Sunteți pe pagina 1din 22

ANALIZA MOLECULARĂ A ALELELOR HLA

CRISTINA LUMINIŢA STANCIU, IOAN FLOREA DUMITRU

Facultatea de Biologie, Universitatea Bucureşti

Introducere

Acum mai bine de 100 de ani patologul Rudolph Virchow a descris


tegumentul ca un înveliş protector al organelor interne. La acea vreme tegumentul
era considerat o barieră pasivă la rănirile mecanice şi pierderile de lichide.
Astăzi este ştiut că tegumentul este compus din tipuri celulare
interdependente. Melanocitele din epiderm sunt celulele responsabile de
producerea pigmentului brun (melanina), celulele Langerhans sunt celule
dendritice histiocitare care preiau şi prelucrează semnalele antigenice şi comunică
aceste informatii celulelor limfoide, celule epiteliale scuamoase (keratinocite) sunt
situsurile majore pentru biosinteza moleculelor solubile (citokine) importante în
reglarea funcţională a celulelor adiacente epidermului şi celulelor care formează în
apropierea dermului un micromediu [24].
S-a descris răspunsul imun antitumoral mediat de fenomenul de restricţie
impus de moleculele sistemului major de histocompatibilitate (MHC Major
Histocompatibility Complex I şi II) la nivel cutanat.
Nu s-a găsit o asociere între răspunsul anticorpului la antigenele HLA şi
apariţia cancerului cutanat. La transplantaţii de rinichi asocierea cu HLA-DR7
indică un control genetic al dezvoltării sau regresiei cancerului cutanat implicând
gene din regiunea clasei II a complexului major de histocompatibilitate [5].
Natura moleculară a răspunsului imun HLA I dependent la pacienţi cu
melanom a fost clarificată odată cu descoperirea peptidelor derivate din antigene
tumorale sau asociate tumorilor. Aceste antigene legate de moleculele HLA I pot fi
recunoscute specific de către limfocitele Tc citotoxice. Mai mult, prezenţa unor
antigene HLA I constituie în prezent un criteriu de orientare a imunoterapiei bazate
pe interleukine-2 (IL-2) şi evaluarea imunoterapiei nespecifice asupra proliferărilor
celulare cutanate în funcţie de modificările apărute în structura primară a
moleculelor MHC I şi II aflate pe celulele tumorale.
Dezvoltarea metodologiei biomoleculare a arătat că frecvenţa crescută a
HLA-DR5 şi HLA-DR4 se poate asocia cu anumite tipuri de melanoame. Tipizarea
DNA permite obţinerea de informaţii de mare acurateţe asupra alelelor HLA.

Componenta celulară a sistemului imun cutanat


Tegumentul este alcătuit din epiderm, derm aşezat pe membrana bazală şi
hipoderm. Fiecare dintre aceste ţesuturi conţine populaţii celulare care pot juca rol
activ în reacţiile imune [2].
27
Cristina Luminiţa Stanciu, Ioan Florea Dumitru
Sistemul imun cutanat este alcătuit din două tipuri de celule dendritice: în
epiderm celulele Langerhans CD1a-pozitive şi în derm macrofagele dendritice
CD36-pozitive. Celulele dendritice pot migra dintr-un explant de piele într-un
mediu de cultură.
Keratinocitele - sunt celule epiteliale epidermice care produc citokine
importante: interleukinele 1, 3 şi 6 (IL-1, 3, 6) , factorul de necroză tumorală (TNF-
alpha), GM-CSF. După activarea cu citokinele produse de către limfocite, de
exemplu cu IFN-gamma, keratinocitele secretă chemochine care stimulează
chemotaxia dar şi anumite linii leucocitare. Deşi aceste constatări sugerează că
inflamaţia locală se poate mări prin inducţie keratinocitară nu se ştie dacă
citokinele produse de către keratinocite pot ajunge la derm unde sunt localizaţi cei
mai mulţi efectori imuni. Pe lângă rolul keratinocitelor de a secreta citokine,
acestea pot induce şi exprimarea moleculelor MHC (Major Human Complex) II
prin expunerea la interferon gamma. Mecanismul este similar cu exprimarea MHC
II pe macrofage. De asemenea, keratinocitele exprimă co-stimulatori diferiţi de
aceia aflaţi pe celulele dendritice, macrofage şi limfocitele B. Oricum este neclară
funcţia keratinocitelor de a prezenta antigene pentru iniţierea răspunsului imun prin
intermediul limfocitelor T [2].
În contrast cu keratinocitele din ţesutul cutanat normal, celulele tumorale
din carcinomul bazocelular exprimă puternic şi difuz ligandul Fas (CD95L), dar nu
exprimă antigenul Fas (CD95). Această exprimare in vivo a ligandului CD95L pe
celulele tumorale ale carcinomului bazocelular este asociată cu limfocitele T
peritumorale care merg către apoptoză. Mai mult, CD95L poate fi indus pe
keratinocitele normale aflate în cultură după expunerea lor la lumina ultravioletă
radiaţia B (UV-B). Această inducere a ligandului CD95L a fost confirmată la nivel
proteic şi mRNA folosindu-se pasaje multiple ale keratinocitelor umane şi a liniei
celulelor keratinocitare. Keratinocitele care induc exprimarea ligandului CD95L
caştigă capacitatea funcţională de a ucide linia celulelor limfocitare CD95-pozitivă.
Pe câtă vreme keratinocitele hiperplastice din plăcile psoriazice netratate care nu
exprimă ligandul CD95L pe membrana lor plasmatică, după tratamentul cu UV-B
se produce o puternică exprimare a CD95L pe keratinocite, ceea ce coincide în
mod temporar cu depletia celulelor T intraepidermale la pacienţii studiaţi.
Datele sugerează o nouă cale prin care lumina UV-B poate contribui la
abilitatea celulelor canceroase cutanate de a scăpa atacului imun al limfocitelor T
citotoxice. Asemenea evenimente imunologice prevăd implicarea ligandului
CD95L ca tratament nou în neoplasmele cutanate dar şi în cazul unor variate
dermatoze mediate de celulele T cum ar fi psoriazisul [9].
Analiza răspunsului obţinut în urma iradierii cu UV (UVB, 280-320 nm),
la nivel transcriptional, prin metoda PCR (Polymerase Chain Reaction) a identificat
o forma nerecunoscută a unui grup larg de gene represate. Printre aceste gene UV-
represabile a fost identificat un nou inhibitor serin proteinaza (serpin) denumit
hurpin (HaCaT UV-repressible serpin). Noul serpin are aproape 59% din

28
Analiza moleculară a alelelor HLA
aminoacizi identici cu antigenul 1 al celulei scuamoase carcinomatoase (SCCA1
squamous cell carcinoma antigen 1) şi cu antigenul 2 al celulei scuamoase
carcinomatoase (SCCA2). Trăsăturile structurale unice ale serpinei aparţin familiei
ovalbuminei (ov-serpins). Secvenţa de aminoacizi din regiunea hinge în situsul
loop reactiv sugerează că hurpin are capacitatea de inhibare a proteazei. Rezidurile
din centru reactiv P1-P1 au fost identificate ca Thr 356-Ser 357 de aliniamentul cu
alte ov-serpine.
Expresia hurpin este limitată la celulele epidermale unde au fost detectaţi
doi transcripti de 3.0 si 3.4 kb. Mai mult exprimarea hurpin pare a fi înrudită cu
activarea şi proliferarea keratinocitelor când transcriptul hurpin este mult mai
abundent în keratinocitele imortalizate (HaCaT) şi în cultura de keratinocite
normale comparativ cu exprimarea lui în ţesutul cutanat normal [1].
Factorul de stimulare a coloniilor de granulocite-macrofage GM-CSF este
unul din factorii care stimulează proliferarea keratinocitelor şi de asemenea este un
factor chemoatractant pentru neutrofile şi macrofage [30].
Deşi există un paralelism clar între apoptoză şi sfârşitul diferenţierii
epidermale este neclar dacă terminarea diferenţierii keratinocitelor este o formă a
apoptozei. Apoptoza este rară în culturile aderente de keratinocite normale chiar şi
atunci când factorii de creştere sunt îndepărtaţi. Keratinocitele puse într-o
suspensie timp de 24-96 ore, majoritatea suferă o diferenţiere terminală. Metoda
TUNEL (Terminal-Uridin-Nucleotide-End-Labelling) utilizată în vederea detectării
punctelor de fragmentare DNA nu este întodeauna un marker specific al apoptozei
keratinocitelor. In vivo şi în cultură, apoptoza şi diferenţierea terminală a
keratinocitelor sunt evenimente celulare distincte, sensibile la diferiţi stimuli [8].
Celulele epidermale Langerhans - sunt celule derivate din măduva osoasă,
având aspect pronunţat de asemănare cu profilul celulelor dendritice localizate în
partea suprabazală a epidermului. Funcţia celulelor Langerhans este aceea de
prezentare a antigenelor către limfocitele T (CD4 +) [2].
Datorită faptului că au ATP-aze, esteraze, receptori pentru complement,
receptori Fc, se aseamănă cu macrofagele, de care se deosebesc prin poziţia lor
predilectă în organism, adică la nivel cutanat. Celulele Langerhans stimulează
potent limfocitele T. Prin cultivarea lor in vitro pierd capacitatea de prelucrare a
antigenului fiind, ca şi celulele dendritice, inductoare ale răspunsului imun primar,
dar nu şi secundar.
Celulele Langerhans sunt bogate în antigene MHC clasa II şi HLA-DP şi
HLA-DQ dar totuşi nu au markerii antigenici specifici monocitelor, macrofagelor
deşi exprimă pe suprafaţa membranei antigene MHC clasa I.
Studiile in vitro au arătat că GM-CSF sunt importante pentru celulele
Langerhans. În ţesutul cutanat uman normal, GM-CSF induce schimbări în
fenotipul şi distribuţia celulelor CD1a+ potrivit cu maturarea funcţională a celulelor
Langerhans şi migrarea lor din epiderm către derm. GM-CSF pot juca un rol
crucial în patogeneza inflamaţiilor dermatoase [27].

29
Cristina Luminiţa Stanciu, Ioan Florea Dumitru
A fost investigat rolul factorului de necroză tumorală alpha (TNF-α) în
mobilizarea şi migrarea celulelor epidermale Langerhans. Injectarea intradermică a
TNF-α recombinat la voluntari umani normali a condus după 2 ore la o reducere a
frecvenţei celulelor Langerhans în stratul epidermal. Rezultate echivalente au fost
obţinute când celulele epidermale Langerhans au fost identificate ca stând la baza
exprimării CD1a sau HLA-DR. La doza uzuală de 500U de TNF-α rezultatul
tratamentului este acela că densitatea celulelor Langerhans se reduce cu
aproximativ 24%. Tratamentul cu TNF-α a fost asociat cu infiltrarea polimorfo-
nuclearelor perivasculare după 2 ore de la injectare, dar epiderma apare normală
fără necroză fibrinoidă şi vasculită, iar morfologia celulelor Langerhans nu a fost
afectată semnificativ. Aceste rezultate demonstrează că TNF-alpha furnizează un
semnal important pentru migrarea celulelor Langerhans şi de aceea joacă un rol
crucial în inducerea răspunsului imun cutanat [7].
Limfocitele intraepidermale - în cadrul epidermului există o mică populaţie
de limfocite. La om acestea constituie doar aproximativ 2% din limfocitele asociate
sistemului cutanat, restul de celule sunt proprii dermului; majoritatea limfocitelor
sunt celule T (CD8+). În cele mai multe ţesuturi extracutanate limfocitele T
intraepidermale pot exprima un set restrictiv de receptori antigenici însă nici
specificitatea şi nici funcţia acestei subpopulaţii de celule T nu este definită.
Procesul de cantonare a limfocitelor din circulaţia periferică în ariile specifice sau
de dependenţă a unor celule T la epiderm (“homing”) poate fi controlată prin
molecule de adeziune specifice. Celulele T intraepidermale precum şi unele celule
T din epiderm exprimă un carbohidrat sializat numit - antigen limfatic cutanat
(CLA -1 - Cutaneous Lymphocyte Antigen) care este recunoscut de selectina E, şi
care a fost identificat iniţial ca o moleculă endotelială ce induce un răspuns imun
inflamator timpuriu. Majoritatea moleculelor determinantului CLA-1 sunt
sintetizate când celulele T devin active în micromediul cutanat ca răspuns la
citokine. Un număr mic de celule T circulante exprimă CLA-1 şi pot adera la
celulele endoteliale, exprimând în acelaşi timp selectina E.
Limfocitele şi macrofagele dermice - ţesutul conjunctiv al dermului conţine
macrofage dispersate şi limfocite T (CD4+/CD8+) situate predominant
perivascular. De obicei celulele T exprimă markerii celulelor activate sau de
memorie cum ar fi CD45-RO şi un număr mare de receptori IL-2R-alpha [2].
Fiziologic, limfocitele B nu sunt prezente la nivel cutanat. Chiar şi în
situaţii patologice ele apar foarte rar. În schimb, limfoamele primare cutanate cu
celule B sunt caracterizate de proliferarea limfocitelor B la nivel cutanat. Aceasta
sugerează cu siguranţă existenţa unui micromediu care sprijină expansiunea clonală
a celulelor B. A fost demonstrată implicarea citokinelor în patogeneza limfoamelor
cutanate care au la origine celula T. Citokinele exprimate în leziunile cutanate ale
limfoamelor cu celule B nu au fost investigate până acum. De aceea s-a analizat la
nivelul mRNA mai multe citokine folosind tehnica RT-PCR [3].

30
Analiza moleculară a alelelor HLA
Iniţierea răspunsului imun în piele
Antigenele proteice ajunse în tegument mobilizează trei tipuri de celule
prezentatoare de antigen. Celulele Langerhans reprezintă calea majoră de
prezentare a antigenelor cutanate către celulele T native. Aceste celule leagă
antigenul de suprafaţa lor, îl prelucrează şi apoi părăsesc sediul tegumentar
încărcate cu antigene, către vasele limfatice aferente spre regiunea paracorticală a
ganglionilor limfatici, unde se formează celulele interdigitate capabile să prezinte
în final antigenele limfocitelor T (CD4+). În stare de repaus fără stimulare
extrinsecă celulele dendritice sunt celule prezentatoare de antigen. Pe de altă parte,
macrofagele şi limfocitele B care sunt prezentatoare de antigen în mod curent
trebuie să fie mai întâi activate. Structural celulele dendritice exprimă un nivel
ridicat de molecule MHC II, precum şi co-stimulatori cum este glicoproteina B7.
Celulele Langerhans proaspăt izolate nu activează limfocitele T dar capătă această
capacitate după o scurtă cultivare de cca. 1-2 zile. Această perioadă de cultivare
este analogă cu migrarea celulelor Langerhans încărcate cu antigen, în vasele
limfatice aferente. Celulele Langerhans prezentatoare de antigene asigură activarea
limfocitelor T în nodulii limfatici şi nu la nivel cutanat unde a fost introdus iniţial
antigenul de referinţă. Macrofagele dermale şi celulele endoteliale venale pot
prezenta antigene limfocitelor T din derm. Cele mai multe dintre aceste celule T
dermale sunt activate anterior sau sunt celule de memorie.

Mecanisme prin care celula tumorală evită raspunsul imun


Chiar dacă celulele tumorale exprimă antigene specifice care pot fi
recunoscute ca proteine străine, sistemul imun nu poate supraveghea şi preveni
apariţia şi frecvenţa cancerelor letale.
Obiectivele de bază ale terapiei antitumorale sunt tocmai creşterea
imunogenicităţii tumorilor şi amplificarea activităţii efectorilor imunologici pe căi
specifice şi nespecifice. Pentru aceasta trebuie să se cunoască în detaliu
mecanismele prin care fiecare tip de celulă tumorală evită răspunsul imun. În
lucrarea de faţă se accentuează descrierea categoriei de mecanisme dependente de
MHC, ţinându-se cont de ambele funcţii ale acestor molecule:
- asigurarea histocompatibilităţii;
- realizarea răspunsului imun sub restricţia lor.

1. Expresia moleculelor MHC-I în celulele tumorale poate fi reglată în


sens negativ (expresie redusă), astfel încât acestea să nu poata forma complexe
între antigenele tumorale prelucrate şi moleculele MHC.
Creşterea nivelului de sinteză şi a capacităţii de exprimare a moleculelor
MHC I în celule tumorale este urmată de mărirea susceptibilităţii lor faţă de liza
produsă “in vitro” de către limfocitele T citotoxice (CTL).

31
Cristina Luminiţa Stanciu, Ioan Florea Dumitru
Deşi există multe analize “in vitro” rezultatele lor nu se pot extrapola în
totalitate situaţiilor existente “in vivo”. De exemplu, nu întotdeauna între celula
tumorală cu potenţial metastatic şi aceea ne-invazivă există diferenţe privind
sinteza şi expresia moleculelor MHC-I.
2. Cele mai multe celule tumorale nu exprimă molecule MHC II, deci nu
pot activa decât celule specifice, adică celule CD4+.
Activitatea antitumorală a limfocitelor T citotoxice CTL este într-o
oarecare măsură dependentă de semnalele provenite de la celulele T helper. Dacă
în structura tumorilor nu există infiltrate celule prezentatoare de antigen clasice,
care să prezinte antigenele tumorale şi apoi să activeze limfocitele T helper, atunci
nu apare nici diferenţierea limfocitelor T citotoxice (CTL) cu activitate
antitumorală.
3. Declanşarea răspunsului imun antitumoral poate conduce uneori, la
selecţia de celule tumorale în care se produc mutaţii ale structurii genelor care
codifică antigenele MHC; aceste molecule au rol indispensabil în prezentarea
peptidelor tumorale către sistemul imun.
Pe suprafaţa celulelor tumorale, antigenele MHC sunt expuse asociat
antigenelor tumorale, formând complexul de recepţie faţă de efectorii celulari
imunologici tip: CD4+/CD8+ (NK, CTL, limfocite helper). Modificarea anti-
genelor MHC prin mutaţie genetică va neutraliza răspunsul imun antitumoral
declanşat specific sau nespecific. Acest fenomen de instabilitate genetică se
produce din cauza ratei mari de multiplicare a celulei tumorale [2].

Antigenele complexului major de histocompatibilitate (MHC)


Antigenele de histocompatibilitate se definesc ca molecule ale suprafeţei
celulare şi care, datorită diferenţelor biochimice individuale sunt recunoscute de
sistemul imunitar al receptorului de grefă. Diversitatea biochimică la nivel
individual a acestor molecule stă la baza unicităţii biochimice a fiecărui individ
uman şi determină o diversitate genică corespunzătoare.
Sistemul HLA este constituit: a) dintr-un prim grup de gene ce se găsesc pe
locusurile A, B şi C a căror expresie fenotipică (antigenele de histocompatibilitate) au o
analogie marcată (atât lanţurile grele cât şi cele uşoare) cu imunoglobulinele; b) dintr-o
a doua clasă de gene echivalente produselor Ir şi constituite din genele DR; c) în afara
genelor A, B, C şi DR o a treia clasă de gene cuprinsă în sistemul HLA.
În Tabelul 1 se poate observa frecvenţa bolilor la diverse specificităţi
HLA-DR [18].
Tabelul 1. Afecţiuni asociate sistemului HLA (dupa Svejgaard) [18]
Frecvenţa %
Boala HLA Risc relativ
Pacienţi Martori
Dermatita herpetiformă D/DR 3 85 26.3 15.4
Psoriazis vulgaris Cw6 87 33.1 13.3
32
Analiza moleculară a alelelor HLA
Distribuţia tisulară a moleculelor MHC II
Moleculele MHC II sunt exprimate predominant pe limfocitele B şi pe
toate celulele care prelucrează şi expun antigenul pe suprafaţa lor.
Intensitatea exprimării moleculelor MHC II este variabilă, fiind controlată
de diferiţi factori: interferonul γ, IL-2 şi alte produse de sinteză a celulelor T
amplifică nivelul de exprimare a moleculelor MHC II, iar glicocorticoizii,
alfafetoproteina, lipopolizaharidele bacteriilor Gram negative diminuă gradul
exprimării acestor molecule. Limfocitele B şi celulele tumorale eliberează
moleculele MHC II [32].

Structura moleculară a antigenelor MHC II


Orice celulă exprimă pe suprafaţa sa molecule cu proprietăţi antigenice
particulare, a căror sinteză este sub controlul genelor din complexul major de
histocompatibilitate [32].
În general se consideră că antigenele MHC clasa I sunt recunoscute de
celulele T CD8+, în timp ce antigenele MHC clasa II sunt recunoscute de celulele T
CD4+ [20].
Complexul genic HLA este localizat la om pe cromozomul 6 [5].
Acest complex se găseşte pe braţul scurt al cromozomului uman (6p21.1 -
6p21.3) [6] şi cuprinde aproximativ 3500 (kbp) kiloperechi de baze, iar în interiorul
complexului, regiunea (telomerică) a clasei I şi regiunea (centromerică) a clasei II
sunt diferite [31].
Clasa a II-a de molecule este alcătuită din lanţurile α ţi β, două
glicoproteine heterodimere distincte de circa 32-34 kDa, respectiv 26-29 kDa. Sunt
legate între ele prin forţe necovalente şi au fiecare un domeniu extracelular cu 195-
199 aminoacizi şi câte două legături disulfidice intralanţ care formează câte două
bucle α1 şi α2 la nivelul lanţului α şi β 1, şi β 2 la nivelul lanţului β, un segment
transmembranar cu circa 23 aminoacizi şi un domeniu intracitoplasmatic. Ambele
lanţuri leagă hidraţi de carbon. Lanţul α are două catene oligozaharidice laterale,
iar lanţul β doar o catenă.
Domeniile NH2 terminale α1 si β 1 sunt polimorfe, pe când cele α2 şi β 2
sunt mai constante, fiind asemănătoare cu regiunile constante ale
imunoglobulinelor. Segmentul transmembranar are circa 25 de resturi de
aminoacizi hidrofobi, iar cel citoplasmatic circa 10-20 resturi de aminoacizi.
Domeniile α1 şi α2 leagă hidraţi de carbon la radicalii de asparagină din poziţiile
78 şi 118, iar lanţul β leagă un glican la poziţia 19, iar gruparea glucidică conţine:
manoză, galactoză, fucoză, glucozamină [21].
Analizele moleculare au permis subdivizarea regiunii HLA clasa II în mai
multe subregiuni [29].
Regiunea genelor din complexul MHC care codifică pentru moleculele
clasei a II-a, denumită HLA-D, codifică de fapt pentru mai multe tipuri de
33
Cristina Luminiţa Stanciu, Ioan Florea Dumitru
molecule care au toate aceeaşi structură, deşi există considerabile diferenţe
biochimice între moleculele controlate de cele trei subregiuni DP, DQ, DR. Sunt
exprimate selectiv pe suprafaţa limfocitelor B, monocitelor şi macrofagelor, pe alte
celule prezentatoare de antigen, pe limfocitele T activate, în special pe cele T
ajutătoare, pe celulele epiteliului timic. Lipsesc pe precursorii limfocitari B, apar pe
suprafaţa limfocitelor B imunocompetente aproape simultan cu moleculele de
imunoglobulină pentru ca să dispară pe plasmocite.
Exprimarea lor este activată de anticorpi anti-imunoglobulină, de IL-4 care
acţionează la nivelul transcripţiei genelor şi este inhibată de IFN-γ care blochează
efectul activator al IL-4 [21].
Antigenele complexului major de histocompatibilitate clasa II au un rol
bine definit în restricţiile interacţiilor celulă – celulă în timpul răspunsului imun.
Rezultatele studiilor sugerează că antigenele HLA II pot induce direct proliferarea
celulară în absenţa activării policlonale. Legarea antigenelor fie a lui DR, fie a lui
DP fac posibilă proliferarea celulară [17].

Citokine implicate în mecanismele inflamatorii


Interleukina 1 (IL-1) este produsă de celulele din seria monocite-
macrofage, dar şi de keratinocitele tegumentare, de celulele endoteliale, gliale,
dendritice, NK (natural killer) [31]; este o glicoproteină transmembranară, cu
greutatea moleculară de 17.5 kDa, rezistentă la temperatura de 56oC şi la pH 2-9,
dar este sensibilă la acţiunea pronazei, chemotripsinei si tripsinei. Molecula are în
compoziţie circa 30% carbohidraţi şi se găseşte sub două forme, care, deşi sunt
produsul unor gene diferite, se leagă de acelaşi receptor: IL-1α, cu 159 resturi de
aminoacizi şi IL-1β, proteina globulară cu 153 resturi de aminoacizi. Majoritatea
moleculelor IL-1α rămân în celulă, fiind active numai în cazul contactului celulă-
celulă, în timp ce moleculele IL-1β sunt eliberate extracelular sub formă de precursori
cu greutate mare (36 kDa) şi scindate de proteaze în molecule de 17 kDa.
Sinteza IL-1 este realizată de numeroase tipuri de celule aflate sub acţiunea
unor factori inductori dependenţi sau independenţi de antigen. Din prima categorie
fac parte contactele intracelulare realizate de moleculele de adeziune după stimul
antigenic, citokinele eliberate de limfocitele T activate, IL-1 exogenă, etc. În a
doua categorie intervin unele iritaţii celulare provocate de virusuri, bacterii sau alte
citokine (TGFβ, TNFα, GM-CSF, etc.)
Sinteza este inhibată sau diminuată de către prostaglandine (PGE2),
interferoni, corticoizi, IL-4, IL-6, IL-10, histamină, ciclosporină, etc.
După legarea de receptorul celular specific, IL-1 declanşează transmiterea
intracelulară a diferitelor semnale ca: activarea proteinkinazelor, creşterea nivelului
intracelular de cAMP care activează factorul nuclear stimulator pentru limfocitele
B ce se fixează la DNA, activarea PLC legată la fosfatidil-etanol-amină, a
calmodulinei, şi exprimarea genelor c-fos, c-myc, c-jun, etc [21].

34
Analiza moleculară a alelelor HLA
Interleukina 2 (IL-2) este un factor solubil produs de către limfocitele T
stimulate cu antigene, aloantigene sau mitogene. Molecula are greutate de 15 kDa
cu 133 resturi de aminoacizi. Sinteza acestei glicoproteine cu rol de "hormon
imunologic" este sub controlul unei gene localizate pe cromozomul 4 şi este
asociată cu exprimarea concomitentă a receptorului pentru ea (IL-2R) pe suprafaţa
membranei plasmatice a celulei care o sintetizează. Activitatea de sinteză are loc în
primele 4 ore după stimulul antigenic, continuă ascendent până în ziua a 3-a, după
care începe un declin cu încetarea sintezei la 5-8 zile de la stimul. Sinteza maximă
a IL-2 ar avea loc între 2-5 zile, cu implicarea unor enzime şi metaboliţi ai
inozitolfosfatului în interdependenţă cu nivelul citoplasmatic al Ca2+. Este inhibată
de către ciclofosfamidă, cortizon, ciclosporina A, fosfolipaza A2, prostaglandina
E2, etc. şi activată de IL-1, IFN, GM-CSF şi alte citokine.
În afară de limfocitul Th(CD4+) care este şi principalul ei producător, IL-2
este sintetizată în cantităţi mici şi de limfocitele T supresoare/citotoxice (CD8+) şi
poate de celulele NK [21].
Interleukina 6 (IL- 6) este o glicoproteină cu greutatea moleculară de
~ 21 kD şi cu 184 de resturi de aminoacizi cu două situsuri de N- glicozilare şi cu
două punţi disulfidice.
Este produsă de către o mare varietate de celule printre care şi keratinocite
şi acţionează asupra a diferite celule ţintă. Este implicată în diferenţierea celuleleor
B, sintezei proteinelor de fază acută, proliferarea şi diferenţirea limfocitelor T,
promovarea creşterii celulelor mielom, sinteza IL-2 şi exprimarea receptorilor
pentru IL-2.
Receptorul pentru IL-6 este exprimat pe suprafaţa celulelor T în repaus, a
celulelor B lipsite de IgD pe membrană, pe celulele mielom etc. Receptorul este un
dimer cu GM = 80 kDa, din familia imunoglobulinelor care, printr-un lanţ
polipeptidic adiacent la o glicoproteină (gp 130) ar transmite semnale intracelular.
De aceea această limfokină este implicată în patogeneza unor boli în care
nivelul seric al ei este crescut: anomalii policlonale B, boli autoimune de genul
artritelor reumatoide, cirozelor hepatice, boli proliferative ca psoriazis sau unele
neoplazii ca plasmocitoame, mieloame, limfoame, leucemii, carcinoame [21].
Creşterea nivelului de exprimare al IL-6 este observată în multe tumori
solide şi în leziuni hiperproliferative (şi glucocorticoid-supresabile) ale psori-
azisului. IL-6 sporeşte proliferarea keratinocitelor dar inhibă linia celulară
carcinomatoasă ZR-75-1 şi T-47D [13].
Studii recente au arătat că tegumentul şi în particular tegumentul rănit
reprezintă un situs major al producţiei de interlukină-6 (IL-6). Marcajul reglării
genei interleukinei-6 este indusă de inflamaţiile asociate citokinelor, produşilor
bacterieni, infecţiilor virale, şi activarea oricărei din cele trei căi majore ale
semnalului de transductie (diacilglicerol- cAMP şi Ca2+ activat) [26]. Exprimarea în
exces a IL-6, IL-10 şi TNF-alpha a fost întalnită în limfoamele cutanate cu
limfocite B. Această exprimare în exces a citokinelor IL-6 şi IL-10 în limfoame
35
Cristina Luminiţa Stanciu, Ioan Florea Dumitru
primare cutanate cu celule B pot avea o importanţă particulară întrucât aceste
citokine sunt considerate a fi suportul creşterii celulelor B [4].

Aplicaţii ale tehnologiei biomoleculare în diagnosticul tumoral


Metoda: PCR Polimerase Chain Reaction a fost inventată de către Mullis şi
colaboratori la Cetus Corporation în anul 1985 [19] , deşi principiul metodei fusese
descris în detaliu de Khorana şi colaboratori cu un deceniu anterior [11, 22].
Aplicaţia tehnică constă în producerea unui număr foarte mare de copii
(220) ale unei secvenţe specifice de DNA; amplificare până la nivel detectabil.
Aplicaţiile practice constau în recunoaşterea unor secvenţe în scop de
diagnostic, obţinerea unei anume gene, în scopul realizării profilului de restricţie
(RFLP); obţinerea unui fragment DNA, în scopul realizării unei construcţii genice.
Componentele biologice pe care se realizeaza PCR sunt:
DNA genomic, DNAc provenit din reverstranscrierea mRNA (RT-PCR),
DNA plasmidic.
DNA-ul genomic este diferit de DNA-ul plasmidic deoarece primul dă un
număr mic de copii ale secvenţei de amplificat spre deosebire de cel plasmidic care
dă un număr mare de copii.
Partenerii de reacţie sunt:
1) Catena DNA care poate fi genomic, plasmidic, DNAc "matriţa" sau
master- conţinând secvenţa de interes.
2) Scurte fragmente DNA complementare extremităţilor 5' şi 3' ale
secvenţei de interes (de amplificat) primeri.
3) DNA-polimeraza ---- Taq polimeraza izolată din Termophylus aquaticus
4) dNTP deoxinucleotidetrifosfat: dATP, dGTP, dTTP şi dCTP.
Mediul de reacţie este o soluţie tampon ce conţine MgCl2 (volum total
50µl).
Reacţia de amplificare genică în lanţ, mediată de DNA polimeraza (Taq-
polimeraza) [5].
a) amplificarea genică prin sinteză bilaterală (cu ajutorul unei perechi de
amorse de reacţie: sens- antisens)

produsul de reacţie
(220 copii)
36
Analiza moleculară a alelelor HLA
b) amplificarea genică prin sinteză unilaterală (cu ajutorul unei perechi de
amorse dintre care o amorsă este în exces)

amorsă
"sens" în exces

produs de reacţie 220 copii

c) "Nested" PCR (reacţie PCR care are loc prin intermediul a două perechi
de amorse). Această reacţie reprezintă cel mai performant mijloc de diagnostic prin
amplificare genică.

Reacţie generată de I-a pereche


de amorse

Reacţie generată de a II-a


pereche de amorse

Produs final de reacţie 240


copii

Metoda : RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) constă în


stabilirea polimorfismului electroforetic al lungimii fragmentelor DNA rezultate
prin digestia cu endonucleaze a unui fragment DNA "ţintă".
Fragmentul DNA "ţintă" supus digestiei enzimatice poate fi o moleculă
cromozomală separată ori un produs PCR (LCR) sau de simpla hibridare.

37
Cristina Luminiţa Stanciu, Ioan Florea Dumitru

DNA

Digestie enzimatică

1 2 3 4

Separare electroforetică

marker proba 1 proba 2

Gel de agaroză (bromura de ethidium)

Analiza mutaţiilor apărute în tronsonul genic HLA-DR prin


metoda PCR-RFLP
Una dintre cele mai folosite tehnici pentru detectarea genelor sau a
markerilor genetici este PCR-RFLP (Polimerase Chain Reaction - Restriction
Fragment Length Polymorphism). În mod tradiţional această tehnică implică
digestia enzimatică pentru aproximativ 5µg de DNA genomic amplificat prin PCR,
urmată de electroforeză sau Southern blot [15]. Folosirea reacţiei PCR face posibilă
amplificarea unei regiuni scurte din DNA în apropierea unui situs specific de acces
al unei endonucleaze cunoscute. DNA amplificat este separat şi vizualizat în UV
direct pe gel de agaroză conţinând bromură de ethidium.
38
Analiza moleculară a alelelor HLA
Selecţia şi amplificarea primelor (amorselor de reacţie)
Pentru realizarea PCR-RFLP a fost necesară cunoaşterea secvenţei DNA
din jurul situsului de restricţie al enzimei Alu I. În scopul analizei RFLP este de
dorit să existe o distanţă scurtă între primeri, distanţa ideală fiind 100-200 bp, iar
situsul de restricţie să fie situat aproximativ central. Aceste condiţii au fost strict
respectate.
Protocolul standard de PCR a cuprins 30 cicluri de amplificare, suficient
pentru a produce o bandă puternică pentru o singură secvenţă în 50 ng de DNA
genomic.

Digestia cu endonucleaze de restricţie


În cele mai multe cazuri se ia o parte din DNA amplificat şi se adaugă
enzima de restricţie care recunoaşte specific anumite situsuri din secvenţa de DNA,
apoi se separă şi se vizualizează cum s-a descris anterior prin electroforeză. Enzima
Alu I folosită în aceste experimente nu a fost compatibilă cu soluţia tampon tip
PCR, fiind necesară purificarea fragmentelor de DNA amplificate anterior digestiei
printr-o metodă modernă de afinitate la granule de sticlă (Glass beads). S-a evitat
digestia parţială care ar fi condus la apariţia de probe false, apărând aspecte
heterozigote pentru situsul de restricţie în cauză. Această tehnologie de diagnostic
implica folosirea de probe DNA de control provenite de la indivizi homozigoţi şi
heterozigoţi pentru gena studiată.
Electroforeza în gel
Fragmentele DNA cu talia moleculară cuprinsă între 10 bp si 2 kb pot fi
uşor separate într-un gel de agaroză de concentraţie corespunzătoare. De exemplu
într-un gel de 6% se pot separa fragmente cu talia moleculară cuprinsă între 56 bp
şi 64 bp. În cazul de faţă un gel de 2% sau de 3% a fost suficient pentru
vizualizarea fragmentelor cu talia moleculară cuprinsă între 50 bp până la 500 bp.
În unele cazuri când a fost necesară o rezoluţie foarte înaltă de separare a
fragmentelor de DNA s-au folosit geluri de poliacrilamidă nedenaturate.
Bromura de ethidium (EtBr) poate fi adaugată în gel la o concentraţie de
1µg/ml sau gelul poate fi colorat dupa migrarea electroforetică cu EtBr şi vizualizat
în UV. De asemenea se foloseşte un marker care va confirma mărimea corectă a
benzii amplificate [16].
Aspectul electroforetic al DNA izolat din sângele periferic oferă informaţii
de ordin cantitativ despre concentraţia DNA. De asemenea poate fi măsurată
densitatea optică DO260 a DNA, o unitate de absorbanţă indică în proba respectivă o
cantitate de 50 µg DNA dublu catenar şi/sau 37 µg DNA monocatenar.
Gradul de puritate DNA într-o probă se apreciază în funcţie de valoarea
raportului: λ260 = 1.8 ~ 2
λ280

39
Cristina Luminiţa Stanciu, Ioan Florea Dumitru

Figura 1. Electroforeza în gel de agaroză 1%


a DNA izolat din sange periferic:
(1) 500 ng/µl DNA; (2) 1000 ng/µl;
(3) 400 ng/µl; (4) 200 ng/µl;
(5) 100 ng/µl DNA.

Figura 1 prezintă imaginea


electroforezei dată de DNA izolat din
sângele periferic prin liza celulelor şi
degradarea totală a proteinelor cu proteinază
K (10mg/ml), urmată de precipitarea
proteinelor cu NaCl 6M şi apoi precipitarea
DNA-ului cu etanol absolut. Tamponul de
migrare al electroforezei este TBE (Tris-
Borat-EDTA) 0.5x.
Acest tip de analize a permis
identificarea mutaţiilor apărute în tronsonul
genic HLA-DR, la doi din cei şase pacienţi studiaţi. Profilul electroforetic de
restricţie a fost diferit în tumoră faţă de profilul expus de DNA extras din sângele
periferic.
La carcinoamele cutanate bazocelulare nu se identifică modificări HLA.
Carcinoamele bazocelulare sunt agregate de celule tumorale superficiale care
seamănă macrostructural cu bulbii piloşi. Organizarea acestor celule poate fi sub
formă de coloane, cordoane sau cuiburi de celule bazale. Epidermul ca structură nu
este deranjat în mod semnificativ şi nici nu există interferenţe structurale între
formaţiunile tumorale adiacente. Unele celule carcinomatoase cresc şi din epiteliile
foliculare. Foarte rar foliculii care mărginesc un carcinom bazocelular apar
displazici şi sunt predispuşi transformării maligne.Tot rar se întâmplă ca tumorile
bazocelulare să aibă origine în leziunile de actinită keratozică.
Cele mai des întâlnite forme de carcinom bazocelular sunt acelea cu
extindere radială clar delimitată, capabile să inducă reacţii stromale imunologice şi
chiar să stimuleze formarea unei strome de care se separă printr-o crevasă.
Aspectul general este acela de cuiburi ataşate epidermului. Citologic există două
grade de diferenţiere a carcinoamelor bazale:
a) bine diferenţiate, când au stroma fibro-mucioasă, celularitate redusă,
infiltrat limfocitar rezervat şi
b) slab diferenţiate, când stroma este inflamată şi prezintă ţesut fibros
laminat [23].
În ambele cazuri apare o mică crevasă cu mucus, separând tumora de
stroma inflamată, semnificând benignitatea leziunii. În cadrul carcinoamelor
bazocelulare diferenţiate există o accentuare deosebită a fenomenului de moarte
40
Analiza moleculară a alelelor HLA
celulară programată (nuclei picnotici, condensarea cromatinei perinuclear) fapt
care conferă un scor şi mai ridicat prognosticului, în timp ce tumorile bazocelulare
slab diferenţiate şi prezentând mitoze sunt considerate mai agresive [28].
La niciunul dintre pacienţii investigaţi care prezentau carcinom bazocelular
nu au apărut modificări în structura genică a alelelor HLA, în schimb s-a observat
că modificările HLA apar numai la pacienţii cu tumori spinocelulare, iar eficienţa
tratamentelor de tip imunologic, în acest caz este dependentă de mutaţiile apărute
la nivel local în blocul genic HLA.

PCR-SSP – reacţii de polimerizare în lanţ cu amorsare de


secvenţă specifică
Folosirea unor secvenţe specifice de primeri este bazată pe observaţia că o
amplificare enzimatică apare doar când capatul 3' al primerului este complementar
cu secvenţa ţintă. Alelele individuale sau grupuri de alele sunt diferenţiate de
amplificarea produsului PCR specific. Astfel, primerii sunt aleşi în aşa fel ca
amplificarea să se realizeze în prezenţa alelelor ţintă individuale sau de grup
(Figura 2). Această metodă a fost concomitent dezvoltată de mai multe grupuri şi,
astfel, apare sub diferite nume şi prescurtări cum ar fi ASA (allele – specific
amplification), PASA (PCR amplification of specific alleles) sau ARMS
(amplification refractory mutation system). Ca matriţă PCR este folosit DNA-ul
genomic. Ulterior produsul obţinut după reacţia PCR serveşte ca matriţă pentru
diferenţierea alelelor – specifice PCR [31].
PCR-ul este o realizare majoră în analiza DNA şi RNA pentru că
simplifică atât tehnologia existentă dar permite şi dezvoltarea rapidă de noi tehnici
care nu ar fi fost altfel posibile [16].
mutaţie
1
DNA
bicatenar fragment I 210 copii

3
4
1, 2: primeri externi
3, 4: primeri interni fragment II
210 copii

Figura 2. SSP-PCR reacţie polimerazică în lanţ, întrepătrunsă test de înaltă rezoluţie.


41
Cristina Luminiţa Stanciu, Ioan Florea Dumitru
Identificarea configuraţiei antigenice a HLA
Serologic
Pentru diagnosticarea in vitro a antigenelor HLA pentru testul de
limfocitoxicitate se folosesc pl[ci de microtitrare cu serul anti-HLA gata aplicat în
godeuri.
Principiul testului:
Serurile anti-HLA reacţionează cu antigenele limfocitare corespunzătoare.
Adăugarea complementului modifică membrana celulară a limfocitelor astfel încât
eozina poate pătrunde în celule, modificându-le culoarea (reacţie pozitivă).
Limfocitele care nu reacţioneză nu se colorează (reacţie negativă).
Izolarea limfocitelor T şi B se realizează prin amestecarea a cca 5 ml sânge
heparinizat proaspăt recoltat cu acelaşi volum de soluţie Hank. Se pune într-un tub
Limfoflot şi se adaugă aceeaşi cantitate de probă diluată, în aşa fel încât să nu se
amestece cele două soluţii, după care se centrifughează la 2800 rpm (1000 x g)
timp de 20 min. Limfocitele se sedimentează sub forma unui inel alb, la limita
dintre plasmă şi Limfoflot. Se extrage inelul celular, se pune într-o eprubetă ce
conţine soluţie Hank şi se spală limfocitele de două ori; centrifugare la 1000 rpm
(150 x g). Se aduc limfocitele la 2000-3000 celule/µl cu limfostabil. Limfocitele T
se utilizează pentru determinarea HLA-ABC, iar limfocitele B pentru determinarea
HLA-DR.
Imunologic
Susceptibilitatea faţă de fenomenele de proliferare celulară tumorală
precum şi reacţiile pacienţiilor în cauză la imunoterapie sunt frecvent asociate cu
distribuţia alelelor HLA I şi/sau II. În cazul pacienţilor cu melanom, natura
răspunsului imun a fost clarificată o dată cu descoperirea peptidelor derivate din
antigenele tumorale sau asociate tumorilor.
Nu s-a găsit o asociere între răspunsul anticorpului la antigenul HLA şi
apariţia cancerului de piele în cazul transplantaţilor renal. Asocierea cu HLA-DR 7
indică un control genetic al dezvoltării sau regresiei cancerului cutanat, implicând
genele din regiunea clasei II a complexului major de histocompatibilitate [4].
Reacţia de polimerizare în lanţ folosită este o metodă foarte sensibilă de
amplificare a probelor de DNA chiar în câteva minute. Prin această metodă se pot
amplifica uneori şi urmele care contaminează probele de DNA conducând la un
rezultat fals pozitiv sau la rezultate care nu pot fi interpretate. O sursă importantă
de contaminare a probelor este DNA amplificat care vine în contact cu DNA încă
neamplificat. Chiar şi picături mici de DNA amplificat din aer (amplificate cu altă
ocazie şi vaporizate), conţin suficiente copii ale moleculelor ţintă care
contaminează alte probe. Pentru a evita asemenea contaminări încrucişate se separă
pregătirea probelor de DNA ce urmează a fi amplificate în laboratoare diferite, pre-
PCR (P1- protecţie de gradul 1) şi post-PCR (P2- protecţie de gradul 2).
42
Analiza moleculară a alelelor HLA
a. Activitatea pre-PCR – constă în prepararea şi păstrarea soluţiilor tampon
necesare pentru extracţia DNA din sânge şi amplificarea lui prin PCR. Acest tip de
activitate implică întreaga tehnologie de extracţie a DNA-ului.
b. Activitatea post-PCR - este reprezentată prin toate procedurile post-
PCR inclusiv electroforeza în gel de agaroză şi interpretarea rezultatelor.
Tipizarea DNA permite obţinerea de informaţii de mare acurateţe asupra
alelelor HLA. Deşi puţine studii privesc complexele HLA II-DRB1, -DQA1, şi –
DQB1, se menţionează din ce în ce mai des că alela DQB1-0301 este element
determinant pentru malignizarea melanoamelor.
Alela HLA-DQB1* 0301 poate fi utilă în cercetarea clinică a pacienţilor cu
melanom. Pentru determinarea prezenţei sau absenţei HLA-DQB1* 0301 genomic
s-a preferat metoda SSP-PCR care este mai rapidă, neradioactivă şi foloseşte sânge
integral ca substrat, faţă de metoda SSO (sequence specific oligonucleotide)-PCR
care este radioactivă şi implică utilizarea de radioizotopi [14].
Peptidele derivate din diferenţierea antigenelor melanocitelor au fost
identificate ca ţinte pentru limfocitele T citotoxice CTL în melanomul uman.
Teste imonohistochimice au dat informaţii despre intensitatea şi
microheterogenitatea expresiei antigenului care nu poate fi detectat prin analiza
mRNA la nivel molecular deoarece evită recunoaşterea lor de către limfocitele T
citotoxice [10].
Oncogenele şi alţi markeri moleculari tumorali care prezic agresivitatea
tumorală pot permite individualizarea şi optimizarea terapiei chirurgicale a
melanomului. Au fost examinate exprimările unor markeri cum sunt antigenul
HLA-DR, proteina de şoc termic HSP-70 (heat shock protein-70) şi oncogene c-
myc în melanomul primar şi nodulii regionali. Aceste proteine nu sunt corelate cu
prezenţa unor noduli metastazici [12].
S-a comparat prezenţa alelelor HLA clasa II cu anumite tipuri histologice
de melanom (melanomul lentiginos, melanomul nodular, melanomul superficial
diseminat şi melanomul malign), găsindu-se o asociere între alelele DR5 şi
melanomul superficial diseminat. Acest rezultat confirmă observaţiile lui Muller-
Eckhardt (1984) şi în cazul populaţiei caucaziene româneşti, întărind ideea că
există diferenţe de etiopatologie după criterii etnice. Analizând datele prezentate în
Tabelul 2 se poate uşor observa că alela DRB1*0802 este prezentă în genotipul
românesc în cazul tuturor tipurilor de melanoame luate în studiu.
Din punct de vedere statistic se remarcă prezenţa constantă la toţi indivizii
a alelelor: DRB1*1602,DRB1*0403, DRB1*1302, si DRB1* 0901 (Tabelul 2).
Acest profil parţial ar putea fi considerat specific genotipului populaţional
caucazian din România, frecvenţa alelelor depăşind procentul de 80 %.

43
Cristina Luminiţa Stanciu, Ioan Florea Dumitru

Tabelul 2 – Frecvenţa alelelor HLA-DR la pacienţi cu melanom


Alele HLA-DR Control – voluntari sănătoşi clinic Pacienţi cu melanom %
n=6 n=6 global

DRB1*0101 3 1 33
DRB1*1501 6 4 83
DRB1*1502 2 2 33
DRB1*1602 6 5 91
DRB1*0401 1 2 33
DRB1*0403 6 4 83
DRB1*0405 3 3 50
DRB1*0406 4 2 50
DRB1*0410 5 3 66
DRB1*1101 2 4 50
DRB1*1202 1 2 25
DRB1*1302 6 6 100
DRB1*1402 4 4 66
DRB1*1406 3 1 33
DRB1*0802 3 6 75
DRB1*0803 4 2 50
DRB1*0901 6 5 91
DRB1*1001 1 0 8
DRB1*0408 2 2 33
DRB1*1102 0 0 0
DRB1*1301 3 2 41
DRB1*1305 1 3 33

În Tabelul 2 s-a realizat şi un calcul estimativ privind repartiţia alelelor


HLA-DR pe întregul lot de 12 persoane (sănătoase clinic şi cu melanom), fiind mai
uşor de apreciat frecvenţa globală a fiecărei alele. Astfel s-a constatat că anumite
alele pot constitui baza unui profil caracteristic al populaţiei din România.
Analiza HLA-DR (Figura 3) s-a realizat amplificând DNA genomic prin
reacţii SSP-PCR.

Identificarea configuraţiei genice a sistemului HLA


Metodologia moleculară utilizată este bazată pe reacţia polimerazică în lanţ
(PCR). Tehnic, metoda constă în analiza prin reacţii de polimerizare în lanţ de tip
SSP-PCR (sequence specific priming), şi tipare HLA secvenţială pentru alelele
menţionate. Reacţia se petrece cu amorsarea specifică a secvenţei de DNA
utilizând amorse (primeri) selective pentru tronsoanele genice ale exonilor 1 şi 2,
44
Analiza moleculară a alelelor HLA
permiţând analiza alelică HLA-I în 95 de variante şi HLA-II în 24 de variante
(Figura 3).
În vederea realizării reacţiei PCR s-a izolat DNA genomic prin extracţie cu
amestec fenol-cloroform urmată de deproteinare cu un amestec de pronază
E/proteinază K şi digestia RNA cu RN-aza A. Fiecare reacţie PCR a cuprins:
250 ng DNA genomic, 200 µM din fiecare nucleotidă (dATP, dCTP, dTTP,
dGTP), 1 µM din fiecare amorsă (primer) de reacţie, 2U Taq polimerază
(Fynnzyme) într-un volum final de soluţie tampon de reacţie conţinând: 10 mM
Tris-HCl pH 8.7, 50 mM KCl 0,01% gelatină şi 0,02% Nonidet P 40. Această
mixtură de reacţie a fost supusă la 37 cicluri de amplificare într-un termo-
amplificator Biometra Uno-II. Fiecare ciclu termic de amplificare este compus din
trei categorii de etape: denaturare DNA la 96 oC, 1 min, hibridizarea primerilor
între 54 oC - 60o C 1 minut, extinderea primerilor 2 minute la 72 oC. Între etapele
de acest tip s-au interpus şi cicluri termice unice în care temperaturile de
hibridizare a primerilor au crescut graduat: respectiv la 56 oC, 58 oC şi ultima, de
60 oC. Produsul de reacţie a fost separat prin electroforeză în gel de agaroză
conţinând bromură de etidium şi vizualizat în UV. Reacţiile PCR s-au realizat
folosind truse Pel-Freez (Canada).
În Figura 3 se prezintă criteriile de diagnostic HLA-DR cuprinse într-un
panel de 24 de reacţii SSP-PCR. Se observă că fiecare godeu al gelului arată o
bandă de control cu excepţia liniei 24 care este banda de control negativă. Grupul
de alele amplificate se găsesc pe liniile 3, 16, 22 şi 23, restul fiind negative. Talia
moleculară a fragmentelor amplificate este cuprinsă între 170pb şi 235pb.
Alele amplificate se găsesc pe liniile: 3, 16, 22 şi linia 23. Primerii
neutilizaţi formează o bandă difuză care migrează în front.
În sprijinul acestei metodologii s-a întocmit fotografia gelului de agaroză
(EtBr) în care s-au separat fragmentele de DNA amplificate.

Figura 3. Profilul electroforetic al


produşilor de reacţie SSP-PCR
(Sequence Specific Priming
Polymerase Chain Reaction)
obţinut prin amplificarea aleleor
HLA-DR.

Amplificare specifică pe liniile 3, 16,


22, 23, restul reacţiilor fiind negative.
HLA-DR 7 1 alela
HLA -DR 15 (2) 8 alele
HLA-DR 16 (2) 6 alele
HLA-DR 4 23 alele
HLA-DR 9 1 alela
HLA-DR 53 5 alele

45
Cristina Luminiţa Stanciu, Ioan Florea Dumitru
Există o diferenţă în distribuţia tisulară a antigenelor de clasa I şi II, la om
antigenele de clasa II sunt exprimate şi pe limfocitele T activate. Dar, atât la om cât
şi la alte specii, antigenele MHC intră în componenţa complexului trimolecular
receptor pentru antigen + antigen + MHC realizând recunoaşterea epitopului de
către limfocitul T "sub restricţie MHC". Ele conferă statutul de "reactant"
diferiţilor indivizi faţă de un anumit antigen şi participă efectiv la selecţia pozitivă
şi negativă a limfocitelor.
În afară de importanţa cunoştinţelor fundamentale privind rolul biologic al
sistemului MHC, acestea au şi aplicaţii practice, în sensul precizării asocierii lui cu
unele boli [21].

Acknowledgement
This work was supported by the grand CNFIS 41891/1999-cod 213.

Lista de abrevieri
CTL = limfocite T citotoxice
GM-CSF = factor de stimulare a coloniilor de granulocite- macrofage
HLA = antigene leucocitare umane (Human Leukocyte Antigens)
IFN-γ = interferon-γ
MHC = complexul major de histocompatibilitate
PCR = Polymerase Chain Reaction – reacţie polimerazică în lanţ
PGE2 = prostaglandine
PCR-RFLP = Polimerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length
Polymorphism
RT-PCR = PCR-reverstranscriptaza
SSP-PCR = sequence specific priming
TGF-β = transforming growth factor
TNF-α = factorul de necroză tumorală

Bibliografie

1. H.F. ABTS, T. WELSS, A. MIRMOHAMMADSADEGH, K. KOHRER, G.


MICHEL, T. RUZICKA - J. Mol. Biol. 293 : 29-39 (1999)
2. K. ABBAS ABUL, H. ANDREW LICHTMAN, S. JORDAN POBER.- Cellular
and Molecular Immunology, 2nd ed.:231-232, (1994)
3. K. ASADULLAH , S. GELLRICH , A. HAEUSSLER-QUADE , M.
FRIDRICH, W.D. DOCKE, S. JAHN, W. STERRY - Exp.Dermatol., 9: 71-76
(2000)
4. J.N. BAVINCK, L. GISSMANN, F.H. CLAAS, F.J. VAN DER WOUDE, G.G.
PERSIJIN, J. TER SCHEGGET, B.J. VERMEER, I. JOCHMUS, M.
MULLER, G. STEGER, et. al. - J. Immunol., 151: 1579-1586 (1993).
46
Analiza moleculară a alelelor HLA
5. B. ALBERTS, D. BRAY, J. LEWIS, M. RAFF, K. ROBERTS, J. D.WATSON.
Molecular Biology of the Cell, 3th ed.Garland Publishing, Inc. 291-318 (1994).
6. R.D. CAMPBELL, J. TROWSDALE - Immonol.Today, 14: 349-352 (1993)
7. M. CUMBERBATCH, C.E. GRIFFITHS, S.C. TUCKER, R.J. DEARMAN, I.
KIMBER - Br.J.Dermatol., 141: 192-200 (1999).
8. A. GANDARILLOS, L.A. GOLDSMITH, S. GSCHMEISSNER, I.M. LEIGT,
F.M. WATT - Exp.Dermatol., 8: 71-79 (1999).
9. C. GUTIERREZ-STEIL, T. WRONE-SMITH, X. SUN, J.G. KRUEGER, T.
COVEN, B.J. NICKOLOFF - J.Clin.Invest., 101 : 33-9 (1998).
10. E. JAGER, M. RINGHOFFER, M. ALTMANNSBERGER, M. ARAND, J.
KARBACH, D. JAGER, F. OESCH, A. KNUTH - Nt J.Cancer, 71 : 142-147
(1997).
11. K. KLEPPE, E. OHSTUKA, R. KLEPPE, L. MOLINEUX, H.G. KHORANA -
J. Mol. Biol., 56, 341 (1971).
12. M.M. KONSTADOULAKIS, M. VEZERIDIS, E. HATZIYIANNI, C.P.
KARAKOUSIS, B. COLE, K.I. BLAND, H.J. WANEBO - Ann.Surg.Oncol., 5:
253-260 (1998).
13. J. KRUEGER, A. RAY, I. TAMM, P.B. SEHGAL - J.Cell.Biochem., 45 : 327-
34 (1991).
14. M. LU, W.A. THOMPSON, D.A. LAWLOR, J.D. REVEILLE, J.F. LEE - J.
Immunol. Methods, 199 : 61-68 (1996).
15. T. MANIATIS, E. FRITSCH, J. SAMBROOK (ed.): Molecular Cloning: A
Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY (1982).
16. M.J. MCPHERSON, P. QUIRKE, G.R. TAYLOR. - PCR A Practical
Approach, Oxford University Press, 21-23 (1993).
17. N. MOONEY , D. CHARRON - Internat. J. Immunopathol. Pharma., 1: 51-56,
(1988).
18. I. MORARU, Imunologie, Editura Medicală, Bucureşti, 376 (1984)
19. K. MULLIS, F. FALOONA - In Methods in enzymology, 155, ed.R.Wu,
Academic Press, New York, 335 (1987).
20. M.I. NISHIMURA, D. AVICHEZER, M.C. CUSTER, C.S. LEE, C. CHEN, M.R.
PARKHURST, R.A. DIAMOND, P.F. ROBBIMS, D.J. SCHWARTZENTRUBER,
S.A. ROSENBERG - Cancer Res., 59 : 6230-6238 (1999).
21. A. OLINESCU - Imunologie, Editura didactică şi pedagogică Bucureşti, 278-
279, 158-173, 280-288 (1995).
22. A. PANET AND H.G. KHORANA - J. Biol. Chem., 249, 5213-21 (1974).
23. R.J. REED In Hartmann W. (ed): New Concepts in Surgical Pathology of the
Skin.New York, John Wiley& Sons, 116 (1976).
24. S.L. ROBBINS, V. KUMAR , R.S. COTRAN - The Skin, Pathologic Basis of
Disease, 5th ed., W.B.Saunders Company, 1173 (1994).

47
Cristina Luminiţa Stanciu, Ioan Florea Dumitru
25. T. SATO, T. IWAI, T. SAKAI, H. SATO, M. SEIKI, Y. MORI, A. ITO, - Br.
J.Cancer, 80: 1137-43 (1999).
26. P.B. SEHGAL - J.Invest.Dermatol., 94: 2S-6S. (1990).
27. C.H. Smith, M.H. Allen, R.W. Groves, J.N. Barker - Br.J.Dermatol., 139: 239-
46 (1998).
28. S.G. SILVERBERG. Principles and practice of surgical pathology, vol.1
Churchill Livingstone Inc., 169-170, (1988).
29. J. TROWSDALE - Br.Med.Bull., 43: 15-36, (1987).
30. K.B. VASUNIA, M.L. MILLER, A. PUGA, C.S. BAXTER - Carcinogenesis,
15 : 653-60 (1994).
31. R. WASSMUTH - Biotest Bulletin, 5: 539-551 (1997).
32. G. ZARNEA, GR. MIHĂIESCU - Imunologie, Editura Universităţii Bucureşti,
82-91, 158-161 (1995).

48