raction va vraisemblablement produire un effet isotopique
primaire dans l'tape chimique, mais avec des effets isotopiques faibles ou nuls sur
les tapes de fixation, nous pouvons prvoir des effets isotopiques substantiels sur k2
et k2, mais des effets ngligeables sur les autres constantes de vitesse. Ceci sous-
entend que les rapports des constantes catalytiques et des constantes de spcificit
pour les ractifs contenant 1H et 2H peuvent tre crits comme suit, o l'exposant D
(deutrium) indique 2H et o l'absence d'exposant fait rfrence 1H :
7 UTILISATION D'ISOTOPES POUR L'TUDE DES MCANISMES ENZYMATIQUES 255
k0 k ( k D + k 2D + k3 )
= 2D 2 [7.21]
D
k0 k 2 ( k 2 + k 2 + k3 )
kA k 2 ( k 1k D2 + k 1k3 + k 2D k3 )
= [7.22]
k AD k 2D ( k 1k 2 + k 1k3 + k 2 k3 )
Si aucun effet isotopique n'est observ avec les constantes de vitesse pour la
fixation, le rapport des effets isotopiques sur k2 et k2 doit tre gal l'effet isoto-
pique sur l'quilibre pour la raction globale. Par simplicit, nous considrerons
que l'effet isotopique sur l'quilibre est exactement gal l'unit, mais comme ce
dernier est de toute manire mesurable indpendamment, l'analyse qui suit peut tre
facilement corrige pour prendre en compte les effets sur l'quilibre si cela est
ncessaire. En supposant que k 2 k 2D = k 2 k D2 , l'quation [7.21] peut tre rar-
range pour donner une expression du rapport k3 ( k 2 + k 2 ) en termes de l'effet
isotopique mesur sur k0 et des effets isotopiques inconnus sur k2 et k2 :
k0
1
k3 k0D
= [7.23]
k 2 + k 2 k 2 k0
k 2D k0D
Etant donn que k 2 k 2D est inconnu, la valeur de ce rsultat peut sembler douteuse.
Nanmoins, mme si la valeur exacte est inconnue, la thorie brivement prsente
dans le 7.6.1, associe au large ensemble d'informations exprimentales dont
nous disposons concernant les effets isotopiques dans les systmes chimiques, nous
donnent une bonne ide de la gamme de valeurs probables. Ainsi, si nous
supposons une valeur de 7, il est clair qu'un effet isotopique mesur de l'ordre de 7
(ou plus) sur k0 fournit une preuve solide que l'tape chimique est suffisamment
lente pour contribuer de manire apprciable aux cintiques observes saturation,
alors qu'une valeur de l'ordre de 1 indique que c'est la libration du produit qui
limite la vitesse.
Des arguments similaires peuvent tre appliqus l'quation [7.22], mais dans ce
cas, la grandeur de l'effet isotopique sur la constante de spcificit kA fournit une
mesure de l'importance relative de l'tape chimique en comparaison non pas avec k3
uniquement, mais avec k 1 et k3. Bien que cette analyse soit quelque peu plus
complique que pour k0, elle a l'avantage de pouvoir tre applique 3H aussi bien
qu' 2H, alors que les effets isotopiques de 3H sur k0 ne peuvent pas tre mesurs,
car un enzyme ne peut pas tre satur par une espce qui est uniquement prsente
sous forme de traces.
Si l'quation [7.18], la relation entre les effets isotopiques de 2H et 3H, pouvait tre
considre comme fiable, elle fournirait un moyen pour s'affranchir de la difficult
rencontre dans cette analyse qui est due au fait que la valeur exacte de k 2 k 2D est
inconnue. La comparaison des effets isotopiques mesurs pour les deux isotopes
permettrait de la calculer. Malheureusement, il n'est pas clair si cette relation
256 CINTIQUE ENZYMATIQUE
PROBLMES
Parmi les nombreux problmes rencontrs lors des premires tudes des cintiques
enzymatiques, le plus important tait certainement labsence de comprhension de
leffet de la concentration en ion hydrogne, H+. En solution aqueuse, la concen-
tration de proton varie entre 1 M et 1014 M, une gamme extrmement large qui est
communment exprime laide dune chelle logarithmique, pH = log [ H + ] ,
de manire rduire la taille des chiffres manipuls. Tous les enzymes sont profon-
dment influencs par le pH, et aucun progrs substantiel na pu tre ralis jusqu
ce que MICHAELIS et ses collaborateurs fassent du contrle du pH une opration de
routine de toute tude enzymatique srieuse. Le concept de tampon pour contrler
la concentration de proton libre et lchelle de pH qui permet de lexprimer, ont t
introduits par SRENSEN (1909), dans une publication dmontrant limportance de
la concentration de lion hydrogne dans les tudes enzymatiques. MICHAELIS,
cependant, avait dj commenc travailler dans cette direction (voir MICHAELIS,
1958) et ce nest que peu de temps aprs quapparu le premier papier dune longue
srie sur les effets du pH sur les enzymes (MICHAELIS et DAVIDSON, 1911). Bien
quil existe encore certains dsaccords concernant linterprtation des effets du pH
sur la cintique enzymatique, limportance pratique du pH reste immuable : il est
impossible denvisager une tude cintique sans contrle adquat du pH.
Aprs avoir pass un an dans le laboratoire de Paul ERLICH, il tudie la mdecine clinique
et sintresse au contrle de la concentration de lion hydrogne et son influence sur les
proprits des solutions de protines et denzymes. Il dveloppe lutilisation de llectrode
hydrogne pour mesurer les effets de la concentration en proton sur lactivit des
enzymes. Il ralise ces travaux la mme poque que le danois Sren SRENSEN, mais ce
258 CINTIQUE ENZYMATIQUE
dernier publie ses conclusions (1909) plus rapidement que MICHAELIS et se voit accorder la
priorit sur ces travaux. Nanmoins, MICHAELIS dmontre que la dpendance au pH de la
catalyse enzymatique ressemble celle de la dissociation dun acide faible. Il dmontre
galement que le point isolectrique des protines nest pas uniquement une rfrence
dans la variation des proprits lectriques de la protine mais quil correspond
galement un minimum ou un maximum pour dautres proprits comme la solubilit
ou la viscosit. Il dveloppe une mthode dlectrophorse qui permet de dterminer le pI.
Sa matrise dans ce domaine le conduit devenir lun des leaders de lpoque dans ltude
des ractions catalyses par des enzymes. Les quelques annes qui ont prcd la
premire guerre mondiale ont t trs productives. Sa fameuse publication ralise avec
Maud MENTEN ntait quune parmi les 94 publications, dont 5 livres, quil a produites entre
1910 et 1914. Plusieurs de ses travaux sont rgulirement cits et notamment son livre,
Die Wassertoffionen-konzentration, est lpoque un ouvrage de rfrence sur le pH et
les tampons. En 1920, il passe trois annes comme professeur de biochimie Nagoya, au
Japon et se rend ensuite aux Etats-Unis o il meurt en 1949. Il est rest scientifiquement
actif jusqu sa mort, notamment dans le domaine de ltude des radicaux libres.
Cela peut paratre surprenant que ce soient les enzymologistes qui aient attir
lattention sur limportance de contrler la concentration de protons et aient intro-
duit lutilisation de tampons. Nous pouvons donc nous demander quelles sont les
proprits spciales des enzymes qui rendent impratif de contrler le pH alors
quaucun besoin ne stait fait sentir dans ltude dj bien dveloppe lpoque
de la cintique chimique. A lexception de la pepsine et de la phosphatase alcaline,
les enzymes qui ont t le plus largement tudis sont actifs en solution aqueuse
des valeurs de pH comprises entre 5 et 9. Dans cette gamme, les concentrations de
proton et dion hydroxyde varient dans la gamme de 105 109 M, qui corres-
pondent de trs faibles variations, et qui sont donc trs sensibles la prsence
dimpurets. Des extraits cellulaires et des prparations brutes denzyme sont en
gnral, bien tamponnes par les enzymes et par les polylectrolytes prsents sous
la forme dimpurets, mais ces tampons naturels sont limins lorsque les enzymes
sont purifis et doivent tre remplacs par dautres tampons. Jusqu ce que ce fait
soit reconnu, peu de progrs tait possible. Cette situation contraste avec celle
rencontre en chimie : peu de ractions sont tudies en solution aqueuse et parmi
celles-ci, nombreuses sont celles qui sont tudies des valeurs de pH, trs leves
ou trs faibles, dans des conditions o les concentrations de proton ou dion
hydroxyde sont suffisamment leves pour tre considres comme constantes. En
consquence, les premires tudes de cintique chimique ont peu souffert du
manque de comprhension du pH.
Le type le plus simple deffet du pH sur les enzymes impliquant un seul groupe
acide ou un seul groupe basique, nest pas diffrent du cas gnral dinhibition ou
dactivation hyperbolique qui a t considr dans le 5.6.3. Conceptuellement, la
protonation du groupe basique dun enzyme est simplement un cas spcial de
fixation dun groupe effecteur sur un site spcifique et il nest ds lors nul besoin
de rpter la rsolution des quations pour ce cas simple. Nanmoins, il existe
8 EFFETS DE LENVIRONNEMENT SUR LES ENZYMES 259
plusieurs diffrences entre les protons et les autres effecteurs qui rendent utiles
dexaminer sparment la fixation des protons. Premirement, quasiment tous les
enzymes sont affects par les protons, de telle sorte que les protons sont des
effecteurs beaucoup plus importants que nimporte quel autre effecteur. Ils sont
beaucoup plus petits que nimporte quel autre compos chimique et nont aucun
effet strique ; cela signifie que certains phnomnes, telle linhibition non-comp-
titive pure ( 5.2.2), sont courants avec les protons alors quils sont particulire-
ment rares en gnral. La concentration de proton peut tre mesure et contrle
sur une gamme beaucoup plus grande que celle accessible tout autre effecteur et
donc nous pouvons nous attendre observer nimporte quel effet possible. Finale-
ment, les protons se fixent normalement sur de nombreux sites sur un enzyme, de
sorte quil est souvent insuffisant de considrer la fixation sur un seul site.
Dans leurs cours de chimie et de biochimie, les tudiants sont confronts plusieurs
dfinitions des acides et des bases. Pour comprendre les proprits des enzymes et
de la plupart des autres molcules biologiques, il est prfrable de considrer la
dfinition propose par BRNSTED (1923) : un acide est une espce ayant tendance
perdre un proton, alors quune base est une espce ayant tendance fixer un
proton.
Mise part limportance prpondrante quelle accorde au proton, cette dfinition
prsente lavantage de se rfrer une espce , et donc elle inclut les atomes
aussi bien que les molcules. Une manire dexprimer cette dfinition est de
considrer quun acide est un donneur de proton sous la forme :
AH A + H + [8.1]
quand AH est un acide neutre, ou sous la forme :
BH + B + H+ [8.2]
+
quand BH est un acide cationique. De la mme manire, une base est dfinie
comme un accepteur de proton. Les formes A et B dans les quations [8.1] et [8.2]
sont des bases et sont gnralement dsignes comme les bases conjugues de
lacide correspondant.
Pour les ractions biochimiques qui se droulent en solution aqueuse, il est impor-
tant de noter que leau participe la raction de dissociation. En effet en solution
aqueuse, la raction dcrite par lquation [8.1] scrit de la manire suivante pour
un acide possdant un seul groupe ionisable :
AH + H2O A + H3O + [8.3]
260 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Il sagit dune raction acide-base o lacide HA ragit avec une base, H2O, pour
donner la base conjugue de lacide, A, et lacide conjugu de la base, lion H3O+.
Le proton hydrat, H3O+, est appel lion hydronium.
La dissociation de leau a t mise en vidence par des mesures de conductivit
lectrique de leau pure. Langlais Henry CAVENDISH, avait remarqu que la
conductivit de leau tait fortement augmente si on dissolvait du sel dans celle-ci.
Mais, cest Svante ARRHENIUS que nous devons la thorie de la dissociation des
ions en phase aqueuse et linterprtation de ces mesures de conductivit lectrique.
Selon sa thorie, un courant lectrique est transmis travers une solution aqueuse
parce que les sels se dissocient en ions de charges opposes et se dplacent dans la
solution, transportant ainsi les charges lectriques. Ainsi, une charge lectrique est
transfre travers une solution parce que les cations sont attirs par la cathode et
se dplace dune rgion entourant lanode vers une rgion entourant la cathode, et
de la mme manire, les anions sont attirs par lanode et se dplacent dune rgion
entourant la cathode vers une rgion entourant lanode. Si leau pure ne contenait
pas dions, cette conductivit lectrique serait nulle. Quand de leau, la plus pure
possible, est prpare par des distillations successives, la conductivit lectrique
approche une valeur limite qui est environ gale celle dune solution dacide
chlorhydrique 1 107 M. Ainsi leau pure ne contient pas simplement des mol-
cules de H2O mais elle contient galement des ions hydronium une concentration
de 1 107 moles par litre ( 25C) et des ions hydroxyde la mme concentration.
Leau est une molcule amphiprotique, cest--dire une substance capable la fois
de donner et daccepter un proton, qui agit donc simultanment comme un acide et
comme une base. Leau pure a donc la proprit de se dissocier en ions hydronium,
H3O+, et hydroxyde, OH (q. [8.4]). Cest un exemple dautoprotolyse puisque
cest une molcule deau qui, agissant comme un acide, fournit un proton une
autre molcule deau, agissant comme une base qui fixe le proton :
H2O + H2O H3O + + HO [8.4]
+
Bien que ce soit lion hydronium, H3O , qui soit prsent dans leau et qui confre
celle-ci ses proprits acides, il est habituel dutiliser le symbole H+ la place de
H3O+ et de parler dion hydrogne plutt que dion hydronium, une pratique que
nous suivrons dans la suite de notre manuel. Lactivit de lion hydrogne joue un
rle central dans de nombreux processus biologiques et sa valeur varie sur une
large gamme. Cette large gamme de valeurs justifie lutilisation dune chelle
logarithmique, lchelle de pH. Ainsi plutt que dutiliser lactivit de lion
hydrogne, il est habituel dutiliser le pH, qui est dfinit comme moins le
logarithme dcimal de lactivit de lion hydrogne .
pH = log a [ H + ] [8.5]
Il faut noter que, pour des solutions trs dilues, lactivit peut tre assimile la
concentration et donc par souci de simplification, le pH est dfini dans la plupart
des manuels de biochimie en terme de concentration dion dhydrogne :
8 EFFETS DE LENVIRONNEMENT SUR LES ENZYMES 261
pH = log [ H + ] [8.6]
Nous suivrons galement cette pratique en insistant sur le fait quil est bon de se
rappeler dans certaines circonstances que la dfinition exacte du pH est base sur
lactivit. Selon cette dfinition [8.6], le pH dune solution contenant 1 mole dions
hydrogne par litre, a un pH de 101 cest--dire zro.
Lquilibre de dissociation de leau peut tre caractris par une constante
dquilibre :
[ H + ][ OH ]
K = [8.7]
[ H 2O ]
o [ H 2 O ] reprsente la concentration de leau dans la solution. Puisque, comme
nous lavons dj mentionn ci-dessous, la concentration (lactivit) de leau dans
une solution dilue est quasiment identique celle de leau pure, il est habituel
domettre ce terme dans lexpression des quilibres de dissociation pour des solu-
tions dilues. Ainsi le produit de la constante K et de [ H 2 O ] est assimil une
constante KW, dnomme le produit de dissociation de leau et nous pouvons
rcrire lquation [8.7] sous la forme :
KW = [ H + ][ OH ] [8.8]
Cette quation montre qu une temprature donne le produit de la concentration
dion hydrogne et de la concentration dion hydroxyde est une constante. La
valeur de KW est de 1 1014 M2 25o C, en accord avec les concentrations de
1 10 7 M des ions hydrogne et hydroxyde mesures dans leau pure (voir ci-
dessus). Une solution neutre contient autant dions hydrogne que dions hydro-
xyde, alors quune solution lgrement acide, contenant 10 fois plus dions
hydrogne quune solution neutre, contiendra 10 fois moins dions hydroxyde.
Tout comme la raction de dissociation de leau, la raction de dissociation dun
acide contenant un seul groupe ionisable, est caractrise par une constante
dquilibre. La raction rversible dcrite par lquation [8.3] est caractrise par
une constante de dissociation :
[ H 3O + ][ A ]
K = [8.9]
[ HA ][ H 2 O ]
Si nous considrons uniquement des solutions dilues, lactivit de leau est proche
de celle de leau pure dont la valeur est gale 1. Toutefois, dans la pratique, les
constantes dquilibre de dissociation sont exprimes en termes de concentration.
Cette simplification persiste et lquilibre de dissociation peut tre exprim en
terme de constante dacidit :
[ H 3O + ][ A ] [ H + ][ A ]
Ka = K [ H 2 O ] = [8.10]
[ HA ] [ HA ]
262 CINTIQUE ENZYMATIQUE
La valeur de la constante dacidit, Ka, est une mesure de laffinit pour le proton
des paires acide-base, HA/A et H2 O/OH, et donne ainsi une mesure de la force
dun acide ou dune base par rapport leau. Les acides sont classs en fonction de
cette force relative. Ceux dont la constante de dissociation est infrieure 1 ne
sionisent que partiellement en solution et sont appels des acides faibles (Ka < 1).
Ceux dont la constante de dissociation est suprieure 1 sont compltement ioniss
en solution (Ka > 1). Ainsi, une solution 0,1 M dun acide fort comme lacide chlo-
rhydrique contient 0,1 M dion hydrogne. Par contre, une solution dun acide
faible, comme lacide actique, qui nest pas compltement dissoci, contient une
concentration dion hydrogne plus faible quune solution dacide fort une con-
centration identique.
La force dune base peut galement tre estime par une mesure de sa constante de
dissociation, Kb, mais celle-ci est rarement utilise. Afin dhomogniser les mesures,
on utilise pour classer les bases, la constante de dissociation de leur acide conjugu :
[ B ][ H + ]
Ka = [8.11]
[ BH + ]
Les acides et les bases faibles sont celles dont la constante Ka est comprise entre
1 et 1014 M.
De la mme manire que le pH est dfini partir de la concentration de proton,
le pKa dun acide ou dune base est dfini comme moins le logarithme dcimal de
la constante de dissociation de lacide .
[ A ][ H + ]
pKa = log Ka = log [8.12]
[ AH ]
La relation entre le pH et les concentrations dun acide et de sa base conjugue
prsentes dans une solution peut aisment tre obtenue en rarrangeant cette quation :
[ A ]
log Ka = log + log [ H + ] [8.13]
[ AH ]
En se rappelant la dfinition du pH donne dans lquation [8.6], nous obtenons
lquation dHENDERSON-HASSELBALCH, qui donne le pH dune solution dacide
ou de base faible partir du pKa et des concentrations de la forme acide (AH dans
lexemple choisi) et de la forme base [ A ] prsentent dans la solution :
[ A ]
pH = pKa + log [8.14]
[ AH ]
Cette quation montre que pour un compos ne contenant quun seul groupe ioni-
sable, les concentrations de la forme acide et de la forme base seront identiques
lorsque le pH sera gal au pKa. La forme de la courbe de titrage prsente dans la
figure 8.1 qui montre la relation entre le pH et la fraction de forme ionise de la
molcule, [ A ] ([ A ] + [ AH ]) , indique que dans une rgion correspondant
8 EFFETS DE LENVIRONNEMENT SUR LES ENZYMES 263
pH 14
12
10
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
[A]/([A]+[AH])
8.1 - Effet tampon
La figure montre la variation du pH en fonction du rapport des concentrations de la forme
base et de la forme acide dune molcule portant un seul groupe ionisable dont le pKa = 4,5
(trait en pointills). La zone grise stendant sur la gamme de pH = pKa 0,5, correspond
une variation du rapport [ A ] /([ A ] + [ AH ]) allant de 0,25 0,75.
B = da [8.19a]
dpH
d ( R + 1 ) 1 d ( R + 1 ) 1 dR 1 dR
B = = = [8.19b]
dpH dR dpH ( R + 1 ) 2 dpH
En utilisant la drivation suivante :
dR = R ln10 [8.20]
dpH
le pouvoir tampon molaire dun acide ou dune base simple est donn par
lquation suivante :
B = R ln 10 [8.21]
( R + 1 )2
Cette fonction B (quation [8.21]) a un maximum R = 1 dont la valeur est
donne par :
ln10
Bmax = [8.22]
4
Il est donc possible de dfinir le pouvoir tampon molaire relatif, b, en divisant
lquation [8.21] par lquation [8.22] :
b = 4R [8.23]
( R + 1 )2
La forme de cette fonction est reprsente dans la figure 8.2. Elle a une valeur
maximale de 1 pR = 0 et diminue symtriquement de part et dautre.
8 EFFETS DE LENVIRONNEMENT SUR LES ENZYMES 265
1
Pouvoir tampon molaire relatif
0,8
0,6
0,4
0,2
0 2 4 6 8 10 12 14 pH
4 2 0 2 4 6 8 pR
8.2 - Pouvoir tampon molaire relatif
La courbe a t calcule partir de lquation [8.23] pour une molcule une seul groupe
ionisable de pKa = 4,5.
Dans la dfinition des acides et des bases (voir 8.2), BRNSTED utilise le terme
espce , qui inclut les ions aussi bien que les molcules. Malheureusement, les
biochimistes ont, par convention, class les groupes ionisables rencontrs dans les
protines en fonction des proprits des acides amins dans leur tat compltement
non-charg. Ainsi, laspartate et le glutamate, qui sont largement responsables des
proprits basiques des protines dans des conditions physiologiques, sont commu-
nment classs comme des acides . Parmi les acides amins dits basiques,
lhistidine peut agir comme un acide ou comme une base dans des conditions
physiologiques, la lysine agit principalement comme un acide et larginine est
quasiment sans importance dans la dfinition des proprits acide-base des
protines, puisquelle ne perd son proton qu des valeurs de pH, suprieures 12.
Dun autre ct, deux des acides amins gnralement classs comme neutres, la
cystine et la tyrosine, contribuent de manire significative aux proprits acide-
base des protines. Si le but de la terminologie standard tait de compliquer les
discussions de ces proprits, un meilleur rsultat naurait pas pu tre obtenu. Bien
que nous ne proposions pas de modifier lappellation communment utilise de ces
groupements, il est bon de garder ce point en mmoire lorsque nous nous int-
ressons aux mcanismes catalytiques des enzymes. A cet usage, nous proposons
266 CINTIQUE ENZYMATIQUE
dans la figure 8.3 une tentative de classification plus rationnelle, qui na quasiment
rien de commun avec celle qui est gnralement rencontre dans les manuels de
biochimie et qui est base sur la dfinition de BRNSTED.
}
3,4 C-terminal (carboxylate)
4,1 Aspartate (carboxylate) Basique
4,5 Glutamate (carboxylate)
6,3 Histidine (imidazole) Principalement basique
N-terminal (ammonium) 7,5 Principalement acide
}
Cystine (thiol) 8,3
Tyrosine (phnol) 9,6 Acide
Lysine (ammonium) 10,4
Arginine (guanidinium) > 12 Aucun (voir texte)
1 3 5 7 9 11 13 pH
8.3 - Groupes ionisables dans une protine
Quelques-uns des groupes inclus dans la figure 8.3 comme le groupe carboxylique
C-terminal ou le groupe -amin de la lysine, ont des valeurs de pKa si loignes
de 7 quil semble improbable que ces groupes contribuent aux proprits catalyti-
ques des enzymes. Nanmoins, les valeurs de pKa donnes dans la table sont des
valeurs moyennes pour des groupes se trouvant dans un environnement typique,
mais ces valeurs peuvent varier normment par rapport aux valeurs de pKa de
groupes individuels dans des environnements particuliers, comme ceux rencontrs
dans les sites actifs de certains enzymes. Les valeurs de pKa de ces groupes peuvent
tre perturbes . Un exemple frappant est celui de la pepsine, qui a un point
isolectrique de 1,4. Puisque cet enzyme renferme quatre groupes qui sont chargs
positivement pH acide, il doit y avoir au moins quatre groupes avec des valeurs
de pKa bien infrieures celles communment rencontres pour des groupes
carboxyliques. Bien que lenzyme renferme une srine phosphoryle, celle-ci ne
peut expliquer quen partie la faible valeur du point isolectrique et il doit y avoir
au moins trois groupes carboxyliques perturbs. Une explication possible repose
sur lide que si deux groupes acides sont placs proximit lun de lautre, ltat
une fois proton de cet ensemble de deux groupes devrait tre beaucoup plus stable
que les tats deux fois protons et deux fois dprotons.
Comme nous venons de le voir, une protine contient en gnral un nombre
important dacides amins acides et basiques. Puisque ces acides amins ont la
capacit de sioniser, les protines sont considres comme des polylectrolytes,
cest--dire que se sont des molcules qui contiennent un trs grand nombre de
groupes ionisables, acides et bases. Le titrage de ces molcules est plus
8 EFFETS DE LENVIRONNEMENT SUR LES ENZYMES 267
complexes que celui dacides un seul groupe ionisable, car les pKa des groupes
acides-bases ne sont gnralement pas indpendants. La charge ionique qui
rsulte de la dissociation dun proton influence la dissociation ultrieure des
autres protons, modifiant ainsi la valeur du pKa de ces groupes. Exprimen-
talement, le titrage de ces macromolcules permet dobtenir une courbe donnant
le nombre de protons fixs sur la macromolcule, J, en fonction du pH de la
solution, en prenant comme point de rfrence (pH = 0) ltat de la macro-
molcule dans lequel le nombre de protons fixs correspond au nombre
maximum de protons qui peut tre fix (figure 8.4).
J 40
35
30
25
20
15
10
10
15
20
2 4 6 8 10 12 pH
8.4 - Courbe de titrage dune protine
La valeur de J reprsente la charge nette de la protine qui dpend du nombre de protons
fixs. Le pH pour lequel la charge nette est gale zro correspond au point isolectrique
de la protine. La courbe a t calcule pour une protine contenant 7 Asp, 14 Glu,
1 C-terminal, 12 His, 3 Tyr, 19 Lys, 4 Arg, et 1 N-terminal en utilisant les valeurs typiques de
pKa pour les diffrents acides amins qui sont prsentes dans la figure 8.3.
di-acide, HEH, avec deux groupes diffrents, comme prsent dans la figure 8.5. Si
les sites de fixation ne sont pas indpendants, les 4 constantes de dissociation dans
la figure 8.5 sont toutes dif-
EH + H+
K11 K22 frentes les unes des autres.
HEH E2 + 2 H+
K12
[ E ]0
[ H+]
[ HE ] = [8.26c]
K +K K K
1 + 11 + 12 + 11 + 222
[H ] [H ]
K11 K 22
[ E ]0
[ H + ]2
[ E2 ] = [8.26d]
K +K K K
1 + 11 + 12 + 11 + 222
[H ] [H ]
Ces quatre expressions montrent comment les concentrations des diffrentes espces
varient avec la concentration de protons libres et donc avec le pH ; un ensemble
typique de courbes est prsent dans la figure 8.6, pour des valeurs arbitraires de
constantes de dissociation.
1
Concentration de la forme de l'enzyme
E2
HEH
0,8
EH
0,6
0,4
0,2
HE
0
4 5 6 7 8 9 10 pH
8.6 - Concentrations relatives des diffrentes formes de lenzyme en fonction du pH
Les courbes sont calcules pour un enzyme HEH dont les constantes de dissociation pour
les deux groupes ionisables sont les suivantes : pK11 = 6,1, pK12 = 6,9, pK21 = 7,0, pK22 = 7,8.
Dans une exprience relle, il est impossible de dfinir les courbes aussi prci-
sment que celles de la figure 8.5, parce quil nest pas possible destimer la valeur
des quatre constantes de dissociation. La raison de cette impossibilit rside dans le
fait que le rapport [ EH ] [ HE ] = K11 K12 est une constante et est donc ind-
pendant de [ H + ] . Ainsi, aucune variation de [ H + ] ne produira un changement
de [ EH ] qui ne sera pas accompagn dun changement proportionnel de [ HE ] .
Il est par consquent impossible de savoir quelles sont les contributions
respectives de EH et de HE une proprit mesure.
270 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Pratiquement, nous devons donc traiter EH et HE comme une seule espce, dont
la concentration est donne par :
K +K
[ E ]0 11 + 12
[H ]
[ EH ] + [ HE ] =
K11 + K12 K11 K 22
1+ +
[H+] [ H + ]2 [8.27]
[ E ]0
=
[H+] K11 K 22
+1+
K11 + K12 ( K11 + K12 )[ H + ]
Cette quation peut tre crite sous la forme :
[ E ]0
[ EH ] + [ HE ] = [8.28]
[H+] K2
+1+
K1 [H+]
si deux nouvelles constantes, K1 et K2, sont dfinies comme suit :
([ EH ] + [ HE ])[ H + ]
K1 = K11 + K12 = [8.29]
[ HEH ]
K11 K 22 K 22 K 21 [ E 2 ][ H + ]
K2 = = = [8.30]
K11 + K12 K 22 + K 21 [ EH ] + [ HE ]
Ces constantes sont appeles les constantes de dissociation molculaires , pour les
distinguer des constantes microscopiques de dissociation de chacun des groupes,
K 11, K 12, K 21 et K22. Elles prsentent lavantage pratique de pouvoir tre mesures,
alors que les constantes microscopiques ne le sont pas.
Des expressions pour [ HEH ] et pour [ E 2 ] peuvent galement tre crites en
terme de constantes molculaires de dissociation :
[ E ]0
[ HEH ] = [8.31]
K1 K1 K 2
1+ +
[ H + ] [ H + ]2
[ E ]0
[ E2 ] = +
[8.32]
[H ] 2
[H+]
+ +1
K1 K 2 K2
Les quations [8.28], [8.31] et [8.32] expriment les concentrations des diffrentes
formes ioniques de lenzyme en fonction de la concentration totale denzyme,
[ E ]0 . Les dnominateurs de ces quations sont des fonctions ne dpendant que de
la concentration en proton libre et des constantes molculaires K1 et K 2 , qui sont
appeles les fonctions pH de MICHAELIS :
8 EFFETS DE LENVIRONNEMENT SUR LES ENZYMES 271
[ E ]0
[ HEH ] = [8.33a]
f
[ E ]0
[ HE ] + [ EH ] = [8.33b]
f
[ E ]0
[ E2 ] = [8.33c]
f 2
2
o les fonctions de MICHAELIS, f, f et f , sont donnes par les expressions
suivantes :
K1 KK
f = 1+ + 1 2 [8.34a]
[ H + ] [ H + ]2
[H+] K2
f
= 1+ + [8.34b]
K1 [H+]
2 [ H + ] [ H + ]2
f = 1+ + [8.34c]
K2 K1 K 2
Nous allons prsent examiner en dtails lquation [8.28] parce que de nombreux
enzymes se caractrisent par un profil dactivit en fonction du pH qui a la forme
dune courbe en cloche. Les courbes reprsentant les concentrations relatives des
espces HE et EHont cette forme caractristique (fig. 8.6). La figure 8.7 repr-
sente un ensemble de courbes en cloche pour diffrentes valeurs de (pK2 pK1).
1
Fraction de l'enzyme
dans la forme ionise une fois
0,8
0,6
0,4
0,2
1 0 1 2 3 4 5
0
4 6 8 10 12 pH
8.7 - Courbes en cloche
Les courbes ont t calcules partir de lquation [8.28] avec pK1 = 6,0 et pK2 allant de
5,0 11,0. Les chiffres indiqus dans la figure reprsentent les valeurs de pK2 pK1, la
quantit qui dtermine la forme de cette courbe. (Notons que le plateau aux alentours du
maximum est plus aplati pour les diffrences de pKa les plus importantes).
272 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Notons que les formes de ces courbes ne sont pas toutes identiques : le maximum
forme un plateau lorsque la valeur de (pK2 pK1) augmente, alors que le profil
ressemble un V invers lorsque cette valeur diminue ou devient ngative. La
valeur du maximum est infrieure 1 sauf si la valeur de (pK2 pK1) est suprieure
3. En consquence, les valeurs de pH pour lesquelles [ EH ] + [ HE ] prend
une valeur quivalant la moiti de sa valeur maximale ne correspondent pas pK1
et pK2. La relation entre la largeur mi-hauteur de la courbe et la valeur de
(pK2 pK1) est donne dans le tableau 8.1. Ce tableau permet de convertir les
mesures du pH pour lesquelles la valeur de lordonne est gale la moiti de sa
hauteur maximale en valeurs de pKa molculaire. Nanmoins, mme si les valeurs
de pK1 et pK2 sont estimes correctement, les valeurs des constantes individuelles
de dissociation restent indtermines, sauf si des arguments de plausibilit sont
invoqus, qui impliquent des hypothses invrifiables (DIXON, 1976)
Tableau 8.1 - Relation entre la largeur mi-hauteur et la valeur de pK2 pK1
pour des profils de pH ayant des formes de courbe en cloche
La mthode la plus pratique pour calculer la diffrence de pKa partir de la largeur mi-
hauteur est celle suggre par DIXON (1979) : elle dfinit la largeur mi-hauteur comme
2 log q ; alors pK2 pK1 = 2 log (q 4 + 1/q).
Bien que le tableau 8.1 autorise des valeurs ngatives de (pK2 pK1), celles-ci sont
seulement possibles si la libration des protons est cooprative, cest--dire si la
perte dun proton par un groupe augmente la tendance de lautre groupe perdre
son proton. Ce comportement nest pas impossible, mais pour des raisons lectro-
statiques celui-ci est improbable. En ralit, la plus petite valeur que (pK2 pK1)
puisse prendre sans impliquer de cooprativit est +0,6, qui correspond une
largeur mi-hauteur de 1,53. En pratique donc, des courbes en cloche plus abruptes
que cela sont trs rares.
8 EFFETS DE LENVIRONNEMENT SUR LES ENZYMES 273
Les courbes dactivit en cloche qui sont souvent observes pour les paramtres
enzymatiques V et V Km peuvent tre expliques par une simple extension de la
thorie de lionisation dun acide dibasique (le traitement du K m est plus com
plexe, comme nous le verrons). Le mcanisme fondamental est prsent dans la
figure 8.8. Lenzyme libre est encore trait comme un acide dibasique, H2E, avec
deux constantes de dissociation, KE1 et KE2, et le complexe enzyme substrat H2EA
se dissocie de manire similaire, impliquant galement deux constantes de
dissociation, KEA1 et K EA2. Uniquement le complexe ionis une fois, HEA, est capa-
ble de ragir pour former les produits. Comme nous allons partir de maintenant
travailler uniquement avec des constantes de dissociation molculaire, il nest plus
ncessaire de faire la distinction entre les deux formes possibles denzyme ionis
une fois, cest--dire que HE fait rfrence aux deux espces qui sont reprsentes
par HE et EH dans la figure 8.5 et dans les quations prcdentes. Il en va de
mme pour le complexe enzyme-substrat HEA.
A + H2E H2EA
KE1 KEA1
k1 k2
A + HE HEA HE + P
k1
KE2 KEA2
A + E2 EA2
8.8 - Enzyme avec deux groupes ionisables
Seules les espces dissocies une fois sont supposes disposer dune activit catalytique.
Si nous considrons que le schma de la figure 8.8 est une reprsentation satisfai-
sante dun mcanisme rel, nous pouvons tablir les quations de vitesse qui en
dcoulent. Sil ny a pas dtape dionisation et que HE et HEA sont les seules
formes de lenzyme, le mcanisme correspond un mcanisme ordinaire de
MICHAELIS et MENTEN, caractris par lquation de vitesse :
k 2 [ E ]0 [ A ] V [ A ]
v = = [8.35]
k 1 + k 2 Km + [ A ]
+ [ A]
k1
dans laquelle V = k [ E ] et K = ( k + k ) k sont des paramtres indpendants
2 0 m 1 2 1
du pH. Dans le modle de la figure 8.8, cependant, lenzyme libre nexiste pas
uniquement sous la forme HE et le complexe enzyme-substrat nexiste pas
uniquement sous la forme HEA. Lquation complte de vitesse a la mme forme
que celle de lquation [8.14], cest--dire :
V [ A]
v = [8.36]
Km + [ A ]
8 EFFETS DE LENVIRONNEMENT SUR LES ENZYMES 275
8.3.4. La dpendance au pH de Km
La variation de K m avec le pH est plus complexe que celle des autres paramtres,
puisque sa valeur dpend des quatre valeurs de pKa :
[H+] K
K m 1 + + E+2
K m f E KE 1 [ H ]
Km = = [8.48]
f EA [ H ] KEA 2
+
1 + +
KEA1 [ H + ]
Nanmoins, il est possible en principe dobtenir les 4 valeurs de pKa en portant en
graphique log K m en fonction du pH et en appliquant la thorie dveloppe par
DIXON (1953a). Pour comprendre ce graphique, il est prfrable de considrer
K m comme V divis par V Km , cest--dire de considrer log K m comme
log V log (V Km ) . Ainsi, une analyse de la manire dont log V et log (V Km )
varient avec le pH permet de comprendre naturellement la manire dont le Km
varie avec le pH. Il apparat clairement que, pour des concentrations leves de
proton (valeurs faibles de pH), lquation [8.46] se simplifie pour donner
V = V KEA1 [ H + ] et que pour des concentrations faibles (valeurs leves de pH),
elle se simplifie pour donner V = V [ H + ] KEA 2 . Si les valeurs de KEA1 et de KEA2
sont significativement diffrentes lune de lautre, il existe galement une rgion
278 CINTIQUE ENZYMATIQUE
logV
pKEA1 pKEA2
pH
log(V/Km)
pKE1 pKE2
pH
pKEA1
log(Km)
pKEA2
c
pKE1
pKE2
pH
8.9 - Interprtation des profils de pH en accord avec la thorie de DIXON (1953a)
Bien que les graphiques du logarithme de nimporte lequel des paramtres cintiques donne
toujours des courbes lisses, comme le montre les courbes en pointills, elles peuvent tre
utilement interprtes comme si elles taient constitues de segments de droites.
(a) Des variations de la pente du graphique de log V en fonction du pH refltent des ioni-
sations dans le complexe enzyme-substrat ; (b) des variations de la pente du graphique de
log (V /Km) en fonction du pH refltent des ionisations dans lenzyme libre ; (c) en principe
toutes les ionisations affectent Km dune manire qui est le plus facilement rationalise en
considrant le graphique de log Km comme le graphique de log V log( V /Km).
8 EFFETS DE LENVIRONNEMENT SUR LES ENZYMES 279
Une des raisons principales des tudes de dpendance au pH est de mesurer les
valeurs de pKa et partir de l, de dduire la nature chimique des groupes de len-
zyme qui participent la catalyse. Bien que cette pratique soit largement rpandue,
elle demande plus de prcautions quil ny parat, parce que les traitements simples
des effets du pH reposent sur des hypothses qui ne sont pas toujours vrifies.
KNOWLES (1976) a discut de manire critique les hypothses qui sont couram-
ment faites lors de linterprtation des profils de pH et a montr comment on peut
tre amen en tirer des conclusions errones ; sa revue devrait tre lue par
quiconque sintresse srieusement aux effets du pH sur les enzymes.
Ce ne sont pas seulement les hypothses quantitatives qui sont suspectes ; linter-
prtation qualitative dun profil de pH peut aussi tre trompeuse. Par exemple, bien
quune courbe en cloche puisse indiquer la ncessit pour deux groupes dexister
dans une forme ionique particulire, comme nous en avons discut dans les 8.3 et
8.4, ce nest pas la seule possibilit : dans certaines circonstances un groupe unique
impliqu dans diffrents tats dionisation dans deux tapes distinctes de la rac-
tion peut donner un comportement similaire (DIXON, 1973 ; CORNISH-BOWDEN,
1976a).
8 EFFETS DE LENVIRONNEMENT SUR LES ENZYMES 281
kcat/Km 300
(M1s1)
200
a - Ac-Phe-Phe-Gly
100
pK1 pK2
kcat/Km
(M1s1) 20
b - Ac-Phe-PheNH2
10
pK1 pK2
0
0 1 2 3 4 5 6 pH
8.10 - Dpendance au pH du paramtre kcat /Km pour les ractions dhydrolyse
catalyses par la pepsine, (a) de lactyl-L-phnylalanine-L-phnylalanylglycine et
(b) lactyl-L-phnylalanine-L-phnylalanin-amide (CORNISH-BOWDEN et KNOWLES, 1969)
La courbe en cloche obtenue rsulte dans ce cas dun changement dtape limitante
avec le pH (JENCKS, 1969) et au moins une des valeurs de pKa ne correspond
aucun groupement chimique. Ce type de pKa est gnralement appel pKa cintique
et ne donne aucune indication prcise quant au groupement impliqu dans le
mcanisme ractionnel. Dautres complications sont que la protonation ou la d-
protonation dun seul groupe dans ltat totalement actif peut conduire une perte
partielle dactivit, et que la perte totale de lactivit peut ncessiter plus dune
protonation ou dprotonation. Pour une discussion plus dtaille de ces effets com-
plexes du pH, nous renvoyons nos lecteurs larticle de TIPTON et DIXON (1979).
Par souci de simplicit, la raction catalytique est reprsente comme une simple
raction de second-ordre avec une constante k, telle que nous lobservons habituel-
lement pour de faibles concentrations de substrat. La constante dquilibre pour la
dnaturation varie avec la temprature en accord avec lquation de VANT HOFF
( 2.5.2) :
RT ln K = DG ' = DH ' TDS ' [8.49]
8 EFFETS DE LENVIRONNEMENT SUR LES ENZYMES 283
o R est la constante des gaz parfaits, T est la temprature absolue et DG' , DH '
et DS' sont respectivement lnergie standard de GIBBS, lenthalpie standard et
lentropie standard de la raction. Cette relation peut tre rarrange pour donner
une expression de K :
DS ' DH '
K = e R RT [8.50]
La constante de vitesse k pour la raction catalytique peut tre dfinie par
lquation dEYRING :
DG '
k T
k = B e RT [8.51]
h
o DG' est lnergie de GIBBS dactivation. La vitesse de la raction catalytique
est donne par v = k [ E ][ A ] , mais pour utiliser cette quation, la concentration
[ E ] de lenzyme actif doit tre exprime en termes de la concentration totale
[ E ]0 = [ E ] + [ E' ] et ainsi,
k [ E ]0 [ A ]
v = [8.52]
1+ K
La constante de vitesse observe, kobs, peut alors tre assimile k ( 1+ K ) , et elle
varie avec la temprature en accord avec lquation suivante :
k BT DG o'
exp
h RT
k obs = [8.53]
DS o' DH o'
1 + exp
R RT
Aux tempratures faibles, quand DS ' R est petit par rapport DH ' RT , le
terme exponentiel du dnominateur est insignifiant, et donc kobs varie avec la
temprature de la manire ordinaire prdite par lquation dEYRING. A des
tempratures suprieures DH ' DS ' , nanmoins, le dnominateur augmente
fortement avec la temprature et la vitesse de la raction diminue et tend
rapidement vers zro.
Bien que le modle soit simplifi, il montre pourquoi lquation dEYRING ne dcrit
pas le comportement des ractions enzymatiques hautes tempratures. Dans la
littrature ancienne, il tait habituel de rapporter loptimum de temprature des
enzymes, et cela se rencontre encore occasionnellement de nos jours. Cependant, la
temprature laquelle kobs est maximum na aucune signification particulire,
puisque le dpendance la temprature des ractions catalyses par les enzymes
varient souvent avec les conditions exprimentales. En particulier, plus longtemps
le mlange ractionnel est incub avant lanalyse et plus l optimum de
284 CINTIQUE ENZYMATIQUE
temprature est bas (figure 8.12). Cet effet s'explique parce que la dnaturation est
souvent une raction lente, de telle sorte quelle ne peut tre correctement traite
comme un quilibre. Lavancement de la dnaturation ds lors augmente avec le
temps dincubation. Ceci ne devrait nanmoins plus poser de problmes avec les
techniques exprimentales modernes, puisque dans les mesures en continu, les
processus dpendants du temps sont aisment mis en vidence.
Avancement de la raction (%)
Vitesse 4 1 min
15
(%/min)
2 2 min
4 min
7 min
0 70
10 0 20 40 60 Temprature (C)
60
50
40
30
5
20
10
0
0
0 2 4 6 8 Temps (min)
8.12 - Effet de linactivation par la chaleur sur la dpendance la temprature
des vitesses des ractions catalyses par un enzyme
Si la vitesse initiale est considre comme la vitesse moyenne mesure pendant une
priode fixe, comme par exemple 1, 2, 4 ou 7 minutes (indique par les lignes en pointills),
la dpendance la temprature aura lallure dune courbe en cloche passant par un
maximum une temprature qui varie avec la priode utilise, comme illustr dans linsert.
effets de la pression qui permet de dterminer les variations de volume que subit le
systme lors dune raction.
Les effets de la pression 1 sont gouverns par le principe de LE CHATELIER qui dit
quun systme lquilibre soumis une perturbation, ragit dune manire qui
tend minimiser les effets de cette perturbation. Une augmentation de la pression
favorise donc la rduction du volume du systme. Lquation [2.18] indique que
lnergie libre dun systme dpend du produit de la pression et du volume. A
temprature constante, la variation de volume, qui est dfinie comme la diffrence
entre le volume final et le volume initial, est donne par lquation suivante :
ln K
DV = V p VA = DG = RT [8.54]
p T p T
Une expression similaire peut tre obtenue pour la constante de vitesse k dun
processus lmentaire, qui relie k aux paramtres dactivation, avec DV repr-
sentant la diffrence entre le volume de ltat de transition et celui de ltat fonda-
mental. Les valeurs de DV et de DV peuvent tre obtenues en portant en graphique
respectivement ln K ou lnk en fonction de la pression, p.
Les tudes de leffet de la pression sur des systmes biologiques sont moins
courantes que celles de leffet de la temprature, dune part parce quelles nces-
sitent un quipement moins courant quun bain thermostatique et dautre part parce
que les concepts de base des effets de la pression sur les ractions chimiques et sur
la structure des macromolcules sont moins bien apprhends, que ceux des effets
de la temprature. Cependant, ltude des effets de la pression prsente lavantage
que cette dernire naffecte que le volume du systme tudi, contrairement la
temprature qui affecte la fois lnergie interne et le volume du systme.
Linterprtation des volumes de raction et dactivation est gnralement prsente
en termes de contributions intrinsques et de contributions du solvant. Des effets de
compensation peuvent alors masquer certains changements et compliquer lanalyse
de ractions complexes comme les ractions enzymatiques. Les contributions
intrinsques peuvent rsulter de changements dans la densit de compaction de la
protine ou de la formation ou de la rupture de liaisons covalentes. La formation
des liaisons covalentes a un DV de lordre de 10 mL mol1, alors que les valeurs
de DV pour les changes de liaison ou les changements dangles sont pratiquement
nulles. Les variations de volume provenant de modifications de la densit de
compaction sont difficiles mesurer mais sont considres comme faibles. Ainsi en
absence de formation ou de rupture de liaisons covalentes, les contributions les
plus importantes proviennent de changements de ltat dhydratation des interac-
tions non-covalentes.
Ltude des changements de volume dans les diffrentes tapes dun processus
catalytique fournit des donnes complmentaires celles obtenues par dautres
mthodes. Toutefois, la variation du volume dactivation pour les ractions enzy-
matiques impliquant plusieurs tapes peut tre complexe et inclure des change-
ments de volume dans ltape qui dtermine la vitesse mais aussi dans ltape de
fixation du substrat et dans toutes les tapes qui prcdent ltape limitant la
vitesse.
Une tude dtaille des variations de volume accompagnant les diffrentes tapes
dune raction enzymatique a t ralise pour la raction de conversion du
288 CINTIQUE ENZYMATIQUE
fumarate (F) en L-malate (M) catalyse par la fumarase (BUTZ et al., 1988). Cette
raction suit un mcanisme ractionnel simple :
E+F EF EM E+M [8.55]
La formation des tats de transition des ractions de fixation des ractifs sur
lenzyme saccompagne dune rduction du volume du systme alors que la for-
mation de ltat de transition partir du complexe enzyme-substrat ou du complexe
enzyme-produit saccompagne dune augmentation du volume (figure 8.13). Ces
variations peuvent sexpliquer par lexistence dun changement de conformation de
lenzyme qui permet au substrat de pntrer dans le site actif. De plus, des
molcules deau sont libres parce que lorientation correcte du substrat dans le
site actif implique la formation de paires dions qui rsultent dune augmentation
du volume en passant de ltat de transition au complexe EF ou EM. Finalement le
volume dactivation pour la raction de conversion du fumarate en L-malate au sein
du complexe enzyme-substrat a un volume suprieur celui du systme de dpart.
Cette augmentation additionnelle du volume associe lhydratation du fumarate et
la dshydratation du L-malate, indique que ltat de transition a un volume plus
grand. Dans ce systme, le volume passe par un maximum ou un minimum dans les
tats de transition, alors que le volume des complexes enzyme-substrats est
similaire celui de lenzyme libre. Il faut nanmoins noter que les changements de
volume au cours de la raction enzymatique sont faibles par rapport au volume
total de lenzyme (environ 0,3%).
Volume 40
(mL.mol1)
[EA][EB]
20
V2 V2
0
E+A E+B
EA EB
20
V1 V1 V3 V3
40
60 [EA] [EB]
Coordonnes de la raction
8.13 - Effets de la pression sur une raction enzymatique
Les variations de volume pour les deux tapes de fixation des substrats et des produits et
pour la raction chimique sont celles mesures pour la raction de conversion du fumarate
en L-malate. La figure est dessine partir des donnes de BUTZ et al. (1988).
8 EFFETS DE LENVIRONNEMENT SUR LES ENZYMES 289
Bien que les effets isotopiques aient t traits dans le chapitre 7 ( 7.6 et 7.7), les
effets dus la substitution isotopique du solvant (SCHOWEN, 1972) sont discuts ici
puisquil est plus appropri de les considrer comme des effets de lenvironnement,
en particulier parce que les processus rellement responsables des effets isoto-
piques du solvant sont les mmes que ceux qui dterminent le comportement du
pH, cest--dire les quilibres impliquant les hydrons dfinition 2. Ltude de ces
effets partage galement quelques autres proprits avec les tudes de dpendance
la temprature, tant exprimentalement simple raliser, mais difficile inter-
prter correctement sauf si ltape tudie du mcanisme est clairement identifie.
Une simple mesure de la vitesse de la raction dans 1H2O et dans 2H2O ne rvle
quasiment rien du mcanisme, mais la mesure de la vitesse en fonction de la
fraction molaire de 2H2O dans des mlanges isotopiques de composition varie peut
tre beaucoup plus informative. Navement, nous pourrions nous attendre ce que
la valeur dune constante de vitesse dans de tels mlanges puisse tre obtenue par
interpolation linaire entre les valeurs mesures dans 1H2O et dans 2H2O, mais la
dpendance est presque toujours non-linaire, et la forme de la courbe peut rvler
des informations sur le mcanisme.
Considrons un mlange de 1H2O et de 2H2O dans lequel la fraction molaire de
2
H2O est n, de telle sorte que le rapport [ 2H 2 O ] [ 1H 2 O ] est gal n ( 1 n ) .
Pour un hydron changeable dans une molcule de ractif AH, le rapport
deutron proton sera aussi donn par [ 2H 2 O ] [ 1H 2 O ] = n ( 1 n ) si les cons-
tantes dquilibre pour les protons et les deutrons sont les mmes. Une slection
sexercera cependant de telle sorte que le rapport rel est f n ( 1 n ) o est le
facteur de fractionnement pour la position changeable. De tels changes
dhydrons peuvent se drouler non seulement dans les molcules de ractifs
mais galement dans ltat de transition de la raction : dans cet tat de transition
il existe un rapport similaire deutron/proton, f n ( 1 n ) o f reprsente le
facteur de fractionnement pour la mme position changeable. La vitesse totale
de la raction est alors donne par la somme des vitesses pour les espces
protones et deutres de telle sorte que la vitesse est proportionnelle
2. En chimie, dans la plupart des cas, le terme proton est utilis pour dsigner la
fois le noyau 1H et le noyau de nimporte lequel des isotopes de lhydrogne, mais
cette pratique nest plus satisfaisante lorsquil sagit de discuter les effets des
isotopes de lhydrogne. Dans les contextes o une plus grande prcision est
ncessaire, la Commission de Chimie Organique Physique de lIUPAC (1988) a
recommand le terme hydron pour dsigner nimporte quel noyau dhydrogne
sans aucune considration pour lisotope, rservant le terme proton pour le
noyau 1H et le terme deutron pour le noyau 2H. Nous suivrons cette recom-
mandation dans la suite de cette section.
290 CINTIQUE ENZYMATIQUE
tivement diffrentes de lunit (les autres peuvent toujours tre incluses mais elles
8 EFFETS DE LENVIRONNEMENT SUR LES ENZYMES 291
PROBLMES
8.1 - Pour un enzyme dont le Km dpend dun seul groupe ionisable, avec des
valeurs de pKa, pKE dans lenzyme libre et pKEA dans le complexe
enzyme-substrat, lquation [8.48] se simplifie sous la forme suivante :
( K E + [ H + ])
K m = K m .
( K EA + [ H + ])
a - A quel pH le graphique de Km en fonction du pH prsente-t-il un point
dinflexion ?
b - A quel pH le graphique de 1 Km en fonction du pH prsente-t-il un
point dinflexion ? [Si vous avez des difficults admettre ce rsultat,
calculez K m et 1 Km plusieurs valeurs de pH dans la gamme com-
prise entre 3 et 10, en supposant que pKE = 6,0 et que pKEA A = 7,0, et
tracez les graphiques de ces paramtres en fonction du pH. Pour une
discussion des principes qui sont lorigine de ce problme, voir
FERSHT (1985)].
8.2 - Linterprtation dun graphique de log K m en fonction du pH est simpli-
fie en utilisant la relation log Km = logV log (V Km ) dans laquelle K m, V
292 CINTIQUE ENZYMATIQUE
S'il est clair que tous les organismes vivants ncessitent un contrle efficace des
processus mtaboliques afin de permettre des changements ordonns tout en vitant
une progression catastrophique vers lquilibre thermodynamique, il est moins
vident de raliser que les enzymes dcrites dans les chapitres prcdents ne sont
pas capables de fournir le degr de contrle ncessaire.
La conversion du fructose 6-phosphate en fructose 1,6-biphosphate fournit une
excellente illustration de ce problme essentiel permettant de discuter des propri-
ts de lenzyme qui sont ncessaires pour quune rgulation efficace soit possible.
La conversion du fructose 6-phosphate en fructose 1,6-biphosphate ncessite de
lATP :
Fructose 6-phosphate + ATP Fructose-1,6-biphosphate + ADP [9.1]
Cette raction est catalyse par la phosphofructokinase et constitue la premire
tape de la glycolyse qui soit unique cette voie mtabolique cest--dire qu'elle
ne fait partie daucune autre voie mtabolique. Elle reprsente donc une tape
adapte pour la rgulation de la glycolyse, et, bien qu'aujourd'hui ( 10.5) la
recherche dun site unique de rgulation dune voie mtabolique soit considre
comme une simplification, il ne fait aucun doute que la phosphofructokinase
contribue de manire importante au contrle de la glycolyse dans la plupart des
cellules.
Dans des conditions physiologiques la raction catalyse par la phosphofructo-
kinase est essentiellement irrversible, et comme le fructose 1,6-biphosphate doit
tre convertit en fructose 6-phosphate lors de la noglucogense, une raction
diffrente doit tre utilise, une raction hydrolytique catalyse par la fructose
biphosphatase :
Fructose 1,6-biphosphate + H2O Fructose 6-phosphate + Pi [9.2]
294 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Cette raction est aussi quasiment irrversible. Lexistence de deux ractions irr-
versibles parallles revt une grande importance dans le contrle mtabolique : elle
signifie que la direction du flux entre les deux mtabolites peut tre dtermine par
une rgulation diffrentielle de lactivit des deux enzymes. Une simple raction
rversible ne pourrait pas tre contrle de cette manire, parce quun catalyseur ne
peut pas modifier la direction du flux dune raction, qui est dtermin uniquement
par des considrations thermodynamiques. Les catalyseurs modifient uniquement
la vitesse laquelle lquilibre est atteint.
Si la phosphofructokinase et la fructose biphosphatase se comportaient de manire
non-contrle, en catalysant les ractions la mme vitesse, il ny aurait aucune
conversion nette du fructose 6-phosphate et du fructose 1,6-biphosphate, mais une
hydrolyse continue de lATP, qui conduirait ventuellement la mort de lorga-
nisme. Cette situation est connue sous le nom de cycle futile. Pour lviter, soit les
deux processus doivent avoir lieu dans des cellules diffrentes (ou dans des
compartiments cellulaires diffrents), soit les deux enzymes doivent tre contrls
de manire telle que lun nest actif que lorsque lautre est inhib. De nombreux
cycles potentiels sont contrls par la compartimentation, mais ce nest pas tou-
jours possible et donc un contrle alternatif est ncessaire. Cest par exemple le cas
de tissus comme le foie qui catalysent la fois la glycolyse et la noglucogense.
Le terme cycle futile a t dlaiss dans les trois dernires dcennies, en raison
de la dcouverte de lexistence de nombreux cycles et parce que ceux-ci ne sont
pas ncessairement prjudiciables la cellule. Comme nous en discuterons dans le
10.9.2, les cycles entre formes actives et inactives des enzymes peuvent cons-
tituer un mcanisme extrmement sensible de rgulation de lactivit catalytique
qui compense trs largement le faible cot d lhydrolyse de lATP. Mme
lorsque le rsultat principal dun cycle est de produire de la chaleur, il peut diffici-
lement tre qualifi de futile sil permet un animal sang chaud de maintenir
la temprature ncessaire la vie ou sil permet au bourdon de voler (et de col-
lecter le nectar) par temps froid.
Dans le contexte cellulaire, il est vident que lactivit des protines et des en-
zymes en particulier, doit tre strictement rgule de sorte que ceux-ci remplissent
leur fonction au bon moment et au bon endroit. Tout dabord, il faut rappeler que
lactivit dun enzyme est dtermine par sa structure et donc par sa squence.
Nanmoins lactivit biologique des protines peut tre rgule diffrents niveaux
et par diffrents mcanismes. Il est possible de distinguer des mcanismes extrin-
sques de rgulation, qui nagissent pas directement sur lactivit dun enzyme
donn, et des mcanismes intrinsques qui modifient directement lactivit dun
enzyme donn.
9 CONTRLE DE LACTIVIT ENZYMATIQUE 295
Nous devons maintenant nous demander si un enzyme qui obit aux lois ordinaires
de la cintique enzymatique peut tre rgul suffisamment prcisment pour viter
les cycles futiles. Pour un enzyme qui obit lquation de MICHAELIS et MENTEN,
v = V [ A ] ( Km + [ A ]) , un simple calcul montre que la vitesse est gale 0,1
quand [ A ] = Km 9 et quelle est gale 0,9 V quand [ A ] = 9 Km . En dautres
termes, une norme augmentation de la concentration de substrat, 81 fois, est
ncessaire pour provoquer une augmentation modeste de la vitesse de 10% 90%
de la vitesse limite.
Un rsultat essentiellement similaire est obtenu pour linhibition simple. Supposons
quune raction soit inhibe de manire comptitive en accord avec lquation
V [ A]
v= . Le rapport des vitesses en prsence (n ) et en absence
[ I ]
Km 1 + + [ A]
Kic
Km + [ A ]
(n0) dinhibiteur peut scrire v = qui a une valeur de 0,1
v0 [ I ]
Km 1 + + [ A]
Kic
[ A] Kic [ A ]
quand [ I ] = 9 Kic 1 + et de 0,9 quand [ I ] = 1 + : encore une
Km 9 Km
fois, une variation de la concentration de 81 fois est ncessaire pour balayer la
gamme allant de 10% 90% de la vitesse limite.
Mme si nous considrons leffet de deux ou de plusieurs inhibiteurs agissant
en parallle, la mme conclusion quantitative simpose : une grande variation de
lenvironnement a des effets modestes sur la vitesse de la raction. Cest pourtant
exactement loppos de ce qui est ncessaire pour une rgulation efficace du
mtabolisme ; dun ct la concentration des principaux mtabolites doit tre main-
tenue dans des limites troites, et dun autre ct les vitesses de raction doivent
tre susceptibles de varier normment probablement plus que la gamme allant
de 10 90% que nous venons d'voquer en rponse des fluctuations
lintrieur de ces limites troites.
9 CONTRLE DE LACTIVIT ENZYMATIQUE 297
9.1.4. La cooprativit
0,8
0,2
0
2 1 0 1 log[A]
0
0 2 4 6 8 10
[A] (units arbitraires)
9.1 - Comparaison dune courbe hyperbolique de la vitesse en fonction
de la concentration de substrat avec deux courbes sigmodes (coopratives),
calcules avec des coefficients de HILL (voir 9.2.1 ci-dessous) de 2 et de 4
Il faut noter que toutes ces courbes sont sigmodes quand elles sont retraces comme une
fonction du log [ A ] (insert) mais les courbes coopratives sont plus pentues.
298 CINTIQUE ENZYMATIQUE
1. La traduction littraire est un autre solide , mais une forme diffrente trans-
met mieux lide essentielle que linhibition ne rsulte pas dune quelconque simi-
larit structurale entre le substrat et leffecteur.
9 CONTRLE DE LACTIVIT ENZYMATIQUE 299
[ ]
Lquation [9.5] montre quun graphique de log v ( V v ) en fonction de log [ A ]
est linaire avec une pente gale h. Ce graphique, illustr dans la figure 9.2, est
appel un graphique de HILL. Il fournit un moyen simple dvaluer les valeurs de h
et de K 0h,5 . Ce graphique de HILL permet de reprsenter une grande varit de
donnes de cintique cooprative pour des valeurs de v V comprises entre 0,1 et
0,9, malgr que des dviations soient toujours visibles aux extrmits du graphique
(comme le montre la figure 9.2) parce que lquation [9.3] nest seulement quune
approximation acceptable dune relation plus complexe.
0,5
1
0
0 4 8 [A]
90%
Asymptotes saturation
0 de pente = 1
Aux extrmits
les points s'cartent
de la droite
de pente = 1
1
10%
saturation
2
1 0 1 log[A]
9.2 - Graphique de HILL
en insert, le graphique correspondant en coordonnes linaires
Les droites sont calcules partir de lquation de HILL [9.13] mais les points sont calcu-
ls partir dune fonction raliste de fixation. Comme lquation de HILL reprsente au mieux
une approximation, nous devrions toujours nous attendre ce que les valeurs observes
tendent vers une pente de un aux extrmits de la gamme de [ A ], quelle que soit la pente
de la rgion centrale. Cependant, mme en absence derreur exprimentale, les dviations
de la linarit sont souvent faibles, en particulier dans la partie de la courbe comprise
entre 10 et 90% de la saturation, qui correspond la partie non-ombre du graphique.
MENTEN), h = 1 et donc une cooprativit positive signifie que h est plus grand
que 1. Une cooperativit ngative, avec h infrieur 1, est aussi observe avec
certains enzymes, bien que cette situation soit moins commune (du moins pour des
enzymes purifis), et que son rle physiologique soit moins clair.
Lindex de cooprativit, Ra, introduit par TAKETA et POGELL (1965) est moins
couramment utilis que le coefficient de HILL, mais il prsente les avantages
davoir une signification exprimentale plus claire et dtre toujours trait comme
un paramtre purement empirique, ce qui vite toute confusion avec des paramtres
issus de modles dont la validit est douteuse. Ce paramtre est dfini comme le
rapport des valeurs de [ A ] pour lesquelles v V = 0,9 et v V = 0,1. La relation
entre Ra et h est obtenue en substituant successivement ces deux valeurs de v V
dans lquation [9.3] :
[ A ]0h,9
0 ,9 = [9.6]
( K0h,5 + [ A ]0h,9 )
[ A ]0h,1
0 ,1 = [9.7]
( K0h,5 + [ A ]0h,1 )
et en rsolvant pour les deux valeurs de [ A ] :
[ A ]0 ,9 = 91 h K0 ,5 [9.8]
K0 ,5
[ A ]0 ,1 = [9.9]
91 h
Ensuite, la valeur de Ra est facilement obtenue comme le rapport [ A ]0 ,9 [ A ]0 ,1 :
Ra = 811 h [9.10]
Les enzymes non-coopratifs se caractrisent par une valeur de Ra = 81, alors que
les enzymes coopratifs ont des valeurs de Ra, infrieures 81 et les enzymes
cooprativit ngative ont des valeurs suprieures 81. Cette relation nest pas plus
prcise que lquation [9.3], bien entendu, mais elle est adapte la plupart des
situations rencontres. Quelques valeurs reprsentatives de Ra sont prsentes dans
le tableau 9.1.
h Ra Description
0,5 6560
0,6 1520
0,7 533 Cooprativit ngative
0,8 243
0,9 132
1,0 81 Non-coopratif
1,5 18,7
2,0 9,00
2,5 5,80 Cooprativit positive
3,0 4,33 (gamme normale pour des enzymes individuels)
3,5 3,51
4,0 3,00
5,0 2,41
6,0 2,08
8,0 1,73
10 1,55
Cooprativit extrme
15 1,34
(en dehors de la gamme accessible pour des enzymes individuels)
20 1,25
50 1,092
100 1,045
1000 1,0044
Le tableau montre la relation entre le coefficient de HILL, h, et lindex de cooprativit Ra.
Les valeurs sont calcules en faisant lhypothse que lquation de HILL (quation [9.3])
est valable. Trs peu denzymes individuels prsentent une cooprativit suprieure celle
obtenue pour 4. Cependant, il ny a presque aucune limite la sensibilit de la rponse qui
rsulte de laction de cascades denzymes convertibles et la partie infrieure du tableau
est ajoute pour faciliter la discussion de systmes de ce genre.
En principe, les mmes arguments sappliquent aux enzymes qui nobissent pas
aux lois de MICHAELIS et MENTEN. Une seule concession peut tre faite dans le cas
des enzymes coopratifs. Nous pouvons supposer que lacquisition dune activit
catalytique leve a eu moins dimportance au cours de lvolution que lacquisi-
tion dun comportement rgul. Ainsi, il est un peu moins vident que les cons-
tantes de vitesse catalytiques de ces enzymes aient volu jusqu atteindre les
limites imposes par la chimie tout en restant lintrieur des contraintes imposes
par la structure. De toute manire, il est virtuellement impossible dobtenir des
quations de vitesse utilisables pour un systme coopratif, moins que des
hypothses soient introduites pour simplifier le systme. Lhypothse de ce type la
plus couramment utilise consiste considrer que la fixation du substrat est
9 CONTRLE DE LACTIVIT ENZYMATIQUE 303
Si la mme raction chimique se droule indpendamment dans les deux sites avec
des constantes de vitesse k1 et k2, chaque site obira alors de faon indpendante au
modle de MICHAELIS et MENTEN avec une constante de MICHAELIS gale la
constante de dissociation approprie, et avec une vitesse globale correspondant la
somme des vitesses pour les deux sites :
k [ E ]0 [ A ] k 2 [ E ]0 [ A ]
v = 1 + [9.11]
Ks 1 + [ A ] Ks 2 + [ A ]
La vitesse limite est la somme des vitesses limites pour chacun des deux
sites, c'est--dire V = k1 [ E ]0 + k 2 [ E ]0 . Si nous supposons, par simplicit, que
les constantes catalytiques sont gales, alors nous pouvons crire que
k1 [ E ]0 = k 2 [ E ]0 = V 2 , et lquation [9.11] peut tre crite de la faon suivante :
v [ A] [ A]
= + [9.12]
V 2 Ks 1 + [ A ] Ks 2 + [ A ]
Cette quation correspond lanalyse de la dissociation de proton en termes de
constantes de dissociation ( 8.2.4), mais le mme modle peut tre exprim en
fonction des constantes de dissociation molculaire ( 8.2.5) :
304 CINTIQUE ENZYMATIQUE
[ A ] [ A ]2
+
v = K1 K1 K 2
[9.13]
V 2[ A ] [ A ] 2
1+ +
K1 K1 K 2
Dans lquation [9.13], K1 caractrise la fixation de la premire molcule de
substrat (sans tenir compte du site) et K2 caractrise la fixation de la seconde
molcule, c'est--dire K1 = ( 2[ E ][ A ]) [ EA ] et K 2 = ([ EA ][ A ]) 2[ EA2 ] . La
relation entre ces constantes et les constantes de dissociation pour chaque site est
donne ci-dessous dans lquation [9.16]. Lquation [9.13] est connue sous le nom
dquation dADAIR, puisque ADAIR (1925) a exprim la fixation de loxygne sur
lhmoglobine en utilisant une quation de la mme forme gnrale. Cette premire
quation tait nanmoins crite pour quatre sites de fixation plutt que pour deux,
puisque lhmoglobine peut fixer jusqu quatre molcules doxygne :
[ A ] 3[ A ] 2 3[ A ]3 [ A ]4
+ + +
K1 K1 K 2 K1 K 2 K3 K1 K 2 K3 K 4
Y = 2
[9.14]
4[ A ] 6[ A ] 4[ A ]3 [ A ]4
1+ + + +
K1 K1 K 2 K1 K 2 K3 K1 K 2 K3 K 4
En plus dtre crite pour quatre sites de fixation, lquation [9.14] se caractrise
par le remplacement du paramtre v V par un paramtre Y, appel fraction de
saturation parce quil reprsente la fraction des sites de fixation qui sont occups
par le ligand. Tout ceci dcoule du fait que dans une authentique exprience de
fixation, il ny a pas de vitesse, et par consquent pas de vitesse limite. Nanmoins,
parce quil est difficile de mesurer directement la fixation dun ligand avec une
prcision suffisante, une pratique courante consiste mesurer dautres variables,
que se soient des vitesses ou des signaux spectroscopiques, pour ensuite les inter-
prter comme des mesures de fixation. Dans le cas de la mesure de vitesses, nous
avons dj discut dans le prcdent du problme de dterminer si la raction de
fixation peut tre considre dans un tat dquilibre ou dans un tat stationnaire, et
nous ne reviendrons donc pas sur ce point. Un second problme est de savoir si une
mesure de v V peut tre assimile une mesure de Y. Cette assimilation revient
supposer que tous les sites actifs ont la mme constante catalytique : nous avions
fait cette hypothse pour passer de lquation [9.11] lquation [9.12], mais
aucune raison ne permet daffirmer que cette supposition est gnralement vraie,
dautant quelle devient de moins en moins plausible lorsque nous considrons des
modles comportant un plus grand nombre de sites de fixation et des diffrences
plus marques entre leurs constantes de fixation. La mme complication survient si
un signal spectroscopique est trait comme une mesure de fixation ; le problme est
nanmoins moins critique puisque, si la variation entre les constantes catalytiques
pour diffrents sites peut tre importante, il est raisonnable de supposer que les
effets spectroscopiques de la fixation sont similaires pour les diffrents sites
concerns, mme sils ne sont pas tout fait identiques.
9 CONTRLE DE LACTIVIT ENZYMATIQUE 305
Il est utile dexaminer lquation [9.14], lquation pour quatre sites de fixation,
puisquelle illustre mieux que lquation [9.13] la forme gnrale de lquation
dADAIR pour un nombre arbitraire n de sites, et quelle montre de manire plus
explicite que les coefficients numriques du numrateur (1,3,3,1) et du dnomi-
nateur (1,4,6,4,1) sont respectivement les coefficients binomiaux de n 1 et de n.
( n 1 )!
Les coefficients du numrateur sont donns par pour i allant de 0
i!( n 1 i )!
( n )!
n 1, et les coefficients du dnominateur sont donns par pour i allant
i!( n i )!
de 0 n. Ces coefficients sont souvent considrs comme des facteurs statis-
tiques . Ainsi, il existe quatre faons de fixer une molcule de substrat sur une
molcule denzyme possdant quatre sites vacants, mais une seule faon de disso-
cier une molcule de substrat partir dun complexe ayant fix une seule mol-
cule de substrat : de cette situation rsulte le facteur 4/1 (cest--dire 4) du dno-
minateur. De la mme manire, il existe trois faons de fixer une seconde molcule
de ligand, mais uniquement deux faons de dissocier une molcule partir dun
complexe ayant fix deux molcules. Il en rsulte que le facteur 4 prcdent est
multipli par 3/2, donnant un facteur 6, et ainsi de suite.
La manire particulire utilise ici pour crire lquation dADAIR, dans les
quations [9.13] et [9.14], est choisie de sorte que les constantes de dissociation
soient gales si tous les sites sont identiques et ninteragissent pas. Cette proprit
est trs utile si nous souhaitons quantifier le degr de divergence par rapport cette
simple supposition. Les constantes dfinies de cette manire sont parfois appeles
des constantes intrinsques, mais parce que ce nom est galement employ pour
dsigner les paramtres que nous avons appels constantes de dissociation dun
groupe, nous viterons son emploi. Diverses variantes dans lcriture de lquation
d'ADAIR sont rencontres dans la littrature, qui utilisent des coefficients num-
riques diffrents (de telle sorte que les constantes de dissociation ne sont plus
gales les unes aux autres, mme dans le cas le plus simple), ou qui utilisent des
constantes dassociation plutt que de dissociation, ou encore dans lesquelles les
produits de constantes dassociation sont remplacs par des symboles spciaux,
comme par exemple : Y3 1 . Lutilisation des constantes dassociation est
K1 K 2 K3
une pratique courante dans la littrature concernant lhmoglobine et dans dautres
publications dont laccent est mis sur la fixation plutt que sur la cintique.
Considrant, dans un souci de simplicit, le cas dun enzyme deux sites de fixa-
tion, la relation entre les constantes molculaires de dissociation de lquation
[9.13] et les constantes de dissociation des deux groupes de lquation [9.12] peut
tre obtenue en comparant lquation [9.13] avec une autre version de lqua-
tion [9.12] :
306 CINTIQUE ENZYMATIQUE
( Ks 2 + Ks1 )[ A ] [ A ] 2
+
v = 2 Ks 1 Ks 2 Ks 1 Ks 2
[9.15]
V ( Ks 2 + Ks1 )[ A ] [ A ] 2
1+ +
Ks 1 Ks 2 Ks 1 Ks 2
Ainsi : 1 = 1 1 + 1 [9.16a]
K1 2 Ks 1 Ks 2
K 2 = 1 ( Ks 1 + Ks 2 ) [9.16b]
2
c'est--dire que K1 est la moyenne harmonique et K2 la moyenne arithmtique des
constantes de dissociation de chaque groupe.
Il est vident, partir de la conception ordinaire de la moyenne, que les valeurs de
K1 et K2 sont gales lune lautre et aux constantes de dissociation des groupes, si
ces dernires sont gales lune lautre. Une relation plus intressante est celle
obtenue lorsque les constantes de dissociation de chacun des groupes sont diff-
rentes. Celle-ci est obtenue en considrant le rapport K 2 K1 obtenu partir des
quations [9.16a] et [9.16b] :
K2 K K
= 1 2 + s 2 + s1 [9.17]
K1 4 Ks 1 Ks 2
Puisque le deuxime et le troisime termes de cette quation varient de manire
oppose quand le rapport Ks 2 Ks1 varie, nous pourrions imaginer, premire vue,
que la valeur du rapport K 2 K1 peut tre soit plus grande, soit plus petite que 1.
En fait, la situation est plus simple parce que pour un nombre positif et sa rci-
proque, le nombre le plus grand est plus loign de 1 que ne lest le plus petit (par
exemple 3 est plus loign de 1 que ne lest 1/3) et, en consquence, la somme
dfinie par lquation [9.17] ne peut pas tre infrieure 1 ou :
K1 K 2 [9.18]
Pratiquement, cela signifie que la seconde molcule se fixera toujours moins
fermement que la premire, exactement comme nous le prsentons dans les
expriences de la vie courante avec des objets notre chelle : il est plus facile de
dtacher quelque chose qui est attach de manire peu solide que quelque chose qui
est fix plus fermement.
Les implications de lquation [9.18] pour la cooprativit ne sont pas faciles
driver algbriquement, mme en utilisant lindex de cooprativit de TAKETA et
POGELL ( 9.2.2), parce que, rsoudre lquation 9.13 pour [ A ] aprs avoir fix
v V gal 0,1 ou 0,9, conduit des expressions dont les significations ne sont
pas claires. Nanmoins, il est facile de dmontrer numriquement, en calculant les
courbes pour diffrentes valeurs de K 2 K1 , quaussi longtemps que lquation
[9.18] est respecte, le rsultat est toujours une cooprativit ngative, c'est--dire
que Ra > 81 ou que h < 1 (voir lquation [9.10]). En conclusion, lhypothse
9 CONTRLE DE LACTIVIT ENZYMATIQUE 307
implique dans le schma de la figure 9.3 ne permet pas dexpliquer une coop-
rativit positive. Le problme ne rside pas dans l'hypothse dune fixation sur
deux sites, qui est raisonnable, mais rside dans l'hypothse que la fixation est
indpendante, c'est--dire quun processus de fixation na pas dinfluence sur
lautre. En exprimant cela de manire oppose, nous pouvons dire que lorsque nous
observons une cooprativit positive, nous pouvons tre certain que la fixation sur
des sites diffrents nest pas indpendante. (La cooprativit ngative peut gale-
ment impliquer des interactions entre les sites, mais, linverse de la cooprativit
positive, cette implication nest pas obligatoire.)
Lquation dADAIR, [9.13], est plus gnrale que le modle partir duquel nous
lavons drive, puisquelle peut toujours dfinir le comportement du systme
mme si lquation [9.18] nest pas respecte. En pratique, elle est le plus souvent
utilise pour dcrire une cooprativit positive quune cooprativit ngative. Elle
permet de donner une dfinition mcanique de la cooprativit qui peut tre
compare avec la dfinition purement empirique en terme de Ra ( 9.2.2) ou avec la
dfinition pseudo-mcanique en termes de h ( 9.2.1). Dun point de vue qualitatif,
les trois dfinitions sont quivalentes, du moins si nous considrons uniquement
des enzymes deux sites de fixation : si nous dfinissons la cooprativit positive
par la relation K2 < K1, alors cela implique que Ra < 81 et que h > 1. Les choses se
compliquent lorsquil existe plus de deux sites de fixation, puisquil est possible,
avec des quations telles que lquation [9.14], davoir des relations telles que
K1 > K2 K3 < K4 comme cest le cas pour la fixation du NADox sur la glycral-
dehyde-3-phosphate dshydrognase de la levure (COOK et KOSHLAND, 1970).
Dun point de vue mcanique, cest clairement un mlange de cooprativit
positive et de cooprativit ngative, mais un tel mlange nest pas possible avec le
paramtre Ra, puisque ce dernier est un nombre unique qui doit tre soit suprieur,
soit infrieur 81, mais qui ne peut pas tre simultanment suprieur et infrieur.
Cette situation nest donc pas satisfaisante, et nous pouvons nous demander sil
nest pas possible de donner une dfinition oprationnelle de la cooprativit qui
rende compte de la complexit rencontre dans la nature. WHITEHEAD (1978) a fait
remarquer que le coefficient de HILL fournit une telle dfinition. Considrons la
(1 y )
quantit Q = [ A ] , qui est une constante quivalente la constante de
y
dissociation si le systme ne comprend quun seul site de fixation, ou sil comprend
n sites identiques et indpendants (c'est--dire si toutes les constantes dADAIR
satisfont la relation K1 = K2 = = Kn). Toutefois, si Q diminue lorsque [ A ] aug-
mente, c'est--dire si dQ d [ A ] est ngatif, alors il est clair que la fixation devient
progressivement plus forte lorsqu'une plus grande proportion de ligand se fixe ; il
est alors raisonnable de dire que le systme prsente une cooprativit positive la
308 CINTIQUE ENZYMATIQUE
log[y(1 y)] 1
2
6 5 4 3 log[NADox]
9.4 - Graphique de HILL pour la fixation du NADOX
sur la glycraldhyde 3-phosphate dshydrognase
Le graphique prsente les donnes de COOK et KOSHLAND (1970) recalcules comme dcrit
par CORNISH-BOWDEN et KOSHLAND (1975). La forme de la courbe suggre que les cons-
tantes dADAIR (dans lquation [9.15]) satisfont la relation K1 > K2 K3 < K4, en accord
avec les valeurs suivantes obtenues par ajustement de la courbe (CORNISH-BOWDEN et
KOSHLAND, 1975) : K1 = 0,217 mM, K2 = 0,0067 mM, K3 = 0,013 mM, K4 = 0,286 mM.
9 CONTRLE DE LACTIVIT ENZYMATIQUE 309
Le haut degr de spcificit que les enzymes montrent pour leur substrat a impres-
sionn les biochimistes depuis le dbut de l'tude des enzymes, longtemps avant
que ne soient connues leurs structures physiques et chimiques. FISCHER (1894)
tait particulirement impressionn par la capacit des organismes vivants distin-
guer totalement des molcules de sucre qui diffrent lgrement et des positions
trs loignes des sites de raction. Pour expliquer cette capacit, il proposa que le
site actif dun enzyme soit lemprunte ngative de son (ses) substrat(s), et quil
catalyse les ractions uniquement avec les composants qui sy insrent prcis-
ment. Cela est similaire au mode dinteraction par lequel une clef sinsre dans une
serrure, et cette thorie daction enzymatique est connue sous le nom de modle
clef-serrure de FISCHER ( 3.1.2 et figure 3.2). Pendant de nombreuses annes,
cette thorie semblait expliquer tous les faits connus de la spcificit enzymatique,
mais lorsque des recherches plus dtailles furent effectues, il y eut de plus en
plus dobservations qui taient difficiles expliquer avec un site actif rigide, comme
FISCHER lavait envisag dans sa thorie. Par exemple, lexistence denzymes pour
des ractions impliquant deux substrats, dans lesquelles les substrats doivent se
fixer dans un ordre prcis, fournit une preuve de ce problme, comme nous en
avons discut dans le 6.2.1. Un exemple plus frappant, remarqu par KOSHLAND,
tait labsence de ractivit de leau dans diffrentes ractions catalyses par des
enzymes, o le modle clef-serrure prdit une raction. Considrons, par exemple,
la raction catalyse par lhexokinase de levure :
Glucose + MgATP Glucose 6-phosphate + MgADP [9.21]
Lenzyme de levure nest pas particulirement spcifique pour son substrat : il
accepte non seulement le glucose, mais galement dautres sucres, comme le fruc-
tose ou le mannose. Toutefois, leau ne ragit pas, mme si elle peut difficilement
ne pas saturer le site actif de lenzyme, avec une concentration de 55 M, environ
7 106 fois suprieure la constante de MICHAELIS pour le glucose, et que chimi-
quement, elle est au moins aussi ractive que les sucres qui ragissent.
KOSHLAND proposa que cette observation et dautres constituaient une preuve
vidente dun site actif flexible ; il proposa que le site actif dun enzyme a la
capacit de sajuster prcisment au substrat, mais quil nadopte cette confor-
mation complmentaire du substrat que lorsque ce dernier se fixe. Cet ajustement
de conformation accompagnant la fixation du substrat conduit lalignement
correct des groupes catalytiques de lenzyme avec le site de raction du substrat.
Avec cette hypothse, les proprits de lhexokinase de levure peuvent tre faci-
lement expliques : la molcule deau peut certainement se fixer dans le site actif
de lenzyme, mais elle na pas une taille suffisante pour induire le changement de
conformation ncessaire la catalyse.
La thorie de KOSHLAND est connue sous le nom dhypothse de lajustement induit
(figure 3.5), pour souligner ses diffrences avec la thorie de FISCHER, qui suppose
que la complmentarit entre lenzyme et le substrat prexiste, et ne doit pas tre
9 CONTRLE DE LACTIVIT ENZYMATIQUE 311
Le modle symtrique tire son origine de lobservation que chaque molcule dune
protine cooprative typique contient plusieurs sous-units. En effet, cette carac-
tristique est ncessaire pour expliquer la cooprativit de fixation lquilibre,
mme si elle nest pas requise pour expliquer la cooprativit cintique, comme
nous en discuterons dans le 9.6. Par souci de simplicit, nous dcrirons le modle
symtrique pour la fixation dun substrat A sur une protine dont le nombre n de
sous-units est 2 et en mentionnant les rsultats pour un nombre non-spcifi de
sous-units, lorsque ceux obtenus avec n = 2 ne reprsentent pas de manire
adquate le cas gnral. Tout nombre de sous-unit plus grand que 1 est possible, et
nimporte quel autre type de ligand (inhibiteur ou activateur) peut remplacer un
substrat.
Le modle symtrique est bas sur les postulats suivants :
Chaque sous-unit peut exister dans deux conformations distinctes, dsignes par
R et par T. A lorigine, ces dnominations signifiaient respectivement relax et
tendu, et dcoulaient de lide que la protine devait se relaxer afin de fixer le
substrat, mais elles sont considres de nos jours uniquement comme des
symboles.
A tout moment, toutes les sous-units dune molcule doivent tre dans la mme
conformation ; pour une protine dimrique, seules les conformations R2 et T2
sont permises. La conformation mixte RT est interdite. Cette condition devient
beaucoup plus restrictive pour les enzymes contenant plus de deux sous-units.
Par exemple, pour n = 4, les tats permis sont R4 et T4, alors que R3T, R2T2, et
RT3 sont interdits.
Les deux tats de la protine sont relis par un quilibre dcrit par une constante
dquilibre L = [ T2 ] [ R2 ] .
Un ligand peut se fixer sur une sous-unit quelle que soit sa conformation, mais
les constantes de dissociation sont diffrentes : KR = [ R ][ A ] [ RA ] pour cha-
que sous-unit dans la forme R, KT = [ T ][ A ] [ RA ] pour chaque sous-unit
dans la forme T. Le rapport KR KT est parfois reprsent par c, mais ici nous
utiliserons la forme plus explicite.
Ces postulats impliquent un ensemble dquilibres entre les diffrents tats comme
le montre le schma de la figure 9.5, et les concentrations des six formes de la pro-
tine sont relies entre elles par les expressions suivantes :
2[ R2 ][ A ]
[ R2 A ] = [9.22]
KR
1
[ R2 A ][ A ] [ R2 ][ A ] 2
[ R2 A2 ] = 2
= [9.23]
KR KR2
[ T2 ] = L [ R2 ] [9.24]
2[ T2 ][ A ] 2 L [ R2 ][ A ]
[ T2 A ] = = [9.25]
KT KT
9 CONTRLE DE LACTIVIT ENZYMATIQUE 313
1
[ T2 A ][ A ] L [ R2 ][ A ] 2
[ T2 A2 ] = 2
= [9.26]
KT KT2
R2A T2A
Dans chaque quation, le facteur statis-
tique 2, 1/2 ou 1 provient du fait que les
constantes de dissociation sont dfinies pour 1/2[A]/KR 1/2[A]/KT
des sites individuels mais que les expressions
sont crites pour les molcules compltes.
[ R ][ A ] 2[ R2 ][ A ] R2A2 T2A2
Par exemple, KR = =
[ RA ] [ R2 A ]
parce quil existe deux sites vacants sur chaque molcule R2 et un site occup sur
chaque molcule R2A.
La fraction de saturation, Y, est dfinie, comme prcdemment, comme la fraction
des sites occups par un ligand, et prend la forme suivante :
[ R2 A ] + 2[ R2 A2 ] + [ T2 A ] + 2[ T2 A2 ]
Y = [9.27]
2( [ R2 ] + [ R2 A ] + [ R2 A2 ] + [ T2 ] + [ T2 A ] + [ T2 A2 ] )
Puisque la faon de gnraliser ces quations pour les cas impliquant plus de deux
sous-units peut ne pas sembler vidente, nous prsentons ci-dessous lquation
correspondante pour une valeur non-prcise de n :
n 1 n 1
[ A] [ A] [ A] [ A]
1 + + L 1 +
KR KR KT KT
Y = n n
[9.29]
[ A] [ A]
1 + + L 1 +
KR KT
La forme de la courbe de saturation dfinie par lquation [9.29] dpend des
valeurs de n, de L et de KR KT , comme nous pouvons lillustrer en attribuant des
valeurs extrmes ces constantes. Si n = 1, c'est--dire sil ny a quun seul site de
[ A]
fixation par molcule, lquation se simplifie pour donner Y = avec
KRT + [ A ]
KRT = 1 + L qui est une constante de dissociation composite, qui tient compte
1 + 1
KR KT
du fait que les formes R et T participent dans la fixation. La complexit de cette
constante de dissociation ne doit cependant pas faire oublier quil sagit dune
constante, et donc quaucune cooprativit nest possible si n = 1.
Si L = 0, la forme T de la protine nexiste pas, quelles que soient les conditions, et
n 1
[ A]
le facteur 1 + sannule au numrateur et au dnominateur, laissant une
KR
[ A]
quation de la forme Y = qui prdit une fixation hyperbolique (non
KR + [ A ]
cooprative) avec une constante de dissociation KR. Une simplification similaire
peut tre faite si L tend vers linfini, c'est--dire si la forme R nexiste pas : dans ce
[ A]
cas, Y = . Il apparat ainsi que la prsence des deux formes, R et T, est
KT + [ A ]
ncessaire pour que la cooprativit soit possible.
Il est galement ncessaire, que les deux formes soient fonctionnellement diff-
rentes lune de lautre, c'est--dire que KR KT . Si KR = KT , il est encore possible
n 1
[ A]
dannuler le facteur commun 1 + , ce qui conduit une expression hyper-
KR
bolique. Ceci indique que dans le cas o le ligand se fixerait de manire identique
sur les deux formes de la protine, les proportions relatives dans lesquelles celles-ci
existent ne seraient pas affectes par la fixation.
A lexception de ces cas spciaux, lquation [9.29] prdit une cooprativit
positive, comme nous pouvons le constater en multipliant entre eux les facteurs
9 CONTRLE DE LACTIVIT ENZYMATIQUE 315
n 1 n 1
[ A] [ A]
1 + et 1 + et en rarrangeant le rsultat sous la forme de lqua-
KR KT
tion dADAIR. Dans le cas du dimre, lquation [9.28] devient :
1 KR + L KT 1 KR2 + L KT2
[ A] +
2
[ A]
1+ L 1+ L
Y = [9.30]
1 KR + L KT 1 KR2 + L KT2
1 + 2 [ A] + [ A]
2
1+ L 1+ L
En comparant cette quation avec lquation [9.13], nous obtenons les expressions
suivantes pour les deux constantes dADAIR :
K1 = 1+ L [9.31a]
( 1 KR ) + ( L KT )
( 1 KR ) + ( L KT )
K2 = [9.31b]
( 1 KR2 ) + ( L KT2 )
et leur rapport est donn par :
1 + 2 L + L2
[ ]
2
K2 ( 1 KR ) + ( L KT ) KR2 KR KT KT2
= = [9.32]
K1 [ ][
( 1 + L ) ( 1 KR2 ) + ( L KT2 ) ]
1 + L + L + L2
KR2 KT2 KR2 KT2
Puisque les termes extrieurs dans lexpression distribue du numrateur et du
dnominateur sont les mmes, il est seulement ncessaire dexaminer les termes
centraux et comme 2xy est plus petit que x2 + y2 quelles que soient les valeurs de x
et de y. Il en dcoule que K1 K2, c'est--dire que le modle prdit une coo-
prativit positive dans les termes de lquation dADAIR. Des relations similaires
sappliquent entre toutes les paires de constantes dADAIR dans le cas gnral o la
valeur de n nest pas prcise, et donc le modle prdit une cooprativit positive
tous les stades du processus de fixation.
Parce que cette conclusion est algbrique et non intuitive, il est utile dexaminer un
dernier cas spcial, dans lequel KT est infini, c'est--dire que A se fixe uniquement
sur ltat R. Cest une application naturelle de lide de lajustement induit, bien
que ce ne soit pas une caractristique essentielle du modle symtrique comme le
proposait MONOD, WYMAN et CHANGEUX. Quand KT est infini, lquation [9.28]
se simplifie sous la forme suivante :
[ A] [ A]
1 +
KR KR
Y = 2
[9.33]
[ A]
L + 1 +
KR
qui ne correspond pas une quation hyperbolique de fixation uniquement cause
de la prsence de la constante L au dnominateur. Quand [ A ] est suffisamment
316 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Y 1 1
Y/[A]
L = 0 (tat R)
0,5 L=1
0,8
L = 10
L = 100
L = 103
0
0,6 0 0,5 Y 1 L = 104
L = (tat T)
Y1
0,4
0,5
0,2
0
0 1000 2000 [A]
0
3 2 1 0 1 2 3 log [A]
9.6 - Courbes de fixation pour le modle symtrique
Les courbes sont calcules partir de lquation [9.28], en utilisant un rapport
KT /KR = 100 et des valeurs de L comme indiqu. Dans les graphiques de SCATCHARD
correspondants, prsents dans linsert suprieur gauche pour des valeurs faibles de L, les
cas extrmes (L = 0 pour une forme R pure et L = pour les formes pures R et T) sont
des droites alors que les cas intermdiaires sont des courbes dont la courbure est dirige
vers le bas. Les courbes extrmes sont hyperboliques lorsque Y est port en fonction de
[ A ], alors que les courbes intermdiaires sont sigmodes, comme illustr pour des valeurs
faibles de L dans linsert infrieur droit.
9 CONTRLE DE LACTIVIT ENZYMATIQUE 317
maximum pour Lapp = 100, mais une fois ce maximum atteint, laugmentation
supplmentaire de la concentration dinhibiteur tendra rduire la cooprativit. Si
la valeur de L est suprieure 100 plutt quinfrieure, lactivateur augmentera la
cooprativit faibles concentrations, alors que linhibiteur diminuera la coop-
rativit quelle que soit sa concentration. Une complication survient si nous
considrons quun inhibiteur comptitif ordinaire (non-allostrique) se fixe sur
ltat R au mme site que le substrat A. Ce cas est considr dans le problme 9.4
la fin de ce chapitre.
Les proprits de fixation de la phosphofructokinase dE. coli ont t tudies de
manire extensive par BLANGY, BUC et MONOD (1968) : sur une large gamme de
concentrations dADP et de phosphonolpyruvate, qui sont respectivement un
activateur et un inhibiteur allostriques de lenzyme, la fixation du substrat, le
fructose 6-phosphate, sest avre en parfait accord avec les prdictions du modle
symtrique. Nanmoins, celui-ci ne peut tre considr comme une explication
complte de la cooprativit de fixation, parce quil ne permet pas dexpliquer un
certain nombre de phnomnes observs, comme la cooprativit ngative, et que
certains de ces postulats ne sont pas convaincants. Par exemple, lhypothse
centrale de symtrie de conformation nest pas aisment explicable en termes de
structure. De plus, pour beaucoup denzymes, il est ncessaire de postuler lexis-
tence dun systme K parfait, qui signifie que les tats R et T de lenzyme ont des
proprits catalytiques identiques en dpit du fait quils ont des proprits de
fixation largement diffrentes. Ces aspects problmatiques du modle symtrique
ont conduit la proposition de modles alternatifs.
Bien que le modle symtrique incorpore lide dun certain dterminisme dans la
flexibilit de la conformation, il scarte de la thorie de lajustement induit, en
autorisant la fixation des ligands aux conformations R et T bien quavec des cons-
tantes de fixation diffrentes. KOSHLAND, NMETHY et FILMER (1966) ont montr
quune application plus orthodoxe de lajustement induit, connue sous le nom de
modle squentiel, peut galement rendre compte de la cooprativit. Comme
MONOD, WYMAN et CHANGEUX, ils ont postul lexistence de deux conformations,
quils ont appeles les conformations A et B, et qui correspondent respectivement
aux conformations T et R. Cette inversion de lordre dans lequel ces conformations
taient dsignes, a quelques fois t une source de confusion. Pour cette raison
mais galement pour nous permettre de continuer utiliser le symbole A pour dsi-
gner le substrat, nous utiliserons ici les symboles T et R 2. A loppos de MONOD,
trouvent sur des sous-units adjacentes (plutt quen diagonale.) Cette simplifi-
cation fournit une expression simple de la concentration du complexe :
4[ T4 ][ A ] 2 KR2:T KR :R
[ R2 T2 A2 ]adjacent = [9.36]
Kt2 K A2
Puisque ceci implique lexistence dune nouvelle interface entre les deux sous-
units adjacentes dans la conformation R qui ont fix un ligand, nous devons
considrer une nouvelle constante dinteraction entre ces sous-units, K R:R, pour
reprsenter sa stabilit relative vis--vis de celle de linterface T : T, mais mis part
cela, lquation [9.36] est construite exactement de la mme faon et partir des
mmes composants que lquation [9.35].
Revenant maintenant au cas du dimre, nous pouvons crire une expression pour la
concentration de R2A2, en accord avec les mmes principes :
[ T2 ][ A ] 2 KR :R
[ R2 A2 ] = [9.37]
Kt2 K A2
En substituant les quations [9.35] et [9.37] dans lexpression de la fraction de
saturation, nous obtenons :
[ A ] KR :T [ A ] 2 KR :R
+
[ RTA ] + 2[ R2 A2 ] Kt K A Kt2 K A2
Y = = [9.38]
2([ T2 ] + [ RTA ] + [ R2 A2 ]) 2[ A ] KR :T [ A ] 2 KR :R
1+ +
Kt K A Kt2 K A2
Le modle squentiel repose fondamentalement sur les interactions entre sous-
units, et la question essentielle laquelle rpond une quation telle que lqua-
tion [9.38] est comment la fixation dun ligand est affecte par la stabilit relative
de linterface mixte R : T vis--vis des interfaces R : R et T : T entre des sous-units
existant dans une mme forme ? Lanalyse de lquation [9.38] permet de voir
quune diminution de KR:T, se traduit par une augmentation de limportance des
termes externes par rapport aux termes internes, mais cela apparat plus clairement
en dfinissant une constante c 2 = KR2:T KR :R pour exprimer cette stabilit relative.
(Il peut sembler surprenant, premire vue, quil ne soit fait aucune mention de
linterface T : T dans cette dfinition, mais il faut se rappeler que KR:T et KR:R
dfinissent dj les stabilits des interfaces R : T et R : R par rapport celle de
linterface T : T.)
Si, en utilisant cette dfinition, KR:T est remplace par c KR1 :2R , il devient alors clair
KK
que le terme K = t 1 2A est toujours gal lunit ; bien que ses trois composantes
KR :R
soient conceptuellement distinctes, elles ne peuvent tre distingues exprimen-
talement par des mesures de fixation. Lquation peut donc tre simplifie en
apparence sans perdre de sa gnralit en lcrivant en termes de c et K :
322 CINTIQUE ENZYMATIQUE
[ A ] [ A ]2
c +
Y = K K2 [9.39]
[ A ] [ A ]2
1 + 2c +
K K2
La dfinition de c est la mme pour toutes les structures quaternaires : elle sap-
plique non seulement aux dimres, mais galement aux trimres, aux ttramres,
sans gard pour la manire dont les sous-units sont organises. La dfinition de K
est un peu plus complique : elle contient toujours Kt KA comme une unit
insparable (en accord avec les tapes 1 et 2 dans la description ci-dessus qui
montrent que tout processus de fixation est dcompos en diffrentes compo-
santes) ; dun autre ct, le puissance laquelle KR:R est porte au dnominateur
varie avec le nombre de sous-units et le nombre dinterfaces R : R que contient la
molcule compltement sature. Toutefois, ceci na que peu dimportance : le point
important est que, sans tenir compte ni de la structure quaternaire ni de sa
gomtrie, la gamme de comportements possibles pour la fixation dun ligand
unique dans le modle squentiel est dtermine par deux paramtres, un qui
reprsente la stabilit de linterface R : T par rapport aux interfaces R : R et T : T, et
lautre qui est une constante de dissociation moyenne pour le processus de fixation
qui relie la forme compltement libre la forme compltement complexe de la
protine. Cest, en ralit, la moyenne gomtrique des constantes de dissociation
dADAIR, comme nous le voyons dans le cas dun dimre en les crivant
explicitement, aprs comparaison de lquation [9.39] avec lquation [9.13] :
K1 = K [9.40a]
c
K2 = c K [9.40b]
K2
avec le rapport suivant : = c2 [9.41]
K1
Il est maintenant clair que le degr de cooprativit, et donc lallure de la courbe de
fixation, dpendent uniquement de la valeur de c. Comme lillustre la figure 9.7,
les valeurs de c < 1 gnrent une cooprativit positive, et les valeurs de c > 1
gnrent une cooprativit ngative. Leffet de la variation de K nest pas prsent
(pour viter de surcharger la figure), mais peut tre nonc simplement : il na
aucune influence sur la forme des courbes quand log [ A ] est port en abscisses (et
affecte uniquement lchelle lorsque dautres variables sont portes en abscisses),
mais provoque simplement leur dplacement vers la droite (si K augmente) ou
vers la gauche (si K diminue) ; en dautres termes, K na aucun effet sur le degr
de cooprativit.
Lexistence dune correspondance simple entre les paramtres du modle squen-
tiel et ceux de lquation de HILL (quation [9.3]) serait apprciable. Toutefois,
comme nous lavons vu, le degr de cooprativit dpend uniquement de c et il
9 CONTRLE DE LACTIVIT ENZYMATIQUE 323
0,5
0,2
0
0 2 4 [A]
0
3 2 1 0 1 2 3 log [A]
9.7 - Courbes de fixation pour le modle squentiel
Les courbes sont calcules partir de lquation [9.39] pour K = 1 000 et les valeurs de c
indiques dans le graphique. La valeur de K naffecte pas la forme de la courbe, mais
uniquement sa position le long de laxe des abscisses. Les graphiques de SCATCHARD
correspondants sont prsents dans linsert en haut, gauche.
est ladhrence lquation dADAIR ; les quations qui ne sont pas des cas sp-
ciaux de lquation dADAIR, tout comme celles, proposes pour la lactate dshy-
drognase (WEBER et ANDERSON, 1965 ; ANDERSON et WEBER, 1965), violent
gnralement les principes de la thermodynamique.
La rfrence PAULING est trompeuse pour une raison diffrente. Malgr que les
mathmatiques du modle squentiel soient les mmes que celles appliques
lhmoglobine par PAULING, les concepts fondamentaux sont diffrents ; PAULING
a tudi lhmoglobine une poque o les sites de fixation de loxygne sur
lhmoglobine taient supposs suffisamment proches dans lespace les uns des
autres pour interagir dune faon chimique ordinaire, et il ny avait aucune
implication de modification de conformation.
Dans le cas dun dimre cooprativit positive, il ny a aucune diffrence entre
les courbes de fixation prdites par les deux modles, puisque toute valeur
infrieure 1 que puisse prendre le rapport des constantes dADAIR ( K 2 K1 ), est
galement en accord avec lautre modle. Il est donc impossible de les distinguer
sur la base dexpriences de fixation avec un dimre. En principe, celles-ci
deviennent diffrentes pour les trimres ou pour des oligomres de plus grande
taille, car les courbes de fixation pour le modle symtrique, telles que celles qui
sont prsentes dans les figures 9.6 et 9.7, deviennent asymtriques par rapport au
point de demi-saturation, alors que les courbes gnres par le modle squentiel
restent symtriques par rapport une rotation de 180 autour de ce point.
Cependant, les dviations de la situation symtrique sont faibles, et des donnes
trs prcises sont ncessaires pour les dtecter. De plus, le plus grand degr de
cooprativit est obtenu avec le modle symtrique lorsque L2 = KTn KRn (RUBIN
et CHANGEUX, 1966), et puisque ce sont galement les conditions pour lesquelles
le modle symtrique prdit une courbe de fixation symtrique, il faut sattendre
ce que, dans certains cas, lvolution limine une asymtrie qui aurait pu exister.
Une revue rcente de ltat actuel de ces modles (et ceux discuts dans le 9.6),
est prsente dans l'article de NEET (1995).
Tous les modles dcrits dans la premire partie de ce chapitre sont essentiellement
des modles lquilibre qui ne peuvent tre appliqus aux expriences cintiques
que si nous faisons lhypothse que le paramtre v V reprsente une vraie mesure
de Y. Nanmoins, la cooprativit peut galement apparatre pour des raisons pure-
ment cintiques, avec des mcanismes qui ne prsenteraient aucune cooprativit si
la fixation pouvait tre mesure lquilibre. Des observations de ce type ont t
dcrites par FERDINAND (1966), par RABIN (1967) et par dautres lpoque o les
modles classiques de cooprativit taient dvelopps, mais elles ntaient pas
apparues ce moment comme des exemples exprimentaux de cooprativit avec
des enzymes monomriques. Ds lors, on a considr que mme si la prsence de
plusieurs sites de fixation nest pas strictement ncessaire pour produire la coop-
rativit, elle fournit le seul mcanisme rellement rencontr dans la nature, et les
modles purement cintiques ont reu peu dattention. Ce nest quavec les travaux
dAINSLIE, SHILL et NEET (1972) et de SHILL et NEET (1975) sur lhexokinase de
levure, et ceux de MEUNIER et al. (1974) sur lhexokinase LI du germe de bl, quil
est apparu que les modles dcrivant une cooprativit avec des enzymes
monomriques doivent tre srieusement considrs. Ceux-ci sont des exemples de
cooprativit ngative, mais le cas de lhexokinase D du foie de rat montre quune
cooprativit positive peut aussi tre obtenue avec un enzyme monomrique.
Lhexokinase D est un enzyme prsent dans le foie et dans les lots pancratiques
des vertbrs. A cause de la perception fausse que cet enzyme est plus spcifique
pour le glucose que les autres hexokinases de vertbrs (voir CRDENAS,
RABAJILLE et NIEMEYER, 1984 ; CRDENAS, 1995), il est souvent dnomm glu-
cokinase dans la littrature mais ce nom ne sera pas utilis ici. Cet enzyme est
monomrique sur une large gamme de concentration, incluant celles utilises dans
le test (HOLROYDE et al., 1976 ; CRDENAS, RABAJILLE et NIEMEYER, 1978), mais
il prsente des dviations importantes vis--vis des cintiques de MICHAELIS et
326 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Ses caractristiques essentielles sont les suivantes : il postule quil existe deux
formes de lenzyme libre, E et E', qui diffrent par leur affinit pour A, le premier
substrat qui doit se fixer ; en plus, lquilibration entre E, E', A et EA doit tre
lente par rapport au flux maximum de la raction. Avec ces postulats, le compor-
tement de lhexokinase D est facilement expliqu. Quand la concentration de B est
diminue, la vitesse laquelle EA est converti en EAB et ensuite en produits doit
devenir suffisamment lente pour que E, E', A et EA atteignent lquilibre. En
consquence des concentrations extrmement faibles de B, la fixation de A
devrait se comporter comme un quilibre ordinaire, sans cooprativit, parce quil
y a un seul site de fixation. A des concentrations leves de B, dun autre ct, il
devient possible que EA disparaisse si rapidement que lquilibre ne peut stablir
et que donc les lois dquilibre ne sappliquent plus (STORER et CORNISH-
BOWDEN, 1977). Des dviations par rapport aux cintiques de MICHAELIS et
MENTEN sont alors possibles parce que, faibles concentrations de A, les deux
formes de lenzyme libre peuvent atteindre un quilibre mais qu fortes concen-
trations, cela nest pas possible.
Dans le mcanisme mnmonique propos par RICARD et ses collaborateurs la
mme forme du complexe EA est produite partir des deux formes de lenzyme
libre quand le substrat se fixe sur celles-ci. Cependant, il ne sagit pas dune
caractristique ncessaire du modle, et le modle de transition lente dvelopp un
peu plus tt par AINSLIE, SHILL et NEET (1972) suppose que les deux confor-
mations diffrentes existent durant lensemble du cycle catalytique, avec des
transitions entre celles-ci qui sont possibles nimporte quel moment et une
vitesse plus lente que la vitesse catalytique. En gnral, tout modle qui permet au
substrat de se fixer de deux ou plusieurs manires parallles gnrera une quation
de vitesse contenant des termes de concentration du substrat concern levs au
carr ou une puissance suprieure, de sorte quil ny a aucune limite sur les
modles de cooprativit cintique qui peuvent tre drivs. Malheureusement, il
est difficile en pratique de les distinguer entre eux ou de dterminer avec confiance
si lun reprsente mieux les donnes que lautre. Il est certain que le modle
mnmonique et le modle de transition lente permettent dexpliquer adquatement
le comportement de lhexokinase D. NEET (1995) donne un rcent compte-rendu
de lapplication du dernier modle lhexokinase D.
PROBLMES
v
9.1 - WATARI et ISOGAI (1976) ont propos un graphique de log
[ A ]( V v )
en fonction de log [ A ] comme une alternative au graphique de HILL.
Quelle est la pente de ce graphique (exprime en terme du coefficient de
HILL h) ? Quel est lavantage de ce graphique par rapport au graphique de
HILL ?
328 CINTIQUE ENZYMATIQUE
9.2 - Ecrire une quation pour la vitesse dune raction catalyse par un
mlange de deux enzymes, chacun obissant la cintique de MICHAELIS
et MENTEN, un avec une vitesse limite V1 et une constante de MICHAELIS
Km1 et lautre avec V2 et Km2. Diffrencier cette quation deux fois par
rapport [ A ] et montrer que la drive seconde rsultante est ngative
pour toutes le valeurs de [ A ] . Quelle est limplication de cela sur la
forme du graphique de v en fonction de [ A ] ?
9.3 - Driver une expression pour le coefficient de HILL en termes de K1 et de
K2 pour un enzyme qui obit lquation [9.13], et donc montrer que la
dfinition de la cooprativit en termes de h est identique une dfi-
nition en termes de K1 et de K2 pour ce systme. A quelle valeur de [ A ]
h est-il un maximum ou un minimum et quelle est sa valeur extrme ?
9.4 - La quasi-concidence des deux asymptotes dans la figure 9.3 est suppo-
se tre une simple concidence. Quelle relation entre les constantes de
dissociation (telles quelles sont dfinies dans lquation [9.14]) cela
implique-t-il ?
9.5 - Considrer un inhibiteur qui se fixe sur une protine qui obit la forme
la plus simple du modle symtrique (quation [9.33]) comme un
analogue simple (non-allostrique) du substrat, c'est--dire qu'il se fixe
uniquement sur la forme R, dans le mme site que le substrat et dune
manire qui le substrat et linhibiteur de se fixer simultanment au
mme site. Que pouvez-vous prdire de leffet dun tel inhibiteur sur la
fixation du substrat, pour des concentration (a) faibles et (b) leves des
deux molcules ?
10 CINTIQUES DES SYSTMES
MULTI-ENZYMATIQUES
Dans la majeure partie de ce manuel, nous nous sommes intresss aux proprits
des enzymes isols, mme si dans les organismes vivants tous les enzymes agissent
virtuellement comme les composants d'un systme complexe ; les substrats d'un
enzyme sont les produits d'autres enzymes et les produits d'un enzyme sont gale-
ment les substrats d'autres enzymes. Dans l'histoire de l'enzymologie, peu d'efforts
ont t consentis pour connecter les mesures cintiques ralises in vitro avec les
proprits physiologiques des enzymes tudis ; aprs qu'un enzyme a t identifi
partir de quelques observations physiologiques, un enzymologiste commence par
purifier celui-ci ou au moins par le sparer de ses partenaires physiologiques. Prati-
quement, toutes les tudes cintiques des enzymes sont ralises avec des enzymes
qui sont dlibrment isols de leur contexte physiologique. Cette approche est
ncessaire si nous souhaitons lucider le mcanisme catalytique de l'enzyme, mais
il n'est pas possible d'obtenir une comprhension complte de la manire dont
l'enzyme rempli son rle dans les voies mtaboliques si nous l'examinons unique-
ment dans des conditions o tous les autres aspects de cette voie ont t limins.
On aurait pu s'attendre ce que la dcouverte de l'inhibition par contrle rtroactif
et des proprits associes de cooprativit et d'interaction allostrique ait rtabli
l'importance des enzymes en tant qu'lment physiologique. En ralit cette dcou-
verte a exacerb la sparation entre la pratique de l'enzymologie et celle de la
physiologie des enzymes, parce qu'il est devenu naturel de penser que quelques
enzymes comme la phosphofructokinase peuvent tre considrs comme des
enzymes rguls et que les autres peuvent tre ignors dans les discussions de
la rgulation physiologique. La forme la plus extrme de cette ide consiste
penser que, pour comprendre la rgulation d'une voie mtabolique, il suffit simple-
ment d'identifier l'tape rgulatrice, habituellement suppose unique, et d'tudier
toutes les interactions de l'enzyme qui catalyse cette tape.
Les mcanismes discuts dans le chapitre prcdent constituent une partie impor-
tante dans la comprhension de la physiologie des enzymes, mais ils laissent une
question sans rponse : comment pouvons-nous savoir qu'un effet sur l'activit d'un
330 CINTIQUE ENZYMATIQUE
enzyme se traduira par un effet sur le flux des mtabolites dans une voie mtabo-
lique ? La seule faon de rpondre cette question est de remplacer l'tude des
enzymes isols par un traitement systmique, c'est--dire un traitement qui s'int-
resse la manire dont les composants d'un systme s'influencent mutuellement.
Il ne s'agit pas d'un problme trivial, mme dans des conditions d'tat stationnaire,
et mme si nous considrons que l'analyse du comportement cintique d'enzymes
individuels isols dans des conditions d'tat stationnaire est un problme rsolu. En
gnral, il n'existe pas d'expressions analytiques pour les vitesses l'tat station-
naire de systmes multi-enzymatiques, mme pour des systmes deux enzymes,
et les difficults s'accroissent rapidement pour les systmes impliquant plus de
deux enzymes. Rien dans les cintiques enzymatiques ordinaires ne permet de jus-
tifier l'hypothse selon laquelle une connaissance complte de l'quation de vitesse
d'un enzyme rgul permettrait de prdire de faon quantitative comment un
changement de son activit affecterait le flux travers la voie mtabolique dans
laquelle l'enzyme est insr. Dans ce chapitre, nous examinerons les relations entre
les cintiques des voies mtaboliques et les proprits cintiques des enzymes qui
les composent.
Plusieurs systmes se recoupant les uns avec les autres ont t dvelopps au cours
des 20 dernires annes pour analyser le comportement des systmes mtaboliques,
mais nous discuterons uniquement un seul de ceux-ci, l'analyse du contrle
mtabolique qui dcoule des travaux de KACSER et BURNS (1973) et d'HEINRICH
et RAPOPORT (1974), et qui est actuellement le plus connu et le plus utilis. Dans
sa forme la plus simple, il implique de considrer les tats stationnaires de sys-
tmes d'enzymes qui relient une srie de mtabolites. Il utilise deux ou plusieurs
rservoirs de mtabolites dont les concentrations sont fixes indpendamment des
enzymes du systme, et peuvent donc tre considrs comme externe vis--vis
de ce systme. Ces rservoirs contiennent au moins une source, partir de laquelle
les mtabolites s'coulent, et au moins un drain vers lequel ils s'coulent. Aucun de
ces flux ne doit tre irrversible et la classification comme source ou comme drain,
n'est pas absolue : dans des circonstances diffrentes, les deux pourraient tre con-
sidrs comme des mtabolites internes d'un systme plus important. Nanmoins,
dans toute analyse il est essentiel d'tre prcis quant aux mtabolites qui sont consi-
drs comme internes et ceux qui sont considrs comme externes, et il est utile
d'utiliser des symboles qui indiquent cette diffrence : en accord avec de nom-
breuses publications nous utiliserons respectivement S (Substrat) et X (eXterne).
Dans l'exemple prsent dans la figure 10.1, le systme correspond la voie allant
d'une sourcee X0 vers un drain X5, avec des mtabolites internes S1, S2, S3 et S4 :
10 CINTIQUES DES SYSTMES MULTI-ENZYMATIQUES 331
la partie fortement ombre du schma, incluant les connections externes vers ces
mtabolites et vers S3, est considre comme tant en dehors du systme1.
Externe
Systme
Local v
[S2 4] < 0
v v
[S2 1] > 0 [S2 2] < 0
E1 E2 E3 E4 E5
X0 S1 S2 S3 S4 X5
En plus des mtabolites relis entre eux par les enzymes, il peut y avoir un nombre
indfini d'effecteurs externes des concentrations fixes. Dans un organisme vivant,
bien sur, trs peu de ractifs sont externes, mais il y a tellement de ractions
considrer que le systme complet est difficile comprendre. Pour rendre le mta-
bolisme accessible l'analyse, le systme doit donc tre dfini simplement comme
une partie de l'organisme complet, et les mtabolites prsents aux interfaces avec le
reste de l'organisme doivent tre dfinis comme externes. Dans la version la plus
simple de l'analyse du contrle mtabolique considre ici, chaque vitesse doit tre
proportionnelle la concentration d'un seul enzyme, et aucun enzyme ne peut agir
sur plus d'une raction du systme. Cependant, ces restrictions ne sont pas absolues
puisqu'elles peuvent tre facilement limines en augmentant la complexit de
l'analyse. Plusieurs revues rcentes (par exemple, FELL, 1992 ; CORNISH-BOWDEN,
1995a) peuvent tre consultes pour davantage d'information, ainsi qu'un livre
1. Dans ce manuel, nous avons reprsent les substrats d'un enzyme par les lettres A,
B Lorsque nous considrons une voie dans sa totalit, un mtabolite interne est
la fois substrat et produit. Afin de marquer cette distinction mais galement pour
utiliser une notation communment accepte, nous utilisons le symbole SI lorsque
nous considrons un systme mtabolique, mais conservons les symboles A, B
lorsque nous discutons des proprits d'enzymes isols..
332 CINTIQUE ENZYMATIQUE
10.3. ELASTICITS
possible de considrer que les vitesses sont dtermines par les concentrations de
mtabolites ou que les concentrations de mtabolites sont dtermines par les
vitesses, la ralit est que ces deux variables sont dpendantes. Ce point sera
considrer plus en dtails dans le 10.3.4.
Les quations cintiques ordinaires comme l'quation [10.1] peuvent certainement
rpondre la question de comment la vitesse rpond une variation faible de con-
centration, mais elles prsentent l'inconvnient de le faire d'une manire indirecte.
Nanmoins, une diffrentiation partielle par rapport [ A ] fournit l'expression :
kP [ I ]
k A [ E ]0 1 + [ P ] 1 + +
v KmP k A KmA KI
= [10.2]
[ A ] [ A] [ P ] [ I ]
2
1 + + +
KmA KmP KI
Dans cette forme, la drive a les dimensions de la rciproque d'un temps, et comme
il est prfrable d'utiliser des drives relatives plutt que des drives absolues, il est
courant de convertir [ A ] v en une forme relative en la multipliant par ces
dernires :
kP [ I ]
1 + [ P ] 1 + +
ln v [ A ] v KmP k A KmA KI
= =
ln [ A ] v [ A ] kP [ P ] [ A ] [ P ] [ I ]
1 1 + + +
k A [ A ] KmA KmP KI
[ A]
1 KmA
= [10.3]
k [P] [ A] [ P ] [ I ]
1 P 1+ + +
kA [ A ] KmA KmP KI
= 1 a
1 G 1 + a + p +i
Keq
o G = [ P ] [ A ] est le rapport d'action de masses, Keq est la constante d'quilibre
dfinie en vertu de la relation d'HALDANE ( 3.6.3), et a = [ A ] KmA ,
p = [ P ] KmP et i = [ I ] KI sont les concentrations talonnes de manire appro-
prie par les constantes de MICHAELIS ou d'inhibition. Cette quation peut sembler
complexe, mais lorsqu'elle est rarrange sous la forme d'une diffrence entre deux
fractions, comme dans les dernires formes prsentes, il est apparent que les deux
fractions peuvent tre interprtes simplement : la premire mesure le dsqui-
libre , c'est--dire l'cart de la raction par rapport sa position d'quilibre ; la
seconde mesure le degr de saturation de l'enzyme par le ractif considr. Nan-
moins, complexe ou non, l'analyse du contrle mtabolique n'est pas concerne par
la forme algbrique de cette drive mais par sa valeur numrique : si elle est gale
zro, v ne varie pas avec [ A ] ; si elle est positive, v augmente lorsque [ A ] aug-
mente ; si elle est ngative, v diminue lorsque [ A ] augmente. En consquence, un
334 CINTIQUE ENZYMATIQUE
nom est attribu cette valeur, l'lasticit, qui est reprsente par le symbole ,
pour exprimer son importance centrale dans l'analyse du contrle mtabolique :
ln v [ A ] v
e [v A ] [10.4]
ln [ A ] v [ A ]
L'exposant v dans le symbole peut sembler suffisamment vident pour tre super-
flu, mais l'analyse du contrle mtabolique est toujours applique des systmes
qui contiennent plusieurs enzymes, et un exposant est donc ncessaire pour spcifier
quelle vitesse est considre.
Si nous examinons l'quation [10.4] en relation avec le 1.2.3 de ce manuel, nous
pouvons raisonnablement avoir le sentiment qu'il s'agit l d'une manire dtourne
d'introduire un nouveau nom pour reprsenter un ancien concept, puisque l'lasti-
cit d'une raction est connue de tous les biochimistes comme l'ordre de la raction.
La seule diffrence est que, alors que les recommandations de l'IUBMB (IUB,
1992) dcouragent l'utilisation de ce terme lorsque les valeurs ne sont pas des
entiers et proposent d'utiliser le terme d'ordre apparent, rien, ni dans l'qua-
tion [10.4], ni dans la manire dont elle est drive, ne suggre que la quantit ainsi
dfinie doive tre un entier. Cependant, cette recommandation n'a pas t coll-
gialement suivie ; elle a t cre pour viter les conflits avec les nouvelles recom-
mandations de l'IUPAC (1981), mais peu de biochimistes s'opposent l'existence
d'ordres variables. La courbe dfinie par l'quation de MICHAELIS et MENTEN dans
le 3.3.4 peut tre interprte comme une transition graduelle partant d'un ordre un
vis--vis du substrat pour les faibles concentrations de substrat, passant par des
ordres intermdiaires et approchant un ordre zro saturation, avec un passage par
un ordre 0,5 pour une concentration de A correspondant la demi-saturation de E.
Il est facile de confirmer, en fixant [ P ] = 0 dans l'quation [10.3], que l'lasticit
se comporte exactement de la mme manire ; elle est, en ralit, identique la
quantit normalement dsigne par les biochimistes comme l'ordre de la raction.
Le terme lasticit a t emprunt l'conomtrie, o il dsigne une quantit simi-
laire celle utilise dans l'analyse du contrle mtabolique, mais avec un signe
oppos : l'lasticit pour une marchandise reprsente un pourcentage de diminution
dans la demande divis par le pourcentage d'augmentation de son prix qui est
l'origine de la diminution de la demande. Il s'agit d'une origine obscure pour dfinir
un terme biochimique et le terme d'ordre cintique utilis dans la thorie des
systmes biochimiques (SAVAGEAU, 1976), une approche alternative qui couvre
environ le mme domaine que l'analyse du contrle mtabolique, est bien meilleur.
Nanmoins, nous continuerons d'utiliser le terme lasticit dans ce chapitre,
puisque avec son synonyme le coefficient d'lasticit, il est utilis universellement
dans le domaine de l'tude du contrle mtabolique.
En revenant l'quation [10.1], nous pouvons la diffrencier vis--vis de chaque
concentration pour obtenir l'ensemble complet des lasticits, qui seront maintenant
exprimes comme des diffrences entre les termes d'cart par rapport l'quilibre
10 CINTIQUES DES SYSTMES MULTI-ENZYMATIQUES 335
G
Keq a
e [vP ] = [10.6]
1 G 1 + a + p +i
Keq
1 si E catalyse la raction
e [vE ] 0 = [10.7]
0 si E ne catalyse pas la raction
e [vI ] = i [10.8]
1+ a + p + i
La seconde forme de l'quation [10.7] ne dcoule pas de l'quation [10.1], qui ne
permettait pas de considrer l'existence de plus d'une forme d'enzyme dans le
systme. Elle indique uniquement qu'un enzyme a une lasticit nulle vis--vis
d'une raction qu'il ne catalyse pas : un point qui peut sembler vident, mais qu'il
est ncessaire de prciser explicitement puisqu'il joue un rle important dans la
thorie du contrle mtabolique.
Bien que les quations [10.5] [10.8] aient t drives partir d'un modle sp-
cifique, l'quation rversible de MICHAELIS et MENTEN, et que leur formes exactes
soient dpendantes de ce modle, elles illustrent un nombre de points qui s'appli-
quent gnralement dans un certain nombre de cas :
Les lasticits des ractifs sont normalement positives quand la direction impose
par le dsquilibre est telle que le ractif est un substrat, et ngatives quand il
s'agit d'un produit ( normalement signifie que l'inhibition par le substrat et
l'activation par le produit sont des phnomnes exceptionnels). Notons cependant
que le passage d'une valeur positive une valeur ngative lorsque la raction
passe d'un ct l'autre de la position d'quilibre ne passe pas par zro, comme
nous pourrions navement le penser, mais par l'infini : les lasticits des ractifs
sont infinies l'quilibre ! Cette caractristique souligne le danger d'incorporer
des quations irrversibles de vitesse dans une simulation sur ordinateur. Avec
des ractions irrversibles, en absence de cooprativit et d'inhibition par le sub-
strat, les lasticits des substrats se situent normalement dans une gamme allant
de 0 1 : des valeurs proches de zro sont caractristiques des concentrations
leves de substrat, et des lasticits infinies sont impossibles. Il en dcoule que
les valeurs numriques des lasticits pour de telles ractions sont entirement
diffrentes de celles vraisemblablement rencontres dans les cellules vivantes.
336 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Les enzymes ont des lasticits gales 1 pour leurs propres ractions (et des
lasticits nulles pour les autres ractions, bien que ce ne soit pas illustr dans
l'quation [10.7]). Ces gnralisations ne sont pas universelles, puisqu'elles
dpendent de l'hypothse selon laquelle chaque vitesse est proportionnelle la
concentration totale d'un seul enzyme. Elles ne sont plus valables si un enzyme
s'associe (avec lui-mme o avec un autre enzyme du systme) pour produire des
espces dont les proprits cintiques sont diffrentes. Une grande partie de
l'analyse du contrle mtabolique repose sur l'hypothse que ces gnralisations
sont vrifies et les quations deviennent beaucoup plus compliques dans le cas
contraire.
Les lasticits pour les inhibiteurs non-ractionnels sont toujours ngatives.
Inversement, les lasticits des activateurs non-ractionnels sont toujours posi-
tives. La qualification de non-ractionnel peut tre ignore si nous nous
rappelons qu'un produit inhibiteur est transform en un substrat quand la direc-
tion du flux s'inverse. De plus, les lasticits des inhibiteurs et des activateurs
non-ractionnels sont indpendantes du degr de dsquilibre du systme (la
qualification est dans ce cas indispensable).
optimale pour le test, sans aucune relation avec les concentrations qui pourraient
exister dans la cellule.
Toutes ces caractristiques sont totalement inappropries pour l'analyse du contrle
mtabolique. Bien que nous soyons toujours intresss par dcrire le comportement
cintique d'un enzyme, l'objectif dans ce cas n'est pas de comprendre le mcanisme
mais d'intgrer la description cintique dans une description du comportement cin-
tique d'un systme au niveau le plus simple, un systme de quelques enzymes
constituant une voie mtabolique et au niveau le plus complexe un organe entier ou
un organisme. En premire approximation, nous pouvons considrer que les propri-
ts qui sont la limite de la prcision de l'quipement dont nous disposons et qui,
en consquence, sont difficiles mesurer, ne sont pas importantes dans le compor-
tement du systme : si les diffrences mcaniques ne produisent pas de diffrences
majeures dans le comportement cintique, elles sont sans importance.
D'un autre ct, nous ne pouvons plus nous permettre de simplifier l'exprience en
omettant certains mtabolites qui affectent la cintique : tous les ractifs et tous les
effecteurs doivent tre prsents des concentrations aussi proches que possibles de
celles rencontres dans les cellules. Ceci inclut les produits, et implique que les
ractions doivent tre tudies dans des conditions o elles sont rversibles. Mme
si la constante d'quilibre favorise fortement la raction dans une direction, les
conditions devraient permettre au systme, au moins dans le principe, d'tre rver-
sible ; en dehors de tout autre chose, l'inhibition par le produit peut tre signifi-
cative, mme si la raction inverse dans son entiret ne l'est pas.
En dpit de l'importance accorde l'utilisation d'un mlange ractionnel raliste,
les mesures d'lasticit restent artificielles pour une raison : elles font rfrence
un enzyme isol de sa voie mtabolique, c'est--dire qu'elles traitent comme des
constantes toutes les concentrations de mtabolites qui influencent son activit,
ignorant les effets que d'autres enzymes dans la voie pourraient avoir sur ces
concentrations.
4 12,6%
v/V 1
3 0,64%
0,5
2
2,5%
0
0 1 2 3 4 5
1
[A]/Km
2,5%
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 v/V
10.2 - Reprsentation diffrente de la relation de MICHAELIS et Menten
L'insert (une forme modifie de la figure 3.7) montre la reprsentation habituelle o v
(normalise par V) est trac en fonction de [ A ] (normalise par Km). Dans cette repr-
sentation, la rgion proche de la saturation est celle dans laquelle de faibles variations de
[ A ] conduisent de faibles variations de v. Cependant, dans un systme mtabolique il
n'est pas moins correct de considrer [ A ] comme une fonction de v. Dans ce cas, nous
pouvons considrer la mme rgion comme proche d'une catastrophe, puisque de faibles
variations de v produisent de trs grandes variations de [ A ].
10 CINTIQUES DES SYSTMES MULTI-ENZYMATIQUES 339
stationnaire. (Notons que l'tat stationnaire peut ne jamais tre atteint et que s'il en
existe un, il n'est pas ncessairement unique : par souci de simplicit, cependant,
nous supposerons qu'il n'existe qu'un seul tat stationnaire possible). Si nous
considrons S1, par exemple, il est vident que l'tat stationnaire implique que la
vitesse v1 laquelle il est produit doit tre gale la vitesse v2 laquelle il est
consomm. Un tat stationnaire pour S2 de la mme manire implique que v2 = v3 et
ainsi de suite ; quand tous les mtabolites sont l'tat stationnaire toutes les
vitesses enzymatiques doivent tre gales les unes aux autres, une situation qui est
caractrise par une valeur J, qui est le flux travers la voie mtabolique. Cette
galit de toutes les vitesses provient du fait que la figure 10.2 dfinit une voie
non-branche. Si la voie mtabolique est branche, les relations sont plus comple-
xes, mais les principes sont directs et vidents : le flux total entrant au niveau de
chaque mtabolite situ un branchement est gal au flux sortant.
Les vitesses enzymatiques sont des proprits locales, parce qu'elles font rfrence
des enzymes isols du systme. Les flux l'tat stationnaire et les concentrations
de mtabolites, par contre, sont des proprits systmiques 3. Les lasticits sont
galement des proprits locales, mais elles sont analogues des proprits
systmiques appeles coefficients de contrle. Supposons qu'un changement quel-
conque d'un paramtre externe p (non dfini pour le moment prsent) provoque le
changement d'une vitesse locale vi quand l'enzyme Ei est isol, quel sera l'effet
correspondant sur le flux du systme quand Ei est intgr dans le systme ? Ce
rsultat n'est pas connu a priori et le iime coefficient de contrle du flux est dfini
par le rapport suivant de drives :
ln J
ln p ln J
CiJ = = [10.12]
ln vi ln vi
ln p
La forme la plus simple prsente ici droite n'est pas strictement correcte parce
que vi n'est pas une vritable variable indpendante du systme, mais elle reste
acceptable pour autant que nous rappelions qu'il existe toujours un paramtre
externe p qui est impliqu, mme s'il n'apparat pas explicitement. Cette dfinition
correspond la manire dont HEINRICH et RAPOPORT (1974) ont dfini leur force
de contrle. Par opposition, le coefficient de sensibilit de KACSER et BURNS
(1973) a t dfini en termes de l'effet des changements de la concentration
d'enzyme sur le flux (ces deux termes ont t supplants dans les tudes modernes
par le coefficient de contrle) :
ln J
CiJ = [10.13]
ln [ Ei ]
3. La distinction entre flux et vitesse faite dans l'analyse du contrle mtabolique n'a
pas de correspondance vidente avec la distinction entre vitesse et flux faite dans
les expriences de marquage radioactif ( 7.5.1).
342 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Ces dfinitions peuvent paratre diffrentes, mais si l'quation [10.7] est vrifie,
c'est--dire si chaque vitesse enzymatique est proportionnelle la concentration
totale d'enzyme, les quations [10.12] et [10.13] sont quivalentes. L'qua-
tion [10.12] a l'avantage d'viter l'erreur de comprhension largement rpandue qui
est de considrer que l'analyse du contrle mtabolique est limite aux effets des
changements de concentration d'enzyme. Initialement, il tait habituel de suivre
KACSER et BURNS et d'utiliser des dfinitions similaires celles de l'qua-
tion [10.13], mais il est maintenant gnralement accept que les coefficients de
contrle ne doivent pas tre dfinis en terme d'un paramtre spcifique, et que
l'quation [10.12] doit tre considre comme la dfinition fondamentale du coeffi-
cient de contrle. La quantit dfinie par l'quation [10.13] peut alors plus correcte-
ment tre dsigne comme un exemple de coefficient de rponse, qui est numri-
quement gale au coefficient de contrle correspondant uniquement parce que
l'lasticit qui les relient est suppose tre gale 1 (voir 10.7 ci-dessous).
Un coefficient de contrle de la concentration est la quantit correspondante qui
dfinit les effets sur les concentrations de mtabolites, par exemple pour un
mtabolite Sj une concentration [ S j ] :
ln [ S j ]
[S j] ln p ln [ S j ]
Ci = = [10.14]
ln vi ln vi
ln p
Dans cette quation la forme la plus simple droite est sujette aux mme rserves
que celles formules pour l'quation [10.12], c'est--dire qu'elle implique l'exis-
tence d'un paramtre p mme si celui-ci n'apparat pas explicitement.
Les proprits fondamentales des coefficients de contrle sont exprimes par deux
relations d'addition, parmi lesquelles la premire, due KACSER et BURNS (1973),
dfinit la somme des coefficients de contrle de flux :
i =1CiJ
n
= 1 [10.15]
dJ = J d [ E ] + J d [ E ] + J d [ E ] + [10.17]
1 2 3
[ E1 ] [ E 2 ] [ E3 ]
En divisant tous les termes par J, en multipliant chaque terme de la partie droite de
l'quation par 1 (exprim comme un rapport de concentrations gales d'enzyme) et
en introduisant les dfinitions des coefficients de contrle de flux, nous obtenons :
dJ [ E1 ] J d [ E1 ] [ E2 ] J d [ E2 ] [ E3 ] J d [ E3 ]
= + + +
J J [ E1 ][ E1 ] J [ E2 ][ E2 ] J [ E3 ][ E3 ]
ln J d [ E1 ] ln J d [ E2 ] ln J d [ E3 ]
= + + + [10.18]
ln [ E1 ][ E1 ] ln [ E2 ][ E2 ] ln [ E3 ][ E3 ]
d [ E1 ] d [ E2 ] d [ E3 ]
= C1J + C 2J + C3J +
[ E1 ] [ E2 ] [ E3 ]
Puisque nous n'avons fait aucune supposition concernant les grandeurs des chan-
gements d [ Ei ] , except qu'ils sont petits, nous pouvons leur donner n'importe
quelle petite valeur et donc nous pouvons supposer que chaque concentration
d'enzyme change dans la mme proportion, de sorte que chaque d [ Ei ] [ Ei ] a la
mme valeur a. Une brve rflexion nous permet de raliser qu'un tel changement
est quivalent modifier l'chelle de temps sur laquelle la mesure est ralise :
donc ce changement devrait modifier tous les flux d'tat stationnaire travers le
systme d'un mme facteur a. Il s'ensuit alors que l'quation [10.18] peut tre crite
de la manire suivante :
a = C1J a + C 2J a + C3J a + [10.19]
L'essence de l'quation [10.15] est que le contrle du flux travers une voie mta-
bolique est partag par tous les enzymes du systme et qu'il n'y a aucune raison de
considrer l'existence d'une tape limitante dans le systme, c'est--dire d'une tape
catalyse par un enzyme dont les proprits dterminent le comportement cintique
de l'ensemble du systme. Si tous les coefficients de contrle de flux sont positifs,
l'ide de partage du contrle est directement vidente : aucun enzyme ne peut avoir
un coefficient de contrle de flux suprieur 1, et si un des enzymes a un coef-
ficient proche de 1, les autres doivent avoir des coefficients beaucoup plus petits.
Ceci est normalement le cas pour les voies non-branches, bien que certaines
exceptions existent, si une inhibition par le substrat ou une activation par le produit
domine le comportement de certains enzymes. Avec des voies branches, l'ide du
partage est moins claire parce que les coefficients de contrle de flux sont souvent
ngatifs et qu'ils peuvent galement tre suprieurs 1. Cependant, les gnrali-
sations suivantes s'appliquent le plus souvent (bien que pas de manire univer-
selle) : chaque enzyme possde un coefficient de contrle de flux positif pour sa
propre raction ; les coefficients de contrle de flux ngatifs numriquement signi-
ficatifs ne sont pas trs communs, se prsentant principalement pour des enzymes
et des flux qui se droulent dans des branches diffrentes, immdiatement en aval
d'un point de branchement.
Dans la mesure o ces gnralisations sont applicables, il s'ensuit que la somme des
coefficients de contrle de flux pour tous les enzymes d'une voie mtabolique lin-
aire sera approximativement gale 1, mme si cette voie constitue seulement une
partie du systme qui est tudi. Donc l'ide selon laquelle le contrle du flux
travers une voie est partag par l'ensemble des enzymes qui catalysent les ractions
de cette voie, et celle selon laquelle l'existence d'une seule tape limitante est
improbable, restent suffisamment significatives pour tre utiles mme dans le cas
de l'analyse de systmes branchs.
Pour une voie non-branche de n enzymes, il existe une seule relation d'addition
des coefficients de contrle de flux et (n 1) relations d'addition entre les coef-
ficients de contrle des concentrations, mais il existe n coefficients de contrle de
flux et n (n 1) coefficients de contrle de concentrations, ce qui au total donne n2
coefficients. En effet, les relations d'addition fournissent n quations reliant n2
inconnues. Pour calculer toutes ces inconnues, n (n 1) quations supplmentaires
sont ncessaires. Celles-ci sont obtenues partir des proprits de connectivit, que
nous allons dcrire maintenant.
10 CINTIQUES DES SYSTMES MULTI-ENZYMATIQUES 345
Bien que des complications soient amenes par l'existence de voies branches,
celles-ci n'altrent en rien le point essentiel qui est qu'un nombre suffisant de rela-
tions indpendantes entre les coefficients de contrle et les lasticits doit exister
pour qu'il soit possible, en principe, de calculer tous les coefficients de contrle.
Ces considrations non seulement tablissent que les proprits d'tat stationnaire
(les coefficients de contrle) d'un systme complet dcoulent des proprits de ses
composants (lasticits), mais elles montrent galement comment le calcul peut
tre ralis. La solution relle de n2 quations simultanes est complique si n n'est
pas trivialement petit, et dans la pratique courante, le problme est trait par
l'algbre linaire (FELL et SAURO, 1985 ; FELL, 1992). Nous n'entrerons pas ici
dans ces dtails, mais nous examinerons uniquement les rsultats d'un tel calcul
pour un exemple simple :
E1 E2 E3
X0 S1 S2 X3 [10.29]
Pour la voie trois tapes prsente dans l'quation [10.29] les trois coefficients de
contrle du flux peuvent tre exprims de la manire suivante en fonction des
lasticits :
e [v 2S 1 ] e [v 3S 2 ]
C1 = v
J
[10.30]
e [ 2S 1 ] e [v 3S 2 ] e [v1S 1 ] e [v 3S 2 ] + e [v1S 1 ] e [v 2S 2 ] e [v 2S 1 ] e [v1S 2 ]
e [v1S 1 ] e [v 3S 2 ]
C 2J = [10.31]
e [v 2S 1 ] e [v 3S 2 ] e [v1S 1 ] e [v 3S 2 ] + e [v1S 1 ] e [v 2S 2 ] e [v 2S 1 ] e [v1S 2 ]
e [v1S 1 ] e [v 2S 2 ] e [v 2S 1 ] e [v1S 2 ]
C3J = [10.32]
e [v 2S 1 ] e [v 3S 2 ] e [v1S 1 ] e [v 3S 2 ] + e [v1S 1 ] e [v 2S 2 ] e [v 2S 1 ] e [v1S 2 ]
10 CINTIQUES DES SYSTMES MULTI-ENZYMATIQUES 347
e [v1S 2 ] e [v 3S 2 ]
C 2[ S 1 ] = [10.34]
e [v 2S 1 ] e [v 3S 2 ] e [v1S 1 ] e [v 3S 2 ] + e [v1S 1 ] e [v 2S 2 ] e [v 2S 1 ] e [v1S 2 ]
e [v 2S 2 ] e [v1S 2 ]
C3[ S 1 ] = [10.35]
e [v 2S 1 ] e [v 3S 2 ] e [v1S 1 ] e [v 3S 2 ] + e [v1S 1 ] e [v 2S 2 ] e [v 2S 1 ] e [v1S 2 ]
Ces quations ont le mme dnominateur que celles pour les coefficients de
contrle de flux, quations [10.30] [10.32], mais maintenant chaque terme du
numrateur contient une lasticit de moins que les termes du dnominateur,
puisque la concentration [S1] qui apparat comme un indice dans la partie gauche
de l'quation n'apparat pas parmi les lasticits au numrateur. Comme prc-
demment, l'enzyme modul est manquant de tous les produits, et un enzyme
supplmentaire est manquant dans chaque produit. Chaque terme du numrateur
apparat deux fois dans les trois expressions, avec des signes opposs ; par exem-
ple, le terme e [v 3S 2 ] dans l'quation [10.33] est balanc par le terme e [v 3S 2 ] dans l'-
quation [10.34]. Cette balance entre les termes du numrateur assure que la relation
d'addition de l'quation [10.16] est vrifie.
348 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Bien que nous vitions l'algbre linaire autant que possible dans ce manuel, les
lecteurs familiers avec celui-ci trouveront peut tre utile d'analyser les rsultats du
paragraphe prcdent sous une forme permettant leur comparaison avec les articles
de revues qui utilisent la formulation matricielle. Celle-ci devient presque indis-
pensable pour appliquer l'analyse du contrle mtabolique un niveau autre que le
niveau lmentaire.
Considrons, par exemple, l'quation suivante dans laquelle nous ferons rfrence
la premire matrice comme la matrice C, la seconde comme la matrice et la partie
droite comme la matrice unit :
C1J C 2J C3J 1 e [v1S ] e [v1S 2 ] 1 0 0
[ S1 ] 1
C1 C 2[ S 1 ] [ S1 ]
C3 1 e [ S 1 ] v2
e [v 2S 2 ] = 0 1 0 [10.36]
[S2] 0 0 1
C1 C 2[ S 2 ] C3[ S 2 ] 1 0 e [v 3S 2 ]
Notons premirement que la premire ligne de la matrice C contient les trois coef-
ficients de contrle de flux, alors que les lignes deux et trois contiennent respecti-
vement les coefficients de contrle des concentrations pour les deux interm-
diaires S1 et S2. La matrice contient un vecteur unit dans la premire colonne
alors que les autres entres contiennent toutes les lasticits, parmi lesquelles e [v 3S 1 ]
est remplace par 0 puisque S1 est suppos dans l'quation [10.29] n'avoir aucun
effet sur E3. Le produit de la premire ligne de C et de la premire colonne de
donne la premire entre dans le coin suprieur gauche de la matrice unit, c'est--
dire 1, et donc exprime la relation d'addition pour les coefficients de contrle de
flux (voir quations [10.15] et [10.20]). D'une manire similaire, les relations
d'addition des coefficients de contrle des concentrations sont exprimes par les
produits des autres lignes de C et de la premire colonne de . La relation de
connectivit pour les coefficients de contrle de flux est exprime par le produit de
la ligne suprieure de C et des lignes de , autres que la premire. Les relations de
connectivit pour les coefficients de contrle des concentrations sont exprimes par
tous les autres produits possibles qui n'ont pas t mentionns ici explicitement.
qui ne sont pas des substrats ou des produits de plusieurs enzymes la fois, auront
uniquement ces deux lasticits non-nulles, et la relation de connectivit prendra
alors une forme simple. Par exemple, pour S1 dans l'quation [10.29], nous
obtenons :
C1J e [v1S 1 ] = C 2J e [v 2S 1 ] [10.37]
qui montre que le rapport des coefficients de contrle de flux de deux enzymes
conscutifs est gal moins la rciproque du rapport des lasticits du mtabolite
qui les connecte (d'o le nom de relation de connectivit) :
C1J e [v 2S 1 ]
= [10.38]
C 2J e [v1S 1 ]
Cette relation permet de se dplacer le long d'une voie en reliant les coefficients
de contrle par paires et puisque les coefficients de contrle sont en principe
beaucoup plus difficiles mesurer directement que les lasticits, cette relation
constitue un avantage important.
Bien qu'il soit parfois commode pour l'algbre de traiter les changements de
l'activit d'un enzyme comme s'ils rsultaient de changements de la concentration
de l'enzyme, en ralit, les effets sur le systme sont exactement les mmes, quelle
que soit la manire dont ils sont provoqus. La justification de cette affirmation
provient du traitement de l'effet d'effecteurs externes sur les enzymes.
Comme un analogue du coefficient de contrle, qui exprime la dpendance d'une
variable du systme telle que le flux, vis--vis d'un paramtre interne tel que
l'activit de l'enzyme, nous pouvons dfinir un coefficient de rponse, R[JZ ] , pour
exprimer la dpendance d'une variable du systme vis--vis d'un paramtre externe,
tel que la concentration [ Z ] d'un effecteur externe Z :
ln J
R[JZ ] = [10.41]
ln [ Z ]
Un effecteur externe tel que Z peut uniquement produire un effet systmique en
agissant sur un ou plusieurs enzymes du systme. Donc, il doit avoir au moins une
lasticit de valeur non-nulle e [vZi ] , dfinie exactement de la mme manire que les
autres lasticits :
ln vi
e [vZi ] = [10.42]
ln [ Z ]
Nous considrons maintenant comment ces deux quantits sont relies l'une
l'autre et comment elles sont relies au coefficient de contrle de flux de l'enzyme
sur lequel Z agit. Tout effet de Z sur le systme peut tre contrebalanc par un
changement de la concentration d'enzyme d'une quantit juste suffisante pour que
l'effet net soit nul.
10 CINTIQUES DES SYSTMES MULTI-ENZYMATIQUES 351
Ainsi, nous pouvons crire qu'un changement nul de la vitesse est gal la somme
de deux effets non-nuls :
dvi d [ Z ] d [ Ei ]
= e [vZi ] + = 0 [10.43]
vi [Z] [ Ei ]
et le changement nul dans le flux est aussi gal la somme de deux termes :
dJ = RJ d [ Z ] + C J d [ Ei ] = 0 [10.44]
[Z ] i
J [Z] [ Ei ]
En divisant une quation par l'autre, nous obtenons une relation importante,
appele la rponse partage, qui exprime le fait que le coefficient de rponse est le
produit de l'lasticit de l'effecteur pour l'enzyme sur lequel il agit et du coefficient
de contrle de cet enzyme :
R[JZ ] = CiJ e [vZi ] (10.45)
Bien que nous ayons considr ici les effets sur les flux, la mme relation
s'applique toute variable du systme, ainsi J dans l'quation [10.45] peut repr-
senter non seulement un flux quelconque mais aussi une concentration.
La rponse partage explique pourquoi les effets sur l'activit de l'enzyme peuvent
tre traits comme s'ils correspondaient des changements de la concentration de
l'enzyme ; elle explique galement la diffrence entre les dfinitions d'un coef-
ficient de contrle donnes dans les quations [10.12] et [10.13] : celles-ci ne sont
apparemment quivalentes que parce que l'quation [10.7] est suppose vraie ; il
existe une lasticit implicite de valeur unit qui relie le coefficient de rponse, tel
qu'il est dfini par l'quation [10.13], au coefficient de contrle, tel qu'il est dfini
par l'quation [10.12]. En gnral, tout coefficient de rponse peut tre crit comme
le produit d'un coefficient de contrle et d'une lasticit. Une brve rflexion
montre qu'une relation de ce type doit manifestement s'appliquer : tout effecteur
peut seulement agir sur une variable du systme en altrant l'activit d'un enzyme,
et la transmission de cet effet primaire est module en accord avec le coefficient de
contrle de l'enzyme en question.
Bien que les ides essentielles qui prsident l'analyse du contrle mtabolique
datent des annes 1973-1974 et que leurs racines sont chercher dans le travail
d'HIGGINS (1965) une dcennie plus tt, elles se sont intgres trs lentement dans
le courant principal de pense de la rgulation mtabolique. En effet, il a fallu
attendre presque une dizaine d'annes avant qu'elles ne soient tendues de nou-
veaux systmes mtaboliques comme la respiration (GROEN et al., 1982a) et la
noglucogense (GROEN et al., 1982b, 1983). Cette lente acceptation de l'analyse
352 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Il s'ensuit donc que nous ne pouvons pas esprer comprendre le rle de l'inhibition
par un produit terminal dans la rgulation mtabolique sauf si nous reprsentons les
voies mtaboliques comme des composants de systmes qui font apparatre expli-
citement qu'il existe des tapes aprs la libration des produits terminaux . Ainsi
dans leur discussion de l'inhibition rtroactive, KACSER et BURNS (1973) ont inclu
une tape aprs la formation du produit terminal, bien qu'ils n'expliquent pas leur
raison d'agir de la sorte.
Pour intgrer les concepts classiques de rgulation dans l'analyse du contrle mta-
bolique (HOFMEYER et CORNISH-BOWDEN, 1991, 2000), nous pouvons reprsenter
une voie mtabolique avec une inhibition rtroactive sous la forme d'une voie
deux tapes, compose d'un bloc de fourniture, constitu de toutes les ractions qui
conduisent au produit terminal et d'un bloc de demande, constitu de toutes les
ractions qui consomment ce produit terminal (figure 10.3). Si le bloc de fourniture
composait l'entiret de la voie, le produit terminal serait un paramtre externe et
tous les effets qu'il aurait sur le flux devraient tre traits sous la forme d'un
coefficient de rponse R[J Ss 3 ] , mais ce coefficient de rponse est conceptuellement
identique l'lasticit du bloc e [v123
S3]
qui dfinit son effet sur le flux de fourniture
considr comme la vitesse locale.
"Produit Bloc de
Bloc de fourniture final" demande
Inhibition
E1 E2 E3 E4
X0 S1 S2 S3
Il dcoule de ce type de discussion que les limites d'un systme et les distinctions
entre paramtres externes et internes ou entre les proprits locales et systmiques
ne peuvent pas tre considres comme absolues. Pour comprendre comment un
produit terminal comme S3 dans la figure 10.3 peut remplir son rle de rgulation,
il n'est pas suffisant de le considrer uniquement comme un mtabolite interne ;
nous devons aussi tudier les sous-systmes dans lesquels il agit en tant que
354 CINTIQUE ENZYMATIQUE
paramtre externe, de sorte que nous pouvons nous poser la question : si le bloc de
fourniture (figure 10.3) reprsentait le systme complet, quel serait l'effet de S3 sur
le flux de fourniture ?
En utilisant ce type d'analyse, nous pouvons tudier comment une voie telle que
celle dcrite dans la figure 10.3 peut tre efficacement rgule par la demande, par
quoi nous entendons non seulement que le flux rponde de manire sensible aux
changements dans la demande, mais galement que la concentration de produit
terminal varie peu lorsque le flux varie. Il apparat que le point essentiel est que
l'lasticit de fourniture e [v123
S3]
dans le systme complet, qui est identique au coeffi-
cient de rponse R[J Ss 3 ] dans le bloc de fourniture quand celui-ci est considr isol-
ment, doit tre aussi grand que possible en grandeur absolue. Puisqu'il s'agit d'une
lasticit d'inhibition, elle est ngative, de sorte que aussi grande que possible
signifie infrieure 2 . L'lasticit de demande e [v 4S 3 ] est moins importante,
puisqu'une rgulation efficace peut tre ralise sur une large gamme de valeurs.
Les rsultats d'une tude de l'importance de la cooprativit de la rgulation
(HOFMEYR et CORNISH-BOWDEN, 1991) sont apparus surprenants puisque,
premire vue, ils suggraient que celle-ci est beaucoup moins importante qu'on ne
l'avait imagin depuis les annes 1960. Nanmoins, il faut mettre en vidence qu'il
ne s'agissait l que d'une illusion : la cooprativit est certainement ncessaire pour
une rgulation efficace comme cela avait t propos, mais son rle est quelque
peu diffrent de celui que l'on peut navement imaginer.
Modifier le degr de cooprativit dans l'inhibition rtroactive de E1 par S3 dans
la figure 10.3, dans la gamme des coefficients de HILL allant de 1 (non coopratif)
4 (approximativement la cooprativit maximale observe pour une interaction
unique effecteur-enzyme), n'a presque aucun effet sur le contrle du flux par la
demande : les courbes montrant le flux en fonction de la demande (exprime
comme la vitesse limite V4 du bloc de demande) indiquent une proportionnalit
quasi parfaite entre le flux et la demande sur une gamme de 25 fois, quelle que soit
la valeur du coefficient de HILL. Ceci peut surprendre celui qui pense que la
cooprativit est essentielle pour la rgulation du flux. Cependant, comme nous
l'avons dj mentionn, la rgulation du flux reprsente seulement une partie de la
rgulation, et elle est de peu d'importance sans la rgulation de la concentration :
nous ne serions pas heureux de disposer d'un rfrigrateur qui tolre une large
gamme de flux de chaleur mais qui n'a aucun contrle sur la temprature interne !
Quand la concentration du produit terminal est considre de la mme manire que
le flux, l'effet du coefficient de HILL devient trs important : sur la mme gamme
d'une variation de 25 fois de la demande considre auparavant, un coefficient de
HILL de 4 maintient la variation de [ S3 ] dans une gamme de variation de trois
fois, alors qu'un coefficient de 1 le maintient dans une gamme de variation de dix
fois pour une variation de la demande de seulement trois fois.
10 CINTIQUES DES SYSTMES MULTI-ENZYMATIQUES 355
Dans une large mesure, l'analyse du contrle mtabolique prend en compte les
proprits des enzymes individuels telles qu'elles sont, considrant une explication
mcanique de ces proprits comme en dehors de son domaine. De plus, nous
avons dj discut les mcanismes principaux de rgulation dans le chapitre 9 de
ce manuel et il n'est pas ncessaire de revenir sur ce sujet. Nanmoins, en plus de
ceux discuts auparavant, il existe trois mcanismes de rgulation qui impliquent
plusieurs enzymes et qui ncessitent une discussion plus complte : il s'agit de la
canalisation 5 d'intermdiaires entre plusieurs enzymes, des cascades d'enzymes
convertibles impliquant des modifications covalentes et de l'amplification des
effets de petites variations de la concentration d'ATP par l'adnylate kinase.
La canalisation implique l'ide que le mtabolite partag par deux enzymes cons-
cutifs dans une voie peut tre transfr directement d'un enzyme vers l'autre sans
tre libr sous forme libre dans la solution ou au moins sans atteindre un quilibre
avec le mtabolite prsent dans la solution. Il existe plusieurs variations sur ce
thme (voir le schma 1 de OVDI, 1991), mais les points essentiels sont prsents
dans la figure 10.4a, qui est base sur le mcanisme propos par GUTFREUND
(1965). Ceci peut tre considr comme une combinaison entre une canalisation
pure (figure 10.4b) et un mcanisme ordinaire de libre diffusion (figure 10.4c).
Bien qu'il existe au moins un cas, celui de l'enzyme multifonctionnel dnomm
tryptophane synthtase, pour lequel les preuves d'une canalisation (de l'indole) sont
abondantes et gnralement acceptes (voir YANOFSKY, 1989), la canalisation reste
controverse en gnral, du moins pour les enzymes qui forment des complexes
dynamiques , c'est--dire des complexes qui existent seulement transitoirement
pendant le transfert du mtabolite.
Les enzymes malate dshydrognase et citrate synthtase illustrent le type de diffi-
cults qui surviennent lorsque l'on essaye de prouver le phnomne de canalisation.
LINDBLADH et al. (1994) ont construit une protine fusion avec ces deux
enzymes issus de la levure, c'est--dire qu'ils ont utilis les techniques de gnie
5. En anglais, channeling.
356 CINTIQUE ENZYMATIQUE
gntique pour produire une seule protine prsentant les deux activits et
SHATALIN et al. (1999) ont ralis la mme construction pour la mme paire
d'enzymes issus du porc.
S1 E1 S2 E2 S3
Premier Intermdiaire Second
substrat libre en solution produit
E1E2S2
Intermdiaire
canalis
E2 E1
a - Canalisation dynamique
E1E2S2
Intermdiaire
canalis
E2 E1
b - Canalisation parfaite
S1 E1 S2 E2 S3
Premier Intermdiaire Second
substrat libre en solution produit
Dans les deux cas, le dlai transitoire dans la formation du produit est plus court
avec la protine fusion qu'il ne l'est avec les enzymes libres, suggrant que l'inter-
mdiaire oxaloactate est canalis entre les sites actifs. Pour tablir cette conclu-
sion, il est ncessaire de supposer que les enzymes ont exactement les mmes
proprits cintiques quand ils sont fusionns l'un l'autre que quand ils sont
spars. Quand cette proprit a t soigneusement vrifie pour la protine fusion
des enzymes de levure, les paramtres cintiques obtenu diffraient de ceux des
enzymes libres, suffisamment pour expliquer la diminution du dlai (PETTERSON et
al., 2000), sans avoir recours l'existence d'une canalisation.
La controverse au sujet de savoir si la canalisation existe rellement dans les
systmes o elle a t propose, est certainement importante en relation avec le
contrle mtabolique, puisque si elle ne s'effectue pas, elle ne peut pas avoir d'in-
fluence sur le contrle. Nanmoins, il ne s'agit l que d'une partie de la question,
puisque mme si elle existe, il n'est pas ncessaire qu'elle joue un rle significatif
sur le mtabolisme. Ce point a t beaucoup moins discut, probablement parce
que les avantages de la canalisation semblent vidents, en raison de la confusion
entre les proprits de la canalisation parfaite et celles du mcanisme de
canalisation dynamique qui est le sujet de la controverse.
Il peut sembler intuitif que mme dans un mcanisme tel que celui de la
figure 10.4a, une augmentation de la vitesse des tapes de canalisation au dpend
des tapes de libre diffusion devrait augmenter la concentration l'tat stationnaire
de l'intermdiaire libre, mais il s'agit ici d'une illusion. Bien qu'une telle aug-
mentation puisse diminuer la vitesse laquelle S2 est libr du complexe E1S2, elle
diminuera galement la vitesse laquelle S2 est fix par E2 et le rsultat net peut
pencher d'un ct ou de l'autre. Qu'il y ait un petit effet ou non est purement une
question de dfinition, puisqu'il n'est pas facile de distinguer les effets authentiques
d'une canalisation des effets qui pourraient provenir de changements de l'activit
catalytique de l'enzyme qui ne sont pas lis la canalisation ; nanmoins, il n'y a
aucun doute que, mme si la canalisation a un effet sur les concentrations
d'intermdiaires l'tat stationnaire, il est trop faible pour jouer un rle rgulateur
utile (CORNISH-BOWDEN et CRDENAS, 1993). Pour cette raison, il n'est pas
ncessaire de considrer d'avantage cet effet dans notre discussion.
La cooprativit des interactions pour des enzymes individuels est une manire trs
importante de rendre une inhibition rtroactive plus efficace en tant que mcanisme
de rgulation. Elle a cependant un srieux inconvnient qui l'empche de fournir un
moyen universel d'augmenter les lasticits : le degr de cooprativit est sv-
rement limit en pratique par le fait que les enzymes ayant un coefficient de HILL
suprieur 4 sont trs rares ; puisque l'lasticit pour une interaction ne peut pas
excder le coefficient de HILL correspondant, cela signifie que les interactions
358 CINTIQUE ENZYMATIQUE
G G
Effecteur Effecteur
E1
Inactif en absence
Eb de G
Inactif
E1
Enzyme Cycle de Activation
allostrique E2 modification E1G
Inhibition (unidirectionnel)
Activation
EG E2G Ea
Inactif en absence
Raction cible de G fix Raction cible
X Y X Y
a - Activation allostrique b - Activation par un systme cyclique
Les systmes d'enzymes convertibles sont connus depuis plus d'un quart de sicle
et de nombreux exemples sont connus, incluant de nombreuses kinases et phos-
phatases de protines (KREBS et BEAVO, 1979). La glutamine synthtase d'E. coli,
qui est inactive par adnylation et ractive par dadnylation (CHOCK, RHEE et
STADTMAN, 1980, 1990), a t tudie en dtails et a servi de base pour un travail
thorique extensif (CHOCK et STADTMAN, 1977 ; STADTMAN et CHOCK, 1977,
1978).
Dans le contexte de ce chapitre, le point essentiel est que les systmes d'enzymes
convertibles peuvent gnrer des sensibilits trs leves aux signaux, beaucoup
plus leves que ce qui n'est possible pour les enzymes seuls (GOLBETER et
KOSHLAND, 1981, 1984). Il est tentant de supposer que cette sensibilit leve est
inhrente la structure du cycle, mais en ralit, si des valeurs arbitraires sont
donnes aux paramtres cintiques de la raction cyclique, le rsultat typique est un
systme qui gnre une sensibilit plus faible qu'un enzyme non-coopratif isol.
10 CINTIQUES DES SYSTMES MULTI-ENZYMATIQUES 359
Une trs grande sensibilit est obtenue uniquement si plusieurs conditions sont
remplies (CRDENAS et CORNISH-BOWDEN, 1989) :
les interactions de l'effecteur avec les enzymes modifiants devraient tre cata-
lytiques plutt que spcifiques (anti-comptitives plutt que comptitives dans la
terminologie de l'inhibition) ;
la raction d'inactivation devrait cesser d'oprer des concentrations d'effecteur
beaucoup plus faibles que celles qui sont ncessaires pour stimuler la raction
d'activation ;
les deux enzymes modifiants devraient fonctionner dans des conditions proches
de la saturation, une caractristique particulirement mise en vidence par
GOLDBETER et KOSHLAND (1981, 1982, 1984) sous le nom d' ultra-sensibilit
d'ordre zro . Si toutes ces conditions sont satisfaites, la sensibilit accessible
avec le mcanisme de la figure 10.5 est considrablement plus grande qu'avec un
enzyme isol ; mme avec des contraintes svres imposes aux paramtres
cintiques des enzymes modifiants, nous pouvons facilement obtenir l'quivalent
d'un coefficient de HILL de 30 ou de 800 si nous relchons les contraintes, tout en
restant dans la gamme de comportements communment observs avec les
enzymes rels (CRDENAS et CORNISH-BOWDEN, 1989).
Les deux premires de ces conditions impliquent que les exprimentateurs
devraient prendre un soin particulier noter ce qui pourrait apparatre comme des
proprits cintiques insignifiantes des enzymes modifiants. Mme si la compo-
sante anti-comptitive de l'inhibition d'un enzyme modifiant est un ordre de gran-
deur plus faible que la composante comptitive, elle peut encore tre essentielle
pour un travail efficace du systme. De la mme manire, si nous observons que la
phosphatase implique dans un cycle est active uniquement des concentrations
apparemment non-physiologiques d'un effecteur, dix fois plus leves que celles
qui sont efficaces pour inhiber la kinase, cela ne signifie pas que l'effecteur est sans
intrt pour l'action de la phosphatase ; cela signifie que l'ensemble du systme est
bien mis au point pour gnrer une sensibilit trs leve.
Puisque les systmes d'enzymes convertibles peuvent gnrer une bien meilleure
sensibilit que des enzymes coopratifs, nous pouvons nous demander pourquoi ils
ne sont pas universellement utiliss dans la rgulation mtabolique. Contrairement
aux enzymes coopratifs, les systmes d'enzymes convertibles consomment de
l'nergie, parce que les deux ractions de modification sont supposes tre irrver-
sibles ; ceci n'est uniquement possible que si elles impliquent des co-substrats
diffrents, par exemple l'activation peut tre la phosphorylation par l'ATP, alors
que l'inactivation peut tre l'hydrolyse par l'eau.
Le troisime mcanisme que nous considrerons ici est celui qui est le moins discut
dans l'analyse du contrle mtabolique, probablement parce que son existence est
360 CINTIQUE ENZYMATIQUE
connue depuis si longtemps (il a t suggr pour la premire fois par KREBS
(1964)) qu'il a t oubli en tant que mcanisme multi-enzymatique de rgulation.
Il concerne l'adnylate kinase (souvent appel myokinase) qui catalyse la conver-
sion entre trois nuclotides adnyliques :
ATP + AMP 2 ADP [10.46]
L'adnylate kinase est prsente avec une activit catalytique trs leve dans
certains tissus (tel que le muscle), o premire vue sa raction apparat n'avoir
aucune fonction mtabolique ; certainement dans de nombreuses cellules o l'en-
zyme est trouv, le flux long terme travers la raction est ngligemment faible.
Pourquoi alors, est-il prsent et pourquoi avec une activit si leve ? Il n'est pas
suffisant d'affirmer simplement que son rle est de maintenir la raction l'qui-
libre, parce que les concentrations d'ATP et d'ADP changent normalement si peu
que la raction pourrait difficilement se trouver loigne de sa position d'quilibre,
mme si la concentration d'enzyme tait beaucoup plus faible. La rponse semble
tre que si les nuclotides d'adnine existent de manire prdominante sous la
forme d'ATP, et que si l'quation [10.46] est toujours l'quilibre, pas juste de
manire approximative mais exactement, alors les petites variations dans la balance
entre l'ATP et l'ADP se traduisent par de larges variations relatives de la concentra-
tion d'AMP, de sorte que les enzymes qui sont spcifiquement affects par l'AMP
peuvent rpondre avec une grande sensibilit aux petites variations originales.
Cette ide est illustre dans la figure 10.6, dont la partie suprieure montre que, si
les trois nuclotides d'adnine sont maintenus une concentration totale
[ ATP ] + [ ADP ] + [ AMP ] = 5 mM
[ ATP ] + [ AMP ]
avec une constante d'quilibre = 0 ,5 , les concentrations d'ATP
[ ADP ] 2
autour de 4 mM correspondent de si faibles concentrations d'AMP que, quelle
que soit la variation de la concentration d'ATP, celle-ci se traduit par une variation
oppose et presque gale de la concentration d'ADP. A premire vue cela ne semble
pas nettement diffrent de ce que nous aurions si l'AMP tait absent. Cependant,
bien que sa concentration dans ces conditions est faible, ces variations fraction-
nelles sont trs importantes en comparaison de celles de l'ATP et de l'ADP. Tous
les enzymes qui fixent l'AMP trs fortement (de sorte qu'ils peuvent le dtecter
mme si sa concentration est trs faible par rapport celles de l'ATP et de l'ADP)
peuvent rpondre avec une sensibilit importante comme l'illustre la figure 10.6b.
La prsence d'une activit leve de l'adnylate kinase dans la cellule permet donc
l'AMP d'agir comme un amplificateur de signaux de faibles amplitudes : dans
l'exemple de la figure 10.6, une variation de 5% de la concentration d'ATP produit
seulement une variation de 2,8% de la vitesse si l'enzyme n'est pas sensible
l'AMP, mais provoque une variation de 20% si l'enzyme est sensible ; en effet, le
mcanisme a augment l'lasticit efficace vis--vis de l'AMP par un facteur sup-
rieur 7, partir d'une valeur d'environ 0,56 (2,8/5) jusqu' une valeur de 4 (20/5).
10 CINTIQUES DES SYSTMES MULTI-ENZYMATIQUES 361
5
[AMP] ou [ADP] (mM)
4 [AMP]
25 [AMP]
3
a
2
1 [ADP]
0
0 1 2 3 4 5 [ATP] (mM)
v 15
2,8%
10
20%
Aucun effet
5 de l'AMP
Inhibition
par l'AMP
b
0 0,5
0
5%
0,5
0 0,1 0,2
5
0 1 2 3 4 5 [ATP] (mM)
10.6 - Effet de l'adnylate kinase
(a) Si les trois nuclotides d'adnine sont toujours l'quilibre, les faibles variations de la
concentration d'ATP autour de 4 mM rsultent dans des variations relatives importantes
de la concentration d'AMP. (b) Ceci permet un enzyme qui fixe fermement l'AMP pour
prsenter une plus importante rponse l'ATP que s'il n'y avait pas de variation dans la
concentration d'AMP. Les courbes dans la figure (b) ont t calcules en supposant des
cintiques de MICHAELIS et MENTEN vis--vis de l'ATP et de l'ADP, et une simple inhibition
comptitive par l'AMP. Si les rponses individuelles taient coopratives, les effets nets
pourraient tre beaucoup plus grands que ceux qui sont prsents. Les faibles vitesses
ngatives aux faibles concentrations d'ATP (rgion agrandie dans l'insert) sont dues la
raction inverse, qui a lieu (quoiqu' un faible taux) quand le rapport [ ATP ] /[ ADP ] est
suffisamment petit.
Par lui-mme cet effet ne permet pas d'expliquer entirement, par exemple, l'aug-
mentation d'un facteur 100 du flux glycolytique dans les muscles de vol des
insectes quand la concentration d'ATP diminue de 10% et que la concentration
d'AMP augmentate simultanment de 2,5 fois (SACKTOR et WORMSER-SHAVIT,
1966 ; SACKTOR et HURLBUT, 1966), mais il contribue certainement de manire
prpondrante cette rponse. D'autant que les enzymes qui sont sensibles l'AMP
362 CINTIQUE ENZYMATIQUE
PROBLMES
10.1 - Considrons un enzyme avec une vitesse donne par l'quation de HILL
V [ A ]h
(quation [9.3]), c'est--dire v = , dans des conditions o
( K0h,5 + [ A ]h )
la raction est hors quilibre et l'inhibition par le produit est ngli-
geable. Quelle est la valeur de l'lasticit e [v A ] quand l'enzyme est
moiti satur, c'est--dire quand [ A ] = K0 ,5 ? Quelles valeurs limites
prend-elle lorsque [ A ] devient trs petit ou trs grand ?
10.2 - Pour la voie trois tapes de l'quation [10.29], calculer les coefficients
de contrle du flux dans des conditions o les lasticits vis--vis des
deux intermdiaires sont les suivantes :
e [v1S 1 ] = 0, 2, e [v 2S 1 ] = 0, 3, e [v 2S 2 ] = 0,1, e [v 3S 1 ] = 0, 2.
(Supposer que S1 n'a aucun effet sur E3 et que S2 n'a aucun effet sur E1,
c'est--dire e [v 3S 1 ] = e [v1S 2 ] = 0 ).
10.5 - Une grande partie de la biotechnologie moderne est base sur le prin-
cipe que l'identification des enzymes qui catalysent les tapes limitant
la vitesse dans une voie qui conduit au produit recherch, le clonage de
ces enzymes et leur sur-expression dans des organismes adapts per-
mettront d'obtenir des rendements levs des produits dsirs.
Quelles implications l'analyse du prsent chapitre a-t-elle sur une telle
stratgie ?
11 LES RACTIONS RAPIDES
Une phase transitoire est reprsente par un terme de la forme A e( t t ) dans une
quation qui exprime la variation d'une quantit donne en fonction du temps.
Etant donn que t, une constante appele temps de relaxation ou constante de
temps, est une grandeur strictement positive, chaque phase transitoire a une valeur
finie de A, connue sous le nom d'amplitude, quand t = 0, mais qui diminue en ten-
dant vers zro lorsque t augmente et qui fini ventuellement par devenir ngli-
geable. Nous avons rencontr plusieurs exemples de phase transitoire notamment
dans le chapitre 1 : le second terme de l'quation [1.10], par exemple, est une phase
transitoire dont le temps de relaxation vaut 1 k et dont l'amplitude vaut [ A ]0 .
Comme l'illustre cet exemple, un temps de relaxation correspond l'inverse d'une
constante de vitesse de premier ordre ou de pseudo-premier ordre. Des phases tran-
sitoires apparaissent toujours dans les quations cintiques qui dcrivent les rac-
tions catalyses par des enzymes sauf si celles-ci sont drives en utilisant l'hypo-
thse de l'tat stationnaire. Cela signifie qu'il y a toujours une priode avant que
l'tat stationnaire ne soit tabli et durant laquelle l'hypothse de l'tat stationnaire
n'est pas valable. Cette priode est appele la phase transitoire de la raction.
Il semble vident que les mthodes exprimentales ncessaires pour tudier des
ractions trs rapides, se droulant sur des temps infrieurs la seconde, doivent
tre diffrentes de celles utilises pour tudier les ractions lentes, tout simplement
parce que la majorit des mthodes habituelles ncessitent un temps de l'ordre de
plusieurs secondes pour mlanger les ractifs. Par contre, il est peut tre moins vi-
dent que des quations cintiques diffrentes soient galement ncessaires pour
analyser ces phnomnes rapides. Avec la majorit des ractions catalyses par des
enzymes, l'tat stationnaire est tabli suffisamment rapidement pour que celui-ci
soit considr comme existant pendant toute la dure de la mesure, condition que
les premires secondes aprs le mlange ne soient pas incluses dans cette priode
(voir 3.3.7). En consquence, la plupart des quations que nous avons discutes
dans ce manuel reposent sur l'hypothse de l'tat stationnaire. Inversement, les
ractions rapides concernent, presque par dfinition, la phase transitoire existant
366 CINTIQUE ENZYMATIQUE
avant l'tablissement de l'tat stationnaire et ne peuvent donc pas tre dcrites par
les quations de vitesse l'tat stationnaire. Ce chapitre est consacr aux aspects
exprimentaux et thoriques de l'tude des phases transitoires, mais avant d'aborder
ces problmes, il est utile de se demander quoi peut servir de s'intresser aux
mesures des phases transitoires : que pouvons-nous apprendre de l'tude de ces
phases que nous ne puissions apprendre des cintiques l'tat stationnaire ?
Les mesures l'tat stationnaire ont t trs utiles pour lucider les mcanismes des
ractions enzymatiques, mais elles prsentent le dsavantage que, la vitesse l'tat
stationnaire d'une raction impliquant plusieurs tapes concide, dans le meilleur
des cas, avec la vitesse de l'tape la plus lente et ne fournit en aucun cas d'infor-
mation sur les tapes les plus rapides. Pour comprendre le mcanisme d'une rac-
tion enzymatique, il est ncessaire d'obtenir des informations sur les tapes rapides
autant que sur les tapes lentes.
Avant de poursuivre cette discussion, nous devons nous dbarrasser d'une absurdit
apparente introduite dans le chapitre prcdent. Pour un processus linaire dans des
conditions d'tat stationnaire, toutes les tapes se droulent une mme vitesse,
donc il semble injustifi de dsigner l'une de ces tapes comme tant l' tape la
plus lente et NORTHROP (2001), par exemple, appelle cela un terme
inappropri . Si nous considrons que le plus lent signifie qui se droule la
vitesse la plus faible, alors NORTHROP a certainement raison, mais si nous consi-
drons que cela signifie qui compte pour la majeure partie du temps total, alors une
vue diffrente est possible.
Si nous considrons l'quation [7.20] (ou l'quation [3.99b], qui est quivalente)
comme un exemple simple, nous pouvons l'crire dans sa forme rciproque de la
manire suivante :
1 = 1 + K1 + K1 K 2 [12.0]
kA k1 k 2 k3
o K1 = k 1 k1 et K 2 = k 2 k 2 sont les constantes d'quilibre (crites dans la direc-
tion inverse) pour les tapes 1 et 2. En gnralisant cela, nous voyons que la rci-
proque de la constante de spcificit est la somme des rciproques des constantes de
vitesse dans la direction directe o chacune est multiplie par le produit des cons-
tantes d'quilibre partir de la premire tape. Cette grandeur, le temps spcifique
( 3.3.4), peut donc tre considr comme la somme d'une srie de temps. Bien que
la rversibilit des tapes indique que le temps mis par des molcules individuelles
pour passer travers l'ensemble du processus, peut varier fortement, il reste vrai qu'il
y a un temps moyen qui peut tre considr comme la somme des quantits
moyennes de temps utilises pour passer sparment au travers de chacune des
tapes ; en effet, il y a de nombreuses annes, VAN SLYKE et CULLEN (1914) ont
11 LES RACTIONS RAPIDES 367
discut les cintiques de l'urase exactement en ces termes. Il y aura toujours une
tape qui contribue autant au temps total que n'importe quelle autre tape, et il ne
semble pas que ce soit un abus de langage d'appeler celle-ci l'tape la plus lente et de
faire rfrence aux tapes qui contribuent de manire moins significative en utilisant
le terme d'tapes plus rapides.
Ainsi, bien que toutes les tapes aient la mme vitesse dans des conditions d'tat
stationnaire, cela ne signifie pas qu'une mme quantit de temps soit ncessaire
pour chaque tape, ainsi lorsque nous dsignons certaines tapes comme les tapes
les plus lentes, nous ne considrons pas qu'elles se droulent plus lentement, mais
qu'elles comptent pour une plus large proportion du temps consomm.
NORTHROP (1981) a galement questionn l'ide globale d'tape limitant la vitesse
dans les mcanismes enzymatiques. RAY (1973) a ralis une analyse complte qui
est sous certains aspects parallle la discussion des tapes limitant la vitesse dans
le mtabolisme, initie par KACSER et BURNS (1973) et prsente dans le 10.5 ;
en effet, RAY a dfini l'indice de sensibilit, utiliser dans l'tude des effets isoto-
piques, qui a des proprits similaires celles des coefficients de contrle de flux.
Il est parfaitement possible (bien que pas ncessaire) pour une tape de ncessiter
plus de temps que pour toutes les autres prises ensembles, et si ceci est vrai, il est
raisonnable d'appeler celle-ci l'tape limitant la vitesse. Mme s'il ne domine pas
entirement la somme, le temps requis par l'tape la plus lente sera toujours habi-
tuellement similaire en grandeur au temps requis par l'ensemble du processus, et il
est trs commun qu'une seule tape limite la vitesse globale. Des exceptions appa-
ratront si le processus complet renferme un grand nombre d'tapes lentes se drou-
lant sur des temps similaires, mais ceci est beaucoup plus improbable dans les mca-
nismes d'enzymes individuels que dans les systmes mtaboliques : ces derniers
peuvent en effet contenir un grand nombre de composants et la slection naturelle
peut avoir limin une grande variabilit dans l'efficacit cintique de diffrentes
tapes entre elles ; mais dans les systmes chimiques, les constantes de vitesse pour
les processus individuels varient typiquement sur plusieurs ordres de grandeur et
aucune slection naturelle ne peut tre invoque (en particulier pour les ractions
tudies avec des ractifs non-naturels) pour suggrer que les variations devraient
tre rduites. Des considrations de ce type expliquent vraisemblablement pourquoi
la ncessit d'liminer les tapes limitant la vitesse des discussions de la rgulation
mtabolique est devenue vidente une dizaine d'annes avant que la question
correspondante ne soit srieusement discute pour les mcanismes enzymatiques.
y 20
0,1
Erreur rsiduelle
15
0
10
0,1
0 10 20 t
0
0 5 10 15 20 t
11.1 - Caractre du mauvais conditionnement des fonctions exponentielles
Les points ont t calculs partir de l'quation : y = 5,1e t 1, 3 + 4.7e t 4, 4 + 9,3e t 14, 2
1. ill conditioning
370 CINTIQUE ENZYMATIQUE
16M
Nitrophnol libr (M)
20
10
8M
10 4M 0
0 4 8 12
2M [Chymotrypsine] (M)
0
0 4 8 12 Temps (min)
11.2 - Un burst de libration de produit
Les donnes sont celles de HARTLEY et KILBY (1954) pour l'hydrolyse du carbonate de
nitrophnylthyle catalyse par la chymotrypsine et la concentration d'enzyme est indique
sur chaque courbe. Les ordonnes l'origine obtenues par extrapolation au temps zro de
la partie linaire de chaque courbe d'avancement sont proportionnelles et presque gales
ces concentrations d'enzyme (insert).
Parce que le substrat n'est pas le substrat spcifique de l'enzyme et qu'il est donc
trs mauvais, ils ont d travailler avec des concentrations leves d'enzyme, et ils
ont ainsi pu mettre en vidence que la grandeur de l'ordonne, qui est appele le
burst de produit, est proportionnelle la concentration d'enzyme. Cette observation
suggre un mcanisme dans lequel les produits sont librs en deux tapes, le
nitrophnolate tant libr en premier :
2. Certains termes anglais sont difficiles traduire simplement en franais sans perdre
une partie de leur signification, si une terminologie complexe veut tre vite. Dans
d'autres cas, la terminologie anglaise fait partie du langage scientifique courant.
Nous avons choisi dans ces cas de conserver le terme anglais plutt que d'utiliser
une traduction imprcise ou lourde. C'est le cas pour les termes burst, stopped-
flow et quenched-flow.
11 LES RACTIONS RAPIDES 371
P
k1 k2 k3
E+A EA EQ E+Q [11.1]
k1
[ EA ] =
(
[ E ]0 k3 + k 2 e[ ( k 2 +k 3 ) t ] )
[11.3]
k 2 + k3
[ EQ ] =
(
k 2 [ E ]0 1 e[ ( k 2 +k 3 ) t ] ) [11.4]
k 2 + k3
Les expressions pour les vitesses de libration des deux produits sont aisment
obtenues en multipliant ces deux quations respectivement par k2 et par k3 :
d[ P ]
= k 2 [ EA ] =
(
k 2 [ E ]0 k3 + k 2 e[ ( k 2 +k 3 ) t ] ) [11.5]
dt k 2 + k3
d[ Q ]
= k3 [ EQ ] =
(
k 2 k3 [ E ]0 1 e[ ( k 2 +k 3 ) t ] ) [11.6]
dt k 2 + k3
A l'tat stationnaire, c'est--dire quand t est grand, le terme exponentiel devient
ngligeable et les deux vitesses deviennent quivalentes :
372 CINTIQUE ENZYMATIQUE
d[ P ] d[ Q ] k k [ E ]0
= = 2 3 [11.7]
dt dt k 2 + k3
Pendant la phase transitoire, cependant, d [ P ] dt est initialement plus grand que
d [ Q ] dt , de sorte que l'apparition de P se caractrise par un burst, alors que
l'apparition de Q se caractrise par un dlai (lag en anglais) quand les parties
linaires des courbes d'avancement sont extrapoles au temps zro. La grandeur du
burst peut tre calcule en intgrant l'quation [11.5] et en introduisant la condition
[ P ] = 0 quand t = 0 :
[P] = +
2
(
k 2 k3 [ E ]0 t k 2 [ E ]0 1 e )
[ ( k 2 +k 3 ) t ]
[11.8]
k 2 + k3 ( k 2 + k3 ) 2
La partie de la courbe d'avancement correspondant la phase d'tat stationnaire est
obtenue en considrant la mme quation aprs que la phase transitoire a diminu
jusqu' zro :
k k [ E ]0 t k 2 [ E ]0
[P] = 2 3 + 2 [11.9]
k 2 + k3 ( k 2 + k3 ) 2
C'est l'quation d'une droite dont l'intersection avec l'axe des [ P ] donne la valeur p,
la grandeur du burst :
k 22 [ E ]0 [ E ]0
p = = [11.10]
( k 2 + k3 ) 2 k3
2
1 +
k2
Ainsi le burst n'est pas gal la concentration d'enzyme mais il s'en approche si k2
est beaucoup plus grand que k3. Bien que l'quation implique que la taille du burst
ne peut jamais dpasser la concentration d'enzyme, la ralit est parfois plus
complexe, parce que la concentration de substrat n'est pas vraiment constante et
diminue pendant la phase d'tat stationnaire. En consquence, la partie de la courbe
d'avancement correspondant l'tat stationnaire n'est pas exactement une droite. Si
la vitesse diminue de manire significative pendant la priode utilise pour la
mesure, l'extrapolation sur l'axe peut conduire une surestimation de la taille du
burst. Ce type d'erreur peut tre vit en s'assurant qu'il n'y a aucune dviation
perceptible par rapport la linarit pendant la phase d'tat stationnaire.
Les expriences l'tat stationnaire sont habituellement ralises sur une chelle de
temps de plusieurs minutes, au minimum. Elles n'ont pas ncessit le dvelop-
pement d'un quipement spcial, parce que, en principe, toute mthode qui permet
l'analyse d'un mlange ractionnel l'quilibre peut tre adapte pour permettre
l'analyse du droulement d'une raction. Dans l'tude des ractions rapides, cepen-
dant, les courtes priodes de temps sur lesquelles les mesures doivent tre ralises
ont ncessit le dveloppement d'appareils spciaux, et ne se prsentent donc pas
comme une simple extension de celles des ractions l'tat stationnaire.
Les chelles de temps typiques des processus importants pour comprendre les
ractions catalyses par des enzymes couvrent la gamme allant d'environ 10 ps pour
les ractions les plus rapides de transfert de proton ou d'lectron jusqu'aux secondes
pour les ractions spcifiques les plus lentes catalyses par des enzymes, ou plus
longues minutes ou heures pour les ractions avec des substrats non-spcifiques,
374 CINTIQUE ENZYMATIQUE
Flux continu
Mthodes
Saut de pression
de relaxation
Saut de temprature
Mthodes ultrasoniques
D'autres mthodes que celles discutes dans ce manuel (figure 11.3) sont utiles
dans certaines circonstances. La photolyse clair ou la radiolyse pulse sont des
techniques qui permettent de gnrer trs rapidement un intermdiaire de courte
dure de vie et d'observer les ractions ultrieures. Ces techniques ont une utilit
limite dans l'tude des ractions biologiques car peu d'intermdiaires peuvent tre
gnrs de cette faon. Cependant, quand elles peuvent tre utilises, la gamme
accessible de l'chelle de temps est trs tendue et peut aller jusqu' des temps
aussi court que 0,1 ps. Mme s'il existe peu de systmes biologiques auxquels elles
peuvent tre directement appliques, l'information qu'elles sont susceptibles de
fournir sur les ractions chimiques simples contribue notre comprhension des
tapes chimiques qui se droulent dans les ractions enzymatiques.
11 LES RACTIONS RAPIDES 375
Pour les processus qui ont des constantes de temps d'un ordre gal ou suprieur la
milliseconde, les techniques principalement utilises sont les mthodes de mlange
rapide collectivement dsignes sous le nom de mthodes de flux. Elles sont toutes
drives de la mthode de flux continu mise au point par HARTRIDGE et
ROUGHTON (1923) pour mesurer la vitesse de la combinaison de l'oxygne avec
l'hmoglobine. Dans cette mthode la raction tait initie en forant deux ractifs
se mlanger, l'hmoglobine rduite et un tampon oxygn, de sorte que le
mlange tait conduit se dplacer rapidement dans un tube d'un mtre de long.
Dans une exprience de ce type, pour viter un flux laminaire de composants
incompltement mlang dans le tube, il est essentiel d'inclure une chambre de
mlange dans le systme et de crer une turbulence pour s'assurer d'un mlange
complet et instantan. Tant que la vitesse de flux est constante, le mlange observ
un point quelconque du tube a un ge constant, dtermin par la vitesse de flux et
la distance qui spare ce point de la chambre de mlange. Ainsi, en ralisant des
mesures plusieurs points le long du tube, il est possible d'obtenir une courbe
d'avancement pour les premires tapes de la raction.
Le principe de l'appareil est prsent dans la figure 11.4, qui n'est pas une repr-
sentation raliste de l'appareil original, mais qui a t dessine de manire souli-
gner la relation avec la mthode de stopped-flow dont nous discuterons ci-dessous.
Moteur
Hmoglobine Source de
ou
dsoxygne lumire
pression
Tampon Systme de
oxygn dtection
Chambre Dchets
de mlange
La raction est initie en poussant simultanment les pistons des deux seringues,
provoquant ainsi le mlange des deux ractifs et forant le mlange se dplacer
travers la chambre d'observation jusque dans la seringue d'arrt. Un court dplace-
ment du piston de cette seringue d'arrt l'amne jusqu' une bute mcanique qui
l'empche de se dplacer plus loin, qui empche ainsi le mlange de se poursuivre
et qui dclenche simultanment le systme de dtection et d'enregistrement. Le
temps qui se passe invitablement entre le mlange des ractifs et son arrive dans
la chambre d'observation est de l'ordre de la milliseconde et est appel le temps
mort de l'appareil.
Remplissage
Moteur Source de
ou Enzyme lumire
pression Cellule
d'observation
Substrat Arrt
Chambre
de mlange
Systme de
Remplissage Dclencheur
dtection
Dchets
Quelques fois la nature chimique des vnements observs par spectroscopie dans
la mthode de stopped-flow n'est pas clairement tablie (PORTER, 1967). Ces ambi-
guts peuvent tre leves en utilisant la mthode de quenched-flow (figure 11.6).
Dans cette mthode, la raction est arrte (quenched) brivement aprs le
378 CINTIQUE ENZYMATIQUE
mlange, par exemple par un second mlange avec un agent dnaturant comme
l'acide trichloroactique, qui limine rapidement l'activit enzymatique ; une autre
mthode consiste refroidir trs rapidement le mlange jusqu' une temprature ou
la vitesse de raction est ngligeable ou mme en congelant l'chantillon. En
variant le temps entre le mlange initial et l'arrt de la raction, il est possible
d'obtenir une srie d'chantillons qui peuvent tre analyss par des mthodes chi-
miques ou autres et partir desquelles la courbe d'avancement de la raction peut
tre construite.
Remplissage
Moteur
ou Enzyme
pression Tube de longueur variable
Substrat Systme de
Chambre "quenching"
de mlange
Remplissage
centre 4Fe-4S. Pour rsoudre cette question, la vitesse d'hydrolyse a du tre mesu-
re directement, et cela a t ralis en mesurant la production du phosphate inor-
ganique par la mthode de quenched-flow. Cette approche a permis de dterminer
que la raction d'hydrolyse proprement dite a une constante de vitesse de 44 4 ms
(figure 11.7b), qui n'est pas distinguable de la valeur mesure par la mthode de
stopped-flow, confirmant que les deux ractions sont synchrones.
E420nm
0,02
Phosphate libr 8
(nmol)
0
b - "Quenched flow" 0 50 100 150 200 Temps (ms)
11.7 - Comparaison des donnes de stopped-flow et de quenched-flow pour la raction
catalyse par la nitrognase de Klebsiella pneumoniae (EADY, LOWE et THORNELEY, 1978)
La trace de stopped-flow (a) mesure le transfert d'lectrons entre les deux composants de
la nitrognase, alors que les observations de quenched-flow (b) mesurent la vitesse
d'apparition du phosphate inorganique, c'est--dire l'hydrolyse de l'ATP. L'galit des
constantes de temps montrent que les deux processus sont coupls.
Une information plus dtaille concernant les mthodes de flux peut tre obtenue
dans les ouvrages plus spcialiss, (par exemple, HIROMI (1979)). Des mthodes
plus labores comprennent l'utilisation de spectrophotomtres balayage rapide
dcrite par HOLLAWAY et WHITE (1975). Ce dernier type d'instrument, maintenant
disponible commercialement, offre des avantages considrables sur les types plus
simples d'quipement de stopped-flow, puisque des spectres complets peuvent tre
enregistrs au cours de la phase transitoire. Ceci a permis, par exemple, une tude
dtaille des intermdiaires produits durant la raction de la myloperoxydase avec
le peroxide d'hydrogne (MARQUEZ, HUANG et DUNFORD, 1994).
Le mlange de ractifs ne peut pas tre ralis efficacement en moins de 0,2 ms, et
l'arrt du flux dans un instrument ncessite environ 0,5 ms. (Bien qu'il soit conce-
vable d'arrter une raction plus abruptement, en pratique, cela provoquerait des
ondes de choc qui gnreraient des fluctuations transitoires dans le systme de
dtection). Le quenching, soit chimique, soit par refroidissement, prend galement
un temps fini. Il existe donc une limite d'environ 0,5 ms pour le temps mort qu'il
est possible d'atteindre avec les mthodes de flux et il est peu probable qu'une
adaptation des instruments permettra une rduction notable de ce temps. En cons-
quence les processus qui sont termins en moins de 0,5 ms ne peuvent tre observs
au moyen de ces mthodes de flux. Ceci constitue une restriction svre pour un
enzymologiste car la plupart des ractions catalyses par des enzymes impliquent
de tels processus, et ils en existent quelques-uns pour lesquels le cycle catalytique
complet se droule en moins de 1 ms. FERSHT (1999), par exemple, a rpertori sept
enzymes dont les constantes catalytiques sont de l'ordre de 103 s1 ou suprieures.
Des considrations de ce type ont conduit au dveloppement des mthodes de
relaxation (EIGEN, 1954) pour l'tude des processus trs rapides. Ces mthodes ne
ncessitent pas le mlange de ractifs, mais comme nous le dcrirons ci-dessous, il
peut tre utile de les combiner avec une mthode de stopped-flow. Dans une m-
thode standard de relaxation, un systme l'quilibre est soumis une perturbation
qui modifie la constante d'quilibre et nous observons alors l'volution du systme
vers un nouvel quilibre, un processus qui est appel relaxation. Plusieurs mthodes
de relaxation existent, parmi lesquelles la plus familire est certainement la
mthode de saut de temprature (t-jump) dans laquelle la perturbation est une
augmentation de temprature ralise par passage d'une dcharge de courant
lectrique travers l'chantillon : de cette manire il est possible d'augmenter la
temprature de l'chantillon de 10C en environ 1 s. Plus rcemment des tech-
niques de saut de temprature utilisant un pulse de radiation mis par un laser ont
t dveloppes. Ces mthodes permettent d'augmenter la temprature en moins
d'1 ns. Un autre type de perturbation consiste dans un saut de pression : cette
mthode est utilise pour mesurer des variations de volume qui peuvent avoir lieu
11 LES RACTIONS RAPIDES 381
pendant le processus catalytique, mais elle est difficile utiliser car les change-
ments des constantes de vitesse qui ont lieu lors d'un changement de pression sont
typiquement beaucoup plus petits que ceux induits par un mme apport d'nergie
sous la forme d'un saut de temprature.
La perturbation produite par une dcharge lectrique n'est pas instantanment
convertie en une variation de temprature uniformment rpartie dans le volume de
l'chantillon. En fait cela prend au moins 1 s, et un soin considrable doit tre
apporter la construction de l'instrument de manire s'assurer que l'ensemble du
volume est chauff uniformment. Ainsi, avec cette mthode, l'augmentation de
temprature ne peut tre considre comme instantane que si l'on s'intresse des
processus se droulant plus de 1 s aprs le dbut de la perturbation. Il est impro-
bable que des temps plus courts puissent tre atteints avec des perturbations
irrversibles, mais des processus beaucoup plus rapides peuvent tre tudis en
utilisant des perturbations sinusodales. Des ultrasons, par exemple, dont les fr-
quences sont aussi leves que 1011 s1, produisent des fluctuations locales de la
temprature et de la pression lorsqu'elles se propagent travers un milieu. Ces fluc-
tuations produisent des oscillations dans les valeurs des constantes de vitesse du
systme, et l'tude de l'absorption de l'nergie ultrasonique par le mlange raction-
nel fournit des informations sur ces constantes de vitesse (HAMMES et SCHIMMEL,
1970). Les systmes enzymatiques sont gnralement trop complexes pour qu'une
application directe de cette approche puisse tre utilise, mais l'tude de systmes
simples a malgr tout fourni des informations utiles pour les enzymologistes : par
exemple, le travail de BURKE, HAMMES et LEWIS (1965) sur le poly-L-glutamate a
montr qu'un changement important de conformation d'une macromolcule, la
transition hlice-pelote statistique, se droule avec une vitesse de 105-107 s1. Appa-
remment, les changements de conformation des enzymes ne se droulent pas
obligatoirement de telles vitesses, mais des vitesses de cet ordre de grandeur sont
possibles et la ncessit d'un changement rapide de conformation ne peut constituer
une objection l'encontre d'un mcanisme de catalyse enzymatique.
Un dsavantage de l'observation des phnomnes de relaxation d'un systme
l'quilibre est que les concentrations l'quilibre des espces transitoires impor-
tantes pour le processus catalytique peuvent tre trop faibles pour tre dtectes.
Cette difficult peut tre contourne en combinant les mthodes de stopped-flow
et de saut de temprature, et des instruments de stopped-flow commercialiss
comprennent un accessoire de saut de temprature. Les ractifs sont mlangs dans
une exprience conventionnelle de stopped-flow et sont soumis ultrieurement un
saut de temprature aprs qu'un tat stationnaire a t atteint. La relaxation vers un
nouvel tat stationnaire caractristique de la temprature la plus leve est alors
observe. Ce type d'exprience permet d'observer des processus dans les phases
prcoces de raction qui sont trop rapides pour tre observe par la mthode
conventionnelle de stopped-flow, parce que les ractifs sont dj mlangs lorsque
le saut de temprature est appliqu.
382 CINTIQUE ENZYMATIQUE
L'une de ces trois quations est redondante, puisque leur somme est simplement la
drive premire de l'quation de conservation (quation [11.12]) :
d [ X 0 ] d [ X1 ] d [ X 2 ]
+ + = 0 [11.16]
dt dt dt
Pour rsoudre le systme, nous pouvons donc considrer qu'il est dfini par les
quations [11.12] [11.14] en ignorant l'quation [11.15].
La solution d'un ensemble de trois quations diffrentielles de trois concentrations
inconnues peut tre rsolue simplement en liminant deux des concentrations pour
produire une seule quation diffrentielle une inconnue. Premirement, [ X 2 ]
peut tre limine en utilisant l'quation [11.12] pour l'exprimer en terme des deux
autres concentrations :
[ X 2 ] = [ XTot ] [ X 0 ] [ X1 ] [11.17]
et en substituant cette quation dans l'quation [11.14], nous obtenons :
d [ X1 ]
= k1 [ X 0 ] ( k 1 + k 2 )[ X1 ] + k 2 ([ XTot ] [ X 0 ] [ X1 ])
dt [11.18]
= ( k1 k 2 )[ X 0 ] ( k 1 + k 2 + k 2 )[ X1 ] + k 2 [ XTot ]
La diffrentiation de l'quation [11.13] fournit :
d 2 [ X0 ] d[ X0 ] d [ X1 ]
= k1 + k 1
dt 2 dt dt
d[ X0 ] [11.19]
= k1 + k 1( k1 k 2 )[ X 0 ]
dt
k 1( k 1 + k 2 + k 2 )[ X1 ] + k 1k 2 [ XTot ]
Ensuite [ X1 ] est limin en rarrangeant l'quation [11.13] de manire obtenir
une expression de k 1 [ X1 ] en terme de [ X 0 ] :
d[ X0 ]
k 1 [ X1 ] = k1 [ X 0 ] + [11.20]
dt
qui peut tre substitue dans l'quation [11.19] :
d 2 [ X0 ] d[ X0 ]
= k1 + k 1( k1 k 2 )[ X 0 ]
dt 2 dt
[11.21]
d[ X0 ]
( k 1 + k 2 + k 2 ) k1 [ X 0 ] + + k 1k 2 [ XTot ]
dt
Si celle-ci est rorganise de la manire suivante :
d 2 [ X0 ] d[ X0 ]
+ ( k1 + k 1 + k 2 + k 2 )
dt 2 dt [11.22]
+ ( k 1k 2 + k1k 2 + k1k 2 )[ X 0 ] = k 1k 2 [ XTot ]
384 CINTIQUE ENZYMATIQUE
t1 2 [
1 = 1 P + ( P 2 4Q ) 12
] [11.25]
1 = 1 [P ( P 4Q ) ]
1
2 2
[11.26]
t2 2
Les solutions pour les deux autres concentrations [ X ]1 et [ X ]2 ont la mme
forme que l'quation [11.24] avec les mmes temps de relaxation que ceux des
quations [11.25] et [11.26] mais avec des amplitudes diffrentes.
Si k 1k 2 est petit par rapport ( k 1k 2 + k1k 2 + k1k 2 ) , les expressions pour les
rciproques des temps de relaxation se simplifient en ( k1 + k 1 ) et en ( k 2 + k 2 ) ,
pas ncessairement dans cet ordre, puisque 1 t 1 est toujours le plus grand et que
1 t 2 est toujours le plus petit. Cette simplification n'est pas toujours autorise,
mais les expressions pour la somme et le produit des rciproques des temps de
relaxation prennent toujours des formes simples :
1 + 1 =k +k +k +k = P [11.27]
1 1 2 2
t1 t 2
1 = k k +k k +k k = Q [11.28]
1 2 1 2 1 2
t 1t 2
11 LES RACTIONS RAPIDES 385
Cet exemple illustre plusieurs points qui s'appliquent de manire plus gnrale.
Tout mcanisme qui consiste dans une squence de n tapes de premier ordre dans
les deux sens de la raction peut tre rsolu exactement. La solution donnant l'vo-
lution de la concentration de chacun des ractifs ou des intermdiaires consiste
dans une somme de (n + 1) termes, le premier donnant sa valeur l'quilibre et
les autres consistant en n phases transitoires dont les temps de relaxation sont les
mmes pour toutes les concentrations et dont les amplitudes sont caractristiques
d'une concentration particulire. Dans les cas favorables, les temps de relaxation
pour certaines ou pour toutes les phases transitoires peuvent tre associs avec des
tapes particulires du mcanisme ; dans ces cas, la rciproque du temps de relaxa-
tion est gale la somme des constantes de vitesse caractristiques des sens direct
et inverse de l'tape concerne.
Un second point gnral qui n'est pas illustr par l'analyse ci-dessus, est que les
ractifs qui sont spars du reste du mcanisme par des tapes irrversibles ont des
caractristiques de relaxation plus simples que celles des autres ractifs, parce que
certaines amplitudes sont nulles. Considrons par exemple le mcanisme suivant en
cinq tapes, dans lequel deux tapes sont irrversibles :
X0 X1 X2 X3 X4 X5 [11.29]
En principe, chaque ractif devrait avoir cinq temps de relaxation, et c'est effec-
tivement ce qui devrait tre observ pour X4 et X5 . Mais X2 et X3 sont isols des
deux dernires tapes par la quatrime tape qui est irrversible ; chacun a, ds lors
une amplitude nulle et donc seulement quatre temps de relaxation observables. X0
et X1 sont isols du reste du mcanisme par la seconde tape qui est irrversible ;
l'volution de chacun de ces ractifs a trois amplitudes nulles et seulement deux
temps de relaxation observables. Indpendamment du nombre d'tapes irrver-
sibles, le nombre total de phnomnes observs de relaxation pour chaque concen-
tration ne peut tre suprieur au nombre prdit par le mcanisme, mais est souvent
infrieur soit parce que des processus ayant des temps de relaxation similaires ne
peuvent pas tre rsolus ou parce que certaines amplitudes sont trop petites pour
tre dtectes.
Tous les mcanismes de catalyse enzymatique comprennent au moins une tape de
second ordre. Cependant, chaque tape de ce type peut tre transforme en une
cintique de premier ordre en fonction du temps (c'est--dire une cintique de
pseudo-premier ordre ; 1.2.3), en s'assurant que l'un des deux ractifs est en large
excs par rapport l'autre. En consquence, au moins un des temps de relaxation
observs renferme une constante de vitesse de pseudo-premier ordre et donc, son
expression comprend une dpendance la concentration. Cela est trs utile, puis-
qu'il permet d'attribuer les temps de relaxation mesurs des tapes particulires
du mcanisme. Considrons, par exemple, le mcanisme suivant qui reprsente la
moiti d'un mcanisme enzyme modifi ( 6.2.2) tudi en absence du second
substrat :
386 CINTIQUE ENZYMATIQUE
k1 k2
E + A EA E' + P [11.30]
k1
Pour ce mcanisme les quations [11.27] et [11.28] prennent la forme suivante :
1 + 1 = k [ A] + k + k [11.31]
1 1 2
t1 t 2
1 = k k [ A] [11.32]
1 2
t 1t 2
Ainsi un graphique de la somme des rciproques des temps de relaxation en fonc-
tion de [ A ] fournit une droite dont la pente vaut k1 et dont l'ordonne l'origine
vaut (k1 + k2), alors qu'un graphique de leur produit en fonction de [ A ] fournit
une droite passant par l'origine et dont la pente vaut k1k2. Les trois constantes de
vitesse peuvent donc tre calcules partir de la mesure des temps de relaxation.
hypothse ne doive tre faite sur la puret de la prparation, et elle reste valable en
prsence de certaines complications telles que la capacit de certains enzymes
fixer le substrat sans catalyser la raction (TOPHAM et al., 2000). L'ide essentielle
est que les mthodes habituelles d'tat stationnaire fournissent facilement des
mesures des paramtres tels que Km V = 1 k A [ E ]0 qui comprend la concentration
d'enzyme [ E ]0 , alors que les mthodes pr-stationnaires, par exemple les gra-
phiques dcrits la fin du 11.4.1, fournissent les quantits correspondantes sans
le facteur [ E ]0 ; en divisant l'un par l'autre, il est donc possible de calculer la
vritable molarit de l'enzyme (BENDER et al., 1966 ; REINER, 1969).
Dans les ractions plusieurs substrats (autres que les ractions d'hydrolyse), il est
possible d'empcher l'enzyme d'tre recycl en omettant un des substrats du m-
lange ractionnel. Cela est particulirement utile pour les enzymes qui suivent un
mcanisme enzyme modifi, parce qu'une raction se droule et est potentiel-
lement mesurable, mme si la raction est incomplte. Un exemple prcoce de
l'application de cette approche a t l'tude de l'aspartate transaminase par
HAMMES et FASELLA (1962). En tudiant les ractions partielles de cet enzyme,
principalement par la mthode de saut de temprature, ces auteurs ont pu attribuer
des valeurs 10 des 12 constantes de vitesse qui caractrisent le mcanisme
(figure 11.8). Les transaminases constituent une classe d'enzymes particulirement
attractive pour ces tudes en raison de la facilit de mesurer les changements
spectraux dus au coenzyme, le phosphate de pyridoxal, qui ont lieu au cours de la
raction.
61 s1
Complexe Complexe
pyridoxal-enzyme-glutamate 30 s1 pyridoxamine-enzyme-2-oxoglutarate
3,3 107 M1 s1 70 s1
2,8 103 s1 2,1 107 M1 s1
Pyridoxal-enzyme Pyridoxamine-enzyme
140 s1
Rapport = 1,8 103 M1 7 107 M1 s1
Complexe 80 s1 Complexe
pyridoxal-enzyme-aspartate pyridoxamine-enzyme-oxaloactate
26 s1
11.8 - Le mcanisme de la raction catalyse par l'aspartate transaminase,
avec les constantes de vitesse attribues par HAMMES et FASELLA (1962)
Le traitement des enzymes qui suivent un mcanisme complexe ternaire est moins
direct parce qu'un mlange ractionnel complet est normalement ncessaire avant
qu'un changement chimique ne puisse se drouler. Nanmoins, PETTERSSON (1976)
11 LES RACTIONS RAPIDES 389
a fourni un traitement rigoureux des cintiques des phases transitoires des ractions
complexe ternaire, et l'a appliqu pour rsoudre certaines ambiguts dans les
ractions catalyses par l'alcool dshydrognase du foie de cheval (KVASSMAN et
PETTERSSON, 1976). Des expriences de cycle unique (single turnover) peuvent
tre ralises avec des enzymes suivants un mcanisme complexe ternaire, en
maintenant un des substrats une concentration plus faible que celle de l'enzyme.
Une des caractristiques attractives des cintiques des ractions rapides est que
celles-ci peuvent souvent fournir une information simple au sujet du mcanisme
tout en vitant la complexit algbrique qui peut tre difficilement vite dans les
tudes l'tat stationnaire. Un exemple vident est celui de l'exprience originale
de burst de HARTLEY et KILBY (1954), dans laquelle l'ordre de libration des
produits a t tabli avec un haut degr de certitude par l'observation qu'un des
produits (le premier) est libr au cours du burst ( 11.2.1). Strictement, il est
ncessaire de montrer que le second produit n'est pas galement libr dans un
burst, parce qu'en principe les deux produits pourraient tre librs dans un burst si
la dernire tape de la raction tait une isomrisation de l'enzyme libre limitant la
vitesse et permettant la rgnration de sa forme originale.
De manire similaire, nous pouvons dduire l'ordre d'addition des substrats dans le
mcanisme complexe ternaire en variant les combinaisons de ractifs dans les
seringues dans une exprience de stopped-flow. S'il existe un ordre obligatoire de
fixation, la trace observe lorsque l'enzyme est pr-mlang avec le substrat qui se
fixe en premier est probablement plus simple que celle observe lorsque l'enzyme
est pr-mlang avec le substrat qui se fixe en second : dans le premier cas, le
premier complexe est dj form quand les seringues sont actionnes, mais dans le
second cas le pr-mlange avec le second substrat ne provoque rien, puisque
aucune raction ne peut se drouler tant que l'enzyme n'est pas mis en contact avec
le premier substrat.
Cette quation est une simple quation diffrentielle linaire qui peut tre rsolue
directement en sparant les variables et en intgrant (voir l'quation [1.1] dans le
1.1.1 qui a la mme forme), ce qui donne le rsultat suivant :
D[ X ] = D[ X ]0 e [k 1 ([ E ] +[ A ] ) +k 1 ]t [11.39]
dans lequel D[ X ]0 est la grandeur de la perturbation quand t = 0. Donc, en suppo-
sant que la perturbation initiale est faible, la relaxation d'une raction une seule
tape est dcrite par une seule phase transitoire avec un temps de relaxation t
donn par :
1 = k ([ E ] + [ A ] ) + k [11.40]
1 1
t
Puisque [ E ] , [ A ] et k 1 k1 peuvent normalement tre mesurs indpen-
damment, une mesure de t permet d'attribuer des valeurs individuelles k1 et k1.
Une analyse similaire peut tre applique tout mcanisme proche de l'quilibre,
que les tapes individuelles soient ou non de premier ordre, parce que les termes
non-linaires du type k1( D[ X ]) 2 peuvent toujours tre ngligs. En gnral, un
11 LES RACTIONS RAPIDES 391
PROBLMES
11.1 - Un enzyme d'une masse molculaire de 50 kDa est tudi dans une
exprience de cycle unique une concentration de substrat de 1 M.
La mesure de la vitesse d'apparition du produit une concentration
d'enzyme de 1 mg mL1 rvle deux phases transitoires, avec des temps
de relaxation de 4,5 ms et de 0,1 s. A 5 mg mL1 d'enzyme les valeurs
correspondantes sont 2,8 ms et 31 ms. En supposant le mcanisme le
plus simple en accord avec ces observations, estimer les valeurs des
constantes de vitesse.
11.2 - Les donnes suivantes peuvent tre exprimes par une quation de la
forme y = A + B e t t 1 + C e t t 2 . En supposant que t1 est infrieur 5 ms,
estimer les valeurs de A, C et t2, et utiliser ces rsultats pour estimer B
et t1.
Par souci de simplicit, toutes les incertitudes prsentes dans le tableau 12.1 ont
t calcules comme des valeurs positives, bien qu'en ralit certaines soient
positives et d'autres soient ngatives. Si le calcul avait t ralis avec des valeurs
ngatives, les rsultats seraient similaires ceux qui sont prsents ( l'exception
du signe) mais pas identiques puisque les transformations non-linaires de v en 1 v
et en [ A ] v ont des effets asymtriques dans les deux directions : c'est pour cette
raison que les barres d'erreur des figures 3.10 3.12 sont asymtriques (toutes sont
asymtriques mme si cette caractristique n'est pas visible pour certaines parmi les
plus longues).
Tableau 12.1 - Effet de l'incertitude exprimentale
sur les valeurs transformes des observations
Mme ces complications pourraient, avec quelques efforts, tre limines, si les
vritables erreurs exprimentales taient systmatiques (toutes de la mme taille et
dans la mme direction) et de grandeur connue, comme dans le tableau 12.1. Dans la
ralit, elles sont de grandeur inconnue et elles varient au hasard, d'une observation
l'autre. Ainsi, une transformation non-linaire des observations originales ralises
pour faciliter le trac d'un graphique produit des distorsions non-linaires de toute
erreur prsente dans les donnes originales, et ces distorsions rendent difficile le
traitement correct de ces incertitudes.
Cela signifie que l'estimation des paramtres cintiques partir de l'analyse des
graphiques n'est pas aussi vidente qu'elle y parat. De nombreux auteurs (et
notamment l'un d'entre nous dans un livre prcdent : CORNISH-BOWDEN, 1976b)
ont conclu que les graphiques devraient tre vits et qu'une estimation srieuse des
paramtres devrait toujours se baser sur une analyse par ordinateur. Cette conclu-
sion est particulirement attirante si nous considrons que la plupart des mthodes
dcrites dans ce chapitre sont utilisables pour le dveloppement de logiciels
12 ESTIMATION DES CONSTANTES CINTIQUES 395
d'analyse et qu'un grand nombre de celles-ci sont trop compliques pour tre
abordes d'une autre manire. Elle est toutefois errone parce qu'elle nglige deux
points : premirement l'il humain est beaucoup plus performant pour reconnatre
un comportement particulier ou inattendu que n'importe quel logiciel existant
aujourd'hui ; deuximement, tous les logiciels reposent sur des hypothses concer-
nant les proprits des erreurs exprimentales prsentes dans les donnes et si celles-
ci ne sont pas appropries, les rsultats fournis par un logiciel ne seront pas meilleurs
que ceux qui seraient obtenus partir d'un graphique mal trac. Il est vident que de
nombreux utilisateurs de ces logiciels sont gnralement mal informs au sujet de
ces hypothses, et de nombreux articles renferment des affirmations inconsistantes.
Ainsi, par exemple, dans les cas o des observations auxquelles sont attribues un
pourcentage d'incertitude approximativement uniforme, sont traites en leur donnant
une pondration gale. Comme nous allons le voir ci-dessous, une pondration gale
est approprie pour des observations caractrises par des incertitudes uniformes
lorsque celles-ci sont exprimes en valeur absolue et non lorsqu'elles sont exprimes
comme des pourcentages.
L'utilisation aveugle d'un logiciel crit par quelqu'un d'autre est rarement un pro-
cd sr. Il ne peut du moins transformer une exprience mal prpare en une
exprience russie et il ne peut extraire une information prcise partir de
mauvaises donnes. Nanmoins, il est irraliste de demander aujourd'hui tous les
utilisateurs d'ordinateur d'crire leurs propres logiciels et, de plus, de nombreux
logiciels d'ajustement des donnes de cintiques enzymatiques sont dj dispo-
nibles. A condition d'tre utiliss avec certaines prcautions, ceux-ci peuvent se
rvler tre des outils trs utiles. Ce chapitre constitue une introduction de la
thorie mais une description plus dtaille peut tre obtenue dans un autre livre
(CORNISH-BOWDEN, 1995b) qui inclut un logiciel permettront d'implmenter les
mthodes dcrites sur un PC ou sur d'autres ordinateurs compatibles.
Avant de terminer cette discussion sur les graphiques, nous devrions noter que leur
fonction s'tend au-del de l'analyse des donnes, qui est en effet ralise plus
efficacement avec l'aide d'un ordinateur ; ils jouent galement un rle essentiel
dans l'illustration des rsultats de l'analyse. Si les lecteurs d'une publication scien-
tifique voient, comme ils le font de plus en plus frquemment, des valeurs de para-
mtres qui ne sont accompagnes d'aucune indication sur la manire dont celles-ci
ont t obtenues, l'exception de l'affirmation que les donnes ont t ajustes
sur l'quation de MICHAELIS et MENTEN (PORTARO et al., 2000) ou que les para-
mtres ont t calculs par ajustement des donnes l'aide du logiciel GRAFIT
(STABILE, CURTI et VANONI, 2000), ils n'ont aucun moyen de juger si l'ajustement
a t ralis en utilisant une pondration approprie et en vrifiant la prsence
d'une erreur systmatique. Ils n'ont aucune raison d'avoir confiance dans les
donnes qui sont prsentes. Accompagner les rsultats quantitatifs au moins par
un graphique qui illustre la qualit et la quantit de donnes devrait tre considr
comme une ncessit. Inversement, la pression des diteurs pour liminer ce qu'ils
396 CINTIQUE ENZYMATIQUE
l'quation [12.3] pour tudier le cas d'une dviation standard uniforme, mais cette
pratique complique l'analyse sans ncessit. L'avantage d'utiliser l'quation [12.2]
dans le cas d'un coefficient uniforme de variation est que nous avons un terme ei
qui se comporte simplement sans facteur de correction. Dans ce chapitre, nous
utiliserons l'quation [12.2] comme la forme standard puisqu'elle correspond au
mieux aux rsultats qui ont t obtenus dans les rares tudes qui ont pris en compte
les erreurs exprimentales rencontres en cintique enzymatique (par exemple
STORER, DARLISON et CORNISH-BOWDEN, 1975 ; ASKELF, KORSFELDT et
MANNERVIK, 1976 ; MANNERVIK, JAKOBSON et WARHOLM, 1986). Nous ne ren-
trerons pas dans l'algbre qui rsulte de l'utilisation de l'quation [12.3], mais nous
donnerons quelques rsultats qui en dcoulent, lorsque cela sera utile. En bonus,
nous pouvons noter qu' la fois l'algbre et l'arithmtique sont plus simples si nous
supposons un coefficient de variation constant ; cependant, nous soulignons que
ceci n'est pas une raison valable pour prfrer cette situation, puisque le choix doit
tre dict par les proprits sous-jacentes des incertaintudes et non par la facilit.
Exprimer l'quation de MICHAELIS et MENTEN sous la forme de l'quation [12.2]
illustre pourquoi les transformations linaires telles que celles dcrites dans le
3.5 peuvent donner des rsultats insatisfaisants. Puisqu'elles sont ralises partir
de l'quation [3.36] (identique l'quation [12.1]) par une algbre parfaitement
correcte, il est difficile d'admettre premire vue pourquoi elles pourraient tre
incorrectes. Le problme disparat une fois que nous avons ralis que l'algbre
n'est pas en cause, mais qu'il provient du point de dpart. En effet, une expression
plus complte de l'quation de MICHAELIS et MENTEN, comme celle de l'qua-
tion [12.2], ne peut tre mise sous la forme de l'quation d'une droite.
12.2.2. Estimations de V et de Km
La somme est faite sur toutes les observations, comme indiqu, mais puisque les
limites d'addition sont normalement videntes dans les calculs statistiques, elles
peuvent tre ngliges sans danger d'introduire des ambiguts et dans le reste de ce
chapitre, elles ne seront plus prsentes explicitement. Le rarrangement de
l'quation [12.2] permet d'exprimer ei en fonction de vi, [ A ]i , Km et V :
K m vi vi
ei = + 1 [12.5]
V [ A ]i V
En substituant cette quation dans l'quation [12.4], nous obtenons :
2
Nvi
SS = + Mvi 1 [12.6]
[ A ]i
dans laquelle N = Km V et M = 1 V sont respectivement l'ordonne l'origine et
la pente du graphique de [ A ]i vi en fonction de [ A ]i ( 3.5.2 et figure 3.11).
Bien que les valeurs de V et de K m qui minimisent SS puissent tre obtenues en
calculant les drives partielles de l'quation [12.6] par rapport V et K m et en
galant chacune de ces deux drives zro, la mme conclusion peut tre atteinte
de manire plus rapide et plus simple en rsolvant d'abord l'quation pour N et M.
Les drivations partielles de l'quation [12.6] vis--vis de N et de M donnent la
paire suivante de drives partielles :
SS = 2 v Nvi
[ A i] + Mvi 1 [12.7]
N i [ A ]i
SS = Nv
M
2 vi [ A ]i + Mvi 1
[12.8]
i
v2
N i + M v2 =
i vi [12.11]
[ A ]i
qui donne les solutions suivantes :
v v2
vi2 [ Ai ] [ Ai ] vi
N = i i
2
[12.11]
vi2 v2
[ A ] 2 vi2 [ Ai ]
i i
12 ESTIMATION DES CONSTANTES CINTIQUES 399
v2 v2 v
[ Ai ] 2 vi [ Ai ] [ Ai ]
=
M i i i
[12.12]
2
vi2 v2
[ A ] 2 vi2 [ Ai ]
i i
v v2
vi2 [ Ai ] [ Ai ] vi
= N =
K i i
[12.14]
m
M vi2 v vi2
[ A ] 2 vi [ A ] [ Ai ]
i i i
Ce rsultat, qui a, pour la premire fois, t donn par JOHANSEN et LUMRY (1961)
est exact ; aucune modification supplmentaire n'est ncessaire pour minimiser SS
comme nous l'avons dfini dans l'quation [12.6].
v 3 v 3 v
v i3 vi [ Ai ] [ Ai ]i v i3
m =
K i i
[12.16]
v 3 v v 3 v v 3
[ Ai ]i2 v i3 [ Ai ]i [ Ai ]
i i i
L'approche par la mthode des moindres carrs pour ajuster les donnes est la
mthode gnrale la plus pratique et la plus largement utilise ( l'exception peut
tre de celle qui consiste tracer l'il une droite passant par les points), mais elle
n'est pas ncessairement la meilleure. Pour dmontrer que la solution de la mthode
des moindres carrs est la meilleure solution au problme pos, nous devons non
seulement dfinir ce que nous considrons comme la meilleure solution , mais
12 ESTIMATION DES CONSTANTES CINTIQUES 401
v5
v4
v3
v2
v1
parce qu'elle repose sur peu d'hypothses et est en consquence insensible aux
dviations vis--vis de la distribution attendue des incertitudes. Par exemple, les
estimations obtenues par la mthode des moindres carrs des paramtres de
MICHAELIS et MENTEN donnes par les quations [12.15] et [12.16] ne sont en
aucune manire les mmes que celles donnes par les quations [12.13] et [12.14] ;
si nous utilisons les quations [12.15] et [12.16] alors que nous devrions utiliser
les quations [12.13] et [12.14] ou vice versa, nous nous cartons des proprits
optimales de la mthode des moindres carrs et nous obtenons de mauvaises
estimations des paramtres. Ceci signifie qu'en pratique, pour utiliser la mthode
des moindres carrs avec confiance, il est ncessaire de connatre la pondration
qui doit tre applique aux observations, de savoir si celles-ci sont uniformes dans
leur coefficient de variation ou si elles sont uniformes dans leur dviation standard
ou dans une combinaison des deux, mais en pratique nous n'avons presque jamais
accs cette connaissance. L'approche distribution libre nous dispense de cette
ncessit d'appliquer la pondration adquate et bien qu'elle puisse fournir des
rsultats marginalement de moins bonne qualit qu'une mthode des moindres
carrs correctement pondre, elle donnera gnralement de bien meilleurs
rsultats qu'une mthode des moindres carrs mal pondre.
Une observation exceptionnelle est une observation prsentant une incertitude plus
grande qu'il n'est attendu sur la base de la distribution des incertitudes de la majorit
des observations. Si une exprience renferme une telle observation, celle-ci peut
avoir un effet dramatique sur l'estimation des paramtres par la mthode des
moindres carrs, mais n'en aura presque aucune sur la mthode distribution libre.
La raison pour cela est trs simple et drive des proprits ordinaires de la moyenne
et de la mdiane : si un octognaire marche dans une chambre remplie d'enfants, l'age
moyen de la population de la pice peut facilement tre doubl, mais la mdiane ne
variera quasiment pas. L'estimation mdiane des paramtres comme nous l'avons
dcrite dans le 12.3.2 n'est pas aussi insensible que cela parce que toute observation
aberrante contribue (n 1) droites dans le graphique, mais elle est toujours beau-
coup plus rsistante ces observations exceptionnelles que l'estimation par la
mthode des moindres carrs.
Pour rsumer ce paragraphe et les prcdents, nous pouvons dire que dans des
conditions idales, la mthode des moindres carrs est plus performante que toute
mthode alternative distribution libre, mais qu'elle est tellement sensible aux
dviations par rapport aux conditions idales que dans la pratique, elle peut s'avrer
beaucoup moins performante.
12 ESTIMATION DES CONSTANTES CINTIQUES 405
Dans les expriences caractrises par des incertitudes importantes sur les mesures
de vitesse, le graphique linaire direct comme il a t dcrit originellement (c'est-
-dire comme il est prsent dans les figures 3.13 et 12.1) prsente un lger dsa-
vantage, c'est--dire qu'il conduit des valeurs de Km* et de V* qui ne sont pas
distribues aux environs des valeurs relles correspondantes mais aux environs de
valeurs qui sont trop faibles (CORNISH-BOWDEN et EISENTHAL, 1978). Ce pro-
blme provient de la prsence de points d'intersection dans le troisime quadrant,
c'est--dire de points avec des valeurs ngatives de Km,ij et de Vij. Pour comprendre
comment corriger ce problme il est utile de considrer pourquoi les intersections
se trouvent en dehors du premier quadrant et la figure 12.2 montre des combi-
naisons typiques de valeurs de [ A ] et de v qui conduisent des intersections
situes dans les premier, second et troisime quadrants ; le cas de l'intersection
dans le quatrime quadrant n'est pas prsent puisqu'il est impossible sauf si les
donnes contiennent des vitesses ngatives.
Il est possible de voir que les intersections localises dans le deuxime et dans
le troisime quadrant ont des origines totalement diffrentes et en consquence,
elles doivent tre traites diffremment. Les intersections du deuxime quadrant
(figure 12.2b) peuvent apparatre parce que l'enzyme prsente un phnomne d'in-
hibition par le substrat et les observations proviennent d'une partie de la courbe o
v diminue lorsque [ A ] augmente. Si s'agit de l'explication correcte, elle devrait tre
confirme par la prsence dans le second quadrant d'autres intersections qui
correspondent des observations ralises dans cette gamme de concentrations de
substrat. Cependant, s'il n'y a aucune preuve d'une dviation systmatique vis--vis
de l'quation de MICHAELIS et MENTEN, la prsence d'une intersection isole dans
le second quadrant est trs vraisemblablement obtenue quand les deux valeurs de
[ A ] sont grandes vis--vis de K m et donc que les deux valeurs de v sont suffi-
samment proches l'une de l'autre pour que l'erreur exprimentale provoque leur
inversion dans l'ordre des valeurs. Ceci implique que la vritable valeur de V est
similaire aux deux valeurs de v et que la vritable valeur de Km est beaucoup plus
petite que les deux valeurs de [ A ] . Puisque la mme conclusion dcoule
du traitement des valeurs de Km,ij et de Vij obtenues partir des intersections du
second quadrant, il n'y a aucune raison d'appliquer un traitement particulier ces
intersections.
Le cas des intersections dans le troisime quadrant (figure 12.2c) est trs diffrent.
Celles-ci peuvent tre le symptme d'une incertitude systmatique, signifiant dans
ce cas que le graphique de v en fonction de [ A ] est une sigmode et non une
hyperbole rectangulaire, mais encore une fois, cela doit tre confirm ou infirm
par l'examen des autres intersections obtenues partir d'observations ralises pour
des valeurs similaires de [ A ] . Si une incertitude systmatique n'est pas confirme,
l'origine la plus vraisemblable de ces observations est que les deux valeurs de [ A ]
406 CINTIQUE ENZYMATIQUE
V v
a - Premier quadrant
Comportement habituel
aucun traitement spcial
0
0 Km 0 [A]
V v
b - Deuxime quadrant
V v
c - Troisime quadrant
Ceci implique que la vritable valeur de K m est grande vis--vis des valeurs de
[ A ] et que la vritable valeur de V est grande vis--vis des petites valeurs de v :
cette conclusion est l'oppose de celle impliques par les valeurs de K m,ij et de Vij
qui sont obtenues en considrant les valeurs brutes de l'intersection, puisque ces
deux valeurs sont ngatives dans le troisime quadrant. Ceci explique le petit
problme rencontr si les valeurs brutes des intersections du graphique linaire
direct sont utilises et celui-ci peut tre corrig en traitant ces intersections comme
donnant des valeurs leves la fois de Km,ij et de Vij. Des valeurs numriques
relles ne doivent pas tre proposes ; il est juste suffisant de dire qu'elles sont
grandes et positives. Ceci s'explique parce que les valeurs numriques des membres
extrmes d'un chantillon ne sont pas ncessaires pour dterminer la mdiane.
Ce remde traite un nombre ngatif comme tant au-del de l'infini plutt qu'en
dessous de zro. Bien que de nombreuses personnes puissent se sentir mal l'aise
d'agir de la sorte, elles devraient raliser qu'extrapoler au-del d'une vitesse infinie
est ce que chaque utilisateur d'un graphique en double inverse fait lorsqu'il consi-
dre l'intersection de sa droite avec l'axe des abscisses pour dterminer la valeur de
1 Km (figure 3.11).
Aucune de ces complications n'affecte la forme alternative du graphique linaire
direct illustr dans la figure 3.14, parce que, avec ce graphique tous les dplace-
ments modrs des droites, provoqus par des incertitudes de grandeurs raison-
nables entranent des dplacements modrs des intersections, c'est--dire que
celles-ci se dplacent modrment sur chacun des deux axes et ne passent jamais
d'un quadrant l'autre en raison d'un passage par l'infini. A cause de cela, aucune
rgle spciale n'est ncessaire pour interprter les intersections situes en dehors du
premier quadrant de ce graphique.
w wi wi
wi v [ Ai ]
[ A ]i
vi
K = i i
[12.20]
m
wi wi wi wi
[ A ]2 v [ A ] [ A ] v
i i i i i
Dans ces quations, les pondrations wi sont les pondrations appropries qui
doivent s'appliquer aux valeurs de 1 vi sur la base de deux hypothses diffrentes
au sujet de la pondration approprie pour vi : si les coefficients de variation
associs aux vitesses sont supposs uniformes, la pondration appliquer 1 vi est
wi = vi2 et les quations [12.19] et [12.20] sont identiques aux quations [12.13] et
[12.14] ; si les dviations standards associs aux vitesses sont supposes uniformes,
la pondration appliquer est wi = v i3 vi et les quations sont identiques aux
quations [12.15] et [12.16].
Diffrents calculs peuvent tre raliss pour tester la qualit de l'ajustement, mais
deux questions apparaissent : de quelle manire la courbe calcule s'ajuste-t-elle
aux points observs et avec quelles prcisions les valeurs des paramtres sont-elles
dfinies ? La somme minimale des carrs fournit un point de dpart pour rpondre
la premire question. En termes d'ajustement pondr, elle peut tre dfinie de la
manire suivante :
2
1 1
SS = wi [12.21]
vi v i
qui est quivalente l'quation [12.6] si nous utilisons l'galit wi = vi2 et si nous
calculons vi avec les meilleures estimations des paramtres. Dans cette situation,
cependant, la somme des carrs n'est pas satisfaisante puisqu'il s'agit d'une somme
plutt que d'une moyenne. Le remde vident est de la convertir en une moyenne
en divisant par n, le nombre d'observations. Cependant, cette procdure est trop
simple, parce qu'elle surestime la prcision si n est petit : la raison peut tre
apprhende en considrant le cas extrme de n = 2, o SS sera toujours gal
zro, puisqu'il est toujours possible d'ajuster exactement deux observations avec
l'quation de MICHAELIS et MENTEN, mme s'il n'y a aucune raison de supposer
que les observations sont exactes. Bien que ceci explique de manire vidente la
ncessit de raliser la correction, il est moins vident de savoir quelle taille cette
correction doit avoir ; ici nous affirmerons simplement sans argumenter qu'une
12 ESTIMATION DES CONSTANTES CINTIQUES 409
wi m2 wi
V 2s exp
2
wi + 2 K m +K
m ) = [ A ]i [ A ]i2
s 2( K 2
[12.24]
w w
[ A i] 2 wi [ Ai]
i i
4
V 2
s exp wi
Km
s2 V = [12.25]
K 2
m w w
[ A i] 2 wi [ Ai]
i i
Cette dernire expression est donne explicitement parce que, bien que la manire
de calculer V K partir de V et de K est vidente, la relation entre les trois
m m
Aprs que des donnes aient t ajustes sur une quation, il est toujours utile de
vrifier si les hypothses faites dans l'analyse sont raisonnables. Avons-nous ajust la
bonne quation, une autre quation aurait-elle apport une explication plus crdible
aux observations, une quation plus simple (avec moins de paramtres) aurait-elle
donn les mmes rsultats ? Avons-nous faits des hypothses statistiques raison-
nables par exemple, le coefficient de variation est-il constant, comme nous l'avons
suppos dans le 12.2.2, ou une dviation standard constante aurait-elle constitu
une meilleure approximation ou les incertitudes exprimentales varient-elles d'une
manire plus complexe que ces deux hypothses ne l'impliquent ?
La manire la plus simple d'aborder ces questions consiste examiner les rsidus
aprs l'ajustement, c'est--dire les diffrences entre les vitesses observes v et les
vitesses correspondantes v calcules partir de l'quation ajuste. Nous ne cherche-
rons pas traiter cette partie de manire exhaustive, mais nous allons plutt indiquer
les types d'usage qui peuvent tre faits des rsidus.
Si les valeurs observes de v ont rellement un coefficient de variation uniforme,
les diffrences simples ( v v ) devraient avoir tendance augmenter en valeur
absolue lorsque la vitesse calcule v augmente, mais les diffrences relatives
( v v ) 1 devraient tre distribues l'intrieur d'une bande parallle autour de
zro. D'un autre ct, si les vitesses observes ont rellement une dviation
standard constante, les diffrences simples devraient tre distribues l'intrieur
d'une bande parallle autour de zro et les diffrences relatives devraient avoir
tendance diminuer en valeur absolue lorsque la vitesse calcule v augmente. La
figure 12.3 montre des exemples de tels graphiques des rsidus. Ils sont faciles
excuter, en dpit de la complexit que peuvent avoir les quations qui ont t
ajustes, et ils peuvent fournir une information utile qui n'est pas rellement
accessible d'une autre manire.
Il est conseill d'avoir autant de points que possible dans un graphique des rsidus,
prfrentiellement plus de 30, si celui-ci doit tre utilis pour dcider de la stratgie
correcte de pondration. Ceci permet d'viter d'tre influenc indment par le
comportement aberrant d'une ou de deux observations, puisque la dispersion est
toujours importante. Nanmoins, mme un graphique qui contient aussi peu que
cinq ou dix points peut tre utile pour autant que nous considrions l'interprtation
comme une suggestion plutt que comme une information prcise.
412 CINTIQUE ENZYMATIQUE
v ^v v /v^ 1
0 0
a b
v v^ v /v^ 1
0 0
c d
12.3 - Graphique des rsidus pour tester l'exactitude du schma de pondration
a, b - La paire suprieure de graphiques montre les graphiques des rsidus attendus quand
toutes les vitesses observes ont la mme dviation standard : (a) si la diffrence simple
est porte en graphique en fonction de v , les points sont disperss l'intrieur
(v v)
d'une bande parallle autour de l'axe des abscisses, mais (b) si la diffrence relative
(v v ) 1 est porte en graphique, la bande a la forme d'une trompette dont l'ouverture est
situe gauche. c, d - La paire infrieure de graphiques montre les graphiques des rsidus
attendus quand toutes les vitesses observes ont le mme coefficient de variation : (c)
maintenant le graphique de (v v) produit une bande en forme de coin dont l'ouverture est
droite, alors que (d) le graphique de (v v ) 1 produit une bande parallle.
Les graphiques des rsidus sont toujours trs utiles pour reconnatre si les dviations
vis--vis de l'quation ajuste sont dues une incertitude systmatique (utilisation
d'une mauvaise quation) plutt qu' une dispersion alatoire. Dans cette utilisa-
tion, l'interprtation peut tre claire mme s'il n'y a que quelques points. Par exem-
ple, la tendance systmatique du graphique des rsidus prsent dans l'insert de la
figure 11.1 serait immanquable mme s'il n'y avait que 6 ou 7 points plutt que 19.
Il s'agit d'un exemple construit artificiellement, mais un exemple rel est prsent
dans la figure 12.4 : notons que sans le graphique des rsidus l'ajustement sur le
mauvais modle apparat excellent l'il, mais avec le graphique des rsidus la
nature systmatique des dviations est vidente.
12 ESTIMATION DES CONSTANTES CINTIQUES 413
Les auteurs fournissent rarement des graphiques des rsidus dans leurs publica-
tions, et donc il est important pour un lecteur critique de savoir quoi ils ressem-
bleraient s'ils taient prsents. Une grande prcision n'est pas essentielle pour cette
application et il s'avre souvent suffisant de retracer un graphique publi sous la
forme d'un graphique des rsidus en estimant les coordonnes l'il. Plus rapide et
plus simple, nous pouvons mettre en vidence les incertitudes rsiduelles dans le
graphique publi en observant la courbe trace en plaant l'il proche du papier.
Cette mthode fonctionne trs bien si la ligne trace est une droite, mais elle peut
aussi tre utilise avec une courbe si la courbure est faible.
Produit form (M) 80
60
40
20
0
0 1 2 3 4 Temps (min)
a - Complexe enzyme-enzyme suppos inactif
Produit form (M) 80
60
40
20
0
0 1 2 3 4 Temps (min)
b - Complexe enzyme-enzyme trait comme actif
12.4 - Discrimination entre modles avec l'aide des graphiques des rsidus
Deux modles utiliss pour reprsenter la courbe d'avancement de la raction catalyse
par la phosphoribulokinase (LEBRETON et GONTERO, 1999) ne sont presque pas distinguables
quand ils sont compars sous la forme de graphiques ordinaires, mais pour le modle qui
traite la phosphoribulokinase complexe comme inactive (a) le graphique des rsidus
prsente une vidence claire d'incertitude systmatique, alors que le modle qui traite le
complexe comme actif (b) ne le fait pas.
Il peut souvent tre impossible de tirer des conclusions dfinitives partir d'un seul
graphique, puisque le nombre d'observations peut tre trop faible, mais si plusieurs
courbes sont traces dans un graphique, reprsentant des conditions exprimentales
414 CINTIQUE ENZYMATIQUE
a f
b g
c h
d i
En gnral, donc, bien que l'ombrage soit utile pour prsenter une interprtation au
lecteur, l'interprtation initiale devrait idalement tre faite sans ombrage et sans
interfrence de toute nature. Si nous comparons les graphiques (h) et (i) avec le
graphique (j), qui reprsente encore les mmes donnes mais qui cette fois sont
noyes dans les annotations du graphique, une pratique communment rencontre
dans les graphiques publis, nous constatons que les points eux-mmes ont presque
perdu leur signification et que la tendance non-linaire est devenue presque
imperceptible. Idalement, un graphique des rsidus ne devrait contenir aucune
annotation (aucune chelle, aucun nombre, aucun titre, aucun nom de variable) :
toute cette information, si elle est ncessaire peut facilement tre communique
dans la lgende. Les axes restent utiles mais ils devraient tre aussi imperceptibles
que possible tout en restant visible, comme dans le graphique (i).
Ces dernires remarques s'appliquent en particulier aux graphiques des rsidus.
Certaines ne s'appliquent pas aux autres types de graphiques pour lesquels relguer
l'information dans la lgende n'est pas une bonne ide. Certains points ne s'appli-
quent pas galement d'autres graphiques, cependant n'importe quel graphique
devrait s'attacher mettre en vidence les donnes analyses et non par exemple
une grille utilise pour l'interprtation. TUFTE (1990), par exemple, recommande
que si nous traons un graphique la main sur une feuille de papier en utilisant une
grille trs prominente, nous devrions tracer le graphique au dos du papier : la
grille apparatrait ainsi suffisamment clairement par transparence pour permettre de
tracer le graphique, mais suffisamment faiblement pour tre ignore par la suite.
Plus gnralement, les trois livres publis par cet auteur (TUFTE, 1983, 1990, 1997)
sont recommands tous ceux qui sont srieusement intress par la reprsentation
graphique d'une information.
PROBLMES
12.1 - Dterminer par les mthodes des moindres carrs et distribution libre
les estimations des paramtres de l'quation de MICHAELIS et MENTEN
pour l'ensemble suivant de donnes :
1 0,219 6 0,525
2 0,343 7 0,512
3 0,411 8 0,535
4 0,470 9 0,525
5 0,490 10 0,540
12 ESTIMATION DES CONSTANTES CINTIQUES 417
1.1 - Ordre 1/2 vis--vis de A et ordre 1 vis--vis de B. Un ordre 1/2 peut tre ex-
pliqu en supposant que l'espce prdominante dans un mlange lquilibre
est le dimre de lespce chimiquement active.
1.2 - a - La pente et lordonne lorigine sont toutes deux incompatibles.
b - Compatible.
c - Pente compatible, ordonne l'origine incompatible.
1.3 - Pente = e ( k 1 +k 1 ) t ; le point d'intersection = ([ P ] ,[ P ] ) .
2.1 - Les enthalpies d'activation sont typiquement d'environ 50 kJ mol1.
2.2 - 0,0033 K1.
3.1 - a - Km 9 .
b - 9Km .
c - 81.
3.3 - Au moins 8,2.
3.4 - La constante d'quilibre = 5,1. La seconde exprience donne une valeur
de 1,5 pour la mme constante d'quilibre. Un changement de l'enzyme ne
peut pas par lui-mme expliquer cette diffrence. Donc soit les valeurs
mesures sont sujettes caution, soit les conditions exprimentales taient
diffrentes sans que cela ne soit spcifi (par exemple, l'exprience a t
ralise une temprature diffrente ou un pH diffrent).
3.5 - Les mthodes les plus prcises devraient donner des valeurs proches de
Km = 10,6 mM, V = 1,24 mM min1.
[ A ]0
1+
k0 [ E ]0 KP
3.6 - b - V app = , Kmapp = KmA ;
K K
1 mA 1 mA
KP KP
c - Quand la valeur de KP est infrieure celle de Km .
420 CINTIQUE ENZYMATIQUE
5.4 - a - 1.
b - 24/6 = 4.
5.5 - a - Le graphique en double inverse.
b - L'ordonne.
c - Comme une intersection ngative sur l'axe des abscisses.
5.6 - A-C (parce qu'il donne la valeur la plus leve de V/Km).
5.7 - a - L-Ala-L-Ala-L-Ala (parce qu'il donne la valeur la plus leve de k0 /Km).
b - Oui (comparer avec le tableau 5.2).
c - Des expriences permettant de tracer un graphique de comptition.
[ I ] [ I ]
5.8 - Si [ A ] < Km , alors Km 1+ est plus grand que [ A ] 1+ quel
Kic Kiu
que soit le rapport entre la concentration d'inhibiteur et la constante d'inhi-
bition. Dsormais, dans ces conditions un inhibiteur comptitif augmente la
valeur du dnominateur de l'quation de vitesse plus qu'un inhibiteur anti-
comptitif la mme concentration, c'est--dire qu'il diminue la vitesse d'un
facteur plus important. L'inverse s'applique quand [ A ] > Km . Un inhibiteur
comptitif exerce ces effets en se fixant sur la forme de l'enzyme qui est
prdominante aux faibles concentrations de substrat, alors qu'un inhibiteur
anti-comptitif le fait en se fixant la forme qui est prdominante des
concentrations leves de substrat.
5.9 - La logique de l'analyse est essentiellement la mme que celle du graphique
de DIXON ( 5.3), mais le rsultat est oppos, c'est--dire que les droites se
coupent o [ I ] = Kiu et non o [ I ] = Kic . Les rsultats pour l'hexo-
kinase D implique que la N-actylglucosamine et la glucosamine se fixe au
mme site et que seulement une seule molcule la fois peut tre fixe, de
sorte que la valeur K'j est infinie. Par contre, la valeur de K'j pour la
protine rgulatrice est la mme ou est similaire la constante d'inhibition,
K'j , impliquant qu'elle se fixe sur un site diffrent de celui sur lequel se fixe
la N-glucosamine et qu'aucun inhibiteur n'affecte la fixation de l'autre.
5.10 - a - 17 possibilits pour chaque position donnent 178 7.109 squences.
b - 1 mg = 103/1600 = 6.107 moles quelque soit la squence. Donc chacune
des 7.109 espces est reprsente en moyenne par 8,5.1017 mol. En mul-
tipliant par la constante d'AVAGADRO, 6.1023, donne une moyenne de
5.107 molcules pour chacune, bien qu'une distribution ingale entre les
17 possibilits pour chaque position puisse toujours se traduire par quel-
ques squences mal reprsentes (ou pas reprsentes du tout) dans
l'chantillon.
422 CINTIQUE ENZYMATIQUE
8.5 - Non : un graphique d'ARRHENIUS avec ces donnes montre une courbure
prononce, caractristique des effets combins de deux ou de plusieurs cons-
tantes de vitesse plutt qu'une droite qui est attendue pour la dpendance la
temprature d'une constante de vitesse lmentaire.
9.1 - La pente = [ H + ] 1. Ce graphique exprime la cooprativit de manire plus
directe que le graphique de HILL parce que sa pente a toujours le mme signe
que celui de la cooprativit.
V1 [ A ] V2 [ A ]
9.2 - v = + .
Km 1 + [ A ] Km 2 + [ A ]
dv = Km 1V1 Km 2V2
+ .
d[ A] ( Km 1 + [ A ]) ( Km 2 + [ A ]) 2
2
d 2v = 2 Km 1V1 2 Km 2V2
.
d[ A] 2
( Km 1 + [ A ]) ( Km 2 + [ A ])3
3
10.5 - Une mthode base sur la surexpression d'enzymes limitant la vitesse peut
uniquement fonctionner si les enzymes limitant la vitesse existent et conti-
nuent limiter la vitesse quand leurs activits augmentent. L'analyse du con-
trle mtabolique suggre non seulement que les enzymes limitant la vitesse
n'existent pas mais aussi que les coefficients de contrle du flux d'un enzyme
tendent diminuer quand l'activit dans le systme est augmente. Donc, la
stratgie propose ne peut pas fonctionner. Pour une discussion plus appro-
fondie de ce point, voir CORNISH-BOWDEN (1995c) et pour une application
voir NIEDERBERGER (1992).
11.1 - Le mcanisme le plus simple en accord avec les rsultats est un mcanisme
de MICHAELIS-MENTEN irrversible, c'est--dire un mcanisme dans lequel
k2 = 0. Dans ce cas, les quations [11.27]-[11.28] sont simplifies et four-
nissent : k1 2.106 M1 s1, k2 60 s1, k1 130 s1.
t t
11.2 - Les donnes ont t calcules partir de y = 16 , 37 + 46 , 3 e 3.72 + 29 ,7 e11,41 ,
mais les valeurs suivantes sont typiques de celles qui pourraient tre obte-
nues en utilisant la mthode d'pluchage dcrite dans le 11.4.2 : A = 17,
B = 42,5, C = 33,4, 1 = 3,4 ms, 2 = 10,3 ms.
11.3 - Il faut noter que les concentrations finales aprs mlange taient les mmes
dans les deux expriences, et la concentration de substrat tait suffisamment
leve pour entrer en comptition effective avec l'inhibiteur. Les diffrentes
constantes de temps indiquent que le processus le plus lent ( = 15 ms)
correspond approximativement la libration de l'inhibteur partir du
complexe enzyme-inhibiteur, c'est--dire que 1 koff 15 ms, koff 67 s1.
Ds lors, kon = 3,3 106 M1s1. L'observation selon laquelle la libration de
l'inhibiteur est l'tape qui limite la vitesse dans l'exprience (b) n'a aucun
effet sur l'interprtation de Ki comme constante d'quilibre. Ceci dcoule du
fait qu'il fait rfrence une raction en cul-de-sac (voir 6.3.6.3).
12.1 - Les moindres carrs : Km = 1,925 mM, V = 0,666 mM min1.
Distribution libre : Km* = 1,718 mM, V* = 0,636 mM min1.
La tendance des rsidus suggre que l'enzyme est sujet une inhibition par le
substrat, de sorte qu'il serait incorrect de tirer des conclusions au sujet des
poids statistiques appropris tant que les donnes n'ont pas t ajustes sur
une quation plus adquate que l'quation de MICHAELIS-MENTEN. Il serait
galement souhaitable de disposer de bien plus que 10 observations.
12.2 - Km = 2,747 mM, V = 0,737 mM min1 ;
Km* = 1,718 mM, V* = 0,638 mM min1 (si vous obtenez Km* = 1,677 mM,
V* = 0,632 mM min1, vous devriez consulter la discussion dans le 12.3.5).
Les rsultats, quand ils sont compars avec ceux du problme 12.1, illustrent
le point gnral selon lequel les estimations par la mthode des moindres
426 CINTIQUE ENZYMATIQUE
carrs sont beaucoup plus sensibles que les estimations par la mthode des
distributions libres pour la prsence des mauvaises observations exception-
nelles.
2
v2 v3 v3 v3
i i vi2
vi3 vi3 i 2 i
m = [ Ai ] [ Ai ] [ Ai ] [ Ai ]
12.3 - K 3 3 2
, V = 3
.
vi vi vi vi vi3 vi2
vi
2
vi
2
[ Ai ] 2 [ Ai ] [ Ai ] [ Ai ] 2 [ Ai ] [ Ai ]
Dans le numrateur de l'expression pour Km , les deux termes ont les dimen-
sions de v 5 [ A ] , alors que dans le dnominateur ils ont les dimensions de
v 5 [ A ] 2 , de sorte que l'expression dans son ensemble a les dimensions de
[ A ] , ce qui est correct. L'analyse de l'expression de V est similaire.
12.4 - Non, cela implique l'oppos. Il faut noter que les poids statistiques v 3 pour
1 v correspondent approximativement aux poids statistiques de 1 v pour v,
c'est--dire qu'ils supposent une variance de v pour v ou une dviation
standard de v1/2 : loin d'tre approximativement constante pour les petites
valeurs et fortement croissante pour les grandes, elle augmente rapidement
partir de l'origine et stagne lorsque v augmente.
RFRENCES
Les paragraphes ou les problmes dans lesquels les publications sont cites en
rfrences sont indiqus entre crochets aprs chaque rfrence.
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RFRENCES 441
L quenched-flow 377-379
stopped-flow 376
laccase 234 mmoire (d'un enzyme) 326-327
lactate dshydrognase 126,228 MENTEN 70-71,258
LAIDLER 81,147 mtabolites internes et externes 330
LANGMUIR 72 mthionine adnosyltransfrase 105
LAUX 152 MEUNIER 325-326
LE CHATELIER (principe) 286 MICHAELIS 70-71,108,128-129,
Li+ 147 144,257-258,267-271
LIEBIG 55 constante 75,210
LINDBLADH 355 fonctions pH 267-271
LINEWEAVER-BURK vitesse initiale 70-71
(graphique) 73,84-86,226 modle daction des enzymes 70-71
lipase 55 dpendance au pH 257-259,267-277
lois de la thermodynamique 28-30 v en fonction de log [A] 82-85
deuxime loi 30 MICHAELIS et MENTEN 70-71,75-81,108
premire loi quation 70-81
(conservation de l'nergie) 28 quation intgre 119
LUMRY 399 raction rversible 96-98
lysine (proprits acide-base) 265 inhibition par le produit 108-110
lysozyme 166 paramtres apparents 212
MILLIKAN 376
MILNES 376
M mise au point des expriences
dinhibition 164-166
malate dshydrognase 355 concentration de MgATP2 135-137
MANSHOURI 116 choix du pH 131-132
MCKAY 239 rplication dobservations 132-135
mcanisme graphique des rsidus 411-416
complexe ternaire 180,213 concentration de substrat 129-131
complexe ternaire alatoire 181,206 raction deux substrats 223-224
complexe ternaire ordonn182,205,218 mnmonique (cooprativit) 326-327
enzyme modifi 183,208 modle
ordre prfrentiel 326 allostrique 311-327
plusieurs substrats (classification) 180 association-dissociation 324
d'activation spcifique 161 mnmonique 326-327
de raction dfinition 11 squentiel voir KNF
de rgulation 294 symtrique 311-318
gnral de modification 163 modification chimique 171-174
ping pong moindres carrs (mthode des) 396
(voir enzyme modifi) 184 molcularit 11-12
squentiel MONOD 298,311-318
(voir complexe ternaire) 184 monophosphatase du myo-inositol 147
meilleur ajustement 397 mutagense dirige 171
mlange rapide 375 mutase 250
flux continu 375 MWC (modle) voir modle symtrique
450 CINTIQUE ENZYMATIQUE
T V
TAKETA et POGELL (index) 301-306
V voir aussi pKcat
TAMMANN 59
dfinition 75-76
tampon 263
mthode distribution libre 400-403
pouvoir molaire 264
mthode des moindres carrs 396-400
temprature
effets du pH 274-276
choix 131-132
ractions deux substrats 205,212-213
effet sur les ractions catalyses
V/Km voir aussi kca t /Km
par des enzymes 281-285
dfinition 75-76
effet sur les
mthode distribution libre 400-403
constantes de vitesse 45-53
mthode des moindres carrs 396-400
optimum 281-285
effets du pH 274-276
mthode de saut 380-382
ractions deux substrats 205,212-213
temps mort 377
VAN SLYKE 72,366
temps spcifique
tampon 264
voir constante de spcificit
VAN SLYKE et CULLEN (quation) 72,366
thronyl-ARNt synthtase 231
VANT HOFF 36,46-47,57,282
THUSIUS 384
variable d'tat 27
TOMPSON 59-64,129
variance exprimentale 409
topologique (raisonnement) 200
variation (coefficient de) 396
traceur (perturbation) 249-250
vitesse
transaminase 183,186,211
dfinition 10
transformation linaire
nette (dfinition) 37
EADIE et HOFSTEE 87
limite (dfinition) 75
graphique linaire direct 89
absolue (thorie) 49
HANES 86
dinactivation 139
LINEWEAVER et BURK 84
maximale Vmax voir vitesse limite
transitoire (phase) 365
vitesse initiale
proche de lquilibre 389-391
dfinition 37
hors-quilibre 382-389
estimation 120
triose-phosphate isomrase 250,254
en absence de produit 210
trypsine 55
mesures prcises 110
tryptophane synthtase 355
VOLKENSTEIN 194
TSOU 171-174
volume d'activation 285-288
graphique 173
TUFTE 416
tyrosine (proprits acide-base) 265
tyrosine kinase 177
W
WAAGE 11,57
WAIGHT 131
U WATARI 327
WESTLEY 212
ultra-sensibilit d'ordre zro 359
WHITE 380
unit denzyme 82
WHITEHEAD 307,326
urase 175
WIGNER 49
INDEX 453
WILKINSON 400 Y
WILSON 139-140,158-159,174
WONG et HANES YANOFSKY 355
formalisme 180,232 YATES 152
mthode de 193
WONG 81
raisonnement topologique 200 Z
WOOLF 88,181
WURTZ 61 ZERNER 373
WYMAN 311-318 zymase 56
zymogne 160
TABLE DES MATIRES
PRFACE .............................................................................................................................................5
1 PRINCIPES DE BASE DE LA CINTIQUE CHIMIQUE ....................................................................7
1.1. Introduction........................................................................................................................7
Les conventions d'criture des ractions chimiques....................................................................7
1.2. Les principes de base de la cintique chimique.............................................................10
1.2.1. Vitesse de raction et quation de vitesse.....................................................................10
1.2.2. Mcanisme de raction et ractions lmentaires ........................................................11
1.2.3. Ordre et molcularit d'une raction.............................................................................11
1.2.4. Dtermination de l'ordre d'une raction........................................................................15
1.2.5. Dimensions des constantes de vitesse...........................................................................16
1.2.6. Les ractions rversibles ...............................................................................................19
1.2.7. Dtermination des constantes de vitesse du premier ordre..........................................20
Problmes ...................................................................................................................................23
RFRENCES ..................................................................................................................................427
INDEX ...............................................................................................................................................443