Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
2.1.1.1 Auxinele
166
Auxinele intervin n multe fenomene fiziologice, iar aciunile lor depind de
concentraiilor i de interaciunile cu ali regulatori de cretere. Studiind cteva
din efectele lor s-a putut concluziona c:
-exercit o aciune clar asupra elongrii celulare, aceste efect urmeaz
creterii plasticitii peretelui celular i penetrrii apei n celul. Apoi rezistena
peretelui scade i celula crete n lungime;
-modific permeabilitatea membranei plasmatice, ceea ce duce la o
descrcare de ioni de H+, determinnd o cretere a aciditii responsabil de
diminuarea rezistenei peretelui celular i o absorbie de ioni de K+;
-influeneaz n general metabolismul celular i n particular sinteza ARN-
ului ribozomal (ribozomii particip la sinteza proteinelor);
-stimuleaz diviziunea celulelor cu origine cambial (acest tip de aciune a
determinat insuccesele din primele ncercri de iniierea a culturilor in vitro);
Acest efect este descris ca histogenic deoarece conduce la formarea unui numr
de celule asemntoare, numite calus;
-acioneaz asupra sintezei etilenei ntr-o anumit concentraie, etilena
intervine n schimb n reglarea nivelului de auxin cel puin la nivelul vaselor
conductoare;
-acioneaz asupra tropismului plantelor i asupra corelaiei dintre organe,
n particular asupra fenomenelor de dominan apical;
-determin ntrzierea cderii frunzelor i a fructelor;
-au aciune rizogenic fiind folosite n special n micropropagarea speciilor
ornamentale destinate comerului de flori tiate;
Aceste efecte numeroase nu pot rezulta doar din aciunea singular a
auxinei deoarece concentraia optim este diferit pentru fiecare tip de aciune n
parte i se schimb n funcie de concentraia celorlali fitoregulatori.
Modul de aciune al auxinelor. Nu se poate da un rspuns precis, dar
cercetrile n domeniu au evideniat existena unor receptori fie membranari, fie
citoplasmatici specifici auxinei. Pe baza acestei ipoteze au rezultat urmtoarele
concluzii:
-n funcie de prezena sau absena unuia sau a celuilalt receptor apar
diferene de reacie n concordan cu originea celulei ce reacioneaz la acest
fitohormon;
-n funcie de afinitatea receptorului pentru auxin unii sunt angrenai mai
repede dect alii.
Au fost descoperii receptori i pentru alte tipuri de fitoregulatori de cretere,
de aici se poate extinde ideea existenei de receptori pentru toate tipurile de
regulatori endogeni.
B. Auxinele n plante
167
Toate plantele sintetizeaz auxine, sintez modulat de stadiul de dezvoltare
ale acestora. Sinteza auxinelor are loc la nivelul frunzelor tinere, a mugurilor i
n florile i fructele tinere.
Auxinele circul de la vrful spre baza organelor cu o polaritate puternic
pronunat n organele tinere, dar n cursul transportului lor sunt descompuse de
auxin-oxidaze, ceea ce nseamn c auxinele sunt n concentraie mai mare n
apropierea situsurilor de sintez. Astfel, auxinele sunt prezente ntr-o
concentraie suficient n vrful plantelor n cretere, n mugurii florali sau
foliari, pentru a asigura multiplicarea i elongarea celulelor.
C. Auxinele sintetice
n practic, auxinele endogene pot fi folosite, fiind mai puin toxice dar
i mai puin eficiente deoarece activitatea acestora este rapid inhibat de
aciunea auxin-oxidazelor. De aceea produsele sintetice le-au luat locul chiar
dac implic un risc mai mare de toxicitate.
n aplicaiile agricole, compuii auxinici sunt folosii pentru cicatrizarea
rnilor rezultate n urma tierilor anuale din pomicultur, n evidenierea
168
fructelor partenocarpice sau pentru ntrzierea cderii frunzelor sau a fructelor
pn la recoltare, ca urmare a efectului invers exercitat de acidul abscisic.
i n domeniul culturilor in vitro se folosesc aceleai substane
urmrindu-se n principal efectele rizogenice i de multiplicare a celulelor pe
care acestea le genereaz.
2.1.1.2 Giberelinele
169
Proprietile fiziologice ce urmeaz a fi descrise corespund acidului
giberelic (GA3). Nu toate giberelinele au activitate similar, unele sunt inactive
sau doar forme intermediare, ceea ce le face dificil de studiat, iar mai mult, nu
toate plantele posed aceleai gibereline.
Principalele proprieti ale acidului giberelic sunt:
-acioneaz asupra elongrii internodurilor, uneori determinnd rezultate
spectaculoase (ex: s-au obinut plante de varz cu tulpina de 3 m), dar nu asupra
tuturor speciilor. Doar unele dintre varietile pitice ale unor specii pot atinge
talii normale n urma aplicrii de GA3, n general varietile pitice nu
reacioneaz la efectul de elongare al acidului giberelic. Acidul giberelic
acioneaz i asupra pedunculilor florali, mpiedic maturizarea timpurie (cu 15
pn la 20 de zile la Cyclamen) sau alungirea inflorescenelor prea dezvoltate
(ex: la viele de vie cu ciorchini deni, acidul giberelic a inhibat dezvoltarea
racemelor laxe);
-n cultura in vitro giberelinele acioneaz i la nivelul meristemelor,
care, n absena acestora, prezint un aspect globular;
-stimuleaz metabolismul celular deoarece favorizeaz sinteza enzimelor
hidrolitice. S-a dovedit c la seminele de orz, acumularea -amilazei, o enzim
cu rol n transformarea amidonului n zaharuri solubile, este datorat acidului
giberelic, care acioneaz direct sau dup asocierea cu un receptor. Giberelinele
acioneaz, de asemenea, n prezena auxinelor, i sunt deseori stimulate de
sinteza sau inhibarea sintezei auxin-oxidazelor;
-acioneaz asupra nfloririi, avnd ca efect fie inhibarea inducerii
florale, cum ar fi cazul pomilor fructiferi, sau stimuleaz nflorirea speciilor ce
necesit temperaturi sczute pentru a nflori, astfel nct n prezena
giberelinelor aceste specii nfloresc i fr temperaturi sczute (morcov). La alte
specii, ce necesit de asemenea temperaturi sczute pentru nflorire, prezena
giberelinelor induce doar alungirea tulpinii fr formarea florilor (sfecl).
Aceste contradicii n aparen au o explicaie simpl: n plantele prezentate mai
sus frigul acioneaz doar asupra creterii tulpinii, pe cnd n cellalt caz asupra
procesului de nflorire. Astfel, giberelinele, i exercit doar rolul de stimulatori
ai elongaiei neinfluennd, n acest caz, procesele fiziologice normale;
-acioneaz asupra formrii fructelor partenocarpice la pr, mandarin,
prun;
-exercit o aciune complex asupra germinrii seminelor sau pornirii n
vegetaie a mugurilor dorminzi, atunci cnd condiiile climaterice (temperaturi
sczute) nu permit acest lucru, inducnd i ramificarea sau creterea ramurilor la
Hydrangea;
-n organogenez, aciunea giberelinelor poate fi antagonic. Par a se
opune fenomenului de dedifereniere, neputnd fi folosite in vitro n acest scop,
acionnd ns asupra meristemelor apicale sau axilare i asupra butonilor
florali, prin stimularea creterii i dezvoltrii acestora.
170
B. Giberelinele n plante
2.1.1.3 Citochininele
a) b)
Fig.4 Citochinine: a) zeatina, b) kinetina
B. Citochininele n plante
172
2.1.1.4 Etilena
Fig.5 Etilena
173
A. Inhibitorii fenolici
B. Acidul abscisic
174
-acioneaz asupra nfloririi. Aplicarea acidului abscisic la plantele de zi
scurt cultivate n condiii perfecte de periodism, poate inhiba complet nflorirea
acestora (Volubilis) sau inhiba parial (Chenopodium rubrum), sau chiar stimula
nflorirea (Plumbago). n cazul n care plantele de zi scurt sunt supuse unor
condiii de zi lung poate induce nflorirea unora dintre specii i inhibarea altora.
Aplicat asupra plantelor de zi lung, acidul abscisic poate inhiba nflorirea
atunci cnd plantele sunt supuse unor condiii normale de fotoperiodism
(spanac, Lolium temulentum). Aceste observaii pot conduce la supoziia c
nopile lungi favorizeaz sinteza acidului abscisic, dar aceast supoziie este
prea simpl pentru explicarea modului diferit de aciune a acidului abscisic.
Acidul abscisic este foarte puin folosit n culturile in vitro, i n funcie
de speciile folosite i de condiiile de cultur utilizate poate induce reacii foarte
diferite i greu de interpretat.
Concluzii
175
2.2 ALEGEREA EXPLANTULUI
A. Embriogeneza
176
i cu mediul de cultur, determin un schimb de semnale biochimice, ce
moduleaz funcionarea fiecrei celule.
n contextul ipotezei mai sus menionate, diferenierea celular intervine
ca urmare a dou cauze: pe de o parte, datorit ereditii genetice a celulei
(fiecare celul are acelai echipament informaional genetic), n care acioneaz
programul embriogenic, iar pe de alt parte, datorit poziionrii specifice a
celulei care va fi recunoscut de structurile membranare. Aceste structuri
filtreaz informaiile i permit sau mpiedic circulaia unuia sau altui semnal
capabil s modifice programul informaional spre un anumit tip de celul.
Sfritul acestei prime etape este marcat, n general, dup ce substanele
sunt depozitate n albumen sau cotiledoane, de deshidratarea seminei, ce induce
intrarea embrionului n starea de laten. Seminele pot fi apoi diseminate,
putndu-se pstra i rezista condiiilor nefavorabile din mediul nconjurtor.
B. Stadiul vegetativ
178
Aceast diferen indic faptul c principalele corelaii implic, n
general, informaii despre ntietatea mugurilor, care e controlat mai degrab
de fenomene de cretere relative dect de motenirea genetic.
Stadiul vegetativ dureaz, n funcie de specie, de la cteva sptmni la
cteva luni pe an, un an pentru plantele bienale sau mai muli ani pentru cele
perene. n ultimul caz, sistemul vegetativ va fi construit pe parcursul mai multor
sezoane, perioadele de cretere alternnd cu cele de repaus. Aceast succesiune,
care reflect adaptarea plantei la climatul mediului nconjurtor, este
determinat de stimulrile sau inhibrile reliefate ca rspuns la variaiile
condiiilor de mediu (temperatur, lumin, secet, umiditate, etc). Plantele ce
intr n perioada de laten i sisteaz creterea, substanele glucizidice
nefolosite sunt pstrate n rezerve, iar frunzele speciilor lemnoase cad, sau
prile aeriene ale plantelor ierboase se usuc. Atunci cnd revin condiiile
favorabile (latena mugurilor este indus de obicei de temperaturile sczute)
rencep creterile, formarea frunzelor i a prilor aeriene.
C. Stadiul reproductiv
179
Cercetrile asupra naturii stimulilor ce acioneaz asupra meristemelor
florale nu sunt concludente, tiindu-se doar c intervin unii fitohormoni dar i
alte substane. Se pot cita cteva modele de culturi in vitro, n care, variind
componentele mediului de cultur i proporia fitoregulatorilor de cretere s-au
putut obine meristeme caulinare, radiculare sau chiar reproductive.
D. Stadiul de senescen
180
n cursul embriogenezei, embrionii pot fi excizai din ovul i inoculai pe
mediul de cultur dac se afl n stadiul globular, putnd reproduce un individ
normal i complet. Aceast tehnic prezint un interes sczut atunci cnd se are
n vedere micropropagarea (potenialul genetic al embrionilor este rareori
cunoscut cu excepia cazului strict de autogamie). Pe de alt parte, aceast
tehnic permite studierea cerinelor speciale necesare unui embrion izolat. n
unele cazuri, de ncruciare interspecific sau intergeneric, cnd embrionii pot
fi avortai sau mor imediat n ovul, aceast tehnic permite creterea i
dezvoltarea normal a acestor embrioni.
esuturile embrionare sunt uor regenerative, dar la unele specii doar din
cotiledoane s-au obinut rezultate notabile, ceea ce a permis specificarea
cerinelor nutritive pentru cultura esuturilor speciilor studiate. Acesta poate fi
primul mod de abordare a culturilor in vitro iniiate din explante btrne. n
unele cazuri aceasta este singura cale cunoscut.
Dup germinarea n stadiul juvenil, esutul prelevat prezint un rspuns
favorabil in vitro i este sursa multor succese n domeniu. Odat cu naintarea n
vrst a plantei donor, potenialul de cultur in vitro a explantelor prelevate de la
acesta se diminueaz. Acest fenomen este specific mai ales plantelor perene, i
n mod deosebit la arbori. La aceste specii, calitatea tehnic a lemnului nu este
msurabil, cu excepia arborilor aduli. n acest stadiu, totui, pentru multe
specii, iniierea culturii doar din butai nu mai este posibil, deoarece n stadiul
tnr acetia au o capacitate rizogenic ridicat.
Exist dou tehnici ce permit obinerea de puiei la speciile pomicole i
arboricole:
-una ar fi utilizarea lstarilor tineri de la baza speciilor pomicole i
arboricole. n acest caz lstarii par a avea caracteristici juvenile i nrdcineaz
mai repede (de exemplu la nuc i eucalipt). La aceste specii esuturile de origine
ale noilor lstari sunt genetic apropiate de stadiul juvenil, probabil datorit
faptului c se afl n apropierea rdcinilor;
-a doua tehnic este aplicat pentru multiplicarea speciilor pomicole i
arboricole tropicale i a coniferelor. Aceast tehnic permite rejuvenilizarea i
obinerea de altoi. Un altoi prelevat dintr-un arbore sau pom este altoit pe un
portaltoi crescut din smn. Altoiul crete i este apoi nlturat fiind ulterior
altoit pe alt portaltoi. Dup mai multe altoiri altoiul ncepe s prezinte
caracterele juvenile, ceea ce-l face apoi apt pentru propagare prin butire.
La culturile in vitro, s-au observat fenomene similare la meristeme.
Prima frunzuli ce se formeaz are caractere juvenile (prima frunzuli a
meristemului la vi de vie are caracteristici similare celei dezvoltate din
smn, de asemenea, i la orhidee meristemele dezvolt, n cultura in vitro,
protocorm identic cu cel obinut din smn). Rejuvenilizarea observat este
deseori obinut din prima subcultur, ns uneori sunt necesare mai multe
subculturi pentru a obine aceste efect, n funcie de specie.
181
ntoarcerea la stadiul juvenil poate fi datorat supresiei de informaii
citoplasmatice sau datorit diminurii considerabile a acestora determinnd
astfel posibilitatea regenerrii de noi celule. Mecanismele exacte ce determin
aceste fenomen nu sunt nc pe deplin cunoscute. Se pare c citochininele sunt
implicate, cel puin parial, n acest proces, dar ele nu acioneaz singure.
Cultivarea organelor reproductive in vitro, se poate realiza cu succes
atunci cnd plantele donor sunt n stadiul reproductiv. Se pare c schimbrile ce
apar n ritmul de funcionare al meristemelor este favorabil i determin n
esuturi un echilibru optim culturii in vitro.
Se pot obine culturi din esuturi prelevate de la plante aflate n stadiul de
senescen, dar rezultatele sunt n general slabe sau incomplete.
182
2.2.4 Selecia explantelor n funcie de amplasarea plantei donor
185
Utilizarea acestui tip de explante este important deoarece asigur
posibilitatea efecturii unui numr foarte mare de subculturi i, din punct de
vedere genetic, un minim de variabilitate.
186
Al doilea proces de organizare, mai puin frecvent, este acela n cursul
cruia celulele se vor comporta ca un ou fertilizat, urmnd etapele
embriogenezei. Vom vorbi astfel de embrioni sau embriogenez somatic. Acest
fenomen, descris pentru prima dat la celule de morcov, a fost descoperit la mai
multe specii, att anuale ct i perene.
Ca o trstur general, inducerea embriogenezei depinde n cea mai
mare msur de compoziia mediului de cultur, dar i de genotipul de la care se
prelev celulele generatoare. n multe cazuri embriogeneza somatic, este
precedat de formarea de calus, n acest caz izolarea celulelor nu mai este un
factor decisiv (Fig 9).
n cursul dezvoltrii se observ cum celulele se divid i embrionii ajung
n stadiul globular, apoi apare simetrie ntre forme i embrionul evolueaz spre
stadiul cordiform i apoi ntr-un embrion capabil s genereze o plantul (Fig
10).
Pentru celulele capabile s genereze embrioni somatici sunt suficiente
dou medii de cultur. Primul asigur formarea embrionilor, putnd servi i ca
mediu de micropropagare, iar al doilea va induce germinarea embrionilor.
Uneori sunt necesare mai multe subcultivri pe medii fr hormoni
pentru a induce germinarea embrionilor somatici i creterea plantulelor, n
timpul acestor subcultivri are loc diluia fitohormonilor la nivel celular
permind astfel dezvoltarea normal a celulelor.
188
CAPITOLUL IV
Apa
Apa reprezint componentul esenial al vieii, al materiei vii. Este
utilizat n tot fluxul tehnologic de producere a plantelor in vitro, de la
splarea materialului vegetal i a vaselor de cultur, pn la utilizarea ei ca
189
solvent pentru celelalte componente i elemente de diluie pn la concentraia
dorit. Pierderea apei din esuturi provoac perturbri metabolice direct
proporionale cu cantitatea de ap pierdut. Stresul hidric este suportat de plante
dac este de scurt durat i dac nu se atinge nivelul de vetejire. n aceast
ultim faz plantele sunt capabile de rehidratarea esuturilor puse n condiii
favorabile de umiditate, dac deficitul de ap se menine plantele mor.
La culturile in vitro exist momente cnd explantele pot s-i piard
turgescena prin pierderea apei, momente n care trebuie acordat atenia
cuvenit, pentru asigurarea succesului culturii.
Sterilizarea materialului vegetal este o etap critic din acest punct de
vedere, deoarece soluiile utilizate sunt concentrate pentru distrugerea agenilor
patogeni. Trebuie corelate foarte bine timpul de sterilizare i concentraia
soluiilor utilizate n funcie de starea de vegetaie a materialului vegetal, pentru
evitarea pierderii apei prin exosmoz. Prelevarea explantelor trebuie fcut
repede, altfel datorit dimensiunilor mici pierd repede apa prin transpiraie, prin
rnile care sunt mari comparativ cu mrimea lui. Manipulrile sub hot trebuie
fcute destul de repede deoarece curentul de aer deshidrateaz relativ uor
explantele care stau descoperite.
Pe timpul creterii explantelor n camera de cretere, vasele trebuie s fie
nchise pentru a evita pierderea apei prin transpiraie, ce ar determina
concentrarea mediului n elemente nutritive, ar provoca crparea mediului i ca
atare slaba cretere a culturilor. Pentru respectarea strict a concentraiilor
soluiilor stoc sau a mediului, apa trebuie distilat, deci eliberat de ionii
minerali pe care i conine. La splarea materialului vegetal dup sterilizare se
folosete ap steril, sterilizare ce se face n autoclav odat cu sterilizarea
mediului sau separat.
Srurile anorganice
Substanele anorganice sunt introduse n mediu sub form de sruri. Cele
mai utilizate sunt: azotaii, fosfaii, clorurile i sulfaii de Ca, K, Mg, Mn, Al, Fe,
Mo, Zn, Cu, Na, etc. Absorbia elementelor din mediu se face sub form de ioni,
utilizarea uneia sau alteia din sruri este n funcie de cerinele fiecrei specii i
de faza de vegetaie. n funcie de cantitatea de elemente ce se folosete n
mediu, elementele se mpart n:
-macroelemente - utilizate n concentraii de ordinul milimolilor C, O,
H, N, K, Ca, P, S, Mg;
-microelemente sau oligoelemente, utilizate n concentraii de micromoli.
190
Tabelul 4.1
Principalele medii de cultur utilizate n culturi
in vitro (dup Street, 1977)
Constitueni Heller White Nitsch Murashige Gamborg
Skoog
Macroelemente mg/l
KCl 750 65 - - -
NaNO3 600 - - - -
MgSO4 x 7H2O 250 720 185 370 250
NaH2PO4 x H2O 125 16,5 - - 150
CaCl2 x 2H2O 75 - - 440 150
CaCl2 - - 166 - -
KNO3 - 80 950 1900 2500
Na2SO4 - 200 - - -
(NH4)2SO4 - - - - 134
NH4NO3 - - 720 1650 -
KH2PO4 - - 68 170 -
Ca(NO3)2 x - 300 - - -
4H2O
Microelemente
FeSO4 x 7H2O - - 27,8 27,8 27,8
Na2EDTA x - - 37,3 37,3 -
2H2O
MnSO4 x H2O - - - - 10,0
MnSO4 x 4H2O 0,01 7,0 25 22,3 -
KI 0,01 0,75 - 0,83 0,75
NiCl2 x 6H2O 0,03 - - - -
CoCl2 x 6H2O - - - 0,025 0,025
ZnSO4 x 7H2O 1,0 3,0 10,0 8,6 2,0
CuSO4 x 5H2O 0,03 - 0,025 0,025 0,025
H3BO3 1,0 1,5 10,0 6,2 3,0
FeCl3 x 6H2O 1,0 - - - -
Na2MoO4 x - - 0,25 0,25 0,25
2H2O
AlCl3 0,03 - - - -
Fe(SO4)3 - 2,5 - - -
Constitueni
organici
Inozitol - - 100 100 100
Acid Nicotinic - 0,05 5 0,5 1,0
Piridoxin HCl - 0,01 0,5 0,5 1,0
Tiamin HCl - 0,01 0,5 0,1 10
Glicin - 3,0 2 2,0 -
Acid folic - - 0,5 - -
Biotin - - 0,05 - -
Zaharoz - 2% 2% 3% 2%
Diferenele ce exist ntre diferite reete de mediu, constau n raportul
dintre diferii ioni. Rolul fiziologic al fiecrui element depinde de forma chimic
n care se gsete n mediu, de concentraia lui, de natura explantului. n prezent
se cunosc principalele reete utilizate pentru speciile cultivate care se preteaz la
cultura in vitro. Acolo unde nu s-a experimentat nc, trebuie fcute tatonri
191
pentru gsirea celei mai adecvate compoziii pentru mediu. Carenele pentru
elementele minerale in vitro se manifest dup 2-3 subculturi, deci trziu, cnd
nu se mai poate face mare lucru pentru salvarea culturii. De exemplu N are rol
important n embriogeneza somatic, n funcie de forma lui nitric sau
amoniacal influeneaz vitrificarea. Carena de N duce la acumulri de
antociani n vacuolele celulelor, iar dac aceasta persist provoac dereglri n
metabolismul glucidelor i proteinelor.
Potasiul influeneaz creterea esuturilor, carena determin o dezvoltare
slab. mpreun cu calciul, regleaz permeabilitatea membranelor celulare, a
fluiditii protoplasmei, intervine n schimbul ionic la nivelul membranelor.
Magneziul ntr n compoziia clorofilei, carena provocnd dereglri
grave n structura frunzei.
Microelementele exercit roluri metabolice i fiziologice diferite de cele
ale macroelementelor. Intr n compoziia multor combinaii organo-metalice
complexe, cu valoare biologic ridicat de tipul enzimelor, care controleaz
ntreg procesul metabolic al plantelor.
B. Compuii organici
Sursele de carbon
Viaa in vitro este aproape n exclusivitate heterotrof, n special n
primele faze ale existenei, pn la formarea unui numr suficient de mare de
frunze pe fiecare plantul sau lstar. Datorit acestei nutriii heterotrofe mediul
de cultur trebuie s conin un compus care s asigure carbonul organic necesar
n metabolism. Principalele surse de carbon sunt glucidele. Acestea sunt
substanele cele mai utilizate i mai accesibile plantelor ca surs energetic.
Dozele pe litru sunt de cca. 2-3% n funcie de faza de vegetaie i tipul de
explant folosit. Dintre glucide zaharoza rspunde cel mai bine cerinelor
culturilor in vitro.
Aminoacizii
Sunt utilizai ca surse de azot amoniacal disponibil imediat pentru celule
i esuturi, fa de azotul organic care este mai greu accesibil. Se adaug n
mediu sub form de compui simpli sau compleci. Principalii aminoacizi
utilizai sunt: glicina, asparagina, acidul aspargic, cisteina, alanina, glutamina
etc.
Vitaminele
Plantele spre deosebire de animale sunt capabile de sinteza vitaminelor,
dar nu i esuturile cultivate in vitro. S-a demonstrat experimental ca in vitro
esuturile i plantulele rspund favorabil la adaosul exogen de vitamine n
cantiti mici. Majoritatea vitaminelor sunt termolabile, sunt distruse la
192
temperaturi ridicate, uneori cu ocazia autoclavrii, dar s-a observat c i
substanele reziduale au rol favorabil asupra culturii.
Principalele vitamine utilizate n mediile de cultur sunt:
-tiamina (vitamina B1, aneurina), se folosete n concentraii cuprinse
ntre 0,1-10 mg/l; stimuleaz creterea vegetativ, sporirea biomasei produs in
vitro;
-piridoxina (vitamina B6), 0,1-1 mg/l; precursor a unor coenzime,
cataliznd reacii de baza n metabolismul aminoacizilor;
-riboflavina (vitamina B2), 0,1-1 mg/l, rezistent la temperaturi ridicate
(280oC); inhibitor al creterii rdcinilor, rol n metabolismul celular;
-acidul pantotenic (vitamina B5), este mai puin utilizat ca atare;
pantotenatul de calciu se folosete n concentraii cuprinse ntre 0,5-2,5 mg/l;
-cobalamina (vitamina B12), este mai rar folosit, stimuleaz sinteza
nucleoproteidelor;
-acidul nicotinic (vitamina B3, niacina), 0,5-5 mg/l, rezistent la
temperaturi ridicate (234-237oC); rol n metabolismul intermediar;
-biotina (vitamina H), 0,1 mg/l; stimuleaz creterea esuturilor
meristematice i proliferarea celulelor;
-acidul folic, 0,01 mg/l; efect stimulator asupra creterii esuturilor la
lumin; la ntuneric are efect toxic;
-acidul para-aminobenzoic, 1 mg/l; stimuleaz biosinteza acidului
pantotenic i a biotinei;
-acidul ascorbic (vitamina C), 1-100 mg/l, prin autoclavare se distruge n
bun parte; este activator general al metabolismului celular;
-vitamina E (tocoferolul), mrete sensibilitatea celulelor la auxine;
-inozitolul (mio-inozitolul, mezo-inozitolul, hexahidroxi-ciclohexan),
100-1000 mg/l; este considerat att vitamin ct i glucid; stimuleaz diviziunea
celular.
Fitoregulatorii
Fitohormonii, fitoregulatorii sau substanele regulatoare de cretere sunt
substane organice utilizate n cantiti mici cu rol de a stimula, inhiba sau
controla procesele fiziologice de cretere i dezvoltare. Exist fitohormoni
endogeni, sintetizai de plante i fitohormoni exogeni sau de sintez.
esuturile in vitro nu sunt capabile s-i sintetizeze ntreaga cantitate de
care au nevoie, fiind necesar adugarea lor n mediul de cultur pentru a
asigura o bun cretere a explantelor. Cei mai folosii fitohormoni n culturile in
vitro sunt auxinele, citochininele i giberelinele.
Auxinele sunt mult utilizate pentru reglarea proceselor de morfogenez
alturi de citochinine. Auxina natural descoperit este AIA (acidul indolil-
acetic) care se produce i prin sintez pe cale industrial. Cele mai folosite
auxine de sintez sunt:
193
-IBA (acidul 3 indolil butiric); ANA (acidul naftilacetic); 2,4D (acidul
2,4 diclorfenoxiacetic); ANOA (acidul beta naftoxiacetic).
Aciunea auxinelor este foarte complex datorit intreaciunii pe care o
are cu alte substane regulatoare i interveniei asupra unor procese fiziologice.
Rolul auxinelor poate fi redat astfel:
-stimuleaz diviziunea celular;
- influeneaz alungirea celulelor prin mrirea plasticitii peretelui
celular;
-modific permeabilitatea membranelor plasmatice pentru ap i ioni;
-rol important n dominana apical;
-inhib formarea embrionilor somatici n suspensiile celulare;
Auxinele sunt sintetizate n partea aerian a plantelor n muguri, frunze,
fructele tinere i bobocii florilor de unde circul n toat planta. Cel mai mult se
folosesc ANA i 2,4D care sunt mai stabile, nu se oxideaz n prezena luminii.
2,4D este mult utilizat pentru inducerea i creterea calusului i pentru
rizogenez. La calus asigur friabilitate mare uurnd separarea calusului pentru
cultura de suspensii celulare i n embriogeneza somatic.
Citochininele sunt substane ce se gsesc n cantiti relativ ridicate n
fructe, semine, etc., iar ca structur au la baz adenina i un nucleu purinic.
Prima citochinin izolat a fost chinetina, experimentat cu succes la
culturile in vitro. La scurt timp s-a sintetizat benzil aminopurina (BAP). n
prezent se folosesc pentru culturile de esuturi patru citochinine dintre care dou
naturale (2 IP i zeatin) i doua de sintez (chinetina i BAP).
Efectul fiziologic al citochininelor const n:
-acioneaz asupra diviziunii celulare alturi de auxine;
-stimuleaz formarea mugurilor adventivi i din calus;
-stimuleaz formarea lstarilor laterali;
-stimuleaz sinteza proteic;
-inhib formarea rdcinilor.
Biosinteza citochininelor endogene are loc n rdcini i n embrioni, iar
migrarea este dependent de cea a glucidelor. Sunt substane termostabile
suportnd uor autoclavarea.
Giberelinele sunt substane care acioneaz la nivelul ntregii plante i
nu asupra celulei, cu rol n stimularea creterii, nfloririi i fructificrii. Cea mai
utilizat giberelin este acidul giberelic (GA3) fiind i cea mai activ.
Aciunea fiziologic este urmtoarea:
-produce alungirea internodiilor tulpinilor;
-stimuleaz creterea frunzelor i rdcinilor.
Giberelinele sunt sintetizate n frunzele i fructele tinere, n mugurii
activi, n embrioni i vrful rdcinilor, circulnd n plante prin vasele liberiene.
Pentru meristeme giberelina este indispensabil n vederea alungirii lor. La alte
194
tipuri de explante nu se recomand giberelina deoarece inhib dediferenierea
celular.
Etilena a fost recunoscut ca fitoregulator mult mai trziu i este
utilizat puin n culturile in vitro. Rolul fiziologic poate fi prezentat sintetic
astfel:
-exercit un control asupra creterii permeabilitii membranelor;
-induce senescena esuturilor;
-are rol n transportul auxinei;
-se produce n cantiti mai mari n esuturile i celulele rnite;
-inhib extensia celular.
Acidul abscisic este implicat n procesele de laten a mugurilor i
seminelor. Poate fi utilizat pentru:
-inducerea latenei embrionilor somatici;
-inducerea latenei seminelor artificiale n vederea pstrrii lor o
perioad mai lung;
-inhibarea creterii esuturilor i organelor pe timpul stocrii;
-are rol antagonist cu auxinele i giberelinele.
Agenii de solidificare
Substratul nutritiv utilizat la culturile in vitro este de obicei semisolid sau
solid, utilizarea mediului lichid fiind limitat doar la unele experiene i la
cultura de suspensii celulare. Cel mai utilizat agent de solidificare este agarul
obinut din alge i are urmtoarele caracteristici:
-formeaz cu apa un gel care se topete la 100oC i se solidific la 45 oC,
rmnnd solid n condiii normale de cultur;
-nu este toxic pentru plante i nu este asimilat de plante;
-nu conine elemente minerale care s afecteze echilibrul dintre ioni n
mediul de cultur, fa de reeta de mediu folosit;
-nu reacioneaz cu constituenii mediului.
Cantitatea de agar utilizat la litru de mediu difer n funcie de
consistena dorit, ntre 0,5-1%.
Cu rol similar n solidificarea mediului de cultur se mai folosesc:
-agaroza are un nalt grad de purificare i se folosete mai ales pentru
cultura protoplatilor i n prepararea gelului pentru electroforez;
-acidul alginic se folosete pentru cultura protoplatilor, suspensiilor
celulare i pentru ncapsularea embrionilor somatici n vederea obinerii
seminelor artificiale;
-phytagelul (Gelrite) produce un gel limpede. Se folosete n concentraii
de 1,5-2,0 % i se gelifica la 27-31oC. Se utilizeaz mai ales la speciile care
necesit un pH mai acid, asigurnd solidificarea mediului i n aceste condiii.
195
C. Alte substane utilizate
A.Intensitatea luminoas
B.Durata iluminrii
C.Calitatea luminii
4.2.2 Temperatura
200
de fa toate laboratoarele de culturi aseptice sunt prevzute cu hote cu flux
laminar de aer steril.
Observaii
Mediile de cultur pot fi preparate n vase Erlenmeyer, dac se prepar
cantiti mici (mai puin de un litru), iar agarul este sterilizat odat cu mediul
prin autoclavare n kukt. Pentru cantiti mai mari de un litru se folosesc vase
speciale, borcane cu capac termorezistent.
Dac mediul conine substane labile termic, substanele vor fi dizolvate
separat, apoi sterilizate prin filtrare i incorporate n mediul autoclavat n
prealabil. Acest procedeu se execut n hota cu flux laminar de aer steril.
Dac se folosesc vase de cultur din plastic achiziionate din comer
sterilizate, adiia mediului de cultur sterilizat se va face de asemenea n condiii
sterile, la gura becului de gaz unde temperatura este de aproximativ 40 oC, dup
ce gura vasului Erlenmeyer n care se afl mediul s-a trecut prin flacr pentru
flambare.
201
Ajustarea pH-ului se face de preferat cu pH metrul nainte de sterilizarea
mediului. A se evita hrtia de pH deoarece aceasta nu d rezultate precise i
importana stabilirii unui pH corect se reflect n succesul culturii in vitro.
Agarul i zaharoza nu schimb pH-ul mediului, de aceea ajustarea acestuia se
face nainte de adiia celor dou componente.
Pentru a se evita infectarea soluiilor stoc este recomandabil folosirea
unor recipiente auxiliare, n care se va goli o cantitate aproximativ egal cu cea
necesar preparrii mediului de cultur, din care se va lua cu ajutorul pipetei
cantitatea optim.
Din punct de vedere teoretic, toate prile unei plante pot constitui
explante pentru iniierea unei culturi de esuturi, datorit totipotenei celulare,
proprietate a celulei vegetale de a regenera n mod normal un individ ntreg,
identic cu planta donor.
Din punct de vedere al asepsiei, pot fi distinse dou tehnici obligatorii:
-stabilirea unei culturi aseptice din esuturi prelevate de la o plant
ntreag cultivat n condiii nesterile (prima etap a micropropagrii vegetale);
-meninerea asepsiei unei culturi deja iniiate prin transplantarea
inoculilor n condiii aseptice pe alte medii de cultur (etapele a doua i a treia n
tehnica de micropropagare vegetativ).
Prima categorie prezint cele mai mari dificulti deoarece implic
efectuarea unei sterilizri corect a esuturilor ce urmeaz a fi introduse n
condiii aseptice de cultur.
A.Sterilizarea esuturilor
Sterilizarea materialului vegetal nainte de iniierea unei culturi in vitro
este dificil deoarece gradul de infectare al esuturilor este variabil i pentru
fiecare tip de manipulare trebuie utilizate diferite substane chimice, n diferite
concentraii cu durate diferite de timp pentru imersarea esuturilor. n general,
prile aeriene ale unei plante sunt mult mai puin infectate cu bacterii i fungi
dect cele subterane. Dificultatea sterilizrii const n necesitatea absolut de a
distruge toate microorganismele patogene folosind produse chimice, astfel nct
s nu se distrug i celulele vegetale (care sunt cel puin la fel de sensibile
precum bacteriile sau fungii). De aceea, este absolut necesar stabilirea unui
timp optim de imersare a esuturilor n soluiile sterilizante.
Drept exemplu, pentru micropropagarea Saintpauliei tehnicile de
sterilizare optime sunt:
-fasonarea peiolului n fragmente de aproximativ 1cm lungime;
-imersia fragmentelor de peiol n etanol 70% timp de 20 secunde;
202
-imersia n hipoclorit de calciu 4% timp de 12 minute, cu agitarea
continu a vasului n care se realizeaz imersia;
-efectuarea a trei cltiri succesive cu ap distilat steril pentru
ndeprtarea agentului de sterilizare.
Cel mai utilizat produs de sterilizare este hipocloritul de calciu Ca(OCl)2
deoarece nu penetreaz esutul vegetal. Este totui un produs puin stabil n
soluie apoas i trebuie preparat imediat nainte de utilizare cantitatea dorit de
hipoclorit este dizolvat n ap prin agitare continu timp de aproximativ 10
minute, dup care, soluia format se filtreaz, iar filtratul se utilizeaz imediat.
Concentraiile standard folosite sunt de 4% i 8%, iar timpul de imersie variaz
ntre 5 i 30 de minute.
Ali produi chimici ce pot fi folosii pentru sterilizarea materialului
vegetal sunt:
Hipocloritul de sodiu, NaOCl - acest produs este comercializat n pungi
de plastic cu titrul colorimetric de 48o. Se folosesc concentraii ntre 5% i 20%
v/v. Timpul necesar pentru realizarea unei sterilizri optime la o diluie de 5%
este de la 5 minute la 30 de minute. Acest produs penetreaz esuturile putnd
cauza leziuni la nivel celular ducnd la scderea capacitii regenerative a
esuturilor cultivate in vitro.
Biclorura mercuric (otrav puternic), HgCl2 este un sterilizant foarte
eficient, folosit n doze mici de ordinul 0,01% pn la 0,05%. Este dificil de
nlturat deoarece are aderen crescut la esuturi, necesitnd cltiri repetate,
fiind recomandate cinci-ase cltiri comparativ cu trei n alte cazuri.
Mercurobutol este de asemenea un sterilizant foarte bun i se poate
gsi n farmacii. Conine un detergent ce-i mrete puterea de penetrarea i
eficiena, dar este foarte dificil de nlturat necesitnd efectuarea a dou, trei
cltiri cu alcool etilic de 70%.
Trebuie subliniat faptul c sterilizarea materialului biologic vegetal se
realizeaz numai la suprafa i dac accidental esuturile sunt infectate n
interior nu este posibil sterilizarea lor.
n unele cazuri sterilizarea explantelor nu este necesar, cum ar cazul
meristemelor bine protejate de numeroase frunzulie rudimentare sau a anterelor
protejate n spic.
204
- explantele se fasoneaz cu ajutorul unui bisturiu chirurgical cu lama foarte
fin, mai ales cnd se dorete obinerea unor explante de dimensiuni mici, cum e
cazul meristemelor, sau extrase cu ajutorul pensetelor cu vrf subire, n cazul
anterelor, ovulelor, etc;
- explantele sunt inoculate pe mediu imediat pentru a se evita deshidratarea lor i
intrarea n contact cu germenii, viteza de lucru fiind un factor important n
succesul culturilor in vitro;
- orice explant ce a czut pe masa de lucru sau a fost atins de altceva n afar de
hrtia de lucru steril, va fi eliminat;
- dopurile de vat nu vor fi lsate niciodat pe masa de lucru, iar capacele pot fi
plasate cu gura n jos;
- gturile borcanelor, vaselor Erlenmeyer i sticlelor sunt sterilizate prin trecerea
prin flacra becului de gaz;
- odat cu terminarea lucrului, alcoolul rmas va fi pstrat n containere nchise,
pentru siguran.
206
6.1.7 Metode de iniiere a unor tipuri de culturi din diferite explante
208
n raport cu celulele parenchimatice sau cu cele prozenchimatice,
celulele meristematice sunt mici, strns unite ntre ele, fr spaii intercelulare.
Meristemele primare au celule de forma poligonal iar meristemele secundare
au form tabular. Celulele derivate din multiplicarea meristemelor secundare
au o dispoziie radial, respectiv toate celulele generate dintr-o celul
meristematic mam sunt dispuse liniar, perpendicular pe celula ce le-a dat
natere.
Celulele meristemului apical, caulinar, sunt uniforme din punct de
vedere anatomic, dar arbitrar, la angiosperme, straturile de celule componente
sunt submprite n tunica i corpusul.
La meristemul radicular pturile celulare prezint o structur diferit de
aceea descris la tulpin.
Forma, mrimea i conformaia meristemului apical, caulinar variaz
mult la diferitele specii dar, n mare, s-au delimitat trei tipuri principale
structurale: meristemul criptogamelor vasculare, meristemul la gimnosperme i
meristemul de angiosperme.
Meristemul caulinar terminal este localizat n vrful ramurilor i de
regul, este protejat n mugur. El poate fi apical, axilar sau adventiv.
Mugurele este constituit dintr-un ax, n apexul cruia se afl meristemul.
Prin diviziunea continu a meristemului rezult celule care, pe msur ce se
ndeprteaz de apex se difereniaz funcional. Celulele externe ale masivului
tisular (numit con de cretere sau vrf vegetativ) se pliaz, iar protuberanele
rezultate constituie primordiile. Cu timpul, primordiile se difereniaz n
primordii foliare sau florale. De regul, n primordiile florale se produce o
cretere a intensitii ratei de multiplicare celular, aceti muguri devin mai
bombai, mai voluminoi. Celulele din zona central se difereniaz n xilem,
floem i esut parenchimatic. Centrifug, dinspre centru spre periferia mugurelui,
se ntlnesc primordii transformate fie n frunzulie, din ce n ce mai mari, fie n
boboci, respectiv n componente florale. Mugurii i bobocii au capacitate
regenerativ ridicat, graie faptului c dein esuturi tinere, slab difereniate i
celule meristematice. Meristemele apicale posed o relativ autonomie, fapt nc
insuficient argumentat i dovedit experimental. n evoluia in vitro a explantelor
meristematice, un rol important l are stadiul de dezvoltare al primordiilor.
Primordiile florale recoltate n faze prea avansate de dezvoltare, cultivate in
vitro, se transform n floare. Adeseori, funcie de specie, la nivelul nveliurilor
florale se poate induce neogeneza de formaiuni meristematice adventive.
Cambiul i felogenul sunt meristeme prezente n organele ngroate
secundar sau n cele metamorfozate (rdcini tuberizate). De regul, cambiul
constituie o principal zon regenerativ.
esuturile inoculate pe medii aseptice, de regul, difereniate
morfofuncional, trebuie s se dediferenieze, fenomen ce se petrece n etape
succesive, pn la rentoarcerea lor la starea de meristem primar, respectiv
209
neoformarea de meristeme. Fenomenul de dedifereniere celular se produce i
spontan, de exemplu n cazul iniierii unor meristeme, sau al genezei de rdcini
secundare din celulele periciclului radicular.
Dediferenierea celulelor inoculate in vitro poate consta n formarea de
calus, dedifereniere primar, din care se poate ajunge la un stadiu de
dedifereniere secundar, cnd o parte din celulele calusului se transform n
meristeme, generatoare de rdcini sau tulpini.
Dediferenierea celulelor inoculate in vitro constituie o condiie a
formrii de promeristeme i de iniiere a organogenezei.
n cultura de meristeme, meristemul este prelevat mpreun cu dou
primordii foliare subiacente acestuia.
Ball (1946) a fost primul care a obinut plantule din meristeme de
Lupinus albus i Tropaeolum majus, prin cultivarea lor in vitro. Aceste
experimente au relevat potenialitatea organogenetic a diferitelor pri ale
apexului.
n prezent, o atenie deosebit se acord studiilor privind cunoaterea
reaciei meristemului cultivat in vitro, n raport cu condiia funcional a
meristemului in situ, precum i a rolului primordiilor. Este evident faptul c un
meristem izolat, cultivat pe medii aseptice, i poate manifesta totipotenialitatea
sa real; n condiiile inoculrii lui mpreun cu primordiile, ori in situ, aceast
capacitate este mascat de corelaiile existente ca urmare a prezenei alturi de
meristem i a celorlalte esuturi. Dezvoltarea in vitro a meristemului solitar, sau
a celui nsoit de primordii, este dependent de fitohormonii de cretere prezeni
n mediul de cultur. Se pare c primordiile, chiar n faza n care frunzele sunt
abia schiate, se pot transforma fie n frunze, fie n muguri floriferi. Experienele
de microchirurgie ale lui Wardlaw (1949), Steeves (1962), Haight i Koehnert
(1969), precum i ale altor autori, au permis stabilirea faptului c tinerele
mucroane foliare se afl ntr-o stare nedeterminat nc morfofuncional.
Problema transformrilor morfologice i structurale, n cadrul proceselor de
tranziie care au loc n trecerea strii vegetative a meristemului n stare floral,
precum i a celor legate de reversia meristemelor iniial florale, n meristeme
vegetative constituie punctul de plecare n multiplicarea vegetativ in vitro,
pornind de la explante constnd din boboci sau din nveliuri florale. La
conopid, n faza de preinflorescen, Margara (1982) se pot distinge trei
categorii de meristeme: vegetativ, de generare a inflorescenei i de formare a
florilor.
Definitivarea direciei de evoluie a meristemului apical, din vegetativ n
floral, depinde de o serie de factori exogeni fotoperioad, temperatur sau
endogeni specie, hormoni.
n condiiile cultivrii unor explante in vitro, celulele esuturilor
inoculate pe medii aseptice sufer un proces de dedifereniere i genereaz
meristeme. Din aceste meristeme, prin redifereniere, vor lua natere organe.
210
Organogeneza constituie momentul de baz n asigurarea multiplicrii
vegetative.
De multe ori la nivelul calusului se pot identifica formaiuni
meristematice, aflate ntr-un stadiu tnr, nedifereniat funcional n meristem
generator de rdcini, sau n meristem generator de tulpini, fiind numite
promeristeme. Tot legat de activitatea meristematic incipient, exist i un alt
termen, ntlnit n literatura de specialitate meristemoid (Torrey, 1966).
Aceast noiune se refer la formaiuni meristematice, abia schiate, cu direcie
de dezvoltare nedeterminat, aparent identice din punct de vedere morfologic.
Se tie c meristemul radicular al angiospermelor se deosebete
funcional de cel al tulpinilor nefiind interconvertibil, cu toate c axa caulinar i
cea radicular, n evoluia filogenetic, au o origine comun. Diferenierea
funcional a meristemului se face, probabil, n stadiul de promeristem; n cazul
meristemoizilor pot fi deja identificate trei tipuri de meristeme ce evolueaz n:
meristem proliferativ, meristem generator de rdcini i meristem de tip
caulogen. Dar nu se cunoate dac aceti meristemoizi sunt identici sau prezint
deja amprenta determinismului lor funcional, radicular i caulinar.
Meristemele radiculare, funcie de originea lor se mpart n mai multe
categorii:
-meristem apical situat n vrful rdcinilor;
-meristem lateral format pe rdcina principal;
-meristem adventiv provocat n a se forma la nivelul tulpinilor,
frunzelor sau al altor organe, care n mod natural nu sunt purttoare de rdcini.
Inducerea formrii acestor meristeme radiculare adventive constituie baza
multiplicrii vegetative prin butai, marcote sau organe de rezerv;
-meristeme neoformate la nivelul calusului, ca o varietate de meristem
adventiv.
Meristemele caulinare pot fi mprite astfel:
-meristeme apicale (terminale) derivate din muguraul embrionului;
-meristeme axilare aflate la axila frunzelor;
-meristeme adventive formate pe diverse organe;
-meristeme neoformate generate la nivelul calusurilor cultivate in vitro.
Formarea meristemelor i organogeneza sunt procese care se petrec
treptat, sub control genetic i hormonal. Factorii de mediu pot i ei stimula
inducerea i viteza de desfurare a proceselor de organogenez. Hormonii sau
regulatorii de cretere de sintez constituie factori cu rol hotrtor n
direcionarea proceselor de difereniere a meristemelor, n meristeme radiculare
sau caulinare. Auxinele intervin n reglarea formrii meristemelor radiculare iar
citochininele n neogeneza de mugurai.
Explantele meristematice caulinare sunt frecvent folosite n tehnicile de
multiplicare i de micropropagare a o serie de specii de interes economic.
211
Astfel, se poate concluziona faptul c, la plantele superioare exist o
diversitate de meristeme clasificate, dup localizarea lor n plant. Meristemele
mai pot fi clasificate i n alte dou categorii:
-meristeme histogene care produc obinuit numai esuturi;
-meristeme organogene care dau natere la esuturi ce formeaz
organe;
Spre deosebire de meristemele radiculare, care sunt foarte simple ca
structur i funciune, meristemele caulinare sunt deosebit de complexe
structural i funcional. Ele variaz ca aspect i potenialitate, de la o specie la
alta. Meristemele caulinare, terminale, constituie, n fapt, un microbuta, ntruct
vrful vegetativ al plantei, inoculat in vitro i formeaz un propriu sistem
radicular, n partea sa bazal. n consecin, acest tip de meristem este frecvent
folosit n tehnicile de multiplicare i de propagare accelerat a plantelor, pe
medii aseptice.
Potenialitatea regenerativ a acestor meristeme este, de regul, extrem
de mare. Ele se adapteaz bine la condiiile in vitro, suport uor traumatismul
provocat de explantare, relundu-i activitatea n urma trecerii lor pe medii
aseptice, genernd plante. Acest fapt presupune att creterea axei mugurelui i
a primordiilor sale, cu dezvoltarea frunzulielor, ct i neogeneza de rdcini. n
final, meristemul terminal, apical sau axial genereaz una sau mai multe plante,
n funcie de balana hormonal prezent n mediul de cultur. Meristemele
terminale, caulinare ale plantelor lemnoase ridic probleme speciale, ntruct ele
aparin unor plante perene, multianuale, de talie mare, ceea ce ngreuneaz o
alimentare optim a lor cu ap, cu nutrieni i hormoni. Acest lucru constituie
impedimente fiziologice care, pe plan funcional, se traduc printr-o regresie a
capacitii regenerative a celulelor lor, soldat cu o scdere a totipotenialitii
acestor meristeme.
Meristemul apical se formeaz n momentul organizrii embrionului i
rmne activ n tot cursul vieii plantei. Excepie fac plantele perene din zonele
temperate, la care meristemul apical n decursul sezonului de iarn se afl n
stare de laten.
Prin intermediul culturii de meristeme apicale, terminale sau laterale,
se poate realiza o rapid multiplicare clonal a plantelor, ndeosebi a celor
horticole i a unor specii silvice.
Prin cultivarea in vitro a meristemelor se obine o regenerare de plante
identice din punct de vedere genetic cu planta mam donatoare, fapt deosebit de
important n horticultur, asigurndu-se astfel o multiplicare clonal.
Un alt aspect, foarte important, care deriv din nmulirea meristematic
a plantelor, este acela al obinerii de material sditor sntos, n esuturile cruia
este prevenit orice fel de atac fitopatogen. Plantulele generate in vitro din
meristeme, nsoite numai de prima pereche de primordii foliare, sunt libere de
viroze, deosebit de pgubitoare i imposibil de evitat i de combtut n condiiile
212
nmulirii vegetative a plantelor. Numai propagarea plantelor prin semine poate
asigura, ntr-o oarecare msur, eradicarea parial, temporar, a virozelor, tiut
fiind faptul c, chiar i prin semine se transmit o serie de viroze. Dar
nenumrate plante horticole nu se pot nmulii prin semine sau, la unele soiuri,
multiplicarea prin semine este dificil (orhidee), ori seminele nu sunt fertile,
ceea ce a fcut ca nmulirea acestora pe cale vegetativ s constituie unica
metod de multiplicare a lor. Pe de alt parte, multiplicarea plantelor pe cale
asexuat, prin metode de nmulire vegetativ clasic, a condus la degenerarea
descendenilor ca o consecin a perpeturii, an de an, a infeciilor virale. Astfel,
o cultur sntoas de garoafe (Rudelle, 1977), nmulite timp de cinci ani prin
butire clasic, a prezentat o rspndire n mas a virozelor, multe din ele,
cauznd degenerri. Totodat, multiplicarea vegetativ, prin metode tradiionale,
are drept consecin i o perpetuare a unor mutaii somatice.
Virozele plantelor aduc mari daune culturilor, la cartofi i cpun, n
floricultur i n arboricultur, ntruct reduc vigurozitatea plantelor, scad
potenialul productiv al acestora, producia realizat este mediocr i produsele
agricole au un grad naintat de depreciere a calitii lor. Butaii obinui din
plante virozate au o capacitate redus de nrdcinare i realizeaz un procent
sczut de prindere. Pe de alt parte, din cauza meninerii n cultur a unor plante
virozate se creeaz pericolul transmiterii virusurilor i la alte plante, prin
vectorii biologici prezeni n cultur.
Primele ncercri de cultivare a extremitilor de tulpini i de rdcini
sunt citate ca fiind realizate nc din 1922, de ctre Kotte i de ctre Robbins, la
mazre i porumb, dar fr mare succes. Ulterior, n 1946, Ball a reuit s obin
plante din apexuri meristematice la Lupinus albus i la Trapaeolum majus. Pn
n jurul anilor 1949-1950 cultura propriu-zis de meristeme nu era cunoscut,
abia ncepnd din anul 1949, prin lucrrile lui Wetmore i Morel s-au pus bazele
cercetrilor sistematice privind cunoaterea reaciei explantelor meristematice la
condiii de cultur, precum i cu privire la comportamentul in vitro al
meristemelor diverselor specii, de diferite dimensiuni, cultivate n condiii
variate de mediu.
Dac meritul de a fi reuit regenerarea de plante din meristeme izolate
revine lui Ball, n schimb prioritatea n ceea ce privete obinerea de plante
sntoase, devirozate, prin cultura in vitro a meristemelor apicale, recoltate de la
plante bolnave, revine lui Morel (1959-1960). Inspirat fiind de rezultatele
obinute ntre anii 1949-1950 de ctre Limasset i Cornuet, Morel a avut intuiia
de a cultiva in vitro meristeme apicale de aproximativ 75-100 m lime i 150-
200 m nlime, cu 1-2 primordii foliare.
Experienele efectuate de Limasset i Cornuet au constat n urmrirea,
prin analize serologice, a gradului de rspndire i a evalurii intensitii
virozrii organelor vegetative aeriene a plantelor la diferite distane de apex. Ei
au constatat o distribuie inegal a virusurilor n corpul plantelor i au observat
213
un gradient mai sczut de infecie viral, pe msura apropierii de vrful
vegetativ, respectiv de meristemul apical. Cea mai redus infecie viral a fost
semnalat n sucul extras din frunzele aflate nc n mugur. Pornind de la aceste
fapte, Limasset i Cornuet au extirpat, aseptic o calot de esut apical sau
meristem i cteva primordii foliare i au depus-o pe o frunz tnr de tutun,
lezat printr-o scarificare superficial. Dup trecerea unei perioade de incubaie
s-a putut constata c frunzele de tutun, pe care s-a amplasat exclusiv calota
meristematic, au fost virozate n proporie de 60%, n timp ce frunzele pe care
s-au aplicat esuturi subiacente meristemului (primordii foliare mai ndeprtate
de meristem) s-a infectat n procent de 100%. Aceste experiene ia condus pe
Limasset i Cornuet la concluzia c n apexul caulinar migrarea i nmulirea
virusurilor este oprit.
nc din 1952, Morel i Martin au intuit faptul c, pornind de la plante
virozate, prin explantarea i cultivarea in vitro a meristemului caulinar, apical,
se poate obine o plant sntoas, conservnd, n acelai timp, caracterele
genetice ale plantei mam. Aceast ipotez a fost atestat de ctre Morel i
Martin prin experiene efectuate cu plante de dalie. Cultura de dalii a beneficiat
prima de eradicarea virozelor, prin procedeul imaginat i pus n practic de ctre
Morel i Martin. Tulpinile generate in vitro, neposednd rdcini, au fost
transformate n minibutai. Acetia au dat natere la plante libere de viroze. Au
urmat apoi cartofii i orhideele. n 1957, Quak a remarcat c metoda lui Morel i
Martin este posibil de aplicat, cu aceleai rezultate, la garoafe. Din acel moment
s-au demarat cercetrile n scopul stabilirii unor metode intensive, industriale, de
controlare i producere a unui material sditor sntos, cu randament economic
asigurat, avnd ca obiectiv obinerea de flori de calitate superioar.
n acest mod a fost elaborat ipoteza imunitii poteniale a celulelor
meristematice la atacul viral. Dac prelevarea se face de la o plant neinfectat,
sau care prezint o infecie viral slab, atunci cresc i mai mult ansele de a
preleva explante meristematice, lipsite de infecii virale.
Din pcate, plantele devirozate nu sunt imune la viroze. Ele se pot
mbolnvi tot att de repede ca i oricare alt plant. De regul, din plantele
devirozate, aflate in vitro se asigur multiplicarea lor, tot pe medii aseptice, prin
minibutai, sau se induce formarea de colonii de propagule, sau se constituie o
plantaie mam, donatoare de meristeme ori chiar de butai, plantaie executat
n condiii speciale de protecie, nct plantele s fie ferite de atac zoopatogen.
Concomitent cu eradicarea virozelor, multiplicarea in vitro a plantelor,
prin explante meristematice, asigur i eliminarea din materialul sditor a
fungilor i a bacteriilor. Astfel, la garoafe s-a realizat eliberarea plantelor de
infecii cu Fusarium roseum, iar la Pelargonium i Diffenbachia eradicarea
bacteriozelor sistemice (Walkey, 1979).
Cercetrile recente au dovedit ns, c nu toate meristemele sunt libere
de infecii virale. Invazia meristemelor cu virusuri este dependent de tipul
214
meristemului, al virusului i de specia plantei parazitate. Cu ct explantele
meristematice sunt mai mici, cu att ansa prelevrii de celule lipsite de virusuri
este mai mare, dar cu ct inoculul meristematic este mai mare, cu att este mai
ridicat capacitatea lor regenerativ.
Nu toate virozele pot fi eradicate prin procedeele de nmulire
meristematic (Martin, 1977). De exemplu, la cartof, virusul X poate fi nlturat,
prin nmulire meristematic, numai n procent de 1%. Unele virusuri pot exista
chiar i n meristemele apicale (Hollings, 1962).
Termoterapia vine n ajutorul culturilor de meristeme pentru a completa
metodele de combatere a infeciilor virale, la plante. Termoterapia a fost
elaborat de ctre Kunkel, n 1936. Aceasta const n supunerea plantelor
bolnave la temperaturi cuprinse ntre 35-39oC, timp de 2-4 sptmni. n cursul
aplicrii termoterapiei virusurile nu se multiplic; ele rmn la nivelul celulelor
n care au fost surprinse n momentul declanrii tratamentului termoterapeutic.
Combinnd cultura de meristeme cu termoterapia se realizeaz, cu anse
foarte mari de reuit, eliminarea virusurilor din plantele generate in vitro. n
consecin, mersitemele sunt prelevate de la plante supuse, prealabil explantrii,
tratamentului termoterapeutic. Dar, n aceast situaie, descrete vitalitatea
plantelor donatoare, concomitent cu scderea capacitii de supravieuire i de
regenerare a celulelor meristematice. Pe durata termoterapiei, apexul se
alungete iar virusurile, nemultiplicndu-se, rmn n celulele bazale ale conului
vegetativ, ceea ce nlesnete prelevarea unor explante apicale mai mari de pn
la 1 mm, micornd pericolul recoltrii unor esuturi subiacente meristemului,
infectate cu germeni fitopatogeni. n consecin, explantele meristematice
prelevate de la plante supuse termoterapiei, fiind mai mari, capacitatea lor
regenerativ i de cretere va fi mai ridicat, ceea ce compenseaz epuizarea
fiziologic, cauzat de termoterapie.
Kassanis (1950) a dovedit c unul din virusurile cartofului, localizat n
frunze, poate fi inactivat la nivelul tuberculilor, prin aplicarea termoterapiei. Dar
tot Kassanis a precizat c la tomate exist virusuri a cror activitate este
suprimat abia la 80oC. acesta a fost unul dintre motivele care i-a determinat pe
cercettori s prelungeasc durata termoterapiei, de la cteva zile la cteva luni
i s ridice temperatura de la 35 la 40oC (Quak, 1977).
Hakkaart i Quak (1964), experimentnd cu meristeme excizate de la
crizanteme, de pn la 1 mm lungime cu 2-3 primordii foliare, au constatat c
prelungirea duratei de termoterapie de la 10-20 zile la 30 zile a dus la sporirea
procentului de plante devirozate, de la 9 la 90% dar prelungirea tratamentului
termoterapeutic peste aceast durat de timp (pn la 50-60 zile)nu a condus la
depirea procentului de plante devirozate.
n unele cazuri, se poate realiza distrugerea virusului din vrful
meristematic i n decursul cultivrii esuturilor in vitro. Astfel, Hollings i
Stone (1964), au reuit aceast performan la garoafe, iar Walkey i colab.
215
(1969) la cire. Aceast eradicare endogen a virozei, n interiorul celulelor
cultivate pe medii aseptice, poate fi un rezultat al unui proces metabolic
dereglat, ca o consecin a traumatizrii celulelor excizate. Cu ct a fost mai mic
fragmentul de esut excizat, cu att traumatismul a fost mai puternic i efectul
endogen, distructiv, exercitat asupra virusului, a fost mai mare (Walkey, 1980).
De regul ns, este imposibil s regenerm anumite specii de plante din
fragmente att de mici de esuturi; ori n alte condiii, nu poate fi realizat o
traum de o aa amploare nct s se produc o disturbare a metabolismului
virusurilor din celulele explantate, soldat cu suprimarea atacului viral.
Explicaiile privind modul n care celulele meristematice rezist
infeciilor nclin spre justificri de ordin molecular. Una din ipoteze susine c
exist o competitivitate ntre celula gazd i parazit, n ceea ce privete utilizarea
unor enzime implicate n procese de restituie; alt ipotez, susine c celula
meristematic utilizeaz ARN viral, sau c substanele generate n urma
traumatizrii celulelor ar suprima virusurile prezente n celule.
n anul 1978, Walkey, a reuit obinerea de plante sntoase i prin
cultivarea in vitro a esutului gametofitic femel, respectiv ovare sau esut
nucelar, sau a meristemului floral.
Trebuie subliniat i marele merit pe care Morel l-a avut n intuirea
importanei deosebite a descoperiri posibilitii de a obine plante sntoase din
plante bolnave, precum i a direciilor aplicative pe care le-a deschis aceast
tehnic, efectuat n condiii aseptice. Cele mai mari realizri le-a avut Morel n
multiplicarea in vitro la orhidee. Astfel, n anul 1963, Morel comunica primele
rezultate cu privire la cultivarea in vitro a meristemului apical de orhidee.
Acestea se refereau la faptul c meristemele de orhidee, cultivate pe medii
aseptice, genereaz un glomerul de 1-2 mm, de culoare verde, numit protocorm.
Prin ruperea i cultivarea in vitro a fragmentelor va rezulta o mas globuloas,
un glomerul de cca 3-4 mm slab difereniat histologic, constituit dintr-un
parechim, cu celule mari, srace n citoplasm i cu vacuole ntinse. n partea
central a glomerulului se disting cteva fascicule vasculare. Fragmentnd
periodic aceast mas i cultivnd-o in vitro s-a putut remarca o foarte mare
capacitate de multiplicare vegetativ a celulelor detaate. n anul 1978,
Murashige afirma c, dintr-un meristem de orhidee, n decursul unui an, prin
fragmentri i subcultivri repetate ale protocormilor, se pot obine cca 4
milioane de noi plante de orhidee. Protocormul produs in vitro este asemntor
cu protocormul de germinaie, rezultat din embrionii seminelor.
n 1959, Martin a intuit posibilitatea crerii unei bnci cu explante, n
care s fie conservat materialul biologic meristematic sntos. Prin aceast
tehnic, astzi, materialul vegetal generat in vitro este uor conservat, esuturile
deinnd nealterat, ntreaga lor capacitate regenerativ.
Valoarea mare a culturii de meristeme const deci n:
-asigurarea uniformitii genetice a materialului sditor, generat in vitro;
216
-eliminarea agenilor fito sau zoopatogeni;
-creterea la maximum a coeficientului de multiplicare, n cel mai scurt
timp, a unui exemplar vegetal;
-obinerea unui material sditor juvenilizat, imposibil de realizat prin
metode tradiionale de nmulire vegetativ;
-conservarea prin temperaturi sczute a inoculilor meristematici, pentru o
lung perioad de timp, ntr-o anumit faz de dezvoltare, pentru a avea un stoc
permanent, ce s asigure, oricnd, necesarul de material sditor solicitat pe
pia;
-conservarea germoplasmei n bnci de gene.
n extinderea rapid a acestor practici, n regim industrial a predominat
factorul economic rezultat, n primul rnd, din aspectele fitosanitare, respectiv
din obinerea unor culturi viguroase, sntoase. Astfel, cartoful, plat extrem de
important att n hrana omului i pentru industrializare dar i n hrana
animalelor, a beneficiat primul de extinderea metodelor de redresare a
vigurozitii culturilor prin eradicarea virozelor, cultivnd in vitro meristemele
caulinare. Cartoful este atacat de nenumrate virusuri care, de cele mai multe
ori, pot fi prezente concomitent n esuturi, ceea ce epuizeaz planta i scade,
considerabil recolta. Pierderile sunt cifrate la 15-25%. Din nefericire, nu toate
tipurile de virusuri pot fi n egal msur combtute. Astfel, la cartof, dintre
toate virusurile prezente foarte des n cultur (A, Y, M, S, X) virusul A este mai
uor de ndeprtat, comparativ cu virusul X. Multiplicarea in vitro prin
meristeme a luat o mare amploare i la garoafe. Astfel, n Frana, cifra de afaceri
realizat, n categoria florilor tiate, prin vnzarea garoafelor, ocup locul doi iar
exportul horticol francez este reprezentat n proporie de 80% de garoafe, 90%
dintre acestea provenind din mutaii de culoare, practicate la tipul american de
garoaf creat de William Sim, n 1939. Multiplicarea acestui cultivar s-a fcut n
miliarde de exemplare. Conservarea calitilor sale genetice se datoreaz
metodei de multiplicare prin cultura in vitro a meristemelor caulinare, apicale.
Infeciile virale afecteaz nu numai calitatea florilor, ci reduce foarte mult i
capacitatea de nrdcinare a butailor. n laboratoarele unei singure uniti se
produc anual, in vitro, cca 10 000 de garoafe. nmulirea meristematic a permis
vindecarea garoafelor i de boli vasculare, respectiv eradicarea atacului de
Phialophora cinerescens, Fusarium oxysporum, i a bacteriozelor Pseudomonas
caryophylli i Pectobacterium parthenii. De o mare importan este cultura
orhideelor, obinerea de material sditor devirozat la garoafe, cpun,
crizanteme, la pomi fructiferi, la arbori i arbuti.
Dar cultivarea in vitro a meristemelor nu nseamn urmrirea, ca scop n
sine, numai eradicarea bolilor ci pur i simplu, multiplicarea unor clone,
respectiv genotipuri valoroase. Aceast metod este cu att mai important cu
ct se pleac de la un material iniial devirozat.
217
Se practic diferite metode de multiplicare in vitro prin intermediul
meristemului de tip caulinar i anume:
-unele procedee vizeaz cultivarea exclusiv a celulelor conului
meristematic, fr primordii foliare, pentru studierea proceselor regenerative, n
dependen de dimensiunea redus a explantelor i de consecinele
traumatismelor provocate;
-altele privesc obinerea de material sditor devirozat, explantele
constnd din meristeme recoltate mpreun cu prima pereche de primordii
foliare, lungimea explantelor fiind de pn la 500 m, respectiv 0,25-0,7 mm;
-altele au n vedere obinerea unui numr foarte mare de plantule, n timp
scurt utiliznd explante mai mari de 1-5 mm sau impulsionnd diferenierea de
meristeme axilare i de muguri adventivi pe apexul iniial.
n oricare din cazuri trebuie s avem n vedere selectarea, cu mare atenie
i pricepere, a plantelor mam, donatoare de explante. Este de dorit ca ele s fie
sntoase i s se afle ntr-o perioad de cretere activ. Latena organelor
uneori ridic probleme speciale i implic aplicarea unor tratamente termice sau
hormonale, pentru a stimula emergena meristemelor. Alegerea explantelor,
sterilizarea organelor, tipul de mediu de cultur folosit, regimul din camerele de
cretere influeneaz supravieuirea explantelor. Restabilirea proceselor
biologice, de diviziune i de regenerare precum i sensul desfurrii histo i
organogenezei, diferenierea de plante, dezvoltarea lor i apoi capacitatea
adaptativ a acestora la mediul normal sunt influenate att de factori endogeni,
ct mai ales de cei exogeni, n special de balana hormonal i de regimul de
lumin, respectiv de temperatur.
De regul meristemele caulinare, terminale, apicale, dovedesc cea mai
rapid cretere. Cu toate acestea i meristemele laterale, prelevate din mugurii
axilari, pot fi folosite n culturile de meristeme. La crizanteme din 5000 de
vrfuri meristematice, 32% din mugurii apicali, terminali, au crescut, genernd
plante mature, n timp ce numai 18% din mugurii laterali au format noi plante.
Mrimea explantelor se stabilete n funcie de specie i de scopul
urmrit. Cnd se are n vedere obinerea de plante libere de viroze la garoafe,
explantul nu trebuie s depeasc 0,5 mm dar nici s fie mai mic de 0,2 mm,
deoarece, n acest caz, este dificil nrdcinarea plantulelor generate din
meristeme. n cazul n care s-a aplicat corect termoterapia explantul poate fi mai
mare, de pn la 1 mm. n camerele de cretere intensitatea luminii se
recomand s fie de 2400-2600 luci, n regim de fotoperioad cu 16 ore lumin
i 8 ore ntuneric. n alte cazuri, lumina trebuie intensificat la 3500-4000 luci,
iar la conifere se poate ajunge chiar la o intensitate de peste 10 000 luci.
Temperatura trebuie s fie stabilizat ntre 22-25oC. Uneori exist indicaii
stricte cu privire la regimul termic i de iluminare, cerute de un anumit tip de
cultur, potrivit unei anumite specii sau corespunztor unei anumite etape de
dezvoltare a inoculilor.
218
n literatura de specialitate sunt recomandri i cu privire la sezonul cel
mai potrivit pentru prelevarea i inocularea unui anumit tip de meristem. Astfel,
se specific c meristemele de garoafe supravieuiesc, n proporie mai mare,
dac sunt recoltate primvara sau toamna devreme; meristemele recoltate iarna
nrdcineaz mai uor iar cele recoltate vara dau cel mai ridicat procent de
plantule libere de viroze (Van Os, 1964). La cartof, meristemele recoltate
primvara sau vara, de timpuriu, nrdcineaz mult mai repede n raport cu cele
care sunt prelevate i inoculate la finele anului.
n ceea ce privete substratul de cultur, de cele mai multe ori, se
utilizeaz medii de cultur solide. La cartof, garoafe i la alte specii se pot folosi
i mediile lichide. PH-ul mediului de cultur poate constitui un factor limitativ al
creterii i dezvoltrii meristemului cultivat in vitro. Astfel, de regul, pH-ul de
5,5-5,8 este indicat ca fiind optim; dup autoclavare, pH-ul scade, iar n decurs
de o sptmn de la cultivarea esuturilor, pH-ul descrete pn aproape de 5,4.
Un pH iniial sczut inhib formarea rdcinilor.
n compoziia mediilor de cultur sunt incluse macro i microelemente,
FeEDTA, vitamine, aminoacizi i o surs de carbon organic, reprezentat, de
regul de zaharoz n concentraie de 2-3%. Natura hormonilor i concentraia
acestora variaz de la o specie la alta, n funcie de scopul urmrit. Astfel, pentru
nrdcinare se folosesc cu precdere ANA i AIA, care ns folosite timp
ndelungat pot duce la inhibarea creterii rdcinilor. n acest caz, se recomand
subcultivarea explantelor pe medii lipsite de auxine. Citochininele stimuleaz
creterea meristemelor, mai ales n cazul n care ele se fal n laten, precum i
formarea de nenumrai mugurai. Concentraia fitohormonilor de cretere
variaz n diferitele faze de evoluie ale meristemelor.
Plantele complet formate prezentnd rdcini i tulpini vor fi scoase
din condiiile in vitro, fiind trecute n condiiile mediului septic. Ele vor fi
transferate n ghivece mici, n amestec de perlit cu pmnt. Se poate realiza
transferul lstrailor n mediul septic,chiar nenrdcinai, aceast operaiune
putnd determina nrdcinarea lor. Buys (1969) recomand transferarea
timpurie n sol a plantelor de garoafe neoformate in vitro, ntruct rdciniele
generate in vitro sunt n mic msur folositoare n sol, iar prelungirea duratei
de meninere a plntuelor n flacoanele de cultur, ridic nejustificat costul
materialului plantat rezultat. Atunci cnd plantele sunt suficient de mari, se va
testa serologic, eventuala prezen a virusurilor i gradul de infecie.
Metodele de testare a virozelor i natura acestora variaz de la o specie la
alta. n 1977, Clark i Adams au pus la punct un procedeu ELISA de
identificare a prezenei virusurilor, iar n 1973, Derrick, a preparat un ser septic
pentru electronomicroscopie, metode de mare sensibilitate n determinrile de
virusologie vegetal. Pentru a uura exactitatea investigaiilor este de dorit s se
fac o analiz a infeciilor la nivelul plantelor donatoare de meristeme, precum
i n cultura, sau culturile apropiate. Dup stabilirea unei culturi lipsite de
219
germeni este absolut indispensabil ca plantele s fie meninute n condiii
speciale fie c ele sunt prezervate n condiii de temperaturi sczute, n
recipientele lor de cultur, pe medii aseptice, fie c sunt cultivate n teren, ntr-
un perimetru ferit de infecii, metodele fiind menite s realizeze evitarea unei
reinfectri a plantelor.
Metodele criobiologice de prezervare a materialului obinut in vitro sunt
economice i indispensabile pentru conservarea, pe termen lung, a
germoplasmei precum i a unei cantiti limitate de material iniial, devirozat.
Crioconservarea poate fi realizat la temperaturi extrem de sczute. n aceste
condiii se asigur reducerea tuturor funciilor metabolice. Primele ncercri de
crioconservare au fost fcute de ctre Seiberg n anul 1976, la garoafe. Ulterior
s-a reuit i conservarea altor tipuri de inoculi: calus, celule sau protoplati.
Tehnicile de crioconservare presupun utilizarea unor substane crioprotectoare,
cu rol n prevenirea daunelor cauzate de nghearea brusc a celulelor, respectiv
formarea cristalelor de ghea. Cele mai folosite substane crioprotectoare sunt
dimetilsulfoxidul (DMSO) i glicerolul (Kartha, 1981, citat de Cachi, 1984).
Meristemul este esutul cel mai potrivit pentru a fi conservat la temepraturi
sczute, graie alctuirii particulare a celulelor lui. Astfel, el i poate pstra
ntreaga capacitate regenerativ, ntruct n momentul repunerii lui n condiii
optime de mediu, celulele i reiau activitatea metabolic i fiziologic normal.
Meristemul se preteaz cel mai bine conservrii prin crioconservare, celulele lui
fiind srace n vacuole i avnd o citoplasm dens.
Pentru executarea operaiunilor de congelare, ndeosebi pentru coborrea
gradat a temperaturii, exist dispozitive speciale. O metod accesibil
preconizeaz introducerea flacoanelor cu inoculi ntr-o baie de alcool, mediu n
care se produce descreterea gradat a temperaturii.
n anul 1980, Dale i colab. Au pus la punct o metod de stocare la
temperaturi sczute a unor graminee sau a unor plante legumicole, constnd n
conservarea ndelungat a plantelor, generate in vitro, prin meninerea lor la
temperaturi de 2-4oC, n regim de 8 ore lumin pe zi si o intensitate de 300 luci.
Cultura poate fi meninut astfel 10-11 luni, dup care se recomand ca aceasta
s fie transferat pe mediu proaspt.
O alt problem deosebit de biologie se ridic n cazul plantelor
generate in vitro. Plantele provenite att din meristeme ct i din explante de alt
natur, prezint un grad de juvenilitate similar plantelor dezvoltate din embrionii
seminelor. Astfel, materialul de plantat, generat in vitro, este superior celui
obinut prin metodele tradiionale: butire, marcotaj, altoire.
Juvenilitatea plantelor generate in vitro poate fi constatat morfologic, de
exemplu la plantulele de cpun, difereniate din meristeme. La cpun, frunzele
tinere sunt ntregi, n timp ce frunzele plantelor btrne sunt trifoliate. Generarea
de frunzulie ntregi sisteaz la inoculi n momentul n care se depete faza de
220
morfogenez, constnd n proliferarea a noi muguri axilari, prin repicri repetate
i cultivarea inoculilor pe mediu cu citochinin.
Un caz particular este acela al rentineririi unor organe de pe care
urmeaz s fie prelevate meristeme apicale. Un exemplu l constituie plantele
lemnoase, multianuale. Explantele sau butaii prelevai de la astfel de plante i
pierd capacitatea de nrdcinare. La aceste plante se practic diferite metode de
rentinerire a materialului biologic prin butiri sau microbutiri in vitro, altoiri
de apexuri de plante adulte pe tinere plantule.
Sfecla constituie un alt exemplu de plant a crei esuturi adulte prezint
o foarte sczut capacitate organogenetic. De aceea se recomand inducerea
formrii de meristem prin repicri succesive.
O problem deosebit o constituie aceea a meninerii meristemului
vegetativ, inoculat pe medii aseptice, ntr-o stare primar, ntruct n cazul n
care se inoculeaz un meristem vegetativ, prelevat de pe o tulpin florifer,
exist pericolul ca anumii factori de mediu s induc formarea florilor sau
invers, s grbim, prin reglarea fotoperioadei i a altor factori de mediu,
transformarea unui mugur vegetativ, n mugure florifer. Reglarea fotoperioadei
i sporirea cantitii de zaharoz din mediu la 40-50 g/l sunt factori care par s
determine transformarea apexului vegetativ n florifer.
La numeroase plante, detaarea meristemelor florale i cultivarea lor in
vitro imprim esuturilor capacitatea de a redeveni meristeme vegetative,
genernd mugurai. Adeseori, se formeaz muguri axilari sau adventivi acolo
unde altfel, normal ar trebui s se formeze boboci. Inocularea in vitro, pe medii,
cu sau fr fitohormoni, a unor fragmente desprinse din inflorescene tinere
conduce la formarea a numeroi muguri. La conopid, prelevarea unui mic
explant din apexul preinflorescenei i cultivarea lui pe mediu lichid, cu o auxin
(AIA), provoac reveria esuturilor din florifere n vegetative. Astfel, poate fi
nmulit planta pe cale vegetativ (Crisp i colab., 1974, citat de Cachi,1984).
Originea comun a meristemului vegetativ i a celui florifer face ca
transformarea, n direcia diferenierii morfologice i funcionale s fie posibil,
ntr-o anumit faz de dezvoltare a plantelor sau a organelor. Reuita este
dependent de vrsta esutului, de specie i de condiiile de mediu.
Ambele tipuri de meristeme, dirijate corect, pot servi la multiplicarea in
vitro a unor plante.
223
Calusul obinut poate fi de tip regenerativ care totdeauna d natere la
noi plante i un calus de tip neregenerativ ce prezint, de regul, o cretere
luxuriant, din el difereniindu-se rdcini, i uneori mugurai, dar niciodat
plante (Nabors, 1982). Aceste dou tipuri de calus au mai fost denumite calusuri
embriogene i neembriogene. Calusul embriogen este dens, translucid sau opac
de culoare alb-lptoas, spre galben, ori galben-verde. Citologic se remarc
zone compacte, cu celule nedifereniate, ce pot genera embrioni sau embrioizi,
din care ulterior se vor forma plante complet formate. Calusul neembriogen este
constituit dintr-o mas cristalin, transparent, de culoare alb, brunie sau verde.
Acest tip de calus prezint o consisten mai lax, fiind mai friabil, desfcndu-
se uor n pachete de celule. Regiunile friabile prezint celule mari, mult
vacuolizate. Aceste regiuni genereaz rdcini i mai rar mugurai dar niciodat
plante. Nabors a fost primul care a dovedit c cea mai ridicat capacitate
regenerativ, meninut timp ndelungat o prezint calusul embriogen, denumit
de tip regenerativ. Tot Nabors a observat c acest calus regenerativ tinde s
devin neregenerativ; dup producerea acestei reversibiliti procesul este
definitiv, ntruct cele dou forme sau tipuri de calusuri, diferite funcional, nu
sunt interconvertibile. De altfel, cele dou tipuri de calusuri necesit fitohormoni
diferii, n doze variate, att pentru impulsionarea i susinerea creterii ct i
pentru difereniere. De regul, calusul neregenerativ crete abundent, n timp ce
calusul regenerativ are o cretere mult mai lent, chiar i pe medii potrivite
scopului meninerii unei creteri susinute a acestuia. Pentru a prentmpina
dezvoltarea neomogen a calusului se urmrete obinerea unui calus regenerativ
omogen sau cel puin predominant ca mas, ntr-o populaie de celule calusale.
Nabors a remarcat i faptul c ceea ce la un anumit moment, ntr-un anumit
stadiu de dezvoltare a calusului, pare s fie esut de tip neregenerativ, poate
genera, n continuare, regiuni regenerative, ce pot fi izolate i subcultivate
(Cachi, 1984).
Frecvent, cele mai bune medii de cultur, adecvate creterii optime a
esutului calusal, nu constituie medii corespunztoare producerii calusului de tip
regenerativ. n general, mediul Linsmaier-Skoog (1965) sau cele de compoziie
similar, respectiv srace n azot cu pH-ul 5,5 sunt de preferat. La cereale se
recomand adugarea n mediu a acidului 2,4,5 triclorfenoxiacetic, avnd efect
pozitiv n susinerea creterii calusului. Acest mediu ns nu este cel mai potrivit
pentru inducerea i meninerea proceselor regenerative.
n general, calusul care provine din rdcini de plantule de cereale
posed mai multe regiuni cu calus de tip regenerativ, n raport cu calusul derivat
din embrioni imaturi. Dar i la calusul bogat n zone regenerative acestea
reprezint numai cca 1-10% din totalul masei calusale. Dac regiunile cu calus
de tip regenerativ sunt subcultivate pe medii care s impulsioneze i s susin
procesele regenerative, celulele lui vor da n final natere la plante.
224
Calusul de tip regenerativ poate fi obinut i din calusul secundar, prin
meninerea calusului regenerativ pe mediu potrivit creterii acestuia i
nefavorabil obinerii de plante, intervenindu-se periodic, prin subcultivri de
ntreinere. Pe alt cale se pot identifica i izola insulele de calus regenerativ, pe
msur ce ele apar pe calusul de tip neregenerativ, realizndu-se transferarea lor
pe un mediu de cretere adecvat.
n decursul timpului s-a constatat c se obine mai mult calus din inoculii
cultivai la ntuneric dect din cei crescui la lumin. Regiunile cu calus
regenerativ sunt mai greu depistabile pe calusurile crescute la ntuneric.
Procentul de formare al calusului regenerativ crete ns la calusul crescut n
condiii de ntuneric. La gru, calusul trebuie transferat la interval de cinci
sptmni, pe mediu potrivit induciei diferenierii de plante. La calusul de gru,
regenerarea se realizeaz pe un mediu lipsit de fitohormoni de cretere; astfel
din calusul de tip regenerativ, n cca 2-5 sptmni dup transferarea pe mediu
adecvat proceselor regenerative, are loc formarea de plante. Pe un astfel de
mediu, calusul de tip regenerativ nu va mai crete. Dac calusul este mixt,
componenta neregenerativ continu s creasc mult; concomitent, ns, din
poriunile de calus de tip regenerativ, n cultur se difereniaz i plante. Dup
dou subcultivri ale calusului de tip regenerativ, pe mediu lipsit de fitohormoni
de cretere, potrivit inducerii neoformrii de plante, se recomand transferarea
calusului rmas, pe un mediu coninnd auxin, pentru a favoriza continuarea
creterii acestuia.
Plantele obinute sunt detaate de calus i sunt plasate n vase deschise,
coninnd perlit, care va fi udat cu ap de la robinet, urmnd ca dup 1-2
sptmni, plantele bine nrdcinate, s fie transferate n ghivece cu pmnt n
amestec cu perlit.
Calusul poate fi folosit i n obinerea unei culturi de celule, cultivndu-l
pe medii lichide, obinnd-se astfel suspensiile celulare folosite n diferite
scopuri.
n vederea obinerii de calus se parcurg urmtoarele etape:
-alegerea materialului vegetal, din care se va executa prelevarea
explantelor. Calusul poate fi obinut din explante provenite din diverse surse:
semine, embrioni, rdcini, esut de rezerv, frunze, ramuri, antere, ovare;
-prepararea mediilor de cultur i alegerea tipului de mediu se vor face n
funcie de scopul propus. Atunci cnd scopul este doar obinerea de calus se
poate utiliza un mediu de cultur oarecare, coninnd substane anorganice
(macro i microelemente) i substane organice (surs de carbon organic,
vitamine, aminoacizi i fitohormoni), iar solidificarea mediului se realizeaz cu
agar;
-sterilizarea recipientelor i a mediilor de cultur;
225
-pregtirea materialului vegetal n vederea dimensionrii explantelor. Se
realizeaz curirea organelor i dezinfectarea lor, folosind diverse procedee n
funcie de tipul de explant utilizat;
-dimensionarea explantelor este diferit n funcie de specia la care se
lucreaz i de tipul de organ folosit ca surs de explante;
-inocularea explantelor se realizeaz n condiii aseptice, la hota cu flux
de aer steril, fie pe mediu solid fie pe mediu lichid cnd ns este necesar
agitarea n vederea aerrii culturii;
-incubarea inoculilor se face fie la ntuneric, fie la lumin, de regul la
temperatura de 25oC;
-observarea proceselor de formare a calusului i urmrirea creterii
acestuia se face periodic, la diverse intervale de timp;
-subcultivarea periodic se realizeaz prin fragmentarea calusului i
inocularea fragmentelor pe medii proaspete. Subcultivarea se efectueaz la cca
4-6 sptmni, fiind obligatorie pentru meninerea viabilitii calusului. Este
important inerea unei evidene stricte a numrului de subcultivri suportate de
ctre fiecare fragment de esut calusal;
-urmrirea proceselor de organogenez sau de embriogenez funcie de
condiiile n care a fost cultivat calusul, de provenien i de vrsta acestuia.
esutul calusal are o utilizare variat. El constituie unul din materialele
biologice asupra cruia se pot aplica diferii ageni selectivi, n scopul obinerii
de linii rezistente, pentru selecionarea de plante care s fie tolerante la prezena
n mediul lor de via a unui anumit factor de stres. Nabors (1982) a reuit s
obin calus i apoi plante rezistente la concentraii ridicate de NaCl, substan
introdus n concentraii crescnde n mediul de cultur. Astfel, a raportat
obinerea de plante de Triticum, Orisa i Pennisetum tolerante la concentraii
ridicate de NaCl (0,6-0,9%), precum i la Avena la care pragul de suportabilitate
a fost ridicat la 0,03%. La gru, cel mai bun calus, care rspunde pozitiv la
astfel de tratamente este acela obinut din rdcinia embrionar, dezvoltat n
condiiile germinrii cariopselor pe medii aseptice.
Atunci cnd se urmrete cultivarea in vitro a embrionilor imaturi,
boabele de gru se sterilizeaz, dup care, la microscop, se detaeaz embrionii,
evitndu-se lezarea acestora i inoculndu-i pe mediu de cultur.
Mediul de cultur recomandat pentru gru (cariopse sau embrioni
imaturi) este Linsmaier-Skoog, coninnd macro i microelemente, vitamine,
surs de carbon (zaharoz), fitohormoni (2,4D sau 2,4,5 T) i agar.
Agenii selectivi la care dorim s obinem toleran pot fi introdui fie n
mediul de cultur, preparat pentru inducerea formrii de calus, fie se adaug n
substratul de cultur destinat repicrii calusului. n cazul n care se utilizeaz ca
material biologic de iniiere a culturii de calus, o varietate n mod natural mai
rezistent la aciunea duntoare a agentului selectiv n cauz, se realizeaz o
reducere a timpului de obinere a unei linii rezistente, cu caracterele dobndite
226
stabilizate, transmisibile descendenilor. S-a constatat c stabilitatea caracterelor
dobndite este dependent de durata n care s-a petrecut imprimarea acestor
caractere, respectiv durata de timp n care s-a operat selecia. Pentru a fi atins o
stabil toleran, chiar i n condiiile absenei ndelungate din mediu a agentului
selectiv, sunt necesare cel puin ase luni de clire i selecie, prin subcultivri
repetate. Menionm c i n situaia unor experimente de acest gen este prezent
fenomenul de manifestare a diferenierii capacitii regenerative a calusului, n
calus de tip regenerativ i neregenerativ. Numai din calusul de tip regenerativ se
poate induce formarea de noi plante; calusul de tip neregenerativ este inutilizabil
n acest gen de experimente.
Calusul poate fi utilizat i ca instrument de cercetare n diferite
experimente de fiziologie, n studierea problemelor de morfogenez, n
urmrirea unor modificri ultrastructurale, n analize de ordin biochimic, sub
aciunea unor anumii factori, administrai exogen sau n dependen de natura
inoculilor din care a provenit calusul.
n concluzie, calusul poate fi utilizat ca monitor al reaciei celulei
vegetale la o serie de substane sau condiii de cultur, permind efectuarea
unor experimente de fiziologie privind: creterea, reacia la pesticide, noxe, ioni
grei, respiraia, morfo i organogeneza, testarea viabilitii celulare, a biogenezei
unor produi primari sau secundari de metabolism.
229
plantule, n timp ce pe un mediu cu numai 1-2% zaharoz, se constat o serioas
limitare a dezvoltrii primordiilor radiculare.
Prin cultivarea in vitro a embrionilor de Taxaus embryo s-a reuit
scoaterea acestora din starea de laten, odat cu detaarea i desprinderea lor de
sub aciunea megagametofitului.
Cultura de endosperm constituie un excelent instrument pentru studierea
problemelor de morfogenez i se refer la cultura endospermului de tip
secundar, derivnd din diviziunea nucleului secundar al sacului embrionar,
avnd celule triploide, gimnospermele avnd un endosperm de tip primar.
Ambele tipuri de endosperm dein un rol important n alimentarea i susinerea
creterii embrionilor. La plantele dicotiledonate, de regul endospermul este
consumat n primele faze ale dezvoltrii embrionului, rolul de depozitare a
rezervelor nutritive revenind cotiledoanelor.
Primele experimente constnd n proliferarea endospermului imatur de
porumb au fost efectuate nc din anul 1933 de ctre Lampe i Mills. La Rue, n
anul 1947, a realizat creterea nelimitat a endospermului de porumb.
Cercetrile menionate au deschis calea unor experimente prin care s-a dovedit
c acest esut iniial are o capacitate ridicat de proliferare, formeaz uor
rdcinie, mugurai i chiar plantule. n aceast direcie, Straus i La Rue n
1954, au obinut rezultate excelente cultivnd endosperm de porumb, la 12 zile
de la polenizare. Cele mai bune varieti, potrivite pentru acest scop sunt cele de
porumb zaharat. Endospermul de porumb, la 8 zile dup polenizare, nu crete pe
medii aseptice. Deci, pentru reuita iniierii culturii este important stadiul n care
se afl diferenierea celulelor embrionului.
Endospermul matur, doar la cteva specii sau varieti, corespunde
scopului inducerii formrii de calus i anume: Zea mays, Lolium, Santalum,
Ricinus, Coffea arabica, Croton, Petroselinum hortense. Dintre acestea numai la
unele specii se manifest procese de organogenez. Endospermul de porumb, de
ricin, precum i la alte specii, genereaz o mas de calus n continu cretere,
fr organogenez, n timp ce la nivelul valusului de Petroselinum se observ
embriogeneza.
Cultura de embrioni ofer un important instrument n cercetrile de
embriologie i n embriogeneza experimental, constituind un sistem de tip
monitorial n redarea fazelor de cretere ale diferitelor pri componente ale
embrionilor. Aceste etape pot fi studiate n dependen de natura substratului de
cultur, de vrsta embrionului, n funcie de condiiile de mediu, oferind
importante informaii privind interferena diferitelor etape metabolice cu
regulatorii de cretere, procesele de depozitare ale substanelor de rezerv n
esuturi, cu factorii care pot intervenii, pozitiv sau negativ, n formarea i
creterea embrionilor.
230
6.1.7.5 Cultura de ovare, ovule i de esut nucelar
232
Embrionii izolai au continuat s prolifereze numeroi ali embrioni (Zatyko,
1975).
S-a constatat c esutul placentar exercit un efect pozitiv asupra creterii
ovulelor cultivate in vitro, favoriznd formarea i maturarea seminelor. Se
presupune c esutul placentar cedeaz ovulelor anumite substane stimulatoare.
Substanele respective nu prezint o specificitate, ntruct ovule fertilizate,
provenind de la diferite specii sau genuri, au fost grefate, cu rezultate favorabile,
pe placent de Capsicum. n condiiile cultivrii acestora in vitro, ovulele s-au
maturizat i au format semine viabile.
Pot fi cultivate in vitro att ovule fertilizate ct i ovule nefertilizate.
Ovulele pot fi recoltate ca fiind fertilizate n condiiile naturale sau pot fi
fertilizate prin polenizarea lor, cultivate fiind pe un mediu aseptic.
Exist perspective mari n ceea ce privete realizarea prin culturi in vitro
a unor polenizri ncruciate, interspecifice i intergenerice care n condiiile
obinuite, n natur duc fie la incapacitatea embrionului format n a-i menine
viabilitatea, fie smna rezultat se dovedete inapt n a suporta dezvoltarea
embrionului.
n literatur se citeaz hibridul realizat ntre Lolium perene i Festuca
rubra, utilizndu-se ovule detaate din floare, la cinci zile de la polenizare.
Plantele rezultate au fost asemntoare cu Festuca rubra.
nvingerea barierelor morfo-fiziologice creeaz posibilitatea realizrii de
hibrizi interspecifici care, n viitor, pot prezenta un interes economic major i
care n mod natural nu pot fi obinui prin hibridare sexuat.
S-au reuit realizarea de experimente privind cultivarea pe medii aseptice
a nucelei. Pornind de la acest tip de esut, in vitro se poate induce poliembrionia.
Astfel, n 1976, Mullins i Srinivasan au provocat formarea de embrioizi la
nivelul ovulelor de Vitis vinifera Cabernet Sauvignon, specie n mod normal
monoembrionar. Din ovulele nefertilizate s-a format un calus nucelar, din
celulele cruia s-au difereniat embrioizi, ceva mai mari dect embrionii zigotici.
Plantulele rezultate au fost viabile.
La fertilizarea ovulelor poate fi folosit fie polen proaspt, recoltat n
perioada iniierii culturilor de ovule, ovare sau de pistile, fie polen conservat,
mai ales n cazul urmririi realizrii de polenizri interspecifice sau
intergenerice. n ambele cazuri este necesar ca prealabil inoculrii, polenul s fie
testat n ceea ce privete capacitatea germinativ, creterea tubului polinic i s
se studieze comparativ eficiena ctorva reete de medii de cultur, n vederea
asigurrii unei creteri optime a tubului polinic, respectiv conservarea i
susinerea ntregului potenial biologic al celulei generative i a celei vegetative.
n cazul n care polenizarea se face la nivelul stigmatului, este necesar s
se aproximeze dac tubul polinic are o lungime corespunztoare pentru a fi
asigurat accesibilitatea lui la ovule; n caz contrar se renun la cultura de
pistile i ovulele vor fi excizate i cultivate ca atare. n acest mod, va fi facilitat
233
fecundarea i se prentmpin epuizarea celulei generative, n decursul
parcurgerii traseului de la stigmat, pn la sacul embrionar (Cachi, 1984).
Cultivarea in vitro a pistilelor, ovarelor, ovulelor i a altor pri florale,
precum i a ansamblelor de componente florale a permis completarea
cunotinelor actuale privind funcionarea organelor respective i privind
biologia fecundrii, a formrii embrionului, a seminei i a fructului. Aceste
cunotine servesc la obinerea de noi succese n nvingerea barierelor
incompatibilitilor existente n hibridarea sexuat, fapt deosebit de important,
ntruct prin nmulirea sexuat se poate rennoi continuu, potenialul biologic al
plantelor, mbogindu-se zestrea ereditar, cu caracterele motenite de la doi
prini, posednd acumulri genetice diferite.
239
CAPITOLUL VIII
240
Observaiile ce au condus la dezvoltarea culturii de meristeme au fost
fcute de White, care a notat c rdcini de tomate infectate cu virus, genereaz
n unele cazuri rdcini fr virus. Studii mai amnunite au fost fcute de
Limaset i Cornuet (1949), care au observat c din plante de tutun infectate cu
virus, explantele prelevate prezentau o infecie de intensitate sczut, sau
explantele de dimensiuni mici erau chiar libere de virusuri.
Aceste cercetri au demonstrat c intensitatea infeciei crete dinspre
prile juvenile ale plantei spre cele mature (de exemplu: frunzele aflate n
apropierea mugurilor apicali conin cu pn la 150 de ori mai puin virus dect
cele aflate la mijlocul plantei).
241
obinut doar dup combinarea celor dou metode: cultura de meristeme cu
termoterapia.
Aceast tehnic este aplicat doar la speciile ce permit nmulirea
vegetativ i favorizeaz diseminarea virusurilor. La speciile ce se nmulesc
generativ, riscul transmiterii prin intermediul seminei este foarte limitat, de
aceea regenerarea prin cultura de meristem este puin interesant.
Dup alegerea plantei donor se trece la prelevarea vrfurilor de cretere
din care, n condiii sterile, va fi izolat meristemul. n funcie de vrful de
cretere se va proceda la sterilizarea materialului vegetal nainte de izolarea
meristemelor. De exemplu, colii tuberculilor sau vrfurile de cretere ale
Saintpaulia sau Gerbera, trebuie sterilizate nainte de prelevarea meristemelor,
pe cnd mugurii de vi de vie, vrfurile vegetative ale garoafelor, crizantemelor
sau anghinrii nu necesit sterilizare, doar schimbarea instrumentarului, cu unul
sterilizat, dup fiecare operaiune. Explantele se sterilizeaz conform
metodologiei prezentate anterior i pstrate pn la fasonare i inoculare n
ultima ap distilat steril destinat cltirii. Excizia poate fi fcut la hota cu
flux de aer steril sau mai simplu pe o mas dezinfectat n prealabil. Un
binocular este indispensabil efecturii acestor operaiuni, magnitudinea optim
putnd fi de 20 sau 40x. Frunzele tinere sunt nlturate de pe explant prin tiere,
urmnd ca foliolele rudimentare s fie nlturate prin smulgere, iar meristemul
izolat cu ajutorul unui vrf de ac de sering sau cu un bisturiu cu vrf foarte fin.
Instrumentarul se schimb foarte des, dup fiecare operaiune, i se nlocuiete
cu unul sterilizat prin flambare. Cnd meristemul este vizibil (domul
meristematic cu o pereche de primordii foliare constituie n general meristemul
primar i are o culoare galben-verzuie transparent) se nltur cu foarte mare
grij i ultimele foliole i prin patru seciuni perpendiculare se izoleaz
meristemul. Ultima seciune transversal izoleaz meristemul, tierea trebuie
fcut imediat sub inelul central. Meristemul (0,2-0,3 mm) este preluat pe o
lam, ac de sering sau bisturiu cu lamela foarte fin i inoculat la suprafaa
mediului de cultur solid.
Toate operaiunile prezentate anterior trebuie fcute ntr-un timp ct mai
scurt pentru a evita deshidratarea i pentru a limita riscurile contaminrii.
n ce privete substratul nutritiv utilizat, n general, acesta trebuie s fie
suficient de bogat n elemente minerale, n special n potasiu, concentraia cruia
trebuie s fie mare ntr-un mediu destinat micropropagrii. Din acest punct de
vedere mediul Murashige-Skoog este optim.
Coninutul n zaharuri trebuie s fie ntre 2 i 6%, n funcie de specie.
Mai sunt necesare i alte componente de tipul microelementelor, vitaminelor i
cheailor de fier, n concentraii variabile.
Mediul de cultur artificial este solidificat, n general, cu agar (6 pn la
10mg/l), dar poate fi i lichid, caz n care schimburile dintre mediu i explant
242
sunt mai bune cu condiia asigurrii unei aerri optime (pentru a se evita
asfixierea explantelor), deci a unei agitaii corespunztoare.
Regulatorii de cretere sunt determinani n realizarea cu succes a unei
culturi de meristeme. n general, auxinele sunt indispensabile multiplicrii
celulare. Uneori se adaug i citochinine n concentraii foarte mici, n special
sub form de urme. Deseori sunt necesare i giberelinele pentru determinarea
alungirii axului principal, meristemele aparinnd grupului de explante de tip
organizat. Vasele optime culturii de meristeme sunt cutiile Petri, deoarece
volumul de aer de deasupra meristemelor trebuie s fie mic pentru a evita
deshidratarea acestora.
Dup inocularea meristemelor, vasele de cultur sunt plasate n camerele
de cretere la o intensitate luminoas de 1000 pn la 3000 de luci, la un
fotoperiodism de 16 ore lumin i 8 ore ntuneric i la temperaturi de 22-25oC.
n aceste condiii, dac mediul este favorabil, se va observa formarea
unor lstari care vor nrdcina sau nu, n funcie de specie. Dac plntuele sunt
complet formate, cum e cazul crizantemelor, garoafelor, violetelor de Parma sau
anghinrii, se poate trece la aclimatizarea lor sau pe mediu de multiplicare, n
cazul n care se dorete obinerea unui numr mare de plante. Dac plntuele nu
nrdcineaz, cum e cazul speciilor Actinia, Gerbera i trandafir, lstarii
regenerai se subcultiv pe mediu pentru nrdcinare, ce va conine doar
elementele minerale necesare fr fitohormoni sau cu adiie de auxine.
Din numrul total de meristeme inoculate se pierd mai multe sau mai
puine din mai multe cauze.
Prima cauz ar fi de ordin tehnic, procedeul de izolare al meristemelor
este dificil i delicat, rezultnd contaminri cu bacterii sau fungi (n medie de
aproximativ 5%). Mai mult, un numr nsemnat de meristeme se deshidrateaz,
iar la cele de dimensiuni foarte mici s-ar putea la seciunea final s se treac
prin inelul central al domului meristematic i astfel s se determine decesul
acestuia.
A doua cauz poate fi de natur fiziologic, condiiile n care au crescut
plantele donor prezentnd o importan deosebit. La speciile ierboase, se
ntlnesc deseori urmtoarele fenomene: cnd meristemul este prelevat de pe
axa principal de cretere, rata de regenerare este de 80-90%. n contrast,
aceast rat poate descrete pn la 5-10% atunci cnd meristemele sunt
prelevate din axele secundare cu creteri lente.
La speciile lemnoase aceast metod este dificil de aplicat deoarece
meristemele prelevate de pe ramuri aflate n faza de vegetaie se brunific n
contact cu mediul i mor. n acest caz, prelevarea meristemelor se face din
muguri dorminzi.
A treia cauz ar putea fi de ordin biologic, pe de o parte, dup cum se
tie, unele virusuri ajung i n domul meristematic, pe cnd unele sunt uor de
nlturat prin cultura de meristeme, iar pe de alt parte, la unele specii se poate
243
ntlni prezena bacteriilor pn n cele mai profunde straturi celulare (marea
majoritate nepatogene) ce se vor dezvolta ulterior n mediu infectnd cultura. De
exemplu, Hydrangea i Pelargonium gzduiesc multe bacterii ceea ce duce la
creterea ratei infeciilor in vitro (aproape de 99% uneori la Hydrangea).
Aceast caracteristic este observat i la speciile acaule (fr tulpin aparent.,
vine din franuzescul acaule, n greac a fr, kaulos tulpin), la care
meristemele sunt situate la nivelul solului.
Cauzele enumerate mai sus determin eliminarea a numeroase vase cu
infecii sau cu meristeme deshidratate, sau dac nu au aprut nici infecii i s-au
dezvoltat lstari trebuie verificat prezena virusurilor la nivelul esuturilor.
n cazul acestei tehnici, nu este att de important procentul de plante
regenerate ct numrul de plante libere de virusuri obinute, ce vor constitui
materialul biologic donor pentru regenerarea unui lot liber de virusuri.
Cultura de meristeme permite obinerea de plante sntoase i viguroase,
la care trebuie ns verificat cu rigurozitate dac s-au eliminat virusurile din
esuturi. Aceste controale se fac prin indexarea plantelor susceptibile de infecii
cu virusuri, la care se calculeaz n general trei indici. Dac aceti indici sunt
negativi, planta se consider liber de virusuri i poate trece pe mediile pentru
micropropagare. Aceste tehnici nu ne permit s afirmm c plantele sunt n
totalitate libere de virusuri, existnd ntotdeauna un oarecare risc. n afara
indexrii se pot efectua teste imunologice sau serologice, ce permit testarea
plantelor pentru virusurile cunoscute.
Controalele sanitare ofer informaii asupra prezenei sau absenei
virusurilor, dar nu indic calitatea genetic a plantelor. Oricnd pot aprea
mutaii, chiar dac din acest tip de explante modificrile genetice sunt foarte
rare. De aceea, nainte de a distribui plantele obinute prin cultura de meristeme,
la beneficiari, este recomandabil a se verifica dac sunt identice din punct de
vedere genetic cu planta donor.
Punerea la punct a acestei tehnici a indus o dezvoltare considerabil
culturilor in vitro i a permis descoperirea unei bariere pentru rspndirea
virusurilor printre speciile de importan propagate vegetativ. De asemenea,
aceast metod permite rejuvenilizarea unei specii, ducnd la obinerea de
descendeni viguroi.
Se presupune c fenomenul de rejuvenilizare este datorat tipului de
explant (civa milimetri de esut) care n urma exciziei pierde o parte din
memoria citoplasmatic construit de-a lungul existenei esuturilor parentale.
Trebuie subliniat faptul c dei aceast tehnic permite eliminarea virusurilor
din esuturi i obinerea de plante sntoase, plantele obinute nu sunt imune,
rmnnd susceptibile la atacul bolilor i duntorilor ca i prinii donor. De
aceea, este recomandabil s se evite recontaminarea materialului vegetal obinut,
i dac nu este posibil s se rennoiasc cu regularitate materialul semincer.
244
CAPITOLUL XI
245
-prin utilizarea agenilor mutageni n diferite faze i tipuri de culturi in
vitro se pot obine i seleciona mutante valoroase. Procedeul este folosit mai
ales la cultura de calus i la regenerarea de lstari adventivi din mezofil;
-prin cultura explantelor in vitro n condiii extreme se poate realiza
selecia la factorii de stres a genotipurilor noi (ex. selecia la aluminiu);
-manipulrile genetice de tipul hibridrilor somatice nu se pot concepe
fr folosirea culturilor de celule i protoplati in vitro;
-anumite plante necesit nmulire vegetativ exclusiv; haploizi,
mutante sterile, liniile mascule sterile folosite la hibridri, aneuploizi, sau
heterozigoi deosebii;
-materialul genetic valoros poate fi conservat n bnci de gene sub form
de explante in vitro.
Folosirea micropropagrii este limitat, n unele cazuri, de anumite
dezavantaje pe care aceasta le prezint:
-n anumite situaii, stabilitatea genetic a materialului nmulit in vitro
este redus;
-plantele nmulite in vitro prezint, uneori, defecte caracteristice i
dup ce sunt trecute in vivo: juvenilitate accentuat manifestat prin frunze
necaracteristice, prezena spinilor, lstrire adventiv, fructificare ntrziat,
vigoare exagerat, pierderea caracterului dominant;
-uneori, nrdcinarea explantelor nmulite in vitro este greoaie sau
imposibil. De regul, rdcinile formate in vitro au o funcionalitate redus ele
fiind nlocuite de alte rdcini n faza de aclimatizare;
-aclimatizarea plantelor obinute in vitro este, la unele specii, foarte
dificil datorit unor modificri morfo-anatomice i fiziologice care apar pe
durata cultivrii in vitro. Pentru realizarea aclimatizrii trebuie construite
structuri speciale sere, solarii, dotate cu dispozitive de control al factorilor de
mediu;
-clonarea exagerat favorizeaz creterea riscurilor de distrugere n mas
a unor clone de ctre rase virulente de boli i duntori aprute ulterior. Pentru
evitarea acestor situaii se va recurge la varianta nmulirii i plantrii
multiclonale;
-capacitatea regenerativ a explantelor poate s se reduc sau s se
piard prin subculturi repetate;
-n anumite situaii, sterilizarea total a materialului iniial este dificil
sau imposibil de realizat;
-micronmulirea in vitro presupune existena unor structuri specializate
i a unei fore de munc specializate.
246
11.1.2 Fazele multiplicrii in vitro
11.1.2.3 Multiplicarea
247
11.1.2.4 nrdcinarea
11.1.2.5 Aclimatizarea
250
Tabelul 11.1
Culturi de meristeme i apexuri la pomii i arbutii fructiferi
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Rezultat Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Lstari axilari MS (1962) 30 - 1,8 ANA; Matheus i Rangan
Ananas
2 AIB; 2 KIN (1979)
comosus
Lstar unic MS (1962) 30 - 25% CM Zepeda i Sagawa (1981)
Lstar unic Rodriquez (1982 b) 5,5 30 6 1 AIB Rodriquez (1982 c)
K(h)
Castanea lstari Rodriquez (1982 b) 5,5 30 6 0,06 AIB; Rodriquez (1982 c)
sativa K(h) 1 BAP
Proliferare Vieitez i Vieitez 5,5 30 7 0,1 BAP Vieitez i Vieitez (1980
lstari (1980 b) b)
Citrus sp. Lstari axilari Bouzid (1975) A 5,8 30 8 1 ANA; Bouzid (1975)
i adventivi 1 KIN
Cocos Rizogenez DSouza (1982) BM 68,4 6,5 1-2 ANA; DSouza (1982)
nucifera 12% CM
Lstari Mullin i colab. 5,7- 30 glucoz - 2,5 AIA; Mullin i colab. (1974)
devirozai (1974) B 5,8 0,1 KIN
White (1954) - sruri 20 7 10% CM Miller i Belkengren
(1963)
Fragaria Adams (1972) 5,2 30 - 1 AIB; 0,1 BAP Adams (1972)
Proliferare Boxus (1974 a) 5,6 22 glucoz 7 1 BAP Boxus (1974)
lstari
Lstari Mullin i colab. 4,5 30 glucoz - 1 AIA Mullin i Schlegel (1976)
(1974)
251
Tabelul 11.1 (continuare)
Culturi de meristeme i apexuri la pomii i arbutii fructiferi
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Rezultat Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Proliferare MS (1962) 5,3 20 7 1,1 BAP Lane (1979)
Malus x lstari
domestica Proliferare Jones i colab. 5,2 30 7 1 AIB; 1 BAP; Snir i Erez (1980)
lstari (1977) 0,1 GA3
Musa Calus MS (1962) 30 6,5 0,3 AIA; 1 KIN; Ma i colb. (1978)
cavendishii
Lstari axilari Mante i Tapper 5,7 30 5-8 2 BAP Mante i Tapper (1983)
Musa textilis
i adventivi (1983)
Prunus Proliferare LS (1965) 5,8 30 7 0,5 BAP Norton i Norton (1986)
cerasifera lstari axilari
Rubus idaeus Cretere lstari Donnelly (1982) 5,7 30 - Donnelly i colab. (1982)
Lstari axilari Skirvin i Chu 5,8 30 10 0,1 ANA; 2 BAP Skirvin i Chu (1978)
Rubus sp.
(1978)
Vaccinium Proliferare Goldy i Lyrene 5,7 30 4 10 2IP; Goldy i Lyrene (1984)
sp. lstari (1984)
Lstari axilari Smagula i Lyrene 5,7 30 - 5 2IP Smagula i Lyrene
(1984) (1984)
252
Tabelul 11.2
Culturi de meristeme i apexuri la arbori i arbuti ornamentali
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Rezultat Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
nrdcinare Hackett (1970) 5,8 20 - 5-10 ANA sau Hackett (1970)
(sub lumin 10 AIA + 5,5
puternic) catechol
nrdcinare Hackett (1970) 5,8 20 - 10 AIA + 5,5 Hackett (1970)
Hedera helix
(sub lumin catecho
slab)
Lstari Polito i Alliata 5,6 20 8 0,5 ANA; 2 BAP Polito i Alliata (1981)
(1981)
Lavandula Calus Kharta (1974) 5,5 20 7 1 ANA; 4 BAP; Quazi (1980)
augustifolia 10% CM
Pinus nmugurire Bornman i Janson 5,6- 50,5 6-7 2,2 BAP; 1-2 2IP Bornman i Janson
sylvestris (1980) 5,8 (1980)
Syringa Dezvoltare Wetmore (1954) 20 10 15% CM Wetmore (1954)
vulgaris lstari
Weigela 4 lstari/expl. MS (1962) 30 6,5 2,25 BAP Calvert i Stephens
florida (1986)
253
Pentru realizarea acestei tehnici se pot folosi ca explante iniiale
meristeme, vrfuri de lstari (apexuri), muguri aflai la subsioara bracteelor la
unele tipuri de inflorescene, precum i alte organe capabile s genereze lstari
in vitro.
De regul, n mediul de cultur, nu se adaug citochinine care s anuleze
efectul dominanei apicale. Se urmrete de fapt, alungirea lstarilor pentru a
obine un numr ct mai mare de noduri.
Iniierea culturii este foarte important. n vederea stabilizrii trebuie
realizat juvenilizarea materialului iniial.
La speciile lemnoase un alt aspect important l reprezint necesitatea
ntreruperii dormansului mugurilor dup inoculare. Acest lucru este posibil prin
tratamente cu temperaturi sczute (0-5 oC), mrirea duratei perioadei de
iluminare (16 h), asociat cu temperaturi sczute, urmat apoi de creterea
temperaturii.
Uneori se recomand creterea concentraiei de citochinine i gibereline.
La speciile erbacee, dormansul se poate ntrerupe prin etiolarea
materialului.
Rata multiplicrii este direct proporional cu viteza de cretere a
lstarilor, respectiv cu numrul de frunze care se formeaz.
De regul, lstarii formai din apexuri cresc i se alungesc mai rapid
dect cei formai din muguri axilari. De aceea, ei sunt trecui n vase de cultur
separate.
Folosirea mediului de cultur n dublu strat (solid i lichid) a avut ca
efect accentuarea vitezei de cretere a lstarilor de gutui BA-29 (Stnic F. i
colab., 1996).
De asemenea, folosirea apei structurate, i a unor glico-steroizi naturali
(Ecostim) a stimulat creterea lstarilor de mr (Svulescu Anca i Stnic F.,
1996).
La liliac (Syringa vulgaris), stimularea creterii lstarilor este posibil
prin folosirea zeatinei sau a 2IP (Pierik i colab., 1986).
La Araucaria cunninghammii (Mott, 1981), la realizarea regenerrii, pot
fi folosii numai lstari ortotropi. La cafea, n schimb are loc o transformare a
lstarilor plagiotropi n ortotropi (Pierik, 1987).
Metoda de fa se folosete cu succes la foarte multe specii (vi-de-vie,
pr, trandafir, ieder, salcie pletoas), (tabelele 11.3 i 11.4).
Dup mai multe cicluri de multiplicare este necesar inducerea
nrdcinrii lstarilor obinui. Acest lucru este realizabil prin folosirea unor
tratamente cu auxine combinate sau nu cu incubarea la ntuneric.
n faza de alungire a rdcinilor, concentraia de auxine trebuie redus.
254
11.1.6 Cultura de lstari axilari
255
n multe situaii se recomand distrugerea mugurelui apical i asocierea
acestei msuri cu aplicarea citochininelor. Pentru creterea eficienei metodei,
citochininele trebuie aplicate dup ce lstarul s-a alungit.
Creterea concentraiei de citochinine aduce, uneori, formarea calusului,
ceea ce trebuie evitat pentru a reduce probabilitatea apariiei variabilitii
somaclonale.
La unele specii (Ananas), formarea lstarilor este uneori stimulat de
folosirea mediului de cultur lichid.
De regul, capacitatea de proliferare scade odat cu creterea numrului
de subculturi, acest fenomen fiind frecvent nsoit i de formarea calusului.
Astfel, la cpun, de exemplu, depirea unui numr de 12 subculturi a
avut ca efect apariia unor modificri fiziologice majore.
Metoda lstririi axilare poate fi folosit att pentru plantele care cresc n
rozet ct i pentru plantele care formeaz lstari normali.
Mrirea concentraiei de citochinine din mediul de cultur, n vederea
stimulrii lstririi axilare, poate avea ca efect apariia fenomenului de tuf,
fenomen care poate continua i dup subcultivarea explantelor pe medii lipsite
de citochinine n vederea alungirii sau nrdcinrii.
n prezent, metoda este mult folosit la micropropagarea materialului
sditor pomicol, n multe ri fiind generalizat (Italia, Frana, Anglia).
n tabelele 11.5 i 11.6 sunt prezentate cteva din cercetrile efectuate n
micropropagarea prin lstrire axilar la plantele horticole lemnoase.
256
Tabelul 11.3
Cultura de fragmente uninodale la arbori i arbuti ornamentali
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Rezultat Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Calus MS 20 6 3 ANA; Radojevic i colab.
Acer negundo
(1962) 15%CM (1980)
Betula Calus Chalupa 30 6 0,05 AIB; Chalupa
verrucosa (1981) 0,6 BAP (1981)
Paulownia Muguri axilari Ben-Jaacov i Dax 5,6 30 6,5 0,1 ANA; Burger i colab.
tomentosa (1981) 1 BAP (1985)
Quercus Lstari Chalupa (1984) 20 6 0,2-1 BAP Chalupa
robur BTM sau WPM (1981)
Lstari Morel i Martin 15 8 Daguin i Letouze
Salix (1955) Glucoz (1986)
babylonica Lstari Daguin i Letouze 15 8 Daguin i Letouze
(1986) Glucoz (1986)
Lstari Whitehed i Giles 5,8 20 6,5 0,01 ANA; Bhojwani
Salix
adventivi i 0,05 BAP (1980)
madsudana
axilari
Lstari axilari Chalupa 20 6 0,2-1 BAP; Chalupa
Tilia cordata (1984) WPM 0,1 ANA sau (1981)
AIB
Proliferare Stapfer i Heuser 5,6- 30 7 0,018-0,18 ANA Stapfer i Heuser
Vinca minor
lstari (1985) 5,8 14,4 BAP (1985)
257
Tabelul 11.4
Cultura de fragmente uninodale la pomi i arbuti fructiferi
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Rezultat Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Actinidia Lstari Harada 5,5 20 7 0,1 ANA; Harada
deliciosa nrdcinai (1975) 40 Ad; (1975)
Armeniaca 70% lstari Lloyd i McCown 5,2 20 6 2 2IP Snir
vulgaris (1981) WPM (1984)
Castanea Proliferare Yang 5,5 20 6,5 0,1 BAP Yang i colab.
mollissima lstari axilari (1986) (1986)
Proliferare San Jose 30 6 0,1 BAP San Jose i colab.
Castanea lstari axilari (1984) (1984)
sativa Proliferare Heinz i Mee 5,5 30 6 1 BAP Vieitez i Vieitez
lstari (1969) (1980 b)
Proliferare LS 5,7 30 10 1 BAP; Navarro i colab.
Citrus sp.
lstari (1965) 100 AdS; (1975)
Corylus Embriogenez Cheng 5,5 30 8 0,1-1 AIB Perez i colab.
avellana direct (1975) Basal (1986)
Juglans Multiplicare Driver i Kuniykuhi 5,5 30 2 0,001 AIB; Driver i Kuniykuhi
hindisii x J. lstari (1984) DKW gelrite 1 BAP; (1984)
regia
Lstari Chalupa 30 6 0,15 ANA; Chalupa
Juglans regia
(1981) 0,1 BAP; (1981)
Proliferare Rugini i Fontanazza 5,8 30 6 0,5 AIB; Rugini i Fontanazza
Olea europea
lstari (1981) 0,5 GA3; (1981)
258
Tabelul 11.4 (continuare)
Cultura de fragmente uninodale la pomi i arbuti fructiferi
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Rezultat Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Pyrus Lstar unic MS 5,8 30 8 0,45 BAP Shen i Mullins
communis (1962) (1984)
Lstar unic Snir 5,0 20 6,5 0,22 2,4 D Snir
Rubus idaeus (1981) 1 BAP; (1981)
0,1 GA3
Theobroma Proliferare Passey i Jones 5,2 30 7 0,2 BAP Passey i Jones
cacao lstari axilari (1983) (1983)
Lstari axilari Cohen i Elliot 5,7 30 6 5 2IP Cohen i Elliot
Vaccinium (1979) (1979)
corymbosum 1-2 lstari/expl. Lloyd i McCown 5,2 30 6 5 2IP Wolfe i colab.
(1981) WPM (1983, 1986)
Vaccinium Lstari axilari Smagula i Lyrene 5,7 30 4 5 2IP Smagula i Lyrene
sp. (1984) WPM (1984)
259
Tabelul 11.5
Cultura de lstari axilari la pomi i arbuti fructiferi
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Rezultat Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Plantule Lakshni Sita 5,8-6 20 9 1 ANA Lakshni Sita
(1974) (1974)
Ananas Plantule MS (1962) 30 6,5 Mapes (1973)
comosus Lstari multipli MS (1962) 30 - 1,8 ANA, 2 AIB, Matheus i Rangan
2 KIN (1979)
Cretere lstari 0,5 x MS (1962) 30 - 25%CM Zepeda i Sagawa (1981)
Castanea Proliferare Vieitez i Vieitez 5,5 30 6 1-2 BAP Vieitez i Vieitez
sativa lstari (1980) (1980)
Lstar unic MS (1962) 5,8 30 8 0,18 ANA, 0,1 Muriithi
BAP, 0,03 GA3 (1982)
Ficus carica
Proliferare LS (1965) 5,2 30 7 0,5 BAP, 0,1 Pontikis i Melas
lstari AIB, 0,1 GA3 (1986)
Cretere lstari Jones i Vine 5,6- 40 - Jones i Vine
Glossularia i rdcini (1968) 5,8 Glucoz (1968)
redinata Dezvoltare Jones i Vine 5,6- 40 - 1 AIB, 0,2 BAP, Jones i Vine
lstari (1968) 5,8 Glucoz 1 GA3 (1968)
Malus x 8 lstari/ LS (1965) 5,2 29,9 7 0,1 AIB, 0,99 Van Nieuwkirk i colab.
domestica explant BAP, 0,48 GA3 (1986)
Lstar unic Heinz i Mee 5,8 40 7 5 BAP Cronauer i Krikorian
Mussa sp.
(1979) (1984)
Proliferare Anderson 5,7 30 6 0,1 AIB, 4 BAP Anderson
Rubus idaeus
lstari (1978, 1980) (1979)
260
Tabelul 11.6
Cultura de lstari axilari la arbori i arbuti ornamentali
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Rezultat Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Clematis sp. Lstari multipli LS (1965) 30 6 10 BAP Kratz i Langhans (1978)
Cotoneaster Lstari multipli LS (1965) 5,8 30 7 1 BAP Norton i Boe
dammeri (1982)
Crataegus Lstari multipli LS (1965) 5,8 30 7 1 BAP Norton i Boe
rachzacantha (1982)
Fraxinus Lstari multipli Lloyd i McCown 5,2 20 Lichid 5-10 BAP Heiman i Preece
americana (1981) (1983)
Hydrangea 6 lstari/explant Gamborg 5,5 20 2 1,8 BAP Bailey i colab.
macrophylla (1968) gelrite (1986)
Proliferare Miller i Murashige 5,7- 20 7 1 BAP Stoltz (1984)
lstari (1976) 5,8
Lavandula Plantule Kartha (1974) 5,5 20 7 2 2,4D, 4 BAP, Quazi (1980)
augustifolia 10%CM
Proliferare Rumary i Thrope 5,9 30 8 Rumary i Thrope
Picea glauca
lstari (1974) (1984)
261
Rezultatele obinute de Standardi A, Ferradini Nicoleta, Stnic F.
(1996), au dovedit importana ntunericului n faza de inducie pentru stimularea
organogenezei adventive din limb foliar la portaltoiul de mr M-27:
-poziia explantului este de asemenea foarte important; n cazul
limbului foliar, la majoritatea speciilor, acesta trebuie aezat cu partea inferioar
pe mediu. Uneori se recomand crestarea nervurilor frunzei nainte de inoculare;
-fitohormonii influeneaz organogeneza n mod diferit; exist specii
care nu necesit aport suplimentar de auxine sau citochinine n mediu pentru
declanarea organogenezei chiar dac aceste substane stimuleaz apoi acest
proces;
-marea majoritate a speciilor formeaz lstari adventivi n prezena
citochininelor n timp ce auxinele inhib procesul. Uneori acest lucru este
posibil i atunci cnd este vorba de explante de tipul peiolului, rdcinilor sau
internodurilor (Stnic F., 1995);
-cea mai folosit citochinin este BAP, iar pentru gimnosperme este
singura recomandat. Celelalte citochinine sunt mai puin utilizate;
-concentraii ridicate de citochinine (n special BAP) poate determina
dereglarea procesului de organogenez. Se recomand n aceast situaie
alternarea culturii pe dou medii cu concentraii diferite;
-zeatina a avut un rol important n procesele de organogenez la kiwi
pornind de la diferite tipuri de explante (Stnic F. i colab., 1995, 1998). De
asemenea TDZ (tidiazuronul) i 2 iP (2 izopenteniladenina) au determinat
efecte spectaculoase de stimulare a lstririi adventive;
-adenina sulfat poate stimula organogeneza adventiv la ulm (Jacquiot,
1951). n combinaie cu citochininele, adenina sulfat a stimulat formarea
lstarilor adventivi (Skoog i Miller, 1975; Nitsch i colab., 1969);
-acidul abscisic inhib formarea lstarilor adventivi la marea majoritate a
speciilor;
-substanele antiauxinice, cele care inhib transportul auxinelor au ca
efect stimularea organogenezei adventive;
-vitaminele stimuleaz formarea lstarilor adventivi la ulm (Jacquiot,
1951);
-infectarea materialului iniial cu Agrobacterium tumefaciens rasa C58, a
stimulat organogeneza adventiv la plop (Steffen i colab., 1986). Efectul s-a
datorat i juvenilizrii materialului iniial datorit aciunii bacteriei.
n tabelele 11.7 i 11.8 sunt prezentate cteva din rezultatele obinute n
organogeneza adventiv la pomi, arbuti fructiferi, arbori i arbuti ornamentali.
262
Tabelul 11.7
Organogeneza adventiv de lstari la pomi i arbuti fructiferi
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Explant Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Fragmente Harada (1975) 5,5 20 7 1 Z, 40 Ad Harada (1975)
rdcini
Actinidia Fragmente MS (1962) 30 6,5 1Z Kwei i colab.
deliciosa lstari (1980)
Fragmente Monette (1986) 5,7 22,5 7 0,023 AIB, 2 Monette (1986)
lstari BAP, 60 AdS
Lstari Hisajima (1982) 5,5 30 6 0,0225 BAP Hisajima (1982)
Lstari Hisajima (1982) 5,5 30 6 0,0225 BAP, Hisajima (1982)
0,005 AIB
Amygdalus
Lstari MS (1962) 5,8 30 9 0,1 ANA, 0,7 Ruginii i Verma
communis
BAP (1982,1983)
Calus Matheus i Rangan 30 6,5 5%CM Matheus i Rangan
(1981) (1981)
Ananas Lstari 0,5 x MS (1962) 30 - 0,5-1 AIB Zepeda i Sagawa
comosus (1981)
Armeniaca Fragmente Skirvin (1980) 5,7 20 6,5 Skirvin (1980)
vulgaris lstari
Castanea Epicotil San Jose (1984) 30 6 0,1 AIB, 2 BAP San Jose (1984)
sativa
Cerasus Fragmente Jones (1977) 5,2 30 7 0,1 AIB, 1 BAP, Seirlis i colab.
avium lstari 0,1 GA3 (1979)
263
Tabelul 11.7 (continuare)
Organogeneza adventiv de lstari la pomi i arbuti fructiferi
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Explant Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Fragmente Skirvin 5,7 20 6,5 Skirvin i colab.
Cerasus lstari (1980) (1980)
vulgaris Lstari Skirvin i Chu 5,7 30 6,5 0,1 ANA, 2 BAP Skirvin i colab.
(1978) (1981)
Fragmente Hoagland i Snyder - - Murashige i colab.
rdcini (1933) (1972)
Citrus sp.
Fragmente Kitto i Young 5,6- 30 -40 10 5 BAP, 80 AdS Kitto i Young
lstari (5 cm) (1981) 5,8 (1981)
Calus Radojevic 20 8-10 1 KIN, 2 Ad Radojevic
Corylus (1975) (1975)
avellana Calus Radojevic 20 8-10 1 KIN, 2 Ad, Radojevic
(1975) 1GA3 (1975)
Diospyros Calus Yokoyama i 5,6- 30 7 1 ANA, 0,1-1 Yokoyama i Takeuchi
kaki Takeuchi (1976) 5,8 KIN (1976)
Fragmente MS (1962) 5,6 30 7 0,2-1 AIB, 1,1 Anderson i colab.
Fragaria
lstari BAP, 1 GA3 (1982)
Glossularia Fragmente MS (1962) 5,5 30 6 0,1 AIB, 0,49 Walender (1985)
redinata lstari BAP
Lstari Chalupa (1981) 30 6 0,1-0,3 ANA, Chalupa (1981)
0,1-0,6 BAP
Juglans regia
Semine 0,5 x Rodriguez 5,5 30 6 9 BAP Rodriguez
(1982) (1982)
264
Tabelul 11.7 (continuare)
Organogeneza adventiv de lstari la pomi i arbuti fructiferi
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Explant Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Fragmente Jones (1977) 5,2 30 7 0,1 AIB, 1 BAP,0,1 Jones (1977)
lstari GA3
Cotiledon Kartha (1974) 5,8 30 8 1 ANA, 0,3 BAP Liu i colab. (1983)
Calus Kartha (1974) 5,8 30 8 1 BAP Liu i colab. (1983)
Calus din White (1943) 20 6,5 4 ANA, 2 KIN, 1 Mehra i Sachdeva
cotiledon GA3, 15%CM (1979)
Malus x Calus din White (1943) 20 6,5 2 ANA, 2 BAP, Mehra i Sachdeva
domestica embrion 15%CM (1979)
Lstari Jones (1977) 5,2 30 7 1 AIB, 1 BAP, 0,1 Snir i Erez
GA3 (1980)
Lstari LS (1965) 5,2 29,9 7 0,1 AIB, 0,48 GA3 Van Nieuwkirk
i colab.(1986)
Muguri Zimmerman 20 7 0,01 AIB, 0,09 BAP Zimmerman
dorminzi/lstar (1984) (1984)
Fragmente Lakshmi-Sita 5,6 30 8 1 BAP Oka i Ohyama
lstari (1976) (1981)
Morus alba Fragmente Lakshmi-Sita 5,6 30 8 10 BAP Oka i Ohyama
lstari (1976) (1981)
Muguri MS (1962) 5,6 30 8 10 BAP Oka i Ohyama (1981)
Musa Lstari Krikorian i Cronauer 5,8 40 - 4,95 BAP, 10%CM Krikorian i Cronauer
acuminata (1984) (1985)
265
Tabelul 11.7 (continuare)
Organogeneza adventiv de lstari la pomi i arbuti fructiferi
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Explant Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Musa Calus MS (1962) 30 6,5 0,3 AIA, 1 KIN Ma i colab.
cavendishii (1978)
Lstari Heinz i Mee (1979) 5,8 40 7 5 BAP Cronauer i Krikorian
Musa spp.
(1984)
Lstari Mante i Tepper 5,7 30 5-8 0,1 AIB, 3-5 BAP, Mante i Tepper
Musa textilis
(1983) 160 AdS (1983)
Persica Lstari Miller (1982) 20 8 0,1 ANA, 2 BAP Miller (1982)
vulgaris Lstari Skirvin i Chu (1978) 5,7 30 6,5 0,1 ANA, 2 BAP Skirvin i Chu (1978)
Fragmente LS (1965) 5,7 30 8 0,1 2,4D sau ANA, 3 Tisserat i colab.
lstari 2-Ip, 40 AdS (1979)
Phoenix Calus Thompson i Gordon 5,6- 30 8 Tisserat i colab.
dactylifera (1977) 5,8 (1982)
Fragmente Tisserat (1984) 5,6- 30 8 10 2,4D Tisserat i colab.
lstari 5,8 (1984)
Semine 0,5 x MS (1962) 5,8 - - Barghchi i Alderson
(1983)
Lstari MS (1962) 5,8 - 7 4 BAP Barghchi i Alderson
Pistacia vera
(1983)
5-8 mm lstari MS (1962) 30 7 4 BAP Barghchi i Alderson
(1985)
266
Tabelul 11.7 (continuare)
Organogeneza adventiv de lstari la pomi i arbuti fructiferi
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Explant Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Fragmente Pietropaolo i Reisch 5,8 30 7 1,1 BAP Pietropaolo i Reisch
Prunus lstari (1984) (1984)
domestica Fragmente Skirvin (1980) 5,7 20 6,5 Nu sunt menionai Skirvin (1980)
lstari
Prunus Fragmente Jones (1977) 5,2 30 7 0,1 AIB, 1 BAP, 0,1 Jones i Hopgood
insititia lstari GA3 (1979)
Fragmente Lane (1979) 5,2 30 7 1,13 BAP Lane (1979)
lstari
Pyrus Fragmente MS (1962) 5,8 30 8 1,36-2,25 BAP, 1,1 Z; Shen i Mullins
communis lstari 1,02 2-iP (1984)
Fragmente LS (1965) 5,7- 30 6 2 BAP Singha (1982)
lstari 5,8
Fragmente MS (1962) 5,7 20 6 1,35 BAP Flegmann i
lstari Wainwright (1981)
Ribes nigrum
Fragmente Jones i Vine (1968) 5,6- 40 - Jones i Vine (1968)
lstari 5,8 Glucoz
Lstari Donnely (1980) 5,7 30 6,5 0,1 AIB; 1 BAP Donnely (1980)
Lstari Snir (1981) 5 20 Gelrite 0,22 2,4D; 1 BAP; 0,1 Snir (1981)
Rubus idaeus GA3
Lstari cu Welander 5,2 30 6 1 BAP Welander
noduri (1985) (1985)
267
Tabelul 11.8
Organogeneza adventiv de lstari la arbori i arbuti ornamentali
(dup Stnic, 1999)
Denumirea Explant Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Acer rubrum x Fragmente MS (1962) 5,7 30 10 0,1-0,5 Thidiazuron Kerns i Meyer (1985)
Acer saccharum lstari
Calus Simola (1985) 5,6 20 6 5-10 Z; 0,1-0,2 ANA Simola (1985)
Calus Srivastava i 5,8 40 6 2 AIA; 6 KIN; 40 Ad Srivastava i
Steinhauer (1981) Steinhauer (1981)
Betula pendula
Frunze Srivastava (1985) 5,8 30 6,5 2 AIA; 5 Z; 2 GA3 Srivastava (1985)
Fragmente Srivastava (1985) 5,8 30 6,5 0,5 ANA; 5 2 iP; 30 Srivastava (1985)
lstari Ad
Calus Chalupa (1981) 30 6 0,05 AIB; 0,2 BAP; Chalupa (1981)
Betula verucosa
20 AdS
Biota orientalis Hipocotil Thomas i Tranvan 5,4 30 8 0,1 AIB; 1,1 BAP Thomas i Tranvan
(thuja) (1982) (1982)
Chaenomeles Fragmente LS (1965) 5,8 30 7 2,5 BAP Norton i Boe
japonica lstari (1982)
Crataegus Fragmente LS (1965) 5,8 30 7 0,1-1 BAP Norton i Norton
rachyacantha lstari (1986)
Fraxinus Fragmente Lloyd i McCown 5,2 20 6 0,5 1 BAP Heiman i Preece
americana lstari (1981) (1983)
268
11.1.8 Embriogeneza somatic
270
Tabelul 11.9
Embriogeneza somatic la pomi i arbuti fructiferi (dup Stnic, 1999)
Denumirea Explant Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Actinidia Fragmente de Harada (1975) 5,5 20 7 0,1-1 2,4D; 40Ad Harada (1975)
deliciosa rdcini
Semine Litz (1984) 5,7 30 - Litz (1984)
Mangifera imature
indica Fructe Litz (1984) 5,7 60 8 1 2,4D Litz (1984)
imature
Fragmente de LS (1965) 5,7 30 8 10 2,4D; 3 2iP; 40 Tisserat (1979)
lstari AdS
Pheonix Muguri Thompson i Gordon 5,6- 30 8 10 2,4D; 3 2iP Tisserat (1982)
dactylifera laterali (1977) 5,8
Calus Tisserat (1984) 5,6- 30 8 Tisserat (1984)
5,8
Tabelul 11.10
Embriogeneza somatic la arbori i arbuti ornamentali (dup Stnic, 1999)
Denumirea Explant Mediu de cultur pH Zaharoz Agar Fitohormoni Autori
speciei (g/l) (g/l) (mg/l)
Hedera helix Calus Banks (1979) 5,7 30 5 1 ANA; 0,5 BAP Banks (1979)
Ilex aquifolium Embrioni LS (1965) 5,6 40 10 Hu i Sussex (1972)
Calus Nagmani i Bogna 5,8 20 8 2 BAP Nagmani i Bogna (1985)
Larix decidua
(1985)
Calus Von Arnold i Erikson 5,8 34,2 5 2,2 2,4D; 1,1 BAP Hakman i colab., (1985)
(1981)
Picea abies
Embrioni Von Arnold i Erikson 10 3 2,21 2,4D; 1,13 Von Arnold i Hakman
maturi (1981) gelrite BAP (1986)
Quercus rubra Internod MS (1962) 30 6,5 5 ANA; 0,1 BAP Seckinger i colab. (1979)
271
11.1.9 Poliembrionia nucelar
O serie de specii din genul Citrus formeaz n mod natural, n aceeai smn, pe
lng embrionul zigotic i unul sau mai muli embrioni somatici. Aceti embrioni iau natere
din celule somatice diploide ale esutului nucelar. esutul nucelar este un esut juvenil
caracterizat printr-o mare capacitate de regenerare. Prin cultivarea esutului nucelar in vitro i
inducerea formrii calusului s-au obinut un numr mare de embrioni9 somatici la genul
Citrus (Rangaswamy, 1981).
Formarea embrionilor somatici prin embriogenez direct sau indirect a fost posibil
prin cultivarea in vitro a unor ovule fecundate sau nefecundate de Citrus (Litz i colab.,
1985).
Embriogeneza somatic din esut nucelar este prezent la mango (Mangifera indica) i
la alte specii pomicole tropicale. La fel ca n cazul citricelor, speciile cu tendine de
poliembrionie in vivo au o capacitate ridicat de regenerare a embrionilor somatici in vitro.
Utilizarea poliembrioniei nucelare prezint o serie de avantaje: permite nmulirea n
mas a speciilor monoembrionare; procesele de embriogenez somatic sunt nsoite i de
devirozarea materialului vegetal obinut; n paralel, se pot induce mutaii i se pot seleciona
mutantele utile; se realizeaz juvenilizarea materialului obinut. n toate cazurile, folosirea
pentru nmulire a embrionilor somatici care conserv caracteristicile genetice ale plantelor
mam, deschide mari perspective n domeniul seminelor artificiale (Standardi, 1998).
11.1.10 Embriocultura
272
culturilor de embrioni este relativ uoar datorit faptului c smburii sau seminele protejate
de endocarp sau tegumente pot fi sterilizate la concentraii ridicate.
Compoziia mediului de cultur este cu att mai complex cu ct embrionii se afl
ntr-un stadiu de dezvoltare mai timpuriu.
Dup inoculare, embrionii se las la ntuneric timp de 30-60 zile la temperatura
camerei pentru germinare, dup care sunt trecui la lumin.
273
CAPITOLUL XIV
O plant provenit din cultura in vitro difer din multe puncte de vedere de una
provenita din mediul in vivo (Fossard, 1977; Grout si Aston, 1978; Grout si Debergh, 1982;
Sutter, 1985) prin urmtoarele aspecte:
1. La plantele crescute n condiii in vitro stratul de cear (cuticular) de la suprafaa
frunzelor i tulpinilor este foarte slab dezvoltat deoarece umiditatea relativ ntr-un vas de
cultura este de 90-100%, iar plantele nu au avut nevoie s se protejeze mpotriva deshidratrii.
Acest fapt are repercusiuni nefaste pentru plantulele transferate direct in vivo, care vor suferi
pierderea unei cantiti mari de apa din esuturi, deoarece umiditatea aerului in vivo este mult
sczut comparativ celei in vitro. Frunzele unei plante regenerate in vitro sunt moi, subiri i
prezint o activitate fotosintetic mult redus, deoarece i pot procura carbonul necesar din
mediul de cultur i anume din zaharurile din mediul de cultur, astfel c, atunci cnd o
plantul regenerat in vitro va fi trecut in vivo va trebui s se readapteze la o activitate
fotosintetic intens. De asemenea, frunzele plantelor provenite din cultura in vitro prezint,
pe lng un numr sczut de celule palisadice, necesare pentru captarea eficient a luminii, i
multe spaii aerifere n mezofil. Stomatele lor nu funcioneaz normal, iar trecerea plantelor
de la mediul in vitro la cel in vivo constituie sursa cea mai important de stres hidric. n
culturile de celule conexiunile vasculare, dintre lstari i rdcinue, sunt slab dezvoltate, ceea
ce duce de asemenea la o slab circulaie a apei dintr-o parte a plantei n alta. Plantele in vitro
au o hrnire heterotrof, pe cnd cele in vivo au o hrnire autotrof, acest fapt constituind un
alt factor de stres pentru plntuele transferate n sol. Ele trebuie s-i dezvolte activitatea
fotosintetic pentru a-i putea procura carbonul necesar.
Din cele de mai sus se poate concluziona c aclimatizarea plantulelor trebuie s fie un
proces lent, care s permit trecerea treptat a plantelor de la condiiile in vitro la cele in vivo,
ceea ce presupune adaptarea la o umiditate relativ sczut, la dezvoltarea mecanismelor de
nchidere i deschidere a stomatelor, la accelerarea procesului fotosintetic. Wardle i colab.
(1983) au demonstrat c scderea umiditii aerului in vitro la Brassica oleracea Botrytis a
dus la formarea unei pelicule de cear mai groas pe stratul cuticular, ceea ce a condus la o
evaporare cuticular mult sczut i la creterea procentului de plante aclimatizate.
Aclimatizarea poate fi fcut prin generarea unei umiditi crescute n mediul in vivo
unde vor fi transferate plantulele provenite din mediul in vitro, prin utilizarea unor aparate
speciale, generatoare de cea, i prin meninerea unei luminoziti i temperaturi relativ
constante i sczute. O alt metod de aclimatizare prevede lsarea vaselor de cultur
deschise, ntr-un mediu steril, pentru a permite aclimatizarea treptat a plantulelor la condiiile
exterioare. De asemenea, mai este posibil folosirea unor substane antiperspirante, care sunt
pulverizate pe frunzele plantulelor transferate n sol, reducnd astfel procesul de evaporare al
apei din esuturi (Sutter i Hutzel, 1985), dei aceast metod poate avea i efecte adverse.
2. Rdcinile plantelor provenite din cultura in vitro sunt mai vulnerabile i nu
funcioneaz foarte bine in vivo, prezentnd foarte puini sau deloc periori absorbani. Aceste
rdcini vor muri n scurt timp fiind nlocuite de altele generate direct n sol. Dezvoltarea
periorilor absorbani in vitro poate fi determinat prin meninerea culturilor, pentru o
perioad de timp, pe mediu lichid. Sistemul radicular slab dezvoltat determin o supravieuire
slab a unei plante n condiiile de mediu natural, in vivo, mai ales n condiiile unei
transpiraii intense. Pentru o plant provenit din cultura in vitro este vital pierderea unei
cantiti ct mai mici de ap din esuturi.
274
3. Plantele care n condiiile mediului lor natural de via triesc n simbioz cu fungi
(micorize) sau bacterii (ex: Leguminosae:Rhizobium) simt lipsa acestei simbioze atunci cnd
sunt transferate n condiii in vitro, dar mai ales dac sunt din nou transferate in vivo. Mai
multe studii au artat c inocularea unor plante in vitro mpreun cu microorganismul
simbiont a determinat o cretere i dezvoltare mai bun a explantelor i o supravieuire
crescut atunci cnd s-a procedat la aclimatizarea acestora.
Dhawan i colab. (1986) au demonstrat c adiia de Rhizobium n timpul aclimatizrii
plantelor de Leucaena a dus la formarea nodulilor la peste 80% dintre plantulele care au
supravieuit transplantrii n sol, iar supravieuirea acestora a avut o rat cu 90% mai mare
fa de cele care nu au nodulat. Morandi i colab. (1979) au raportat c plantele produse in
vitro de Rubus idaeus au crescut mult mai bine dac au fost inoculate cu cteva
microorganisme din specia Glanus mycorrhiza. De asemenea, Struller i colab. (1984) au
raportat c micorizele joac un rol important n micropropagarea plantulelor de plop;
inocularea explantelor mpreun cu micorize din specia Paxillus involutus a determinat o
cretere cu 75% a plantelor comparativ cu cele inoculate fr micorize.
Atunci cnd se iau n considerare problemele asociate cu sistemele radiculare ne-
funcionale trebuie avut n vedere urmtoarele msuri speciale:
-permiterea formrii rdcinilor in vitro, ce vor putea ulterior fie s se dezvolte n rdcini
subterane proprii, fie mcar s asigure supravieuirea plantulei pn la formarea unor rdcini
subterane proprii;
-permiterea dezvoltrii in vitro a rdcinilor, atunci cnd e posibil, prin meninerea culturilor,
o perioad de timp, cu rdcinile n mediul lichid, acestea fiind apoi capabile s preia toate
funciile unei rdcini normale, atunci cnd va fi transferat n sol;
-transferarea ntregii faze de nrdcinare n mediu in vivo. nrdcinarea n sol nu este
realizabil la toate speciile de cultur, dar poate fi stimulat prin nmuierea bazei lstarilor n
soluie de auxin. Totui pentru multe specii faza de nrdcinare este bine s aib loc in vitro
mai ales pentru speciile care nu nrdcineaz uor nici n condiii normale de cultur, cu ar fi
speciile ierboase.
Atunci cnd se recurge la aclimatizarea unor plntue obinute prin tehnicile de
regenerare in vitro, trebuie s se in seama de urmtoarele:
1.Pentru a evita infeciile cu fungi sau bacterii:
-agarul de pe rdcinuele explantelor (ce conine zaharuri) trebuie ndeprtat prin splarea
acestora cu ap cldu;
-solul sau substratul solid, n care vor fi trecute plntuele regenerate in vitro, trebuie s fie
sterilizat prin meninerea la temperaturi ridicate (n etuv la 180oC pentru 3 ore) sau prin
iradiere cu radiaii gama.
2.Asigurarea unor condiii ct mai sigure de via, prin executarea tratamentelor de
combatere a insectelor, bacteriilor, fungilor, melcilor (limax), determin o rat mai mare de
supravieuire a plantelor transferate in vivo, care sunt destul de sensibile.
3.Pentru a se evita rnirea rdcinuelor se recomand folosirea, pentru nceput, a unui
sol uor.
4.Pentru a mbunti aclimatizarea plantulelor la condiiile in vivo, nrdcinarea este
bine a avea loc pe medii de cultur srace n sruri minerale (MS concentrat la jumtate sau
KNOP).
5.Uneori este necesar un tratament cu temperaturi sczute (4-8 sptmni la 5oC) in
vitro sau imediat dup transferul in vivo, pentru a scoate plantulele din perioada de laten.
Acest procedeu este necesar mai ales plantelor cu bulbi, arbutilor i plantelor lemnoase, dar
i cerealelor care necesit o perioad de vernalizare pentru a putea produce semine.
275
6.Plantele care formeaz protocorm (cormofitele) sau bulbi, trebuie transferate n sol
n aceast form (protocorm, bulbi), ceea ce va crete ansele de aclimatizare i supravieuire
ale acestora.
7.Transferarea lstarilor generai in vitro pe un mediu fr zaharuri i mbogirea
mediului nconjurtor cu CO2 poate duce la o aclimatizare mai uoar a plantelor (Langford i
Wainwright, 1986).
Mai jos sunt prezentate pe scurt ultimele descoperiri n domeniu:
1.n unitile comerciale, transferul plantelor pentru aclimatizare se face direct n
straturi acoperite cu folie de plastic, ceea ce ajut la meninerea umiditii (uneori se folosesc
i pulverizatoare de ap n acest scop), iar luminozitatea i temperatura trebuie s fie relativ
sczute.
2.Lstarii obinui in vitro la unele specii (Gerbera i Rhododendron) sunt transferai
direct pe un substrat artificial, care va permite nrdcinarea acestora. Laboratoarele Twyford
au confecionat un tip de ldie de plastic prevzute cu 400 de orificii, care vor fi umplute cu
substrat pentru nrdcinare. Acestea vor permite scurgerea surplusului de apa i susinerea
optim a lstarilor. nrdcinarea lstarilor n ldiele perforate va avea loc ntr-o ncpere
semisteril, climatizat, n care umiditatea aerului este meninut ridicat. Imediat ce
nrdcinarea este suficient i lstarii ncep s creasc, butaii sunt transferai din ldiele
perforate direct n ser.
Speciile lemnoase sunt n prezent nrdcinate mai mult in vivo dect in vitro,
deoarece astfel se economisete mai mult timp i bani. La specii ca Rhododendron, Kalmia,
Amelanchier, Betula, Vaccinium, Syringa vulgaris (Zimmerman, 1985) i n general la toate
speciile lemnoase, care sunt propagate comercial, se aplic acest tip de nrdcinare.
3.Compania Milcop din Frana a produs un substrat artificial pentru nrdcinare, pe
baz de polypropilen, autoclavabil, stabil biologic, inert chimic, permind o aerare bun.
Acest substrat este disponibil sub form de fulgi, fiind potrivit pentru nrdcinarea in vitro.
Pentru o nrdcinare direct, in vivo, exist blocuri (cuburi) mici, din acelai material, n care
lstarii pot fi plasai cu uurin.
Pe baza celor prezentate mai sus, se poate presupune c, n viitorul apropiat, vor
aprea pe pia tot mai multe tipuri de substraturi artificiale, ce vor face aclimatizarea
plantulelor mult mai eficient i mai uoar, dect a fost n trecut. Trecerea direct a butailor
in vivo este important, pentru c va duce la eliminarea fazei de nrdcinare in vitro, care este
relativ costisitoare i necesit o perioada de timp suplimentar, ceea ce crete perioada dintre
doua generaii de plantule, fapt nedorit de companiile comerciale productoare de material
semincer. Astfel micropropagarea va deveni o tehnic uzual i mai la ndemn, necesitnd
doar camere de cretere special amenajate pentru aclimatizarea i nrdcinarea butailor
direct pe substraturile artificiale.
276