Sunteți pe pagina 1din 112

CAPITOLUL II

2.1 FENOMENE FIZIOLOGICE CORELATE CU


REALIZAREA UNEI CULTURI IN VITRO

Tehnicile de cultur in vitro folosite n cercetare sau pentru producerea


de plante, pornesc de la aceeai premiz: posibilitatea de a controla ntr-un mod
optim factorii de mediu (temperatur, lumin, compoziia mediului de cultur,
pH, umiditate) necesari fragmentului de plant inoculat n condiii artificiale de
mediu, n ncercarea de a analiza funciile sale fiziologice sau de a-l conduce
ntr-o anumit direcie, cum ar fi formarea de noi lstari (micropropagarea).
Tehnicile de cultur in vitro, pe lng aspectul tehnologic, ne permit
rezolvarea unui numr de probleme:
-meninerea unui explant viabil i activ din punct de vedere vegetativ;
-permiterea creterii normale a unui explant reprezentat de o structur
organizat (meristem, vrf de cretere sau mugure);
-inducerea proceselor de difereniere n cazul unor fragmente de calus
pentru formarea de organe sau embrioni somatici;
-inducerea proceselor de dedifereniere, n cazul unor explante formate
din celule difereniate (fragmente de tulpin, frunz, peiol, rdcin, etc.)
rezultnd o nou organizare tisular;
-inducerea proceselor de diviziune celular, valabil tuturor cazurilor
amintite mai sus.
Aceste probleme au fost parial rezolvate odat cu identificarea
regulatorilor de cretere endogeni de tipul auxinelor (primul grup de fitohormoni
recunoscut), giberelinelor, citochininelor, pentru a numi doar cele trei clase
principale de regulatori de cretere. Aceste substane par a determina orientarea
dezvoltrii celulelor n cultura artificial, fapt pentru care li se acord prima
atenie atunci cnd se ncearc explicarea unor fenomene fiziologice.

2.1.1 Regulatorii de cretere

Existena hormonilor vegetali a fost bnuit nc de la nceputul


secolului trecut. Numeroase lucrri tiinifice privitoare la aceste subiect au
evideniat prezena lor, dar nu le-au putut identifica dect mult mai trziu. Primii
fitohormoni descoperii au fcut parte din clasa auxinelor, n jurul anului 1934,
giberelinele i citochininele fiind descoperite mai trziu, n anii 50. Aceste trei
tipuri de regulatori de cretere exercit o aciune stimulativ asupra
metabolismului celular. Exist i substane cu efecte inhibitoare asupra creterii
i dezvoltrii celulelor vegetale cum ar fi acidul abscisic, identificat n anul 1965
i substanele fenolice identificate civa ani mai trziu. De asemenea, etilena,
un compus gazos, a fost recunoscut ca regulator de cretere atunci cnd
165
metodele de msurare a acesteia au permis detectarea sa n organele plantelor.
Etilena poate avea fie efect stimulator, fie efect inhibitor asupra plantelor.
Aceste substane sunt endogene, ceea ce nseamn c sunt sintetizate de
plante. Exist i fitoregulatori de cretere artificiali cu formule chimice
asemntoare celor naturali, prezentnd o aciune fiziologic similar. Toate
aceste substane, sintetice sau naturale, sunt numite regulatori de cretere i au
anumite caracteristice comune:
-acioneaz ntr-o concentraie foarte mic, n concentraie mare sunt
toxice, de aceea unele dintre ele sunt folosite ca erbicide;
-acioneaz numai n interaciune cu ali fitoregulatori, funcia lor fiind
determinat de balana hormonal stabilit ntre ei;
-intervin ntr-un numr de fenomene fiziologice ce implic mai multe
moduri de aciune astfel nct noiunea de hormon (cu un efect rizogenic sau
caulogenic specific) a fost abandonat.
O diferen substanial ntre fitoregulatorii de cretere artificiali i cei
naturali const n faptul c cei endogeni pot fi controlai de mecanismele
metabolice ale celulelor fiind eliminai suficient de repede, pe cnd cei artificiali
persist mult mai mult fiind deseori preferai aplicaiilor practice.

2.1.1.1 Auxinele

Auxinele au fost descoperite n urma unor experimente asupra


coleoptilului la Gramineae. Numele de auxine provine din grecescul auxein a
crete, determinnd elongarea celulelor (auxesis cretere ce se refer n special
la mrimea celulei dect la numrul de celule).
Este un compus ce are la baz nucleul indolic cu formula de baz
C10H9O2N cunoscut sub numele de acid - indolil acetic (Fig.1).

Fig.1 Acidul - indolil acetic


A. Proprietile fiziologice ale auxinelor

166
Auxinele intervin n multe fenomene fiziologice, iar aciunile lor depind de
concentraiilor i de interaciunile cu ali regulatori de cretere. Studiind cteva
din efectele lor s-a putut concluziona c:
-exercit o aciune clar asupra elongrii celulare, aceste efect urmeaz
creterii plasticitii peretelui celular i penetrrii apei n celul. Apoi rezistena
peretelui scade i celula crete n lungime;
-modific permeabilitatea membranei plasmatice, ceea ce duce la o
descrcare de ioni de H+, determinnd o cretere a aciditii responsabil de
diminuarea rezistenei peretelui celular i o absorbie de ioni de K+;
-influeneaz n general metabolismul celular i n particular sinteza ARN-
ului ribozomal (ribozomii particip la sinteza proteinelor);
-stimuleaz diviziunea celulelor cu origine cambial (acest tip de aciune a
determinat insuccesele din primele ncercri de iniierea a culturilor in vitro);
Acest efect este descris ca histogenic deoarece conduce la formarea unui numr
de celule asemntoare, numite calus;
-acioneaz asupra sintezei etilenei ntr-o anumit concentraie, etilena
intervine n schimb n reglarea nivelului de auxin cel puin la nivelul vaselor
conductoare;
-acioneaz asupra tropismului plantelor i asupra corelaiei dintre organe,
n particular asupra fenomenelor de dominan apical;
-determin ntrzierea cderii frunzelor i a fructelor;
-au aciune rizogenic fiind folosite n special n micropropagarea speciilor
ornamentale destinate comerului de flori tiate;
Aceste efecte numeroase nu pot rezulta doar din aciunea singular a
auxinei deoarece concentraia optim este diferit pentru fiecare tip de aciune n
parte i se schimb n funcie de concentraia celorlali fitoregulatori.
Modul de aciune al auxinelor. Nu se poate da un rspuns precis, dar
cercetrile n domeniu au evideniat existena unor receptori fie membranari, fie
citoplasmatici specifici auxinei. Pe baza acestei ipoteze au rezultat urmtoarele
concluzii:
-n funcie de prezena sau absena unuia sau a celuilalt receptor apar
diferene de reacie n concordan cu originea celulei ce reacioneaz la acest
fitohormon;
-n funcie de afinitatea receptorului pentru auxin unii sunt angrenai mai
repede dect alii.
Au fost descoperii receptori i pentru alte tipuri de fitoregulatori de cretere,
de aici se poate extinde ideea existenei de receptori pentru toate tipurile de
regulatori endogeni.

B. Auxinele n plante

167
Toate plantele sintetizeaz auxine, sintez modulat de stadiul de dezvoltare
ale acestora. Sinteza auxinelor are loc la nivelul frunzelor tinere, a mugurilor i
n florile i fructele tinere.
Auxinele circul de la vrful spre baza organelor cu o polaritate puternic
pronunat n organele tinere, dar n cursul transportului lor sunt descompuse de
auxin-oxidaze, ceea ce nseamn c auxinele sunt n concentraie mai mare n
apropierea situsurilor de sintez. Astfel, auxinele sunt prezente ntr-o
concentraie suficient n vrful plantelor n cretere, n mugurii florali sau
foliari, pentru a asigura multiplicarea i elongarea celulelor.

C. Auxinele sintetice

De cnd au fost identificate auxinele, s-au sintetizat compui chimici similari


acestora, care au generat n celulele vegetale efecte similare auxinelor endogene,
ceea ce confirm existena receptorilor pentru auxine. Mai mult, fiind influenai
mai puin de activitatea auxin-enzimelor , vor putea avea un efect prelungit n
plante.
Printre numeroasele substane folosite, cele mai importante sunt:
-acidul.indolil butiric (AIB);
-acidul naftalen acetic (ANA Fig.2) i derivaii si: acidul naftooxiacetic
(ANOA) i naftilacetilamida (NAD);
-acidul 2,4 diclorfenoxiacetic (2,4 D).

Fig.2 Acidul naftalen -acetic

n practic, auxinele endogene pot fi folosite, fiind mai puin toxice dar
i mai puin eficiente deoarece activitatea acestora este rapid inhibat de
aciunea auxin-oxidazelor. De aceea produsele sintetice le-au luat locul chiar
dac implic un risc mai mare de toxicitate.
n aplicaiile agricole, compuii auxinici sunt folosii pentru cicatrizarea
rnilor rezultate n urma tierilor anuale din pomicultur, n evidenierea

168
fructelor partenocarpice sau pentru ntrzierea cderii frunzelor sau a fructelor
pn la recoltare, ca urmare a efectului invers exercitat de acidul abscisic.
i n domeniul culturilor in vitro se folosesc aceleai substane
urmrindu-se n principal efectele rizogenice i de multiplicare a celulelor pe
care acestea le genereaz.

2.1.1.2 Giberelinele

Asemeni auxinelor, efectul giberelinelor a fost evideniat nainte ca


acestea s fie identificate. Primele observaii (1926) au fost fcute pe plante de
orez atacate de o ciuperc (Giberella fujikuroi) care prezentau internoduri mult
elongate i frunze clorotice. Extractul apos din ciuperc a provocat simptome
similare la plantele testate, ceea ce a condus la ideea existenei unei substane
responsabile de aceste efecte.
Prima giberelin identificat a fost acidul giberelic sau GA3 (un complex
izolat n 1939 i numit giberelina A). Aceast prim descoperire a fost urmat
de descoperirea altor gibereline pn cnd n plante i n ciuperci au fost
identificate n total aproximativ cincizeci de gibereline. Acetia sunt toi
compui endogeni. n practic, giberelinele folosite sunt extracte purificate.
Cea mai folosit giberelin este GA3 (Fig.3) i mai puin folosite sunt
amestecul GA4+GA7 sau GA7. Este posibil ca n urmtorii ani s fie folosite
gibereline sintetice, avnd n vedere c primele gibereline sintetice au fost
obinute prin anii 80.

Fig.3 Acidul giberelic

Toi aceti compui au un nucleu similar (nucleul giberelic) diferind doar


prin calitate i poziia substituenilor n nucleu.

A. Proprietile fiziologice ale giberelinelor

169
Proprietile fiziologice ce urmeaz a fi descrise corespund acidului
giberelic (GA3). Nu toate giberelinele au activitate similar, unele sunt inactive
sau doar forme intermediare, ceea ce le face dificil de studiat, iar mai mult, nu
toate plantele posed aceleai gibereline.
Principalele proprieti ale acidului giberelic sunt:
-acioneaz asupra elongrii internodurilor, uneori determinnd rezultate
spectaculoase (ex: s-au obinut plante de varz cu tulpina de 3 m), dar nu asupra
tuturor speciilor. Doar unele dintre varietile pitice ale unor specii pot atinge
talii normale n urma aplicrii de GA3, n general varietile pitice nu
reacioneaz la efectul de elongare al acidului giberelic. Acidul giberelic
acioneaz i asupra pedunculilor florali, mpiedic maturizarea timpurie (cu 15
pn la 20 de zile la Cyclamen) sau alungirea inflorescenelor prea dezvoltate
(ex: la viele de vie cu ciorchini deni, acidul giberelic a inhibat dezvoltarea
racemelor laxe);
-n cultura in vitro giberelinele acioneaz i la nivelul meristemelor,
care, n absena acestora, prezint un aspect globular;
-stimuleaz metabolismul celular deoarece favorizeaz sinteza enzimelor
hidrolitice. S-a dovedit c la seminele de orz, acumularea -amilazei, o enzim
cu rol n transformarea amidonului n zaharuri solubile, este datorat acidului
giberelic, care acioneaz direct sau dup asocierea cu un receptor. Giberelinele
acioneaz, de asemenea, n prezena auxinelor, i sunt deseori stimulate de
sinteza sau inhibarea sintezei auxin-oxidazelor;
-acioneaz asupra nfloririi, avnd ca efect fie inhibarea inducerii
florale, cum ar fi cazul pomilor fructiferi, sau stimuleaz nflorirea speciilor ce
necesit temperaturi sczute pentru a nflori, astfel nct n prezena
giberelinelor aceste specii nfloresc i fr temperaturi sczute (morcov). La alte
specii, ce necesit de asemenea temperaturi sczute pentru nflorire, prezena
giberelinelor induce doar alungirea tulpinii fr formarea florilor (sfecl).
Aceste contradicii n aparen au o explicaie simpl: n plantele prezentate mai
sus frigul acioneaz doar asupra creterii tulpinii, pe cnd n cellalt caz asupra
procesului de nflorire. Astfel, giberelinele, i exercit doar rolul de stimulatori
ai elongaiei neinfluennd, n acest caz, procesele fiziologice normale;
-acioneaz asupra formrii fructelor partenocarpice la pr, mandarin,
prun;
-exercit o aciune complex asupra germinrii seminelor sau pornirii n
vegetaie a mugurilor dorminzi, atunci cnd condiiile climaterice (temperaturi
sczute) nu permit acest lucru, inducnd i ramificarea sau creterea ramurilor la
Hydrangea;
-n organogenez, aciunea giberelinelor poate fi antagonic. Par a se
opune fenomenului de dedifereniere, neputnd fi folosite in vitro n acest scop,
acionnd ns asupra meristemelor apicale sau axilare i asupra butonilor
florali, prin stimularea creterii i dezvoltrii acestora.
170
B. Giberelinele n plante

Giberelinele au fost descoperite att n plante ct i n ciuperci cu o


distribuie inegal. Unele gibereline se pot ntlni doar n plante, altele doar n
ciuperci i unele n ambele grupe (acizii giberelici 1,3,4,7,9). Unele plante
posed doar un fel de gibereline, n alte specii se afl i acioneaz mai multe
tipuri de gibereline.
Locurile de sintez a giberelinelor se afl la nivelul frunzelor foarte
tinere, n mugurii foliari i florali, n lstarii activi, n vrful rdcinilor i n
embrioni.
Giberelinele circul liber prin plant fr existena unei polariti fiind
asociate deseori zaharurilor, eliberndu-se n situsurile int.

2.1.1.3 Citochininele

Citochininele au fost descoperite n timpul studiilor efectuate asupra


esuturilor vegetale cultivate in vitro. S-a descoperit i acum este bine cunoscut
faptul c adiia de lapte de nuc de cocos n mediile artificiale de cultur are un
efect favorabil asupra multiplicrii celulare i n lstrire. Cercetrile ce au
ncercat s descopere factorul responsabil de aceste efecte au dus la izolarea
unui complex chimic activ de natur purinic, care nu a putut fi iniial
identificat. Aceste rezultate au dat posibilitatea continurii cercetrilor asupra
purinelor i n 1956, Skoog a izolat, din ARN denaturat, o substan activ
numit chinetina.
Citochininele sunt nlocuitori ai adeninelor la care sunt cunoscui doi
compui endogeni:
-zeatina (Fig.4)
-izopenteniladenina, a crei compui sintetici sunt: chinetina (Kin
Fig.4) (6-furfurilaminopurina) i benziladenina (BAP) (6-benzilaminopurina).

a) b)
Fig.4 Citochinine: a) zeatina, b) kinetina

Se mai folosesc i ali nlocuitori ai adeninelor, sintetici, liberi sau n


asociere cu zaharuri.
171
A. Proprietile fiziologice ale citochininelor

Citochininele sunt foarte active n plante i asemeni celorlalte dou clase


de fitohormoni prezentate anterior au o serie de proprieti dintre care:
-au un efect foarte clar asupra diviziunii celulare. n acest proces
citochininele sunt indispensabile, dar ineficiente fr aciunea auxinelor, cele
dou complementndu-se reciproc. Auxinele favorizeaz duplicarea ADN, iar
citochininele permit separarea cromozomilor;
-au un rol la fel de important n organogenez stimulnd formarea
lstarilor, fiind ns antagonice rizogenezei;
-exercit un efect de stimulare a metabolismului celular, favoriznd
sinteza proteinelor, prin rolul ce-l joac n compoziia ARN-ului de transfer i
protejnd metaboliii de aciunea enzimelor hidrolitice. Acest efect determin
ntrzierea senescenei pn la punctul n care frunzele mature tratate cu
citochinine se comport asemntor celor tinere din punct de vedere metabolic;
-exercit un efect antagonic asupra dominanei apicale stimulnd
lstrirea axilar;
Citochininele prezint o importan deosebit n domeniul culturii in
vitro deoarece au permis obinerea unor progrese importante n micropropagarea
plantelor. Proprietile citochininelor permit rezolvarea dificultilor enumerate
mai sus, cum ar fi meninerea viabilitii celulelor vegetale, stimularea diviziunii
celulare, orientarea celulelor spre dedifereniere.

B. Citochininele n plante

Prima citochinin endogen a fost identificat n 1963 n embrioni


imaturi de porumb, de unde i numele de zeatin, urmat de izopentenil adenina
(IPA), descoperit puin mai trziu n plante atacate de bacteria
Corynebacterium fasciens. Toate plantele conin citochinine sintetizate n
special n rdcini i n embrioni. Aplicarea citochininelor pe frunze determin
atragerea substanelor nutritive spre aceste zone datorit efectului de stimulare a
metabolismului exercitat de citochinine la acest nivel. Creterea n dimensiuni a
tuberculilor i fructelor se datoreaz prezenei citochininelor endogene localizate
n aceste organe.
Citochininele se pot asocia cu zaharurile i circula prin plante fr
polaritate. Se presupune ca ele circul ntr-o form inactiv i c rmn
localizate la anumite nivele unde vor fi activate ulterior, ca n cazul aplicaiilor
pe frunze.

172
2.1.1.4 Etilena

Etilena (fig.5) este un compus gazos identificat cu mult timp n urm n


ncperile de depozitare a fructelor sau plantelor, dar funcia sa de regulator de
cretere nu a fost evideniat pn n momentul dezvoltrii tehnicilor de analiz
n plante. Etilena se afl n plante n cantiti infime i poate fi produs de toate
prile acesteia.

Fig.5 Etilena

Principalele proprieti ale acestui regulator de cretere sunt:


-determin iniierea procesului de maturare a fructelor, etilena fiind
folosit la nceput pentru coacerea fructelor la lmi, iar acum pentru
determinarea coacerii simultane a fructelor la mr i cire;
-accelereaz procesele de cdere a frunzelor i fructelor, fiind folosit
atunci cnd se urmrete recoltarea mecanizat a fructelor la cirei i mslini;
-induce formarea florilor la speciile familiei Bromeliaceae (ananas), o
proprietate folosit n horticultur;
-modific ritmul de cretere prin aciunea pe care o exercit asupra
polaritii transportului auxinelor;
-are aciune favorabil asupra tuberizrii.
Aceste proprieti au unele puncte comune cu auxinele (nflorirea
Bromeliaceaelor, corelaii de cretere) iar unele antagonice (cderea frunzelor i
fructelor, tuberizarea). Aciunea antagonic a etilenei pare a depinde de
interaciunea dintre cele dou substane ce pot controla sinteza, concentraia i
circulaia lor.
Aplicaiile practice ale etilenei, dificil de utilizat n starea sa gazoas, au
fcut progrese doar dup descoperirea acidului 2-cloro-etan fosforic. Acest
produs, aplicat prin pulverizare penetreaz esuturile, unde se elibereaz etilena.
Toate prile plantelor sunt capabile s sintetizeze etilena, ns cantitatea
cea mai mare se sintetizeaz n fructe, apoi ntr-o concentraie mai mic n flori
i organe rnite.

2.1.1.5 Inhibitori ai creterii

Multe substane au efecte inhibitoare asupra creterii plantelor, printre


substanele endogene enumerndu-se compuii fenolici i acidul abscisic.

173
A. Inhibitorii fenolici

Inhibitorii fenolici, ntr-un numr mare n plante, inhib metabolismul i


intervine n multe procese fie ca antagonici ai regulatorilor de cretere, fie ca
inhibitori ai reaciilor metabolice. Ei intervin n inducerea strii de laten a
mugurilor i seminelor, la nceput prin ncetinirea creterii acestora urmat de
stoparea total a acesteia. Nu se tie exact rolul i mecanismul lor n inducerea
strii de laten.
n culturile in vitro aceti compui sunt deseori sintetizai i eliberai n
mediul de cultur, unde se oxideaz cauznd brunificarea mediului ceea ce duce
deseori la moartea explantelor, de aceea n unele medii de cultur se utilizeaz
substane anti-oxidante sau adsorbani pentru a detoxifia mediul.
Exist cteva exemple referitoare la folosirea substanelor fenolice n
cultura in vitro, cum ar fi utilizarea florizinei pentru inducerea nrdcinrii la
altoii de mr.

B. Acidul abscisic

Acidul abscisic (fig.6) a fost identificat n 1965 i de atunci a fost


descoperit n toate plantele. Acest inhibitor pare s fie sintetizat de fiecare dat
cnd o plant este supus unor condiii stresante (lipsa apei, rnire, cldur
excesiv). Existena acidului abscisic n celule este una din cauzele crora
plantele supuse unor factori stresani i ncetinesc activitatea metabolic.
ncetinirea activitii plantelor este reversibil atunci cnd condiiile de stres
sunt trectoare i poate induce starea de laten sau chiar decesul plantei atunci
cnd condiiile nefavorabile sunt prelungite.

Fig.6 Acidul abscisic

Proprietile acidului abscisic sunt similare celor ale compuilor fenolici.


Astfel, cele mai importante proprieti ale acidului abscisic sunt:
-aciune favorabil asupra cderii frunzelor i fructelor;
-determin creterea permeabilitii celulelor fa de ionii de potasiu,
ceea ce poate influena nchiderea stomatelor;

174
-acioneaz asupra nfloririi. Aplicarea acidului abscisic la plantele de zi
scurt cultivate n condiii perfecte de periodism, poate inhiba complet nflorirea
acestora (Volubilis) sau inhiba parial (Chenopodium rubrum), sau chiar stimula
nflorirea (Plumbago). n cazul n care plantele de zi scurt sunt supuse unor
condiii de zi lung poate induce nflorirea unora dintre specii i inhibarea altora.
Aplicat asupra plantelor de zi lung, acidul abscisic poate inhiba nflorirea
atunci cnd plantele sunt supuse unor condiii normale de fotoperiodism
(spanac, Lolium temulentum). Aceste observaii pot conduce la supoziia c
nopile lungi favorizeaz sinteza acidului abscisic, dar aceast supoziie este
prea simpl pentru explicarea modului diferit de aciune a acidului abscisic.
Acidul abscisic este foarte puin folosit n culturile in vitro, i n funcie
de speciile folosite i de condiiile de cultur utilizate poate induce reacii foarte
diferite i greu de interpretat.

Concluzii

Regulatorii de cretere endogeni sunt prezeni n plante pe tot parcursul


vieii acestora, dar prezena acestora nu este constant. Concentraiile lor se
schimb n cursul diferitelor stagii fiziologice i sunt diferite pentru fiecare parte
a plantei, pentru aceeai etap fiziologic. Variaia continu n plante a
coninutului n regulatori de cretere determin problemele legate de alegerea
momentului de recoltare a explantului.
Tehnicile de cultur in vitro pot fi controlate de echilibrul fitohormonal,
dintre care cele mai importante sunt auxinele i citochininele.
Raportul citochininauxin influeneaz procesele fiziologice din
explante, determinnd evoluia acestora n diferite sensuri n funcie de
concentraia celor doi fitohormoni. Astfel, dup Skoog, comportamentul
fiziologic al explantelor va fi:
-dac raportul auxine citochinine este mare, se induce rizogeneza;
-dac raportul este subunitar se induce lstrirea, explantele tind spre o
funcionare caulogenic;
-dac raportul este apropiat de unitate, explantele au tendina s genereze
formaiuni calusare.
Aceast schem general este ntotdeauna valabil, chiar dac exist
variaii n funcie de tipul de explant i mai ales n funcie de specia luat n
cultur. Pe lng aceti fitoregulatori principali exist i ali regulatori de
cretere ce s-ar putea dovedi indispensabili, dar n cele mai multe cazuri acetia
au doar rol stimulator sau favorizant i rareori esenial.

175
2.2 ALEGEREA EXPLANTULUI

Celulele vegetale vii au capacitatea potenial de a intra n diviziune i


de a reproduce un individ ntreg similar plantei donor. Aceast capacitate
denumit totipotena celular, indic faptul c fiecare celul deine toate
informaiile necesare regenerrii unei plante ntregi, proprietate ce este tot mai
mult exploatat n culturile in vitro.
Chiar dac toate celulele au totipoten nu este uor, cel puin pentru
moment, s se foloseasc n practic aceast calitate, ns cu ct cercetrile
avanseaz, cu att numrul acestora va crete.
Este mai uor de ales un grup de celule, de exemplu un explant, capabil
s reacioneze n condiii artificiale de cultur unde s evolueze spre multiplicare
clonal mai mult sau mai puin semnificativ n funcie de rspunsul obinut.
Micropropagarea face posibil obinerea de plante identice din punct de vedere
genetic cu planta mam, ns uneori este i surs de variabilitate genetic atunci
cnd explantul este supus anumitor condiii.
nainte de a decide criteriile de selecie ale unui explant este necesar
cunoaterea evoluiei fiziologice ce va ajuta la nelegerea diferenelor dintre
comportamentul celulelor unui segment de plant atunci cnd este detaat de
planta mam.

2.2.1 Etapele fiziologice ale unei plante

n contextul reproducerii sexuate se poate preciza, ntr-o manier


simplist, c ciclul de via al unei plante se mparte n patru stadii principale.

A. Embriogeneza

Embriogeneza ncepe cu fecundarea unei oosfere de ctre un anterozoid.


Oul astfel format este protejat de ovul unde ncepe s se divid. Celulele se
organizeaz la nceput ntr-o mas sferic (faza globular a embrionului), apoi
se dezvolt forme simetrice reprezentnd cotiledoanele rudimentare (faza
cordiform a embrionului dicotiledonat) dup care se dezvolt structurile
cotiledonare, hipocotilul, gemula i radicula (stadiul de torpedou al
embrionului). De la acest stadiu ncepe diferenierea celular. Specializarea
celulelor este nc foarte puin datorat unei funcionri programate i mai mult
datorit unui program genetic ce se va pstra i n celulele mature ce n anumite
condiii se vor comporta similar unor celule gametice, dnd natere unor organe
sau embrioni, de aceast dat somatici.
n momentul de fa, nu se cunoate pe deplin mecanismul diferenierii
celulare. Se presupune c poziionarea celulelor n relaie cu celelalte celule, dar

176
i cu mediul de cultur, determin un schimb de semnale biochimice, ce
moduleaz funcionarea fiecrei celule.
n contextul ipotezei mai sus menionate, diferenierea celular intervine
ca urmare a dou cauze: pe de o parte, datorit ereditii genetice a celulei
(fiecare celul are acelai echipament informaional genetic), n care acioneaz
programul embriogenic, iar pe de alt parte, datorit poziionrii specifice a
celulei care va fi recunoscut de structurile membranare. Aceste structuri
filtreaz informaiile i permit sau mpiedic circulaia unuia sau altui semnal
capabil s modifice programul informaional spre un anumit tip de celul.
Sfritul acestei prime etape este marcat, n general, dup ce substanele
sunt depozitate n albumen sau cotiledoane, de deshidratarea seminei, ce induce
intrarea embrionului n starea de laten. Seminele pot fi apoi diseminate,
putndu-se pstra i rezista condiiilor nefavorabile din mediul nconjurtor.

B. Stadiul vegetativ

Cnd condiiile externe sunt favorabile i starea de laten este ntrerupt


seminele germineaz i din embrion ia natere o nou plant. De creterea
plantelor sunt responsabile dou tipuri de meristeme: meristemul caulinar ce
determin creterea prii aeriene a plantei i meristemul radicular, ce determin
creterea prii subterane a plantei.
Meristemul caulinar are o structur bine definit, fiind alctuit dintr-o
parte extern, epiderma de dou sau trei straturi numit tunica, i o parte intern
sau corpus. ntr-o seciune transversal se poate observa o parte apical unde
celulele au o activitate mitotic redus, nconjurat de un inel de celule aflate n
diviziune activ, celule responsabile de creterea tulpinii. Diviziunea ncepe de
la inelul iniial: zona epidermal difereniaz n frunze rudimentare spre exterior,
iar spre interior n parenchim cortical i vase conductoare. Centrul este umplut
de meristemul medular. Meristemul caulinar are o funcionare ritmic
programat genetic cu o precizie aflat, n primul rnd, n aranjamentul filotaxic
al frunzelor (distribuie corespunztoare unei simetrii particulare fiecrei specii)
i, n al doilea rnd, n forma frunzelor. Se remarc aici c florile ce permit
identificarea i clasificarea plantelor se bazeaz aproape exclusiv pe caracterele
morfologice. Ipoteza prezentat mai sus privitoare la diferenierea celulelor n
interiorul embrionului poate fi luat n considerare similar celei privitoare la
meristeme.
La nceput, plantula este hrnit din rezervele nutritive aflate n
endospermul seminei, primele frunzulie, deseori conturate n interiorul
embrionului, sunt diferite de frunzele adulte, fiind cunoscute sub denumirea de
frunze juvenile. Planta crete i devine capabil s se hrneasc singur,
rdcinile transport spre frunze srurile minerale i compuii organici odat cu
regulatorii de cretere. n schimb, rdcinile primesc de la frunze substane
177
nutritive bogate n glucozide, vitamine i de asemenea n regulatori de cretere.
Aceste schimburi stau la baza construirii scheletului unei plante, stabilind
corelaii de cretere ntre sistemul aerian i cel subteran al plantei.

Fig.7 Meristem apical

Corelaiile, specie specifice, vor favoriza dezvoltarea unuia sau a altui


mugure caulinar, ceea ce va conduce la dezvoltarea formei specifice fiecrei
plante (arbore, tufi, tulpini ntortochiate sau mprtiate, etc). Aceast
arhitectur poate fi modificat prin curarea de uscturi sau ramuri
nefolositoare, prin conducerea ramurilor sau prin aplicarea regulatorilor de
cretere. n contrast frunzele i menin forma.

Fig.8 Meristem radicular

178
Aceast diferen indic faptul c principalele corelaii implic, n
general, informaii despre ntietatea mugurilor, care e controlat mai degrab
de fenomene de cretere relative dect de motenirea genetic.
Stadiul vegetativ dureaz, n funcie de specie, de la cteva sptmni la
cteva luni pe an, un an pentru plantele bienale sau mai muli ani pentru cele
perene. n ultimul caz, sistemul vegetativ va fi construit pe parcursul mai multor
sezoane, perioadele de cretere alternnd cu cele de repaus. Aceast succesiune,
care reflect adaptarea plantei la climatul mediului nconjurtor, este
determinat de stimulrile sau inhibrile reliefate ca rspuns la variaiile
condiiilor de mediu (temperatur, lumin, secet, umiditate, etc). Plantele ce
intr n perioada de laten i sisteaz creterea, substanele glucizidice
nefolosite sunt pstrate n rezerve, iar frunzele speciilor lemnoase cad, sau
prile aeriene ale plantelor ierboase se usuc. Atunci cnd revin condiiile
favorabile (latena mugurilor este indus de obicei de temperaturile sczute)
rencep creterile, formarea frunzelor i a prilor aeriene.

C. Stadiul reproductiv

Stadiul reproductiv este marcat de modificrile de ritm n funcionarea


meristemului caulinar. Inelul iniial nceteaz progresiv s mai funcioneze i se
observ c celulele centrului latent intr n diviziune activ iniiind formarea
florii sau a inflorescenei. Diferenierile ncep la margini unde se formeaz
staminele i prile fertile ale plantei: staminele i pistilul. Florile
angiospermelor sunt considerate lstari modificai constituite dintr-un ax central
i anexele sale sterile (periantul) sau fertile (staminele i pistilul).
Aceste nou program este la fel de precis ca i precedentul i se presupune
c mecanismele de difereniere sunt similare. Instalarea strii generative este
progresiv i la nceput poate fi reversibil, n unele condiii este posibil s se
revin la starea vegetativ.
Modificrile modului de aciune pot fi controlate fie de plant i n
aceste condiii variaiile climatice nu au nici un efect, fie de variaiile climatice
(temperatur, lumin, umiditate), caz n care planta percepe aceste variaii i
drept rspuns emite stimuli ce vor direciona meristemul spre stadiul
reproductiv. La unele specii, existena un timp ndelungat a condiiilor
nefavorabile de mediu poate duce la mpiedicarea nfloririi. Floarea constituie
ultimul stadiu n viaa unui meristem, asigurnd prin fertilizare, continuitatea
speciei. La unele specii perene ierboase unele meristeme terminale nu pot
induce formarea florilor. Aceast caracteristic permite plantei s
supravieuiasc mai muli ani (Saintpaulia, cerenel-Geum urbanum, cpun,
etc). Dac aceste meristeme sunt induse artificial s nfloreasc, plantele
nfloresc i mor comportndu-se asemeni unei plante anuale.

179
Cercetrile asupra naturii stimulilor ce acioneaz asupra meristemelor
florale nu sunt concludente, tiindu-se doar c intervin unii fitohormoni dar i
alte substane. Se pot cita cteva modele de culturi in vitro, n care, variind
componentele mediului de cultur i proporia fitoregulatorilor de cretere s-au
putut obine meristeme caulinare, radiculare sau chiar reproductive.

D. Stadiul de senescen

Stadiul de senescen urmeaz stadiului reproductiv la plantele anuale


deoarece meristemele sunt la sfritul vieii lor, fructificarea epuiznd rezervele,
rdcinile nu mai hrnesc planta n mod normal, schimburile de substane
nutritive se reduce i plantele se pregtesc de iernare. La speciile perene, aceast
etap ncepe prin ncetinirea funciilor rdcinilor odat cu debilitarea ntregii
plante, ce devine mult mai sensibil la toate tipurile de atac. Nu este imposibil
ca regulatorii cu rol inhibitor s intervin cel puin la nceputul acestui stagiu
fiziologic (acidul abscisic i etilena, alturi de alii).
Aceast scurt prezentare a proceselor fiziologice ce au loc de-a lungul
vieii unei plante ne permite nelegerea importanei interaciunilor ce regleaz
morfogeneza plantelor. Astfel, interaciunile pe distan scurt, predominant
genetice, au loc la nivelul embrionilor i al meristemelor vegetative i
regenerative. Alt tip de interaciuni sunt interaciunile dintre organe ce permit
plantelor s recunoasc mediul nconjurtor i variaiile ce intervin la nivelul
acestuia. Planta va putea s se adapteze noilor condiii datorit schimbului de
semnale sub forma fitohormonilor sintetizai n anumite locusuri, circulnd n
direcia unui punct int ce rspunde la acel stimul. n cursul deplasrii lor
fitohormonii sunt controlai de sistemele enzimatice existente n plante. Aceste
interaciuni sunt de aa natur nct de-a lungul unui ciclu de via al unei
plante, echilibrul endogen dintre regulatorii de cretere evolueaz continuu i
reflect la un moment dat, nu doar starea prezent a mediului nconjurtor al
celulei, ci i ultimele evenimente petrecute cu acea celul. Datorit acestui fapt,
la recoltarea unui explant trebuie s se in seama de valoarea acestui echilibru,
ce depinde de stadiul fiziologic i de vrsta plantei donor, dar i de organul de
pe care se prelev, precum i de mrimea i natura fragmentului excizat.

2.2.2 Selecia explantelor n funcie de stadiul fiziologic i vrsta


plantei mam

n funcie de stadiul fiziologic i vrsta plantei donor explantele pot


reaciona diferit la condiiile culturii in vitro. n general, plantele tinere sunt
sursa cea mai potrivit de explante, potenialul de adaptabilitate al explantelor la
condiiile artificiale de via diminundu-se cu vrsta plantei mam.

180
n cursul embriogenezei, embrionii pot fi excizai din ovul i inoculai pe
mediul de cultur dac se afl n stadiul globular, putnd reproduce un individ
normal i complet. Aceast tehnic prezint un interes sczut atunci cnd se are
n vedere micropropagarea (potenialul genetic al embrionilor este rareori
cunoscut cu excepia cazului strict de autogamie). Pe de alt parte, aceast
tehnic permite studierea cerinelor speciale necesare unui embrion izolat. n
unele cazuri, de ncruciare interspecific sau intergeneric, cnd embrionii pot
fi avortai sau mor imediat n ovul, aceast tehnic permite creterea i
dezvoltarea normal a acestor embrioni.
esuturile embrionare sunt uor regenerative, dar la unele specii doar din
cotiledoane s-au obinut rezultate notabile, ceea ce a permis specificarea
cerinelor nutritive pentru cultura esuturilor speciilor studiate. Acesta poate fi
primul mod de abordare a culturilor in vitro iniiate din explante btrne. n
unele cazuri aceasta este singura cale cunoscut.
Dup germinarea n stadiul juvenil, esutul prelevat prezint un rspuns
favorabil in vitro i este sursa multor succese n domeniu. Odat cu naintarea n
vrst a plantei donor, potenialul de cultur in vitro a explantelor prelevate de la
acesta se diminueaz. Acest fenomen este specific mai ales plantelor perene, i
n mod deosebit la arbori. La aceste specii, calitatea tehnic a lemnului nu este
msurabil, cu excepia arborilor aduli. n acest stadiu, totui, pentru multe
specii, iniierea culturii doar din butai nu mai este posibil, deoarece n stadiul
tnr acetia au o capacitate rizogenic ridicat.
Exist dou tehnici ce permit obinerea de puiei la speciile pomicole i
arboricole:
-una ar fi utilizarea lstarilor tineri de la baza speciilor pomicole i
arboricole. n acest caz lstarii par a avea caracteristici juvenile i nrdcineaz
mai repede (de exemplu la nuc i eucalipt). La aceste specii esuturile de origine
ale noilor lstari sunt genetic apropiate de stadiul juvenil, probabil datorit
faptului c se afl n apropierea rdcinilor;
-a doua tehnic este aplicat pentru multiplicarea speciilor pomicole i
arboricole tropicale i a coniferelor. Aceast tehnic permite rejuvenilizarea i
obinerea de altoi. Un altoi prelevat dintr-un arbore sau pom este altoit pe un
portaltoi crescut din smn. Altoiul crete i este apoi nlturat fiind ulterior
altoit pe alt portaltoi. Dup mai multe altoiri altoiul ncepe s prezinte
caracterele juvenile, ceea ce-l face apoi apt pentru propagare prin butire.
La culturile in vitro, s-au observat fenomene similare la meristeme.
Prima frunzuli ce se formeaz are caractere juvenile (prima frunzuli a
meristemului la vi de vie are caracteristici similare celei dezvoltate din
smn, de asemenea, i la orhidee meristemele dezvolt, n cultura in vitro,
protocorm identic cu cel obinut din smn). Rejuvenilizarea observat este
deseori obinut din prima subcultur, ns uneori sunt necesare mai multe
subculturi pentru a obine aceste efect, n funcie de specie.
181
ntoarcerea la stadiul juvenil poate fi datorat supresiei de informaii
citoplasmatice sau datorit diminurii considerabile a acestora determinnd
astfel posibilitatea regenerrii de noi celule. Mecanismele exacte ce determin
aceste fenomen nu sunt nc pe deplin cunoscute. Se pare c citochininele sunt
implicate, cel puin parial, n acest proces, dar ele nu acioneaz singure.
Cultivarea organelor reproductive in vitro, se poate realiza cu succes
atunci cnd plantele donor sunt n stadiul reproductiv. Se pare c schimbrile ce
apar n ritmul de funcionare al meristemelor este favorabil i determin n
esuturi un echilibru optim culturii in vitro.
Se pot obine culturi din esuturi prelevate de la plante aflate n stadiul de
senescen, dar rezultatele sunt n general slabe sau incomplete.

2.2.3 Selecia explantelor n funcie de vrsta explantului

Problemele legate de vrsta explantului apar la speciile perene n care se


poate distinge un stadiu activ i unul lent, latent, ntre care reaciile fiziologice
sunt diferite. Astfel, primele experimente, ce vizau cultivarea de meristeme la
plantele lemnoase, au euat atunci cnd s-a ncercat iniierea unei culturi de
esuturi din meristeme prelevate de pe ramuri n vegetaie, dar au avut succes
atunci cnd s-a pornit de la meristeme prelevate din muguri dorminzi.
De-a lungul unui ciclu anual, echilibrul intern al plantelor se schimb.
Primvara organele cresc i analizele relev prezena regulatorilor de cretere de
tipul auxinelor, giberelinelor i citochininelor. Vara transportul fitohormonilor
prin vasele conductoare se diminueaz, iar toamna se sintetizeaz inhibitorii
creterii. De aceea, nu e surprinztor faptul c explantele, prelevate de la aceeai
plant n perioade variate ale vegetaiei, vor da rspunsuri diferite chiar dac vor
fi plasate pe acelai tip de mediu.
De aceste considerente trebuie s se in seama atunci cnd se are n
vedere micropropagarea speciilor lemnoase. Unele explante au tendina de a
nrdcina uor atunci cnd sunt prelevate n anumite faze de vegetaie, n
special dac sunt excizate n perioada de vegetaie, cnd concentraia de auxin
este maxim.
La speciile cunoscute deja ca recalcitrante la cultura in vitro, pentru
realizarea rejuvenilizrii se poate supune planta mam, pentru o perioad scurt,
unui tratament cu temperaturi sczute, unui regim de lumin particular sau unui
tratament cu fitohormoni pentru modificarea echilibrului lor intern n vederea
stimulrii rizogenezei.

182
2.2.4 Selecia explantelor n funcie de amplasarea plantei donor

Dup determinarea stadiului i perioadei optime explantele pot fi


prelevate. Dup tipul de organizare a fragmentului ce urmeaz a fi cultivat in
vitro se pot lua n considerare dou cazuri:
1.Explantele ce au o structur rudimentar sau organizat, cum e cazul
mugurilor, apexurilor caulinare, meristemelor i apexurilor florale, sunt cele mai
utilizate pentru iniierea unei culturi de esuturi, deoarece acestea sunt receptive
i ridic cele mai puine probleme, genernd cu uurin, n condiiile unui
mediu de cultur adecvat, structuri organizate (de exemplu, organe). Dac
mediul de cultur nu este potrivit poate tulbura funciile explantului i conduce
la dediferenierea celulelor, genernd calus.
Utilizarea acestui tip de explante este similar unei microbutiri i este
tehnica cel mai des folosit atunci cnd se urmrete micropropagarea pe scar
larg a unei specii.
Interesant de amintit este faptul c explantele posed un fel de memorie
a tipului de cretere ce l-au prezentat in vivo, acest fenomen fiind n special
ntlnit la speciile lemnoase. La mai multe plante la care corelaiile de cretere
sunt puternice, explantele provenite din ramuri laterale au generat plante cu
rdcini, dar de tipul lianelor, sub forma unor plante culcate la pmnt i nu
erecte. Unele cercetri au evideniat faptul c aceast memorie aparine celui
mai apropiat internod de lng meristem.
2.Explantele constituite din diferite tipuri de esuturi, cum ar fi
fragmente de tulpin, frunze, flori i fructe, crora, inoculate pe mediu de
cultur, li se induce o reversie complet cu scopul de a restaura capacitatea
celulelor de a se divide i de a-i ctiga din nou capacitatea organogenic.
Pentru aceste explante, n funcie de specie, s-a dovedit c toate prile
plantei sunt capabile s urmeze procesul dediferenierii conducnd spre o nou
organizare structural. Dar, n acest caz, diferenele ntre specii sunt uriae.
Unele specii, cum ar fi violetele de Parma, sunt capabile s regenereze din toate
prile plantei (peiol, limb, rdcini, petale, stamine, polen, ovule), alte specii
sunt mai recalcitrante, cum ar fi Actinidia sinensis, la care rezultate notabile au
fost obinute doar din fragmente de tulpin. Unele specii sunt total recalcitrante,
nereuindu-se iniierea culturii de esuturi din explantele amintite, iar la unele
conifere s-a reuit obinerea de propaguli doar din cotiledoane.
n general, cele mai bune rezultate au fost obinute, la cele mai multe
specii, din fragmente de limb foliar i tulpini tinere.

2.2.5 Selecia explantelor n funcie de mrimea i natura acestora

Mrimea explantului ce urmeaz a fi cultivat prezint cea mai mare


importan. Cu ct explantul este mai mare cu att echilibrul endogenic al
183
acestuia este mai determinant i mediul de cultur va avea o influen limitat.
n cazul explantelor de dimensiuni mici direcionarea acestuia n sensul dorit se
face mai uor, deoarece explantul este receptiv la substanele din mediul de
cultur, i anume la regulatorii de cretere existeni.
Explantele organizate cuprind n general un nod, un apex sau un mugure
(solzii protectori sunt nlturai), fiind o unitate suficient de complet pentru
care mediul va favoriza creterea, sau n cazul diferenierii axilare, va bloca
creterea apical. Pentru meristemele ce trebuie s aib dimensiuni foarte mici,
exist o mrime minim ce conine domul meristematic cu dou primordii
foliare. Sub aceast mrime supravieuirea explantului este foarte dificil i
pierderile sunt mari, peste aceast dimensiune, rspunsul la cultura in vitro este
mult mai bun , ns n detrimentul eliminrii virusurilor.
Dimensiunile explantelor variaz ntre 5 i 10 mm, ceea ce corespunde
unei manipulri uoare a materialului vegetal, sub aspectul excizrii sau
prelevrii, fasonrii i inoculrii acestora. De exemplu, prin cultivarea pe acelai
mediu de cultur, a mai multe fragmente de peiol de Saintpaulia, de 1,5; 3; 5 i
7 mm, s-a observat c doar fragmentele de peste 3 mm au generat plantule
normale. Fragmentele de 1,5 mm au generat dou tipuri de rezultate: unele
explante s-au vetejit, iar altele au format doar rdcini. Fr ndoial, n
ultimul caz, auxinele prezente n mediu au jucat cel mai important rol, pe cnd
n cazul fragmentelor de dimensiuni mai mari au intrat n joc i fitohormonii
endogeni.
Se pot fasona explante din diferite tipuri de esuturi: epidermal, cortical,
parenchim medular, dar i rspunsurile vor varia. Cel mai regenerativ tip de
esut este cel epidermal. esuturile corticale i cambiale prezint de asemenea
rezultate bune, dar rmn deseori n stadiul de calus. Parenchimul medular este
esutul cel mai puin regenerant, aceste esuturi cer o armonizare perfect ntre
regulatorii de cretere, un exemplu fiind dat de Skoog, care a folosit mduv de
tutun pentru a determina rolul echilibrului dintre auxine i citochinine.
Din esuturi epidermale de cteva straturi grosime a fost posibil
orientarea regenerrii spre stadiul caulogenic (lstari), rizogenic (rdcini),
calusogenic sau reproductiv. Acest experiment confirm ipoteza unei activiti
crescute a fitohormonilor asupra explantelor de dimensiuni reduse.
Cel mai mic explant este constituit dintr-o singur celul, cum e cazul
protoplatilor izolai mecanic sau enzimatic. Protoplatii sunt capabili de a se
divide i a reproduce plante, dar nun sunt capabili de inducerea meristemelor
florale.

2.3 RSPUNSUL EXPLANTELOR N CULTUR

Prima problem ce trebuie rezolvat, atunci cnd se iniiaz o cultur in


vitro este meninerea viabilitii (pe lng problema asepsiei) explantului.
184
Deseori se poate observa, dup fasonarea explantului, o brunificare a
celulelor,mai ales a celor ce vin n contact direct cu mediul de cultur, fenomen
datorat oxidrii substanelor fenolice sintetizate n mediu, oxidare ce are efect
toxic asupra celulelor vegetale. Mai mult, celulele moarte pot diminua sau anula
schimburile dintre explant i mediul de cultur. Nu toate speciile prezint
fenomenul de brunificare a explantelor, deoarece la aceste specii problema este
parial rezolvat prin imersia explantelor ntr-o soluie antioxidant (soluie de
acid ascorbic cu acid citric n proporie de 0,5 % respectiv 0,05%), imediat dup
fasonarea acestuia sau prin adiia n mediul de cultur a unor substane
adsorbante sau detoxificante, cum ar fi crbunele activ (1 pn la 4 g/l) sau
polivinilpirolidon (5 pn la 10g/l).
Odat rezolvat aceast problem este necesar orientarea explantului, n
funcie de natura sa, n direcia dorit de operator.

2.3.1 Explante cu structur rudimentar

Explantele din aceast categorie pot fi cultivate prin dou metode.


Prima metod const n inducerea creterii apicale prin adiia n mediul
de cultur a fitohormonilor din clasa auxinelor i/sau a giberelinelor, foarte rar
se pot aduga i citochinine, ntotdeauna ntr-o doz foarte mic.
Dup iniierea pe acest tip de mediu se observ apariia unor formaiuni
calusare la baza explantelor. Este de dorit ca aceste explante s rmn de
dimensiuni mici, deoarece dac acest calus crete n dimensiune, ceea ce deseori
se ntmpl, indic existena unui dezechilibru ntre substanele minerale sau
fitohormonii din mediul de cultur. Dup formarea calusului, ce are rol protector
(asemeni calusului format la o ran) se formeaz prima frunzuli, apoi prima
rozet de frunze i mai trziu are loc elongarea tulpinii (axului principal). Aceste
etape morfogenice pot avea loc pe acelai tip de mediu la unele specii
ornamentale (crizanteme, garoafe) sau pe dou medii succesive, la speciile
lemnoase. Primul mediu va iniia creterea, putnd fi utilizat ulterior i pentru
propagarea fragmentelor cu un nod (microbutire). Al doilea mediu, mbogit
cu auxine (cel mai frecvent, acidul indolil acetic), servete ca mediu de
nrdcinare (Actinidia, mr, numeroase specii lemnoase).
A doua metod const n blocarea creterii apexului caulinar favoriznd
regenerarea i dezvoltarea lstarilor laterali (axilari), caz n care mediul de
cultur este adiionat cu citochinin (de la 1 la 10mg/l). Lstarii regenerai pot fi
izolai i crescui pe mediu pentru cretere, fr hormoni sau cu acid giberelic n
concentraie mic. n unele cazuri este nevoie de al treilea mediu de cultur
pentru nrdcinarea lstarilor, mediu adiionat n general cu auxine.

185
Utilizarea acestui tip de explante este important deoarece asigur
posibilitatea efecturii unui numr foarte mare de subculturi i, din punct de
vedere genetic, un minim de variabilitate.

2.3.2 Explante constituite din diferite tipuri de esut

Aceste explante sunt compuse din diferite celule asociate n esuturi fr


o organizare structural, putnd proveni din orice parte a sistemului vegetativ
(tulpin, frunze, rdcini) sau generativ (ax floral, sepale, petale, stamine, polen,
ovul, fruct).
Celulele ce rspund la cultura in vitro trebuie s treac prin procesul de
dedifereniere, adic sa se ntoarc la stadiul de celule nedifereniate. Acest tip
de reversie este mai uor de obinut la celulele vegetale i mai greu la cele
animale.
Observaiile asupra acestui tip de celule au evideniat cteva modificri
ce intervin n procesul dediferenierii: se reduce volumul vacuolar, dispar
moleculele specializate, nucleul se mrete, citoplasma devine mai dens. Dup
realizarea acestor modificri celulele ncep s se divid, stadiu denumit
histogenez, uor de realizat prin adiia n mediul de cultur a auxinelor. n al
doilea stadiu, numit organogenez, citoplasma celular devine i mai dens, cu
vacuole mici i nucleu voluminos. Celulele pstreaz capacitatea de a se divide,
dar celulele fiice vor fi capabile s se organizeze ntr-o mas meristematic ce se
va dezvolta ntr-un nou individ.
Observnd un explant n cultur se observ formarea, mai nti, a unei
formaiuni calusare cu rol protector. Celulele aflate n imediata apropiere a
mediului sunt primele ce ncep s se divid i s se dediferenieze.
Dac celulele ce vin n contact cu mediul brunific, nu se mai formeaz
calus i deci tot explantul moare. Celulele ce rspund la cultura in vitro au o
poziie precis, de exemplu la Begonia rex, celulele generatoare sunt cele
subepidermale situate la baza periorilor glandulari. n general celulele int,
adic celulele ce rspund uor culturii pe mediu artificial, sunt cele epidermale,
n special cele provenite din tunic, dar pot avea i alte origini. Aceste celule se
vor organiza ntr-un meristem, care va dezvolta ulterior o plantul ntreag cu
tulpini i rdcini, cum este cazul la Begonia i Saintpaulia.
La alte specii, cum ar fi Pelargonium, se observ n primul stadiu
formarea de calus (calusogeneza), unde celulele regenerante se divid activ, i
doar n al doilea stadiu, ce poate avea loc pe acelai mediu de cultur sau pe alt
mediu, se dezvolt meristemul ce va da natere noii plantule. Cnd se formeaz
meristemul prezint, n funcie de specie, acelai mod de a se dezvolta ca i
explantele organizate, doar c se cere un mediu mai complex pentru a asigura
elementele nutritive necesare dezvoltrii complete pn la stadiul de plantul.

186
Al doilea proces de organizare, mai puin frecvent, este acela n cursul
cruia celulele se vor comporta ca un ou fertilizat, urmnd etapele
embriogenezei. Vom vorbi astfel de embrioni sau embriogenez somatic. Acest
fenomen, descris pentru prima dat la celule de morcov, a fost descoperit la mai
multe specii, att anuale ct i perene.
Ca o trstur general, inducerea embriogenezei depinde n cea mai
mare msur de compoziia mediului de cultur, dar i de genotipul de la care se
prelev celulele generatoare. n multe cazuri embriogeneza somatic, este
precedat de formarea de calus, n acest caz izolarea celulelor nu mai este un
factor decisiv (Fig 9).
n cursul dezvoltrii se observ cum celulele se divid i embrionii ajung
n stadiul globular, apoi apare simetrie ntre forme i embrionul evolueaz spre
stadiul cordiform i apoi ntr-un embrion capabil s genereze o plantul (Fig
10).
Pentru celulele capabile s genereze embrioni somatici sunt suficiente
dou medii de cultur. Primul asigur formarea embrionilor, putnd servi i ca
mediu de micropropagare, iar al doilea va induce germinarea embrionilor.
Uneori sunt necesare mai multe subcultivri pe medii fr hormoni
pentru a induce germinarea embrionilor somatici i creterea plantulelor, n
timpul acestor subcultivri are loc diluia fitohormonilor la nivel celular
permind astfel dezvoltarea normal a celulelor.

Fig. 9 Embrioni somatici de morcov regenerai din calus

Utilizarea explantelor difereniate este foarte avantajoas deoarece sursa


de explante este nelimitat i rata de multiplicare poate atinge valori
considerabile. n funcie de rspuns, aceste explante prezint unele dezavantaje
la nivel genetic.
n primul rnd, celulele ce dau natere noilor plantule sunt somatice i
exist probabilitatea ca celule mutante s genereze embrioni din care s ia
natere noi plante.
187
a b c

Fig.10 Embrioni somatici de citrice: a) n stadiul globular, b) n stadiul


cordiform, c) genernd o plantul

n al doilea rnd, cea mai mare rat de inducere a embriogenezei


somatice are loc din calus, caz n care, datorit ritmului intens de diviziune
celular numeroase celule pot prezenta modificri la nivel genetic (modificri
cromozomale de tipul poliploidiei sau aneuploidiei, sau modificri
citoplasmatice). Aceast variabilitate poate fi suficient de mare i n unele cazuri
a fost chiar folosit pentru inducerea de mutani, prin stimularea formrii
calusului pe medii adecvate fitohormonal i chiar prin subculturi succesive ale
calusului pentru creterea probabilitii mutaiilor. Dup fragmentarea
calusurilor i inocularea lor pe medii pentru regenerare, s-a observat c printre
plantulele neoformate unele prezentau modificri morfologice evidente mai ales
citoplasmatice. n consecin, de fiecare dat cnd propagarea unei specii
necesit trecerea prin stadiul de calus se impune verificarea calitii genetice a
plantelor obinute.
Ca o concluzie a celor spuse mai sus, cercetrile asupra culturilor ce au
pornit de la explante difereniate au permis nelegerea modului de aciune al
fitoregulatorilor de cretere, a cror echilibru n mediul de cultur este
determinant pentru orientarea celulelor s funcioneze ntr-un ritm ales de
operator, innd cont de echilibrul endogenic. Nu se tie nici n prezent care este
modalitatea de a determina exact concentraia i balana hormonal atunci cnd
se apeleaz la fitoregulatori exogeni, dar pe de alt parte, acetia din urm
permit cercettorilor manipularea materialului biologic n sensul dorit.
Aceste cercetri, ce sunt nc incomplete, sunt baza de la care s-a pornit n
realizarea multor aplicaii practice, unele dintre ele fiind acum parte din procesul
de micropropagare ce a nceput s fie tot mai mult folosit.

188
CAPITOLUL IV

4.1 CERINELE NUTRITIVE ALE ESUTURILOR


VEGETALE CULTIVATE N CONDIII ASEPTICE

4.1.1 Mediul de cultur

Explantele vegetale pentru a putea tri, dup desprinderea de planta


donator, au nevoie de condiii speciale de cultur, s fie protejate de agenii
patogeni (asepsie total) i s aib ca surs de hran o soluie nutritiv
complex, format din ap, sruri minerale, substane organice i fitohormoni.
Pentru meninerea explantelor la suprafa i pentru ca acestea s nu fie
asfixiate, mediul de cultur se solidific cu un agent de solidificare. Soluia
nutritiv complex lichid sau solid se numete mediu de cultur sau substrat
de cultur. Acest mediu de cultur trebuie sa fie steril i cu o compoziie
complex deoarece explantul nu are capacitate de a se hrni autotrof, el triete
heterotrof pe baza substanelor existente n mediu. n funcie de scopul urmrit,
evoluia explantului poate fi dirijat prin modificarea compoziiei mediului,
obinndu-se calus sau regenerarea de noi plante prin stimularea organogenezei.
Compoziia mediului de cultur este specific pentru fiecare specie, soi
i faz de dezvoltare, cerinele fiind diferite i n funcie de explantul folosit,
momentul de prelevare i zona din care s-a prelevat, chiar n cadrul aceluiai soi.
n prezent se cunosc i se utilizeaz o serie de medii de cultur ce poart numele
celor care le-au creat: White, Murashige-Skoog, Nitsch, Gamborg, Heller
(Tabelul 4.1).
Compoziia mediului s-a stabilit att prin tatonri repetate cu diferite
substane, ct i prin studii ale sevei brute i elaborate la diferite specii, studii
privind absorbia i desorbia, schimbul ionic care exist ntre plant i mediul
nconjurtor. n prezent se cunosc destul de bine modificrile pe care le sufer
plantele cnd elementele chimice sunt n exces sau n deficit. Trebuie evitate pe
ct posibil aceste stri de stres pentru plante att la cultura n cmp, ct mai ales
la culturile in vitro.

4.1.1.1 Compoziia chimic

A. Compuii anorganici i rolul lor

Apa
Apa reprezint componentul esenial al vieii, al materiei vii. Este
utilizat n tot fluxul tehnologic de producere a plantelor in vitro, de la
splarea materialului vegetal i a vaselor de cultur, pn la utilizarea ei ca

189
solvent pentru celelalte componente i elemente de diluie pn la concentraia
dorit. Pierderea apei din esuturi provoac perturbri metabolice direct
proporionale cu cantitatea de ap pierdut. Stresul hidric este suportat de plante
dac este de scurt durat i dac nu se atinge nivelul de vetejire. n aceast
ultim faz plantele sunt capabile de rehidratarea esuturilor puse n condiii
favorabile de umiditate, dac deficitul de ap se menine plantele mor.
La culturile in vitro exist momente cnd explantele pot s-i piard
turgescena prin pierderea apei, momente n care trebuie acordat atenia
cuvenit, pentru asigurarea succesului culturii.
Sterilizarea materialului vegetal este o etap critic din acest punct de
vedere, deoarece soluiile utilizate sunt concentrate pentru distrugerea agenilor
patogeni. Trebuie corelate foarte bine timpul de sterilizare i concentraia
soluiilor utilizate n funcie de starea de vegetaie a materialului vegetal, pentru
evitarea pierderii apei prin exosmoz. Prelevarea explantelor trebuie fcut
repede, altfel datorit dimensiunilor mici pierd repede apa prin transpiraie, prin
rnile care sunt mari comparativ cu mrimea lui. Manipulrile sub hot trebuie
fcute destul de repede deoarece curentul de aer deshidrateaz relativ uor
explantele care stau descoperite.
Pe timpul creterii explantelor n camera de cretere, vasele trebuie s fie
nchise pentru a evita pierderea apei prin transpiraie, ce ar determina
concentrarea mediului n elemente nutritive, ar provoca crparea mediului i ca
atare slaba cretere a culturilor. Pentru respectarea strict a concentraiilor
soluiilor stoc sau a mediului, apa trebuie distilat, deci eliberat de ionii
minerali pe care i conine. La splarea materialului vegetal dup sterilizare se
folosete ap steril, sterilizare ce se face n autoclav odat cu sterilizarea
mediului sau separat.

Srurile anorganice
Substanele anorganice sunt introduse n mediu sub form de sruri. Cele
mai utilizate sunt: azotaii, fosfaii, clorurile i sulfaii de Ca, K, Mg, Mn, Al, Fe,
Mo, Zn, Cu, Na, etc. Absorbia elementelor din mediu se face sub form de ioni,
utilizarea uneia sau alteia din sruri este n funcie de cerinele fiecrei specii i
de faza de vegetaie. n funcie de cantitatea de elemente ce se folosete n
mediu, elementele se mpart n:
-macroelemente - utilizate n concentraii de ordinul milimolilor C, O,
H, N, K, Ca, P, S, Mg;
-microelemente sau oligoelemente, utilizate n concentraii de micromoli.

190
Tabelul 4.1
Principalele medii de cultur utilizate n culturi
in vitro (dup Street, 1977)
Constitueni Heller White Nitsch Murashige Gamborg
Skoog
Macroelemente mg/l
KCl 750 65 - - -
NaNO3 600 - - - -
MgSO4 x 7H2O 250 720 185 370 250
NaH2PO4 x H2O 125 16,5 - - 150
CaCl2 x 2H2O 75 - - 440 150
CaCl2 - - 166 - -
KNO3 - 80 950 1900 2500
Na2SO4 - 200 - - -
(NH4)2SO4 - - - - 134
NH4NO3 - - 720 1650 -
KH2PO4 - - 68 170 -
Ca(NO3)2 x - 300 - - -
4H2O
Microelemente
FeSO4 x 7H2O - - 27,8 27,8 27,8
Na2EDTA x - - 37,3 37,3 -
2H2O
MnSO4 x H2O - - - - 10,0
MnSO4 x 4H2O 0,01 7,0 25 22,3 -
KI 0,01 0,75 - 0,83 0,75
NiCl2 x 6H2O 0,03 - - - -
CoCl2 x 6H2O - - - 0,025 0,025
ZnSO4 x 7H2O 1,0 3,0 10,0 8,6 2,0
CuSO4 x 5H2O 0,03 - 0,025 0,025 0,025
H3BO3 1,0 1,5 10,0 6,2 3,0
FeCl3 x 6H2O 1,0 - - - -
Na2MoO4 x - - 0,25 0,25 0,25
2H2O
AlCl3 0,03 - - - -
Fe(SO4)3 - 2,5 - - -
Constitueni
organici
Inozitol - - 100 100 100
Acid Nicotinic - 0,05 5 0,5 1,0
Piridoxin HCl - 0,01 0,5 0,5 1,0
Tiamin HCl - 0,01 0,5 0,1 10
Glicin - 3,0 2 2,0 -
Acid folic - - 0,5 - -
Biotin - - 0,05 - -
Zaharoz - 2% 2% 3% 2%
Diferenele ce exist ntre diferite reete de mediu, constau n raportul
dintre diferii ioni. Rolul fiziologic al fiecrui element depinde de forma chimic
n care se gsete n mediu, de concentraia lui, de natura explantului. n prezent
se cunosc principalele reete utilizate pentru speciile cultivate care se preteaz la
cultura in vitro. Acolo unde nu s-a experimentat nc, trebuie fcute tatonri

191
pentru gsirea celei mai adecvate compoziii pentru mediu. Carenele pentru
elementele minerale in vitro se manifest dup 2-3 subculturi, deci trziu, cnd
nu se mai poate face mare lucru pentru salvarea culturii. De exemplu N are rol
important n embriogeneza somatic, n funcie de forma lui nitric sau
amoniacal influeneaz vitrificarea. Carena de N duce la acumulri de
antociani n vacuolele celulelor, iar dac aceasta persist provoac dereglri n
metabolismul glucidelor i proteinelor.
Potasiul influeneaz creterea esuturilor, carena determin o dezvoltare
slab. mpreun cu calciul, regleaz permeabilitatea membranelor celulare, a
fluiditii protoplasmei, intervine n schimbul ionic la nivelul membranelor.
Magneziul ntr n compoziia clorofilei, carena provocnd dereglri
grave n structura frunzei.
Microelementele exercit roluri metabolice i fiziologice diferite de cele
ale macroelementelor. Intr n compoziia multor combinaii organo-metalice
complexe, cu valoare biologic ridicat de tipul enzimelor, care controleaz
ntreg procesul metabolic al plantelor.

B. Compuii organici

Sursele de carbon
Viaa in vitro este aproape n exclusivitate heterotrof, n special n
primele faze ale existenei, pn la formarea unui numr suficient de mare de
frunze pe fiecare plantul sau lstar. Datorit acestei nutriii heterotrofe mediul
de cultur trebuie s conin un compus care s asigure carbonul organic necesar
n metabolism. Principalele surse de carbon sunt glucidele. Acestea sunt
substanele cele mai utilizate i mai accesibile plantelor ca surs energetic.
Dozele pe litru sunt de cca. 2-3% n funcie de faza de vegetaie i tipul de
explant folosit. Dintre glucide zaharoza rspunde cel mai bine cerinelor
culturilor in vitro.

Aminoacizii
Sunt utilizai ca surse de azot amoniacal disponibil imediat pentru celule
i esuturi, fa de azotul organic care este mai greu accesibil. Se adaug n
mediu sub form de compui simpli sau compleci. Principalii aminoacizi
utilizai sunt: glicina, asparagina, acidul aspargic, cisteina, alanina, glutamina
etc.

Vitaminele
Plantele spre deosebire de animale sunt capabile de sinteza vitaminelor,
dar nu i esuturile cultivate in vitro. S-a demonstrat experimental ca in vitro
esuturile i plantulele rspund favorabil la adaosul exogen de vitamine n
cantiti mici. Majoritatea vitaminelor sunt termolabile, sunt distruse la
192
temperaturi ridicate, uneori cu ocazia autoclavrii, dar s-a observat c i
substanele reziduale au rol favorabil asupra culturii.
Principalele vitamine utilizate n mediile de cultur sunt:
-tiamina (vitamina B1, aneurina), se folosete n concentraii cuprinse
ntre 0,1-10 mg/l; stimuleaz creterea vegetativ, sporirea biomasei produs in
vitro;
-piridoxina (vitamina B6), 0,1-1 mg/l; precursor a unor coenzime,
cataliznd reacii de baza n metabolismul aminoacizilor;
-riboflavina (vitamina B2), 0,1-1 mg/l, rezistent la temperaturi ridicate
(280oC); inhibitor al creterii rdcinilor, rol n metabolismul celular;
-acidul pantotenic (vitamina B5), este mai puin utilizat ca atare;
pantotenatul de calciu se folosete n concentraii cuprinse ntre 0,5-2,5 mg/l;
-cobalamina (vitamina B12), este mai rar folosit, stimuleaz sinteza
nucleoproteidelor;
-acidul nicotinic (vitamina B3, niacina), 0,5-5 mg/l, rezistent la
temperaturi ridicate (234-237oC); rol n metabolismul intermediar;
-biotina (vitamina H), 0,1 mg/l; stimuleaz creterea esuturilor
meristematice i proliferarea celulelor;
-acidul folic, 0,01 mg/l; efect stimulator asupra creterii esuturilor la
lumin; la ntuneric are efect toxic;
-acidul para-aminobenzoic, 1 mg/l; stimuleaz biosinteza acidului
pantotenic i a biotinei;
-acidul ascorbic (vitamina C), 1-100 mg/l, prin autoclavare se distruge n
bun parte; este activator general al metabolismului celular;
-vitamina E (tocoferolul), mrete sensibilitatea celulelor la auxine;
-inozitolul (mio-inozitolul, mezo-inozitolul, hexahidroxi-ciclohexan),
100-1000 mg/l; este considerat att vitamin ct i glucid; stimuleaz diviziunea
celular.

Fitoregulatorii
Fitohormonii, fitoregulatorii sau substanele regulatoare de cretere sunt
substane organice utilizate n cantiti mici cu rol de a stimula, inhiba sau
controla procesele fiziologice de cretere i dezvoltare. Exist fitohormoni
endogeni, sintetizai de plante i fitohormoni exogeni sau de sintez.
esuturile in vitro nu sunt capabile s-i sintetizeze ntreaga cantitate de
care au nevoie, fiind necesar adugarea lor n mediul de cultur pentru a
asigura o bun cretere a explantelor. Cei mai folosii fitohormoni n culturile in
vitro sunt auxinele, citochininele i giberelinele.
Auxinele sunt mult utilizate pentru reglarea proceselor de morfogenez
alturi de citochinine. Auxina natural descoperit este AIA (acidul indolil-
acetic) care se produce i prin sintez pe cale industrial. Cele mai folosite
auxine de sintez sunt:
193
-IBA (acidul 3 indolil butiric); ANA (acidul naftilacetic); 2,4D (acidul
2,4 diclorfenoxiacetic); ANOA (acidul beta naftoxiacetic).
Aciunea auxinelor este foarte complex datorit intreaciunii pe care o
are cu alte substane regulatoare i interveniei asupra unor procese fiziologice.
Rolul auxinelor poate fi redat astfel:
-stimuleaz diviziunea celular;
- influeneaz alungirea celulelor prin mrirea plasticitii peretelui
celular;
-modific permeabilitatea membranelor plasmatice pentru ap i ioni;
-rol important n dominana apical;
-inhib formarea embrionilor somatici n suspensiile celulare;
Auxinele sunt sintetizate n partea aerian a plantelor n muguri, frunze,
fructele tinere i bobocii florilor de unde circul n toat planta. Cel mai mult se
folosesc ANA i 2,4D care sunt mai stabile, nu se oxideaz n prezena luminii.
2,4D este mult utilizat pentru inducerea i creterea calusului i pentru
rizogenez. La calus asigur friabilitate mare uurnd separarea calusului pentru
cultura de suspensii celulare i n embriogeneza somatic.
Citochininele sunt substane ce se gsesc n cantiti relativ ridicate n
fructe, semine, etc., iar ca structur au la baz adenina i un nucleu purinic.
Prima citochinin izolat a fost chinetina, experimentat cu succes la
culturile in vitro. La scurt timp s-a sintetizat benzil aminopurina (BAP). n
prezent se folosesc pentru culturile de esuturi patru citochinine dintre care dou
naturale (2 IP i zeatin) i doua de sintez (chinetina i BAP).
Efectul fiziologic al citochininelor const n:
-acioneaz asupra diviziunii celulare alturi de auxine;
-stimuleaz formarea mugurilor adventivi i din calus;
-stimuleaz formarea lstarilor laterali;
-stimuleaz sinteza proteic;
-inhib formarea rdcinilor.
Biosinteza citochininelor endogene are loc n rdcini i n embrioni, iar
migrarea este dependent de cea a glucidelor. Sunt substane termostabile
suportnd uor autoclavarea.
Giberelinele sunt substane care acioneaz la nivelul ntregii plante i
nu asupra celulei, cu rol n stimularea creterii, nfloririi i fructificrii. Cea mai
utilizat giberelin este acidul giberelic (GA3) fiind i cea mai activ.
Aciunea fiziologic este urmtoarea:
-produce alungirea internodiilor tulpinilor;
-stimuleaz creterea frunzelor i rdcinilor.
Giberelinele sunt sintetizate n frunzele i fructele tinere, n mugurii
activi, n embrioni i vrful rdcinilor, circulnd n plante prin vasele liberiene.
Pentru meristeme giberelina este indispensabil n vederea alungirii lor. La alte

194
tipuri de explante nu se recomand giberelina deoarece inhib dediferenierea
celular.
Etilena a fost recunoscut ca fitoregulator mult mai trziu i este
utilizat puin n culturile in vitro. Rolul fiziologic poate fi prezentat sintetic
astfel:
-exercit un control asupra creterii permeabilitii membranelor;
-induce senescena esuturilor;
-are rol n transportul auxinei;
-se produce n cantiti mai mari n esuturile i celulele rnite;
-inhib extensia celular.
Acidul abscisic este implicat n procesele de laten a mugurilor i
seminelor. Poate fi utilizat pentru:
-inducerea latenei embrionilor somatici;
-inducerea latenei seminelor artificiale n vederea pstrrii lor o
perioad mai lung;
-inhibarea creterii esuturilor i organelor pe timpul stocrii;
-are rol antagonist cu auxinele i giberelinele.
Agenii de solidificare
Substratul nutritiv utilizat la culturile in vitro este de obicei semisolid sau
solid, utilizarea mediului lichid fiind limitat doar la unele experiene i la
cultura de suspensii celulare. Cel mai utilizat agent de solidificare este agarul
obinut din alge i are urmtoarele caracteristici:
-formeaz cu apa un gel care se topete la 100oC i se solidific la 45 oC,
rmnnd solid n condiii normale de cultur;
-nu este toxic pentru plante i nu este asimilat de plante;
-nu conine elemente minerale care s afecteze echilibrul dintre ioni n
mediul de cultur, fa de reeta de mediu folosit;
-nu reacioneaz cu constituenii mediului.
Cantitatea de agar utilizat la litru de mediu difer n funcie de
consistena dorit, ntre 0,5-1%.
Cu rol similar n solidificarea mediului de cultur se mai folosesc:
-agaroza are un nalt grad de purificare i se folosete mai ales pentru
cultura protoplatilor i n prepararea gelului pentru electroforez;
-acidul alginic se folosete pentru cultura protoplatilor, suspensiilor
celulare i pentru ncapsularea embrionilor somatici n vederea obinerii
seminelor artificiale;
-phytagelul (Gelrite) produce un gel limpede. Se folosete n concentraii
de 1,5-2,0 % i se gelifica la 27-31oC. Se utilizeaz mai ales la speciile care
necesit un pH mai acid, asigurnd solidificarea mediului i n aceste condiii.

195
C. Alte substane utilizate

Adenina are rol regulator n mediul de cultur, favorizeaz formarea


mugurilor adventivi, stimuleaz creterea i alungirea apexurilor ct i rata de
multiplicare. Se pare c are o aciune sinergic cu a citochininelor putnd fi un
precursor al acestora. De regul se folosete sub form de sulfat de adenin, n
doz de 40-80 mg/l.
Compuii fenolici stimuleaz creterea calusului, favorizeaz
nrdcinarea, creterea lstarilor i a ratei de multiplicare. Are o aciune
sinergic cu a auxinelor, n special cu AIA. Dup unii autori are rol n
prevenirea degradrii auxinelor. Dintre compuii fenolici cel mai utilizat este
fluoroglucinolul i procaina.
Floroglucinolul este mult utilizat n multiplicarea meristematic a
pomilor i arborilor, se gsete n seva brut, mai ales la mr.
Procaina are rol n multiplicarea i respiraia celulelor, stimuleaz
creterea biomasei explantelor, a coninutului n pigmeni, stimuleaz germinaia
seminelor i creterea plantelor. Dozele utilizate sunt cuprinse ntre 0,1-10 mg/l.
Substanele antioxidante se utilizeaz pentru prevenirea brunificrilor
explantelor i a mediului, n special, la speciile ce conin substane fenolice n
cantiti mari, evitnd oxidarea lor. Se folosesc fie ca soluii n care se ine
materialul vegetal naintea prelevrii explantelor, fie se adaug n mediul de
cultur. Dintre substanele antioxidante, cele mai folosite sunt: acidul ascorbic
(50-100 mg/l), acidul citric (150 mg/l), cisteina HCl (100 mg/l).
Polivinilpirolidona (PVP) este un poliamid utilizat pentru absorbia i
blocarea fenolilor, mpiedicnd astfel oxidarea lor cu brunificarea i moartea
explantului. Se folosete n concentraii de 250-1000 mg/l.
Crbunele activ este un crbune vegetal, bine mrunit ce se adaug
mediului, cu scopul de a absorbi i bloca substanele toxice din mediu. Poate
avea aciune i asupra fitohormonilor (auxine), blocndu-le parial efectul, are
aciune de inhibare a formrii calusului, stimuleaz embriogeneza, favorizeaz
formarea rdcinilor.
Uneori se mai pot folosi i alte substane cu rol de a mbuntii, de a
completa compoziia mediului, cum sunt: laptele de cocos, sucul de tomate,
sucuri de fructe. Prezena acestora n mediul de cultur este facultativ.

4.1.1.2 Caracteristicile fizice ale unui mediu de cultur

Metabolismul unui esut vegetal poate fi modificat integral n funcie de


consistena mediului de cultur. Rdcini de cicoare cultivate pe hrtie de filtru
mbibat cu mediu lichid pot produce doar lstari vegetativi, n timp ce cultivate
pe mediu solidificat cu agar pot genera muguri florali. Alegerea tipului de mediu
de cultur, lichid sau solid, prezint o importan deosebit.
196
La mediul solid, concentraia de agar-agar, precum i calitatea acestuia
au un efect distinct. Masa calusului de cartof se dubleaz atunci cnd
concentraia de agar-agar din mediu crete de la 0,8 la 1%, iar microbutaii de
anghinare prezint fenomenul de hiperhidricitate pe mediu cu o concentraie de
agar-agar de 0,6% , ce dispare atunci cnd concentraia agarului crete la 1,1%.
Concentraia optim de agar variaz n funcie de tipul de organ cultivat,
de calitatea agarului folosit i de pH-ul mediului. n general, consistena
mediului de cultur crete odat cu pH-ul acestuia.
Trecerea unor explante pe mediu lichid poate constitui o faz necesar n
procesul de micropropagare, ca n inducerii embriogenezei somatice la morcov
din celule de calus n mediu lichid. n cazul garoafelor, meristemele izolate sunt
cultivate n mediu lichid cu agitare pentru a induce lstrirea axilar multipl.
Viteza de agitare a mediilor lichide este n general sczut atunci cnd se cultiv
organe (cca 1rpm) i ridicat n cazul culturii de suspensii celulare (cca 100
-150rpm).
Dac n alte tipuri de culturi nu se acord o mare importan schimbului
de gaze, la culturile in vitro schimbul de gaze cu exteriorul prezint o mare
importan pentru inoculi. Schimburile de gaze se realizeaz prin difuzie,
diferenele de concentraie ntre gazele din interiorul containerelor i cele din
mediul ambiant exterior, precum i variaiile de temperatur influennd aceste
schimburi. Organogeneza indirect la morcov este stimulat de reducerea
concentraiei de oxigen, pe cnd nrdcinarea lstarilor a fost stimulat de
creterea acesteia. Mai multe experimente au dovedit c difuzia liber a
oxigenului n esuturi a afectat semnificativ capacitatea organogenic a acestora.
Alte studii au demonstrat c intervenirea unei modificri n schimburile de gaze
dintre esuturile cultivate in vitro i mediu a indus apariia unor modificri n
morfologia plantulelor. De aceea, este demn de luat n considerare i tipul de vas
de cultur folosit pentru culturile de celule i esuturi, precum i de capacele
utilizate: capace cu burete, parafilm, folie de aluminiu, etc.
Un alt factor important pentru mediul de cultur i implicit pentru
plntuele regenerate in vitro este pH-ul. n practic, ajustarea pH-ului se face la
5,5-5,8 n timpul preparrii mediului de cultur. Totui, n dese cazuri pH-ul
mediului scade n timpul autoclavrii sau chiar n timpul culturii ceea ce poate
avea efecte nedorite asupra materialului vegetal. Se tiu nc foarte puine
despre efectele acestor variaii ale pH-ului i despre cauzele determinante.

4.2 FACTORII FIZICI CARE INFLUENEAZ


CULTURILE DE ESUTURI

Principalii factori ai mediului nconjurtor sunt lumina i temperatura.


Umiditatea relativ este irelevant atta timp ct n interiorul vaselor de cultur
aceasta atinge valori de aproximativ 100%.
197
4.2.1 Lumina

Cerinele fa de lumin pot fi divizate n mai muli parametri:


-intensitatea luminii pe unitatea de suprafa exprimat n W/m2
(unitatea lux nu ar mai trebui folosit ca unitate de msur a intensitii
luminoase, deoarece depinde de fiziologia ochiului uman, ceea ce este total
neadecvat necesitilor unei plante);
-durata iluminrii, exprimat n ore/zi;
-calitatea spectral a luminii primite de plante.
Pentru culturile de esuturi, fotosinteza nu este o activitate necesar atta
timp ct energia este furnizat sub forma carbohidrailor. Totui, unele cercetri
au evideniat c fotosinteza nu este eliminat n totalitate din culturile de esuturi
vegetale, dar este considerabil redus probabil datorit prezenei zaharurilor n
mediu.
Numeroase studii au dovedit c lumina este indispensabil reglrii
multor procese morfogenetice.

A.Intensitatea luminoas

O intensitate luminoas foarte mare poate duce la pierderi importante n


culturile in vitro. Utilizarea unei intensiti luminoase de 50 W/m2 (aproximativ
10000luci) n camerele de cretere, intensitate folosit n mod obinuit n
fitotron, duce la ncetinirea creterii i scderea capacitii de regenerare la
multe specii vegetale. Intensitatea luminoas optim culturilor in vitro variaz
ntre 5 i 25 W/m2 (1000-5000 luci) cele mai folosite valori fiind de 10 pn la
15 W/m2. deseori, n faza a treia a micropropagrii, se urmrete creterea
treptat a intensitii luminoase n vederea aclimatizrii plantulelor la condiiile
de lumin din fitotron.

B.Durata iluminrii

Nu exist multe date cu privire la influena fotoperiodismului asupra


morfogenezei esuturilor in vitro, aa cum exist dovezi clare ale influenei
acestui parametru asupra plantelor donor, in vivo. Se pare c n medie, calitatea
luminii (intensitatea durata luminii) este important dezvoltrii armonioase a
plantulelor n condiii aseptice de cultur.
n practic, marea majoritate a camerelor de cretere au o durat a
iluminrii de 16-18 ore/zi.
Cerinele fa de durata de iluminare, din camerele de cretere sunt
diferite n funcie de natura explantului, scopul urmrit dar i de specia la care se
experimenteaz. Astfel, la gru, n cazul culturii de antere, n vederea obinerii
198
de produi androgenetici, s-a dovedit c, anterele cultivate n primele ase
sptmni la ntuneric, vor forma un procent mai ridicat de produi
androgenetici. Dup aceast perioad, culturile vor fi incubate n condiii
normale de fotoperioad cu 16 ore lumin i 8 ore ntuneric.

C.Calitatea luminii

Numeroase studii au evideniat c spectrul luminos influeneaz


procesele fiziologice i morfologice ale celulelor cultivate in vitro. Lumina
albastr (cca 467nm) sau violet (cca 419nm) induce formarea de lstari din
calus de tutun, iar cea roie (cca 660nm) induce rizogeneza. Aceste rezultatele
asemntoare altora indic faptul c procesele morfogenetice par a fi reglate de
pigmenii fotoreceptori, cum ar fitocromul. n mod normal, lumina de zi
conine radiaii n principal albastre, iar lumina numit lumin alb conine
radiaii roii, dar nu se cunosc cu exactitate curbele spectrale de emisie ale
acestora. n general, tuburile fluorescente albe aflate n comer sunt adecvate
culturilor de esuturi.
n ultimul timp au aprut n comer dou tipuri de tuburi fluorescente:
tuburi cu lumin cald i tuburi cu lumin rece, astfel c, o combinaie ntre
cele dou tipuri de tuburi s-a dovedit a fi foarte potrivit pentru culturile
incubate n camerele de cretere.

4.2.2 Temperatura

n general, temperatura folosit n camerele de cretere este de 22-24oC.


Aceste temperaturi sunt la pragul critic, deoarece n interiorul vaselor de cultur
temperatura poate fi cu 2 pn la 4oC mai mare dect n camera de cretere.
Practic, temperatura din camera de cretere trebuie s fie cu 2 oC mai mic dect
cea necesar speciei cultivate in vitro. Speciile provenite din climatul temperat
sunt obinuite la temperaturi mai sczute dect speciile tropicale, de aceea ar fi
de dorit ca pentru speciile din zonele temperate s se seteze temperatura n
camera de cretere la 201 oC , iar pentru cele tropicale la 251 oC.
De asemenea, temperatura n camera de cretere va fi diferit i n
funcie de scopul urmrit n cultura in vitro. Astfel, la cartof, s-a observat c o
temperatur de cca 19oC, influeneaz pozitiv formarea minituberculilor, n timp
ce la gru, cultura de antere necesit o temperatur de cca 27oC.
De aceea, se recomand ca fiecare unitate de cercetare s beneficieze de
cel puin dou camere de cretere, n care temperatura s poat fi reglat n
funcie de necesitile explantelor i tipurilor de culturi existente.
n natur, plantele sunt supuse unor fluctuaii de temperatur, iar reproducerea
lor n camera de cretere ar fi fr ndoial avantajoas. Totui, prea puine
studii au fost fcute n aceste sens pentru a putea trage o concluzie relevant.
199
CAPITOLUL VI

6.1 INIIEREA UNEI CULTURI IN VITRO

6.1.1 Aspecte generale privind condiiile aseptice de cultur

Prima condiie n realizarea cu succes a unei culturi de celule sau esuturi


in vitro este asepsia. Mediile de cultur sunt foarte favorabile dezvoltrii
bacteriilor i ciupercilor, creterea crora este mult mai rapid dect cea a
celulelor vegetale i duce la inhibarea proceselor fiziologice ale esuturilor
cultivate. De aceea un laborator de culturi de esuturi este organizat i pstrat
ntr-o asepsie strict asemeni unei sli de operaie.
Principalele cauze ale apariiei infeciilor n culturile in vitro sunt:
1) Aerul care conine o cantitate mare de organisme patogene de tipul
bacteriilor sau fungilor.
2) esuturile vegetale sunt acoperite la suprafa cu fungi i/sau bacterii.
Cele mai infectate organe sunt cele ce se dezvolt n pmnt (rdcini, bulbi,
tuberculi). Bacteriile i ciupercile se dezvolt i n interiorul esuturilor, n
vasele conductoare libero-lemnoase sau n spaiile intercelulare, caz n care este
imposibil sterilizarea esuturilor, iar folosirea antibioticelor nu este
recomandat.
3) Corpul uman, care poart numeroase microorganisme pe piele sau n
respiraie.
Metodele de eliminare ale acestor surse de infecie sunt:
a) Produsele chimice, care distrug microorganismele:
-hipoclorit de sodiu;
-hipoclorit de calciu;
-mercurobutol;
-clorid mercuric;
-produse bactericide i fungicide;
-etanol 70-80%.
b)Becuri de gaz pentru sterilizarea instrumentarului prin flambare.
c) Aerul cald: la 120oC timp de 20 minute (autoclav), cldur umed
pentru sterilizarea mediilor de cultur i a apei sau 180 oC timp de 2-3 ore,
cldur uscat (etuv) pentru sterilizarea sticlriei.
d) Razele ultraviolete, care distrug doar o parte din spori.
e) Sisteme de filtrare a aerului: se folosesc filtre speciale ce nu permit
trecerea particulelor mai mari de 0,22m. Filtrarea este realizat de un
ventilator-extractor ce asigur o ventilaie constant cu o vitez optim i are
avantajul de a menine steril aerul din incinta hotei cu flux laminar. n momentul

200
de fa toate laboratoarele de culturi aseptice sunt prevzute cu hote cu flux
laminar de aer steril.

6.1.2 Prepararea mediului de cultur

Datorit faptului c n prepararea unui mediu de cultur intervin mai


muli factori este necesar alctuirea unei liste de materiale nainte de a se trece
la prepararea lui. Pe parcursul preparrii se vor bifa, pe rnd, toate elementele
msurate i introduse, inndu-se seama cu strictee de volumul final al
mediului.
Se vor nota cu atenie toate detaliile legate de proveniena substanelor
chimice sau a soluiilor stoc, erorile, coreciile, proveniena agarului, calitatea
apei. n aparena sunt factori ce nu prezint o mare importan, dar n realitate
succesul unei culturi depinde ntr-o foarte mare msur de calitatea mediului i
implicit de factorii menionai mai sus.
Etapele preparrii unui mediu de cultur sunt:
1)Diluia srurilor minerale: macro- i microelemente, apoi ajustarea la
volumul final.
2)Msurarea pH-ului, corectarea cu KOH 10N; n general pH-ul este de
5,5-5,8.
3)Adiia zaharurilor (sucrozei) urmat de adiia agarului, care se adaug
n ploaie n timp ce mediul este amestecat tot timpul.
4)Sterilizarea mediului de cultur la 120oC ntre 20-30 minute, n funcie
de cantitatea de mediu din recipient.
5)Adugarea vitaminelor i hormonilor (sterilizai prin filtrare) n mediu
se face atunci cnd temperatura mediului ajunge la 40-50 oC.
6)Repartizarea mediului n vasele de cultur sterile se face imediat dup
adiia vitaminelor i fitohormonilor.

Observaii
Mediile de cultur pot fi preparate n vase Erlenmeyer, dac se prepar
cantiti mici (mai puin de un litru), iar agarul este sterilizat odat cu mediul
prin autoclavare n kukt. Pentru cantiti mai mari de un litru se folosesc vase
speciale, borcane cu capac termorezistent.
Dac mediul conine substane labile termic, substanele vor fi dizolvate
separat, apoi sterilizate prin filtrare i incorporate n mediul autoclavat n
prealabil. Acest procedeu se execut n hota cu flux laminar de aer steril.
Dac se folosesc vase de cultur din plastic achiziionate din comer
sterilizate, adiia mediului de cultur sterilizat se va face de asemenea n condiii
sterile, la gura becului de gaz unde temperatura este de aproximativ 40 oC, dup
ce gura vasului Erlenmeyer n care se afl mediul s-a trecut prin flacr pentru
flambare.
201
Ajustarea pH-ului se face de preferat cu pH metrul nainte de sterilizarea
mediului. A se evita hrtia de pH deoarece aceasta nu d rezultate precise i
importana stabilirii unui pH corect se reflect n succesul culturii in vitro.
Agarul i zaharoza nu schimb pH-ul mediului, de aceea ajustarea acestuia se
face nainte de adiia celor dou componente.
Pentru a se evita infectarea soluiilor stoc este recomandabil folosirea
unor recipiente auxiliare, n care se va goli o cantitate aproximativ egal cu cea
necesar preparrii mediului de cultur, din care se va lua cu ajutorul pipetei
cantitatea optim.

6.1.3 Izolarea i inocularea explantelor

Din punct de vedere teoretic, toate prile unei plante pot constitui
explante pentru iniierea unei culturi de esuturi, datorit totipotenei celulare,
proprietate a celulei vegetale de a regenera n mod normal un individ ntreg,
identic cu planta donor.
Din punct de vedere al asepsiei, pot fi distinse dou tehnici obligatorii:
-stabilirea unei culturi aseptice din esuturi prelevate de la o plant
ntreag cultivat n condiii nesterile (prima etap a micropropagrii vegetale);
-meninerea asepsiei unei culturi deja iniiate prin transplantarea
inoculilor n condiii aseptice pe alte medii de cultur (etapele a doua i a treia n
tehnica de micropropagare vegetativ).
Prima categorie prezint cele mai mari dificulti deoarece implic
efectuarea unei sterilizri corect a esuturilor ce urmeaz a fi introduse n
condiii aseptice de cultur.

A.Sterilizarea esuturilor
Sterilizarea materialului vegetal nainte de iniierea unei culturi in vitro
este dificil deoarece gradul de infectare al esuturilor este variabil i pentru
fiecare tip de manipulare trebuie utilizate diferite substane chimice, n diferite
concentraii cu durate diferite de timp pentru imersarea esuturilor. n general,
prile aeriene ale unei plante sunt mult mai puin infectate cu bacterii i fungi
dect cele subterane. Dificultatea sterilizrii const n necesitatea absolut de a
distruge toate microorganismele patogene folosind produse chimice, astfel nct
s nu se distrug i celulele vegetale (care sunt cel puin la fel de sensibile
precum bacteriile sau fungii). De aceea, este absolut necesar stabilirea unui
timp optim de imersare a esuturilor n soluiile sterilizante.
Drept exemplu, pentru micropropagarea Saintpauliei tehnicile de
sterilizare optime sunt:
-fasonarea peiolului n fragmente de aproximativ 1cm lungime;
-imersia fragmentelor de peiol n etanol 70% timp de 20 secunde;

202
-imersia n hipoclorit de calciu 4% timp de 12 minute, cu agitarea
continu a vasului n care se realizeaz imersia;
-efectuarea a trei cltiri succesive cu ap distilat steril pentru
ndeprtarea agentului de sterilizare.
Cel mai utilizat produs de sterilizare este hipocloritul de calciu Ca(OCl)2
deoarece nu penetreaz esutul vegetal. Este totui un produs puin stabil n
soluie apoas i trebuie preparat imediat nainte de utilizare cantitatea dorit de
hipoclorit este dizolvat n ap prin agitare continu timp de aproximativ 10
minute, dup care, soluia format se filtreaz, iar filtratul se utilizeaz imediat.
Concentraiile standard folosite sunt de 4% i 8%, iar timpul de imersie variaz
ntre 5 i 30 de minute.
Ali produi chimici ce pot fi folosii pentru sterilizarea materialului
vegetal sunt:
Hipocloritul de sodiu, NaOCl - acest produs este comercializat n pungi
de plastic cu titrul colorimetric de 48o. Se folosesc concentraii ntre 5% i 20%
v/v. Timpul necesar pentru realizarea unei sterilizri optime la o diluie de 5%
este de la 5 minute la 30 de minute. Acest produs penetreaz esuturile putnd
cauza leziuni la nivel celular ducnd la scderea capacitii regenerative a
esuturilor cultivate in vitro.
Biclorura mercuric (otrav puternic), HgCl2 este un sterilizant foarte
eficient, folosit n doze mici de ordinul 0,01% pn la 0,05%. Este dificil de
nlturat deoarece are aderen crescut la esuturi, necesitnd cltiri repetate,
fiind recomandate cinci-ase cltiri comparativ cu trei n alte cazuri.
Mercurobutol este de asemenea un sterilizant foarte bun i se poate
gsi n farmacii. Conine un detergent ce-i mrete puterea de penetrarea i
eficiena, dar este foarte dificil de nlturat necesitnd efectuarea a dou, trei
cltiri cu alcool etilic de 70%.
Trebuie subliniat faptul c sterilizarea materialului biologic vegetal se
realizeaz numai la suprafa i dac accidental esuturile sunt infectate n
interior nu este posibil sterilizarea lor.
n unele cazuri sterilizarea explantelor nu este necesar, cum ar cazul
meristemelor bine protejate de numeroase frunzulie rudimentare sau a anterelor
protejate n spic.

B.Pregtirea echipamentului necesar sterilizrii i lucrului la hota cu


flux laminar steril
nainte de realizarea sterilizrii materialului vegetal i nceperea
operaiilor de fasonare i inoculare pe mediu de cultur artificial a materialului
vegetal, activiti ce se realizeaz n condiii sterile, este necesar pregtirea
hotei cu flux laminar de aer steril, locul unde se vor realiza etapele precizate.

Sterilizarea hotei necesit parcurgerea mai multor etape:


203
- se terg, cu o bucat de vat nmuiat n alcool etilic de 70%, toate suprafeele
orizontale i verticale din interiorul hotei insistndu-se pe suprafaa de lucru;
- se pulverizeaz puin alcool pe filtrele de aer ale hotei;
- se pulverizeaz alcool n toate colurile i colioarele interiorului hotei;
- se pornete lampa UV, iar dup cinci minute se pornete i ventilaia.
n cazul hotelor cu flux de aer laminar (alctuit din lamele dispuse n
straturi paralele) steril este suficient, ca nainte de utilizare, s se tearg cu
alcool etilic 70% toate suprafeele interioare, n special suprafaa de lucru. La
acest tip de hot, filtrul de aer nu trebuie pulverizat cu alcool sau alte lichide
deoarece este foarte fragil.
Pregtirea instrumentarului se face nainte de nceperea lucrului:
- se flambeaz instrumentele de metal la flacra becului de gaz, dup nmuierea
n alcool 90%; este recomandabil folosirea concomitent a cte trei buci din
fiecare instrument;
- instrumentele se imerseaz n alcool etilic 70% n vase de sticl dac nu se
folosete flambarea i n alcool de 90-96% dac se dorete flambarea acestora;
- hrtia de filtru sau aluminiu folosit ca suport pentru fasonarea materialului
biologic se sterilizeaz prin autoclavare;
- vasele Petri sterilizate n prealabil n etuv la 180oC timp de 2-3ore se scot, din
pachetele de hrtie sau din cutiile de metal speciale n care au fost sterilizate,
doar n hota sterilizat;
- mediul de cultur sterilizat se va turna n vase de sticl sau plastic sterilizate n
prealabil doar la hot, cnd aceasta este pornit;
- se pregtesc vasele de cultur cu sau fr mediu;
- se pregtesc dou borcane cu ap distilat steril, pentru cltirea materialului
vegetal, sau a instrumentarului n cazul cnd acesta este introdus doar n alcool,
fr flambare.

C.Operaiunile ce se execut la hota cu flux de aer steril


Meninerea condiiilor aseptice se face urmnd cteva reguli stricte i
necesare:
- nainte de a ncepe lucrul la hot, operatorul trebuie s-i spele minile cu
spun (preferabil cu mercurobutol sau alt substan sterilizant), s-i suflece
mnecile halatului pn mai sus de coate, s-i frece palmele, ncheieturile
minilor i antebraele cu alcool 70% sau cu mercurobutol i s se clteasc cu
ap distilat steril;
- minile operatorului vor fi sterilizate cu alcool de 70%, de fiecare dat cnd
vin n contact cu materiale nesterile (pr, haine, etc);
- instrumentarul se schimb des, dup dou pn la maximum cinci explante, i
se sterilizeaz prin flambare sau imersie n alcool i cltire cu ap distilat
steril;

204
- explantele se fasoneaz cu ajutorul unui bisturiu chirurgical cu lama foarte
fin, mai ales cnd se dorete obinerea unor explante de dimensiuni mici, cum e
cazul meristemelor, sau extrase cu ajutorul pensetelor cu vrf subire, n cazul
anterelor, ovulelor, etc;
- explantele sunt inoculate pe mediu imediat pentru a se evita deshidratarea lor i
intrarea n contact cu germenii, viteza de lucru fiind un factor important n
succesul culturilor in vitro;
- orice explant ce a czut pe masa de lucru sau a fost atins de altceva n afar de
hrtia de lucru steril, va fi eliminat;
- dopurile de vat nu vor fi lsate niciodat pe masa de lucru, iar capacele pot fi
plasate cu gura n jos;
- gturile borcanelor, vaselor Erlenmeyer i sticlelor sunt sterilizate prin trecerea
prin flacra becului de gaz;
- odat cu terminarea lucrului, alcoolul rmas va fi pstrat n containere nchise,
pentru siguran.

6.1.4 Meninerea culturilor

n general, culturile sunt plasate pe rafturi iluminate cu tuburi neon


fluorescent alb cu o intensitate de 12W/m2 (aproximativ 2500 luci) la o
temperatur de 20-25o i un fotoperiodism de 16 ore lumin i 8 ore ntuneric.
Odat cu instalarea culturilor se va urmri apariia infeciilor, care se vd
n general dup cteva zile.

6.1.5 Infeciile i cauzele apariiei acestora

Apariia infeciilor n culturile in vitro are mai multe cauze. Dup


simptomele manifestate putem s ne dm seama dac infecia este cauzat de o
ciuperc sau de o bacterie.
Dac este generat de o ciuperc, se va observa dezvoltarea unui miceliu
cu o textur mat sau pufoas, de cele mai multe ori de culoare alb sau gri.
Penicillium genereaz un miceliu de culoare gri mat, pe cnd Rhizopus
nigricans, care se i multiplic foarte repede i care trebuie distrus prin
autoclavarea culturilor nainte de deschidere i splare, sau aruncare, formeaz
miceliu de culoare nchis cu aspectul unor fructificaii de culoare neagr.
Dac infeciile se datoreaz unei bacterii se va manifesta de forma unei
paste lptoase n interiorul mediului i pe suprafaa acestuia. Aceast past este
uneori colorat roz sau galben.
Se va observa dac infecia a pornit de la zona de contact dintre esut i
mediul de cultur, i dac e aa se poate concluziona c sursa de infecie este
nsui explantul. Dac infecia pornete din alt punct al mediului de cultur,
sursa poate fi aerul, sterilizarea ineficient a mediului sau din apa condensat pe
205
capacul recipientului de cultur. n unele cazuri, din fericire rare, sporii unor
bacterii pot rezista autoclavrii, de aceea este necesar cltirea sticlriei n
clorur lichid. Atunci cnd se observ dezvoltarea unui miceliu de
Penicillinium se constat o capacitate de lucru slab a operatorului. Manipularea
necorespunztoare a materialului vegetal i aplicarea ineficient a tehnicilor de
cultur in vitro, genernd infecii ale culturilor se poate datora: vorbitului n
timpul lucrului la hota cu flux de aer laminar steril, sterilizarea
necorespunztoare i insuficient a instrumentarului, transportul
microorganismelor de la explantele infectate la cele neinfectate.
Se poate ca, n cursul culturii, s nu se observe apariia unei infecii cu
bacterii, caz n care mediul de cultur folosit nu permite dezvoltarea acestora.
Totui, culturile pot fi infectate i cea mai sigur cale este subcultivarea lor pe
mediu adiionat cu 2g/l pepton (un component obligatoriu n mediile de
cretere ale bacteriilor). Prin aceast metod se testeaz culturile i de elimin
vasele de cultur infectate, obinnd culturi de esuturi libere de bacterii.

6.1.6 Probleme tehnice minore ce pot cauza pierderi n culturile in


vitro
Se poate ntmpla ca unele culturi s mearg foarte bine n anumite
condiii, iar alteori, n aceleai condiii s mearg prost sau deloc. Problema
poate fi dat de condiiile de cultur, care sunt rareori identice, condiiile
climaterice din camera de cretere se pot schimba, s-a schimbat tipul vasului de
cultur sau calitatea sticlei acestuia. Un singur detaliu minor n aparen, poate
schimba ntreaga evoluie a culturii, de aceea atenia i meticulozitatea sunt
caliti absolut necesare unui operator in vitro.
n continuare se prezint cteva exemple concludente:
- creterea volumului vasului de cultur poate ncetini schimbul de gaze cu
exteriorul ceea ce duce la ncetinirea creterii inoculilor;
- utilizarea parafilmului ncetinete considerabil schimbul de gaze i poate
modifica funcionarea esuturilor;
- unele capace cptuite conin cleiuri toxice ce pot, prin evaporare sau prin
dizolvare n apa condensat, s otrveasc esuturile; de aceea, este recomandat
ndeprtarea acestor cptueli nainte de folosirea capacelor;
- condensul apei n vasele de cultur apare atunci cnd temperatura din
exteriorul vasului este cu cteva grade mai mic dect cea din interior, cauza
putnd fi expunerea direct a culturilor la aerul rece suflat de aparatele de
climatizare.

206
6.1.7 Metode de iniiere a unor tipuri de culturi din diferite explante

6.1.7.1 Cultura de rdcini

Cultura de rdcini const n creterea pe medii aseptice a rdcinilor


detaate. Tehnicile de cultivare in vitro a rdcinilor au fost realizate nc n
etapa de pionierat a cercetrilor efectuate n aceast direcie. Astfel, White a
dovedit c rdcini detaate de la plantule de tomate pot fi cultivate in vitro timp
nelimitat, prin subculturi repetate.
n general, se utilizeaz rdcina primar, embrionar, prelevat de la
plantulele formate prin germinarea seminelor n condiii aseptice. Principala
problem care se ridic, n acest caz, este aceea a realizrii unei perfecte
sterilizri a seminelor. Smna sntoas, cu tegumentele ntregi, nelezate, are
esuturi embrionare neinfectate. Seminele pot fi dezinfectate folosind ageni
puternici de sterilizare ntruct prezena tegumentului protejeaz formaiunile
embrionare de toxicitatea soluiei de sterilizare. Astfel, un exemplu de realizare
a sterilizrii, izolrii i cultivrii in vitro poate fi cel al unei rdcini primare
prelevate de la o plantul de mazre. Aproximativ 20 semine de mazre, cu
tegumentul ntreg, se introduc ntr-un vas Erlenmayer, n aproximativ 250 ml
alcool etilic 70o; se agit seminele, iar dup cca 10 secunde se decanteaz
etanolul iar peste semine se adaug soluie de hipoclorit de calciu 10%, timp de
20 minute, toate operaiunile efectundu-se n camera steril. Dup cele 20
minute se decanteaz soluia de hipoclorit de calciu iar seminele se cltesc n
trei reprize de ap distilat steril. Dup cltire se ndeprteaz seminele
devenite translucide, ca urmare a infiltrrii apei sub tegument, iar seminele
ntregi se inoculeaz, tot n condiii sterile, n vase Petri, n care a fost repartizat
un mediu de cultur MS (Murashige-Skoog) simplu constituit din soluia stoc de
macroelemente i agar 6,5%. Seminele se incubeaz la ntuneric, n condiii
controlate, timp de 48 ore, dup care, cnd rdcinia plantulei atinge lungimea
de aproximativ 20 mm, n condiii aseptice, se detaeaz vrful rdciniei (cca
5-10 mm) i se inoculeaz tot n vase Petri, 1-2 explante/vas, pe un mediu de
cultur constituit din macroelemente i zaharoz, pH-ul fiind 5,8 (Reinert i
Yeoman, 1982).
Se poate constata c mediul de cultur recomandat este unul simplu lipsit
de microelemente, vitamine sau hormoni. Se pot utiliza i medii mai complexe,
clasice, iar ca surs de carbon organic poate fi folosit glucoza n loc de
zaharoz. Creterea rdcinilor in vitro are loc pe medii de cultur lichide
neagitate. Zilnic se poate urmri dezvoltarea radicelelor secundare, prin
aplicarea sub cutia Petri a unei hrtii milimetrice.
De obicei, dup 21 zile de cultur se constat o plafonare a creterii,
moment n care se recomand subcultivarea rdcinilor, prin excizarea apexului
i transferarea lui pe mediu proaspt. Subcultura se poate face i la interval de 7
207
zile. Dup aproximativ dou subculturi, este oportun introducerea n mediul de
cultur a tiaminei i a acidului nicotinic, n dozele normale, utilizate pentru alte
tipuri de explante.
Prin cultura de rdcini s-a putut cerceta efectul auxinelor asupra
celulelor radiculare. Street precizeaz c auxina stimuleaz att creterea n
lungime a fragmentelor de rdcini de tomate ct i diviziunea celulelor
meristemului apical. Utiliznd culturi de rdcini, pe diferite tipuri de medii, ca
i compoziie i consisten, s-a putut stabili efectul diferiilor fitohormoni de
cretere, al elementelor chimice sau al unor substane organice, n formarea
rdcinilor, n creterea lor, precum i urmrile carenrii celulelor lor n
anumite elemente. Prin extrapolarea acestor rezultate, s-a reuit mbogirea, an
de an, a cunotinelor privind funcionarea rdcinilor i rolul lor n
metabolismul general.
De asemenea, din cultura de rdcini se poate obine uor calus, mai ales
din cele principale sau din cele ngroate secundar. Procesele de organogenez,
la nivelul rdcinilor netransformate n calus, se rezum la ramificarea acestora
n radicele secundare. Geneza de mugurai i tulpinie are loc la nivelul esutului
calusal, provenit din rdcini, sau pe explante radiculare.

6.1.7.2 Cultura de meristeme

Meristemele sunt esuturi de tip formativ, cu celule tinere, ce-i menin,


n tot cursul vieii plantelor, capacitatea de a prolifera, respectiv proprietatea de
a se divide, formnd mereu noi celule. Meristemele sunt localizate n vrful
ramificaiilor organelor (tulpini sau rdcini), fiind meristeme apicale, de tip
primar, cu rol n creterea n lungimea organelor; meristeme primare gsim i n
straturile profunde ale rdcinilor i tulpinilor. La organele ce sufer procese de
modificare secundar morfo-anatomic, ngrori, ntlnim meristeme
secundare, respectiv cambiul i felogenul. De regul, prin termenul de cultur de
meristeme se nelege cultivarea in vitro a meristemelor apicale, caulinare.
Masivul de celule care alctuiete meristemul apical se apreciaz c
msoar maximum 500 (Margara, 1982) sau altfel spus, cca 0,1 mm diametru
i 0,25-0,30 mm lungime (Kartha, 1981). n cazul n care se depete aceast
dimensiune, vorbim despre o cultur de apex.
Celulele meristematice dein caracteristici structurale particulare, ce le
confer capacitatea de a se menine ntr-o continu stare de proliferare, cum ar
fi:
-au pereii celulari subiri, celulozici, nemodificai secundar;
-sunt bogate n citoplasm, au mitocondrii numeroase, nucleul este mare,
cu nucleoli bine reliefai;
-vacuolele sunt mici i nu dein metabolii.

208
n raport cu celulele parenchimatice sau cu cele prozenchimatice,
celulele meristematice sunt mici, strns unite ntre ele, fr spaii intercelulare.
Meristemele primare au celule de forma poligonal iar meristemele secundare
au form tabular. Celulele derivate din multiplicarea meristemelor secundare
au o dispoziie radial, respectiv toate celulele generate dintr-o celul
meristematic mam sunt dispuse liniar, perpendicular pe celula ce le-a dat
natere.
Celulele meristemului apical, caulinar, sunt uniforme din punct de
vedere anatomic, dar arbitrar, la angiosperme, straturile de celule componente
sunt submprite n tunica i corpusul.
La meristemul radicular pturile celulare prezint o structur diferit de
aceea descris la tulpin.
Forma, mrimea i conformaia meristemului apical, caulinar variaz
mult la diferitele specii dar, n mare, s-au delimitat trei tipuri principale
structurale: meristemul criptogamelor vasculare, meristemul la gimnosperme i
meristemul de angiosperme.
Meristemul caulinar terminal este localizat n vrful ramurilor i de
regul, este protejat n mugur. El poate fi apical, axilar sau adventiv.
Mugurele este constituit dintr-un ax, n apexul cruia se afl meristemul.
Prin diviziunea continu a meristemului rezult celule care, pe msur ce se
ndeprteaz de apex se difereniaz funcional. Celulele externe ale masivului
tisular (numit con de cretere sau vrf vegetativ) se pliaz, iar protuberanele
rezultate constituie primordiile. Cu timpul, primordiile se difereniaz n
primordii foliare sau florale. De regul, n primordiile florale se produce o
cretere a intensitii ratei de multiplicare celular, aceti muguri devin mai
bombai, mai voluminoi. Celulele din zona central se difereniaz n xilem,
floem i esut parenchimatic. Centrifug, dinspre centru spre periferia mugurelui,
se ntlnesc primordii transformate fie n frunzulie, din ce n ce mai mari, fie n
boboci, respectiv n componente florale. Mugurii i bobocii au capacitate
regenerativ ridicat, graie faptului c dein esuturi tinere, slab difereniate i
celule meristematice. Meristemele apicale posed o relativ autonomie, fapt nc
insuficient argumentat i dovedit experimental. n evoluia in vitro a explantelor
meristematice, un rol important l are stadiul de dezvoltare al primordiilor.
Primordiile florale recoltate n faze prea avansate de dezvoltare, cultivate in
vitro, se transform n floare. Adeseori, funcie de specie, la nivelul nveliurilor
florale se poate induce neogeneza de formaiuni meristematice adventive.
Cambiul i felogenul sunt meristeme prezente n organele ngroate
secundar sau n cele metamorfozate (rdcini tuberizate). De regul, cambiul
constituie o principal zon regenerativ.
esuturile inoculate pe medii aseptice, de regul, difereniate
morfofuncional, trebuie s se dediferenieze, fenomen ce se petrece n etape
succesive, pn la rentoarcerea lor la starea de meristem primar, respectiv
209
neoformarea de meristeme. Fenomenul de dedifereniere celular se produce i
spontan, de exemplu n cazul iniierii unor meristeme, sau al genezei de rdcini
secundare din celulele periciclului radicular.
Dediferenierea celulelor inoculate in vitro poate consta n formarea de
calus, dedifereniere primar, din care se poate ajunge la un stadiu de
dedifereniere secundar, cnd o parte din celulele calusului se transform n
meristeme, generatoare de rdcini sau tulpini.
Dediferenierea celulelor inoculate in vitro constituie o condiie a
formrii de promeristeme i de iniiere a organogenezei.
n cultura de meristeme, meristemul este prelevat mpreun cu dou
primordii foliare subiacente acestuia.
Ball (1946) a fost primul care a obinut plantule din meristeme de
Lupinus albus i Tropaeolum majus, prin cultivarea lor in vitro. Aceste
experimente au relevat potenialitatea organogenetic a diferitelor pri ale
apexului.
n prezent, o atenie deosebit se acord studiilor privind cunoaterea
reaciei meristemului cultivat in vitro, n raport cu condiia funcional a
meristemului in situ, precum i a rolului primordiilor. Este evident faptul c un
meristem izolat, cultivat pe medii aseptice, i poate manifesta totipotenialitatea
sa real; n condiiile inoculrii lui mpreun cu primordiile, ori in situ, aceast
capacitate este mascat de corelaiile existente ca urmare a prezenei alturi de
meristem i a celorlalte esuturi. Dezvoltarea in vitro a meristemului solitar, sau
a celui nsoit de primordii, este dependent de fitohormonii de cretere prezeni
n mediul de cultur. Se pare c primordiile, chiar n faza n care frunzele sunt
abia schiate, se pot transforma fie n frunze, fie n muguri floriferi. Experienele
de microchirurgie ale lui Wardlaw (1949), Steeves (1962), Haight i Koehnert
(1969), precum i ale altor autori, au permis stabilirea faptului c tinerele
mucroane foliare se afl ntr-o stare nedeterminat nc morfofuncional.
Problema transformrilor morfologice i structurale, n cadrul proceselor de
tranziie care au loc n trecerea strii vegetative a meristemului n stare floral,
precum i a celor legate de reversia meristemelor iniial florale, n meristeme
vegetative constituie punctul de plecare n multiplicarea vegetativ in vitro,
pornind de la explante constnd din boboci sau din nveliuri florale. La
conopid, n faza de preinflorescen, Margara (1982) se pot distinge trei
categorii de meristeme: vegetativ, de generare a inflorescenei i de formare a
florilor.
Definitivarea direciei de evoluie a meristemului apical, din vegetativ n
floral, depinde de o serie de factori exogeni fotoperioad, temperatur sau
endogeni specie, hormoni.
n condiiile cultivrii unor explante in vitro, celulele esuturilor
inoculate pe medii aseptice sufer un proces de dedifereniere i genereaz
meristeme. Din aceste meristeme, prin redifereniere, vor lua natere organe.
210
Organogeneza constituie momentul de baz n asigurarea multiplicrii
vegetative.
De multe ori la nivelul calusului se pot identifica formaiuni
meristematice, aflate ntr-un stadiu tnr, nedifereniat funcional n meristem
generator de rdcini, sau n meristem generator de tulpini, fiind numite
promeristeme. Tot legat de activitatea meristematic incipient, exist i un alt
termen, ntlnit n literatura de specialitate meristemoid (Torrey, 1966).
Aceast noiune se refer la formaiuni meristematice, abia schiate, cu direcie
de dezvoltare nedeterminat, aparent identice din punct de vedere morfologic.
Se tie c meristemul radicular al angiospermelor se deosebete
funcional de cel al tulpinilor nefiind interconvertibil, cu toate c axa caulinar i
cea radicular, n evoluia filogenetic, au o origine comun. Diferenierea
funcional a meristemului se face, probabil, n stadiul de promeristem; n cazul
meristemoizilor pot fi deja identificate trei tipuri de meristeme ce evolueaz n:
meristem proliferativ, meristem generator de rdcini i meristem de tip
caulogen. Dar nu se cunoate dac aceti meristemoizi sunt identici sau prezint
deja amprenta determinismului lor funcional, radicular i caulinar.
Meristemele radiculare, funcie de originea lor se mpart n mai multe
categorii:
-meristem apical situat n vrful rdcinilor;
-meristem lateral format pe rdcina principal;
-meristem adventiv provocat n a se forma la nivelul tulpinilor,
frunzelor sau al altor organe, care n mod natural nu sunt purttoare de rdcini.
Inducerea formrii acestor meristeme radiculare adventive constituie baza
multiplicrii vegetative prin butai, marcote sau organe de rezerv;
-meristeme neoformate la nivelul calusului, ca o varietate de meristem
adventiv.
Meristemele caulinare pot fi mprite astfel:
-meristeme apicale (terminale) derivate din muguraul embrionului;
-meristeme axilare aflate la axila frunzelor;
-meristeme adventive formate pe diverse organe;
-meristeme neoformate generate la nivelul calusurilor cultivate in vitro.
Formarea meristemelor i organogeneza sunt procese care se petrec
treptat, sub control genetic i hormonal. Factorii de mediu pot i ei stimula
inducerea i viteza de desfurare a proceselor de organogenez. Hormonii sau
regulatorii de cretere de sintez constituie factori cu rol hotrtor n
direcionarea proceselor de difereniere a meristemelor, n meristeme radiculare
sau caulinare. Auxinele intervin n reglarea formrii meristemelor radiculare iar
citochininele n neogeneza de mugurai.
Explantele meristematice caulinare sunt frecvent folosite n tehnicile de
multiplicare i de micropropagare a o serie de specii de interes economic.

211
Astfel, se poate concluziona faptul c, la plantele superioare exist o
diversitate de meristeme clasificate, dup localizarea lor n plant. Meristemele
mai pot fi clasificate i n alte dou categorii:
-meristeme histogene care produc obinuit numai esuturi;
-meristeme organogene care dau natere la esuturi ce formeaz
organe;
Spre deosebire de meristemele radiculare, care sunt foarte simple ca
structur i funciune, meristemele caulinare sunt deosebit de complexe
structural i funcional. Ele variaz ca aspect i potenialitate, de la o specie la
alta. Meristemele caulinare, terminale, constituie, n fapt, un microbuta, ntruct
vrful vegetativ al plantei, inoculat in vitro i formeaz un propriu sistem
radicular, n partea sa bazal. n consecin, acest tip de meristem este frecvent
folosit n tehnicile de multiplicare i de propagare accelerat a plantelor, pe
medii aseptice.
Potenialitatea regenerativ a acestor meristeme este, de regul, extrem
de mare. Ele se adapteaz bine la condiiile in vitro, suport uor traumatismul
provocat de explantare, relundu-i activitatea n urma trecerii lor pe medii
aseptice, genernd plante. Acest fapt presupune att creterea axei mugurelui i
a primordiilor sale, cu dezvoltarea frunzulielor, ct i neogeneza de rdcini. n
final, meristemul terminal, apical sau axial genereaz una sau mai multe plante,
n funcie de balana hormonal prezent n mediul de cultur. Meristemele
terminale, caulinare ale plantelor lemnoase ridic probleme speciale, ntruct ele
aparin unor plante perene, multianuale, de talie mare, ceea ce ngreuneaz o
alimentare optim a lor cu ap, cu nutrieni i hormoni. Acest lucru constituie
impedimente fiziologice care, pe plan funcional, se traduc printr-o regresie a
capacitii regenerative a celulelor lor, soldat cu o scdere a totipotenialitii
acestor meristeme.
Meristemul apical se formeaz n momentul organizrii embrionului i
rmne activ n tot cursul vieii plantei. Excepie fac plantele perene din zonele
temperate, la care meristemul apical n decursul sezonului de iarn se afl n
stare de laten.
Prin intermediul culturii de meristeme apicale, terminale sau laterale,
se poate realiza o rapid multiplicare clonal a plantelor, ndeosebi a celor
horticole i a unor specii silvice.
Prin cultivarea in vitro a meristemelor se obine o regenerare de plante
identice din punct de vedere genetic cu planta mam donatoare, fapt deosebit de
important n horticultur, asigurndu-se astfel o multiplicare clonal.
Un alt aspect, foarte important, care deriv din nmulirea meristematic
a plantelor, este acela al obinerii de material sditor sntos, n esuturile cruia
este prevenit orice fel de atac fitopatogen. Plantulele generate in vitro din
meristeme, nsoite numai de prima pereche de primordii foliare, sunt libere de
viroze, deosebit de pgubitoare i imposibil de evitat i de combtut n condiiile
212
nmulirii vegetative a plantelor. Numai propagarea plantelor prin semine poate
asigura, ntr-o oarecare msur, eradicarea parial, temporar, a virozelor, tiut
fiind faptul c, chiar i prin semine se transmit o serie de viroze. Dar
nenumrate plante horticole nu se pot nmulii prin semine sau, la unele soiuri,
multiplicarea prin semine este dificil (orhidee), ori seminele nu sunt fertile,
ceea ce a fcut ca nmulirea acestora pe cale vegetativ s constituie unica
metod de multiplicare a lor. Pe de alt parte, multiplicarea plantelor pe cale
asexuat, prin metode de nmulire vegetativ clasic, a condus la degenerarea
descendenilor ca o consecin a perpeturii, an de an, a infeciilor virale. Astfel,
o cultur sntoas de garoafe (Rudelle, 1977), nmulite timp de cinci ani prin
butire clasic, a prezentat o rspndire n mas a virozelor, multe din ele,
cauznd degenerri. Totodat, multiplicarea vegetativ, prin metode tradiionale,
are drept consecin i o perpetuare a unor mutaii somatice.
Virozele plantelor aduc mari daune culturilor, la cartofi i cpun, n
floricultur i n arboricultur, ntruct reduc vigurozitatea plantelor, scad
potenialul productiv al acestora, producia realizat este mediocr i produsele
agricole au un grad naintat de depreciere a calitii lor. Butaii obinui din
plante virozate au o capacitate redus de nrdcinare i realizeaz un procent
sczut de prindere. Pe de alt parte, din cauza meninerii n cultur a unor plante
virozate se creeaz pericolul transmiterii virusurilor i la alte plante, prin
vectorii biologici prezeni n cultur.
Primele ncercri de cultivare a extremitilor de tulpini i de rdcini
sunt citate ca fiind realizate nc din 1922, de ctre Kotte i de ctre Robbins, la
mazre i porumb, dar fr mare succes. Ulterior, n 1946, Ball a reuit s obin
plante din apexuri meristematice la Lupinus albus i la Trapaeolum majus. Pn
n jurul anilor 1949-1950 cultura propriu-zis de meristeme nu era cunoscut,
abia ncepnd din anul 1949, prin lucrrile lui Wetmore i Morel s-au pus bazele
cercetrilor sistematice privind cunoaterea reaciei explantelor meristematice la
condiii de cultur, precum i cu privire la comportamentul in vitro al
meristemelor diverselor specii, de diferite dimensiuni, cultivate n condiii
variate de mediu.
Dac meritul de a fi reuit regenerarea de plante din meristeme izolate
revine lui Ball, n schimb prioritatea n ceea ce privete obinerea de plante
sntoase, devirozate, prin cultura in vitro a meristemelor apicale, recoltate de la
plante bolnave, revine lui Morel (1959-1960). Inspirat fiind de rezultatele
obinute ntre anii 1949-1950 de ctre Limasset i Cornuet, Morel a avut intuiia
de a cultiva in vitro meristeme apicale de aproximativ 75-100 m lime i 150-
200 m nlime, cu 1-2 primordii foliare.
Experienele efectuate de Limasset i Cornuet au constat n urmrirea,
prin analize serologice, a gradului de rspndire i a evalurii intensitii
virozrii organelor vegetative aeriene a plantelor la diferite distane de apex. Ei
au constatat o distribuie inegal a virusurilor n corpul plantelor i au observat
213
un gradient mai sczut de infecie viral, pe msura apropierii de vrful
vegetativ, respectiv de meristemul apical. Cea mai redus infecie viral a fost
semnalat n sucul extras din frunzele aflate nc n mugur. Pornind de la aceste
fapte, Limasset i Cornuet au extirpat, aseptic o calot de esut apical sau
meristem i cteva primordii foliare i au depus-o pe o frunz tnr de tutun,
lezat printr-o scarificare superficial. Dup trecerea unei perioade de incubaie
s-a putut constata c frunzele de tutun, pe care s-a amplasat exclusiv calota
meristematic, au fost virozate n proporie de 60%, n timp ce frunzele pe care
s-au aplicat esuturi subiacente meristemului (primordii foliare mai ndeprtate
de meristem) s-a infectat n procent de 100%. Aceste experiene ia condus pe
Limasset i Cornuet la concluzia c n apexul caulinar migrarea i nmulirea
virusurilor este oprit.
nc din 1952, Morel i Martin au intuit faptul c, pornind de la plante
virozate, prin explantarea i cultivarea in vitro a meristemului caulinar, apical,
se poate obine o plant sntoas, conservnd, n acelai timp, caracterele
genetice ale plantei mam. Aceast ipotez a fost atestat de ctre Morel i
Martin prin experiene efectuate cu plante de dalie. Cultura de dalii a beneficiat
prima de eradicarea virozelor, prin procedeul imaginat i pus n practic de ctre
Morel i Martin. Tulpinile generate in vitro, neposednd rdcini, au fost
transformate n minibutai. Acetia au dat natere la plante libere de viroze. Au
urmat apoi cartofii i orhideele. n 1957, Quak a remarcat c metoda lui Morel i
Martin este posibil de aplicat, cu aceleai rezultate, la garoafe. Din acel moment
s-au demarat cercetrile n scopul stabilirii unor metode intensive, industriale, de
controlare i producere a unui material sditor sntos, cu randament economic
asigurat, avnd ca obiectiv obinerea de flori de calitate superioar.
n acest mod a fost elaborat ipoteza imunitii poteniale a celulelor
meristematice la atacul viral. Dac prelevarea se face de la o plant neinfectat,
sau care prezint o infecie viral slab, atunci cresc i mai mult ansele de a
preleva explante meristematice, lipsite de infecii virale.
Din pcate, plantele devirozate nu sunt imune la viroze. Ele se pot
mbolnvi tot att de repede ca i oricare alt plant. De regul, din plantele
devirozate, aflate in vitro se asigur multiplicarea lor, tot pe medii aseptice, prin
minibutai, sau se induce formarea de colonii de propagule, sau se constituie o
plantaie mam, donatoare de meristeme ori chiar de butai, plantaie executat
n condiii speciale de protecie, nct plantele s fie ferite de atac zoopatogen.
Concomitent cu eradicarea virozelor, multiplicarea in vitro a plantelor,
prin explante meristematice, asigur i eliminarea din materialul sditor a
fungilor i a bacteriilor. Astfel, la garoafe s-a realizat eliberarea plantelor de
infecii cu Fusarium roseum, iar la Pelargonium i Diffenbachia eradicarea
bacteriozelor sistemice (Walkey, 1979).
Cercetrile recente au dovedit ns, c nu toate meristemele sunt libere
de infecii virale. Invazia meristemelor cu virusuri este dependent de tipul
214
meristemului, al virusului i de specia plantei parazitate. Cu ct explantele
meristematice sunt mai mici, cu att ansa prelevrii de celule lipsite de virusuri
este mai mare, dar cu ct inoculul meristematic este mai mare, cu att este mai
ridicat capacitatea lor regenerativ.
Nu toate virozele pot fi eradicate prin procedeele de nmulire
meristematic (Martin, 1977). De exemplu, la cartof, virusul X poate fi nlturat,
prin nmulire meristematic, numai n procent de 1%. Unele virusuri pot exista
chiar i n meristemele apicale (Hollings, 1962).
Termoterapia vine n ajutorul culturilor de meristeme pentru a completa
metodele de combatere a infeciilor virale, la plante. Termoterapia a fost
elaborat de ctre Kunkel, n 1936. Aceasta const n supunerea plantelor
bolnave la temperaturi cuprinse ntre 35-39oC, timp de 2-4 sptmni. n cursul
aplicrii termoterapiei virusurile nu se multiplic; ele rmn la nivelul celulelor
n care au fost surprinse n momentul declanrii tratamentului termoterapeutic.
Combinnd cultura de meristeme cu termoterapia se realizeaz, cu anse
foarte mari de reuit, eliminarea virusurilor din plantele generate in vitro. n
consecin, mersitemele sunt prelevate de la plante supuse, prealabil explantrii,
tratamentului termoterapeutic. Dar, n aceast situaie, descrete vitalitatea
plantelor donatoare, concomitent cu scderea capacitii de supravieuire i de
regenerare a celulelor meristematice. Pe durata termoterapiei, apexul se
alungete iar virusurile, nemultiplicndu-se, rmn n celulele bazale ale conului
vegetativ, ceea ce nlesnete prelevarea unor explante apicale mai mari de pn
la 1 mm, micornd pericolul recoltrii unor esuturi subiacente meristemului,
infectate cu germeni fitopatogeni. n consecin, explantele meristematice
prelevate de la plante supuse termoterapiei, fiind mai mari, capacitatea lor
regenerativ i de cretere va fi mai ridicat, ceea ce compenseaz epuizarea
fiziologic, cauzat de termoterapie.
Kassanis (1950) a dovedit c unul din virusurile cartofului, localizat n
frunze, poate fi inactivat la nivelul tuberculilor, prin aplicarea termoterapiei. Dar
tot Kassanis a precizat c la tomate exist virusuri a cror activitate este
suprimat abia la 80oC. acesta a fost unul dintre motivele care i-a determinat pe
cercettori s prelungeasc durata termoterapiei, de la cteva zile la cteva luni
i s ridice temperatura de la 35 la 40oC (Quak, 1977).
Hakkaart i Quak (1964), experimentnd cu meristeme excizate de la
crizanteme, de pn la 1 mm lungime cu 2-3 primordii foliare, au constatat c
prelungirea duratei de termoterapie de la 10-20 zile la 30 zile a dus la sporirea
procentului de plante devirozate, de la 9 la 90% dar prelungirea tratamentului
termoterapeutic peste aceast durat de timp (pn la 50-60 zile)nu a condus la
depirea procentului de plante devirozate.
n unele cazuri, se poate realiza distrugerea virusului din vrful
meristematic i n decursul cultivrii esuturilor in vitro. Astfel, Hollings i
Stone (1964), au reuit aceast performan la garoafe, iar Walkey i colab.
215
(1969) la cire. Aceast eradicare endogen a virozei, n interiorul celulelor
cultivate pe medii aseptice, poate fi un rezultat al unui proces metabolic
dereglat, ca o consecin a traumatizrii celulelor excizate. Cu ct a fost mai mic
fragmentul de esut excizat, cu att traumatismul a fost mai puternic i efectul
endogen, distructiv, exercitat asupra virusului, a fost mai mare (Walkey, 1980).
De regul ns, este imposibil s regenerm anumite specii de plante din
fragmente att de mici de esuturi; ori n alte condiii, nu poate fi realizat o
traum de o aa amploare nct s se produc o disturbare a metabolismului
virusurilor din celulele explantate, soldat cu suprimarea atacului viral.
Explicaiile privind modul n care celulele meristematice rezist
infeciilor nclin spre justificri de ordin molecular. Una din ipoteze susine c
exist o competitivitate ntre celula gazd i parazit, n ceea ce privete utilizarea
unor enzime implicate n procese de restituie; alt ipotez, susine c celula
meristematic utilizeaz ARN viral, sau c substanele generate n urma
traumatizrii celulelor ar suprima virusurile prezente n celule.
n anul 1978, Walkey, a reuit obinerea de plante sntoase i prin
cultivarea in vitro a esutului gametofitic femel, respectiv ovare sau esut
nucelar, sau a meristemului floral.
Trebuie subliniat i marele merit pe care Morel l-a avut n intuirea
importanei deosebite a descoperiri posibilitii de a obine plante sntoase din
plante bolnave, precum i a direciilor aplicative pe care le-a deschis aceast
tehnic, efectuat n condiii aseptice. Cele mai mari realizri le-a avut Morel n
multiplicarea in vitro la orhidee. Astfel, n anul 1963, Morel comunica primele
rezultate cu privire la cultivarea in vitro a meristemului apical de orhidee.
Acestea se refereau la faptul c meristemele de orhidee, cultivate pe medii
aseptice, genereaz un glomerul de 1-2 mm, de culoare verde, numit protocorm.
Prin ruperea i cultivarea in vitro a fragmentelor va rezulta o mas globuloas,
un glomerul de cca 3-4 mm slab difereniat histologic, constituit dintr-un
parechim, cu celule mari, srace n citoplasm i cu vacuole ntinse. n partea
central a glomerulului se disting cteva fascicule vasculare. Fragmentnd
periodic aceast mas i cultivnd-o in vitro s-a putut remarca o foarte mare
capacitate de multiplicare vegetativ a celulelor detaate. n anul 1978,
Murashige afirma c, dintr-un meristem de orhidee, n decursul unui an, prin
fragmentri i subcultivri repetate ale protocormilor, se pot obine cca 4
milioane de noi plante de orhidee. Protocormul produs in vitro este asemntor
cu protocormul de germinaie, rezultat din embrionii seminelor.
n 1959, Martin a intuit posibilitatea crerii unei bnci cu explante, n
care s fie conservat materialul biologic meristematic sntos. Prin aceast
tehnic, astzi, materialul vegetal generat in vitro este uor conservat, esuturile
deinnd nealterat, ntreaga lor capacitate regenerativ.
Valoarea mare a culturii de meristeme const deci n:
-asigurarea uniformitii genetice a materialului sditor, generat in vitro;
216
-eliminarea agenilor fito sau zoopatogeni;
-creterea la maximum a coeficientului de multiplicare, n cel mai scurt
timp, a unui exemplar vegetal;
-obinerea unui material sditor juvenilizat, imposibil de realizat prin
metode tradiionale de nmulire vegetativ;
-conservarea prin temperaturi sczute a inoculilor meristematici, pentru o
lung perioad de timp, ntr-o anumit faz de dezvoltare, pentru a avea un stoc
permanent, ce s asigure, oricnd, necesarul de material sditor solicitat pe
pia;
-conservarea germoplasmei n bnci de gene.
n extinderea rapid a acestor practici, n regim industrial a predominat
factorul economic rezultat, n primul rnd, din aspectele fitosanitare, respectiv
din obinerea unor culturi viguroase, sntoase. Astfel, cartoful, plat extrem de
important att n hrana omului i pentru industrializare dar i n hrana
animalelor, a beneficiat primul de extinderea metodelor de redresare a
vigurozitii culturilor prin eradicarea virozelor, cultivnd in vitro meristemele
caulinare. Cartoful este atacat de nenumrate virusuri care, de cele mai multe
ori, pot fi prezente concomitent n esuturi, ceea ce epuizeaz planta i scade,
considerabil recolta. Pierderile sunt cifrate la 15-25%. Din nefericire, nu toate
tipurile de virusuri pot fi n egal msur combtute. Astfel, la cartof, dintre
toate virusurile prezente foarte des n cultur (A, Y, M, S, X) virusul A este mai
uor de ndeprtat, comparativ cu virusul X. Multiplicarea in vitro prin
meristeme a luat o mare amploare i la garoafe. Astfel, n Frana, cifra de afaceri
realizat, n categoria florilor tiate, prin vnzarea garoafelor, ocup locul doi iar
exportul horticol francez este reprezentat n proporie de 80% de garoafe, 90%
dintre acestea provenind din mutaii de culoare, practicate la tipul american de
garoaf creat de William Sim, n 1939. Multiplicarea acestui cultivar s-a fcut n
miliarde de exemplare. Conservarea calitilor sale genetice se datoreaz
metodei de multiplicare prin cultura in vitro a meristemelor caulinare, apicale.
Infeciile virale afecteaz nu numai calitatea florilor, ci reduce foarte mult i
capacitatea de nrdcinare a butailor. n laboratoarele unei singure uniti se
produc anual, in vitro, cca 10 000 de garoafe. nmulirea meristematic a permis
vindecarea garoafelor i de boli vasculare, respectiv eradicarea atacului de
Phialophora cinerescens, Fusarium oxysporum, i a bacteriozelor Pseudomonas
caryophylli i Pectobacterium parthenii. De o mare importan este cultura
orhideelor, obinerea de material sditor devirozat la garoafe, cpun,
crizanteme, la pomi fructiferi, la arbori i arbuti.
Dar cultivarea in vitro a meristemelor nu nseamn urmrirea, ca scop n
sine, numai eradicarea bolilor ci pur i simplu, multiplicarea unor clone,
respectiv genotipuri valoroase. Aceast metod este cu att mai important cu
ct se pleac de la un material iniial devirozat.

217
Se practic diferite metode de multiplicare in vitro prin intermediul
meristemului de tip caulinar i anume:
-unele procedee vizeaz cultivarea exclusiv a celulelor conului
meristematic, fr primordii foliare, pentru studierea proceselor regenerative, n
dependen de dimensiunea redus a explantelor i de consecinele
traumatismelor provocate;
-altele privesc obinerea de material sditor devirozat, explantele
constnd din meristeme recoltate mpreun cu prima pereche de primordii
foliare, lungimea explantelor fiind de pn la 500 m, respectiv 0,25-0,7 mm;
-altele au n vedere obinerea unui numr foarte mare de plantule, n timp
scurt utiliznd explante mai mari de 1-5 mm sau impulsionnd diferenierea de
meristeme axilare i de muguri adventivi pe apexul iniial.
n oricare din cazuri trebuie s avem n vedere selectarea, cu mare atenie
i pricepere, a plantelor mam, donatoare de explante. Este de dorit ca ele s fie
sntoase i s se afle ntr-o perioad de cretere activ. Latena organelor
uneori ridic probleme speciale i implic aplicarea unor tratamente termice sau
hormonale, pentru a stimula emergena meristemelor. Alegerea explantelor,
sterilizarea organelor, tipul de mediu de cultur folosit, regimul din camerele de
cretere influeneaz supravieuirea explantelor. Restabilirea proceselor
biologice, de diviziune i de regenerare precum i sensul desfurrii histo i
organogenezei, diferenierea de plante, dezvoltarea lor i apoi capacitatea
adaptativ a acestora la mediul normal sunt influenate att de factori endogeni,
ct mai ales de cei exogeni, n special de balana hormonal i de regimul de
lumin, respectiv de temperatur.
De regul meristemele caulinare, terminale, apicale, dovedesc cea mai
rapid cretere. Cu toate acestea i meristemele laterale, prelevate din mugurii
axilari, pot fi folosite n culturile de meristeme. La crizanteme din 5000 de
vrfuri meristematice, 32% din mugurii apicali, terminali, au crescut, genernd
plante mature, n timp ce numai 18% din mugurii laterali au format noi plante.
Mrimea explantelor se stabilete n funcie de specie i de scopul
urmrit. Cnd se are n vedere obinerea de plante libere de viroze la garoafe,
explantul nu trebuie s depeasc 0,5 mm dar nici s fie mai mic de 0,2 mm,
deoarece, n acest caz, este dificil nrdcinarea plantulelor generate din
meristeme. n cazul n care s-a aplicat corect termoterapia explantul poate fi mai
mare, de pn la 1 mm. n camerele de cretere intensitatea luminii se
recomand s fie de 2400-2600 luci, n regim de fotoperioad cu 16 ore lumin
i 8 ore ntuneric. n alte cazuri, lumina trebuie intensificat la 3500-4000 luci,
iar la conifere se poate ajunge chiar la o intensitate de peste 10 000 luci.
Temperatura trebuie s fie stabilizat ntre 22-25oC. Uneori exist indicaii
stricte cu privire la regimul termic i de iluminare, cerute de un anumit tip de
cultur, potrivit unei anumite specii sau corespunztor unei anumite etape de
dezvoltare a inoculilor.
218
n literatura de specialitate sunt recomandri i cu privire la sezonul cel
mai potrivit pentru prelevarea i inocularea unui anumit tip de meristem. Astfel,
se specific c meristemele de garoafe supravieuiesc, n proporie mai mare,
dac sunt recoltate primvara sau toamna devreme; meristemele recoltate iarna
nrdcineaz mai uor iar cele recoltate vara dau cel mai ridicat procent de
plantule libere de viroze (Van Os, 1964). La cartof, meristemele recoltate
primvara sau vara, de timpuriu, nrdcineaz mult mai repede n raport cu cele
care sunt prelevate i inoculate la finele anului.
n ceea ce privete substratul de cultur, de cele mai multe ori, se
utilizeaz medii de cultur solide. La cartof, garoafe i la alte specii se pot folosi
i mediile lichide. PH-ul mediului de cultur poate constitui un factor limitativ al
creterii i dezvoltrii meristemului cultivat in vitro. Astfel, de regul, pH-ul de
5,5-5,8 este indicat ca fiind optim; dup autoclavare, pH-ul scade, iar n decurs
de o sptmn de la cultivarea esuturilor, pH-ul descrete pn aproape de 5,4.
Un pH iniial sczut inhib formarea rdcinilor.
n compoziia mediilor de cultur sunt incluse macro i microelemente,
FeEDTA, vitamine, aminoacizi i o surs de carbon organic, reprezentat, de
regul de zaharoz n concentraie de 2-3%. Natura hormonilor i concentraia
acestora variaz de la o specie la alta, n funcie de scopul urmrit. Astfel, pentru
nrdcinare se folosesc cu precdere ANA i AIA, care ns folosite timp
ndelungat pot duce la inhibarea creterii rdcinilor. n acest caz, se recomand
subcultivarea explantelor pe medii lipsite de auxine. Citochininele stimuleaz
creterea meristemelor, mai ales n cazul n care ele se fal n laten, precum i
formarea de nenumrai mugurai. Concentraia fitohormonilor de cretere
variaz n diferitele faze de evoluie ale meristemelor.
Plantele complet formate prezentnd rdcini i tulpini vor fi scoase
din condiiile in vitro, fiind trecute n condiiile mediului septic. Ele vor fi
transferate n ghivece mici, n amestec de perlit cu pmnt. Se poate realiza
transferul lstrailor n mediul septic,chiar nenrdcinai, aceast operaiune
putnd determina nrdcinarea lor. Buys (1969) recomand transferarea
timpurie n sol a plantelor de garoafe neoformate in vitro, ntruct rdciniele
generate in vitro sunt n mic msur folositoare n sol, iar prelungirea duratei
de meninere a plntuelor n flacoanele de cultur, ridic nejustificat costul
materialului plantat rezultat. Atunci cnd plantele sunt suficient de mari, se va
testa serologic, eventuala prezen a virusurilor i gradul de infecie.
Metodele de testare a virozelor i natura acestora variaz de la o specie la
alta. n 1977, Clark i Adams au pus la punct un procedeu ELISA de
identificare a prezenei virusurilor, iar n 1973, Derrick, a preparat un ser septic
pentru electronomicroscopie, metode de mare sensibilitate n determinrile de
virusologie vegetal. Pentru a uura exactitatea investigaiilor este de dorit s se
fac o analiz a infeciilor la nivelul plantelor donatoare de meristeme, precum
i n cultura, sau culturile apropiate. Dup stabilirea unei culturi lipsite de
219
germeni este absolut indispensabil ca plantele s fie meninute n condiii
speciale fie c ele sunt prezervate n condiii de temperaturi sczute, n
recipientele lor de cultur, pe medii aseptice, fie c sunt cultivate n teren, ntr-
un perimetru ferit de infecii, metodele fiind menite s realizeze evitarea unei
reinfectri a plantelor.
Metodele criobiologice de prezervare a materialului obinut in vitro sunt
economice i indispensabile pentru conservarea, pe termen lung, a
germoplasmei precum i a unei cantiti limitate de material iniial, devirozat.
Crioconservarea poate fi realizat la temperaturi extrem de sczute. n aceste
condiii se asigur reducerea tuturor funciilor metabolice. Primele ncercri de
crioconservare au fost fcute de ctre Seiberg n anul 1976, la garoafe. Ulterior
s-a reuit i conservarea altor tipuri de inoculi: calus, celule sau protoplati.
Tehnicile de crioconservare presupun utilizarea unor substane crioprotectoare,
cu rol n prevenirea daunelor cauzate de nghearea brusc a celulelor, respectiv
formarea cristalelor de ghea. Cele mai folosite substane crioprotectoare sunt
dimetilsulfoxidul (DMSO) i glicerolul (Kartha, 1981, citat de Cachi, 1984).
Meristemul este esutul cel mai potrivit pentru a fi conservat la temepraturi
sczute, graie alctuirii particulare a celulelor lui. Astfel, el i poate pstra
ntreaga capacitate regenerativ, ntruct n momentul repunerii lui n condiii
optime de mediu, celulele i reiau activitatea metabolic i fiziologic normal.
Meristemul se preteaz cel mai bine conservrii prin crioconservare, celulele lui
fiind srace n vacuole i avnd o citoplasm dens.
Pentru executarea operaiunilor de congelare, ndeosebi pentru coborrea
gradat a temperaturii, exist dispozitive speciale. O metod accesibil
preconizeaz introducerea flacoanelor cu inoculi ntr-o baie de alcool, mediu n
care se produce descreterea gradat a temperaturii.
n anul 1980, Dale i colab. Au pus la punct o metod de stocare la
temperaturi sczute a unor graminee sau a unor plante legumicole, constnd n
conservarea ndelungat a plantelor, generate in vitro, prin meninerea lor la
temperaturi de 2-4oC, n regim de 8 ore lumin pe zi si o intensitate de 300 luci.
Cultura poate fi meninut astfel 10-11 luni, dup care se recomand ca aceasta
s fie transferat pe mediu proaspt.
O alt problem deosebit de biologie se ridic n cazul plantelor
generate in vitro. Plantele provenite att din meristeme ct i din explante de alt
natur, prezint un grad de juvenilitate similar plantelor dezvoltate din embrionii
seminelor. Astfel, materialul de plantat, generat in vitro, este superior celui
obinut prin metodele tradiionale: butire, marcotaj, altoire.
Juvenilitatea plantelor generate in vitro poate fi constatat morfologic, de
exemplu la plantulele de cpun, difereniate din meristeme. La cpun, frunzele
tinere sunt ntregi, n timp ce frunzele plantelor btrne sunt trifoliate. Generarea
de frunzulie ntregi sisteaz la inoculi n momentul n care se depete faza de

220
morfogenez, constnd n proliferarea a noi muguri axilari, prin repicri repetate
i cultivarea inoculilor pe mediu cu citochinin.
Un caz particular este acela al rentineririi unor organe de pe care
urmeaz s fie prelevate meristeme apicale. Un exemplu l constituie plantele
lemnoase, multianuale. Explantele sau butaii prelevai de la astfel de plante i
pierd capacitatea de nrdcinare. La aceste plante se practic diferite metode de
rentinerire a materialului biologic prin butiri sau microbutiri in vitro, altoiri
de apexuri de plante adulte pe tinere plantule.
Sfecla constituie un alt exemplu de plant a crei esuturi adulte prezint
o foarte sczut capacitate organogenetic. De aceea se recomand inducerea
formrii de meristem prin repicri succesive.
O problem deosebit o constituie aceea a meninerii meristemului
vegetativ, inoculat pe medii aseptice, ntr-o stare primar, ntruct n cazul n
care se inoculeaz un meristem vegetativ, prelevat de pe o tulpin florifer,
exist pericolul ca anumii factori de mediu s induc formarea florilor sau
invers, s grbim, prin reglarea fotoperioadei i a altor factori de mediu,
transformarea unui mugur vegetativ, n mugure florifer. Reglarea fotoperioadei
i sporirea cantitii de zaharoz din mediu la 40-50 g/l sunt factori care par s
determine transformarea apexului vegetativ n florifer.
La numeroase plante, detaarea meristemelor florale i cultivarea lor in
vitro imprim esuturilor capacitatea de a redeveni meristeme vegetative,
genernd mugurai. Adeseori, se formeaz muguri axilari sau adventivi acolo
unde altfel, normal ar trebui s se formeze boboci. Inocularea in vitro, pe medii,
cu sau fr fitohormoni, a unor fragmente desprinse din inflorescene tinere
conduce la formarea a numeroi muguri. La conopid, prelevarea unui mic
explant din apexul preinflorescenei i cultivarea lui pe mediu lichid, cu o auxin
(AIA), provoac reveria esuturilor din florifere n vegetative. Astfel, poate fi
nmulit planta pe cale vegetativ (Crisp i colab., 1974, citat de Cachi,1984).
Originea comun a meristemului vegetativ i a celui florifer face ca
transformarea, n direcia diferenierii morfologice i funcionale s fie posibil,
ntr-o anumit faz de dezvoltare a plantelor sau a organelor. Reuita este
dependent de vrsta esutului, de specie i de condiiile de mediu.
Ambele tipuri de meristeme, dirijate corect, pot servi la multiplicarea in
vitro a unor plante.

6.1.7.3 Cultura de calus

Calusul este o formaiune particular constituit dintr-o mas


nedeterminat de celule deinnd o structur histologic uniform. De regul,
cnd este tnr, posed celule nedifereniate, care se divid activ. Un anumit tip
de calus se produce i n mod natural, fie la nivelul zonelor traumatizate, avnd
rol n cicatrizarea rnilor, fie se formeaz la baza butailor plantai pentru
221
nrdcinare, constituind zona de genez a rdcinilor adventive. n funcie de
obiectivul urmrit, obinerea de calus poate constitui un scop n sine, alteori
apariia i dezvoltarea lui poate fi un dezavantaj. Inducerea formrii de calus ct
mai friabil constituie scopul principal atunci cnd se urmrete iniierea unei
culturi de celule, iar din acestea a unei culturi de protoplati. Instabilitatea
genetic a celulelor sale i poliploidizarea facil a lor, n anumite condiii de
cultur, fac din calus si din cea de celule, un material biologic valoros asupra
cruia agenii mutageni i factorii stresani pot opera modificri, selectndu-se
linii cu caliti speciale. Multiplicarea clonal, via calus nu este posibil tocmai
din cauza facilei poliploidizri a celulelor sale. Pe aceast cale se practic ns
nmulirea regenerativ, rapid a unei specii, fr a avea sigurana conservrii
genotipului. La unele specii: morcov, tutun, crizanteme din calus se pot obine
uor plante. La specii ierboase (bumbac)sau la plante lemnoase (stejar), geneza
de plante din calus este extrem de dificil.
Atunci cnd se urmrete multiplicarea clonal rapid, formarea de calus
n poriunea bazal a explantului sau transformarea ntregului inocul ntr-o mas
de calus constituie un fenomen care perturb dirijarea proceselor de
morfogenez. Astfel, administrarea unei balane hormonale neechilibrate, face
ca la baza explantului s se genereze calus, cauznd dezvoltarea preponderent a
rdcinilor, n defavoarea diferenierii mugurailor sau invers, se formeaz unul
sau mai muli mugurai, iar pentru inducerea rizogenezei fiecare mugura
trebuie detaat i subcultivat pe un mediu cu sau fr auxin. Aceast metod se
practic cu succes, atunci cnd se procedeaz la multiplicarea in vitro a unor
specii ornamentale (Saintpaulia i Gerbera), constnd n desprinderea de
propaguli, de pe un esut calusal comun de dimensiuni minime generat din
inoculul iniial, situat n poriunea bazal a coloniei de propaguli.
Creterea calusului este considerat ca fiind nedefinit, ntruct el poate
fi nmulit i cultivat la nesfrit, atunci cnd, periodic, se procedeaz la
repicarea, respectiv la fragmentarea lui. Fiecare fragment este apoi subcultivat
pe un mediu proaspt. Calusul crescut la 25oC se recomand a fi repicat la un
interval de 4-6 sptmni, n dependen de natura esuturilor din care a provenit
i de condiiile n care a fost cultivat. Numai prin subcultivri repetate poate fi
conservat vitalitatea celulelor sale. Dac calusul nu este subcultivat n timp util,
se produce o mbtrnire a celulelor sale, masa tisular i schimb culoarea, din
glbui, galben-verzui ori verde, devenind cenuie sau galben-brun; uneori
culoarea calusului devine roiatic sau viinie, datorit formrii i acumulrii de
antociani n sucul vacuolar. Proveniena calusului i natura inoculului iniial
influeneaz sinteza antocianilor. Street (1973) precizeaz c trecerea calusului
n suspensie celular duce la scderea substanial a cantitii de antociani. De
altfel, s-a constatat c anaerobioza inhib formarea antocianilor (Gautheret,
1959, citat de Cachi, 1984). n general, prezena luminii i natura acesteia
intensific acumularea n celule a antocianilor. Antocianii sunt sintetizai ns i
222
la ntuneric. Astfel Eriksson (1967) iradiind o cultur de celule de Haplopappus
cu raze UV, a izolat o linie celular cu un coninut foarte ridicat de antociani.
Fitohormonii de cretere i natura acestora influeneaz i ei sinteza antocianilor.
Astfel, auxina inhib, iar citochininele stimuleaz formarea antocianilor (Street,
1977; Kalinin, 1981). Temperatura sczut, carena de azot i coninutul ridicat
al mediului de cultur n glucide stimuleaz sinteza de antociani. Se pare c
zaharoza intervine prin presiunea osmotic pe care o creeaz, ntruct i un
coninut ridicat de NaCl stimuleaz formarea acestor pigmeni.
La plantele dicotiledonate calusul este indus cu mai mult uurin, dect
la gimnosperme sau la monocotiledonate.
Pe msur ce calusul depete un numr de zile de cultur, n
profunzime se difereniaz centri vasculari, ori noduli organoformatori. n morfo
i organogeneza calusului un rol determinant l au mediul de cultur i condiiile
de cultur, natura esuturilor din care a provenit calusul i vrsta acestora.
Formarea, creterea i aspectul calusului sunt dependente de natura i
concentraia fitohormonilor de cretere, prezeni n mediile de cultur. De
regul, concentraiile ridicate de auxin conduc la formarea de calus. Cele mai
eficiente auxine n inducerea de calus s-au dovedit a fi acidul 2,4
diclorfenoxiacetic (2,4D) i acidul 2,4,5 triclorfenoxiacetic (2,4,5 T), folosite n
concentraii cuprinse ntre 1-10 mg/l.
n general, calusul poate fi generat cu uurin din material vegetal de
provenien diferit, chiar i din esuturi cu structur definitiv. Astfel, prin
inocularea de liber secundar, muguri, meristeme, internodii, fragmente de
frunze, pe mediu bogat n 2,4D, se ajunge uor la formarea de calus.
Celulele esutului calusal pot fi mai compacte, legate ntre ele, sau pot fi
mai laxe, formnd un calus friabil, grunjos, separabil n fragmente granulate, de
mrimi diferite, mai greu dezagregabile, sau spumos, ce se separ n formaiuni
tisulare fine, adecvat pentru iniierea unei culturi de celule. Consistena i
friabilitatea esutului calusal depind de specie, de natura organelor din care au
fost detaate explantele generatoare de calus, de tipul fitohormonilor de cretere
prezeni n substratul de cultur i uneori de condiiile de cultur. Capacitatea
organogen sau embriogen a esutului calusal este dependent att de factorii
endogeni i exogeni, de numrul repicajelor fcute, de condiiile de cultur i de
vrsta calusului. Se cunosc cazuri de calusuri care subcultivate periodic, chiar i
dup cinci ani, i menin o potenialitate ridicat de a regenera plante (la tutun).
Calusul provenit din plantele monocotiledonate (cereale) are o capacitate
regenerativ sczut, evaluat la cteva sptmni (Conger, 1981).
Dintr-un inocul iniial se obine calus de tip primar, ce conine un numr
de aproximativ 50 000 celule. Dup cca ase sptmni, calusul primar este
suficient de bine dezvoltat pentru a putea fi subcultivat pe un mediu nou.
Calusul transferat pe mediu proaspt, se numete calus secundar.

223
Calusul obinut poate fi de tip regenerativ care totdeauna d natere la
noi plante i un calus de tip neregenerativ ce prezint, de regul, o cretere
luxuriant, din el difereniindu-se rdcini, i uneori mugurai, dar niciodat
plante (Nabors, 1982). Aceste dou tipuri de calus au mai fost denumite calusuri
embriogene i neembriogene. Calusul embriogen este dens, translucid sau opac
de culoare alb-lptoas, spre galben, ori galben-verde. Citologic se remarc
zone compacte, cu celule nedifereniate, ce pot genera embrioni sau embrioizi,
din care ulterior se vor forma plante complet formate. Calusul neembriogen este
constituit dintr-o mas cristalin, transparent, de culoare alb, brunie sau verde.
Acest tip de calus prezint o consisten mai lax, fiind mai friabil, desfcndu-
se uor n pachete de celule. Regiunile friabile prezint celule mari, mult
vacuolizate. Aceste regiuni genereaz rdcini i mai rar mugurai dar niciodat
plante. Nabors a fost primul care a dovedit c cea mai ridicat capacitate
regenerativ, meninut timp ndelungat o prezint calusul embriogen, denumit
de tip regenerativ. Tot Nabors a observat c acest calus regenerativ tinde s
devin neregenerativ; dup producerea acestei reversibiliti procesul este
definitiv, ntruct cele dou forme sau tipuri de calusuri, diferite funcional, nu
sunt interconvertibile. De altfel, cele dou tipuri de calusuri necesit fitohormoni
diferii, n doze variate, att pentru impulsionarea i susinerea creterii ct i
pentru difereniere. De regul, calusul neregenerativ crete abundent, n timp ce
calusul regenerativ are o cretere mult mai lent, chiar i pe medii potrivite
scopului meninerii unei creteri susinute a acestuia. Pentru a prentmpina
dezvoltarea neomogen a calusului se urmrete obinerea unui calus regenerativ
omogen sau cel puin predominant ca mas, ntr-o populaie de celule calusale.
Nabors a remarcat i faptul c ceea ce la un anumit moment, ntr-un anumit
stadiu de dezvoltare a calusului, pare s fie esut de tip neregenerativ, poate
genera, n continuare, regiuni regenerative, ce pot fi izolate i subcultivate
(Cachi, 1984).
Frecvent, cele mai bune medii de cultur, adecvate creterii optime a
esutului calusal, nu constituie medii corespunztoare producerii calusului de tip
regenerativ. n general, mediul Linsmaier-Skoog (1965) sau cele de compoziie
similar, respectiv srace n azot cu pH-ul 5,5 sunt de preferat. La cereale se
recomand adugarea n mediu a acidului 2,4,5 triclorfenoxiacetic, avnd efect
pozitiv n susinerea creterii calusului. Acest mediu ns nu este cel mai potrivit
pentru inducerea i meninerea proceselor regenerative.
n general, calusul care provine din rdcini de plantule de cereale
posed mai multe regiuni cu calus de tip regenerativ, n raport cu calusul derivat
din embrioni imaturi. Dar i la calusul bogat n zone regenerative acestea
reprezint numai cca 1-10% din totalul masei calusale. Dac regiunile cu calus
de tip regenerativ sunt subcultivate pe medii care s impulsioneze i s susin
procesele regenerative, celulele lui vor da n final natere la plante.

224
Calusul de tip regenerativ poate fi obinut i din calusul secundar, prin
meninerea calusului regenerativ pe mediu potrivit creterii acestuia i
nefavorabil obinerii de plante, intervenindu-se periodic, prin subcultivri de
ntreinere. Pe alt cale se pot identifica i izola insulele de calus regenerativ, pe
msur ce ele apar pe calusul de tip neregenerativ, realizndu-se transferarea lor
pe un mediu de cretere adecvat.
n decursul timpului s-a constatat c se obine mai mult calus din inoculii
cultivai la ntuneric dect din cei crescui la lumin. Regiunile cu calus
regenerativ sunt mai greu depistabile pe calusurile crescute la ntuneric.
Procentul de formare al calusului regenerativ crete ns la calusul crescut n
condiii de ntuneric. La gru, calusul trebuie transferat la interval de cinci
sptmni, pe mediu potrivit induciei diferenierii de plante. La calusul de gru,
regenerarea se realizeaz pe un mediu lipsit de fitohormoni de cretere; astfel
din calusul de tip regenerativ, n cca 2-5 sptmni dup transferarea pe mediu
adecvat proceselor regenerative, are loc formarea de plante. Pe un astfel de
mediu, calusul de tip regenerativ nu va mai crete. Dac calusul este mixt,
componenta neregenerativ continu s creasc mult; concomitent, ns, din
poriunile de calus de tip regenerativ, n cultur se difereniaz i plante. Dup
dou subcultivri ale calusului de tip regenerativ, pe mediu lipsit de fitohormoni
de cretere, potrivit inducerii neoformrii de plante, se recomand transferarea
calusului rmas, pe un mediu coninnd auxin, pentru a favoriza continuarea
creterii acestuia.
Plantele obinute sunt detaate de calus i sunt plasate n vase deschise,
coninnd perlit, care va fi udat cu ap de la robinet, urmnd ca dup 1-2
sptmni, plantele bine nrdcinate, s fie transferate n ghivece cu pmnt n
amestec cu perlit.
Calusul poate fi folosit i n obinerea unei culturi de celule, cultivndu-l
pe medii lichide, obinnd-se astfel suspensiile celulare folosite n diferite
scopuri.
n vederea obinerii de calus se parcurg urmtoarele etape:
-alegerea materialului vegetal, din care se va executa prelevarea
explantelor. Calusul poate fi obinut din explante provenite din diverse surse:
semine, embrioni, rdcini, esut de rezerv, frunze, ramuri, antere, ovare;
-prepararea mediilor de cultur i alegerea tipului de mediu se vor face n
funcie de scopul propus. Atunci cnd scopul este doar obinerea de calus se
poate utiliza un mediu de cultur oarecare, coninnd substane anorganice
(macro i microelemente) i substane organice (surs de carbon organic,
vitamine, aminoacizi i fitohormoni), iar solidificarea mediului se realizeaz cu
agar;
-sterilizarea recipientelor i a mediilor de cultur;

225
-pregtirea materialului vegetal n vederea dimensionrii explantelor. Se
realizeaz curirea organelor i dezinfectarea lor, folosind diverse procedee n
funcie de tipul de explant utilizat;
-dimensionarea explantelor este diferit n funcie de specia la care se
lucreaz i de tipul de organ folosit ca surs de explante;
-inocularea explantelor se realizeaz n condiii aseptice, la hota cu flux
de aer steril, fie pe mediu solid fie pe mediu lichid cnd ns este necesar
agitarea n vederea aerrii culturii;
-incubarea inoculilor se face fie la ntuneric, fie la lumin, de regul la
temperatura de 25oC;
-observarea proceselor de formare a calusului i urmrirea creterii
acestuia se face periodic, la diverse intervale de timp;
-subcultivarea periodic se realizeaz prin fragmentarea calusului i
inocularea fragmentelor pe medii proaspete. Subcultivarea se efectueaz la cca
4-6 sptmni, fiind obligatorie pentru meninerea viabilitii calusului. Este
important inerea unei evidene stricte a numrului de subcultivri suportate de
ctre fiecare fragment de esut calusal;
-urmrirea proceselor de organogenez sau de embriogenez funcie de
condiiile n care a fost cultivat calusul, de provenien i de vrsta acestuia.
esutul calusal are o utilizare variat. El constituie unul din materialele
biologice asupra cruia se pot aplica diferii ageni selectivi, n scopul obinerii
de linii rezistente, pentru selecionarea de plante care s fie tolerante la prezena
n mediul lor de via a unui anumit factor de stres. Nabors (1982) a reuit s
obin calus i apoi plante rezistente la concentraii ridicate de NaCl, substan
introdus n concentraii crescnde n mediul de cultur. Astfel, a raportat
obinerea de plante de Triticum, Orisa i Pennisetum tolerante la concentraii
ridicate de NaCl (0,6-0,9%), precum i la Avena la care pragul de suportabilitate
a fost ridicat la 0,03%. La gru, cel mai bun calus, care rspunde pozitiv la
astfel de tratamente este acela obinut din rdcinia embrionar, dezvoltat n
condiiile germinrii cariopselor pe medii aseptice.
Atunci cnd se urmrete cultivarea in vitro a embrionilor imaturi,
boabele de gru se sterilizeaz, dup care, la microscop, se detaeaz embrionii,
evitndu-se lezarea acestora i inoculndu-i pe mediu de cultur.
Mediul de cultur recomandat pentru gru (cariopse sau embrioni
imaturi) este Linsmaier-Skoog, coninnd macro i microelemente, vitamine,
surs de carbon (zaharoz), fitohormoni (2,4D sau 2,4,5 T) i agar.
Agenii selectivi la care dorim s obinem toleran pot fi introdui fie n
mediul de cultur, preparat pentru inducerea formrii de calus, fie se adaug n
substratul de cultur destinat repicrii calusului. n cazul n care se utilizeaz ca
material biologic de iniiere a culturii de calus, o varietate n mod natural mai
rezistent la aciunea duntoare a agentului selectiv n cauz, se realizeaz o
reducere a timpului de obinere a unei linii rezistente, cu caracterele dobndite
226
stabilizate, transmisibile descendenilor. S-a constatat c stabilitatea caracterelor
dobndite este dependent de durata n care s-a petrecut imprimarea acestor
caractere, respectiv durata de timp n care s-a operat selecia. Pentru a fi atins o
stabil toleran, chiar i n condiiile absenei ndelungate din mediu a agentului
selectiv, sunt necesare cel puin ase luni de clire i selecie, prin subcultivri
repetate. Menionm c i n situaia unor experimente de acest gen este prezent
fenomenul de manifestare a diferenierii capacitii regenerative a calusului, n
calus de tip regenerativ i neregenerativ. Numai din calusul de tip regenerativ se
poate induce formarea de noi plante; calusul de tip neregenerativ este inutilizabil
n acest gen de experimente.
Calusul poate fi utilizat i ca instrument de cercetare n diferite
experimente de fiziologie, n studierea problemelor de morfogenez, n
urmrirea unor modificri ultrastructurale, n analize de ordin biochimic, sub
aciunea unor anumii factori, administrai exogen sau n dependen de natura
inoculilor din care a provenit calusul.
n concluzie, calusul poate fi utilizat ca monitor al reaciei celulei
vegetale la o serie de substane sau condiii de cultur, permind efectuarea
unor experimente de fiziologie privind: creterea, reacia la pesticide, noxe, ioni
grei, respiraia, morfo i organogeneza, testarea viabilitii celulare, a biogenezei
unor produi primari sau secundari de metabolism.

6.1.7.4 Cultura de embrioni i endosperm

Cultura de embrioni sau de segmente embrionare se practic n diferite


scopuri, att pentru cercetri de fiziologie a seminei ct i n experiene de
hibridri intersoiuri, interspecii i intergenuri.
nc din 1904, Hanning a demonstrat posibilitatea cultivrii pe medii
aseptice a embrionilor de Raphanus i Cachlearia pe soluii minerale cu adaos
de zaharoz, obinnd plantule transferabile n sol.
Metodele de cultivare a embrionilor pe medii aseptice au fost
perfecionate continuu. Van Qverbeek i colab. (1941) au definitivat un
procedeu care le-a sugerat lui Lee (1955) i Morel (1956) s efectueze
experiene de multiplicare in vitro folosind ca material iniial embrioni extrai
din semine coapte. Seminele au fost sterilizate, dup care au fost mbibate n
ap, 12-24 ore, i apoi, n condiii aseptice a fost izolat embrionul.
Embrionii pot fi cultivai in vitro, ca atare sau se opereaz detari de
fragmente embrionare, sau sunt cultivai n scopul obinerii de calus, care este
utilizat ulterior n alte experimente. Exist i practici constnd n grefarea de
embrioni pe endospermul aparinnd altor specii sau genuri, operaie denumit
hibridare in vitro.
Problemele ridicate de cultura embrionilor sunt, asemenea celorlalte
tipuri de explante, complexe. Un rol deosebit revine momentului n care se
227
execut explantarea embrionului, respectiv timpul scurs dup fecundare, din
clipa formrii zigotului i pn la inocularea lui in vitro, perioad care exprim
vrsta embrionului n zile. Ovulul fertilizat adpostete zigotul care, dup
formare, ncepe s se divid i se hrnete din rezervele endospermului. n
aceast faz celulele embrionului sunt heterotrofe; pentru creterea i
dezvoltarea lor ele au nevoie de: glucide, aminoacizi, vitamine i hormoni. n
aceast etap explantarea embrionului i inocularea lui pe medii aseptice creeaz
probleme deosebite pentru realizarea cadrului fiziologic optim, adecvat
continurii proceselor de cretere i de dezvoltare.
De regul, la dicotiledonate, embrionul este apt pentru cultivare pe medii
aseptice n momentul n care sunt formate cotiledoanele, respectiv cnd ncepe
diferenierea intern a celulelor embrionului. stadiul critic de transformare
endogen a structurii embrionare variaz de la specie la specie i uneori este
dependent de condiiile meteorologice. n unele cazuri, cnd este important
izolarea timpurie a embrionului de sub aciunea plantei mam, poate fi realizat
o cretere corespunztoare a acestuia numai dac embrionul este izolat mpreun
cu nucela sau cu esutul nutritiv, sau dac se detaeaz ovulul n ntregime
realizndu-se astfel inocularea lui pe medii aseptice, corespunztoare ca i
compoziie.
Prin cultura in vitro de embrioni se poate prentmpina avortarea sau
dezvoltarea anormal a embrionilor ca urmare a instalrii unei incompatibiliti
ntre embrion i esutul nutritiv, aa cum este cazul hibrizilor sexuali
intervarieti interspecii i intergenuri, sau al formrii de hibrizi sterili.
Spre deosebire de cultura de embrioni imaturi, care ridic mari
probleme, cultura de embrioni maturi este mult mai uor de realizat.
Embrionii maturi necesit un mediu de cultur simplu, care are n
compoziia sa sruri minerale i o component glucidic. Adugarea la mediul
de baz a vitaminelor (acidul nicotinic, acidul ascorbic, piridoxin)
impulsioneaz creterea esuturilor, iar adugarea fitohormonilor de cretere are
drept scop urmrirea evoluiei embrionilor n prezena acestora, pentru a asigura
stimularea creterii unui anumit organ sau pentru inducerea formrii de calus. n
mediile aseptice destinate culturii embrionilor imaturi, adesea se recomand
adiionarea unor extracte naturale: hidrolizat de casein, lapte din nuc de cocos,
suc din fructe de tomate sau extract de endosperm.
n general, dezvoltarea embrionilor in vitro se petrece natural, cu
condiia ca ei s fie explantai n acea faz de formare care s le permit, n
continuare parcurgerea evoluiei fireti a proceselor de ontogenez i s se
respecte integritatea lor morfoanatomic; cu ct stadiul n care au fost prelevai a
fost mai timpuriu cu att i factorii de care depinde dezvoltarea lor sunt mai
compleci i greu de reprodus. n timp ce plantulele provenite din embrionii
maturi au o dezvoltare similar cu cei dezvoltai n condiii naturale, sau prezint
chiar un uor avans n cretere plantulele dezvoltate din embrionii imaturi sunt
228
plpnde, iar n sol dovedesc o cretere mai lent i sunt mai firave. Cultura de
embrioni imaturi, recoltai foarte tineri, uneori conduce la obinerea de plantule
malformate, chiar dac mediile de cultur au o compoziie adecvat dezvoltrii
acestora.
n unele cazuri, dup polenizarea interspecific sau intergeneric,
dezvoltarea embrionilor a fost extrem de lent, ceea ce a fcut ca explantarea
embrionilor i cultivarea lor in vitro, s fie imposibil. Taira i Larter (1978) au
tratat ovulele fertilizate cu acid E-amino-n-caproic, facilitnd astfel, creterea
embrionilor hibrizi, realizai ntre gru i secar, depind barierele fiziologice
care mpiedicau creterea acestora. Deci, pretratamentul florilor femele cu
anumii regulatori de cretere, dup polenizare, impulsioneaz creterea
embrionilor pn la faza n care ei pot fi extrai i cultivai, cu succes, pe medii
aseptice.
Prin cultura de embrioni s-a reuit obinerea de plante mature din hibrizi
de trifoi 2n x 4n, mbinndu-se caracterul de perenitate cu cel al calitii
furajului realizat (Evans, 1962). Rezultate bune s-au obinut i n regenerarea de
plante din embrionii altor specii furajere, obinndu-se hibrizi interspecifici de
Melilotus, Lotus, Phaseolus, i Medicago.
Tot prin cultura de embrioni s-a reuit obinerea de plante la specii ale
cror semine nu germineaz (banane) sau a celor care se nmulesc greu prin
semine (specii forestiere). n unele cazuri scoaterea embrionilor din starea de
laten, prin cultivarea lor pe medii aseptice a constituit o metod eficient n
scurtarea ciclului de dezvoltare a plantelor.
De asemenea, embrionii pot s serveasc i ca esuturi de plecare n
multiplicarea i propagarea rapid a unor plante (la specii ornamentale) atunci
cnd acest lucru este dificil de realizat prin utilizarea altor tipuri de explante.
O atenie deosebit trebuie acordat aspectelor teoretice i practice pe
care le ridic problemele de embriologie experimental la gimnosperme. Cea
mai veche cultur de embrioni la gimnosperme este citat ca fiind efectuat de
ctre Schmidt n anul 1924, cnd a cultivat pe un mediu organic embrioni de
Pinus sylvestris. Mai trziu, n 1936 Rue a reuit cultivarea in vitro a
embrionilor provenii de la cteva specii: Pinus resinosa, Picea canadensis,
Tsuga canadensis i Pseudotsuga menziensii i a demonstrat, totodat, c
embrionul imatur de gimnosperme (de 2-4 mm) poate fi cultivat pe medii
aseptice, pn la stadiul de plantul. Experimentele ulterioare au reliefat faptul
c embrionii de gimnosperme pot fi crescui in vitro, n lipsa megagametofitului
(Cachi, 1984).
La cultura de embrioni, presiunea osmotic, sau sursa de carbon organic,
joac un rol important n evoluia acestora, atunci cnd embrionii sunt excizai i
sunt cultivai in vitro. De exemplu, embrionii de Pinus strobus, pe mediu
Murashige-Skoog, cun un coninut de 3-6% zaharoz i hormoni, vor genera

229
plantule, n timp ce pe un mediu cu numai 1-2% zaharoz, se constat o serioas
limitare a dezvoltrii primordiilor radiculare.
Prin cultivarea in vitro a embrionilor de Taxaus embryo s-a reuit
scoaterea acestora din starea de laten, odat cu detaarea i desprinderea lor de
sub aciunea megagametofitului.
Cultura de endosperm constituie un excelent instrument pentru studierea
problemelor de morfogenez i se refer la cultura endospermului de tip
secundar, derivnd din diviziunea nucleului secundar al sacului embrionar,
avnd celule triploide, gimnospermele avnd un endosperm de tip primar.
Ambele tipuri de endosperm dein un rol important n alimentarea i susinerea
creterii embrionilor. La plantele dicotiledonate, de regul endospermul este
consumat n primele faze ale dezvoltrii embrionului, rolul de depozitare a
rezervelor nutritive revenind cotiledoanelor.
Primele experimente constnd n proliferarea endospermului imatur de
porumb au fost efectuate nc din anul 1933 de ctre Lampe i Mills. La Rue, n
anul 1947, a realizat creterea nelimitat a endospermului de porumb.
Cercetrile menionate au deschis calea unor experimente prin care s-a dovedit
c acest esut iniial are o capacitate ridicat de proliferare, formeaz uor
rdcinie, mugurai i chiar plantule. n aceast direcie, Straus i La Rue n
1954, au obinut rezultate excelente cultivnd endosperm de porumb, la 12 zile
de la polenizare. Cele mai bune varieti, potrivite pentru acest scop sunt cele de
porumb zaharat. Endospermul de porumb, la 8 zile dup polenizare, nu crete pe
medii aseptice. Deci, pentru reuita iniierii culturii este important stadiul n care
se afl diferenierea celulelor embrionului.
Endospermul matur, doar la cteva specii sau varieti, corespunde
scopului inducerii formrii de calus i anume: Zea mays, Lolium, Santalum,
Ricinus, Coffea arabica, Croton, Petroselinum hortense. Dintre acestea numai la
unele specii se manifest procese de organogenez. Endospermul de porumb, de
ricin, precum i la alte specii, genereaz o mas de calus n continu cretere,
fr organogenez, n timp ce la nivelul valusului de Petroselinum se observ
embriogeneza.
Cultura de embrioni ofer un important instrument n cercetrile de
embriologie i n embriogeneza experimental, constituind un sistem de tip
monitorial n redarea fazelor de cretere ale diferitelor pri componente ale
embrionilor. Aceste etape pot fi studiate n dependen de natura substratului de
cultur, de vrsta embrionului, n funcie de condiiile de mediu, oferind
importante informaii privind interferena diferitelor etape metabolice cu
regulatorii de cretere, procesele de depozitare ale substanelor de rezerv n
esuturi, cu factorii care pot intervenii, pozitiv sau negativ, n formarea i
creterea embrionilor.

230
6.1.7.5 Cultura de ovare, ovule i de esut nucelar

n hibridare poate exista, adeseori, o incompatibilitate ntre partenerii


sexuali. De aceea prin utilizarea metodelor culturilor in vitro se poate, uneori,
facilita fie accesul polenului la ovul, fie acceptarea de ctre ovule a
autopolenizrii ori a polenizrii ncruciate, nvingndu-se astfel barierele de
autoincompatibilitate, a celor de incompatibilitate la ncruciri, operaiunile
fiind fcute n scopul obinerii de semine viabile.
Incompatibilitatea dintre ovule i polen este provocat de ctre diferite
cauze, de ordin endogen i anume: o prim selecie a polenului se face la nivelul
stigmatului. Aceasta poate prezenta o conformaie morfologic
necorespunztoare, mpiedicnd angrenarea ornamentaiilor exinei polenului pe
vilozitile stigmatului; pe de alt parte, natura umed sau uscat a suprafeei
stigmatului poate constitui un impediment n reinerea polenului pe stigmat i n
crearea mediului optim; substanele secretate de ctre celulele epiteliale ale
stigmatului pot stimula sau inhiba, germinarea polenului precum i creterea
tubului polinic.
n unele cazuri exist o autoincompatibilitate natural, generat de faptul
c plantele care trebuie ncruciate prezint diferene morfologice constnd n
mrimea polenului, amplasarea anterelor n floare etc. Alteori, maturitatea
organelor sexuale se face n momente diferite, caz n care se impune ca, n
prealabil, polenul s fie recoltat i s fie conservat, pentru o anumit perioad de
timp.
Experimentele de polenizare i fecundare artificial in vitro trebuie
precedate de o cunoatere a bilogiei florilor cu care se dorete efectuarea
experienelor, att n ceea ce privete morfologia, etapele de morfogenez ct i
a compatibilitii i a incompatibilitii, a antezei i a factorilor care pot
intervenii favorabil sau pot inhiba fiecare din fazele respective. Pe de alt parte
trebuie fcute testri prealabile cu privire la mediile de cultur adecvate
meninerii microsporilor la un potenial biologic i ntr-o stare optim de
viabilitate, pentru asigurarea creterii tubului polinic, pentru meninerea
viabilitii prilor componente ale pistilului.
Polenizarea i fecundarea artificial in vitro se poate face, deci, la nivelul
stigmatului unui pistil cultivat pe mediu aseptic, ori prin punerea n contact a
polenului, respectiv a tuburilor polinice, cu ovarele sau cu ovulele excizate.
Aplicarea polenului pe stigmatul pistilelor, cultivate pe medii aseptice, se
practic n cazul speciilor compatibile sexual, cnd nu exist impedimente
morfofiziologice, privind fixarea i germinarea polenului la nivelul stigmatului.
Prin aceast metod s-a reuit autopolenizarea la Antirrhinum majus (Usha,
1965), n schimb la Petunia violacea, specie autocincompatibil s-a constatat c
autopolenizarea in vitro a fost urmat de o cretere a pistilului dar dup un timp
acesta s-a brunificat (Shivanna, 1965, citat de Cachi, 1984).
231
Deseori, ns, polenizarea i fecundarea in vitro a ovulelor au euat, n
condiiile utilizrii tehnicilor constnd n folosirea, ca partener femel, a
pistilului,motiv pentru care s-a trecut la reproducerea acelorai ncruciri, dar
opernd cu ovare sau ovule.
Meritul primei culturi de ovare i revine lui La Rue (1942), care a reuit
cultivarea in vitro a ovarelor de Lycopersicon pimpinellifolium, neobinnd, ns
n final semine viabile. n aceast perioad, Nitsch (1949-1951) a cultivat in
vitro ovare de Lycopersicon esculentum, Cucumis angeria, Phaseolus vulgaris i
Nicotiana tabacum. Mediile de cultur au fost complexe i au coninut ca
fitohormoni: acidul 2,4 diclorfenoxiacetic i acidul 2,4,5 triclorfenoxiacetic.
Ovarele au fost recoltate fie nainte de polenizare fie dup ce polenizarea s-a
petrecut n mod natural. In vitro ele au crescut, dar n final nu au format semine.
Prin tehnicile de cultur in vitro a ovarelor au fost obinui hibrizi din
ncruciarea hibrizilor diploizi de Brassica chinensis i autotetraploidul
Brassica pekinensis (Inomata, 1968). Hibrizii triploizi au prezentat caracterele
intermediare ntre cei doi prini.
La Oryza sativa i la Haworthia turgida, Majumdar a obinut, n anul
1970, plantule din ovare nepolenizate, cultivate pe medii aseptice.
Mitra (1972) a reuit obinerea de embrioizi din pereii ovarelor
nepolenizate de Citrus aurantifolia i Citrus sinensis, cultivate in vitro. n
general cultura de ovare servete la inducerea artificial a poliembrioniei, la
seminele care, normal, sunt monoembrionare.
Exist numeroase cercetri care atest rolul deosebit pe care l joac
prile florale n dezvoltarea fructului. Astfel, Maheshwari i Lal (1961, citai de
Cachi, 1984) experimentnd cu flori excizate, cultivate in vitro, au constatat la
Iberis amara formarea unor fructe normale, numai dac, n condiiile inoculrii
lor la o zi dup polenizare, acestea prezentau caliciu. Lipsa caliciului poate fi
suplinit prin adugarea n mediul de cultur a unui surplus de zahr. n cazul n
care florile au fost excizate i inocularea s-a fcut la opt zile dup polenizare,
lipsa caliciului nu a mai fost resimit.
Cultivarea pe medii aseptice a ovulelor a permis stabilirea unui contact
direct ntre polen i ovule, ceea ce a facilitat accesibilitatea tubului polinic pn
la sacul embrionar. n acest mod, s-a realizat actul de fecundare ntre indivizii
ndeprtai filogenetic, nlturndu-se barierele incompatibilitilor genetice i
obinerea, n final, de semine viabile.
nc din anul 1932, White a ncercat s cultive ovule de Antirrihinum,
dar a obinut calus, generat din integumentele ovulului. Apoi, La Rue cultivnd
in vitro ovule de Erythronium americanum, observat o cretere a acestora fr
ca s obin maturizarea lor.
n anumite cazuri, de exemplu la ovulele de Ribes rubrum, n condiiile
cultivrii in vitro a acestora, s-a observat apariia fenomenelor de poliembrionie.

232
Embrionii izolai au continuat s prolifereze numeroi ali embrioni (Zatyko,
1975).
S-a constatat c esutul placentar exercit un efect pozitiv asupra creterii
ovulelor cultivate in vitro, favoriznd formarea i maturarea seminelor. Se
presupune c esutul placentar cedeaz ovulelor anumite substane stimulatoare.
Substanele respective nu prezint o specificitate, ntruct ovule fertilizate,
provenind de la diferite specii sau genuri, au fost grefate, cu rezultate favorabile,
pe placent de Capsicum. n condiiile cultivrii acestora in vitro, ovulele s-au
maturizat i au format semine viabile.
Pot fi cultivate in vitro att ovule fertilizate ct i ovule nefertilizate.
Ovulele pot fi recoltate ca fiind fertilizate n condiiile naturale sau pot fi
fertilizate prin polenizarea lor, cultivate fiind pe un mediu aseptic.
Exist perspective mari n ceea ce privete realizarea prin culturi in vitro
a unor polenizri ncruciate, interspecifice i intergenerice care n condiiile
obinuite, n natur duc fie la incapacitatea embrionului format n a-i menine
viabilitatea, fie smna rezultat se dovedete inapt n a suporta dezvoltarea
embrionului.
n literatur se citeaz hibridul realizat ntre Lolium perene i Festuca
rubra, utilizndu-se ovule detaate din floare, la cinci zile de la polenizare.
Plantele rezultate au fost asemntoare cu Festuca rubra.
nvingerea barierelor morfo-fiziologice creeaz posibilitatea realizrii de
hibrizi interspecifici care, n viitor, pot prezenta un interes economic major i
care n mod natural nu pot fi obinui prin hibridare sexuat.
S-au reuit realizarea de experimente privind cultivarea pe medii aseptice
a nucelei. Pornind de la acest tip de esut, in vitro se poate induce poliembrionia.
Astfel, n 1976, Mullins i Srinivasan au provocat formarea de embrioizi la
nivelul ovulelor de Vitis vinifera Cabernet Sauvignon, specie n mod normal
monoembrionar. Din ovulele nefertilizate s-a format un calus nucelar, din
celulele cruia s-au difereniat embrioizi, ceva mai mari dect embrionii zigotici.
Plantulele rezultate au fost viabile.
La fertilizarea ovulelor poate fi folosit fie polen proaspt, recoltat n
perioada iniierii culturilor de ovule, ovare sau de pistile, fie polen conservat,
mai ales n cazul urmririi realizrii de polenizri interspecifice sau
intergenerice. n ambele cazuri este necesar ca prealabil inoculrii, polenul s fie
testat n ceea ce privete capacitatea germinativ, creterea tubului polinic i s
se studieze comparativ eficiena ctorva reete de medii de cultur, n vederea
asigurrii unei creteri optime a tubului polinic, respectiv conservarea i
susinerea ntregului potenial biologic al celulei generative i a celei vegetative.
n cazul n care polenizarea se face la nivelul stigmatului, este necesar s
se aproximeze dac tubul polinic are o lungime corespunztoare pentru a fi
asigurat accesibilitatea lui la ovule; n caz contrar se renun la cultura de
pistile i ovulele vor fi excizate i cultivate ca atare. n acest mod, va fi facilitat
233
fecundarea i se prentmpin epuizarea celulei generative, n decursul
parcurgerii traseului de la stigmat, pn la sacul embrionar (Cachi, 1984).
Cultivarea in vitro a pistilelor, ovarelor, ovulelor i a altor pri florale,
precum i a ansamblelor de componente florale a permis completarea
cunotinelor actuale privind funcionarea organelor respective i privind
biologia fecundrii, a formrii embrionului, a seminei i a fructului. Aceste
cunotine servesc la obinerea de noi succese n nvingerea barierelor
incompatibilitilor existente n hibridarea sexuat, fapt deosebit de important,
ntruct prin nmulirea sexuat se poate rennoi continuu, potenialul biologic al
plantelor, mbogindu-se zestrea ereditar, cu caracterele motenite de la doi
prini, posednd acumulri genetice diferite.

6.1.7.6 Cultura de celule

Poate fi definit ca o cretere a celulelor libere sau a unor mici agregate


celulare pe un mediu de cultur lichid. n funcie de momentul n care se face
aprecierea acestui aspect, gradul de agregare al celulelor poate fi mai mic sau
mai mare, fiind mai redus n momentul iniierii culturii i mult mai accentuat n
perioada optim de cretere. Agregatele celulare pot fi datorate unei ineficiente
dezmembrri a celulelor inoculate, a separrii i individualizrii pariale a
acestora. De asemenea ele pot fi i rezultatul unor repetate diviziuni celulare,
fr separarea celulelor, iar n astfel de cazuri frecvena agregatelor crete pe
msura atingerii perioadei maxime de diviziune celular. Ulterior dei frecvena
diviziunilor scade, mrirea agregatelor celulare se datoreaz creterii n volum a
celulelor.
Cea mai perfect cultur de celule nu este alctuit numai din celule
libere. Pentru a reduce numrul de agregate se practica filtrarea culturii.
Agregatele care persist i dup filtrare vor deine maximum 4-10 celule,
uniforme din punct de vedere genetic (Street, 1976).
Gradul de dispersare a celulelor, ntr-o suspensie celular, depinde de
durata creterii celulelor n cultur, originea acestora, compoziia mediului i
condiiile de cultur (Street, 1977). Mediul de cultur optim, de cultivare la
celulele de gimnosperme difer de mediul de folosit pentru cultivarea celulelor
la plantele monocotiledonate, dar i fa de mediul folosite la dicotiledonate.
Unul din constituenii mediului de cultur de care depinde meninerea celulelor
n suspensie sunt fitohormonii de cretere care pot influena cultura celulelor in
vitro prin natura lor i concentraia folosit. Astfel un coninut ridicat de auxin
determin creterea numrului de celule n suspensie, iar reducerea coninutului
n acest fitohormon, descrete capacitatea celulelor de a se separa (Torrey i
Reinert, 1962). De asemenea s-a constatat c procesele de agregare celular sunt
influenate i de prezena n mediul de cultur a etilenei dar i de creterea
concentraiei n glucide.
234
O cultur celular ideal trebuie s fie omogen din punct de vedere
morfologic i biochimic. Numai o cultur de celule individualizate, obinute prin
clonarea unei singure celule, meninut n condiii care s pstreze stabilitatea
nuclear, constituie un material biologic valoros pentru operaiunile de
mutagenez, n izolarea de linii celulare, n selectarea de mutani, de un anumit
tip. Culturile de celule de lung durat manifest o diversitate genetic n cadrul
populaiei de celule (Cachi, 1984).
Pentru meninerea celulelor ntr-o stare activ de diviziune i astfel
creterea gradului de agregare, suspensiile celulare trebuie subcultivate la
intervale scurte de timp.
Din momentul iniierii unei culturi celulare i pn n momentul
practicrii unei subculturi se parcurge un interval de timp care se numete ciclu
de cretere a culturii. n decursul acestui ciclu se produc schimbri n ceea ce
privete viteza de diviziune i de cretere a celulelor. Se distinge o faz
incipient de cretere a vitezei de multiplicare celular, urmat de o perioad de
plafonare a frecvenei diviziunilor, dup care, fr o subcultivare a celulelor,
apare un declin, finalizat cu oprirea diviziunilor. Celulele cultivate ntr-un
volum finit de mediu nutritiv constituie celule izolate sau agregate celulare
cuprinse n acelai flacon de cultur. n aceste condiii creterea nceteaz atunci
cnd nutrienii de baz din mediu s-au redus sau au fost epuizai. Exist i
sisteme nchise de cultur care asigur remprosptarea continu a mediului
consumat; celulele sunt separate mecanic din mediul eliberat din vasul de
cultur aciune care asigur funcionarea sistemului i recoltarea biomasei
produse. n acest sistem se realizeaz un echilibru ntre cantitatea de mediu
introdus n sistem i mediul evacuat.
Durata meninerii n condiii de viabilitate a unei culturi, fr a se
produce modificri, depinde de specie, de condiiile de cultur, de epuizarea din
mediu a constituenilor, care pot limita diviziunea i creterea, de pH.
Dea asemenea oxigenul i glucidele din mediu pot influena creterea,
astfel c o reducere a celor dou componente determin reducerea sau chiar
stoparea creterii celulelor. Subcultivarea celulelor nainte de finalizarea
perioadei exponeniale de cretere a celulelor permite obinerea unor populaii
de celule mai stabile.
Prin ncorporarea n mediul de cultur a unor concentraii reduse de
enzime se poate realiza separarea celulelor, ntruct enzimele, n diluii
adecvate, nu influeneaz negativ rata de cretere, permind obinerea de
suspensii celulare cu celule mai uniforme din punct de vedere morfologic i
metabolic.
Rata de cretere a numrului de celule n decursul ciclului de cretere a
culturii se modific din momentul iniierii culturii, pn la oprirea diviziunilor.
O prim faz, imediat dup inoculare, const ntr-o ntrziere a declanrii
proceselor de multiplicare i de cretere, dar n urmtoarele 10 zile numrul de
235
celule per unitatea de volum crete exponenial, urmnd apoi faza de staionare
i apoi faza de declin. Faza exponenial de cretere se caracterizeaz ca o
perioad finit de timp, n care rata de cretere a biomasei, raportat la unitatea
concentraiei de biomas este constant. Faza de cretere exponenial este
extins n condiiile n care cultura este iniiat cu o densitate redus a celulelor
per unitatea de volum (Cachi, 1984).
Pentru a menine culturile ntr-o faz de cretere exponenial trebuie
prevenit situaia limitrii nutrienilor din mediu ca o consecin a epuizrii
acestora. n acest sens se impune subcultivarea frecvent a celulelor. Eriksson a
subcultivat cultura de Haplopappus gracilis i la un interval de 48 ore. La o
cultur de Acer pseudoplatanus, Dorre i colab. (1971) au realizat subculturile la
un interval de 7 zile, obinnd o densitate iniial de 2 x 105 celule/ml.
Pentru culturile de celule se pot folosi urmtoarele tipuri de dispozitive:
-fermentatoare de cca 1 l sau chiar mai mari, utilizate i n cultura cu
volum de mediu limitat, stabilit iniial;
-chemostate pentru cultura continu, deschis;
-fitostate chemostat pentru reglarea culturii semicontinue aparate n
care rata de cretere i densitatea celular sunt meninute constante, prin fixarea
unei rate de introducere a factorilor nutritivi i hormonali;
-turbiostate sistem deschis de cultur continu, n care mediul proaspt
se adaug n momentul creterii turbiditii culturii i a eliberrii, prin splare i
eliminare a excedentului de celule.
O cultur de celule poate fi obinut pe mai multe ci. Cea mai folosit
metod const n realizarea n mediul de cultur lichid a unei suspensii utiliznd
ca material iniial calus, pentru ca s se realizeze o dispersare a celulelor i a
agregatelor ce alctuiesc masa de calus, condiie ce poate fi ndeplinit prin
efectuarea unor subculturi repetate de calus, pe medii cu balan hormonal
adecvat scopului respectiv. Cel mai folosit fitohormon este acidul 2,4
diclorfenoxiacetic, n diferite concentraii. n cazul n care gradul de dispersie al
calusului este redus, chiar i n condiiile agitrii mediilor de cultur lichide, se
vor efectua subculturi prin recoltarea supernatantului i diluarea agregatelor
celulare mici n mediu de cultur proaspt.
De asemenea, n acelai scop, se poate practica recoltarea fragmentelor
de calus din mediul lichid i recultivarea lor, din nou pe mediu solid, astfel c,
coloniile de celule formate vor avea un procent mult mai ridicat de dispersie
atunci cnd se reiniiaz suspensia celular (Street, 1976).
O alt metod const n omogenizarea organelor plantulelor prin triturare
moderat, n omogenizator de sticl i apoi inocularea pe mediu lichid a
suspensiei ce celule rezultate.
n acelai scop se pot utiliza protoplati obinui prin digestie enzimatic.
Cultura de suspensii celulare se menine prin inocularea unei cantiti de
mediu, dintr-o cultur deja existent, avnd o densitate cunoscut de celule,
236
dilund-o cu mediu proaspt. Densitatea celulelor n subcultur nu trebuie s
depeasc iniial 0,5-2,5 x 105 celule/ml. n decurs de 15-25 zile densitatea va
crete pn la cca 4 x 106 celule/ml (Street, citat de Cachi, 1984).
Cultura de celule prezint foarte multe avantaje. Exist specii care
constituie modele n ceea ce privete reacia la condiiile create i la care
procesele de citodifereniere, de organogenez i embriogenez pot fi controlate
i dirijate n sensul dorit (morcov, tutun). Astfel, cultura de celule prezint
avantaje deosebite n efectuarea unor studii la nivel celular, privind aspecte ale
creterii, citodiferenierii, ale metabolismului celular. De asemenea cultura de
celule, fiind constituit ntr-o populaie omogen de celule se poate folosi n
vederea inducerii variabilitii genetice i seleciei de mutani, prin expunerea
culturii la aciunea unor anumii ageni fizici sau chimici.
Unul din marile obiective urmrite prin culturile de celule l constituie
acela al selectrii de mutante biochimice, cum ar fi mutante rezistente la
antibiotice, erbicide, metale grele, sruri, etc. Prin astfel de experimente au fost
create linii celulare mutante, iar modificrile genetice operate la nivel celular pot
fi regsite n plantele regenerate pornind de la celula care a suferit un proces de
mutaie. Selectarea liniei celulare se poate face uor prin etalarea suspensiei pe
medii de cultur solide, recoltarea efectundu-se n perioada creterii
exponeniale (Cachi, 1984).
Capacitatea regenerativ depinde de gradul de agregare al celulelor,
viabilitatea acestora, vrsta culturii, compoziia substratului i de condiiile de
cultur.
ntruct experienele de ameliorare i genetic din cmp sunt
costisitoare, necesitnd mult for de munc i suprafa mare de teren, prin
tehnicile de culturi in vitro aceste experimente se simplific, reducndu-se
activitatea, n prima faz, doar n laborator, astfel c se reduc att suprafeele de
lucru ct i timpul necesar obinerii rezultatelor dorite. n plus materialul
biologic valoros obinut, prin cultura de celule se poate pstra timp ndelungat
prin crioconservare, n azot lichid.
O problem deosebit este aceea a obinerii de culturi de celule
fotoautotrofe. Celulele cultivate pe medii aseptice dei au clorofil nu pot
supravieui n lipsa zahrului din mediul de cultur. n ncercrile fcute pe
medii aseptice s-a constatat c succesul cultivrii esuturilor i celulelor
clorofiliene autotrofe a fost minim, nregistrndu-se o rat sczut a creterii
acestora. Vigurozitatea slab a celulelor crescute n astfel de condiii a fost
explicat printr-o activitate fotosintetic sczut, datorat unor deficiene de
cultur, care mpiedic dezvoltarea cloroplastelor i a fotosintezei. Yamada i
colab.(1978) s-au ocupat de aceast problem i au ajuns la concluzia c n
realizarea culturilor de celule fotoautotrofe trebuie s se aib n vedere
selectarea de celule care produc mult clorofil. Lumina puternic stimuleaz
sintetizarea clorofilei, dar numai la o concentraie sczut de zaharoz. Prezena
237
n mediul de cultur a unor concentraii ridicate de zaharoz inhib sinteza
clorofilei.
Culturile de celule au implicaii practice deosebite n industria aa zis
de tip fermentativ, dup modelul biotehnologiilor care folosesc
microorganismele n scopuri industriale. i n culturile de celule s-a asimilat i
adoptat termenul de fermentatoare pentru recipientele n care se cultiv celule.
La plantele superioare, spre deosebire de microorganisme, produii secundari de
metabolism sunt depozitai n vacuole, nefiind excretai n mediul de cultur. La
suspensiile celulare, derivnd din plantele superioare, durata de fermentaie este
de cca 10 ori mai mare dect la culturile de tip microbian.
Un aspect particular l constituie capacitatea celulelor cultivate in vitro
de a transforma precursori sau anumii compui prezeni n mediul de cultur.
Biotransformarea poate fi utilizat pentru diferite tipuri de reacii: hidroxilare,
dehidrogenare, hidrogenare, glicozidare, adiia de carbon, ruperea lanului de
carbon.
Culturile n mediu lichid prezint avantajul unui contact mai bun al
celulelor cu nutrienii, se asigur un schimb de gaze optimizat, se evit
neajunsurile provocate de o eventual orientare polar neadecvat, precum i
depozitarea i concentrarea n jurul celulelor a produilor de metabolism,
eliminai n mediu.

6.1.7.7 Cultura altor tipuri de explante

Teoretic, oricare parte a plantei poate fi folosit ca explant pentru


iniierea culturilor in vitro. Inducerea neoformrii de esuturi este dependent de
specie, de natura organului, de mrimea explantului, natura esuturilor prezente
n explant, sezonul n care s-a recoltat organul, modul de sterilizare, compoziia
mediului de cultur, orientarea lor pe mediu precum i balana hormonal
folosit n mediul de cultur.
De regul, n afar de meristemele apicale, la nivelul nodurilor, al
frunzelor, al inflorescenelor, cotiledoanelor i mai rar, n poriunea internodal
a tulpinilor se constat existena unei capaciti regenerative, a crei intensitate
depinde de specie, de vrsta organului din acre se preleveaz esuturile, mrimea
explantului, orientarea lui pe mediu de cultur, de compoziia mediului sau de
condiiile din camera de cretere.
ntr-un experiment efectuat de Lazr i Cachi (1980-1982), cu explante
de crizantem de natur diferit, cultivate pe mediu de baz cu adaos de AIA (2
mg/l) i BA (2mg/l) s-a constatat c, n afar de meristeme, alte tipuri de
explante folosite de la peduncul floral, peiol, inflorescena, minibutai
frecvent au generat calus. La nivelul calusului s-a observat inducerea proceselor
de organogenez, pe suprafaa superioar, formare de mugurai iar pe cea
inferioar, generarea de rdcinie. Din meristemele apicale, dup dou luni de
238
cultivare pe medii aseptice s-au format plante, complet conformate. Din
meristemele axilare, diferenierea plantelor s-a fcut mai lent. Plantele formate
din meristeme au avut o conformaie proporionat i s-au adaptat bine la viaa
mediului septic. Explantele nodale i cele constnd din teaca frunzelor, au
generat, pe un explant, un numr variabil de mugurai. Dintre acetia unul pn
la trei s-au dezvoltat, ceilali rmnnd n diferite faze de cretere. separai i
subcultivai pe medii proaspete au format rdcinie i s-au dezvoltat normal.
Inoculii constnd din explante de form cilindric (ex. internod), au prezentat o
pregnant polaritate morfogenetic, chiar dac explantul a fost acoperit de calus.
Procesul de organogenez a fost i mai sczut la fragmentul desprins din
mijlocul peiolului frunzelor. n general, inoculii constnd din internod i mai
ales cei dimensionai din peiol au generat mult mai mult calus dect cei de
form i mrime similar, obinui din peduncul floral.
Explantele dimensionate din poriunea limbului foliar, n care nervura
principal a frunzei era bine reprezentat, au generat o cantitate mai redus de
calus, n schimb au dat natere la mugurai, din care s-au format plante (Lazr i
Cachi, 1982). n general, lstraii formai la nivelul calusurilor au un aspect
diferit de acela al tulpinielor formate din meristeme, ceea ce atest c din
celulele calusului se pot diferenia plantule cu o conformaie particular, diferit
de aceea a plantelor din care au provenit, nefiind asigurat, pe aceast cale
nmulirea clonal.
Concluzia final a constat n aceea c regenerarea i diferenierea rapid
a noi plante s-a realizat din inoculii meristematici. Lstarii pot fi transformai n
minibutai i prin aceasta se ridic coeficientul de multiplicare a clonei
respective.
Se poate deci concluziona c, n funcie de specia la care se dorete
experimentare, dar innd cont i de scopul urmrit, natura explantului este
diferit, iar rezultatul preconizat a se obine este influenat de o serie de factori,
de la compoziia mediului de cultur, natura fitohormonilor de cretere i
concentraia acestora, pn la vrsta organului donor sau condiiile din camerele
de cretere. Exist, aadar, o gam variat de posibiliti de inducere a unei
culturi in vitro, astfel c se pot depista pentru fiecare specie de cultur,
ornamental sau forestier, sursele de explante cele mai potrivite n vederea
realizrii unor astfel de experiene. Iar acolo unde literatura nu ofer posibiliti
de inducere a culturilor de celule, experiena cercettorului poate permite
depistarea prin tatonri a celor mai bune metode n vederea realizrii
obiectivelor n acest domeniu.

239
CAPITOLUL VIII

8.1 TEHNOLOGII DE CULTUR IN VITRO

Tehnicile de cultur in vitro a explantelor reprezint o cale optim de


cercetare a fiziologiei plantelor. Aplicaiile practice ale acestor tehnici au fost
repede apreciate de vreme ce plantulele obinute n vase de cultur pot fi
aclimatizate pe un substrat normal n condiii naturale de via.
Cronologic, cultura de meristeme a stat la originea primelor aplicaii,
deoarece scopul acestor culturi a fost, n principal, obinerea de plante libere de
virusuri. Dup primele succese ce au confirmat semnificaia metodei, s-au
dezvoltat rapid tehnicile de micropropagare pentru a asigura o producie rapid
de plante libere de virusuri.
Acestor dou tehnici, care sunt acum utilizate frecvent n horticultur, le
mai pot fi adugate altele trei, ce nc aparin domeniului cercetare, obinerea
plantelor haploide, izolarea i cultura de protoplati i cultura de calus i
suspensii celulare cu scopul producerii de compui medicinali aromatici. Ultima
tehnic vizeaz obinerea de substane farmaceutice direct din culturi de celule
vegetale, fr o cultivare n cmp.

8.1.1 Cultura de meristeme

Meristemele sunt esuturi de tip formativ cu celule tinere ce-i menin pe


tot parcursul vieii plantelor capacitatea de se divide, formnd mereu noi celule.
Meristemele sunt localizate n vrful ramificaiilor organelor tulpini sau
rdcini fiind meristeme apicale cu rol n creterea n lungime a acestora.
Importana culturii de meristeme const n principal n utilizarea lor n vederea
obinerii de plante libere de viroze, aceasta fiind i principala aplicaie practic a
acestui tip de culturi.
Pentru cultura de meristeme cu scopul devirozrii plantelor se folosesc
ndeosebi meristemele din vrful de cretere al tulpinilor, i anume din mugurii
floriferi sau foliari, iar la cartof din ochii de pe tubercul tocmai pornii n
vegetaie.
Mugurele este constituit dintr-un ax principal n apexul cruia se afl
meristemul, iar prin diviziunea continu a meristemului se formeaz primordiile
foliare (Fig.17). Formarea meristemelor i mai apoi organogeneza, adic
formarea organelor plantei, sunt procese ce au loc sub influena fitohormonilor,
de aceea meristemele excizate sunt plasate pe medii cu o balan hormonal
adecvat.

240
Observaiile ce au condus la dezvoltarea culturii de meristeme au fost
fcute de White, care a notat c rdcini de tomate infectate cu virus, genereaz
n unele cazuri rdcini fr virus. Studii mai amnunite au fost fcute de
Limaset i Cornuet (1949), care au observat c din plante de tutun infectate cu
virus, explantele prelevate prezentau o infecie de intensitate sczut, sau
explantele de dimensiuni mici erau chiar libere de virusuri.
Aceste cercetri au demonstrat c intensitatea infeciei crete dinspre
prile juvenile ale plantei spre cele mature (de exemplu: frunzele aflate n
apropierea mugurilor apicali conin cu pn la 150 de ori mai puin virus dect
cele aflate la mijlocul plantei).

a zona apical axial; b zona lateral;


c primordii foliare; d meristeme axilare;
e meristem medular; f - procambiu

Fig. 17 Reprezentarea schematic a unui meristem caulinar


(dup Badea i colab., 2001)

Aceste cercetri au permis emiterea teoriei conform creia multiplicarea


virusurilor a fost limitat la nivelul sub-meristematic, meristemul fiind liber de
virusuri. Morel i Martin au fost primii care au reuit s regenereze noi plantule
din meristeme inoculate pe medii artificiale. Plantele regenerate au fcut parte
din genul Dahlia i erau infectate cu virusul ptrii inelare i virusul mozaicului.
Meristemele cultivate au generat lstari tineri dintre care unii s-au dovedit a fi
liberi de virusuri. Acest prim succes a fost urmat de altele i a deschis calea
utilizrii acestei tehnici de cultur in vitro n horticultur.
Motivul pentru care meristemele sunt libere de virusuri nu este elucidat
n ntregime presupunndu-se c datorit ritmului alert de multiplicare a
celulelor la acest nivel genereaz o anumit imunitate sau poate c n lupta
pentru metabolii dat ntre celule i virusuri primele au mai mult succes. A
doua presupunere este verificat prin rezultatele obinute n urma aplicrii
termoterapiei, deoarece temperaturile ridicate avantajeaz multiplicarea
celulelor vegetale i reduce viteza de multiplicare a virusurilor. De fapt, studiile
au artat c n unele cazuri de infecie cu anumite virusuri rezultate notabile s-au

241
obinut doar dup combinarea celor dou metode: cultura de meristeme cu
termoterapia.
Aceast tehnic este aplicat doar la speciile ce permit nmulirea
vegetativ i favorizeaz diseminarea virusurilor. La speciile ce se nmulesc
generativ, riscul transmiterii prin intermediul seminei este foarte limitat, de
aceea regenerarea prin cultura de meristem este puin interesant.
Dup alegerea plantei donor se trece la prelevarea vrfurilor de cretere
din care, n condiii sterile, va fi izolat meristemul. n funcie de vrful de
cretere se va proceda la sterilizarea materialului vegetal nainte de izolarea
meristemelor. De exemplu, colii tuberculilor sau vrfurile de cretere ale
Saintpaulia sau Gerbera, trebuie sterilizate nainte de prelevarea meristemelor,
pe cnd mugurii de vi de vie, vrfurile vegetative ale garoafelor, crizantemelor
sau anghinrii nu necesit sterilizare, doar schimbarea instrumentarului, cu unul
sterilizat, dup fiecare operaiune. Explantele se sterilizeaz conform
metodologiei prezentate anterior i pstrate pn la fasonare i inoculare n
ultima ap distilat steril destinat cltirii. Excizia poate fi fcut la hota cu
flux de aer steril sau mai simplu pe o mas dezinfectat n prealabil. Un
binocular este indispensabil efecturii acestor operaiuni, magnitudinea optim
putnd fi de 20 sau 40x. Frunzele tinere sunt nlturate de pe explant prin tiere,
urmnd ca foliolele rudimentare s fie nlturate prin smulgere, iar meristemul
izolat cu ajutorul unui vrf de ac de sering sau cu un bisturiu cu vrf foarte fin.
Instrumentarul se schimb foarte des, dup fiecare operaiune, i se nlocuiete
cu unul sterilizat prin flambare. Cnd meristemul este vizibil (domul
meristematic cu o pereche de primordii foliare constituie n general meristemul
primar i are o culoare galben-verzuie transparent) se nltur cu foarte mare
grij i ultimele foliole i prin patru seciuni perpendiculare se izoleaz
meristemul. Ultima seciune transversal izoleaz meristemul, tierea trebuie
fcut imediat sub inelul central. Meristemul (0,2-0,3 mm) este preluat pe o
lam, ac de sering sau bisturiu cu lamela foarte fin i inoculat la suprafaa
mediului de cultur solid.
Toate operaiunile prezentate anterior trebuie fcute ntr-un timp ct mai
scurt pentru a evita deshidratarea i pentru a limita riscurile contaminrii.
n ce privete substratul nutritiv utilizat, n general, acesta trebuie s fie
suficient de bogat n elemente minerale, n special n potasiu, concentraia cruia
trebuie s fie mare ntr-un mediu destinat micropropagrii. Din acest punct de
vedere mediul Murashige-Skoog este optim.
Coninutul n zaharuri trebuie s fie ntre 2 i 6%, n funcie de specie.
Mai sunt necesare i alte componente de tipul microelementelor, vitaminelor i
cheailor de fier, n concentraii variabile.
Mediul de cultur artificial este solidificat, n general, cu agar (6 pn la
10mg/l), dar poate fi i lichid, caz n care schimburile dintre mediu i explant

242
sunt mai bune cu condiia asigurrii unei aerri optime (pentru a se evita
asfixierea explantelor), deci a unei agitaii corespunztoare.
Regulatorii de cretere sunt determinani n realizarea cu succes a unei
culturi de meristeme. n general, auxinele sunt indispensabile multiplicrii
celulare. Uneori se adaug i citochinine n concentraii foarte mici, n special
sub form de urme. Deseori sunt necesare i giberelinele pentru determinarea
alungirii axului principal, meristemele aparinnd grupului de explante de tip
organizat. Vasele optime culturii de meristeme sunt cutiile Petri, deoarece
volumul de aer de deasupra meristemelor trebuie s fie mic pentru a evita
deshidratarea acestora.
Dup inocularea meristemelor, vasele de cultur sunt plasate n camerele
de cretere la o intensitate luminoas de 1000 pn la 3000 de luci, la un
fotoperiodism de 16 ore lumin i 8 ore ntuneric i la temperaturi de 22-25oC.
n aceste condiii, dac mediul este favorabil, se va observa formarea
unor lstari care vor nrdcina sau nu, n funcie de specie. Dac plntuele sunt
complet formate, cum e cazul crizantemelor, garoafelor, violetelor de Parma sau
anghinrii, se poate trece la aclimatizarea lor sau pe mediu de multiplicare, n
cazul n care se dorete obinerea unui numr mare de plante. Dac plntuele nu
nrdcineaz, cum e cazul speciilor Actinia, Gerbera i trandafir, lstarii
regenerai se subcultiv pe mediu pentru nrdcinare, ce va conine doar
elementele minerale necesare fr fitohormoni sau cu adiie de auxine.
Din numrul total de meristeme inoculate se pierd mai multe sau mai
puine din mai multe cauze.
Prima cauz ar fi de ordin tehnic, procedeul de izolare al meristemelor
este dificil i delicat, rezultnd contaminri cu bacterii sau fungi (n medie de
aproximativ 5%). Mai mult, un numr nsemnat de meristeme se deshidrateaz,
iar la cele de dimensiuni foarte mici s-ar putea la seciunea final s se treac
prin inelul central al domului meristematic i astfel s se determine decesul
acestuia.
A doua cauz poate fi de natur fiziologic, condiiile n care au crescut
plantele donor prezentnd o importan deosebit. La speciile ierboase, se
ntlnesc deseori urmtoarele fenomene: cnd meristemul este prelevat de pe
axa principal de cretere, rata de regenerare este de 80-90%. n contrast,
aceast rat poate descrete pn la 5-10% atunci cnd meristemele sunt
prelevate din axele secundare cu creteri lente.
La speciile lemnoase aceast metod este dificil de aplicat deoarece
meristemele prelevate de pe ramuri aflate n faza de vegetaie se brunific n
contact cu mediul i mor. n acest caz, prelevarea meristemelor se face din
muguri dorminzi.
A treia cauz ar putea fi de ordin biologic, pe de o parte, dup cum se
tie, unele virusuri ajung i n domul meristematic, pe cnd unele sunt uor de
nlturat prin cultura de meristeme, iar pe de alt parte, la unele specii se poate
243
ntlni prezena bacteriilor pn n cele mai profunde straturi celulare (marea
majoritate nepatogene) ce se vor dezvolta ulterior n mediu infectnd cultura. De
exemplu, Hydrangea i Pelargonium gzduiesc multe bacterii ceea ce duce la
creterea ratei infeciilor in vitro (aproape de 99% uneori la Hydrangea).
Aceast caracteristic este observat i la speciile acaule (fr tulpin aparent.,
vine din franuzescul acaule, n greac a fr, kaulos tulpin), la care
meristemele sunt situate la nivelul solului.
Cauzele enumerate mai sus determin eliminarea a numeroase vase cu
infecii sau cu meristeme deshidratate, sau dac nu au aprut nici infecii i s-au
dezvoltat lstari trebuie verificat prezena virusurilor la nivelul esuturilor.
n cazul acestei tehnici, nu este att de important procentul de plante
regenerate ct numrul de plante libere de virusuri obinute, ce vor constitui
materialul biologic donor pentru regenerarea unui lot liber de virusuri.
Cultura de meristeme permite obinerea de plante sntoase i viguroase,
la care trebuie ns verificat cu rigurozitate dac s-au eliminat virusurile din
esuturi. Aceste controale se fac prin indexarea plantelor susceptibile de infecii
cu virusuri, la care se calculeaz n general trei indici. Dac aceti indici sunt
negativi, planta se consider liber de virusuri i poate trece pe mediile pentru
micropropagare. Aceste tehnici nu ne permit s afirmm c plantele sunt n
totalitate libere de virusuri, existnd ntotdeauna un oarecare risc. n afara
indexrii se pot efectua teste imunologice sau serologice, ce permit testarea
plantelor pentru virusurile cunoscute.
Controalele sanitare ofer informaii asupra prezenei sau absenei
virusurilor, dar nu indic calitatea genetic a plantelor. Oricnd pot aprea
mutaii, chiar dac din acest tip de explante modificrile genetice sunt foarte
rare. De aceea, nainte de a distribui plantele obinute prin cultura de meristeme,
la beneficiari, este recomandabil a se verifica dac sunt identice din punct de
vedere genetic cu planta donor.
Punerea la punct a acestei tehnici a indus o dezvoltare considerabil
culturilor in vitro i a permis descoperirea unei bariere pentru rspndirea
virusurilor printre speciile de importan propagate vegetativ. De asemenea,
aceast metod permite rejuvenilizarea unei specii, ducnd la obinerea de
descendeni viguroi.
Se presupune c fenomenul de rejuvenilizare este datorat tipului de
explant (civa milimetri de esut) care n urma exciziei pierde o parte din
memoria citoplasmatic construit de-a lungul existenei esuturilor parentale.
Trebuie subliniat faptul c dei aceast tehnic permite eliminarea virusurilor
din esuturi i obinerea de plante sntoase, plantele obinute nu sunt imune,
rmnnd susceptibile la atacul bolilor i duntorilor ca i prinii donor. De
aceea, este recomandabil s se evite recontaminarea materialului vegetal obinut,
i dac nu este posibil s se rennoiasc cu regularitate materialul semincer.

244
CAPITOLUL XI

11.1 MICROPROPAGAREA PLANTELOR

11.1.1 Consideraii generale

Spre deosebire de metodele de nmulire clasic, generativ i vegetativ,


micropropagarea plantelor prezint o serie de avantaje, care au impus-o n faa
primelor. Aceste avantaje ar putea fi urmtoarele:
-nmulirea in vitro este mult mai rapid dect cea in vivo, astfel c ntr-
un an dintr-un explant se pot obine peste un milion de exemplare;
-multe specii care nu pot fi nmulite in vivo sau care se nmulesc greu,
pot fi nmulite in vitro n urma parcurgerii unui proces de juvenilizare;
-creterea plantelor nmulite in vitro este mai puternic, fapt datorat
juvenilizrii i devirozrii. Astfel, Cameron i colab. (1986) au observat la
cpun, c creterea mai puternic a explantelor obinute in vitro se datoreaz
modificrilor survenite n schimburile gazoase ale acestora;
-este posibil obinerea i nmulirea plantelor libere de virusuri cu toate
avantajele care decurg de aici;
-plantele cultivate in vitro pot fi transportate n condiii de siguran
fitosanitar desvrite, putnd fi schimbate, exportate sau importate;
-pentru iniierea unei culturi in vitro este nevoie de o cantitate redus de
material biologic. Pentru amelioratori acest lucru este foarte important nct se
poate realiza o selecie drastic a materialului biologic i n plus se pot nmulii
indivizi deosebii obinui prin hibridri sau mutante aprute;
-se realizeaz importante economii de teren, spaiu, energie i
combustibil;
-ofer posibilitatea controlului total al factorilor de mediu, fapt ce duce
la creterea productivitii i eficienei culturilor i la nlturarea periodicitii
produciei determinat de efectul sezonier. Se poate, de asemenea, planifica
producia de plante obinute in vitro n funcie de necesitile concrete ale pieei;
-nmulirea in vitro permite obinerea plantelor pe rdcini proprii,
nlturnd altoirea cu toate dezavantajele pe care le presupune;
-materialul produs in vitro poate s fie conservat prin diferite metode i
folosit n momentul n care este cerut;
Pentru ameliorarea plantelor, micropropagarea ofer avantaje
suplimentare:
-se scurteaz timpul necesar producerii i lansrii unui soi;
-se pot obine i nmulii clone homozigote care s fie folosite pentru
obinerea hibrizilor F1;

245
-prin utilizarea agenilor mutageni n diferite faze i tipuri de culturi in
vitro se pot obine i seleciona mutante valoroase. Procedeul este folosit mai
ales la cultura de calus i la regenerarea de lstari adventivi din mezofil;
-prin cultura explantelor in vitro n condiii extreme se poate realiza
selecia la factorii de stres a genotipurilor noi (ex. selecia la aluminiu);
-manipulrile genetice de tipul hibridrilor somatice nu se pot concepe
fr folosirea culturilor de celule i protoplati in vitro;
-anumite plante necesit nmulire vegetativ exclusiv; haploizi,
mutante sterile, liniile mascule sterile folosite la hibridri, aneuploizi, sau
heterozigoi deosebii;
-materialul genetic valoros poate fi conservat n bnci de gene sub form
de explante in vitro.
Folosirea micropropagrii este limitat, n unele cazuri, de anumite
dezavantaje pe care aceasta le prezint:
-n anumite situaii, stabilitatea genetic a materialului nmulit in vitro
este redus;
-plantele nmulite in vitro prezint, uneori, defecte caracteristice i
dup ce sunt trecute in vivo: juvenilitate accentuat manifestat prin frunze
necaracteristice, prezena spinilor, lstrire adventiv, fructificare ntrziat,
vigoare exagerat, pierderea caracterului dominant;
-uneori, nrdcinarea explantelor nmulite in vitro este greoaie sau
imposibil. De regul, rdcinile formate in vitro au o funcionalitate redus ele
fiind nlocuite de alte rdcini n faza de aclimatizare;
-aclimatizarea plantelor obinute in vitro este, la unele specii, foarte
dificil datorit unor modificri morfo-anatomice i fiziologice care apar pe
durata cultivrii in vitro. Pentru realizarea aclimatizrii trebuie construite
structuri speciale sere, solarii, dotate cu dispozitive de control al factorilor de
mediu;
-clonarea exagerat favorizeaz creterea riscurilor de distrugere n mas
a unor clone de ctre rase virulente de boli i duntori aprute ulterior. Pentru
evitarea acestor situaii se va recurge la varianta nmulirii i plantrii
multiclonale;
-capacitatea regenerativ a explantelor poate s se reduc sau s se
piard prin subculturi repetate;
-n anumite situaii, sterilizarea total a materialului iniial este dificil
sau imposibil de realizat;
-micronmulirea in vitro presupune existena unor structuri specializate
i a unei fore de munc specializate.

246
11.1.2 Fazele multiplicrii in vitro

11.1.2.1 Pregtirea materialului biologic

Prima faz a micropropagrii este o etap important mai ales pentru


speciile lemnoase care trebuie s treac printr-o faz de juvenilizare. Aceasta se
poate realiza prin:
-tieri repetate, puternice, fiind stimulate astfel creterile noi;
-prin butire;
-prin altoiri repetate sau microaltoire.
Materialul biologic juvenil se poate obine prin germinarea seminelor
sau smburilor atunci cnd este posibil.
n acelai timp, faza de pregtire presupune cultivarea plantelor destinate
prelevrii de explante, n spaii nchise pentru prevenirea sau reducerea
contaminrilor sau pentru efectuarea unor tratamente fitosanitare eficiente.

11.1.2.2 Iniierea i stabilizarea

Faza de iniiere i stabilizare a culturilor in vitro presupune, sterilizarea


materialului biologic, izolarea explantelor i inocularea acestora pe un mediu de
iniiere. Mediile de iniiere sunt, n general, variante ale mediilor obinuite,
recomandate pentru specia respectiv, avnd ns concentraia de sruri redus
la jumtate. Frecvent se folosesc reete de medii lipsite de fitohormoni.
n aceast faz este important realizarea culturii aseptice i nceperea
creterii explantelor. Pentru depistarea infeciilor latente sunt necesare teste
suplimentare pe medii bogate n zaharuri, peptone, etc.

11.1.2.3 Multiplicarea

Faza de multiplicare se ntinde pe mai multe subculturi cu o durat de 3-


4 sptmni. n aceast faz scopul principal este creterea ratei de multiplicare
n condiiile meninerii stabilitii genetice a materialului biologic.
Aceasta se poate realiza, n general, prin creterea cantitii de
citochinine din mediu sau prin realizarea unei balane hormonale favorabile
citochininelor.
Numrul de subculturi trebuie s fie limitat, n funcie de specie, i orice
prelungire a fazei respective necesit verificri suplimentare a stabilitii
genetice a materialului.

247
11.1.2.4 nrdcinarea

Faza de nrdcinare sau de pregtire a materialului pentru trecerea in


vivo este o faz important care const n reducerea lstririi axilare, stimularea
alungirii lstarilor, inducerea formrii rdcinilor sau chiar formarea rdcinilor.
Frecvent, n aceast faz se folosesc medii de cultur adiionate cu
crbune vegetal, lipsite de hormoni sau cu concentraii ridicate de auxine. O alt
variant const n cultivarea pe un mediu cu o concentraie ridicat de auxine, o
anumit perioad, urmat de cultivarea pe un mediu fr hormoni. Foarte multe
laboratoare opteaz ns pentru realizarea nrdcinrii concomitent cu
aclimatizarea pentru a evita astfel pierderile de timp i reactivi.

11.1.2.5 Aclimatizarea

Este etapa cea mai dificil dintr-un protocol de micropropagare. Lstarii


nrdcinai sau cu primordii de rdcini sunt trecui n amestecuri de pmnt i
apoi meninui ntr-un spaiu caracterizat prin umiditate relativ ridicat i
temperatur controlat.
nainte de a fi folosit pentru plantare materialul sditor, att cel de pomi
fructiferi i vi-de-vie, ct i cel de arbori trebuie s petreac cteva luni n
cmp (pepiniere) pentru cretere i fortificare.

11.1.3 Cultura de meristeme i apexuri

Meristemele caulinare sunt folosite n mod normal pentru a fi cultivate


pe medii aseptice in vitro.
Datorit totipotenei de care dau dovad meristemele caulinare, ele vor fi
capabile s genereze n final plante ntregi.
n general, se folosesc pentru iniierea de culturi meristematice,
meristemele terminale i cele axilare (laterale). Acestea sunt capabile s
genereze in vitro plntue care sunt folosite apoi pentru nmulirea rapid.
Primele ncercri de cultivare a meristemelor caulinare i radiculare in
vitro au fost fcute n 1922 de ctre Kotte la mazre i de ctre Robbins la
porumb. Abia n 1946, Ball a reuit s obin plante din apexuri meristematice
de Lupinus albus i Tropaeollum majus. Ulterior, Wetmore i Morel, citai de
Cachia-Cosma (1984), au studiat comportarea meristemelor provenite de la
diferite specii, n diferite condiii de cultur.
Epoca optim pentru prelevarea meristemelor variaz de la caz la caz.
De regul se evit perioadele de laten a organelor, cnd activitatea
meristematic este redus.
La garoafe, cel mai mare procent de supravieuire l-au avut meristemele
recoltate primvara sau toamna devreme, pe cnd cele recoltate iarna au
248
nrdcinat mai uor, iar cele recoltate vara au prezentat cel mai ridicat grad de
devirozare.
La cartof, meristemele recoltate primvara i vara formeaz plante care
nrdcineaz mai bine dect cele recoltate n a doua parte a anului.
Prelevarea meristemelor se face dup sterilizarea prealabil a
materialului vegetal.
La speciile lemnoase care prezint meristeme protejate de catafilele
mugurilor, sterilizarea poate s se fac la concentraii mai ridicate ale agenilor
sterilizani.
Ulterior, prelevarea meristemelor se face la hot sub o lup binocular. Se
nltur treptat catafilele i primordiile frunzelor cu ajutorul bisturiului i a unor
ace spatulate pn se ajunge la domul meristematic. Excizarea acestuia se face
prin una sau dou tieturi urmrind detaarea unei cantiti ct mai reduse din
esutul aflat dedesubt.
Pentru uurarea lucrului, la mugurii vegetativi provenii de la speciile
lemnoase nainte de dezvelirea domului meristematic, sub lup, se poate
recurge la eliminarea prin patru tieturi paralele cu marginile mugurilor a
aproximativ 50% din volumul acestora. Tierea se va face antrennd i scoara
adiacent de pe ramur i nlturnd astfel i eventualele riscuri de infecie.
Dup detaare, meristemul este aezat uor de pe lama bisturiului pe
mediul de cultur. Se poate practica, cu ajutorul vrfului bisturiului, o uoar
incizie n masa mediului n care se va aeza meristemul.
Mediul de cultur folosit este, de regul, mediul solid, putndu-se ns
folosi i medii lichide, meristemele aezndu-se n acest caz, pe puni de hrtie
de filtru.
Frecvent se recomand reducerea coninutului de macroelemente la
jumtate (Standardi, 1982), iar pH-ul mediului variaz ntre 5,5 5,8.
Concentraiile de hormoni sunt reduse 0,1-0,5 m/l, auxinele i
citochininele fiind indicate pentru stimularea diviziunii celulare, iar giberelinele
pentru stimularea alungirii lstarilor.
Intensitatea luminoas variaz de la caz la caz, n general recomandndu-
se 2400-2600 luci, cu o fotoperioad de 16 ore lumin i 8 ore ntuneric. La
unele specii incubarea meristemelor la ntuneric timp de cteva zile (2-6) are ca
efect reducerea brunificrilor (Stnic i colab., 1992).
Exist situaii cnd intensitatea luminoas trebuie s ating valori
cuprinse ntre 3000-4000 luci sau chiar de 10000 luci la conifere. Uneori, se
recomand suplimentarea luminii fluorescente , cu lumin roie.
Temperatura optim este de 22-25oC, dar la unele specii (via-de vie)
incubarea meristemelor la temperaturi mai ridicate poate avea un efect mai
drastic n eradicarea virusurilor.
Dup nceperea formrii lstarilor din meristeme se trece la nmulirea
acestora, folosind cel mai adecvat procedeu n funcie de specie.
249
Astfel, se poate realiza minibutirea lstarului prin secionarea lui n
fragmente uninodale sau stimularea lstririi axilare i izolarea lstarilor
formai.
Avantajele folosirii meristemelor sunt multiple:
-posibilitatea nmulirii clonale a materialului biologic valoros;
-eliminarea bolilor i duntorilor periculoi;
-obinerea unui material juvenilizat cu capacitate mare de multiplicare;
-conservarea la temperaturi sczute a inoculior valoroi pn n
momentul folosirii;
-posibilitatea realizrii bncilor de gene.

11.1.4 Cultura de apexuri

Pe lng folosirea meristemelor , iniierea culturilor in vitro se poate


realiza prin folosirea unor apexuri de lstari. Vrful de cretere al lstarului,
nsoit de 1-2 frunze n formare, este detaat dup o prealabil sterilizare i
inoculat pe mediul de cultur. Cel mai bun moment pentru inoculare este
perioada de cretere intens a lstarilor.
Lstarii pot proveni de la plante cultivate n cmp sau n ser. n aceste
cazuri ns gradul de infectare a materialului este ridicat.
O soluie mult mai practic este obinerea lstarilor n laborator prin
punerea la forare a unor ramuri anuale. n acest scop, ramurile se fasoneaz n
butai de 10-15 cm, se parafineaz la vrf i eventual se dezinfecteaz prin
mbiere ntr-o soluie de fungicide. Se pun apoi n vase cu ap la temperatur
ridicat, n camera de cretere, urmnd ca n 10-14 zile mugurii s se deschid i
s formeze lstarii care vor fi folosii pentru prelevarea apexurilor.
n tabelele 11.1 i 11.2 sunt prezentate cteva din realizrile obinute prin
cultura de meristeme i apexuri la plantele horticole lemnoase, pomi i arbuti
fructiferi, arbori i arbuti ornamentali. Sunt indicate att mediile de cultur
folosite, ct i rezultatul cercetrilor.

11.1.5 Cultura de fragmente uninodale

Metoda const n secionarea lstarilor crescui in vitro n poriuni


uninodale urmat de cultivarea acestora pe un nou mediu de cultur.
Din mugurii axilari vor lua natere noi lstari care dup o anumit
perioad de timp vor fi secionai din nou.
Primele experiene privind cultura de fragmente uninodale, obinerea de
lstari i nrdcinarea acestora au fost efectuate de Galston (1947, 1948) i
Gorter (1965) la asparagus.

250
Tabelul 11.1
Culturi de meristeme i apexuri la pomii i arbutii fructiferi
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Rezultat Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Lstari axilari MS (1962) 30 - 1,8 ANA; Matheus i Rangan
Ananas
2 AIB; 2 KIN (1979)
comosus
Lstar unic MS (1962) 30 - 25% CM Zepeda i Sagawa (1981)
Lstar unic Rodriquez (1982 b) 5,5 30 6 1 AIB Rodriquez (1982 c)
K(h)
Castanea lstari Rodriquez (1982 b) 5,5 30 6 0,06 AIB; Rodriquez (1982 c)
sativa K(h) 1 BAP
Proliferare Vieitez i Vieitez 5,5 30 7 0,1 BAP Vieitez i Vieitez (1980
lstari (1980 b) b)
Citrus sp. Lstari axilari Bouzid (1975) A 5,8 30 8 1 ANA; Bouzid (1975)
i adventivi 1 KIN
Cocos Rizogenez DSouza (1982) BM 68,4 6,5 1-2 ANA; DSouza (1982)
nucifera 12% CM
Lstari Mullin i colab. 5,7- 30 glucoz - 2,5 AIA; Mullin i colab. (1974)
devirozai (1974) B 5,8 0,1 KIN
White (1954) - sruri 20 7 10% CM Miller i Belkengren
(1963)
Fragaria Adams (1972) 5,2 30 - 1 AIB; 0,1 BAP Adams (1972)
Proliferare Boxus (1974 a) 5,6 22 glucoz 7 1 BAP Boxus (1974)
lstari
Lstari Mullin i colab. 4,5 30 glucoz - 1 AIA Mullin i Schlegel (1976)
(1974)

251
Tabelul 11.1 (continuare)
Culturi de meristeme i apexuri la pomii i arbutii fructiferi
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Rezultat Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Proliferare MS (1962) 5,3 20 7 1,1 BAP Lane (1979)
Malus x lstari
domestica Proliferare Jones i colab. 5,2 30 7 1 AIB; 1 BAP; Snir i Erez (1980)
lstari (1977) 0,1 GA3
Musa Calus MS (1962) 30 6,5 0,3 AIA; 1 KIN; Ma i colb. (1978)
cavendishii
Lstari axilari Mante i Tapper 5,7 30 5-8 2 BAP Mante i Tapper (1983)
Musa textilis
i adventivi (1983)
Prunus Proliferare LS (1965) 5,8 30 7 0,5 BAP Norton i Norton (1986)
cerasifera lstari axilari
Rubus idaeus Cretere lstari Donnelly (1982) 5,7 30 - Donnelly i colab. (1982)
Lstari axilari Skirvin i Chu 5,8 30 10 0,1 ANA; 2 BAP Skirvin i Chu (1978)
Rubus sp.
(1978)
Vaccinium Proliferare Goldy i Lyrene 5,7 30 4 10 2IP; Goldy i Lyrene (1984)
sp. lstari (1984)
Lstari axilari Smagula i Lyrene 5,7 30 - 5 2IP Smagula i Lyrene
(1984) (1984)

252
Tabelul 11.2
Culturi de meristeme i apexuri la arbori i arbuti ornamentali
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Rezultat Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
nrdcinare Hackett (1970) 5,8 20 - 5-10 ANA sau Hackett (1970)
(sub lumin 10 AIA + 5,5
puternic) catechol
nrdcinare Hackett (1970) 5,8 20 - 10 AIA + 5,5 Hackett (1970)
Hedera helix
(sub lumin catecho
slab)
Lstari Polito i Alliata 5,6 20 8 0,5 ANA; 2 BAP Polito i Alliata (1981)
(1981)
Lavandula Calus Kharta (1974) 5,5 20 7 1 ANA; 4 BAP; Quazi (1980)
augustifolia 10% CM
Pinus nmugurire Bornman i Janson 5,6- 50,5 6-7 2,2 BAP; 1-2 2IP Bornman i Janson
sylvestris (1980) 5,8 (1980)
Syringa Dezvoltare Wetmore (1954) 20 10 15% CM Wetmore (1954)
vulgaris lstari
Weigela 4 lstari/expl. MS (1962) 30 6,5 2,25 BAP Calvert i Stephens
florida (1986)

253
Pentru realizarea acestei tehnici se pot folosi ca explante iniiale
meristeme, vrfuri de lstari (apexuri), muguri aflai la subsioara bracteelor la
unele tipuri de inflorescene, precum i alte organe capabile s genereze lstari
in vitro.
De regul, n mediul de cultur, nu se adaug citochinine care s anuleze
efectul dominanei apicale. Se urmrete de fapt, alungirea lstarilor pentru a
obine un numr ct mai mare de noduri.
Iniierea culturii este foarte important. n vederea stabilizrii trebuie
realizat juvenilizarea materialului iniial.
La speciile lemnoase un alt aspect important l reprezint necesitatea
ntreruperii dormansului mugurilor dup inoculare. Acest lucru este posibil prin
tratamente cu temperaturi sczute (0-5 oC), mrirea duratei perioadei de
iluminare (16 h), asociat cu temperaturi sczute, urmat apoi de creterea
temperaturii.
Uneori se recomand creterea concentraiei de citochinine i gibereline.
La speciile erbacee, dormansul se poate ntrerupe prin etiolarea
materialului.
Rata multiplicrii este direct proporional cu viteza de cretere a
lstarilor, respectiv cu numrul de frunze care se formeaz.
De regul, lstarii formai din apexuri cresc i se alungesc mai rapid
dect cei formai din muguri axilari. De aceea, ei sunt trecui n vase de cultur
separate.
Folosirea mediului de cultur n dublu strat (solid i lichid) a avut ca
efect accentuarea vitezei de cretere a lstarilor de gutui BA-29 (Stnic F. i
colab., 1996).
De asemenea, folosirea apei structurate, i a unor glico-steroizi naturali
(Ecostim) a stimulat creterea lstarilor de mr (Svulescu Anca i Stnic F.,
1996).
La liliac (Syringa vulgaris), stimularea creterii lstarilor este posibil
prin folosirea zeatinei sau a 2IP (Pierik i colab., 1986).
La Araucaria cunninghammii (Mott, 1981), la realizarea regenerrii, pot
fi folosii numai lstari ortotropi. La cafea, n schimb are loc o transformare a
lstarilor plagiotropi n ortotropi (Pierik, 1987).
Metoda de fa se folosete cu succes la foarte multe specii (vi-de-vie,
pr, trandafir, ieder, salcie pletoas), (tabelele 11.3 i 11.4).
Dup mai multe cicluri de multiplicare este necesar inducerea
nrdcinrii lstarilor obinui. Acest lucru este realizabil prin folosirea unor
tratamente cu auxine combinate sau nu cu incubarea la ntuneric.
n faza de alungire a rdcinilor, concentraia de auxine trebuie redus.

254
11.1.6 Cultura de lstari axilari

Aceast metod presupune, spre deosebire de cultura de fragmente


uninodale, stimularea creterii lstarilor axilari prin creterea concentraiei de
citochinine, fr stimularea alungirii lstarului mam.
Creterea concentraiei de citochinine are ca efect eliminarea dominanei
apicale a mugurelui. Acest lucru este posibil i prin eliminarea apexului
lstarului iniial.
Principiile acestei metode sunt cunoscute nc din 1925. Ea a fost
aplicat pentru prima dat de ctre Hackett i Anderson (1967) la garoafe, de
ctre Adams (1972) i Boxus (1973, 1974) la cpun i de Pierik (1973, 1974,
1975) i Murashige (1974) la gerbera. Dup descoperirea chinetinei, eliminarea
dominanei apicale a fost posibil prin folosirea acesteia, iar ulterior prin
utilizarea altor citochinine.
Frecvent, aceast metod de micropropagare este folosit n tandem cu
cultura de fragmente uninodale. Astfel, n prima etap dintr-un explant uninodal
se obine un lstar, apoi acest lstar este trecut pe un mediu cu un coninut
ridicat n citochinine i este stimulat formarea lstarilor axilari.
Cultura de lstari axilari are o serie de avantaje:
-este simpl;
-rata de multiplicare este relativ ridicat;
-stabilitatea genetic este asigurat;
-este unica metod de multiplicare in vitro eficient la plantele care cresc
n rozet (ex: cpun).
Necesarul de citochinine este diferit n funcie de specie. La multe specii
s-a observat scderea necesarului de citochinine odat cu creterea numrului de
subculturi datorit acumulrii acestora dar, mai ales datorit juvenilizrii
lstarilor.
Concentraia citochininelor trebuie corelat i cu stadiul de dezvoltare al
materialului biologic. Astfel, materialul juvenil necesit o cantitate mai redus
de citochinine n mediul de cultur dect cel provenit de la plante adulte
(Sequoia sempervirens, David, 1982).
Frecvent se recomand s se foloseasc medii cu concentraii sczute de
auxine i concentraii ridicate de citochinine. Raportul citochinine:auxine cel
mai recomandat este de 10:1.
Felul citochininelor folosite este i el important. Cele mai multe specii
reacioneaz bine la utilizarea BAP (benzil aminopurin) i mai puin bine la
chinetin sau 2-iP.
Tidiazuronul i compuii de substituie ai piridil-fenil-ureei stimuleaz,
uneori, mai mult lstrirea axilar dect citochininele (Read i colab., 1986).

255
n multe situaii se recomand distrugerea mugurelui apical i asocierea
acestei msuri cu aplicarea citochininelor. Pentru creterea eficienei metodei,
citochininele trebuie aplicate dup ce lstarul s-a alungit.
Creterea concentraiei de citochinine aduce, uneori, formarea calusului,
ceea ce trebuie evitat pentru a reduce probabilitatea apariiei variabilitii
somaclonale.
La unele specii (Ananas), formarea lstarilor este uneori stimulat de
folosirea mediului de cultur lichid.
De regul, capacitatea de proliferare scade odat cu creterea numrului
de subculturi, acest fenomen fiind frecvent nsoit i de formarea calusului.
Astfel, la cpun, de exemplu, depirea unui numr de 12 subculturi a
avut ca efect apariia unor modificri fiziologice majore.
Metoda lstririi axilare poate fi folosit att pentru plantele care cresc n
rozet ct i pentru plantele care formeaz lstari normali.
Mrirea concentraiei de citochinine din mediul de cultur, n vederea
stimulrii lstririi axilare, poate avea ca efect apariia fenomenului de tuf,
fenomen care poate continua i dup subcultivarea explantelor pe medii lipsite
de citochinine n vederea alungirii sau nrdcinrii.
n prezent, metoda este mult folosit la micropropagarea materialului
sditor pomicol, n multe ri fiind generalizat (Italia, Frana, Anglia).
n tabelele 11.5 i 11.6 sunt prezentate cteva din cercetrile efectuate n
micropropagarea prin lstrire axilar la plantele horticole lemnoase.

11.1.7 Organogeneza adventiv

Organele i esuturile cultivate in vitro n anumite condiii au capacitatea


de a diferenia centri meristematici care ulterior dau natere la lstari sau
rdcini, iar uneori la structuri de tip embrioid.
Formarea adventiv a lstarilor i rdcinilor poart denumirea de
organogenez. Aceasta poate fi de dou feluri: direct sau indirect, dup cum
organele respective se formeaz direct din explantele inoculate sau se trece
printr-o faz intermediar de calus.
n general, factorii care influeneaz pozitiv organogeneza i formarea
lstarilor adventivi sunt numeroi:
-plantele juvenile au o capacitate organogenetic ridicat; la
gimnosperme regenerarea de lstari adventivi este posibil doar folosind
embrioni, puiei tineri sau pri ale acestora (David, 1982);
-zaharurile stimuleaz organogeneza direct cu formarea de lstari;
-giberelinele i acidul abscisic inhib organogeneza;
-lumina stimuleaz, n general, procesul de organogenez.
Exist i o serie de specii care necesit o perioad de ntuneric.

256
Tabelul 11.3
Cultura de fragmente uninodale la arbori i arbuti ornamentali
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Rezultat Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Calus MS 20 6 3 ANA; Radojevic i colab.
Acer negundo
(1962) 15%CM (1980)
Betula Calus Chalupa 30 6 0,05 AIB; Chalupa
verrucosa (1981) 0,6 BAP (1981)
Paulownia Muguri axilari Ben-Jaacov i Dax 5,6 30 6,5 0,1 ANA; Burger i colab.
tomentosa (1981) 1 BAP (1985)
Quercus Lstari Chalupa (1984) 20 6 0,2-1 BAP Chalupa
robur BTM sau WPM (1981)
Lstari Morel i Martin 15 8 Daguin i Letouze
Salix (1955) Glucoz (1986)
babylonica Lstari Daguin i Letouze 15 8 Daguin i Letouze
(1986) Glucoz (1986)
Lstari Whitehed i Giles 5,8 20 6,5 0,01 ANA; Bhojwani
Salix
adventivi i 0,05 BAP (1980)
madsudana
axilari
Lstari axilari Chalupa 20 6 0,2-1 BAP; Chalupa
Tilia cordata (1984) WPM 0,1 ANA sau (1981)
AIB
Proliferare Stapfer i Heuser 5,6- 30 7 0,018-0,18 ANA Stapfer i Heuser
Vinca minor
lstari (1985) 5,8 14,4 BAP (1985)

257
Tabelul 11.4
Cultura de fragmente uninodale la pomi i arbuti fructiferi
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Rezultat Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Actinidia Lstari Harada 5,5 20 7 0,1 ANA; Harada
deliciosa nrdcinai (1975) 40 Ad; (1975)
Armeniaca 70% lstari Lloyd i McCown 5,2 20 6 2 2IP Snir
vulgaris (1981) WPM (1984)
Castanea Proliferare Yang 5,5 20 6,5 0,1 BAP Yang i colab.
mollissima lstari axilari (1986) (1986)
Proliferare San Jose 30 6 0,1 BAP San Jose i colab.
Castanea lstari axilari (1984) (1984)
sativa Proliferare Heinz i Mee 5,5 30 6 1 BAP Vieitez i Vieitez
lstari (1969) (1980 b)
Proliferare LS 5,7 30 10 1 BAP; Navarro i colab.
Citrus sp.
lstari (1965) 100 AdS; (1975)
Corylus Embriogenez Cheng 5,5 30 8 0,1-1 AIB Perez i colab.
avellana direct (1975) Basal (1986)
Juglans Multiplicare Driver i Kuniykuhi 5,5 30 2 0,001 AIB; Driver i Kuniykuhi
hindisii x J. lstari (1984) DKW gelrite 1 BAP; (1984)
regia
Lstari Chalupa 30 6 0,15 ANA; Chalupa
Juglans regia
(1981) 0,1 BAP; (1981)
Proliferare Rugini i Fontanazza 5,8 30 6 0,5 AIB; Rugini i Fontanazza
Olea europea
lstari (1981) 0,5 GA3; (1981)

258
Tabelul 11.4 (continuare)
Cultura de fragmente uninodale la pomi i arbuti fructiferi
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Rezultat Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Pyrus Lstar unic MS 5,8 30 8 0,45 BAP Shen i Mullins
communis (1962) (1984)
Lstar unic Snir 5,0 20 6,5 0,22 2,4 D Snir
Rubus idaeus (1981) 1 BAP; (1981)
0,1 GA3
Theobroma Proliferare Passey i Jones 5,2 30 7 0,2 BAP Passey i Jones
cacao lstari axilari (1983) (1983)
Lstari axilari Cohen i Elliot 5,7 30 6 5 2IP Cohen i Elliot
Vaccinium (1979) (1979)
corymbosum 1-2 lstari/expl. Lloyd i McCown 5,2 30 6 5 2IP Wolfe i colab.
(1981) WPM (1983, 1986)
Vaccinium Lstari axilari Smagula i Lyrene 5,7 30 4 5 2IP Smagula i Lyrene
sp. (1984) WPM (1984)

259
Tabelul 11.5
Cultura de lstari axilari la pomi i arbuti fructiferi
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Rezultat Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Plantule Lakshni Sita 5,8-6 20 9 1 ANA Lakshni Sita
(1974) (1974)
Ananas Plantule MS (1962) 30 6,5 Mapes (1973)
comosus Lstari multipli MS (1962) 30 - 1,8 ANA, 2 AIB, Matheus i Rangan
2 KIN (1979)
Cretere lstari 0,5 x MS (1962) 30 - 25%CM Zepeda i Sagawa (1981)
Castanea Proliferare Vieitez i Vieitez 5,5 30 6 1-2 BAP Vieitez i Vieitez
sativa lstari (1980) (1980)
Lstar unic MS (1962) 5,8 30 8 0,18 ANA, 0,1 Muriithi
BAP, 0,03 GA3 (1982)
Ficus carica
Proliferare LS (1965) 5,2 30 7 0,5 BAP, 0,1 Pontikis i Melas
lstari AIB, 0,1 GA3 (1986)
Cretere lstari Jones i Vine 5,6- 40 - Jones i Vine
Glossularia i rdcini (1968) 5,8 Glucoz (1968)
redinata Dezvoltare Jones i Vine 5,6- 40 - 1 AIB, 0,2 BAP, Jones i Vine
lstari (1968) 5,8 Glucoz 1 GA3 (1968)
Malus x 8 lstari/ LS (1965) 5,2 29,9 7 0,1 AIB, 0,99 Van Nieuwkirk i colab.
domestica explant BAP, 0,48 GA3 (1986)
Lstar unic Heinz i Mee 5,8 40 7 5 BAP Cronauer i Krikorian
Mussa sp.
(1979) (1984)
Proliferare Anderson 5,7 30 6 0,1 AIB, 4 BAP Anderson
Rubus idaeus
lstari (1978, 1980) (1979)

260
Tabelul 11.6
Cultura de lstari axilari la arbori i arbuti ornamentali
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Rezultat Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Clematis sp. Lstari multipli LS (1965) 30 6 10 BAP Kratz i Langhans (1978)
Cotoneaster Lstari multipli LS (1965) 5,8 30 7 1 BAP Norton i Boe
dammeri (1982)
Crataegus Lstari multipli LS (1965) 5,8 30 7 1 BAP Norton i Boe
rachzacantha (1982)
Fraxinus Lstari multipli Lloyd i McCown 5,2 20 Lichid 5-10 BAP Heiman i Preece
americana (1981) (1983)
Hydrangea 6 lstari/explant Gamborg 5,5 20 2 1,8 BAP Bailey i colab.
macrophylla (1968) gelrite (1986)
Proliferare Miller i Murashige 5,7- 20 7 1 BAP Stoltz (1984)
lstari (1976) 5,8
Lavandula Plantule Kartha (1974) 5,5 20 7 2 2,4D, 4 BAP, Quazi (1980)
augustifolia 10%CM
Proliferare Rumary i Thrope 5,9 30 8 Rumary i Thrope
Picea glauca
lstari (1974) (1984)

261
Rezultatele obinute de Standardi A, Ferradini Nicoleta, Stnic F.
(1996), au dovedit importana ntunericului n faza de inducie pentru stimularea
organogenezei adventive din limb foliar la portaltoiul de mr M-27:
-poziia explantului este de asemenea foarte important; n cazul
limbului foliar, la majoritatea speciilor, acesta trebuie aezat cu partea inferioar
pe mediu. Uneori se recomand crestarea nervurilor frunzei nainte de inoculare;
-fitohormonii influeneaz organogeneza n mod diferit; exist specii
care nu necesit aport suplimentar de auxine sau citochinine n mediu pentru
declanarea organogenezei chiar dac aceste substane stimuleaz apoi acest
proces;
-marea majoritate a speciilor formeaz lstari adventivi n prezena
citochininelor n timp ce auxinele inhib procesul. Uneori acest lucru este
posibil i atunci cnd este vorba de explante de tipul peiolului, rdcinilor sau
internodurilor (Stnic F., 1995);
-cea mai folosit citochinin este BAP, iar pentru gimnosperme este
singura recomandat. Celelalte citochinine sunt mai puin utilizate;
-concentraii ridicate de citochinine (n special BAP) poate determina
dereglarea procesului de organogenez. Se recomand n aceast situaie
alternarea culturii pe dou medii cu concentraii diferite;
-zeatina a avut un rol important n procesele de organogenez la kiwi
pornind de la diferite tipuri de explante (Stnic F. i colab., 1995, 1998). De
asemenea TDZ (tidiazuronul) i 2 iP (2 izopenteniladenina) au determinat
efecte spectaculoase de stimulare a lstririi adventive;
-adenina sulfat poate stimula organogeneza adventiv la ulm (Jacquiot,
1951). n combinaie cu citochininele, adenina sulfat a stimulat formarea
lstarilor adventivi (Skoog i Miller, 1975; Nitsch i colab., 1969);
-acidul abscisic inhib formarea lstarilor adventivi la marea majoritate a
speciilor;
-substanele antiauxinice, cele care inhib transportul auxinelor au ca
efect stimularea organogenezei adventive;
-vitaminele stimuleaz formarea lstarilor adventivi la ulm (Jacquiot,
1951);
-infectarea materialului iniial cu Agrobacterium tumefaciens rasa C58, a
stimulat organogeneza adventiv la plop (Steffen i colab., 1986). Efectul s-a
datorat i juvenilizrii materialului iniial datorit aciunii bacteriei.
n tabelele 11.7 i 11.8 sunt prezentate cteva din rezultatele obinute n
organogeneza adventiv la pomi, arbuti fructiferi, arbori i arbuti ornamentali.

262
Tabelul 11.7
Organogeneza adventiv de lstari la pomi i arbuti fructiferi
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Explant Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Fragmente Harada (1975) 5,5 20 7 1 Z, 40 Ad Harada (1975)
rdcini
Actinidia Fragmente MS (1962) 30 6,5 1Z Kwei i colab.
deliciosa lstari (1980)
Fragmente Monette (1986) 5,7 22,5 7 0,023 AIB, 2 Monette (1986)
lstari BAP, 60 AdS
Lstari Hisajima (1982) 5,5 30 6 0,0225 BAP Hisajima (1982)
Lstari Hisajima (1982) 5,5 30 6 0,0225 BAP, Hisajima (1982)
0,005 AIB
Amygdalus
Lstari MS (1962) 5,8 30 9 0,1 ANA, 0,7 Ruginii i Verma
communis
BAP (1982,1983)
Calus Matheus i Rangan 30 6,5 5%CM Matheus i Rangan
(1981) (1981)
Ananas Lstari 0,5 x MS (1962) 30 - 0,5-1 AIB Zepeda i Sagawa
comosus (1981)
Armeniaca Fragmente Skirvin (1980) 5,7 20 6,5 Skirvin (1980)
vulgaris lstari
Castanea Epicotil San Jose (1984) 30 6 0,1 AIB, 2 BAP San Jose (1984)
sativa
Cerasus Fragmente Jones (1977) 5,2 30 7 0,1 AIB, 1 BAP, Seirlis i colab.
avium lstari 0,1 GA3 (1979)

263
Tabelul 11.7 (continuare)
Organogeneza adventiv de lstari la pomi i arbuti fructiferi
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Explant Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Fragmente Skirvin 5,7 20 6,5 Skirvin i colab.
Cerasus lstari (1980) (1980)
vulgaris Lstari Skirvin i Chu 5,7 30 6,5 0,1 ANA, 2 BAP Skirvin i colab.
(1978) (1981)
Fragmente Hoagland i Snyder - - Murashige i colab.
rdcini (1933) (1972)
Citrus sp.
Fragmente Kitto i Young 5,6- 30 -40 10 5 BAP, 80 AdS Kitto i Young
lstari (5 cm) (1981) 5,8 (1981)
Calus Radojevic 20 8-10 1 KIN, 2 Ad Radojevic
Corylus (1975) (1975)
avellana Calus Radojevic 20 8-10 1 KIN, 2 Ad, Radojevic
(1975) 1GA3 (1975)
Diospyros Calus Yokoyama i 5,6- 30 7 1 ANA, 0,1-1 Yokoyama i Takeuchi
kaki Takeuchi (1976) 5,8 KIN (1976)
Fragmente MS (1962) 5,6 30 7 0,2-1 AIB, 1,1 Anderson i colab.
Fragaria
lstari BAP, 1 GA3 (1982)
Glossularia Fragmente MS (1962) 5,5 30 6 0,1 AIB, 0,49 Walender (1985)
redinata lstari BAP
Lstari Chalupa (1981) 30 6 0,1-0,3 ANA, Chalupa (1981)
0,1-0,6 BAP
Juglans regia
Semine 0,5 x Rodriguez 5,5 30 6 9 BAP Rodriguez
(1982) (1982)

264
Tabelul 11.7 (continuare)
Organogeneza adventiv de lstari la pomi i arbuti fructiferi
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Explant Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Fragmente Jones (1977) 5,2 30 7 0,1 AIB, 1 BAP,0,1 Jones (1977)
lstari GA3
Cotiledon Kartha (1974) 5,8 30 8 1 ANA, 0,3 BAP Liu i colab. (1983)
Calus Kartha (1974) 5,8 30 8 1 BAP Liu i colab. (1983)
Calus din White (1943) 20 6,5 4 ANA, 2 KIN, 1 Mehra i Sachdeva
cotiledon GA3, 15%CM (1979)
Malus x Calus din White (1943) 20 6,5 2 ANA, 2 BAP, Mehra i Sachdeva
domestica embrion 15%CM (1979)
Lstari Jones (1977) 5,2 30 7 1 AIB, 1 BAP, 0,1 Snir i Erez
GA3 (1980)
Lstari LS (1965) 5,2 29,9 7 0,1 AIB, 0,48 GA3 Van Nieuwkirk
i colab.(1986)
Muguri Zimmerman 20 7 0,01 AIB, 0,09 BAP Zimmerman
dorminzi/lstar (1984) (1984)
Fragmente Lakshmi-Sita 5,6 30 8 1 BAP Oka i Ohyama
lstari (1976) (1981)
Morus alba Fragmente Lakshmi-Sita 5,6 30 8 10 BAP Oka i Ohyama
lstari (1976) (1981)
Muguri MS (1962) 5,6 30 8 10 BAP Oka i Ohyama (1981)
Musa Lstari Krikorian i Cronauer 5,8 40 - 4,95 BAP, 10%CM Krikorian i Cronauer
acuminata (1984) (1985)

265
Tabelul 11.7 (continuare)
Organogeneza adventiv de lstari la pomi i arbuti fructiferi
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Explant Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Musa Calus MS (1962) 30 6,5 0,3 AIA, 1 KIN Ma i colab.
cavendishii (1978)
Lstari Heinz i Mee (1979) 5,8 40 7 5 BAP Cronauer i Krikorian
Musa spp.
(1984)
Lstari Mante i Tepper 5,7 30 5-8 0,1 AIB, 3-5 BAP, Mante i Tepper
Musa textilis
(1983) 160 AdS (1983)
Persica Lstari Miller (1982) 20 8 0,1 ANA, 2 BAP Miller (1982)
vulgaris Lstari Skirvin i Chu (1978) 5,7 30 6,5 0,1 ANA, 2 BAP Skirvin i Chu (1978)
Fragmente LS (1965) 5,7 30 8 0,1 2,4D sau ANA, 3 Tisserat i colab.
lstari 2-Ip, 40 AdS (1979)
Phoenix Calus Thompson i Gordon 5,6- 30 8 Tisserat i colab.
dactylifera (1977) 5,8 (1982)
Fragmente Tisserat (1984) 5,6- 30 8 10 2,4D Tisserat i colab.
lstari 5,8 (1984)
Semine 0,5 x MS (1962) 5,8 - - Barghchi i Alderson
(1983)
Lstari MS (1962) 5,8 - 7 4 BAP Barghchi i Alderson
Pistacia vera
(1983)
5-8 mm lstari MS (1962) 30 7 4 BAP Barghchi i Alderson
(1985)

266
Tabelul 11.7 (continuare)
Organogeneza adventiv de lstari la pomi i arbuti fructiferi
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Explant Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Fragmente Pietropaolo i Reisch 5,8 30 7 1,1 BAP Pietropaolo i Reisch
Prunus lstari (1984) (1984)
domestica Fragmente Skirvin (1980) 5,7 20 6,5 Nu sunt menionai Skirvin (1980)
lstari
Prunus Fragmente Jones (1977) 5,2 30 7 0,1 AIB, 1 BAP, 0,1 Jones i Hopgood
insititia lstari GA3 (1979)
Fragmente Lane (1979) 5,2 30 7 1,13 BAP Lane (1979)
lstari
Pyrus Fragmente MS (1962) 5,8 30 8 1,36-2,25 BAP, 1,1 Z; Shen i Mullins
communis lstari 1,02 2-iP (1984)
Fragmente LS (1965) 5,7- 30 6 2 BAP Singha (1982)
lstari 5,8
Fragmente MS (1962) 5,7 20 6 1,35 BAP Flegmann i
lstari Wainwright (1981)
Ribes nigrum
Fragmente Jones i Vine (1968) 5,6- 40 - Jones i Vine (1968)
lstari 5,8 Glucoz
Lstari Donnely (1980) 5,7 30 6,5 0,1 AIB; 1 BAP Donnely (1980)
Lstari Snir (1981) 5 20 Gelrite 0,22 2,4D; 1 BAP; 0,1 Snir (1981)
Rubus idaeus GA3
Lstari cu Welander 5,2 30 6 1 BAP Welander
noduri (1985) (1985)

267
Tabelul 11.8
Organogeneza adventiv de lstari la arbori i arbuti ornamentali
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Explant Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Acer rubrum x Fragmente MS (1962) 5,7 30 10 0,1-0,5 Thidiazuron Kerns i Meyer (1985)
Acer saccharum lstari
Calus Simola (1985) 5,6 20 6 5-10 Z; 0,1-0,2 ANA Simola (1985)
Calus Srivastava i 5,8 40 6 2 AIA; 6 KIN; 40 Ad Srivastava i
Steinhauer (1981) Steinhauer (1981)
Betula pendula
Frunze Srivastava (1985) 5,8 30 6,5 2 AIA; 5 Z; 2 GA3 Srivastava (1985)
Fragmente Srivastava (1985) 5,8 30 6,5 0,5 ANA; 5 2 iP; 30 Srivastava (1985)
lstari Ad
Calus Chalupa (1981) 30 6 0,05 AIB; 0,2 BAP; Chalupa (1981)
Betula verucosa
20 AdS
Biota orientalis Hipocotil Thomas i Tranvan 5,4 30 8 0,1 AIB; 1,1 BAP Thomas i Tranvan
(thuja) (1982) (1982)
Chaenomeles Fragmente LS (1965) 5,8 30 7 2,5 BAP Norton i Boe
japonica lstari (1982)
Crataegus Fragmente LS (1965) 5,8 30 7 0,1-1 BAP Norton i Norton
rachyacantha lstari (1986)
Fraxinus Fragmente Lloyd i McCown 5,2 20 6 0,5 1 BAP Heiman i Preece
americana lstari (1981) (1983)

268
11.1.8 Embriogeneza somatic

Embriogeneza somatic a fost realizat pentru prima dat, n anul 1958,


de Reinert i Steward, la morcov, din calus i suspensie de celule. Tot ei au
realizat o paralel ntre formarea embrionilor zigotici i a celor somatici, fapt
uurat de folosirea laptelui de cocos n mediul de cultur.
Thomas i colab. (1979) au reuit inducerea de embrioni somatici la
elin, o alt reprezentant a familiei Umbeliferae.
n formarea embrionilor somatici se disting mai multe etape:
-dediferenierea celulelor difereniate i nceperea diviziunii;
-formarea celulelor parenchimatice, nceperea diviziunii i creterea
coninutului de citoplasm sub influena auxinelor. Astfel are loc transformarea
celulelor parenchimatice n celule embriogene. Acestea sunt mici, cu coninut
dens de citoplasm, vacuol mic, nuclei mari cu nucleoli mari i un coninut
ridicat de grunciori de amidon. Au activitate metabolic intens i de asemenea
o sintez a ARN-ului;
-formarea embrionilor din celule embriogene n absena auxinelor n
mediu.
Formarea embrionilor somatici se poate face n interiorul calusului, sau
la exteriorul acestuia. Embrionii somatici se mai pot forma n esutul nucelar i
hipocotil, sau pe organe florale, antere, grunciori de polen, endosperm,
embrioni zigotici. Embrionii somatici se formeaz dintr-o singur celul care se
divide i formeaz o structur embrioid.
S-a reuit inducerea embriogenezei somatice la 132 specii din 81 de
genuri, aparinnd familiilor: Ranunculaceae, Rutaceae, Solanaceae,
Umbeliferae, Gramineae (Tisserat i colab., 1979, citai de Pierik, 1987).

11.1.8.1 Embriogeneza somatic direct

Embriogeneza somatic direct const n formarea embrionilor somatici


sau a esuturilor embrionare direct din explantul inoculat iniial. Embrionii
somatici se pot forma din celule somatice, din celule nucelare la specii
aparinnd genului Citrus, din celule epidermice i hipocotil de morcov sau
Brassica napus.
n vederea inducerii i studierii embriogenezei somatice cel mai frecvent
se recurge la culturi de embrioni zigotici imaturi. esutul acestora are un
pronunat caracter embriogenic. Momentul optim pentru izolarea i inocularea
embrionilor zigotici in vitro este la aproximativ 14 zile de la polenizare.
Ca substrat nutritiv se folosesc medii de cultur care conin cantiti
variabile de auxine, n special ANA i 2,4D.
Dup sterilizare se face excizarea embrionului imatur i inocularea lui pe
mediu. Dup aproximativ o sptmn, la o parte dintre explante ncep s se
269
diferenieze embrioni somatici n diferite stadii de dezvoltare. Fazele de evoluie
ale embrionilor somatici sunt: globular, cordiform, de torpil i cotiledonar.
Se poate observa dezvoltarea asincron a embrionilor, ceea ce poate determina
suprapunerea diferitelor faze ale evoluiei.

11.1.8.2 Embriogeneza somatic indirect

Tehnica de micropropagare care const n formarea embrionilor somatici


din calus se numete embriogenez somatic indirect. Dup obinerea i
multiplicarea calusului acesta este trecut pe un mediu de inducere i formare a
embrionilor somatici.
Capacitatea de regenerare din calus depinde de specie, tipul de explant
utilizat iniial, vrsta explantului sau numrul de subculturi.
Inducerea embriogenezei somatice este condiionat de un numr
nsemnat de factori:
-concentraia ridicat de auxine (mai ales 2,4 D), determin inducerea
embrionilor somatici;
-acidul abscisic stimuleaz formarea embrionilor somatici n culturile de
calus sau n suspensiile celulare;
-giberelinele i etilena inhib inducerea formrii embrionilor somatici;
-probabilitatea formrii embrionilor somatici crete la esuturile juvenile.
La speciile genului Citrus embrionii se formeaz numai n nucel;
-azotul redus sub form de ioni de amoniu, potasiul i concentraia
ridicat de sruri stimuleaz formarea celulelor embriogene n masa calusului; n
acelai timp, ionii de calciu influeneaz negativ acest proces;
-lumina este un factor stimulator al embriogenezei somatice, existnd
ns i specii care reacioneaz mai bine la ntuneric;
-temperatura ridicat, este un alt factor care stimuleaz formarea
embrionilor somatici; la cultura de antere, n vederea inducerii embrionilor
somatici, este necesar, la nceput, un oc cu temperaturi sczute;
-prezena n mediul de cultur a zaharozei (2-3%) i a laptelui de cocos
are un efect pozitiv asupra inducerii embrionilor somatici.
Ca urmare a capacitii mai reduse de a forma embrioni somatici, la
speciile horticole lemnoase, aceast tehnic de micropropagare este folosit mai
puin (tabelele 11.9 i 11.10).
La speciile de conifere se studiaz posibilitatea extinderii acestei metode
pentru nmulirea rapid, pornind de la embrioni zigotici i trecnd prin faza de
calus embriogen. Rata de multiplicare este ridicat i rezultatele obinute pn n
prezent sunt ncurajatoare (Palada Nicolau Magdalena, 1994).

270
Tabelul 11.9
Embriogeneza somatic la pomi i arbuti fructiferi (dup Stnic, 1999)
Denumirea Explant Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Actinidia Fragmente de Harada (1975) 5,5 20 7 0,1-1 2,4D; 40Ad Harada (1975)
deliciosa rdcini
Semine Litz (1984) 5,7 30 - Litz (1984)
Mangifera imature
indica Fructe Litz (1984) 5,7 60 8 1 2,4D Litz (1984)
imature
Fragmente de LS (1965) 5,7 30 8 10 2,4D; 3 2iP; 40 Tisserat (1979)
lstari AdS
Pheonix Muguri Thompson i Gordon 5,6- 30 8 10 2,4D; 3 2iP Tisserat (1982)
dactylifera laterali (1977) 5,8
Calus Tisserat (1984) 5,6- 30 8 Tisserat (1984)
5,8

Tabelul 11.10
Embriogeneza somatic la arbori i arbuti ornamentali (dup Stnic, 1999)
Denumirea Explant Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Hedera helix Calus Banks (1979) 5,7 30 5 1 ANA; 0,5 BAP Banks (1979)
Ilex aquifolium Embrioni LS (1965) 5,6 40 10 Hu i Sussex (1972)
Calus Nagmani i Bogna 5,8 20 8 2 BAP Nagmani i Bogna (1985)
Larix decidua
(1985)
Calus Von Arnold i Erikson 5,8 34,2 5 2,2 2,4D; 1,1 BAP Hakman i colab., (1985)
(1981)
Picea abies
Embrioni Von Arnold i Erikson 10 3 2,21 2,4D; 1,13 Von Arnold i Hakman
maturi (1981) gelrite BAP (1986)
Quercus rubra Internod MS (1962) 30 6,5 5 ANA; 0,1 BAP Seckinger i colab. (1979)

271
11.1.9 Poliembrionia nucelar

O serie de specii din genul Citrus formeaz n mod natural, n aceeai smn, pe
lng embrionul zigotic i unul sau mai muli embrioni somatici. Aceti embrioni iau natere
din celule somatice diploide ale esutului nucelar. esutul nucelar este un esut juvenil
caracterizat printr-o mare capacitate de regenerare. Prin cultivarea esutului nucelar in vitro i
inducerea formrii calusului s-au obinut un numr mare de embrioni9 somatici la genul
Citrus (Rangaswamy, 1981).
Formarea embrionilor somatici prin embriogenez direct sau indirect a fost posibil
prin cultivarea in vitro a unor ovule fecundate sau nefecundate de Citrus (Litz i colab.,
1985).
Embriogeneza somatic din esut nucelar este prezent la mango (Mangifera indica) i
la alte specii pomicole tropicale. La fel ca n cazul citricelor, speciile cu tendine de
poliembrionie in vivo au o capacitate ridicat de regenerare a embrionilor somatici in vitro.
Utilizarea poliembrioniei nucelare prezint o serie de avantaje: permite nmulirea n
mas a speciilor monoembrionare; procesele de embriogenez somatic sunt nsoite i de
devirozarea materialului vegetal obinut; n paralel, se pot induce mutaii i se pot seleciona
mutantele utile; se realizeaz juvenilizarea materialului obinut. n toate cazurile, folosirea
pentru nmulire a embrionilor somatici care conserv caracteristicile genetice ale plantelor
mam, deschide mari perspective n domeniul seminelor artificiale (Standardi, 1998).

11.1.10 Embriocultura

Cultura embrionilor zigotici a aprut ca necesitate pentru rezolvarea unor probleme


aprute n procesul ameliorrii plantelor horticole.
n pomicultur, apare posibil cultivarea pe medii aseptice a unor embrioni imaturi
care provin prin ncruciri de la soiuri extratimpurii i timpurii de smburoase. n mod
natural, aceti embrioni nu ajung la maturitate datorit unor dereglri fiziologice care apar n
procesul de cretere a seminei i fructului. n mod similar, n cazul unor hibridri
interspecifice are loc avortarea embrionilor naintea ajungerii lor la maturitate (Stnic F.,
Dumitracu Monica, Ion Ligia, 1977).
La via-de-vie nu este posibil obinerea unor descendeni hibrizi atunci cnd se
folosete ca genitor matern un soi apiren i n acest caz, embrionul avortnd timpuriu. Situaii
oarecum similare se ntlnesc i la realizarea unor combinaii hibride sau ncruciri ntre
soiuri, specii sau genuri incompatibile.
Prin extragerea embrionului abia format cu o poriune de esut nucelar, sau prin
cultivarea ovulului fecundat se reuete s se depeasc barierele incompatibilitii.
Un alt caz particular este reprezentat de cultivarea embrionilor maturi. Metoda se
folosete pentru scurtarea procesului de ameliorare prin eliminarea perioadelor de repaus
relativ al seminelor.
De asemenea, n cazul unor combinaii hibride valoroase se face nmulirea
materialului genetic nainte de realizarea seleciei in vitro, sau materialul hibrid este supus
unor procese de stres, nainte de a fi aclimatizat i trecut n cmp.
Momentul nceperii culturii variaz de la specie la specie n funcie de scopul urmrit.
Astfel, la cire, la 28-35 zile de la nflorire, la viin, la 29-41 zile i la piersic la 81-97 zile.
Un alt indiciu folosit este reprezentat de mrimea cotiledoanelor la piersic, momentul
optim fiind cnd acestea ating 4-5 mm n diametru.
La cire se mai recomand iniierea culturii n momentul ntririi smburelui, dup
aceea viabilitatea embrionilor scznd pn la momentul intrrii n prg. Stabilizarea

272
culturilor de embrioni este relativ uoar datorit faptului c smburii sau seminele protejate
de endocarp sau tegumente pot fi sterilizate la concentraii ridicate.
Compoziia mediului de cultur este cu att mai complex cu ct embrionii se afl
ntr-un stadiu de dezvoltare mai timpuriu.
Dup inoculare, embrionii se las la ntuneric timp de 30-60 zile la temperatura
camerei pentru germinare, dup care sunt trecui la lumin.

11.1.11 Microaltoirea in vitro

Const n altoirea n condiii aseptice a unui apex meristematic pe un portaltoi obinut


din semine sau din minibutai.
Portaltoii folosii trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:
-s posede semine cu o bun capacitate germinativ pe mediile de cultur;
-minibutaul s aib esuturi elastice i turgescente;
-minipuietul s posede cambiu activ, uor depistabil;
-esuturile s fie rezistente la oxidare;
-s posede un aparat radicular bine format, capabil s creasc n mediul de cultur.
Portaltoiul poate fi obinut din semine. n acest sens seminele sunt scoase din starea
de laten fie prin tratamente cu fitohormoni (citochinine i gibereline), sau prin tratamente cu
temperaturi sczute. Se nltur apoi endocarpul, iar apoi se determin viabilitatea seminelor
prin imersie timp de cteva ore, a unor probe de semine ntr-o soluie de clorur de 2,3,5
trifenil-tetrazoliu, 1%. Viabilitatea seminelor este evideniat prin culoarea esuturilor
seminelor n culoare rou intens.
Materialul este apoi sterilizat prin imersie n alcool 70% cca 1 min., urmat de imersia
n hipoclorit de sodiu 7% timp de 20 minute, iar n final se cltesc seminele n cinci reprize
cu ap distilat steril.
Germinarea seminelor se face pe mediu Murashige-Skoog solidificat cu 7 g/l agar.
Incubarea se face la 22-24oC, la ntuneric.
Portaltoii se pot obine i din minibutai, care, sub form de fragmente uninodale se
preleveaz de pe plante libere de viroze.
Pregtirea altoiului. Altoiul const dintr-un apex meristematic provenit fie din lstari
crescui in vitro, fie de la lstari sau ramuri in vivo.
Altoirea propriu-zis se face prin nlturarea cotiledoanelor de la portaltoii obinui din
semine care apoi sunt secionai transversal. Se secioneaz de asemenea, transversal
portaltoii vegetativi. Apexul meristematic, de dimensiuni foarte reduse se detaeaz i se
aeaz pe zona cambial a portaltoiului secionat.
Planta altoit se trece apoi ntr-un vas steril, pe mediu lichid pentru a asigura o atmosfer
saturat n umiditate. Aclimatizarea se realizeaz cnd minialtoiul atinge 1,5-2,5 cm lungime,
prin transplantarea plantei altoite n condiii normale (Stnic, 1999).

273
CAPITOLUL XIV

14.1 TRANSFERUL PLANTELOR DE PE MEDIUL DE CULTUR


N SOL ACLIMATIZAREA

O plant provenit din cultura in vitro difer din multe puncte de vedere de una
provenita din mediul in vivo (Fossard, 1977; Grout si Aston, 1978; Grout si Debergh, 1982;
Sutter, 1985) prin urmtoarele aspecte:
1. La plantele crescute n condiii in vitro stratul de cear (cuticular) de la suprafaa
frunzelor i tulpinilor este foarte slab dezvoltat deoarece umiditatea relativ ntr-un vas de
cultura este de 90-100%, iar plantele nu au avut nevoie s se protejeze mpotriva deshidratrii.
Acest fapt are repercusiuni nefaste pentru plantulele transferate direct in vivo, care vor suferi
pierderea unei cantiti mari de apa din esuturi, deoarece umiditatea aerului in vivo este mult
sczut comparativ celei in vitro. Frunzele unei plante regenerate in vitro sunt moi, subiri i
prezint o activitate fotosintetic mult redus, deoarece i pot procura carbonul necesar din
mediul de cultur i anume din zaharurile din mediul de cultur, astfel c, atunci cnd o
plantul regenerat in vitro va fi trecut in vivo va trebui s se readapteze la o activitate
fotosintetic intens. De asemenea, frunzele plantelor provenite din cultura in vitro prezint,
pe lng un numr sczut de celule palisadice, necesare pentru captarea eficient a luminii, i
multe spaii aerifere n mezofil. Stomatele lor nu funcioneaz normal, iar trecerea plantelor
de la mediul in vitro la cel in vivo constituie sursa cea mai important de stres hidric. n
culturile de celule conexiunile vasculare, dintre lstari i rdcinue, sunt slab dezvoltate, ceea
ce duce de asemenea la o slab circulaie a apei dintr-o parte a plantei n alta. Plantele in vitro
au o hrnire heterotrof, pe cnd cele in vivo au o hrnire autotrof, acest fapt constituind un
alt factor de stres pentru plntuele transferate n sol. Ele trebuie s-i dezvolte activitatea
fotosintetic pentru a-i putea procura carbonul necesar.
Din cele de mai sus se poate concluziona c aclimatizarea plantulelor trebuie s fie un
proces lent, care s permit trecerea treptat a plantelor de la condiiile in vitro la cele in vivo,
ceea ce presupune adaptarea la o umiditate relativ sczut, la dezvoltarea mecanismelor de
nchidere i deschidere a stomatelor, la accelerarea procesului fotosintetic. Wardle i colab.
(1983) au demonstrat c scderea umiditii aerului in vitro la Brassica oleracea Botrytis a
dus la formarea unei pelicule de cear mai groas pe stratul cuticular, ceea ce a condus la o
evaporare cuticular mult sczut i la creterea procentului de plante aclimatizate.
Aclimatizarea poate fi fcut prin generarea unei umiditi crescute n mediul in vivo
unde vor fi transferate plantulele provenite din mediul in vitro, prin utilizarea unor aparate
speciale, generatoare de cea, i prin meninerea unei luminoziti i temperaturi relativ
constante i sczute. O alt metod de aclimatizare prevede lsarea vaselor de cultur
deschise, ntr-un mediu steril, pentru a permite aclimatizarea treptat a plantulelor la condiiile
exterioare. De asemenea, mai este posibil folosirea unor substane antiperspirante, care sunt
pulverizate pe frunzele plantulelor transferate n sol, reducnd astfel procesul de evaporare al
apei din esuturi (Sutter i Hutzel, 1985), dei aceast metod poate avea i efecte adverse.
2. Rdcinile plantelor provenite din cultura in vitro sunt mai vulnerabile i nu
funcioneaz foarte bine in vivo, prezentnd foarte puini sau deloc periori absorbani. Aceste
rdcini vor muri n scurt timp fiind nlocuite de altele generate direct n sol. Dezvoltarea
periorilor absorbani in vitro poate fi determinat prin meninerea culturilor, pentru o
perioad de timp, pe mediu lichid. Sistemul radicular slab dezvoltat determin o supravieuire
slab a unei plante n condiiile de mediu natural, in vivo, mai ales n condiiile unei
transpiraii intense. Pentru o plant provenit din cultura in vitro este vital pierderea unei
cantiti ct mai mici de ap din esuturi.

274
3. Plantele care n condiiile mediului lor natural de via triesc n simbioz cu fungi
(micorize) sau bacterii (ex: Leguminosae:Rhizobium) simt lipsa acestei simbioze atunci cnd
sunt transferate n condiii in vitro, dar mai ales dac sunt din nou transferate in vivo. Mai
multe studii au artat c inocularea unor plante in vitro mpreun cu microorganismul
simbiont a determinat o cretere i dezvoltare mai bun a explantelor i o supravieuire
crescut atunci cnd s-a procedat la aclimatizarea acestora.
Dhawan i colab. (1986) au demonstrat c adiia de Rhizobium n timpul aclimatizrii
plantelor de Leucaena a dus la formarea nodulilor la peste 80% dintre plantulele care au
supravieuit transplantrii n sol, iar supravieuirea acestora a avut o rat cu 90% mai mare
fa de cele care nu au nodulat. Morandi i colab. (1979) au raportat c plantele produse in
vitro de Rubus idaeus au crescut mult mai bine dac au fost inoculate cu cteva
microorganisme din specia Glanus mycorrhiza. De asemenea, Struller i colab. (1984) au
raportat c micorizele joac un rol important n micropropagarea plantulelor de plop;
inocularea explantelor mpreun cu micorize din specia Paxillus involutus a determinat o
cretere cu 75% a plantelor comparativ cu cele inoculate fr micorize.
Atunci cnd se iau n considerare problemele asociate cu sistemele radiculare ne-
funcionale trebuie avut n vedere urmtoarele msuri speciale:
-permiterea formrii rdcinilor in vitro, ce vor putea ulterior fie s se dezvolte n rdcini
subterane proprii, fie mcar s asigure supravieuirea plantulei pn la formarea unor rdcini
subterane proprii;
-permiterea dezvoltrii in vitro a rdcinilor, atunci cnd e posibil, prin meninerea culturilor,
o perioad de timp, cu rdcinile n mediul lichid, acestea fiind apoi capabile s preia toate
funciile unei rdcini normale, atunci cnd va fi transferat n sol;
-transferarea ntregii faze de nrdcinare n mediu in vivo. nrdcinarea n sol nu este
realizabil la toate speciile de cultur, dar poate fi stimulat prin nmuierea bazei lstarilor n
soluie de auxin. Totui pentru multe specii faza de nrdcinare este bine s aib loc in vitro
mai ales pentru speciile care nu nrdcineaz uor nici n condiii normale de cultur, cu ar fi
speciile ierboase.
Atunci cnd se recurge la aclimatizarea unor plntue obinute prin tehnicile de
regenerare in vitro, trebuie s se in seama de urmtoarele:
1.Pentru a evita infeciile cu fungi sau bacterii:
-agarul de pe rdcinuele explantelor (ce conine zaharuri) trebuie ndeprtat prin splarea
acestora cu ap cldu;
-solul sau substratul solid, n care vor fi trecute plntuele regenerate in vitro, trebuie s fie
sterilizat prin meninerea la temperaturi ridicate (n etuv la 180oC pentru 3 ore) sau prin
iradiere cu radiaii gama.
2.Asigurarea unor condiii ct mai sigure de via, prin executarea tratamentelor de
combatere a insectelor, bacteriilor, fungilor, melcilor (limax), determin o rat mai mare de
supravieuire a plantelor transferate in vivo, care sunt destul de sensibile.
3.Pentru a se evita rnirea rdcinuelor se recomand folosirea, pentru nceput, a unui
sol uor.
4.Pentru a mbunti aclimatizarea plantulelor la condiiile in vivo, nrdcinarea este
bine a avea loc pe medii de cultur srace n sruri minerale (MS concentrat la jumtate sau
KNOP).
5.Uneori este necesar un tratament cu temperaturi sczute (4-8 sptmni la 5oC) in
vitro sau imediat dup transferul in vivo, pentru a scoate plantulele din perioada de laten.
Acest procedeu este necesar mai ales plantelor cu bulbi, arbutilor i plantelor lemnoase, dar
i cerealelor care necesit o perioad de vernalizare pentru a putea produce semine.

275
6.Plantele care formeaz protocorm (cormofitele) sau bulbi, trebuie transferate n sol
n aceast form (protocorm, bulbi), ceea ce va crete ansele de aclimatizare i supravieuire
ale acestora.
7.Transferarea lstarilor generai in vitro pe un mediu fr zaharuri i mbogirea
mediului nconjurtor cu CO2 poate duce la o aclimatizare mai uoar a plantelor (Langford i
Wainwright, 1986).
Mai jos sunt prezentate pe scurt ultimele descoperiri n domeniu:
1.n unitile comerciale, transferul plantelor pentru aclimatizare se face direct n
straturi acoperite cu folie de plastic, ceea ce ajut la meninerea umiditii (uneori se folosesc
i pulverizatoare de ap n acest scop), iar luminozitatea i temperatura trebuie s fie relativ
sczute.
2.Lstarii obinui in vitro la unele specii (Gerbera i Rhododendron) sunt transferai
direct pe un substrat artificial, care va permite nrdcinarea acestora. Laboratoarele Twyford
au confecionat un tip de ldie de plastic prevzute cu 400 de orificii, care vor fi umplute cu
substrat pentru nrdcinare. Acestea vor permite scurgerea surplusului de apa i susinerea
optim a lstarilor. nrdcinarea lstarilor n ldiele perforate va avea loc ntr-o ncpere
semisteril, climatizat, n care umiditatea aerului este meninut ridicat. Imediat ce
nrdcinarea este suficient i lstarii ncep s creasc, butaii sunt transferai din ldiele
perforate direct n ser.
Speciile lemnoase sunt n prezent nrdcinate mai mult in vivo dect in vitro,
deoarece astfel se economisete mai mult timp i bani. La specii ca Rhododendron, Kalmia,
Amelanchier, Betula, Vaccinium, Syringa vulgaris (Zimmerman, 1985) i n general la toate
speciile lemnoase, care sunt propagate comercial, se aplic acest tip de nrdcinare.
3.Compania Milcop din Frana a produs un substrat artificial pentru nrdcinare, pe
baz de polypropilen, autoclavabil, stabil biologic, inert chimic, permind o aerare bun.
Acest substrat este disponibil sub form de fulgi, fiind potrivit pentru nrdcinarea in vitro.
Pentru o nrdcinare direct, in vivo, exist blocuri (cuburi) mici, din acelai material, n care
lstarii pot fi plasai cu uurin.
Pe baza celor prezentate mai sus, se poate presupune c, n viitorul apropiat, vor
aprea pe pia tot mai multe tipuri de substraturi artificiale, ce vor face aclimatizarea
plantulelor mult mai eficient i mai uoar, dect a fost n trecut. Trecerea direct a butailor
in vivo este important, pentru c va duce la eliminarea fazei de nrdcinare in vitro, care este
relativ costisitoare i necesit o perioada de timp suplimentar, ceea ce crete perioada dintre
doua generaii de plantule, fapt nedorit de companiile comerciale productoare de material
semincer. Astfel micropropagarea va deveni o tehnic uzual i mai la ndemn, necesitnd
doar camere de cretere special amenajate pentru aclimatizarea i nrdcinarea butailor
direct pe substraturile artificiale.

276