Sunteți pe pagina 1din 215

Universitatea de Medicină şi Farmacie “Carol Davila” 

Facultatea de Medicină  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Aplicaţii ale celulelor stem mezenchimale în 
reconstrucţia tractului digestiv  
 
 
 
Autor: 
CĂTĂLIN­IULIAN EFRIMESCU 
 
 
 
 
 
 
 
 
Bucureşti,  
2010 
CENTRUL NAŢIONAL ISBN
BIBLIOTECA NAŢIONALĂ A ROMÂNIEI
Str. Ion Ghica nr. 4, sect. 3, cod 030046
Bucureşti - ROMANIA
Tel. +40 21 311.26.35
Fax +40 21 312.49.90
E-mail: isbn@bibnat.ro
Web:www.bibnat.ro/isbn.php

APLICAŢII ALE CELULELOR STEM 
MEZENCHIMALE ÎN RECONSTRUCŢIA 
TRACTULUI DIGESTIV 
(EDIŢIE ONLINE, 2010) 
 ISBN 978­973­0­09015­4. 

Versiune online a lucrării de licenţă cu acelaşi titlu. 
 
Este intrezisă reproducerea, copierea, editarea şi/sau 
prezentarea materialului de faţă (fragment sau integral) , fără 
acordul autorului. 
Solicitările pot fi transmise pe adresa: catalin_efrimescu@yahoo.com 
Citare:

Efrimescu, CI (2010), “Aplicaţii ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucţia tractului digestiv”,
lucrare de licenţă, accesat (data, zi/lună/an ) la adresa: [http://www.__________]
„Omnis cellula e cellula.”
„Orice celulă provine dintr-o altă celulă.”

Rudolph Virchow, 1855


Coordonator ştiințific: 
 
Prof.Univ.Dr. IRINEL POPESCU 
 
 
 
 
 
 
Îndrumător ştiințific: 
 
Asist.Univ.Dr. MIRELA PATRICIA SÎRBU­BOEŢI 
 
 
 
 

Sincere mulţumiri Domnului Prof.Univ.Dr. Irinel Popescu, pentru şansa


oferită în urmă cu 4 ani de a face parte dintr-un colectiv de cercetare profesionist,
oportunitate încununată prin realizarea acestei lucrări.

Recunoştinţă nemărginită Doamnei Asist.Univ.Dr. Mirela Patricia Sîrbu-


Boeţi pentru sprijinul necondiţionat acordat pe perioada realizării acestei teze.
Doresc să îi mulţumesc pe această cale pentru învăţăturile oferite părinteşte
în decursul perioadei petrecute alături de domnia sa, ca tânăr ucenic în domeniul
cercetării clinice şi experimentale; cunoştiinţele transmise au contribuit major la
formarea mea profesională, învăţându-mă că pasiunea, voinţa, încrederea şi
siguranţa de sine sunt piatra de temelie a oricarui început de drum.

Stimă şi respect!
Sinceră apreciere celor ce şi-au adus contribuţia
la realizarea acestei lucrări:

Prof.Univ.Dr. Liliana Pâslaru,


UMF Carol Davila, Bucureşti

Conf.Univ.Dr. Mihnea Ionescu,


UMF Carol Davila,
Institutul Clinic de Boli Digestive şi
Transplant Hepatic Fundeni, Bucureşti

Conf.Univ.Dr. Cristina Vidulescu,


UMF Carol Davila, Bucureşti

Asist.Univ.Dr. Mihaela Vasilescu,


UMF Carol Davila, Bucureşti

Dr. Lucia Moldovan,


Institutul Naţional de Cercetare-Dezvoltare
pentru Ştiinţe Biologice, Bucureşti

Dr. Mihaela Chivu,


Institutul de Virusologie Ştefan S. Nicolau, Bucureşti

Dr. Coralia Bleotu,


Institutul de Virusologie Ştefan S. Nicolau, Bucureşti

Dr. Vlad Herlea,


Institutul Clinic Fundeni, Bucureşti

Dr. Adriana Dulămea,


Institutul Clinic Fundeni, Bucureşti

Dr. Carmen Mitran,


Spitalul Clinic de Urgenţă pentru Copii M.S. Curie, Bucureşti

Dr. Alexandru Cristescu,


Spitalul Universitar de Urgenţă Elias, Bucureşti

Stud. Elena Ciucur,


UMF Carol Davila, Bucureşti
Motivarea alegerii temei

În ultima decadă, domeniul celulelor stem a obţinut realizări ce păreau incredibile până
nu demult. Ca rezultat, numeroase ramuri clinice se bucură de metode experimentale ce îşi
aşteaptă aprobarea finală pentru a intra în arsenalul terapeutic general, revoluţia “stem”
culminând în anul 2008 cu obţinerea primei inimi cu activitate electro-mecanică create în
laborator (Doris Taylor, Universitatea Minnesota, USA), forţând astfel intrarea într-o nouă etapa
– crearea organelor în laborator.
Cu toate acestea, celulele stem mai au multe de spus în ceea ce priveşte crearea de
ţesuturi şi utilizarea lor. Mai mult, descoperirea periodică a unor noi tipuri de celule stem,
măreşte considerabil numărul posibilelor întrebuinţări.
Din marea familie a celulelor stem, se distinge de departe grupul celulelor stem
mezenchimale (MSC), care sub aspectul obţinerii şi utilizării reprezintă categoria ce oferă cele
mai multe promisiuni clinice. Ca urmare este absolut necesară testarea în diverse condiţii
experimentale, menite a proba utilitatea şi rolul lor.
În chirurgie, MSC şi-au găsit un rol în tratamentul afecţiunii graft versus host disease şi
al unor afecţiuni ortopedice, însă aplicaţiile lor pot fi utile unei patologii vaste, iar acest fapt
merită explorat.
Întrucât datele din literatură de specialitate privind rolul MSC în regenerarea tubului
digestiv sunt insuficiente şi ţinând cont de potenţialul lor dovedit în studii din alte domenii, am
considerat oportună utilizarea lor în acest sens, având în minte folosirea lor pentru una din
complicaţiile chirurgicale cu o mare morbiditate: fistula digestivă. Astfel, rezultatele obţinute vor
putea sta la baza unor studii viitoare mai amănunţite, care să îşi propună decodarea
mecanismelor interacţiunii celulare şi diferenţierea condusă a acestor celule, în favoarea
reconstrucţiei tubului digestiv.
Având încredere în potenţialul acestor celule, studiul prezent îşi propune să apropie
utilizarea MSC în clinica chirurgicală, contribuind la obţinerea unor metode terapeutice
individualizate fiecărui pacient.

Cătălin-Iulian Efrimescu
CUPRINS
PARTEA GENERALĂ   
INTRODUCERE  10 
1  ETIMOLOGIE ŞI DEFINIŢII  11 
2  ORIGINEA CELULELOR STEM  15 
3  CLASIFICAREA CELULELOR STEM  22 
4  PLASTICITATEA CELULELOR STEM  30 
5  CELULELE STEM MEZENCHIMALE: NOŢIUNI INTRODUCTIVE  32 
6  LOCALIZAREA/SURSE MSC  39 
7  ORIGINEA MSC  41 
8  BIOLOGIA MSC  45 
9  CULTIVAREA MSC  63 
10  APLICAŢII ALE MSC ÎN DOMENIUL INGINERIEI TISULARE  82 
11  IMUNOLOGIA MSC  91 
12  CELULELE STEM ŞI CANCERUL  98 
13  METODE DE CARACTERIZARE ŞI IDENTIFICARE IN VIVO A MSC  106 
14  STEMNESS  114 
15  ETICA ŞI STANDARDELE UTILIZĂRII CLINICE A MSC  120 
16  VIITORUL CELULELOR STEM ÎN CLINICĂ  128 
CONCLUZII  131 

PARTEA SPECIALĂ   
INTRODUCERE  134 
IPOTEZĂ  136 
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE LUCRĂRII  136 
MATERIALE ŞI METODE  137 
REZULTATE  162 
DISCUŢII  179 
CONCLUZII  183
PREZENTARE CAZURI  184 
CONCLUZII  196

ANEXA I  198 
ANEXA II  199 
ANEXA III  201 
ANEXA IV  205 
ANEXA V  207 

BIBLIOGRAFIE  208 
Partea generală

Analiza literaturii de specialitate,


centrată pe celulele stem mezenchimale.

Imagine de imunufluorescenţă a unor celule stem mezenchimale.


Marcaj: Zymed Ms anti-Stro-1 şi Gt anti-Mouse-Alexa Fluor 488 (verde).
Tubulina marcată cu phalloidin-Alexa 594 (roşu); nuclei marcaţi cu DAPI (albastru). Invitrogen.

  9 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
Introducere 

INTRODUCERE

Omul, începând încă din zorii maturităţii sale intelectuale, a fost cuprins de dorinţa de a
învinge senescenţa şi moartea. Dacă până acum se putea interveni numai din exterior, acum a
venit timpul ca omul să îşi poată croi singur destinul biologic, coborând spre a lucra însăşi în
interiorul unităţii fundamentale a organismelor vii, celula.
În ultimele două mii de ani, omul şi-a aprofundat cunoaşterea propriului corp, multe
convingeri au fost astfel infirmate sau confirmate, zguduind din temelii ceea ce se ştie despre om
şi originea sa.
Primele întrebări pertinente asupra originii omului şi evoluţiei vieţii, i-au aparţinut lui
Aristotel (384-322 IHr.), aşa cum menţionează Leslie Brainerd Arey, părintele embriologiei
moderne (Arey 1974). Aristotel a fost cel ce a făcut legătura între primele stadii evolutive ale
omului şi uter. Tot el, a adus în dezbatere şi polemica: omul se formează de novo în pântec sau
se găseşte preformat, şi doar se măreşte în cursul evoluţie sale (Arey 1974). O altă corelaţie,
realizată de Aristotel, a fost aceea conform căreia omul se naşte din sângele menstrual al mamei.
O prezumpţie în conformitate cu credinţa acelor vremuri, în care originea animalelor este în
mâzga primordială sau materia descompusă (teoria generaţiei spontane – populară până în Evul
mediu târziu, mai bine de 2000 de ani).
Această teorie a intrat în dezbatere în secolul al XIX-lea, când a fost combătută de o nouă
idee, susţinută de Leydig în 1855: viaţa nu apare spontan, ci originea vieţii este în viaţă (omne
vivum ex vivo). Ideea a fost apoi preluată, susţinută şi extinsă de Virkow în aceeaşi perioadă:
originea tuturor celulelor organismului uman se află într-o celulă (omnis cellula e cellula). (Sell
2004b)
Oficial, teoria generaţiei spontane, a fost revocată în 1864, de către experimentele lui
Pasteur, care au demonstrat că viaţa nu poate apărea acolo unde nu este viaţă. Astfel, rezumând
principiile lui Leydig, Virchow şi Pasteur, putem concluziona că viaţa este un perpetuum mobile,
iar omul – fiinţa fizică, este un stadiu din acest ciclu. (Sell 2004b)
Deşi numeroase progrese s-au făcut în domeniul ştiinţelor biologice şi cel medical, încă
există numeroase afecţiuni ce nu şi-au găsit răspuns, continuând să facă numeroase victime. În
această privinţă, primele cercetări realizate în sfera celulelor stem au menirea de a furniza
răspunsuri la unele dintre întrebările fundamentale cu scopul de a facilita apariţia unor noi terapii
în clinică.
Celulele stem reprezintă pentru lumea ştiinţifică medicală echivalentul pietrei filosofale a
alchimiştilor. Se aşteaptă ca acestea să ofere un rezervor nelimitat de celule, ţesuturi şi organe
menit a corecta dizabilităţile cauzate de boală. Deşi acest domeniu de cercetare se găseşte în
perioada primei copilării, numeroasele rezultate obţinute dau oamenilor de ştiinţă încrederea că
se va putea găsi tratament unor boli precum traumatismele măduvei spinării (McDonald 1999),
bolilor cardiace (Fraidenraich 2004) (Menasché 2004), bolii Parkinson (Takagz 2005), bolii Lou
Gehrig (Wichterle 2002), diabetului de tip 1, sindroamelor de imunodeficienţă, bolilor ţesutului
osos şi cartilaginos, şi, în final, chiar cancerului. Speranţele multor bolnavi sunt legate de
răspunsurile pe care comunitatea ştiinţifică le poate oferi vizând utilizarea celulelor stem în
medicina clinică.
Pentru a fi utile, fiecare tip de celule stem trebuie analizat în amănunt pentru a descifra
modalităţile de manipulare şi control, iar această activitate continuă să fie principala ocupaţie a
oamenilor de ştiinţă ai acestei epoci.
Odată cu crearea primului organ in vitro şi cu aprobarea primelor trial-uri clinice ce
utilizează celule stem mezenchimale şi derivate din celulele stem embrionare, putem spune ca
omul şi-a sfidat condiţia apropiindu-şi imortalitatea....

  10 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 1]                                                                                                                            Etimologie şi definiții 

1 ETIMOLOGIE ŞI DEFINIŢII

„Stem cell research can revolutionize medicine, more


than anything since antibiotics.”
Ron Reagan

Celulele stem mezenchimale suscită un mare interes datorită valorii lor terapeutice, fiind
un instrument cu o largă manevrabilitate în domenii precum medicina regenerativă sau ingineria
tisulară.
Ingineria tisulară/medicina regenerativă reprezintă o arie interdisciplinară a
biotehnologiei, ce are drept scop soluţionarea problemelor medicale critice prin dezvoltarea unor
produse ce pot reanima sau substitui elemente ale organismului uman. Scopul este producerea de
ţesuturi competente din materiale alternative pentru a menţine, restaura şi îmbunătăţi funcţiile
biologice.
Combinaţia inginerie tisulară-MSC constituie o realitate ce accelerază progresul
metodelor terapeutice, cu un cost acceptabil. Raportându-ne la realizările şi dificultăţile întâlnite
de către domeniul transplantologiei, crearea de ţesuturi şi organe funcţionale bazate pe celule
stem va reprezenta o inovaţie salvatoare, mai ales în condiţiile în care transplantul de organ are
unul dintre cele mai scăzute rapoarte cost-eficienţă terapeutică dar şi o disponibilitate limitată.
Celulele stem mezenchimale izolate din măduva hematogenă şi ţesutul adipos sunt
capabile de o diferenţiere variată, producând celule ce pot fi utilizate pentru vitalizarea unor
componente suport ce constituie infrastructura viitoarelor organe şi ţesuturi.
Pentru a dezvolta astfel de tehnici de înlocuire, trebuie luată în considerare necesitatea de
a crea un substrat propice pentru supravieţuirea şi diferenţierea celulară. O strategie pentru
atingerea acestui deziderat este utilizarea implanturilor biocompatibile bazate pe componente ale
moleculelor matricei extracelulare, însămânţate cu celulele auto sau heterologe. În prezent,
eforturile sunt direcţionate către izolarea, expansiunea şi dezvoltarea de sisteme de încapsulare a
MSC în micromedii 3D care conţin un amestec de colagen şi agaroză.
Problemă majoră în crearea unor înlocuitori de ţesuturi şi organe este simularea cât mai
exactă a naturii acestora. Cea mai bună cale pentru atingerea acestui obiectiv este studierea
ţesuturilor şi organelor în timpul embriogenezei şi de-a lungul proceselor normale de reparare,
precum şi modul în care aceste funcţii sunt menţinute.
În cadrul dezvoltării tehnicilor de substituţie a ţesuturilor, trebuie luate în considerare o
serie de factori: (1) necesitatea înlăturării răspunsului imun care poate determina inflamaţia
şi/sau rejetul; (2) realizarea unui substrat propriu pentru supravieţuirea şi diferenţierea celulară;
(3) furnizarea unor condiţii de mediu propice pentru menţinerea ţesutului.
Cu toate acestea, MSC promit a fi un component vital de bază al substitutelor de ţesuturi
şi organe, tehnologia viitorului oferind cercetătorilor posibilitatea de manipulare şi direcţionare
controlată a acestor celule, care vor deveni elementul central în terapie, astfel încât se justifică
orientarea atenţiei asupra MSC.

1.1 Etimologia cuvântului „stem”

Utilizarea cuvântului „stem”, în contextul de celulă stem, provine din limba engleză
unde are numeroase sensuri în sfera botanică şi nu numai. Uzual, cuvântul denumeşte partea
centrală a unei plante, situate deasupra pământului ce dă naştere ramurilor, sau porţiunea unei
plante ce susţine frunze sau flori (Longman 1998). Acelaşi cuvânt denumeşte şi suportul
(piciorul) unui pahar sau partea tubulară îngustă a unei pipe, rădăcina unui cuvânt urmată de un
sufix, linia principală de descendenţă a unei familii, originea unei noi linii familiale ("Stem"
2009a), partea centrală a unei pene etc.

  11 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 1]                                                                                                                            Etimologie şi definiții 

Originile cuvântului „stem” sunt amestecate. În limba engleză modernă îşi are originea
din engleza veche (apărut înainte de anul 900 d.Hr.) ("Stem" 2009b), din perioada medievală, din
cuvântul stefn, stemn cu referirea botanică menţionată. O posibilă origine în limba engleză poate
fi găsită în limba germană stam=stem sau greacă stamnos=cupă de vin ("Stem" 2009a).
Se observă ca element comun al tuturor definiţiilor ideea de element central, de susţinere,
ce stă la origine (linie genealogică).

1.2 Definiţia celulelor stem

Celulele stem sunt celule unice în interiorul corpului uman, ce stau la baza formării
organismului uman şi animal (fiind prezente încă din stadiul de zigot), definite de către Lajtha în
1979 ca celule cu capacitate extensivă de reînnoire şi producere a unor celule fiice capabile de
diferenţiere, având rolul de a regenera şi repara ţesuturile. Sunt celule imature capabile în acelaşi
timp de self-renewal (auto-reînnoire) pe întreaga durată de viaţă a organismului şi generare a
unor celule înalt specializate, însărcinate cu realizarea unor funcţii complexe ce stau la baza
funcţionării organismului uman (ex. neuroni, celule musculare, hepatocite, cardiomiocite, celule
pancreatice etc.).
Principala caracteristică a celulelor stem, indiferent de sursa de provenienţă, care le
diferenţiază capital de restul celulelor din organism, este lipsa specializării şi capacitatea de
diferenţiere. Sunt celule nespecializate, pe întreaga lor durată de viaţă, al căror rol este de a
răspunde la un stimul specific prin self-renewal şi diferenţiere (producerea de celule specializate)
(Fig. 1.1), încât pot genera peste 200 de tipuri de celule specializate identificate în organism.
Semnalele externe ce promovează diferenţierea sunt reprezentate de diverse citokine, contactul
fizic cu celulele vecine şi molecule prezente în micromediu.

Fig. 1.1. Diferenţierea celulelor stem.

Convenţional se consideră o celulă stem orice celulă nediferenţiată, capabilă de self-


renewal pe o perioadă de timp nelimitată şi care poate da naştere cel puţin unui tip de celulă
diferenţiată. În aceeaşi lucrare autorul a cuprins şi menţiuni referitoare la comportamentul
acestor celule şi la caracteristicile ce le deosebesc de anumite celule pseudostem. Astfel, se face
diferenţierea clară între celulele stem (capabile de self-renewal indefinit) şi transit-amplifying
cells (TAC – celule care se pot divide de câteva ori înainte de a se diferenţia; se recomană ca
această denumire să fie aplicată celulelor ce au părăsit compartimentul stem dar care păstrează
capacitatea de diviziune celulară şi diferenţiere (Potten 1990). La aceasta se adaugă ca trăsături
definitorii: diviziunea asimetrică şi interacţiunea cu nişa stem (micromediul format de celulele
înconjurătoare ce favorizează menţinerea şi proliferarea celulelor stem – concept introdus de
către Schofield) (Slack 2008).
Se poate afirma că definiţia „oficială” a acestor celule este forţată şi chiar uneori
paradoxală, deoarece elementele teoretice sumate în aceasta nu se regăsesc in vivo, până la acest

  12 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 1]                                                                                                                            Etimologie şi definiții 

moment, decât la nivelul unui număr redus de celule (celulele stem hematopoietice – HSC,
celulele stem din epiderma adultă şi epiteliul intestinal); astfel încât se defineşte teoretic un
concept, pe baza unor observaţii ale culturilor celulare, a cărui existenţă in vivo este parţial
demonstrată.

1.3 Scurt istoric al activităţilor de cercetare cu celule stem

Anul Eveniment
1958 - Jean Dausset descoperă sistemul HLA.
- Leroy Stevens identifică tendinţa la pluripotenţă a teratocarcinoamelor murine.
Anii - Organele sexuale ale şoarecilor conţin celule ce au posibilitatea de a forma alte tipuri de
1960 celule.
- Originea teratocarcinomului se află în celulele germinale embrionare, la şoarece.
- Identificarea celulelor embrionare carcinomatoase (EC), catalogate ca un tip de celule stem.
1966 - Izolarea celulelor stem embrionare din embrioni de iepure (Cole şi Edwards).
1968 - Prima fertilizarea umană in vitro.
- Primul transplant medular.
- Primele himere murine din celule stem embrionare (Gardner).
1970 - EC injectate în blastocişti murini produc şoareci himerici.
- Leroy Stevens observa că celule germinale murine ce stau la baza teratocarcinoamelor se
asemăna cu celulele embrionare.
1975 - Mintz şi Illmensee, demonstrează că aceste celule pot genera organisme nu numai teratoame.
1978 - Descoperirea celulelor stem în sângele din cordonul ombilical uman.
- Primul copil conceput prin fecundare in vitro se naşte în Anglia.
1980 - Primele rezultate privind obţinerea de blasticişti umani după recoltarea ovulelor prin stimulare
gonadotropinică, fecundare in vitro şi cultivare în laborator (Edwards, Steptoe).
1981 - Identificarea primei linii de celule stem murine izolate din blastocişti.
- Celulele stem injectate la şoareci imunosuprimaţi formează teratoame.
- Evans şi Martin cultivă celule stem embrionare murine în mediu condiţionat de celule
generatoare de teratoame.
1984- - Apar linii clonale de EC.
1988 - Diferenţierea EC în celule neuron-like sub influenţa acidului retinoic.
1985- - Hohan şi Donovan descoperă factorii din cultură, specifici, ce determină diferenţierea
1992 celulelor stem embrionare.
1987 - Celulele stem embrionare regenerează măduva osoasă a şoarecilor iradiaţi letal (Hollands).
1988 - Identificarea primei linii de celule stem embrionare la hamster.
1989 - Producerea de ţesuturi specifice celor trei straturi embrionare din EC umane. Capacitate de
diferenţiere limitată.
1994 - Producerea şi cultivarea de blastocişti umani.
- Identificarea celulelor cu morfologie stem like în aceste culturi.
1995 - Izolarea primei linii de celule stem embrionare primate.
1996 - Wilmut o clonează pe Dolly prin transfer nuclear somatic.
1997 - Clonarea unui miel din celule stem.
- Se naşte Cumulina- primul şoarece clonat din celule cumulus ovariene.
- Identificarea originii leucemiei în celulele stem hematopoietice – dovada implicării celulelor
stem în cancere.
1998 - James Thomson publică izolarea primei linii de celule stem embrionare umane din blastocisti
- Cibelli obţine primul blastocist himera om-vaca
1998- - Michael Levesque transplantează 6 milioane de nuroni dopaminergici unui pacient cu boala
2002 Parkinson, proveniţi din 15 celule stem neuronale recoltate de la pacient. Pacientul îşi
îmbunătăţeşte starea cu cca 40% pe scală UPDRS.
1999 - Diferenţierea celulelor stem mezenchimale umane din măduva osoasă pe linie adipogenică,
condrogenică şi adipoblastică.

  13 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 1]                                                                                                                            Etimologie şi definiții 

1999- - Manipularea ţesuturilor murine adulte produce diferite tipuri de celule.


2000 - Celulele stem embrionare umane produc teratoame după administrarea lor subiecţilor murini
imunosuprimaţi.
2001 - Cercetătorii de la Advanced Cell tehnology Institute anunţă obţinerea unor embrioni umani
clonaţi prin transfer somatic şi partenogeneză.
- Preşedintele SUA limitează fondurile federale pentru cercetare pe celule stem embrionare.
2003 - Se izolează primele celule stem din dinţi pierduţi natural în jurul vârstei de 6 ani. Se întrevăd
noi terapii pentru bolile neurodegenerative şi osoase, bazate pe aceste celule.
2006 - Advanced Cell Technology obţine primele culturi de celule stem embrionare derivate dintr-o
singură celulă embrionară, astfel încât embrionul nu este omorât.
- Celule stem vindeca distrofia musculară la câini.
2007 - Yamanaka şi Thomson obşin primele celule stem pluripotente induse.
- O echipă canadiană obţine primele celule stem leucemice din celule sangvine normale.
2008 - Cercetătorii de la Harvard Stem Cell Institute obţin primele zece linii celulare stem ce
simulează diferite afecţiuni genetice.
- Primul transplant al unui organ obşinut pe bază de celule stem autologe (trahee).
2009 - Preşedintele SUA ridică ban-ul asupra cercetării pe celule stem embrionare finanţate federal.
- Transplantul de celule stem provenind de la nivelul măduvei spinării reversează paralizia
asociată cu leziunile traumatice medulare.
- Karim Nayernia obţine celule spermatozoid-like din celule stem embrionare umane.
după Garland Science 2010, Timetoast 2010, Explore Stem Cells 2010

  14 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 2]                                                                                                                        Originea celulelor stem 

2 ORIGINEA CELULELOR STEM


„In the beginning there is the stem cell; it is the origin
of an organism's life.”
Stewart Sell

2.1 Zigotul

Totul, din punct de vedere biologic, începe şi se termină cu o celulă. La linia de start a
vieţii organismului uman se găseşte celula stem supremă, totipotentă, întruchipată de ZIGOT, iar
la punctul de sosire se găseşte celula capabilă a prelungi viaţa cu încă o generaţie, celula
reproducătoare (ovulul şi spermatozoidul).
Evoluţia zigotului, ca element suprem totipotent este consemnată de-a lungul primelor
diviziuni celulare mitotice (clivaj), simetrice, când toate celulele stem rezultate din acesta
(numite blastomere) sunt totipotente (pot produce celule specifice oricărui ţesţut adult sau
embrionar (Fig. 2.1)).

Fig. 2.1. Evoluţia celulei stem


în ontogeneză. (Sell 2004b)

În timpul acestei perioade, celule fiice primesc un set complet de material genetic diploid
în urma diviziunii blastomerelor. Această diviziune este simetrică (Fig. 2.2), adică fiecare celulă
generează două fiice care la rândul lor vor produce fiecare încă două fiice ş.a.m.d., spre
deosebire de diviziunea celulelor stem adulte care este asimetrică (o celulă, “mama”, produce
două celule, dintre care una păstrează caracterul parental, iar cealaltă se va diferenţia producând
o celulă matură) (Fig. 2.2) (Thrasher 1966). Celula ce va intra în cursul procesului de
determinare se numeşte TDTAC (tissue determined transit-amplifying cells )/TAC şi se divide
de câteva ori până la diferenţierea într-o celulă matură. Divizunea asimetrică joacă un rol
important în biologia celulei stem, asigurând perenitatea acesteia. Totuşi mecanismul prin care
aceasta se realizează nu este cunoscut. Cairns (Sell 2004a) a speculat că în cursul diviziunii doar
una din celule primeşte material genetic identic cu cel al „mamei” (celula destinată reînnoirii
fondului stem) în timp ce, celula destinată procesului de determinare primeşte o copie ADN
sintetizată de novo. Rezultatele lui Potten şi Merck par a susţine această explicaţie (Sell 2004a).

  15 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 2]                                                                                                                        Originea celulelor stem 

Fig. 2.2. Diviziunea celulelor


stem. (Sell 2004b)

Totipotenţa celulelor acestea se menţine pe durata stadiului de morulă, până la apariţia


blastocistului (sfârşitul stadiului de 32-64 de celule, corespunzător zilei 4 de la fecundare).
Din acest moment, apar celulele stem embrionare, pluripotente, ce au pierdut caracterul
de totipotenţă printr-o serie de diviziuni în cadrul procesului de determinare.
Ulterior, celulele stem embrionare capătă noi proprietăţi în urma cărora se vor diferenţia
una de cealaltă şi vor contribui la realizarea unuia din cele trei straturi embrionare primitive
(endoderm, mezoderm sau ectoderm) – proces numit gastrulaţie.
Acest proces, în urma căruia celulele pierd potenţă dar câştigă specializare se numeşte
determinare (Sell 2004b). Determinarea este un concept în embriologie ce datează din 1985,
introdus de Hopper şi Hart (Hopper 1985), ce descrie evoluţia unei celule totipotente către
diferite populaţii celulare care au capacităţi de diferenţiere din ce în ce mai limitate. Presupune o
serie de evenimente în cursul cărora celule stem totipotente dau naştere celulelor stem
pluri/multipotente din structura celor trei straturi embrionare, iar acestea la rândul lor dau naştere
celulelor progenitoare (clasic, se consideră că orice celulă ce nu este totipotentă, cu excepţia
celulelor germinale, se numeşte celula progenitoare (Sell 2004b) din structura organelor
primitive şi adulte. Aceste fenomene se înscriu într-un termen mai cunoscut numit diferenţiere
celulară.
Cu cât celulele capătă o specializare mai înaltă la nivel tisular, cu atât potenţialul lor se
reduce până la stadiul de celulă diferenţiată terminal – celulă adultă funcţională. Astfel, procesul
de determinare nu se derulează numai la nivelul embrionului ci şi la nivelul organismului adult.
Aşa cum se poate observa în figura de mai jos (Fig. 2.3), gradul de
diferenţiere/plasticitate al celulelor stem se modifică odată cu dezvoltarea progresivă a
embrionului (Sell 2004b).
Deşi conform embriologiei clasice, se acceptă că procesul de determinare este cu sens
unic, adică o celulă diferenţiată terminal, este o celulă stabilă (Surani 2001), ce nu este capabilă
de dediferenţiere, rezultatele de laborator contrazic acest fapt. Astfel, transferul unui nucleu
dintr-o celulă adultă într-un ovul, are ca rezultat activarea totipotenţei nucleului transplantat
(Wilmut 1997) (Surani 2001).
Concluzionând, originea celulelor stem, indiferent de tipul lor, se găseşte în celula stem
totipotentă, ovulul fecundat (zigot). Pornind de la aceasta, în cursul evoluţiei embrionului până la
stadiul de adult, fiecare etapă are celulele ei stem caracteristice, astfel încât acestea ajung să fie
prezente chiar şi în ţesuturile organismului adult. Însă, dacă ne referim la localizarea strictă la
nivel de ţesut sau organ, celulele stem ale organismului adult se găsesc localizate la nivelul nişei
celulelor stem – un spaţiu virtual localizat la nivelul oricărui organ adult, care găzduieşte şi
condiţionează evoluţia celulelor stem.

  16 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 2]                                                                                                                        Originea celulelor stem 

Fig. 2.3. Tipurile de celule progenitoare ale intestinului în cursul dezvoltării. (Sell 2004b)

2.2 Originea celulelor stem specifice ţesutului

Numeroşi cercetători au încercat să explice originea şi să găsească drumul evolutiv al


acestor celule, încercând să îl integreze evoluţiei ontogenetice a organismului uman.
Este ironic şi chiar paradoxal faptul că, deşi se încearcă sistematizarea evoluţiei acestor
celule începând de la zigot şi până la organismul adult, prezenţa acestora la nivelul embrionului
nu este demonstrată decât după momentul începerii organogenezei. În acest sens, celulele stem
embrionare (ESC) provenite din masa celulară internă a blastocistului (care in vitro, în cultură, se
pot multiplica nelimitat), cu greu pot fi considerate celule stem sursă a celorlalte tipuri de celule
stem din organismul adult, întrucât ele nu sunt destinate, în cursul ontogenezei, multiplicării
nelimitate şi producerii de celule stem în organismul adult, ci diferenţierii şi formării celor trei
straturi embrionare. Practic ele nu sunt celule stem, deoarece fiziologic ele sunt destinate
diferenţierii. Astfel, termenul de celulă stem embrionară denumeşte o populaţie de celule in vitro
şi nu in vivo.
Un exemplu care susţine teoria lipsei celulelor stem bona fides la nivelul embrionului
înainte de organogeneză, este cel al celulelor stem hematopoietice murine. Acestea sunt celule
stem bona fides care apar la vârsta gestaţională de 10 zile (Orkin 2008).
Se consideră, că celulele embrionului sunt celule progenitoare (celule cu evoluţie
tranzitorie, lipsite de self-renewal, menite a produce unul sau mai multe tipuri de celule
diferenţiate). În această clasă se poate include grupul celulelor stem embrionare şi celulele TAC
(tranzit-amplifying cells) (Slack 2008). Distincţia între celulele stem şi celulele progenitoare se
face pe baza duratei de viaţă şi perioadei de multiplicare (self-renewal).
Întrucât embrionul este lipsit de celule stem, originea celulelor stem ale organismului
adult a fost transpusă peste procesul de organogeneză, încercând să explice astfel prezenţa
celulelor stem în fiecare ţesut matur.
Modelul „dezvoltării ierarhizate” (Fig. 2.4) (Slack 2008), ce explică evoluţia diferitelor
ţesuturi în cursul ontogenezei, poate fi aplicabil şi celulelor stem din structura ţesuturilor
respective. În cadrul acestui model, dezvoltarea unui ţesut matur are la bază evoluţia ordonată
dictată de anumiţi factori de transcripţie, trecând prin mai mulţi paşi predefiniţi. Fiecare pas este

  17 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 2]                                                                                                                        Originea celulelor stem 

controlat prin intermediul concentraţiei unor factori inductori. Rolul acestora este extrem de
important, deoarece concentraţia lor reglează anumite gene responsabile de alegerea unei
anumite căi (selecţie a căii de dezvoltare), în contextul în care fiecare pas ierarhizat propune mai
multe variante de evoluţie (Slack 2008). Repetarea ordonată a acestui proces promovează
evoluţia organismului complex începând de la stadiul de zigot.
Nu trebuie uitat faptul că originea anumitor organe (implicit a celulelor din structura lor,
incluzând şi celulele stem) se găseşte în mai mulţi muguri embrionari proveniţi din straturi
embrionare diferite. În consecinţă, trebuie ţinut cont de prezenţa mai multor căi în originea
celulelor stem ale unui ţesut adult. Un astfel de exemplu este pancreasul (Zaret 2008) şi
adenohipofiza (Gleiberman 2008).

Fig. 2.4. Modelul


„dezvoltării
ierarhizate”.
(Slack 2008)
Formarea țesuturilor şi
celulelor stem specifice
țesuturilor respective, se
realizează în urma unui
proces decizional plurifac-
torial condiţionat de pre-
zenţa factorilor inductori.
Fiecare etapă este coor-
donată de un anumit
factor sau complex de
factori ce conduce
procesul de diferenţiere
pe o anumită cale.

Slack (2008), consideră apariţia celulelor stem adulte ca o ultimă decizie de dezvoltare şi
evoluţie ierarhizată a unui ţesut. În acest fel celulele stem specifice ţesuturilor, se vor găsi într-o
stare de evoluţie similară ţesutului embrionar de provenienţă. Un rol în menţinerea potenţialului
stem al acestor celule îl are şi interacţiunea cu celulele înconjurătoare ce formează nişa celulelor
stem (Fig. 2.5).
Deşi acest model este doar teoretic, nefiind demonstrat practic, nu este contestat.
Confirmarea sau infirmarea sa necesită compararea unor mostre transcripţionale ale ţesuturilor
embrionare originare pure şi ale profilelor unor populaţii de celule stem adulte pure specifice
ţesutului.
Rolul factorilor de transcripţie în cadrul evoluţiei anumitor organe şi menţinerii celulelor
stem specifice lor este subliniat de rezultatele câtorva studii, constituind un prim pas în
susţinerea acestei teorii (Tab. 2.1).
Deşi momentan, acest model este fezabil şi nu este infirmat, vor fi necesare numeroase
date care să îl desluşească şi să îl confirme. Astfel, principalul factor trenant este reprezentat de
greutatea obţinerii unor profile transcripţionale pure ale ţesuturilor embrionare şi ale celulelor
stem precum şi elaborarea unor metode de marcare a celulelor embrionare şi identificare
ulterioară. Acest ultim neajuns poate fi îndepărtat prin utilizarea metodei CreEr-lox (Fig. 2.6)
(Joyner 2006).

  18 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 2]                                                                                                                        Originea celulelor stem 

Fig. 2.5. Apariția celulelor


stem în țesuturile adulte.
(Slack 2008)
Apariția celulelor stem este
condiționată de interacțiunea cu
nişa stem. Semnalele provenite
din aceasta, mențin celule
stem, în timp ce restul celulelor
se diferențiază. Marcarea unei
celule stem ar putea pune în
evidenţă toate celulele
provenite din aceasta. 

Fig. 2.6. Metoda CreEr-lox


(şoarece). (Slack 2008)
Utilizează un genom transgenic
murin ce conține o genă ce
produce recombinaza ADN
hormon-dependenta (CreER)
condiționată de un promotor
tisular specific (TSP) şi o genă
reporter activată de către
CreEr.
În prezenţa tamoxifenului
administrat şoarecelui, CreEr
devine activă şi activează gena
reporter prin excizia
segmentului inter-loxP (STOP)
din structura ei. Proteina
reporter marchează astfel
celulele descendente ce au
promotorul specific activ la
momentul administrării
tamoxifenului.

  19 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 2]                                                                                                                        Originea celulelor stem 

Tab. 2.1. Factori de transcripţie implicaţi în evoluţia şi menţinerea celulelor stem.


Factor Rol Autor
Sox2 Determină proprietăţile epiteliului neural embrionar şi ale celulelor stem neuronale Graham 2003
Episkopou
2005
Runx 1 Formarea ţesutului hematopoietic în aorta dorsală şi menţinerea celulelor stem North 2004
hematopoietice adulte
Cdx2 Menţinerea celulelor stem intestinale la adult Silberg 2000
p63 Controlează epiteliile scuamoase şi celule stem kerationcitare Koster 2004
Pellegrini
2001
Sox9 Formarea foliculilor piloşi embrionari şi menţinerea celulelor stem Nowak 2008
de la nivelul foliculilor piloşi
după Slack 2008

Deşi metoda CreEr-lox poate oferi anumite răspunsuri, ea este dependentă de


specificitatea şi fidelitatea promotorului tisular, astfel încât s-ar putea să prezinte neajunsuri ce
vor promova apariţia unor noi tehnici utile în descifrarea originii celulelor stem (Slack 2008).
Nu trebuie uitat faptul că anumite ţesuturi pot să nu prezinte o populaţie stem rezidentă,
deoarece pentru anumite tipuri precum ţesutul conjunctiv, inima şi anumite glande s-a
demonstrat că au o rată de self-renewal foarte scăzută ce sugerează acest lucru (Slack 2008).
Alături de teoria „dezvoltării ierarhizate”, acceptată de cercetătorii ce utilizează celule
stem embrionare şi celule stem adulte, mai există o altă teorie, propusă de Zipori, ce postulează
existenţa unei sau unor populaţii de celule stem circulate cu sursă în măduva osoasă, ce
populează ţesuturile şi se diferenţiază în consecinţă. Aceasta din urmă, cataloghează ca celulă
stem, celula cu o plasticitate crescută, şi nu ţine cont de self-renewal (Slack 2008). Niciuna din
cele două teorii nu beneficiază de o dovadă clară care să o anuleze pe cealaltă.
O altă întrebare importantă pentru domeniul celulelor stem este aceea reprezentată de
însăşi existenţa in vivo a acestora. Reprezentativ în acest sens este grupul celulelor pluripotente
adulte (Tab. 2.2). Un grup de celule potenţial stem, pluripotente, izolate din numeroase ţesuturi
postnatale (vezi tabelul), cu potenţial de diferenţiere la fel de mare ca al celulelor stem
embrionare şi mult mai mare ca al celulelor stem specifice ţesuturilor (Slack 2008).
Deşi unele tipuri de celule nu au putut fi reproduse şi de către alte laboratoare, fiind un
grup celular atât de mare, izolat din ţesuturi postnatale, orientează asupra potenţialului extins al
celulelor stem din ţesuturile adulte. Niciunul din aceste tipuri celulare nu a fost identificat in
vivo, ci numai în culturi. Acest fapt pune întrebări asupra existenţei lor in vivo şi a originii. Se
speculează că un precursor al acestor celule sunt pericitele vasculare (Slack 2008).

Tab.2.2. Grupul celulelor pluripotente adulte.


Tip celule stem Observaşii
Celule mezenchimale progenitoare Izolate din populaşia MSC murină şi umană.
adulte (MAPC) Se pot diferenşia în numeroase tipuri celule.
Celule adulte izolate din MO multiliniar Izolate din (MO).
inductibile (MIAMI) Pot produce neuroni, celule pancreatice şi derivaşi mezenchimali.
Celule stem pluripotente (PSC) Izolate din numeroase şesuturi murine.
Se pot diferenşia în celule musculare, ţesut adipos şi neuroni.
Celule stem tissue-commited (TCSC) Izolate din MO murină şi umană.
Par a fi derivate dintr-o populaţie de celule stem pluripotente,
capabilă de a forma numeroase tipuri de celule diferenţiate.
Celule stem mezenchimale (MSC) Vezi capitolul V

Celule stem mezenchimale din ţesutul Pot forma neuroni, cardiomiocite, hepatocite, celule pancreatice.
adipos
Precursori derivaţi din piele (SKP) Izolaţi din derma umană şi murină.
Se pot diferenţia în neuroni, celule gliale, muşchi neted, adipocite.

  20 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 2]                                                                                                                        Originea celulelor stem 

Se pune întrebarea, dacă celulele stem, adulte sau embrionare, există in vivo sau sunt doar
o transformare spontană în cultură a anumitor precursori, similară obţinerii celulelor stem
pluripotente induse, ce se petrece stocastic. Totuşi observaţia că anumite celule, precum SKP şi
MSC, sunt izolate cu o frecvenţă crescută şi relativ simplu, sugerează existenţa unor echivalenţi
in vivo (Slack 2008).
Idea fenomenului stocastic, orientează originea celulelor pluripotente adulte către
populaţia celulară a crestei neurale, întrucât în această populaţie evenimentele diferenţierii au loc
după un model stocastic. Mai multe echipe au izolat „celule stem” similare celor din creasta
neurală, din ţesuturi precum: nervul sciatic fetal, intestin adult, inima şi piele. Aceste celule
neurale se pot diferenţia în numeroase tipuri de celule, urmând modelul „dezvoltării ierarhizate”.
În cursul acestor fenomene se poate observa probabilitatea stocastica a evenimentelor (Slack
2008).
Pentru două tipuri de celule, SKP şi MSC din MO, există rezultate asupra originii lor în
celulele crestei neurale. Identificarea marker-ilor Wnt1-Cre (pentru SKP) şi Sox1-Cre şi P0-Cre
(pentru MSC) sugerează originea lor neurală. (Slack 2008)
O altă variantă postulează existenţa unor resturi embrionare responsabile de existenţa
acestor celule, având la bază existenţa numeroaselor resturi embrionare la nivelul organismului
postnatal (uraca, notocordul, punga lui Ratkhe, canalul tireoglos etc.). Astfel, existenţa unor
grupuri de celule provenite din epiblast, care şi-au menţinut starea embrionară, nu poate fi
abandonată. Incidenţa cu care aceste celule sunt identificate, mai frecvent în organismele tinere,
susţine parţial originea lor în resturile embrionare. Totuşi, observaţia conform căreia tumorile cu
caracter embrionar apar preponderent pe traseul de migrare al celulelor primordiale germinale şi
nu oriunde în corp, contestă aspectul originii în resturile embrionare, cu toate că există anumite
tumori cu celule embrionare (pineale şi neurohipofizare) care apar fără a fi localizate pe traseul
de migrare al celulelor primordiale germinale. (Slack 2008)
În concluzie, originea celulelor stem specifice ţesuturilor adulte se consideră a fi la
nivelul precursorilor embrionari ai ţesutului rezultaţi în urma procesului de „dezvoltare
ierarhizată” sub influenţa factorilor transcripţionali controlaţi de către factorii inductori (Slack
2008).

  21 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 3]                                                                                                                     Clasificare celulelor stem 

3 CLASIFICAREA CELULELOR STEM

„Science is the systematic classification of experience.”


George Henry Lewes

În cursul evoluţiei sale organismul uman interacţionează cu trei tipuri majore de celule
stem: embrionare (ESC), germinale şi somatice (adulte), ultimele două găsindu-se în produsul
final ontogenetic, iar cele dintâi fiind prezente numai pentru o scurtă perioadă.
Celulele embrionare reprezintă precursorul tuturor celulelor din organele adulte, acest
lucru născând ipoteza că tot ele reprezintă şi originea celulelor stem germinale şi somatice. Cele
două categorii de celule stem întâlnite la adult (germinale şi somatice) au roluri diferite. Celulele
germinale se găsesc la nivelul gonadelor producând ovulele şi spermatozoizii, în timp ce celulele
somatice sunt responsabile de regenerarea tisulară.
Deşi celulele stem embrionare sunt considerate prototipul celulelor stem, nu acestea
reprezintă celula stem primordială (ultimate stem cell), ci ovulul fecundat – zigotul. Acesta, prin
intermediu ESC (celule totipotente), în cadrul procesului de determinare (Fig. 3.1) formează
organismul uman.

Fig. 3.1. Evoluția celulelor stem în ţesuturi şi regenerarea tisulară. (Sell 2004a)
Celulele stem reprezintă o mică proporție din celulele unui țesut, şi nu proliferează. Spre deosebire de
un copac ale cărui frunze cad ciclic, reînnoirea unui țesut se realizează continuu.

Spre deosebire de celulele embrionare, care sunt totipotente, cele întâlnite la adult sunt
restricţionate la un nivel inferior al potenţialului de diferenţiere. Totuşi, tumorile pornite de la
celulele germinale (carcinoame embrionare) au arătat că acestea pot forma ţesuturi variate,
inclusiv placentă, ceea ce le plasează ca potenţial de diferenţiere în apropierea ovulului fecundat,
înaintea celulelor stem embrionare (care nu pot produce elemente trofoblastice).
Cu toate că prezenţa celulelor stem în ţesuturile adulte a fost dovedită, numărul acestora
este scăzut, fiind considerate celule de rezervă pentru regenerarea tisulară. Rolul primar în
regenerarea tisulară este îndeplinit de TAC /celulele progenitoare, celule multipotente cu rol în

  22 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 3]                                                                                                                     Clasificare celulelor stem 

regenerarea unui organ (se pot diferenţia în celule prezente în organul gazdă), diferite de celule
stem (provin din celulele stem).
În funcţie de vârsta ţesutului de origine, celulele stem, se pot clasifica în celule stem
somatice şi celule stem embrionare. O a treia categorie, recent descoperită, este reprezentată de
celulele stem pluripotente induse (Tab. 3.1).

Tab. 3.1. Clasificarea celulelor stem.


Celule stem somatice Origine Potenţă
(adulte, mature)
- izolate în anii ‘60 - izolate din ţesuturi mature, cordon - multipotente (pot produce un
ombilical, placentă, MO, ţesut adipos număr limitat de celule specializate)
etc.

Avantaje - răspuns imun neglijabil – pacientul foloseşte propriile celule


- parţial specializate – necesită mai puţini paşi pentru a le specializa

Dezavantaje - longevitate în cultura limitată


- disponibilitate scăzută (greu de izolat din ţesuturi)
- densitatea lor în ţesut este invers proporţională cu vârsta donatorului
- multipotenţa – nu pot produce orice tip de celule
- calitate genetică – pot conţine anomalii genetice

Celule stem embrionare Origine Potenţă


(timpurii, blastocitare)
- izolate în 1998 (Universitatea - blastocistul cu vârstă de 4-5 zile - pluripotente (pot produce toate
Wisconsin) celulele organismului uman, cu
excepţia celulelor din placentă)

Avantaje - longevitate în cultură nelimitată


- uşor de izolat
- pluripotenţă – foarte flexibile
- disponibilitate crescută
- barieră imunologică poate fi depăşită prin transfer nuclear

Dezavantaje - imunologice – dacă blastocistul provine din fecundare în vitro


- dificil de controlat – necesită mulţi paşi până la diferenţiere

Celulele stem Origine Potenţă


pluripotente induse
- create în anul 2006 de către - orice celulă matură diferenţiată - pluripotente similare ESC
Takahashi şi Yamanaka la - obţinute prin manipulare in vitro din
Universitatea Kyoto celule diferenţiate, cărora li se
activează funcţia de self-renewal
Avantaje - pot reprezenta un rezervor de celule cu aplicaţii clinice

Dezavantaje - probleme imunologice şi de siguranţă datorită utilizării virusurilor pentru


obţinerea lor

Celule stem se pot clasifica şi după gradul de plasticitate, putând avea un potenţial ce
variază de la uni la totipotent (vezi capitolul IV).

3.1 Celulele stem somatice/adulte (SSC)/(ASC)

Sunt un grup de celule nediferenţiate (Fig. 3.2), nespecializate, clasic multipotente ce se


găsesc cantonate în ţesuturi mature, diferenţiate, specializate, parte componentă a sistemului de

  23 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 3]                                                                                                                     Clasificare celulelor stem 

reînnoire/reparare ţesut/celulă. Numărul acestor celule este destul de restrâns în ţesuturile adulte.
Teoretic, ele formează un compartiment special în cadrul fiecărui ţesut, unde rămân într-o stare
latentă până în momentul activării lor de către o afecţiune sau nevoie intrinsecă de celule. Acest
compartiment poartă numele de „nişa celulelor stem”. Cu toate acestea, originea lor în ţesuturile
adulte este necunoscută.

Fig. 3.2. Celulele stem somatice din MO.

La nivelul ţesuturilor adulte, rolul lor în reparare şi regenerare (Fig. 3.3) se realizează
prin intermediul celulelor progenitoare/TAC (fiice diferenţiate superior provenite din celulele
stem ale ţesutului respectiv) (Sell 2004b). Acest tip de celule furnizează ţesutului celule
progenitoare mitotic competente ce produc fiice diferenţiate terminal, ce susţin funcţia organului
respectiv. Ulterior acestea nu se mai pot diferenţia şi mor (Sell 1994).
Deşi acest proces este unidirecţional, cel puţin in vivo, studii experimentale au arătat că
acest lucru nu este adevărat. Astfel, celulele progenitoare pot fi capabile de transdiferenţiere sau
dediferenţiere. Un exemplu în acest sens este furnizat de către măduva osoasă care conţine celule
capabile de transdiferenţiere (Wulf 2001).
Multipotenţa clasică a SSC se traduce prin posibilitatea acestora de a produce o gamă
largă de celule specializate, înrudite/asociate cu ţesutul de provenienţă al SSC (ex. celulele stem
hematopoietice generează întregul grup de celule sangvine; celulele stem mesenchimale pot
produce adipocite, condrocite, endoteliu vascular) (Tab. 3.2).
Studii recente au dovedit că acest tip de celule este mult mai flexibil decât a fost
confirmat până acum cu toate că au fost creditate cu un potenţial de self-renewal redus datorită
unor nivele scăzute ale telomerazei (Verfaillie 2002). Astfel, puse într-o nouă lumină, aceste
celule par a fi pluripotente.
O proprietate importantă a acestor celule este plasticitatea, dar mai ales transdiferenţierea
(Tab. 3.3). Numeroasele date ce descriu această posibilitate, oferă o noua imagine asupra
utilizării SSC (Gruh 2009). Prin acest fenomen, ele se pot diferenţia în celule total diferite faţă de
celulele ţesutului de provenienţă, atunci când sunt condiţionate de factorii de transcripţie potriviţi
(Barzilay 2009). De exemplu, celulele stem hematopoietice se pot transforma în cardiomiocite,
celule stem hepatice pot produce celule secretoare de insulină etc.
Până la acest moment SSC au fost identificate în ţesuturi precum măduva osoasă, sânge,
cornee, retină, pulpă dentară, ficat, piele, pancreas şi tub digestiv.
Ca o observaţie generală, utilă în identificarea ţesuturilor ce cuprind în componenta lor
SSC, trebuie ţinut cont de rata de turnover specifică ţesutului respectiv. Cu cât turnover-ul este
mai ridicat, cu atât mai mari sunt şansele ca acel ţesut să conţină celule stem cu un potenţial cât

  24 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 3]                                                                                                                     Clasificare celulelor stem 

mai diversificat, deoarece rata de regenerare a ţesutului trebuie să fie egală cu cea de dispariţie a
celulelor, pentru menţinerea unui echilibru funcţional (Sell 2004b) (Tab. 3.4).

Fig. 3.3. Modelul regenerării tisulare, bazat pe celule stem. (Sell 2004b)

Tab. 3.2. Exemple de celule stem adulte.


Tip celula stem adultă Cale de diferenţiere
Celule stem hematopoietice Eritrocite, limfocite, celule NK, neutrofile, bazofile, monocite, macrofage, plachete
Celule stem mesenchimale Osteocite, condrocite, adipocite, celule specifice ţesutului conjunctiv
Celule stem neurale Neuroni, astrocite, oligodendrocite
Celule stem epiteliale Celule Paneth, celule enteroendocrine, epiteliu de absorbţie
Celule stem tegumentare Keratinocite, epiderma, celule foliculare

Tab. 3.3. Transdiferenţierea SSC.


Tip celula stem adultă Cale de diferenţiere
Celule stem Neuroni, astrocite, oligodendrocite, cardiomiocite
hematopoietice
Celule stem mesenchimale Cardiomiocite, miocite striate, neuroni (Montzka 2009)
Celule stem neurale Celule sangvine, miocite striate, miocite netede peniene
(Song 2009)

Tab. 3.4. Potenţialul celulelor progenitoare adulte in functie de rata turnover-ului.


Organ Timpul de turnover Potenţial
Maduva osoasa 1-2 zile Multi/pluripotent
Mucoasa tractului GI 2-4 zile Cvadripotent
Piele 14 zile Bipotent
Ficat 365-730 zile Bipotent
Creier Nu se divid Unipotent
după Sell 2004b

În ceea ce priveşte biologia acestor celule, nu trebuie neglijat faptul că aceste celule au un
ciclu celular lent in vivo, motiv pentru care se găsesc într-un număr scăzut în ţesuturi, astfel încât
încercarea de multiplicare in vitro poate fi împotriva naturii lor. În plus, aceste celule nu au
marker-i specifici, aceştia fiind exprimaţi contextual, sub influenţa condiţiilor de cultură; condiţii
care diminueză şi potenţialul de diferenţiere. Aceste observaţii, sugerează caracterul subiectiv al
studiului lor in vitro, care nu reproduce decât într-o foarte mică măsură condiţiile in vivo, posibil
generator al unor rezultate nespecifice. (da Silva 2008)

  25 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 3]                                                                                                                     Clasificare celulelor stem 

3.2 Celulele stem embrionare (ESC)

Reprezintă punctul de referinţă în domeniul celulelor stem. Pentru prima dată, au fost
izolate de către Cole şi Edwards (1966) din blastocişti de iepure, reuşind la acea vreme şi primele
încercări de diferenţiere în insule sangvine, muşchi, ţesut conjunctiv, neuroni şi macrofage (Cole
1966). Un pas important în acest domeniu a fost realizat în 1968, când Gardner a obţinut primele
himere de şoarece utilizând ESC (Gardner 1968).
Deşi au o istorie relativ lungă, ESC au putut fi cultivate şi expansionate nelimitat în
condiţii standardizate începând cu anul 1981, utilizând embrioni murini (M. J. Evans 1981, Cole
1966).
Izolarea celulelor stem embrionare umane a fost realizată abia în 1998 de către Dr. James
Thomson la Universitatea din Wisconsin, USA. În anii ’90 au fost făcuţi primii paşi către
izolarea de ESC umane, prin punerea la punct a protocoalelor de izolare pentru două specii
primate: maimuţa Rhesus (Thomson 1995) şi Callithrix Jacchus (Thomson 1996). Această
realizare a facilitat dezvoltarea unor protocoale şi medii de cultură apte să susţină dezvoltarea
ESC umane. Această realizare are la bază rezultatele lui Steptoe şi Edwards (1980) care au
realizat recoltarea de ovule umane şi fertilizarea lor in vitro punând astfel bazele tratamentelor de
fertilizare in vitro (IVF).
ESC sunt considerate a fi celule stem pluripotente. Ele pot da naştere unor tipuri de
celule specifice fiecărui ţesut ce îşi are originea într-unul din cele trei straturi embrionare, chiar
dacă au fost cultivate o lungă perioadă de timp (Tab. 3.5).

Tab. 3.5. Ţesuturi specifice celor trei straturi embrionare.


Ectoderm Mezoderm Endoderm
neuroni (creier, măduva spinării) miocite tub digestiv
celule senzoriale (retină, ureche internă, celule sangvine plămâni
nas,cavitatea bucală) vase de sânge ficat, pancreas
celule pigmentare celule specifice ţesutului conjunctiv amigdale
epidermă miocardocite

Sursa ESC umane este pre-embrionul în vârstă de 4-5 zile. La această vârstă el se găseşte
în stadiul de blastocist, compus din trei elemente: trofoblast, blastocel şi masa celulară internă, şi
are un diametru de 0.1-0.2 mm şi aproximativ 50-100 de celule în masa internă.
Pentru obţinerea ESC (Fig. 3.4), celulele masei interne sunt aspirate din blastocist şi
cultivate în laborator după tehnici speciale. Tehnica de cultură este extrem de importantă pentru
ESC. Astfel, timpul de cca 18 ani de la izolarea ESC murine şi până la izolarea primelor ESC
umane, a fost folosit pentru punerea la punct a unor metode de cultură adecvate.
În acest moment, blastocişti destinaţi recoltării de ESC umane provin prin donaţie
consimţită, din partea cuplurilor sterile ce apelează la fertilizarea in vitro. Se apreciază existenta
unui număr de 400.000 de blastocişti crioprezervaţi, existenţi la nivelul anului 2003 în USA,
rămaşi neutilizaţi în urma procesului de IVF (Hoffman 2003).

Fig. 3.4. Schiţa obţinerii


ESC din pre-embrionul
uman.

  26 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 3]                                                                                                                     Clasificare celulelor stem 

Utilizarea pre-embrionilor umani, pentru obţinerea de ESC umane pune numeroase


probleme de ordin etic şi moral. O posibilă soluţie la această problemă poate fi folosirea pre-
embrionilor rezultaţi în urma procedeului de Transfer Nuclear Somatic (TNS) (clonare). Tehnica
constă în înlocuirea materialului genetic (doar nucleul) al unui ovul cu nucleul extras dintr-o
celulă somatică (ex. celulă epitelială). Ulterior noul ovul este condiţionat electric şi/sau chimic,
astfel încât începe să se comporte ca un ovul fecundat (zigot), în lipsa spermatozoidului, dând
naştere unui blastocist cu informaţie genetică identică cu aceea provenită din celula donor (celula
epitelială). Prin această metodă se pot depăşi şi barierele imunologice legate de uzul embrionilor
rezultaţi prin IVF.
Primele observaţii asupra utilizării ESC în clinică, i-au aparţinut lui Hollands (1987) care
a observat regenerarea măduvei osoase la şoareci iradiaţi letal, după administrarea de ESC.
Ulterior, alte date experimentale privind diferenţierea ESC în epiteliu intestinal, cartilaj,
os, muşchi, neuroni etc (Thomson 1998), au întrezărit noi aplicaţii ale ESC. La acestea se adăugă
posibilitatea de a fi cultivate in vitro, de a produce linii de celule stem embrionare (Schuldiner
2000), cât şi posibilitatea de a putea fi diferenţiate în orice tip de celulă (Pittenger 1999).
Fiind sursa diferenţierii în orice celulă din organism, ESC sunt obiectul de studiu ideal
atât în plan experimental cât şi clinic. O primă utilizare poate fi în domeniul toxicologiei servind
la testarea toxicităţii medicamentelor la nivelul diverselor organe, înainte de a începe trial-urile
clinice (Bremer 2004) (Rolletschek 2004).
Datorită marelui potenţial pe care îl au ESC, cea mai intensă utilizare a lor poate fi în
domeniul transplantologiei. Numeroase boli degenerative pot fi vindecate prin aportul de noi
celule care să susţină funcţia organelor afectate. Astfel, este cazul diabetului zaharat de tip II, al
bolii Parkinson, unde deficitul celulelor producătoare de insulină şi al neuronilor dopaminergici
poate fi suplinit prin injectarea de noi celule funcţionale.

SSC vs. ESC, în clinică

Proprietăţile celor două tipuri de celule stem, fac ca utilizarea lor în clinică să fie încă
limitată.
Întrucât ESC dau naştere celulelor germinale, aceste produc ovule şi spermatozoizi, care
la rândul lor generează un zigot (ou fertilizat), se poate trage concluzia că oricare din aceste
celule cu caracter diploid, în timpul acestui ciclu, pot fi folosite pentru obţinerea de celule adulte
(Sell 2004b).
ESC, pluripotente, oferă o posibilitate terapeutică ridicată. Însă utilizarea lor este dificilă.
Momentan încă nu sunt cunoscute toate căile biochimice implicate în diferenţierea lor,
diferenţiere care necesită numeroşi paşi. În tot acest timp ESC sunt expuse numeroaselor
interacţiuni fizice şi chimice ce pot duce la modificări genetice cu răsunet asupra celulelor fiice.
Rejetul lor, este o posibilitate probabilă, ce îngreunează translaţia lor în clinică. În cele din urmă,
originea acestor celule, embrionul uman, pune probleme de ordin etic şi moral.
O altă dificultate îşi are originea în însăşi evoluţia acestor celule, care este destul de
lungă până la obţinerea unor celule diferenţiate, combinată cu o eficienţă scăzută. O posibilă
soluţie la această problemă este reprezentată de utilizarea unor celule stem adulte (precursoare)
sau de diferenţierea indusă controlată a ESC. Însă pentru aceasta, cultivarea ESC necesită
condiţii speciale, care la acest moment nu sunt cunoscute in totalitate.
Deşi recent s-a descoperit că multipotenţa SSC este relativă, utilizarea SSC în clinică nu
este mai aproape decât a ESC. Celulele stem adulte, în condiţiile potrivite se pot comporta
asemenea celulelor pluripotente, însă nu a fost izolată încă SSC care să producă toate celulele
specifice celor 3 straturi embrionare. Un alt impediment este reprezentat de raritatea acestor
celule în ţesuturile adulte, ceea ce le face dificil de izolat. Şi SSC sunt predispuse la afectări
genetice. Faptul că ele sunt înaintate pe scara diferenţierii, şi au trecut prin mai multe stadii, le
face susceptibile pentru achiziţia de malformaţii genetice în urma expunerii la soare, toxinelor,
erorilor de transcripţie şi replicare.

  27 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 3]                                                                                                                     Clasificare celulelor stem 

3.3 Celulele embrionare germinale (EGC)

Deşi reprezintă o categorie de celule embrionare cu capabilităţi stem asemănătoare ESC,


EGC nu sunt foarte popularizate în ceea ce priveşte aplicaţiile lor clinice şi/sau experimentale.
EGC au fost izolate din celulele germinale primordiale ale crestei gonadale şi din
mezenchimul fetal uman în vârstă de 8-9 săptămâni (Shamblott 1998) şi sunt capabile ca şi ESC
de self-renewal pe termen lung cu conservarea unui cariotip normal.
Cu toate că au un potenţial proliferativ în cultură de cca 5 ori mai mic decât ESC, EGC se
pot diferenţia asemeni ESC în celule aparţinând celor trei straturi embrionare. Avantajul suprem
faţă de ESC îl constituie faptul că EGC nu formează teratoame in vivo (Shamblott 1998), astfel
încât utilizarea lor cu spectru smiliar ESC se poate dovedi mai sigură.

3.4 Celulele stem pluripotente induse (IPSC)

Reprezintă o achiziţie recentă în familia celulelor stem. Primul pas a fost făcut în 2006 de
către Takahashi şi Yamanaka la Universitatea Kyoto, care utilizând celule murine obţinute prin
inginerie genetică, au demonstrat că prezintă asemănări importante cu ESC (Takahashi 2006 ). În
anul 2007, două grupuri au publicat că aceste celule, în urma introducerii într-un embrion murin
obişnuit pot produce toate ţesuturile şoarecilor rezultaţi, inclusiv gameţi, o trăsătură denumită
germline transmission (Okita 2007) (Maherali 2007). În anul 2007, un grup de cercetători au
descoperit condiţiile optime necesare pentru a transforma celulele adulte somatice umane,
specializate, în celule cu potenţial stem. Procedeul are la bază aplicaţiile reprogramării genetice.
Astfel, celulele specializate (mature, diferenţiate) sunt condiţionate forţat să exprime factori şi
gene embryonic stem cell like (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) introduse cu ajutorul lentivirusurilor
(Kang 2009), conferind unei celule specializate caracterul stem pluripotent. Deşi aceste celule
îndeplinesc condiţiile definitorii pentru celulele stem pluripotente (marker-i specifici, producerea
de celule specifice celor 3 straturi embrionare), momentan nu se ştie dacă, clinic există diferenţe
între cele două tipuri de celule.
Pentru caracterizarea IPSC, oamenii de ştiinţă au preluat un test utilizat pentru
cuantificarea pluripotenţei ESC, numit complementare tetraploidă (CT). Prin acesta, doi pre-
embrioni în stadiul de două celule sunt fuzionaţi electric rezultând o celulă tetraploidă (Tam
2003) ce se poate divide normal, însă rareori poate genera un organism viabil tetraploid.
Utilizând CT, două echipe au reuşit să obţină indivizi murini viabili şi fertili din IPSC (Kang
2009) (Yhao 2009).
Prin acest test, IPSC dovedesc un comportament similar ESC. Acest fapt este confirmat şi
de profilul genic care este similar ESC şi celulelor de provenienţă ale IPSC (Kang 2009).
Până acum, aceste celule s-au dovedit un bun instrument pentru studiul citotoxicităţii
unor medicamente şi realizarea unor modele patogenice. Însă, până la utilizarea lor în
transplantologie este necesar depăşirea barierei impuse de utilizarea vectorilor virali în
producerea lor. În anumite studii animale aceste celule, prin virusul utilizat pentru reprogramarea
lor, au produs cancere.
IPSC reprezintă un model util în studiul bolilor genetice. Deşi au fost produse numeroase
tipuri de IPSC, provenite de la pacienţi cu diferite afecţiuni genetice, nu s-a arătat până acum
dacă evoluţia şi comportamentul acestora este diferit faţă de cel al IPSC provenite de la persoane
sănătoase. Utilizând IPSC provenite de la pacienţi cu disautonomie familială, Lee (2009), a
demonstrat că IPSC afectate de mutaţia genei IKBKAP, cauzatoare a acestei afecţiuni, se
comportă diferit in vitro (exprimă un nivel scăzut al genelor implicate în producerea neuronilor
periferici, produc mai puţini neuroni, celulele precursoare ale crestei neuronale prezintă o
mobilitate scăzută) faţă de cele fără această mutaţie.
Toate acestea vin în sprijinul ipotezei că aceste celule, generând culturi utile în studiul
patogeniei afecţiunilor genetice, sunt un instrument important în producerea unor noi substanţe
menite a corecta deficitele genetice cauzate de anumite mutaţii (Lee 2009).

  28 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 3]                                                                                                                     Clasificare celulelor stem 

Acest tip de celule au capacitat atenţia publicului, oferind şanse de vindecare pentru
tratarea unor boli degenerative şi genetice precum scleroza laterala amiotrofică (Dimos 2008),
siclemia (Hanna 2007), sindromul Shwachman-Bodian-Diamond, boala Gaucher, maladia
Duchenne, distrofie musculară Becker, boala Parkinson, diabet tip 1, sindrom Down (Park 2008).

  29 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 4]                                                                                                                 Plasticitatea celulelor stem 

4 PLASTICITATEA CELULELOR STEM

„Plasticity is a double-edged sword; the more flexible


an organism is the greater the variety of maladaptive,
as well as adaptive, behaviors it can develop.”
Donald Symons

Deşi există mai multe tipuri de celule stem cunoscute, nu toate prezintă aceleaşi
proprietăţi; fiecare tip de celulă stem prezintă o capacitate proprie de a se diferenţia într-un
anume tip de celulă specializată.
Plasticitatea se defineşte ca fiind proprietatea celulelor stem sau a celulelor progenitoare
de a produce celule fiice cu fenotipuri mature variate (Sell 2004a).
Pentru a caracteriza plasticitatea celulelor stem, ca urmare a observării evoluţiei acestora
au fost introduşi o serie de temeni ce ilustrează variaţia procesului de diferenţiere pentru unele
celule (Fig. 4.1).

Fig. 4.1. Căile posibile de generare a celulelor diferențiate în țesuturile adulte.


(Sell 2004a)
1. Din celule stem determinate - în acest model celulele progenitoare intra în procesul de
determinare şi produc celule diferențiate. 2. Celulele stem pleo/pluripotente reţin potenţialul de a da
naştere unor celule progenitoare capabile să producă câteva linii celulare. 3. Transdiferenţierea
celulelor determinate - celulele progenitoare determinate a forma celule specifice unui țesut îşi
schimbă determinare formând celule specifice altui țesut. 4. Dediferențierea - celule mature ce încă
mai păstrează capacitatea de a se divide, se diferențiază retrograd (înapoi) dând naştere la celule
progenitoare capabile a se diferenția în celule diferite faţă de cele din care provin. 5. Fuziunea - este
posibil ca celulele stem dintr-un țesut (e.g. măduva osoasă) să se unească cu alte celule (e.g.
hepatocite) formând celule hibrid cu proprietăți noi diferite de cele ale celulelor din care provin.
Întrucât unele celule sunt capabile de transdiferenţiere, a fost introdus termenul de
pleopotenţă, aplicabil unei celule cu potenţial mai mic decât totipotent dar mai mare decât
multi/pluripotent (e.g. progenitorii epiteliului bronhial pot genera progenitori ai epiteliului

  30 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 4]                                                                                                                 Plasticitatea celulelor stem 

scuamos). Pentru MSC se recomandă folosirea termenului de pleopotente deoarece sunt capabile
de a genera numeroase fenotipuri mature, fără a fi însă totipotente. (Sell 2004a)
Capacitatea de diferenţiere a celulelor stem, a fost caracterizată prin studii ce au vizat
urmărirea comportamentului acestor celule in vivo, in vitro şi după transplantarea lor. În funcţie
de capacitatea de diferenţiere, celulele stem se clasifică astfel (Tab. 4.1):

 celule totipotente (lat. totus = totul): au potenţialul de a genera toate tipurile de celule din
organism sau necesare dezvoltării sale (inclusiv celulele trofoblastului); astfel de celule
sunt considerate a fi celulele zigotului până în momentul transformării sale în blastocist
(de la fecundare până în ziua 4). Sunt cel mai versatil tip de celule.

 celule pluripotente (lat. plures = numeroase): sunt considerate celulele stem care prin
diferenţiere pot produce celule specifice celor 3 straturi embrionare; din această categorie
fac parte celulele stem embrionare (celulele masei interne a blastocistului) care spre
deosebire de celulele totipotente, ele formează întregul organism mai puţin placenta, care
este formată de trofoblast.

 celule multipotente (lat. multi = multe): se pot diferenţia într-un număr limitat de celule
specializate, care sunt asociate cu un anumit organ sau funcţie; astfel de celule sunt
celulele stem hematopoietice, care dau naştere hematiilor, leucocitelor, limfocitelor,
plachetelor. Celulele urmaşe acestora, pe linie evolutivă, se numesc celule progenitoare
(pot produce mai multe tipuri de celule, însa şi-au pierdut capacitatea de self-renewal).

N.B. Termenii multipotent şi pluripotent sunt echivalenţi, definind celule ce pot produce
mai multe fenotipuri. După ghidul din 2000 al NIH (National Institute of Health) se
recomandă ca termenul pluripotent să fie aplicat celulelor capabile de a produce cât mai
multe dintre ţesuturile organismului iar cel de totipotent celulelor cu capacitate
nelimitată. (Sell 2004a)

 celule uni/bi/tri-bipotente: este un termen care face referire în general la anumite


categorii de celule stem adulte, ce se găsesc în ţesuturi diferenţiate, şi care în mod normal
pot produce un număr limitat de celule specializate, asigurând regenerarea ţesutului
respectiv.

Tab. 4.1. Glosar de termeni ce desemnează plasticitatea.


Prex Semnificaţie Exemplu
Toti Tot/toate Celule embrionare
Multi Multe Celule hematopoietice
Pluri Numeroase Celule hematopoietice
Pleo Excesiv/mai multe Celule hematopoietice şi cele din piele

Oligo Câteva Celule stem din tractul GI


Cvadri Patru Celule stem din tractul GI
Tri Trei Epiteliul bronhial
Bi Două Ductele biliare
Uni Unul/Una Prostata/piele
după Sell 2004b, Sell 2004a

  31 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 5]                                                                        Celulele stem mezenchimale: noțiuni introductive 

5 CELULELE STEM MEZENCHIMALE:


NOŢIUNI INTRODUCTIVE

„Adult stem cells are also problematic, as they are


difficult to identify, purify and grow, and simply may
not exist for certain diseased tissues that need to be
replaced.”
Eliot Engel

Celulele stem mezenchimale sunt reprezentantul cel mai notoriu al celulelor stem adulte,
totodată fiind şi cele mai studiate din punctul de vedere al aplicaţiilor clinice, de aşteaptându-se
şi cele mai probabile rezultate terapeutice.
Clasic, MSC nominalizează cu precădere grupul de MSC izolate de la nivelul măduvei
osoase.

5.1 Definiţie

MSC din MO sunt celule stem non-hematopoietice, subgrup al celulelor stem


somatice/adulte (SSC)/(ASC), clasic izolate din stroma MO (dar şi a altor organe), ce formează
in vitro culturi aderente la flask-ul de cultură, cu aspect fibroblastic (CFU-F) capabile a se
diferenţia condiţionat în ţesuturi mezenchimale, ecto şi endodermice.
Termenul MSC denumeşte celule izolate in vitro şi reuneşte mai multe populaţii
eterogene de celule stem izolate din stroma mai multor organe, cărora nu li s-a identificat încă un
corespondent cert in vivo.
Iniţial, criteriile de definire includeau capacitatea de aderenţă, posibilitatea de self-
renewal şi capacitatea de a se diferenţia in vitro în cel puţin un tip de celule mature
mezenchimale. (da Silva 2008)
Odată cu evoluţia cunoştinţelor despre MSC, definiţia acestora se îmbunătăţeşte. Astfel,
Dominici (2006) adaugă şi criterii fenotipice: celule pozitive CD105, CD73 şi CD90, negative
CD45, CD34, CD14/11b, CD79a/CD19 şi HLA-DR, cu potenţial de diferenţiere osteo, condro şi
adipogenică. Aceste trăsături, împreună cu cele de aderare la plastic şi diferenţiere multiliniară,
reprezintă testul standard de caracterizare a MSC propus de Societatea Internaţională pentru
Terapia Celulară (ISCT).

5.2 Nomenclatură

“Celule stem mezenchimale” reprezintă denumirea aplicată curent celulelor aderente la


plastic (referire la materialul plastic din care sunt confecţionate flask-urile de cultură) izolate din
MO, ţesut adipos sau alte ţesuturi şi care prezintă capacitatea de diferenţiere multipotentă in
vitro. (Horwitz 2005) Termenul mezenchimal este utilizat pentru a arăta că se diferenţiază în
celule specifice ţesutului mezenchimal (Chamberlain 2007).
Caplan a fost cel care a utilizat primul termenul de „celulă stem mezenchimală” în anul
1991 (Bianco 2008), preocupându-se de popularizarea termenului în prima jumătate a anilor ’90,
deşi în a doua jumătate a anilor ’80, Maureen Owen a propus (pe baza observaţiilor lui
Friedenstein) termenul de “celule stem stromale” (Owen 1985) (Owen 1988).

  32 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 5]                                                                        Celulele stem mezenchimale: noțiuni introductive 

Glosarul de termeni pentru această noţiune şi acest grup de celule este variat (Tab. 5.1).
În literatura de specialitate se folosesc mai mulţi termeni pentru a denumi celula sau populaţia de
celule cunoscute sub numele de celule stem mezenchimale.

Tab. 5.1. Glosar de termeni.


TERMEN DEFINIŢIE
CFU-F O celula unică proaspăt izolată dintr-un ţesut intact.
Capabila de a genera creştere clonală la densităţi scăzute.
Denumită în funcţie de ţesutul de origine: BM-CFU-F (bone
marrow), AT-CFU-F (adipose tissue).
Bănuite a conţine mai multe subtipuri de celule stem
Celule stromale ale MO (in situ) Celule extravasculare non-hematopoietice, non-endoteliale.
Asociate fizic cu celulele hematopoietice din MO.
Includ celulele reticulare adventiceale, adipocitele medulare,
celulele osteogenice mature şi imature, pericitele.
Furnizează indicii asupra retenţiei, proliferării şi diferenţierii
progenitorilor stem hematopoietici.
Celule stromale ale MO (in vitro) - Linii celulare cultivate, derivate din celulele aderente, non-
BMSC/BM-MSC (bone marrow MSC) hematopoietice, non-endoteliale ale MO.
Pot fi iniţiate de către CFU-F, celule stromale însămânţate la
densităţi non-clonale sau celule sortate fenotipic.
Unele BMSC sunt CFU-F.
Celule stromale mezenchimale multipotente Familie de celule în care MSC reprezintă un subtip.
(MSC) Un sinonim pentru MSC.
Subliniază potenţialul multiliniar.
Nu li se poate aplica denumirea de celule stem din lipsa
probelor de self-renewal in vivo.
Celule stromale multipotente umane derivate Un sinonim pentru MSC.
din MO Subliniază potenţialul multiliniar.
(bone marrow derived hMSC)
Celule stem mezenchimale/ multipotent O celulă progenitoare posibil cantonată în toate ţesuturile de
mesenchymal stromal cells (MSC) natura mezodermică.
Potenţialul de diferenţiere poate fi scheletal sau non-scheletal.
Presupus a exista în MO, ficat, sinovii, ţesut adipos, inima etc.
Se consideră că poate conţine un subtip de celule pluripotente
Frecvent folosită pentru a denumi culturi de celule provenite din
ţesuturile conjunctive.
Celule stem scheletale; Celule progenitoare postanatale multipotente şi capabile de self-
Celule stem stromale; renewal ale ţesuturilor scheletale.
Celule stem osteogenice
Celule stromale (din orice ţesut) Populaţii fibroblastice obţinute în cultură din orice ţesut.
Posibil derivate din stroma/ţesutul conjunctiv al organului de
origine din orice ţesut.
Celule progenitoare adulte multipotente Populaţie de celule aderente izolate din MO adultă la om,
(MAPC) şobolan şi şoarece.
Capacitate de diferenţiere endodermală, mezodermală şi
ectodermală.
Identificate şi în periost, sânge şi ţesutul conjunctiv hepatic.
Diferite de MSC.
după Bianco 2008, Wolfe 2008

Alături de aceşti termeni, mai există un grup derivat din câmpul de activitate în care a fost
realizat studiul ce a vizat aceste celule. Astfel, în hematologie se foloseşte termenul de „unităţi
colonii formatoarea fibroblastice” (CFU-F), primul nume atestat în literatură pentru aceste celule
de către Friedenstein, pentru a denumi celulele cu caracter mezenchimal izolate din măduva
osoasă. Un alt termen din sfera hematologie, ce poate îngloba în el populaţia de MSC din MO,
este cel de „celule stromale” (Dennis 2004). Tot pentru acestea se poate utiliza şi termenul de
BM-MSC (bone marrow mesenchymal stem cells) insistând pe originea lor medulară.
În literatură, toată această mulţime de termeni sinonimi poate crea confuzie pentru cititor.
Se poate observa din figura de mai jos (Fig. 5.1), cum se impune un trend în literatura de

  33 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 5]                                                                        Celulele stem mezenchimale: noțiuni introductive 

specialitate, în ultimii ani împământenindu-se termenul „mesenchymal stem cells” asupra


celorlalţi. Un rol în această schimbare îl are şi Societatea Internaţională pentru Terapie Celulară,
care a optat pentru acest termen, deşi încă nu există o argumentare completă a sa.

Fig. 5.1. Numărul citațiilor PubMed pentru MSC (căutare în toate câmpurile).

Odată cu apariţia studiilor ce deconspiră plasticitatea MSC, au apărut şi primele îndoieli


asupra folosirii corecte a termenului de „celule stem mezenchimale” (Dominici 2006). Cu toate
acestea, terminologia a persistat şi acronimul MSC a devenit ferm inveterat în limbajul ştiinţific.
Primul termen discutat este chiar cel de „celule stem mezenchimale”. Prezenţa termenului
„stem” în această denumire nu este corectă. Caracterul stem al unei celule se dovedeşte prin
proprietatea acesteia de self-renewal şi este o însuşire de bază. Însă în literatura de specialitate,
până la acest moment nu există dovada că in vivo aceste celule se pot divide asimetric (să
producă o fiică ce se va diferenţia şi o alta ce va păstra caracterul iniţial al celulei din care
provine) (Dennis 2004). În plus, în anul 2000, ISCT a concis că nu există suficiente dovezi
pentru a certifica “stemness”-ul acestor celule.
Termenul „mezenchimal” a fost atribuit acestor celule având la bază ipoteza că exceptând
ţesuturile scheletale, aceste celule se pot diferenţia şi în ţesuturi non-scheletale (i.e. muşchi
cardiac, muşchi neted, neuroni etc.) (Caplan 2005). Cu toate acestea termenul nu este în totalitate
indicat deoarece potenţialul non-scheletal al MSC nu a fost demonstrat in vivo, iar originea
diferitelor tipuri de MSC postnatale este diferită de ce a ţesuturilor înrudite ca linie. MSC şi
aceste ţesuturi îşi au originea în cursul organogenezei în celule progenitoare diferite, şi nu într-un
progenitor comun, ţesuturile scheletale având origine diferită unul de celălalt. De exemplu,
ţesutul osos îşi are originea în celule progenitoare neuroectodermale sau în mezodermul lateral şi
axial (Olsen 2000). Deşi neuroectodermul poate genera o populaţie de celule embrionare cu
proprietăţi similare MSC (Takashima 2007), nu acest grup de celule reprezintă originea MSC
postnatale, rămânând a fi soluţionată pe viitor.
Menţinerea cuvântului mezenchimală în denumire este motivată de originea
mezenchimală a acestor celule şi nu de potenţialul de diferenţiere care a arătat că aceste celule
pot forma celule specifice celor trei straturi embrionare. (Horwitz 2005)
Tot la origine face referire şi cuvântul stromal, reprezentând compartimentul specific mai
multor ţesuturi din care s-au izolat MSC (cordon ombilical, ţesut adipos, MO). (Horwitz 2005)
Deşi MSC îndeplinesc criteriile de celulă stem (i.e. self-renewal şi diferenţiere
multiliniară) la nivel populaţional în cultură, nu se poate vorbi de demonstrarea lor la nivel de
celulă unică. (Nauta 2007)
Întrucât eticheta "de celule stem" are implicaţii ştiinţifice, care nu sunt corect aplicate
acestor celule, Comitetul pentru Celule Mezenchimale şi Celule Stem Tisulare al ISCT

  34 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 5]                                                                        Celulele stem mezenchimale: noțiuni introductive 

recomandă clarificarea nomenclaturii acestor celule, cu scopul utilizării unui limbaj unitar
standardizat, corect ştiinţific. (Horwitz 2005)
Astfel a fost propus ca celulele aderente la plastic, denumite în mod curent celule stem
mezenchimale să fie redenumite folosind titulatura de celule stromale mezenchimale
multipotente, iar termenul de celule stem mezenchimale să fie utilizat doar pentru a denumi acea
fracţie de celule din populaţie care prezintă indubitabil caracteristici de celulă stem. Indiferent de
tipul de populaţie pentru care se utilizează, se poate folosi abrevierea MSC însă specificând în
text tipul populaţiei la care se face referire. Folosirea abrevierii MSC se justifică pentru
continuarea discursului ştiinţific în articole ca urmare a intrării în vocabularul cercetătorilor.
(Horwitz 2005)
Cuvântul stem a fost îndepărtat din denumire deoarece face referire la proprietăţi ce nu
sunt caracteristice MSC (i.e. self-renewal pe o perioadă nedeterminată şi potenţial de diferenţiere
multiliniară in vivo). Rezultatele actuale care au arătat anumite caractere de multipotenţialitate nu
sunt suficiente pentru a considera aceste celule ca fiind stem. În plus, populaţia MSC nu este
omogenă, eterogenitatea acesteia fiind exprimată şi prin procentul scăzut de celule izolate care
generează CFU-F. (Horwitz 2005)
Prin analogie cu hematologia, aşa cum nu toată populaţia celulelor CD34+ este
considerată stem, deşi conţine celule stem hematopoietice, nici populaţia celulelor plastic-
aderente nu trebuie considerată ca fiind stem. În plus, deşi rezultatele in vitro indică prezenţa
unei celule mezenchimale potenţial stem, in vivo rezultatele privind supravieţuirea nelimitată şi
diferenţierea multiliniară nu sunt concludente. (Horwitz 2005)
Deşi anumite grupuri ştiinţifice consideră termenii MSC şi celule medulare stromale ca
fiind echivalenţi (Prockop 1997), studii amănunţite au arătat că este vorba despre două populaţii
distincte cu caracteristici specifice. MSC – celule omogene, cu aspect fibroblastic, cu rol
suportiv al hematopoiezei mai scăzut decât al celulelor medulare stromale. Celulele medulare
stromale – sunt mai puţin omogene prezentând simultan caracteristici fibroblastice şi rol suportiv
hematopoietic mai important (Tuan 2003). Având acest background, Tuan (2003) consideră pe
baza existenţei acestor celule în acelaşi spaţiu (MO), că celulele stromale medulare sunt celule
primitiv diferenţiate din MSC.
Cu toate că nu este o denumire completă şi corectă, “celula stem mezenchimală” a
depăşit graniţa MO, pentru care fusese iniţial utilizată ajungând să denumească toate populaţiile
de celule stromale fibroblast-like identificate în ţesuturile conjunctive postnatale (e.g. ţesut
adipos). Ca rezultat al acestei incompatibilităţi unii autori au propus termenul de „celule
mezenchimale progenitoare”.
Deşi conceptul existenţei unei celule stem bona fides la nivelul MO a depăşit proba
timpului, fiind motivat mai ales de rezultatele recente, discuţia asupra denumirii corecte încă
rămâne deschisă.
În elaborarea unui termen corect şi complet trebuie să se ţină cont de funcţia celulei,
metoda de analiză şi evaluare, fenotip şi morfologie. Astfel, în ceea ce priveşte funcţia este de
preferat, până în momentul demonstrării că BMSC se pot diferenţia in vivo în alte ţesuturi non-
scheletale, ca denumirea practicată să fie aceea de „celule stem scheletale” (Bianco 2008).
Sub aspectul metodei de cultură, se recomandă ca termenul CFU-F să fie folosit pentru a
desemna celulele clonogene în cultură; pentru a cuprinde şi originile CFU-F, acest termen poate
fi precedat de prefixul ţesutului din care a fost izolat (e.g. AT – pentru ţesutul adipos – AT-CFU-
F sau BM – pentru măduva osoasă – BM-CFU-F, etc.)
Însă, pentru o simplificare şi o exprimare corectă este de preferat a se utiliza termenul de
„celule adulte mezenchimale progenitoare” sau “celule stromale mezenchimale multipotente”,
pentru a denumi populaţia de celule capabilă a se diferenţia într-o mare varietate de ţesuturi
mezenchimale şi non-mezenchimale.
Utilizarea termenului de celule stromale mezenchimale multipotente este cea mai
corectă ştiinţific fără a face referire la caracteristicile biologice sau terapeutice nedovedite
ştiinţific. (Horwitz 2005)

  35 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 5]                                                                        Celulele stem mezenchimale: noțiuni introductive 

Concluzionând, în literatură se acceptă folosirea următorilor termeni: celule


mezenchimale progenitoare, celule medulare stromale, celule stromale mezenchimale
multipotente, MSC şi CFU-F, ca fiind sinonime şi denumind aceeaşi populaţie de celule cu
caractere mezenchimal (Dennis 2004)
N.B. În lucrarea curentă termenii CFU-F, celule stem mezenchimale, celule stromale ale
MO, celule stromale mezenchimale multipotente, celule adulte mezenchimale progenitoare,
celule stem scheletale sunt considerate sinonime şi toate fac referire la populaţia celulară
aderentă, fibroblast-like din MO sau alte ţesuturi, capabilă de diferenţiere multipotenţială in
vitro.

5.3 Istoric

Prezenţa MSC la nivelul măduvei osoase a fost teoretizată extensiv în a doua jumătate a
secolului al XX-lea, începând cu Owen (1978) (Dennis 2004), care a prezentat conceptul de
celulă stem cu localizare medulară. Doi ani mai târziu, Tiell şi McCulloch, au propus existenţa
unei linii celulare analoage liniei hematopoietice la nivelul MO (Till 1980).
Deşi a doua jumătate a secolului al XX-lea a oferit cea mai mare cantitate de informaţii
referitoare la MSC, ducând la identificarea lor, primele observaţii experimentale ce au dezvăluit
proprietăţile „speciale” ale MO, datează din anul 1869 (Dennis 2004).
Goujon a fost primul care a documentat prezenţa celulelor progenitoare mezenchimale în
MO, demonstrând capacitatea osteogenică a MO în urma transplantului heterotop de MO la
iepure. Rezultatele acestuia au fost confirmate în 1870 de către Biakow (Dennis 2004). Tot în
aceeaşi perioadă, Cohneim a propus existenţa unor fibroblaste medulare implicate în vindecarea
a numeroase ţesuturi periferice (Ohishi 2010).
Începând cu Danis (1960), şi continuând cu Petrakova (1963) şi Friedenstein (1966), o
serie de experimente au reluat teoria osteogenică a MO, demonstrând că MO are capacitatea de a
forma os şi cartilaj, de novo (Dennis 2004).
Cu toate că proprietăţile osteogenice ale fragmentelor de MO fuseseră observate începând
cu 1869 de către Goujon, identificarea propriu-zisă a celulelor responsabile de acest
comportament s-a realizat mult mai târziu, anii 1960-1970, având ca substrat rezultatele lui
Fridenstein care a reuşit identificarea subpopulaţiei celulare osteogenice din MO. În 1976
Friedenstein a descris populaţia celulară clonală, aderentă la flask-ul de cultură, sursă de
diferenţiere osteoblastică, adipogenică şi condrogenică (Friedenstein 1976). Acesta, a lăsat timp
de 4 ore măduva osoasă în placi de cultură. După eliminarea fracţiei lichide, care a îndepărtat
celulele neaderente hematopoietice, a observat că celulele care au aderat sunt eterogene, însă cele
mai aderente au o forma „spindel-shape” formând grupuri de 2-4 celule. După o perioadă de
latenţă de 2-4 zile, acestea se multiplică rapid putându-se diferenţia în colonii cu aspect osos sau
cartilaginos (Chamberlain 2007).
Legătura dintre aceste celule şi compartimentul stromal al MO a fost observată în a doua
jumătate a anilor ’’70 având la bază munca lui Tavassoli, Friedenstein şi Owen. În aceeaşi
perioadă a luat naştere şi conceptul de „nişa a celulelor stem” (Schofield 1978), ce a favorizat
apariţia ideii de asociere şi reglare a comportamentului celulelor stem hematopoietice cu
micromediul celular înconjurător, fapt susţinut de rezultatele obţinute de către Allen (1978),
Dexter (1977) (Bianco 2008).
Cele mai mari eforturi în găsirea grupului de celule răspunzătoare de această proprietatea
a MO, au fost depuse de către Friedenstein. Acesta a reconfirmat proprietăţile osteogenice ale
fragmentelor de măduvă osoasă, prin transplant heterotop (sub capsula renală, la şoareci),
capacitatea de creştere la acel nivel, self-renwal şi de suport hematopoietic. În 1970, a descoperit
capacitatea celulelor stromale medulare de a forma colonii; fiecare celula fiind capabilă a
produce o astfel de colonie, numindu-le CFU-F (colony-forming unit fibroblastic) (Bianco
2008). În 1973, a identificat iniţial celulele din CFU-F, ca fiind cauzatoare ale acestui
comportament al MO. Ulterior (1980) a demonstrat că aceste colonii sunt alcătuite din celule

  36 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 5]                                                                        Celulele stem mezenchimale: noțiuni introductive 

individuale capabile a se diferenţia atât în ţesut osos cât şi în ţesut de susţinere hematopoietic,
identificând astfel cel de al treilea fenotip prezent în MO (Dennis 2004). Rezultatele sale au
permis şi dezvoltarea culturilor de celule hematopoietice. Observaţiile privind rolul celulelor
stromale fibroblast-like aderente în suportul hematopoiezei au permis utilizarea acestora ca
feeder layer pentru culturile de MO.
În 1980, Castro-Malaspina a raportat izolarea de CFU-F din MO umană. (Ohishi 2010)
Ulterior Owen (1985) a propus un model pentru linia stromală a MO (Fig. 5.2) ce
cuprindea mai multe compartimente: al celulelor stem, al celulelor progenitoare şi al celulelor
mature. De asemenea, tot el a realizat şi o schemă de diferenţiere a celulelor stromale pe linie
reticulară, fibroblastică, adipocitară şi osteogenică (Dennis 2004).
Având aceste antecedente, actul de naştere al MSC a fost semnat în anul 1991, când
Caplan a propus existenţa unui grup de celule, la nivelul MO, capabil de a genera mai multe
fenotipuri: adipos, tendon, ligament, muşchi, derm (Caplan 1991).
În ceea ce priveşte multipotenţa acestor celule, ea a fost demonstrată de către mai multe
studii realizate de Friedenstein (1970), Bennet (1991), Dennis (1999) şi Caplan (1997). Aceştia
au identificat în populaţia MSC, celule cu potenţă ce variază de la unipotent până la cvadripotent.
Rezultate similare au fost raportate şi în urma utilizării MO umane (Pittenger 1999).
Cu toate că date elocvente referitoare la existenţa celulelor non-hematopoietice medulare
şi posibila relaţie cu celulele stem hematopoietice (HSC), cât şi la capacitatea osteogenică şi
apartenenţa la compartimentul stromal al MO, au fost documentate de numeroase studii în
antecedente, conceptul ce vizează existenţa unei populaţii celulare non-hematopoietice la nivelul
MO nu a fost utilizat extensiv decât după anul 1999 când Pittenger (reprezentând corporaţia
OSIRIS Therapeutics, Inc.) a publicat rezultate asemănătoare cu ale predecesorilor săi (Bianco
2008).

Fig. 5.2. Modelul liniei stromale medulare al lui Owen. (Dennis 2004)

  37 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 5]                                                                        Celulele stem mezenchimale: noțiuni introductive 

Popularizarea termenului „mesenchymal stem cells (MSC)” a fost realizată tot în aceeaşi
perioadă, dorind să înlocuiască termenii clasici de „celula stromale” sau „celule osteogenice”
(propus de Caplan în 1991) (Bianco 2008).
Răspândirea termenului s-a realizat concomitent cu apariţia în literatură a datelor
referitoare la ESC, beneficiind astfel de ideea că MSC sunt un tip de celule stem postnatale, cu
potenţă şi aplicaţii asemănătoare ESC. Această presupunere s-a regăsit în numeroase studii ce au
arătat potenţialul transgermal (i.e. plasticitate) (Beltrami 2007) (Poulsom 2002) al acestor celule,
fără a fi însă confirmat şi in vivo.

  38 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 6]                                                                                                                         Localizarea/Surse MSC 

6 LOCALIZAREA/SURSE MSC

„We can continue to make significant strides in the


scientific community by exploring new stem cell
research methods that do not include destroying human
embryos.”
John Boehner

Ţesuturile postnatale posedă rezervoare specifice ce conţin celule stem: celulele stem
epiteliale din epidermă şi criptele intestinale (Slack 2000), celulele stem din SNC (McKay 1997),
celulele satelite din muşchi (Charge 2004), HSC şi MSC din MO.
La adult principala sursă de MSC este reprezentată de măduva osoasă (bone marrow
MSC – BM-MSC); însă până la acest moment, MSC au fost identificate în mai multe ţesuturi
precum: MO, muşchi, piele (Pettis 1990), ţesut adipos (Gronthos 2001) (Zuk 2001), periost şi
ţesut patologic articular specific artritei reumatoide (Chamberlain 2007), sânge din cordonul
ombilical, placentă (Igura 2004), lichid amniotic (Tsai 2004), sânge periferic (Zvaifler 2000),
ficat fetal (Campagnoli 2001), plămân fetal (Anker 2003) şi ţesutul dentar decidual (Miura
2003). Deşi au fost izolate din numeroase ţesuturi, prezentând capacităţi de proliferare şi
diferenţiere diferite (Tab. 6.1), nu există rezultate complete privind echivalenţa acestor populaţii.
Deşi măduva osoasă reprezintă principalul rezervor pentru MSC (fiind şi cel mai bogat la
adult – Tuan 2003), Pittenger a arătat că numai un mic procent (0.001-0.01%) din totalul
celulelor mononucleare izolate prin gradient de densitate din MO produc colonii celulare
aderente la plastic cu aspect fibroblast-like (Pittenger 1999). După alţii numărul de CFU-F
medulare ar fi între 1/10000 şi 1/100000 de celule mononucleare din MO (Castro-Malaspina
1980). Raportat la întreaga populaţie HSC (1%) medulară, cantitatea de MSC izolate direct este
infimă.
O alternativă la MO este ţesutul osos trabecular (Tuli 2003). Având în vedere
multitudinea ţesuturilor din care au fost izolate MSC, Tuan (2003) afirmă că MO reprezintă sursa
unui fond comun de celule multipotente care capătă acces prin intermediul circulaţiei în diferite
ţesuturi, adoptând caracteristicile necesare regenerării ţesutului respectiv (i.e. fenotip mono sau
bipotent).
Cantitatea de MSC din organism variază cu vârsta (Fibbe 2003) şi prezenţa afecţiunilor
sistemice (Inoue 1997). Astfel, cel mai mare număr de celule se găseşte la nou născuţi, însă pe
durata vieţii acesta scade ajungând la aproximativ 50% la vârsta de 80 de ani (Fibbe 2003).
Acesta poate fi şi motivul pentru care ţesuturile copiilor se vindecă mai uşor. Fiziologic,
scăderea numărului celulelor stem se datorează mai multor factori, precum: diferenţierea în
celule adulte şi senescenţa celulară (Pittenger 2008 carte). În timpul vieţii fetale MSC ating o
valoare maximală în primul trimestru, urmând să scadă în trimestrul al doilea până la 0.0001%.
La naştere în cordonul ombilical se găsesc într-un procent de cca 0.00003% (Campagnoli 2001).
În ultima vreme au fost izolate din MO, celule care în afară de cele trei fenotipuri clasice
(osteoblaste, condroblaste şi adipocite) se pot diferenţia în cultură şi în ţesuturi ecto şi
endodermale. Din acest grup de celule pluripotente fac parte: MAPC (multipotent adult
progenitor cells) (Jiang 2002), hBMSC (human bone marrow derived multipotent stromal cells)
(Yoon 2005), MIAMI (marrow isolated adult multiliniage inducible cells) (D-ippolito 2004),
VSEL (very small embryonic-like stem cells) (Kucio 2006). Celule similare au fost găsite şi în
sângele din cordonul ombilical (USSC – unrestrictioned somatic stem cells) (Kogler 2004),
ţesutul adipos (Rodriguez 2004) şi lichidul amniotic (de Coppi 2007). Întrucât cultivarea în
condiţii speciale in vitro a acestor celule conduce la obţinerea unor celule progenitoare
mezenchimale (dar şi ecto şi endodermale) cu potenţial restricţionat (Verfaillie 2002), cumulată
cu eşecul izolării lor din ţesuturi proaspete, face să planeze dubii asupra existenţei lor in vivo.

  39 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 6]                                                                                                                         Localizarea/Surse MSC 

Deşi manifestă potenţial mezenchimal, nu se ştie dacă aceste celule reprezintă subpopulaţii MSC
sau populaţii celulare diferite MSC-like.

Tab. 6.1. Surse MSC.


Ţesut Potenţial de diferenţiere
Măduva osoasă Adipocite, astrocite, neuroni, cardiomiocite,
condrocite, hepatocite, celule mezangiale, osteoblaste,
celule gliale – microglia
Muşchi Adipocite, miotubuli, osteocite, celule endoteliale,
neuroni, condrocite
Osul trabecular Adipocite, osteoblaste, condrocite
Dermul Condrocite, osteoblaste, condrocite
Ţesutul adipos Condrocite, osteoblaste
Periostul Condrocite, osteoblaste
Pericitele Condrocite, osteoblaste
Sângele Adipocite, fibroblaste, osteoblaste, osteoclaste
Membrane sinovială Adipocite, condrocite, osteoblaste
după Tuan 2003

  40 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 7]                                                                                                                                         Originea MSC 

7 ORIGINEA MSC

„All difficult things have their origin in that which is


easy, and great things in that which is small.”
Lao Tzu

Încă nu se cunoaşte cu certitudine originea acestor celule, la acest moment existând mai
multe teorii ce speculează acest subiect.
Cea mai răspândită teorie, ce doreşte a explica originea MSC în diferite ţesuturi, face o
legătură între MSC şi linia celulară musculară netedă prin intermediul pericitelor (Galmiche
1993) şi al vascularizaţiei. O dovadă ce sprijină această ipoteză este proprietatea osteogenică
(Brighton 1992) şi condrogenică (Doherty 1998) a pericitelor.
Pericitele, numite şi celule peri-endoteliale sau celule Rouget, sunt celule murale ce se
găsesc în vasele mici (arteriole, venule şi capilare) şi mari, pe suprafaţa abluminală, opuse
celulelor endoteliale cu care au relaţii fizice şi umorale. Există şi categorii de pericite specifice
unor organe, precum celula Ito hepatică, celulele mezangiale renale şi celulele adventiceale
reticulare medulare (ARC) (Tab. 7.1). Deoarece se găsesc în toate vasele, ele realizează o reţea
ce acoperă întreg organismul. Ele sunt definite de următoarele caracteristici: contact fizic cu
celulele endoteliale mediat de joncţiuni tip gap, exprimă cel puţin un marker specific fără a
exprima marker-i pan-endoteliali.

Tab. 7.1. Similarităţile între MSC şi ARC.


ARC MSC
Morfologie Reticulare cu procese lungi Reticulare cu procese lungi
LNGFR/CD271 Pozitive Pozitive
Fosfataza alcalină Pozitive Pozitive
VCAM-1/CD106 Pozitive Pozitive
SDF-1/CXCL12 Exprima Exprima
Marker-i stromali/fibroblastici Prezenţi; printre care D7-FIB, CD10 şi Prezenţi; printre care D7-FIB,
CD13 CD10 şi CD13
după Jones 2008

Pericitele pot fi o sursă locală de celule diferenţiate pentru ţesuturi. Studii pe animale au
arătat că sunt implicate în repararea fracturilor prin diferenţiere în condrocite şi osteocite; în plus,
se pot diferenţia în adipocite (contribuind la regenerarea ţesutului lezat) şi celule Leydig. (da
Silva 2008)
Fiind o sursă importantă de celule cu rol în regenerarea ţesuturilor mezenchimale, găsirea
originii MSC beneficiază şi de o explicaţie embriologică. Deşi se speculează că în timpul
dezvoltării sale ontogenetice, organismul uman sădeşte în ţesuturile mezenchimale celule
progenitoare necesare întreţinerii tournover-ului, nu se cunoaşte cu exactitate provenienţa MSC
nici măcar la nivelul MO (Dennis 2004).
Conform teoriei embriologice clasice, MO se formează în urma colonizării cartilajului
hipertrofic de la nivelul treimii medii a oaselor lungi, de către procesul de vascularizaţie (Pechak
1986). Această etapă are loc după ce ţesutul osos nou format ce acoperă acest cartilaj, a fost
mineralizat. Alături de vascularizaţie la acest proces participă şi elementele medulare şi celulele
hematopoietice ce migrează din ficatul fetal (Dennis 2004).
O posibilă explicaţie asupra colonizării MO cu MSC, ilustrează trei posibile căi: (1)
colonizează odată cu vascularizaţia; (2) migrează de la nivelul periostului (care prezintă o
multipotenţialitate documentată (Nakahara 1992)) urmând calea vasculară, după ce procesul de
vascularizaţie s-a încheiat; (3) sosesc pe cale sangvină, ilustrând posibilitatea existenţei MSC
circulante (Dennis 2004).

  41 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 7]                                                                                                                                         Originea MSC 

Deşi primele două căi sunt înrudite, între ele diferind doar momentul începerii
colonizării, cea de a treia cale oferă o nouă perspectivă asupra originii MSC şi a utilizării lor
terapeutice. Astfel, se poate lua în considerare calea de administrare sistemică în cazul folosirii
lor în clinică.
Primele două mecanisme sunt susţinute de observaţiile experimentale asupra pericitelor
(celule asociate capilarelor) şi celulelor musculare netede medulare. Pericitele exprimă marker-i
specifici celulelor musculare netede şi sunt capabile a se diferenţia în celule musculare netede
(Meyrik 1981), osteoblaste (Brighton 1992) condrocite şi adipocite (Doherty 1998). Localizarea
pericitelor la nivelul periostului, le conferă acestora locul şi momentul potrivit migrării în MO.
Mai mult, au fost puşi în evidenţă marker-i celulari comuni MSC, CFU-F şi pericitelor.
Astfel, este cazul antigenului STRO-1 (Doherty 1998) şi MCAM, exprimat activ de către
pericite.
O dovadă funcţională este reprezentată de funcţia periostului în repararea fracturilor. În
1941, Duhamel du Monceau a identificat periostul ca fiind agentul important în repararea osului,
idee ce a precedat teoria celulară a lui Schleiden şi Schwann. Făcând legătura între proprietăţile
osteogenice ale pericitelor, localizarea lor periosteală şi rolul periostului în repararea fracturilor
se poate obţine un argument solid pentru teoria lui Albrecht von Haller, care a afirmat că sursa
osului este în artere, iar periostul are doar rol de hrănire (Dennis 2004).
În plus, Bianco (2008) a arătat că celulele subendoteliale MCAM/CD146+ (pericite), din
MO, sunt singurele celule medulare care sunt clonogenice in vitro şi pot transfera funcţia de
suport hematopoietic, ectopic.
da Silva (2008) consideră că la nivel medular corespondentele MSC din cultură par a fi
celulele adventiceale reticulare (ARC). Acestea, din punct de vedere funcţional sunt suport al
hematopoiezei (similar MSC), contribuind la realizarea nişei HSC (e.g. secreta SDF-1
(CXCL12)), putând transfera funcţia de suport hematopoietic, ectopic (e.g subcutanat),
asemănător MSC în. În plus, ontogenetic, hematopoieza apare iniţial în oasele lungi, după ce
apar celulele mioide pe suprafaţa abluminală a vaselor ce invadează macheta de ţesut cartilaginos
a viitorului os. Pericitele se pot diferenţia în celule mezenchimale (i.e. adipocite, condrocite şi
osteoblaste) in vitro şi in situ, test caracteristic MSC (demonstrat in vitro, fără a fi confirmat însă
in vivo). Toate acestea susţin corespondenţa MSC-ARC pentru MO. (da Silva 2008)
Capacitatea pericitelor de a avea mai multe fenotipuri in vivo, în funcţie de organul în
care se găsesc, poate justifica comportamentul MSC in vitro de a genera fenotipuri similare
celulelor mature specifice organului gazdă cât şi capacitatea de a-şi însuşi fenotipul celulelor
mature în caz de co-cultură. Totodată această observaţie poate susţine şi influenţa nişei asupra
celulelor stem, condiţionându-le diferenţierea. (da Silva 2008)
Având în vedere aceste rezultate da Silva (2008), propune un model teoretic ce încearcă
să explice originea şi localizarea MSC, realizând o legătură între acestea şi pericite. Modelul său
pleacă de la ipoteză că celulele MSC in vitro sunt de fapt pericite in vivo, mai exact sunt de fapt
celulele progenitoare provenite din celulele stem perivasculare (i.e. pericite). Astfel, MSC se
găsesc în tot organismul sub forma pericitelor, fiind localizate la nivelul unei nişe peri-vasculare
şi având rolul de a stabiliza vasele sangvine şi în homeostazia celulară tisulară; ele sunt eliberate
când vasele de sânge sunt lezate, se divid şi secretă factori umorali (au efect trofic, anti-
apoptotic, inhibă cicatrizarea, stimulează angiogeneza şi pro-mitotic pentru celulele progenitoare
tisulare implicate în repararea ţesutului respectiv). Deşi termenul de celule perivasculare descrie
un amestec de celule stem asociate compartimentului perivascular, numai o parte a acestora pot
genera MSC in vitro. (da Silva 2008)
În ceea ce priveşte localizarea lor, teoretic se citează trei posibilităţi. Prima consideră că
MSC sunt localizate la nivelul unui organ sursă (posibil MO), de unde migrează către alte
ţesuturi, înlocuind celulele apoptotice (această variantă este puţin probabilă, datorită dificultăţii
cu care au fost izolate din sângele periferic). În cea de a doua, MSC se găsesc cantonate în mai
multe organe (se bazează pe succesul izolării lor din acestea). Cea mai recentă variantă provine
din modelul lui da Silva (2008): MSC sunt localizate la nivelul patului perivascular din tot
corpul. Astfel, se poate explica de ce sunt izolate din atât de multe ţesuturi şi de ce au

  42 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 7]                                                                                                                                         Originea MSC 

comportament similar. Această localizare le permite să participe în cadrul proceselor de


regenerare a ţesuturilor gazdă. Ipoteza este susţinută de reuşita izolării de celule MSC-like din
vase de sânge şi glomeruli decapsulaţi. În plus, această localizare poate explica prin scăderea
numărului de vase odată cu înaintarea în vârstă (fibrozarea) de ce MSC sunt mult mai puţine la
persoanele vârstnice.
Cu toate acestea se observă că datele referitoare la pericite construiesc ideea unui sistem
specific de organ al progenitorilor cu potenţă specifică de organ (Bianco 2008). O observaţie
importantă este cea care prezintă proprietatea pericitelor izolate din muşchiul striat de a se
diferenţia miogenic spontan (Dellavalle 2007) şi non-osteogenic in vivo, în contrast cu
comportamentul CFU-F din MO şi celulele stromale subendoteliale.
Existenţa unei posibile populaţii omogene de celule stem stromale prezente în ţesuturile
mezenchimale este o problemă vastă ce rămâne încă deschisă.
Un model care propune să explice prezenţa MSC la nivelul diverselor organe adulte (Fig.
7.1), foloseşte modelul pericitele ca intermediar. Se speculează existenţa unui mecanism general
bazat pe racolarea pericitelor la nivelul peretelui microvascular, în cursul organogenezei, model
care ipotetic poate fi aplicat şi progenitorilor organ-specifici. Celulele stromale destinate
diferenţierii organ-specifice fiind preluate în acelaşi moment (Jain 2003). Aceste celule rămân
într-o stare latentă până în momentul apariţiei semnalului in vivo (turnover sau refacere tisulară)
sau in vitro (formând CFU-F), când îşi reiau proliferarea şi diferenţierea.
Relaţia celule stem-pericite, studiată cu ajutorul tehnicii label-retaining cell (LRC –
identifică celulele stem care au un ciclu celular lent pe baza unui marker nucleotidic (e.g. H-
thymidine) încorporat în ADN în timpul sintezei acestuia şi care persistă mai mult, şi, la
concentraţii mai mari faţă de celulele pe cale de diferenţiere) a arătat că densitatea celulelor stem
este mai mare pe o distanţă de circa 10 µm faţă de vase, în timp ce la distanţe mai mari
predomină celule proliferative. Această observaţie sugerează că celulele stem se găsesc
perivascular, iar după selectarea acelora ce vor intra în procesul de determinare/diferenţiere,
acestea vor ocupa spaţiul para-vascular. Prezenţa pericitelor în spaţiul peri-vascular poate fi
răspunzătoare de existenţa unui număr vast de populaţii celulare MSC-like. (da Silva 2008)
În modelul lui da Silva (2008) (MSC – un subset al populaţiilor celulare peri-vasculare),
originea MSC este orientată către celulele din aorta dorsală embrionară numite mezangioblaste.
Originea embriologica comună, cumulată cu asocierea celulelor stem postanatale cu
locaţia perivasculară, sugerează că tipurile diferite de SSC sunt similare putând explica şi
trăsăturile specifice de plasticitate.

Fig. 7.1. Model propus


pentru explicarea
„rezervorului” de celule
progenitoare tisular-
specifice. (Bianco 2008)
Osteoblastele şi mioblastele
sunt încorporate ca pericite
în peretele vascular al
ţesutului de rezidenţă, în
cursul procesului de
embriogeneză, pentru a
contribui postnatal la
regenerarea ţesutului prin
transformarea lor în
osteocite şi miocite striate. 

  43 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 7]                                                                                                                                         Originea MSC 

Rezultate recente plasează originea MSC la nivelul crestei neurale. S-a observat că
primele celule cu aspect MSC-like ce apar la embrion sunt generate de neuroepiteliul Sox 1+ din
creasta neurală. Această observaţie este susţinută de faptul că celulele derivate din creasta
neurală migrează către MO prin sânge, fiind prezente în MO la adult şi având potenţial de
diferenţiere neuronal, glial şi miofibroblastic. (Ohishi 2010).
Foster (2008) a arătat că celule derivate din creasta neurală pătrund în timus unde rămân
cantonate sub forma pericitelor. În plus originea neurală a pericitelor cerebrale a fost deja
demonstrată. Aceste rezultate pot susţine speculaţii privind originea neurală a MSC, explicând şi
izolare cu succes a MSC medulare pe baza marker-ului low-affinity nerve growth factor receptor
(LNGFR) şi faptul că MSC au proprietatea de diferenţiere neurală. În plus, ARC sunt pozitive
pentru factorii de creştere neuronali. Se speculează astfel că celulele crestei neurale
supravieţuiesc la adult sub forma pericitelor. (da Silva 2008)
Legătura între cele două teorii este realizată de către următoarea observaţie:
mezangioblastele provin din aorta dorsală embrionară, care se află în contact strâns cu tubul
neural în jurul vârstei de 9 zile, moment în care celulele neuroepiteliale Sox 1+ sunt singurele ce
exprimă caracteristici MSC-like când sunt cultivate. Ipoteza în care celulele neurale pot migra în
aorta dorsală formând mezangioblaste, astfel încât pericitele şi MSC să provină din celule
neurale Sox 1+ nu poate fi contestată. (da Silva 2008)
Deşi se întrevede o legătură susţinută cu dovezi clare, între pericite şi MSC, mai sunt
necesare numeroase studii care să descopere cu exactitate mecanismul de apariţie al MSC.

  44 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 8]                                                                                                                                          Biologia MSC 

8 BIOLOGIA MSC

„Any living cell carries with it the experience of a


billion years of experimentation by its ancestors.”
Max Delbruck

8.1 Biologia şi rolul MSC

Înţelegerea biologiei SSC in vivo este critică pentru dezvoltarea terapiilor celulare bazate
pe celule stem. Cele mai multe date sunt semnificative pentru MSC medulare, al căror studiu
datează încă din a doua jumătate a sec al XIX-lea.
In vivo se presupune că sunt apte pentru a rămâne într-o stare latentă de nediferenţiere
până la acţiunea stimulului triger, replicându-se asimetric şi producând celule diferenţiate
necesare regenerării ţesutului de rezidenţă. (Tuan 2003)
MSC reprezintă o populaţie eterogenă, ale cărei proprietăţi depind de micromediul în care
se află, ce formează în cultură colonii CFU-F. Numărul de colonii obţinut din aspiratul medular
depinde de specie, vârsta donatorului şi condiţiile de cultură (Bobis 2006).
Un aspect specific BM-MSC umane ce le diferenţiază de MSC provenite de la rozătoare
cât şi de ESC umane este reprezentat de lipsa substratului feeder cells necesar ESC umane şi
MSC recoltate de la rozătoare (Bruder 1997) atingerii eficienţei maxime a culturii.
În ceea ce priveşte analiza culturilor MSC, unele studii (Im 2005) au arătat eterogenitatea
acestora, contestând concepţia clasică conform căreia culturile MSC cuprind un singur fenotip
celular (celule fusiforme) (Pittenger 1999). A fost observată în cultură prezenţa a cel puţin două
fenotipuri: celule fusiforme, mici şi celule cuboidale/plate, mari (Im 2005).
Referitor la capacitatea proliferativă există contradicţii. Reyes (2001) identifică un tip
celular cu reînnoire rapidă (celule mici) şi unul cu reînnoire lentă (celule mari). În contrast cu
aceasta Colter (2000) atribuie celulelor mici un fenotip lent în ceea ce priveşte evoluţia ciclului
lor celular (celule mici şi agranulare, numite şi RS-1, cu o capacitate scăzută de a forma colonii).
Cu toate acestea, celulelor RS le-a fost asumată capacitatea de a coordona evoluţia/expansiunea
întregii culturi MSC, precum şi capacitatea de a răspunde la stimulii produşi de MSC mature
jucând astfel rolul de regeneratori ex vivo ai culturii MSC (Colter 2000). În 2001, Colter a
identificat un al treilea fenotip: celule foarte mici (7µ) cu raport nucleu/citoplasma mare,
fusiforme, ce se pot reînnoi rapid, fiind considerate progenitori timpurii cu cea mai mare
capacitate de diferenţiere multiliniară. Acestor celule le-au fost atribuiţi următorii marker-i de
suprafaţa şi proteine: receptorul 2 al VEGF, receptorul pentru tirozin kinază, receptorul pentru
transferină, lipocortina 2, CD117 şi epitopul de rezistenţă multidrog. Un element important îl
constituie lipsa STRO-1, considerat a fi un marker de bază al MSC (Dennis 2002).
Unul dintre cele mai recente studii, (Lee 2010), ce a evaluat capacitatea proliferativă a
MSC la nivelul unei singure celule a identificat patru tipuri celulare: HPP-MCFC (high
proliferativepotential mesenchymal colony-forming cells), cca 7% din totalul coloniilor, cu
fenotip pozitiv pentru SH-3, CD29, CD71, CD90- şi negativ pentru CD14, CD34, CD45; LPP-
MCFC (low proliferativepotential mesenchymal colony-forming cells), cca 29%; MCC
(mesenchymal cell clusters), cca 26%; şi MMC (mature mesenchymal cells), cca 38%. În ceea ce
priveşte potenţialul de diferenţiere, HPP-MCFC au putut fi diferenţiate pe cele trei linii clasice,
LPP-MCFC pe linie osteogenică şi condrogenică slabă, în timp ce, MCC şi MMC au putut fi
diferenţiate cu un randament scăzut în linii osteogenice şi adipogenice. Acest studiu confirmă
eterogenitatea MSC, demonstrând că la baza potenţialului MSC poate sta o singură subpopulaţie
(HPP-MCFC).
În ceea ce priveşte funcţia MSC la nivelul MO, aceasta este variată şi depinde de tipul
fenotipului MSC exprimat (Dennis 2004). Astfel, principalul rol, deşi discutat, constă în

  45 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 8]                                                                                                                                          Biologia MSC 

realizarea reţelei stromale de susţinere a hematopoiezei, după diferenţierea lor în celule stromale
(Trentin 1976). MSC sprijină hematopoieza acţionând ca feeder layer pentru HSC (Dexter 1982).
La acest moment, nu este cert dacă MSC participă ca suport al hematopoiezei în mod
direct sau prin intermediul progeniturilor lor stromale, deşi după unii autori (Dennis 2004) aceste
două tipuri de celule ar fi identice; însă rezultatele mai multor echipe au arătat că multe dintre
celulele stromale se pot diferenţia în ţesuturi mezenchimale, constituind astfel un rezervor latent
de celule cu fenotip posibil MSC (Dennis 2004).
MSC sunt implicate în susţinerea hematopoiezei prin realizarea unui micromediu
suportiv celular şi prin intermediul asigurării, stabilizării şi întreţinerii reţelei sinusoidale a MO
(Sacchetti 2007). Rolul MSC la nivelul MO a fost demonstrat de numeroase studii experimentale
ce au dovedit persistenţa MSC marcate la nivelul MO precum şi contribuţia acestora la
accelerarea procesului de repopulare medulară în caz de cotransplant MSC + HSC (Koc 2000).
La nivelul MO, MSC secretă factori implicaţi în homing-ul (stromal derived factor 1) sau
proliferarea şi diferenţierea HSC (GM-CSF, SCF, IL-6) (Hoffman 2002). Se speculează ideea că
în cadrul homeostaziei MO, secreţia chemokinelor pentru receptorii CCR9 şi CXCR4 acţionează
autocrin asupra MSC, într-un mod similar HSC (Honczarenko 2006).
La nivelul compartimentului stromal al MO, dar nu numai, MSC produc o paletă largă de
proteine matriceale extracelulare, factori de creştere, chemokine şi citokine (Tab. 8.1). Aceste
substanţe sunt produse atât de celulele latente cât şi după stimulare adecvată (Bobis 2006). În
plus, producerea lor poate fi condiţionată şi de interacţiunea cu alte tipuri celulare(Aggarwal
2005) (Le Blanc 2005) (Groh 2005).

Tab. 8.1. Molecule produse de MSC.


Proteine
matriceale Fibronectină, laminină, colagen, proteoglicani
Produşi ai MSC
la nivelul Produşi cu rol IL-1a, IL-1b, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, IL-14, IL-15,
compartimentului factorul de stimulare al coloniilor macrofage, GM-SCF, factorul
de semnalizare
stromal al MO inhibitor leucemic, factorul celulelor stem (SCF), tirozin kinaza 3
din ficatul fetal, trombopoietină, factorul de creştere hepatocitar
Denumire Abreviere
Factorul de creştere vascular endotelial VEGF
Factorul celular stem nr. 1 SCF-1
Factorul inhibitor al leucemiei LIF
Produşi ai MSC Factorul stimulator al coloniilor granulocitare G-CSF
(rezultate din studii ce Factorul stimulator al coloniilor macrofage M-CSF
au cuprins mai multe
Factorul stimulator al coloniilor GM-CSF
specii şi mai multe
macrofago-granulocitare
localizări)
Interleukine (1, 6, 7, 8, 11, 14, şi 15) IL-1, IL-6, IL-7, IL-8, IL-
11, IL-14 şi IL-15
Factorul derivat din celule stromale nr. 1 SDF-1
Ligandul Flt-3
după Pittenger 1999, Haynesworth 1996, Majumdar 1998, Reese 1999, Cheng 2003 Devine 2000, Boiret 2005,
Colter 2001, Dazzi 2006, Gronthos 2003, Katz 2005

Pe lângă moleculele deja menţionate, MSC utilizează o clasă specială de glicoproteine,


numite chemokine (citokine chemotactice). Acestea sunt glicoproteine de 8-10 kDa implicate în
procesele biologice; fiind singurele citokine care interacţionează cu receptorii serpentine
(coupled 7 transmembrane domain receptors) – clasa a proteinelor G. Ele sunt împărţite în 4
familii: CC, CXC, CX3C şi XC (Fig. 8.1, Fig. 8.2).

  46 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 8]                                                                                                                                          Biologia MSC 

Fig. 8.1. Chemokinele şi receptorii din familia CC. (Chamberlain 2007)

Fig. 8.2. Chemokinele şi receptorii din familia CXC, CX3C şi XC. (Chamberlain 2007)

În ceea ce priveşte fenotipul receptorilor pentru chemokine, exprimaţi de către MSC,


aceştia sunt eterogen prezenţi pe suprafaţa celulelor. Rezultatele studiilor privind acest aspect
sunt variate. Unele au arătat că receptorul CXCR4 este prezent pe mai puţin de 1% din celule, în
timp ce altele au indicat absenţa lui şi prezenţa receptorilor CCR1, CCR4, CCR7, CXCR5 şi
CCR10 şi rolul acestora în migrarea MSC. Întrucât prezenţa chemokinelor şi a receptorilor
acestora pe suprafaţa unei celule echivalează cu existenţa unei adrese chimice a celulei, această
variabilitatea a receptorilor poate fi tradusă prin capacitatea MSC de a utiliza aceşti receptori

  47 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 8]                                                                                                                                          Biologia MSC 

pentru a migra selectiv în ţesuturi (i.e. MSC pot utiliza CCR9 pentru a migra la nivel intestinal
sau CCR1 pentru a se localiza la nivelul articulaţiilor inflamate sau al encefalului în scleroza
multiplă). (Chamberlain 2007)
La această vastă gamă de molecule de pe suprafaţa MSC se adaugă şi prezenţa
moleculelor de adeziune precum: integrinele α1, α2, α3, α4, α5, αv, β1, β3, β4, VCAM-1,
ICAM-3, ALCAM, CD105, VLA-4 etc. (Chamberlain 2007)
Alături de participarea la homeostazia hematopoiezei, MSC manifestă un rol important şi
în cadrul răspunsului imunitar. Aceste celule sunt puternic imunomodulatoare influenţând atât
răspunsul imun celular cât şi pe cel umoral. Influenţa asupra limfocitelor T (LT) este inhibitoare.
MSC nu prezintă pe suprafaţa lor molecule din clasa II MHC sau receptori co-stimulatori (CD80,
CD86), neavând astfel funcţie de celulă prezentatoare de antigen (Angoulvant 2004). MSC
provenite de la mai multe specii au manifestat o puternică influenţă inhibatoare asupra
răspunsului LT la stimuli policlonali (di Nicola 2002).
Inhibiţia manifestată este antigen nespecifică şi vizează răspunsul imun primar şi
secundar deopotrivă (Krampera 2003), având la bază inhibarea proliferării celulelor T care sunt
oprite în faza G1 a ciclului celular ca urmare a scăderii nivelului ciclinei D (Glennie 2005).
Acest proces nu este apoptotic şi poate fi reversat (di Nicola 2002). Deşi mecanismul acestei
relaţii nu este cunoscut se speculează implicarea contactului fizic celulă-celulă, precum şi a
factorilor solubili (TGF-β şi HGF) ca urmare a observaţiilor făcute atunci când interacţiunea a
fost blocată prin introducerea în mediul de reacţie a anticorpilor anti TGF-β şi HGF (di Nicola
2002). (pe larg în capitolul XI)
Având potenţial condrogenic şi osteogenic, MSC participă activ atât în cadrul procesului
de reparare a fracturilor cât şi în cel de turnover osos. Conform schemei elaborate de Ham şi
Harris în 1971, MSC colonizează cheagul post-fractură contribuind la formarea calusului şi apoi
la procesul de condrogeneză şi osificare encondrală.
Referitor la turnover-ul osos, MSC participă prin intermediul osteoblastelor – celule
osteogenice diferenţiate din MSC medulare, având astfel rol în procesul de osteosinteză. Se
apreciază că anumite afecţiuni degenerative corelate cu vârsta, ce asociază pierdere de ţesut osos,
pot fi cauzate de diminuare nişei MSC medulare sau de un acces dificil la aceasta (Dennis 2004).
Un alt rol, mult mai controversat, este consemnat de prezenta fenotipului adipocitar în
rândul MSC. Deşi numeroase laboratoare au demonstrat că MSC se pot diferenţia în adipocite,
nu se cunoaşte rolul acestora la nivel medular. Câteva speculaţii se pot face pe marginea acestui
subiect. De exemplu, la şoareci, adipocitele medulare sunt implicate prin intermediul unor
proteine produse în funcţia de termoreglare (Marko 1995).
La om se speculează rolul adipocitelor ca sistem spaţiu-tampon, dinamic, de reglare a
spaţiului medular (prin expansiune sau restricţie adipocitară) invers proporţional cu dezvoltarea
ţesutului hematopoietic (Tavassoli 1974). Această speculaţie este susţinută de observaţia că
adipocitele medulare nu mobilizează lipide ca răspuns la înfometare (Tavassoli 1974).
Exceptând rolul la nivelul MO, studiile ultimilor 10 ani au demonstrat că transplantul
BM-MSC în regiuni non-scheletale au produs refacerea miocardului, creierului şi a altor organe
(Barry 2003). Deşi capacitatea de diferenţiere în neuroni şi cardiomiocite, in vivo, a BM-MSC
transplantate este contestată, o îmbunătăţire a funcţiei acestor organe a fost înregistrata (Picinich
2007).
Se poate afirma că transplantul BMSC poate transfera funcţia de „nursing” medular la
nivelul ţesuturilor non-scheletale, astfel încât şi celulele gazdă să poată beneficia de această
„îngrijire” (Caplan 2006). Clasic, se acceptă 5 roluri principale in vivo pentru MSC medulare: (1)
celule progenitoare pentru reparare şi tournover la nivel osos; (2) progenitoare ale ţesutului
cartilaginos; (3) suport vascular; (4) suport hematopoietic; (5) celule progenitoare ale
adipocitelor (Dennis 2004). Recent au început să apară şi alte roluri ale MSC, în special cu
referire la rolul MSC/pericitelor în cadrul procesului de reconstrucţie tisulară.
Evenimentele implicate în repararea tisulară, ce survin lezării ţesutului, sunt: formarea
cheagului sanguin; activarea plachetelor cu eliberarea de factori de creştere şi chemokine;
declanşarea procesului inflamator; migrarea diferitelor tipuri de celule în ţesut şi proliferare

  48 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 8]                                                                                                                                          Biologia MSC 

locală, intensificarea producerii matricei extracelulare de către fibroblaste, urmată de


contractarea plăgii sub acţiunea miofibroblastelor; cicatrizare şi remaniere cicatriceală.
Originea fibroblastelor implicate în repararea tisulară este controversată. O legătură între
ele şi celulele perivasculare este sugerată de prezenţa pericitelor PDGFRb+/HMW-MAA+ la
pacienţii cu scleroză sistemică şi cicatrizare cheloidă. Totuşi se consideră că această situaţie este
mai degrabă o excepţie patologică decât regula. În ficatul şobolanilor s-a observat că pericitele
(celulele ITO) după activarea lor de către agentul lezional (e.g. CCl4) se activează şi proliferează
urmând a intra în apoptoză (ca urmare a creşterii CD95 şi CD95L la 96 de ore după leziune)
limitând astfel fibroza. Un alt rol al pericitelor este reprezentat de diferenţierea acestora în celule
mature specifice ţesutului afectat. S-a observat in vivo (la animale) că pericitele pot genera celule
mezodermale şi neuroni în urma leziunilor ischemice.
Pe baza acestor observaţii da Silva (2008) a creat un model de acţiune al MSC/pericitelor
în procesul de reparare tisulară (Fig. 8.3, Fig. 8.4). Acestea, proliferează în urma leziunii, ca
răspuns la pierderea contactului între celulele endoteliale cu membrana bazală. Numărul lor
creşte, la fel şi cantitatea de factori umorali produşi, exercitând astfel efecte trofice şi
imunosupresoare pe ţesutul înconjurător.

Fig. 8.3. Implicarea MSC în cadrul procesului de reconstrucție tisulară. (da Silva 2008)
A. MSC/pericitele (nucleu bleu) contribuie la homeostazia imunitară, evitând răspunsurile imune
inutile (săgeți). B. Lezarea tisulară afectează interacțiunea MSC/pericite vs. celule endoteliale
(nucleu verde); membrana bazală (roşu) este lezată => cheag; plachetele eliberează molecule
bioactive; celulele imunitare (nucleu roz) sunt atrase la locul leziunii, => răspuns (săgeți roz);
celulele progenitoare circulante (nucleu verde închis) sunt recrutate în focar. C. Evenimentele
precedente conduc la migrarea MSC/pericitelor la nivelul leziunii; se activează (nucleu albastru),
proliferează şi produc factori umorali cu efect anti-apoptotic şi de blocare a răspunsului imun (săgeți
galbene). D. După acest proces, celulele endoteliale şi progenitorii circulanți refac endoteliul şi
membrana bazală. MSC/pericitele au mai multe căi posibile de evoluție ulterioară: 1. îşi pot relua
fenotipul şi se fixează la membrana bazală; 2. celulele care au pierdut contactul cu membrana
bazală intră în apoptoză; 3. unele rețin fenotipul progenitor (nucleu albastru); 4. se pot diferenţia
(nucleu oranj) în celule mezenchimale.

În acest model, se ţine cont şi de implicarea imunologică în procesul de refacere tisulară.


Se consideră că toleranţa imună, critică în menţinerea homeostaziei imune, este dependentă de
mecanismele active periferice (din afara organelor imune periferice). Modelul lui da Silva (2008)
privind MSC, confirmă şi susţine implicarea acestora în controlul răspunsului imun, beneficiind
de localizarea peri-vasculară a acestora şi de proprietăţile imunoreglatoare manifestate in vitro şi
in vivo. MSC, prin imunosupresia LT şi LB, protejează ţesutul de acţiunea distructivă a
răspunsului imun consecutiv leziunii. Astfel, se poate specula că MSC pot fi implicate şi în
autoimunitate, fiziologic ele având rolul de a proteja organismul faţă de un răspuns autoimun
survenit ca urmare a pierderii toleranţei. Unele studii au arătat că anumite defecte în funcţia
imunosupresoare a MSC pot cauza diabet tip I şi scleroză multiplă. (da Silva 2008)

  49 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 8]                                                                                                                                          Biologia MSC 

Fig. 8.4. Efectele


paracrine şi acțiunea
trofică a MSC în
reconstrucția tisulară.
(da Silva 2008)
A. Leziune focală soldată cu
moartea celulelor mature
specifice țesutului şi afectare
vasculară.
B. Activarea celulelor en-
doteliale, imunologice şi a
pericitelor/MSC.
C. Pericitele/ MSC migrează
în zona lezată şi proliferează,
cu efect antiapoptotic asupra
celulelor diferențiate tisulare,
imunomodulator,
proangiogen, anticicatriceal
şi chemoatractant pentru
alte populații celulare.
D. Efectele paracrine prece-
dente stimulează progenitorii
tisulari intrinseci regenerând
zona lezată.

O particularitate a modelului lui da Silva (2008) este reprezentată de implicarea


MSC/pericitelor sub forma acţiunii factorilor umorali. O parte din efectele MSC, dacă nu toate,
sunt cauzate de producerea unor factori umorali (Fig. 8.5) ce au potenţial angiogenic, anti-
apoptotic, anti-firbrotic şi imunoreglator. MSC fuzionează cu celulele adiacente mature, iar
efectele lor se bazează pe acţiunea factorilor umorali. Acest fenomen este mult mai probabil
decât diferenţierea lor în anumite tipuri de celule mature. (da Silva 2008)
Astfel utilizarea MSC poate stimula refacerea tisulară deoarece acestea au rol trofic şi
imunomodulator, iar în plus pot migra către ţesuturile lezate. Această funcţie de homing
reprezintă poate cel mai important rol al MSC după administrarea lor sistemică.

Fig. 8.5. Chemokinele şi receptorii


interacțiunii MSC. (da Silva 2008)
Receptorii (verde), chemokinele (albastru).

  50 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 8]                                                                                                                                          Biologia MSC 

8.2 Nişele şi circulaţia MSC

Majoritatea cunoştinţelor referitoare la MSC au fost obţinute în urma studierii culturilor


celulare izolate din diferite ţesuturi şi sunt semnificative pentru acestea precum şi pentru
modelele experimentale în care au fost testate.
Datorită faptului că MSC au putut fi izolate din numeroase organe diferite embriologic, a
luat naştere întrebarea dacă cumva micromediul înconjurător al MSC (nişa stem) este comun
tuturor acestor organe sau MSC supravieţuiesc autonom, indiferent de micromediu (Kolf 2007).
Conceptul de „nişă a celulelor stem” (micromediul format de toate acele elemente –
celule şi matrice extracelulară – ce favorizează menţinerea nediferenţiată şi proliferarea celulelor
stem) a fost introdus de către Schofield (1978) cu referire la existenţa unui compartiment
funcţional de la nivelul MO în care MSC există într-o stare latentă conservându-şi capacitatea de
self-renewal.
Pentru MO această nişă a fost localizată la nivelul endoostului de către Gronthos (2003).
Totuşi localizarea anatomică a nişei MSC, atât pentru MO cât şi pentru alte ţesuturi este
imprecisă şi se poate modifica în timp ca urmare a folosirii unor marker-i cu specificitate
dinamică pentru MSC, cum este de exemplu Stro-1 (Bobis 2006),
O altă posibilitate consideră MSC localizate perivascular la nivelul MO asemenea
pericitelor. Astfel, se realizează o legătură între MSC, pericite şi ARC (ce pot fi considerate
pericite specializate cu localizare la nivelul sinusoidelor venoase medulare), întrucât MSC
izolate pe baza fenotipului Stro-1+/CD106+ şi Stro-1+/CD146+, au fost pozitive şi pentru αSMA
(α smoth muscle actin) şi 3G5 – marker-i ai pericitelor. (Jones 2008)
La nivelul organismului uman se consideră că nişa MSC are o natură perivasculară.
Această afirmaţie este susţinută de prezenţa αSMA în MSC izolate din diverse ţesuturi, de
prezenţa celulelor CD45-/CD31-/Sca-1+/Thy-1+ în zonele perivasculare, precum şi localizarea
perivasculară (la nivelul MO şi pulpei dentare) a MSC cu ajutorul marker-ilor Stro-1 şi CD146.
Celulele astfel localizate au fost pozitive pentru αSMA şi 3G5. (Kolf 2007). Un contraargument
al acestei teorii este faptul că celule ce îndeplinesc criteriile pentru MSC au fost izolate din
cartilaj articular, care este avascular (Jones 2008).
Interacţiunea fiziologică a nişei stem asupra MSC (Fig. 8.6) nu este cunoscută clar. De
exemplu, nu se cunoaşte cu certitudine rolul celulelor vecine şi schimbul pe proteine şi
informaţie între acestea şi MSC, nefiind încă identificată o celulă sau grup de celule responsabile
de efectul nişei. Nu au fost identificate nici componente ale matricei extracelulare (ECM) care să
conserve statusul nediferenţiat al MSC, deşi s-a remarcat că ECM influenţează diferenţierea
MSC în osteoblaste. În schimb, s-a observat că hipoxia creşte numărul de CFU-F, plasticitatea şi
expresia factorilor oct-4 şi rex-1, implicaţi în proliferarea MSC. (Kolf 2007)

Fig. 8.6. Nişa MSC.


(Kolf 2007)
Se observă localizarea MSC
la nivel perivascular şi
interacţiunea cu alte tipuri
celulare diferenţiate prin
intermediul moleculelor de
adeziune (e.g. caderinele),
cu ECM şi moleculele de
semnalizare din mediu.
BV - vas de sânge; DC1,2 -
celule diferenţiate; ECM -
matrice extracelulară.

  51 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 8]                                                                                                                                          Biologia MSC 

Modalitatea prin care MSC îşi menţin starea de nediferenţiere la nivelul nişei nu este
cunoscută complet. Numeroşi factori observaţi ca având influenţă în culturile de MSC au fost
extrapolaţi ca fiind implicaţi în controlul ciclului celular la nivelul nişei stem. Dintre aceştia cei
mai vehiculaţi sunt: factorii din familia Wnt (împiedică diferenţierea prin creşterea expresiei
factorilor oct-3/4, rex-1 şi Nanog) (Fig. 8.7), Dkk1, Frzb-1, sFRP1 (Sato 2004) împreună cu căile
de semnalizare Notch, Hedgehog şi BMP (Bobis 2006).
MSC sunt mobilizate de la nivelul nişei sub acţiunea anumitor factori specifici, pătrund
în torentul sanguin (Fernandez 1997) şi de aici pot ajunge teoretic oriunde în organism. Filia
acestor celule faţă de un ţesut sau altul este dependentă de producerea anumitor chemokine şi de
prezenţa receptorilor pentru acestea pe suprafaţa lor (Lee 2006). Un astfel de receptor implicat în
homing-ul MSC este CXCR4 (Bobis 2006).
Mobilizarea MSC constituie un concept ce datează de mai bine de 150 de ani (Prockop
1997). Deşi unele studii au arătat la om predispoziţia MSC a se localiza către ţesuturi afectate
patologic, după injectarea sistemică, încă se discută pe tema circulaţiei MSC. Lipsa unor criterii
stricte de evaluare face ca analiza MSC infuzate, bazată pe detecţia unui marker sau pe obţinerea
de CFU-F să fie discutabilă, mai ales că există posibilitatea ca MSC să îşi altereze capacitatea de
aderare după pătrunderea în circulaţie (Khosla 2006).
Deşi Jones (2008) afirmă că nu a reuşit să izoleze colonii CFU-F din sângele unor
persoane sănătoase (prezenţa MSC circulante fiind un lucru foarte rar la om (Fernandez 1997),
Fernandez (1997) a observat prezenţa MSC circulante în sângele pacientelor cu cancer de sân
care au fost tratate cu factori de creştere. Din culturile de MSC izolate din sângele din cordonul
ombilical, Makino (1999) a izolat o subpopulaţie MSC (5-10%) latentă, sugerând astfel existenţa
unor progenitori mezenchimali nediferenţiaţi circulanţi în viaţa fetală. Mai multe rezultate
publicate confirmă capacitatea de homing a MSC la nivelul organelor afectate patologic pentru a
susţine regenerarea acestora: cartilaj (Caplan 1997), muşchi (de Bari 2003), miocard (Shake
2002), cerebel (Kopen 1999) şi os (Horwitz 2002).
Având în vedere acestea, Jones (2008) a încercat să explice anumite caractere legate de
circulaţia MSC native. În primul rând, prezenţa MSC în cantitate crescută în primul trimestru al
dezvoltării fetale urmată de scăderea lor ulterioară, împreună cu localizarea MSC la nivelul
ţesutului moale al cordonului ombilical (nu numai al sângelui din vena ombilicală) sprijină
ipoteza conform căreia după încetarea angiogenezei MSC se metamorfozează în pericite dispuse
perivascular. În al doilea rând, dacă MSC circulă aşa cum se crede, dar într-o cantitate atât de
mică încât greu pot fi detectate atunci este posibil ca rolul lor în organism să nu fie atât de
semnificativ pe cat se crede. Fiind cunoscută relaţia dintre BM-MSC şi adipocitele medulare ce
se pot mobiliza în circulaţie în urma traumelor osoase, Jones (2008) consideră că existenţa MSC
circulante în afara unui context traumatic osos este destul de improbabilă.
Cu toate că unele studii au arătat că MSC se pot deplasa preferenţial către anumite
ţesuturi sub influenţa unor chemokine, dispoziţia ubicuitară a MSC la nivelul scheletului sub
forma pericitelor pledează împotriva necesităţii in vivo de circulaţie a MSC, pe distanţe lungi,
către ţesuturile lezate.
Aceste observaţii, privind circulaţia MSC native, nu afectează importanţa homing-ului şi
circulaţiei MSC injectate în scop terapeutic care sunt susţinute de rezultatele favorabile survenite
post-administrare.

  52 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 8]                                                                                                                                          Biologia MSC 

Fig. 8.7. Calea de semnalizare


Wnt.
Reprezintă o cascadă de
transducţie a semnalelor cu rol
esențial în dezvoltarea embrionară,
proliferarea celulară, self-renewal şi
homeostazia tisulară. Foloseşte trei
căi: 1. calea canonică (bazată pe
catenina β); 2. calea PCP (planar
cell polarity); 3. calea Wnt-Ca2+.

  53 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 8]                                                                                                                                          Biologia MSC 

8.3 Homing-ul MSC

De un real interes pentru aplicaţiile clinice ale MSC este problema homing-ului acestora
după administrarea lor sistemică (cea mai facilă şi des utilizată metodă în trialuri). În plus,
capacitatea de homing poate înlătura complicaţii legate de administrarea locală a celulelor (e.g.
osificare la locul de injectare în cazul administrării lor la nivelul peretelui cardiac post IMA)
(Salem 2009).
Homing-ul reprezintă migrarea şi blocarea/cantonarea MSC la nivelul capilarelor unui
organ urmată de migrarea acestora trans-endotelial în ţesutul respectiv, consecutiv administrării
sistemice a acestora.
Deşi la nivel internaţional există mai multe trial-uri ce studiază administrarea sistemică a
MSC pentru diferite afecţiuni, puţine lucruri se cunosc despre mecanismele de homing. Această
lipsă de informaţii se traduce prin utilizarea unor cantităţi mari de celule (150-300 milioane) în
cadrul modelelor experimentale de terapii celulare. La acestea se adaugă şi lipsa informaţiilor
referitoare la efectele pe termen lung ca urmare a producerii de către MSC a unor factori
paracrini difuzibili, la nivelul ţesutului în care sunt grefate.
Rezolvarea acestei dileme va trebui să ofere răspunsuri la întrebări legate de mobilizarea
MSC endogene în sângele periferic şi migrarea acestora în ţesuturile
ischemice/inflamatorii/tumorale, de capacitatea MSC exogene de a migra din sângele periferic în
aceleaşi ţesuturi şi care este eficienţa şi mecanismul acestui proces.
Se speculează că traficul MSC se bazează pe gradientul chemokinelor eliberate de
ţesuturile inflamate, fiind mediatorul cheie al homing-ului MSC. Acestea activează receptorii de
pe suprafaţa MSC.
O primă substanţă implicată este SDF-1/CXCL12 (eliberată de ţesuturile lezate) care
interacţionează cu receptorul CXCR4 al MSC; ca răspuns la această stimulare, MSC exprimă o
serie de molecule: CX3CL1, CXCl16, CCl3, CCL19 şi CCL21. Blocarea axului SDF-1/CXCR4
blochează homing-ul celulelor. Se crede că SDF-1 este implicat şi în migrarea MSC către ţesutul
ischemic cardiac, jucând astfel un rol important în traficul MSC către ţesuturile ischemice.
(Salem 2009) Alături de complexul SDF-1/CXCR4, mai este implicat şi sistemul ligand-receptor
hepatoczte growth factor/c-Met (Kolf 2007).
Un alt ax de reglare este cel reprezentat de chemokina CCL21 şi receptorul său CCR7.
Interacţiunea CCL21 (exprimată de către keratinocite)/CCR7 (receptor pe suprafaţa MSC) este
răspunzătoare de migrarea MSC la nivelul leziunilor cutanate. (Sasaki 2008)
Alte căi de comunicare implicate în homing: integrina β1 (migrare la nivel cardiac, IMA),
PODXL şi CD49f (migrare la nivel cardiac şi renal). Un aspect important este legat de MSC cu
fenotip PODXL (hi)/CD49f (hi): reduc riscul de trombembolism pulmonar după administrarea
sistemică şi au un potenţial de diferenţiere mai eficient. (Salem 2009)
Capacitatea de homing poate fi îmbunătăţită prin transducţia virală a celulelor cu
CXCR4, sau utilizarea unor tratamente cu TNFα, IFN-β şi insulin growth factor. La acestea se
adaugă şi selecţia unor MSC ce exprimă Stro-1 în cantităţi mari, observându-se că MSC Stro-1+
sunt mult mai capabile de homing şi grefare decât cele negative (Kolf 2007).

8.3.1 Factori ce influenţează homing-ul

Mobilizarea MSC endogene. Este un aspect controversat, întrucât există studii ce


dovedesc izolarea MSC din sângele periferic (Kuznetsov 2001) dar şi contrariul (He 2007).
Un prim aspect ce este necesar a fi analizat este legat de modalitatea de prelevarea a
sângelui pentru aceste studii. Puncţia venoasă, cea mai utilizată, poate mobiliza (cel puţin
teoretic) pericite (celule CFU-F asupra cărora planează legături de filiaţie şi origine a MSC) din
peretele vascular, oferind astfel rezultate fals pozitive. da Silva (2006) a depăşit această
problemă recoltând sânge de la nivelul venei porte, o metodă ce diminuează posibilitatea
mobilizării pericitelor, fără a putea obţine culturi MSC.

  54 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 8]                                                                                                                                          Biologia MSC 

Metodele de izolare şi cultură au un rol important în succesul izolării MSC din sânge.
Mai multe studii au arătat că MSC izolate din sânge manifestă fenotipuri diferite de cele ale
MSC izolate din MO (Kuznetsov 2001).
În ceea ce priveşte factorii ce stimulează mobilizarea MSC endogene, Wang (2009) a
observat, la şoarecii răniţi, nivele crescute de MSC circulante corelate cu valori crescute ale
VEGF şi G-CSF în sângele periferic. Mai mult, MSC izolate de la aceştia au prezentat fenotipuri
similare MSC din MO.

Tehnica de cultură şi expansiune in vitro, influenţează capacitatea de homing. Astfel,


celulele în confluenţă crescută au o capacitate de migrare trans-endotelială scăzută (de Becker
2007) în timp ce MSC proaspăt izolate manifestă un homing crescut (Rombouts 2003).
În plus, condiţiile de cultură afectează şi dispoziţia MSC pentru un ţesut sau altul. Astfel,
Fibbe (2003) a remarcat că MSC medulare murine îşi pierd capacitatea de homing pentru MO şi
splină după o expansiune în cultura de 24-28 h.
Cultura excesivă a MSC este asociată cu scăderea expresiei moleculelor de adeziune, a
receptorilor pentru chemokine (e.g. CXCR4) şi a răspunsului chemotactic. (Salem 2009). Acest
fenomen este reversibil dacă cultura este condiţionată cu anumite citokine.
Hipoxia culturilor MSC stimulează mobilitatea celulelor. La acestea se adaugă şi locul de
izolare al MSC şi mediile de cultură utilizate – ambele contribuind la obţinerea unor populaţii
MSC eterogene. (Karp 2009)
În plus, condiţiile de cultură pot influenţa expresia unor gene implicate în homing; astfel,
prin metoda de cultură “hanging drop” se poate stimula expresia CXCR4 şi a integrinei α2.
(Salem 2009)
Toate aceste aspecte impun o caracterizare amănunţită a populaţiilor celulare pre-
transplant şi o standardizare a tehnicilor de cultură.

Administrarea MSC. Administrarea celulelor într-o cantitate cât mai mare şi cât mai
aproape de momentul ischemic/inflamator creşte gradul de grefare (Chen 2001), fără însă a se
observa o îmbunătăţire crescută faţă de administrarea tardivă (Omori 2008). Cantitatea de celule
injectate suferă un efect tip platou, astfel încât nu se constată o îmbunătăţire superioară dacă se
creşte cantitatea de celule peste o anumită doză optimă (la şoarece) (Wu 2008).
Pe lângă acestea, şi calea de administrare a celulelor influenţează homing-ul. Calea
intracardiacă şi intraarterială (IA) au condus la o grefare sporită în caz de IMA (Freyman 2006).
Administrarea IA cât mai aproape de locul afectat creşte grefarea comparativ cu administrarea
IV distal (Walczak 2008). În plus, calea IA reduce filtrarea celulelor la nivel pulmonar, hepatic şi
splenic (Sackstein 2008) şi favorizează „capturarea pasivă” a MSC la nivelul patului
microvascular (ocluzia capilarelor ca urmare a diferenţei de mărime între celule şi diametrul
capilarelor; se consideră a fi un pas premergător migrării transcapilare din cadrul homing-ului).
Barbash a arătat că MSC de şobolan administrate intraventricular migrează preferenţial în
miocardul ischemic decât cel sănătos, ceea ce sugerează producerea unor molecule semnal de
către ţesutul lezat facilitând homing-ul şi traficul către acesta. Expresia acestor molecule scade
după câteva zile de la leziune, astfel încât este preferabil ca administrarea să se realizeze proxim
faţă de atacul ischemic (2 zile). În plus, administrarea IV a fost însoţită de o rată mare de
sechestrare pulmonară, care poate fi diminuată prin administrare de nitroprusiat de sodiu.
(Chamberlain 2007)
Într-un studiu pe şoareci, calea intraperitoneală a avut rezultate mai bune decât injectarea
IV, pentru tratamentul fetuşilor in utero (Chan 2007).
Deşi injectarea locală asigură cel mai mare număr de celule, în multe cazuri aceasta nu
este aplicabilă (e.g. inimă, creier), iar în plus rata de mortalitate posttransplant a celulelor este
mai mare datorită difuziei limitate a nutrienţilor (Muschler 2004), putând apărea şi complicaţii
de tipul formării de ţesut osos la locul injectării.

  55 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 8]                                                                                                                                          Biologia MSC 

Cu toate acestea, calea de administrare IV suscită interesul, datorită invazivităţii minime.


În plus, mai multe echipe au raportat rezultate favorabile după injectarea IV pentru leziuni
ischemice cerebrale, rejetul alogrefei cardiace, fibrozei pulmonare (Chamberlain 2007).

8.3.2 Mecanismele de homing

Eficacitatea terapeutică depinde de extravazarea şi localizarea MSC injectate sistemic,


urmată de declanşarea unei activităţi trofice locale sau paracrine, sau de eliberarea sistemică a
unor factori de la nivelul ţesutului gazdă.
Teoretic, pe baza puţinelor rezultate ce vizează homing-ul, se poate aprecia existenţa a
două mecanisme posibile (Fig. 8.8). Primul implică un model activ (capturare activă), bazat pe
implicarea moleculelor de adeziune (similar adeziunii leucocitare), în timp ce al doilea este un
model pasiv (capturare pasivă), bazat pe existenţa diferenţelor de mărime între celule şi capilar
(Walczak 2008). Acest ultim model este probabil datorită observaţiilor că MSC îşi măresc
dimensiunile în cultură (Chavakis 2008).

Condiţionarea homing-ului. O primă metodă utilizează iradierea corporală totală,


pornind de la observaţia că MSC se grefează preferenţial în ţesuturile inflamate. În acest mod,
Francois (2006) a arătat că MSC se grefează preponderent în creierul (2.8 ori), inima (3 ori),
ficatul (2,5 ori), MO (2.6 ori) şi muşchiul striat (1.7 ori) al şoarecilor iradiaţi total, comparativ cu
cei neiradiaţi. În ceea ce priveşte grefarea pulmonară nu au existat diferenţe.
Iradierea induce creşterea integrinei VCAM-1 ceea ce sprijină implicarea capturării
active (Mazo 2002), însă este posibil să producă şi o micşorare a diametrului vaselor, fiind astfel
responsabilă şi de implicarea unui mecanism pasiv (Eder 2004) simultan, ceea ce ar explica lipsa
modificărilor pulmonare.
Implicarea mecanismului activ este susţinută de studiile ce vizează blocarea integrinelor
(Ip 2007) şi modelele knockout (Ruster 2006). Ruster (2006) a arătat dependenţa procesului de
homing faţă de integrine şi selectine, sugerând implicarea mecanismelor de interacţiune
intercelulară ca precursor al migrării transvasculare.
„Rostogolirea” MSC pe peretele endotelial in vitro a arătat implicarea interacţiunilor
VLA-4/VCAM-1, între MSC şi celulele endoteliale (Ruster 2006), în condiţiile utilizării unui
endoteliu neactivat inflamator. Rezultate similare au fost raportate şi de Segers (2006), care a
utilizat un model activat inflamator.

Transmigrarea. Un timp important în cadrul homing-ului este reprezentat de deplasarea


MSC pe suprafaţa endotelială. Acest proces utilizează interacţiuni ale selectinelor E şi P. MSC
exprimă CD44, receptor pentru selectine. În urma acestor interacţiunii, viteza de rostogolire a
MSC pe suprafaţa endotelială este redusă până la oprirea lor, urmată de realizarea unor
interacţiuni ferme şi activarea unor integrine (e.g. VLA-4) şi a VCAM-1. (Salem 2009)
Aderarea fixă la peretele endotelial este urmată de migrarea transendotelială ce se
realizează cu ajutorul moleculelor joncţionale de adeziune (JAM), caderinelor şi PECAM-
1/CD31 (platelet-endothelial cell adhesion molecule 1). Un rol important în acest proces îl au şi
enzimele MMP (matrix metalloproteinase) şi TIMP-1/2 (tissue inhibitor of metalloproteinase),
VCAM-1 şi VLA4, integrinele α6β1, α8β1 şi α9β1. (Salem 2009)
MSC, ajunse extravascular, realizează legături cu matricea extracelulară (colagenul şi
fibronectina) (Fig. 8.9) prin intermediul interginelor α1, acidului hialuronic şi al CD44. (Salem
2009)
Interacţiunea VCAM-1/VLA-4 a fost raportată de Steingen (2008) ca fiind implicată şi în
procesul de extravazare transendotelială, pe endoteliu neactivat. MSC au părăsit vasul în cca 240
minute (leucocitele 5-20 minute), diferenţele fiind cauzate mai degrabă de lipsa activării
endoteliale decât de o incapacitate fizică a MSC.

  56 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 8]                                                                                                                                          Biologia MSC 

Chemotactismul. Eliberarea de chemokine de către ţesuturi sau celulele endoteliale,


joacă un rol important în migrarea transendotelială, chemotactism şi fixarea MSC în ţesuturile
ţintă (Belema-Bedada 2008).
Belema-Bedada (2008) a arătat că MSC marcate eGFP, şi care exprimă receptorul CCR2
(pentru ligandul MCP-1 – eliberat de ţesuturile inflamate) se grefează de până la 20 de ori mai
eficient în miocardul ischemic al şoarecilor comparativ cu alte ţesuturi sau control. Blocarea
receptorului a condus la scăderea eficienţei grefării. Astfel, sistemul MCP1-CCR2 poate fi un
efector în cadrul mecanismului de homing.
Alături de acesta, a fost observată şi implicarea ligandului MCP-3, cu receptorii săi
CCR1 şi CCR2 (Schenk 2007).

Enzimele. Pe lângă chemokine şi molecule de adeziune, MSC utilizează şi enzime în


cadrul activităţilor migratorii.
În migrarea transendotelială MSC produc proteaze necesare degradării matricei
extracelulare a membranei bazale endoteliale. Blocarea acestor proteaze scade migrarea
transendotelială in vitro (De Beker 2007).
Kim (2008) a arătat pe un model de ocluzie a arterei cerebrale medii ca după injectarea
ipsi sau controlaterală, MSC migrează în totalitate în decurs de 10 săptămâni în zona infarctizată.
O migrare atât de specifică este datorată factorilor chemotactici şi degradării enzimatice (Karp
2009).
Alte enzime implicate sunt: MMP2, MT-1MMP, TIMP-2 şi gelatinaza (Steingen 2008).

Fig. 8.8. Homing activ vs. homing pasiv. (Karp 2009)


A. Încetinirea MSC în vase poate avea loc fie prin „frecare” datorită diferenței de mărime între
celule şi vas, sau prin deformare similară leucocitelor (îşi modifică forma, pătrund în venulele
postcapilare unde se fixează (1) şi se rostogolesc pe suprafața endotelială activată, în sensul
gradientul chemokinelor (2)). B. În timpul capturării pasive se poate observa apariția turbulenţelor
(săgețile curbe) de flux; turbulenţele lipsesc în timpul capturării active (celula se aplatizează ca
rezultat al interacțiunii moleculelor de adeziune). C. După capturarea activă celulele transmigrează
endotelial; este posibil ca acelaşi proces să aibă loc şi pentru MSC capturate pasiv. VLA-4 - very
late antigen 4; VCAM-1 - vascular cell adhesion molecule 1; ICAM-1 - intercellular adhesion
molecule 1; MMP - matrix metalloproteinases; TIMP - tissue inhibitor of metalloproteinases.

  57 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 8]                                                                                                                                          Biologia MSC 

Fig. 8.9. Mecanismele de homing şi trafic la nivelul țesutului țintă. (Salem 2009)

8.3.3 Eficienţa homing-ului MSC

Eficienţa grefării MSC depinde de factori intrinseci (ce ţin de interacţiunea celulă-
organism) şi extrinseci (reprezentaţi în principal de metodele şi tehnicile de detecţie utilizate).
Principalele metode de detecţie utilizate pentru MSC administrate sistemic sunt:
marcarea radioactivă, marcarea fluorescentă, transducţia MSC cu gene reporter, transplantul sex-
mismatched sau specie-mismatched via hibridizare fluorescentă in situ sau RT-PCR.
În final aceste metode se reduc la identificarea numerică a celulelor fluorescente sau la
dozarea radioactivităţii relative, putând obţine rezultate nespecifice. Nivelurile diferite de
specificitate a fiecărei tehnici pot fi responsabile pentru rezultatele diferite privind eficienţa
grefării. Aceste metode sunt relative atât prin tehnică în sine cât şi prin lipsa unui control de
eficienţă maximă pentru comparaţie.
Toate aceste metode au arătat că MSC ţintesc cu predilecţie ţesuturile
inflamate/ischemice/tumorale sau MO, iar distribuţia nespecifică este îndreptată către plămân,
ficat, splină şi rinichi.
Utilizarea unor metode de marcare cu nanoparticule superparamagnetice de oxid de fier
sau a metodei “quantum dots” (Shah 2007) pot creşte nivelul de detecţie şi de cuantificare
obiectivă a eficienţei grefării.

Localizarea precisă a MSC în funcţie de timp. Pentru eficienţa grefării MSC


administrate sistemic, este important a se ţine cont de posibilitatea de redistribuţie a celulelor
după localizarea tisulară iniţială şi de timpul necesar pentru aceasta.
Utilizând imagistica SPECT/CT, Kraitchman (2005) a arătat că după injectarea sistemică,
MSC se localizează pulmonar, iar de aici migrează în decurs de 24 de ore la nivelul miocardului
infarctizat.
Aceasta sugerează că pentru studiile de homing MSC este necesar a fi ţinut cont de
momentul realizării transplantului şi de metoda de detecţie utilizată. În plus, trebuie ţinut cont de
posibilitatea că MSC localizate intravascular la mai puţin de 24 de ore de la transplant, nu sunt

  58 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 8]                                                                                                                                          Biologia MSC 

grefate în acel organ, ci sunt mai probabil în tranzit. Este de importanţă critică să se cunoască
dacă MSC sunt în tranzit, capturate pasiv sau extravazate.
Cel puţin teoretic, până acum, grefarea este sinonimă cu migrarea transendotelială a
celulelor. O altă posibilitate ce poate crea confuzie în ceea ce priveşte homing-ul este
reprezentată de posibilitatea MSC de a fuziona cu celulele gazdă.

Caracterizarea MSC posttransplant, după administrarea sistemică reprezintă o


problemă.
Încă nu se poate spune dacă aceste celule formează o “nişă MSC” posttransplant sau
contribuie prin diferenţierea lor în celule mature.
Studii pe om (Cilloni 2000) şi şoareci (Belema-Bedada 2008) au arătat că MSC
supravieţuiesc la nivel medular constituind straturi stromale. În plus, Belema-Bedada (2008) a
arătat că MSC ce exprimă eGFP pot fi identificate după 3-6 luni la nivel medular la indivizii
murini la care s-au practicat transplanturi domino. Întrucât studiul nu a beneficiat de o analiză
completă a celulelor recoltate între transplanturi, rămâne de discutat dacă celulele pozitive GFP
identificate la cei trei indivizii sunt MSC sau celule diferenţiate.
Deşi s-a încercat o separare MSC-celule diferenţiate, prin utilizarea unor markeri
specifici celulelor mature diferenţiate, rezultatele nu sunt convingătoare.
Toate aceste probleme privind caracterizarea MSC după administrarea sistemică îşi au
originea în definiţia MSC, care este discutabilă, şi în metoda de analiză şi identificare a grefării
lor.

Tehnici de inginerii biomoleculară pentru stimularea homing-ului. Deşi exprimă


receptori ce intermediază homing-ul (e.g. VLA-4) şi fixarea chemokinelor, MSC nu exprimă şi
alte molecule (e.g. PSGL-1), sau exprimă la un nivel redus (e.g. CXCR4) implicate în contactul
cu endoteliile activate, precum leucocitele sau HSC.
Prin inginerie genetică, crescând expresia receptorului CXCR4 (Cheng 2008) şi a
subunităţii α4 a integrinei VLA-4 (Kumar 2007), s-a îmbunătăţit homing-ul către miocard
respectiv MO, simultan cu scăderea numărului MSC la nivel pulmonar.
O altă abordare constă în prelucrarea MSC astfel încât să exprime molecule care le
lipsesc, implicate în interacţiunile cu celulele endoteliale activate în timpul „rostogolirii” MSC
pe suprafaţa endovasculară. Astfel, Sackstein (2008), prin obţinerea unor MSC ce exprimă un
receptor pentru E selectină (exprimată preponderent la nivelul MO) a reuşit o creştere a migrării
MSC către MO, după administrarea sistemică a celulelor.
La acestea se adaugă utilizarea unor MSC ce exprimă pe suprafaţa lor Ac bispecifici ce se
pot lega de orice Ac endogen cu un fragment Fc liber, tehnica biotin-streptoverdin, ce permite
ataşarea oricărui ligand pe suprafaţa MSC, favorizând legăturile cu receptorii celulari implicaţi în
adeziune şi controlul condiţiilor de cultură ce facilitează expresia unor receptori (e. g. CXCR4).
Homing-ul MSC expansionate in vivo este slab în comparaţie cu cel al HSC sau
leucocitelor, însă tehnicile de bioinginerie pot compensa acest neajuns, însă aceste tehnici nu
sunt de preferat în clinică întrucât realizează o modificare a celulelor. Luate împreună aceste
tehnici pot îmbunătăţi semnificativ pe viitor homing-ul şi traficul MSC.

Înţelegerea metodelor de trafic ale MSC rămâne parţial cunoscută, iar progresul în acest
domeniu întârzie să apară ca urmare a eşecului izolării MSC native şi continuării utilizării MSC
expansionate in vitro care nu exprimă molecule de interacţiune observate la HSC sau leucocite.
Acestea se sumează cu folosirea unor metode de detecţie nespecifice sau care interferă cu
biologia gazdei.
Cu toate acestea, pe baza rezultatelor de până la acest moment se poate concluziona: (1)
MSC ţintesc preferenţial ţesuturile inflamatorii şi anumite ţesuturi specifice, prin mecanisme
active de homing, parţial cunoscute; (2) nu se poate aprecia încă dacă localizarea MSC în
ţesuturile ţintă este intravasculară (captură pasivă) sau extravasculară (prin transvazare

  59 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 8]                                                                                                                                          Biologia MSC 

endotelială); (3) identificarea MSC native şi a celor injectate care nu s-au diferenţiat rămâne o
provocare.

8.4 Influenţa micromediului gazdă asupra MSC

Deşi prezintă o serie de proprietăţi necesare îndeplinirii rolului lor terapeutic (i.e.
capacitate de diferenţiere diversă, imunosupresie, homing), trebuie ţinut cont şi de factorii
micromediului gazdă ce pot influenţa evoluţia MSC posttransplant.
Dintre aceştia, o atenţie deosebită este acordată citokinelor pro-inflamatorii (IL-1α/β,
TNFα şi SDF-1α) ce pot fi responsabile de eşecul transplantului MSC. Cu toate că MSC
manifestă un puternic efect imunosupresor, majoritatea informaţiilor provin din studii in vitro
astfel încât cel puţin teoretic se poate vorbi de un posibil eşec al efectului terapeutic.
Într-o măsură mai mică sau mai mare, transplantul local al MSC produce un răspuns
inflamator soldat cu recrutarea unor celule inflamatorii şi producerea de substanţe ce pot afecta
direct MSC sau să determine producerea unor citokine de către MSC responsabile de eşecul
terapeutic. Mai ales în acele ţesuturi în care funcţia de producere a factorilor trofici de către MSC
primează, influenţarea acestora de către citokine şi celule inflamatorii este de importanţă
extremă.
În condiţiile acestea, se preconizează că utilizarea unor molecule ce vizează întreruperea
mecanismelor dependente de cele trei citokine pro-inflamatorii, poate creşte şansa de succes a
terapiei MSC.

IL-1α. MSC prezintă pe suprafaţa lor receptorul IL-1RI, receptor pentru ambele citokine
IL-1, ce se menţine şi pe celulele rezultate în urma diferenţierii. Ca urmare a stimulării IL-1α,
MSC produc neurotransmiţătorul substanţa P (SP) ce are efect stimulator al răspunsului imun
celular. (Greco 2008)
IL-1α are un efect stimulator benefic asupra diferenţierii neuronale a MSC, ce se poate
dovedi benefic în anumite circumstanţe. Totuşi cel mai util, pare să fie efectul paracrin al MSC,
şi ca urmare, blocarea acţiunii IL-1α poate fi necesară. (Greco 2008)
Astfel, utilizarea antagoniştilor pentru receptorul IL-1R, de tipul Anakinra® sau
Kineret®, este utilă transplantului MSC, mai ales dacă se reuşeşte fixarea acestora pe MSC,
evitând administrarea sistemica. În plus, s-a evidenţiat că MSC murine pot secreta in vivo IL-1ra
(antagonist endogen IL-1R) neutralizând efectele IL-1α ceea ce limitează utilizarea exogenă a
antagoniştilor. (Greco 2008)

TNFα. Este o citokină implicată în faza acută a răspunsului inflamator, însă implicată şi
în homingul, proliferarea şi diferenţierea celulelor imune.
MSC prezintă membranar, receptorul TNFα-R1 ce se transmite şi celulelor diferenţiate.
Spre deosebire de IL-1α, efectul TNFα este preferenţial asupra celulelor parţial sau total
diferenţiate, manifestat prin apariţia unui răspuns imun exacerbat împotriva celulelor diferenţiate
transplantate. (Greco 2008)
S-a observat că TNFα stimulează capacitatea chemotactică a MSC, ceea ce nu este
neapărat un efect benefic, mai ales că poate genera o mobilizare continuă a MSC la nivelul
ţesutului, întârziind sau blocând efectul terapeutic. (Greco 2008)
Efectele TNFα pot fi blocate utilizând anatagonişti ca: Remicade®, Humira® sau
Enbrel®. (Greco 2008)

SDF-1α. Este o chemokină implicată în răspunsul imun prin modularea chemotaxiei


limfocitare. La nivelul MO, este implicată vital în menţinerea rolului suportiv al MSC faţă de
hematopoieză, iar receptorul sau, CXCR4, joacă un rol important în homing-ul MSC. (Greco
2008)
Totuşi, SDF-1α este un chemoatractant limfocitar puternic ce duce la creşterea
infiltratului inflamator celular în zona transplantată. Pe lângă aceasta, SDF-1αstimulează

  60 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 8]                                                                                                                                          Biologia MSC 

proliferarea progenitorilor neurali din cortexul de şobolan, astfel încât excesul de SDF-1α
conduce la blocarea maturării neuronale. (Greco 2008)
Blocarea acestuia se poate realiza cu ajutorul Mozobil® sau AMD3100. În plus,
AMD3100 poate fi utilizat pentru prevenirea localizării nespecifice a MSC, întrucât s-a dovedit
că blochează migrarea MSC către cortexul cerebral la şobolan lezat. (Greco 2008)

8.5 Îmbătrânirea MSC şi rolul MSC în îmbătrânire

Întrucât se consideră că MSC stau la baza regenerării multor ţesuturi, se poate afirma că
tot ele joacă un rol important în procesul de îmbătrânire a organismului uman.
Îmbătrânirea, din punct de vedere celular se defineşte după Sames şi Stolzing ca suma
restricţiilor primare în cadrul proceselor de regenerare a organismelor multicelulare, în timp ce
senescenţa este atribuită celulelor şi este definită de Campisi ca o oprire esenţială ireversibilă a
diviziunii celulare, celula rămânând în viaţă. (Sethe 2006)
Pentru MSC, această îmbătrânire se traduce sub forma modificărilor calitative, cantitative
şi ale capacităţii de mobilizare.

8.5.1 Marker-ii îmbătrânirii MSC

Morfologia. In vitro MSC bătrâne sunt mai mari, emit mai multe prelungiri şi la distanţe
mai mari, conţin mai multe fibre de actină. MSC provenite de la persoanele în vârstă nu au formă
caracteristică spindle-shape, în timp ce, acelea provenite de la tineri o au, însă, o pierd pe măsură
ce îmbătrânesc. (Sethe 2006)

Proliferarea. Pe măsură ce MSC îmbătrânesc scade capacitatea acestora de a forma


CFU-F la fel ca şi potenţialul de diferenţiere. Mai mult, se pare că are loc un switch adipogenic,
astfel încât MSC pierd potenţialul osteogenic şi îl cresc pe cel adipogenic, această observaţie
explică şi apariţia osteoporozei. În contrast cu aceasta, unii autori au observat că MSC pierd mai
întâi potenţialul adipogenic. (Sethe 2006)
Odată cu îmbătrânirea organismului donor s-a observat că scade şi perioada replicativă a
MSC, astfel încât MSC provenite de la persoane în vârstă nu mai pot dubla cultura de cca 30-40
de ori aşa cum fac în mod normal, iar în plus mărimea coloniei se micşorează. La aceasta se
adaugă diminuarea ratei de creştere, care în mod normal este de 12-24 de ore, în funcţie de donor
şi densitatea culturii. (Sethe 2006)

Telomerele. Atunci când telomerele ating o anumită lungime celulele nu se mai divid şi
devin senescente. Reprezintă un mecanism regulator al duratei de viaţă a unei celule şi un
mecanism de protecţie antitumorală. Se pare că MSC pierd între 30-120 de perechi de baze la
fiecare dublare populaţională. Ca mecanism de refacere a telomerelor există telomeraza care are
scopul de a reface bazele pierdute, însă se pare că pentru MSC activitatea acesteia este extrem de
scăzută, iar populaţiile MSC ce prezintă telomerază sunt foarte rare. Transfecţia retrovirală a
MSC umane cu gena telomerazei umane a prelungit viaţa acestor celule de la 35 de dublări (în
mod normal) până la 260, fără a altera starea de diferenţiere sau potenţialul multiliniar.
(Simonsen 2002).

Ca marker de senescenţă in vitro se remarcă beta-galactozidaza (beta-GAL), însă


rezultatele diferitelor grupuri sunt opuse, astfel încât se consideră că acest marker nu este de
încredere. Alături de marker-ii specifici, pentru aprecierea caracterului de senescenţă a MSC se
utilizează şi identificarea unor substanţe precum cytokine inflamatorii, metaloproteaze, factori de
creştere.

  61 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 8]                                                                                                                                          Biologia MSC 

TGF-β şi BMP2/4 sunt scăzute în cazul MSC recoltate de la donatori senescenţi, şi sunt
asociate cu fenomenul de switch adipogenic. În opoziţie cu acestea, nivelul producerii IL-6
creşte proporţional cu vârsta, în timp ce IL-7 se pare că menţine un nivel constant. Deşi nivelul
IL-11 este scăzut pentru MSC recoltate de la subiecţi în vârstă, se pare că nivelul său creşte în
vitro după cca 9 zile de cultivare. (Sethe 2006)
La acestea se adăugă nivelurile speciilor reactive de oxigen (ROS) şi ale oxidului nitric
(NO), care în funcţie de situaţie şi ţesut pot avea efect pro sau anti-senescent. În cazul MSC,
ROS sunt implicate în semnalizarea la distanţă, cu diminuarea proliferării celulare şi stimularea
procesului de diferenţiere, în timp ce în cazul leziunilor osoase ROS stimulează procesul de
reparare tisulară. În completarea, NO stimulează diferenţierea în osteoblaste şi adipocite. (Sethe
2006)
În contrast cu toate substanţele pro-senescente se pare că antioxidanţii au un rol benefic
pentru MSC, sporind durata de viaţă şi rata de creştere în culturile suplimentate cu antioxidanţi.

8.5.2 Îmbătrânirea intrinsecă şi extrinsecă a MSC

În legătură cu rolul jucat de MSC în îmbătrânire se consideră două ipostaze esenţiale: (1)
efectele îmbătrânirii organismului asupra MSC şi (2) rolul MSC în îmbătrânirea organismului.
Acestea sunt alimentate de teoria intrinsecă (MSC îmbătrânesc ca urmare a unor semnale
interne) şi de teoria extrinsecă (MSC îmbătrânesc ca urmare a unor semnale venite din exterior).
(Sethe 2006)
Deşi cele mai multe dovezi par a susţine teoria extrinsecă, având în minte interacţiunea
MSC cu nişa stem şi modul în care aceasta influenţează celulele stem sub aspectul reţelei
matriceale de susţinere şi al moleculelor semnal prezente, se pare că se ivesc şi probe ce par a
susţine teoria intrinsecă. Astfel, s-a observat că MSC provenite de la donator în vârstă sunt mai
puţin eficiente. În completare, dacă efectul extrinsec este predominant ar trebui să se ţină cont de
vârsta primitorului pentru evaluarea reuşitei transplantului. Totuşi s-a observat că parabioza
şoarece tânăr-şoarece bătrân a crescut rata de regenerare la subiectul senescent, pledând pentru
influenţa extrinsecă bazat pe molecule semnal provenite de la organismul tânăr. (Sethe 2006)
Având în vedere rezultatele obţinute, marea populaţie a MSC poate fi împărţită sub
aspectul îmbătrânirii în trei tipuri celulare majore (Tab. 8.2). Importanţa acestora se va dovedi
critică în aplicarea lor clinică precum şi în studiul aprofundat al îmbătrânirii, întrucât rolul MSC
este major la nivel de organ în ceea ce priveşte procesul de senescenţă şi îmbătrânire. (Sethe
2006)
Toate aceste observaţii sugerează implicarea MSC în procesul de îmbătrânire şi existenţa
unor efecte ale acestui proces ce lovesc direct MSC, astfel încât îmbătrânirea MSC trebuie
privită şi analizată, atât sub aspect extrinsec cât şi intrinsec, privind analitic rezultatele in vitro.

Tab.8.2. Tipurile de MSC clasificate în funcţie de rezistenţa la procesul de îmbătrânire.


MSC MSC MSC
ce se deteriorează persistente perene
Potenţial de Mediu Mediu Crescut
diferenţiere
Senescenţa Da Da Nu
Telomeraza Inactivă Potenţială Activă
Self-renewal Nu Da Da
după Sethe 2006

  62 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 9]                                                                                                                                      Cultivarea MSC 

9 CULTIVAREA MSC

„Evolution isn't just a story or a theory on the corner of


science, evolution is the fundamental idea in biology.”
Warren Allmon

9.1 Recoltarea MSC

Recoltarea MSC, trebuie să fie un proces uşor realizabil, non-invaziv, care să prezinte
morbiditate minimă, iar sursa să nu fie epuizată.
Recent s-au publicat rezultate favorabile ce au arătat că MSC pot fi izolate şi din alte
ţesuturi precum: sângele periferic (Zvaifler 2000) (Kuznetsov 2001), ţesut adipos (Zuk 2001),
piele (Pettis 1990), muşchi (Lee JY 2001), periost şi ţesut patologic articular specific artritei
reumatoide (Chamberlain 2007), sânge din cordonul ombilical, placentă (Igura 2004), lichid
amniotic (Tsai 2004), ficat fetal (Campagnoli 2001), plămân fetal (Anker 2003) şi ţesutul dentar
decidual (Miura 2003).
Cu toate acestea, cel mai frecvent, MSC sunt recoltate din MO. MO este accesibilă în
urma unei proceduri simple sub anestezie locală, fiind un rezervor regenerabil bogat. MSC se
obţin cel mai uşor din aspiratul medular, recoltat prin puncţie.
Pregătirea preintervenţională a pacientului depinde de statusul biologic şi tipul afecţiunii.
Se recomandă profilaxia antiinfecţioasă (în funcţie de condiţia imună a donatorului), sedarea
moderată urmată de anestezie locală. Fiind o procedură invazivă, pacientul va fi monitorizat
atent post-intervenţional, pentru surprinderea precoce a complicaţiilor (cel mai frecvent
infecţioase şi hemoragice).
Cel mai accesibil loc pentru puncţia medulară este creasta iliacă (Fig. 9.1), în treimea
posterioară, la nivelul spinei iliace postero-superioare. Tegumentul ce se suprapune zonei de
interes este aseptizat corespunzător. Se infiltrează ţesutul moale cu lidocaină pentru a face
intervenţia suportabilă. Accesul la nivelul MO se face prin intermediul unui trocar ce se
introduce cu grijă în creasta iliacă. Trocarul poate fi folosit şi pentru a aspira MO. Însă, pentru a
obţine o cantitate mai mare de măduvă şi nu de sânge, se recomandă ca aspirarea să se realizeze
cu un ac cu diametru mare introdus prin trocar, ac ce va putea fi repoziţionat în cursul procedurii.
Pentru aspirare se va utiliza o seringă heparinată cu cca 3000 UI. Aspirarea se va face brusc, cu
mişcări rapide ale pistonului, astfel scăzând proporţia de sânge aspirat. În timpul aspiraţiei
poziţia acului poate fi modificată, însă fără a-l deconecta de la seringă, menţinând astfel vidul
aspirativ. În cursul unei astfel de proceduri pot fi obţinuţi cca 15-20 de ml de măduvă. Aspirarea
unei cantităţi mai mari va creşte proporţia de sânge aspirat. (Pittenger 2008)
Aspiratul astfel obţinut poate fi utilizat imediat sau stocat la temperatura camerei pentru
cca 36 de ore, fără a influenţa reuşita izolării şi culturii. (Pittenger 2008) Transportul aspiratului
se poate face fie la temperatura camerei (Pittenger 2008) sau la gheaţă în eprubete Vacutainer
heparinate ce conţin 3 ml mediu αMEM (Wolfe 2008).
Pentru animalele mari, procedeul de recoltare de la om poate fi adaptat. Pentru mamifere
mici, precum iepurele, se poate apela la o mică intervenţie chirurgicală care să faciliteze accesul
al nivelul femurului. Pentru o aspiraţie completă se poate introduce pe trocar un tub rigid în
canalul medular, adaptat la seringa de aspirat. Recoltarea de la rozătoare implică eutanasierea
acestora. Se folosesc oasele lungi precum femurul şi humerusul. Acestea sunt curăţate de ţesut
moale şi prelucrate ulterior sub hotă cu flux laminar. Se şterg cu alcool 70% pentru a reduce
contaminarea, iar epifizele sunt îndepărtate cu ajutorul unui cleşte steril. Conţinutul medular este
împins, prin spălare cu jet, în vasul de colectare cu ajutorul unui ac cu diametru potrivit canalului
medular adaptat la o seringă cu soluţie salină. Acul nu trebuie să fie mai mic decât diametrul
canalului medular. Practic, canalul medular este spălat cu soluţie salină pe la un capăt, iar pe la
celălalt se colectează amestecul de măduvă şi soluţie salină. (Pittenger 2008)

  63 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 9]                                                                                                                                      Cultivarea MSC 

F3
Fig. 9.1. Puncţia spinei iliace în vederea recoltării aspiratului medular.

Recoltarea de ţesut adipos sau lichid de lipoaspiraţie, este mai invazivă şi nu este utilizată
de rutină la pacienţi. Ţesutul adipos solid poate fi ţesut adipos subcutanat sau epiplon, iar
recoltarea se face utilizând anestezie generală şi, de obicei, în cursul unor intervenţii pentru alte
afecţiuni. Pentru obţinerea de ţesut solid se poate utiliza şi biopsia cu ac. Lipoaspiratul poate fi
obţinut de la donatori ce apelează la chirurgia estetică sau de la pacient. Probele pot fi stocate la
temperatura camerei nu mai mult de 24 ore.

9.2 Izolarea şi cultura MSC

Pentru a putea fi utilizate în cadrul terapiilor bazate pe celule stem, MSC recoltate trebuie
mai întâi izolate şi multiplicate. Aceste operaţii pot da naştere la confuzii privind identitatea
celulelor izolate, utilizând metode de izolare şi cultură diferite, nestandardizate, ce duc la selecţia
preferenţială a unor anumite populaţii sau la modificarea fenotipului celulelor izolate (Salem
2009).
Izolarea MSC din MO a fost descrisă pentru prima dată de către AJ Friedenstein (1974-
1976) (Dennis 2004), fiind descrisă pentru specii precum om, şoarece, iepure şi porc de Guineea,
însă primii care au publicat rezultate consistente privind izolarea MSC din ţesuturile umane au
fost Caplan şi Haynesworth (1992a) (Case Western Reserve University).
Ulterior, mai multe laboratoare au publicat tehnici standardizate pentru cultura MSC
umane (Kuznetsov 1997), şoarece (Krebsbach 1997) şi iepure (Wakitani 1994).

  64 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 9]                                                                                                                                      Cultivarea MSC 

Studiile intensive asupra izolării şi multipotenţialităţii MSC au început în 1994, iar în


1996 s-a demonstrat potenţialul de diferenţiere in vitro al acestora. Aceste rezultate au culminat
în 1999 cu publicarea de către Pittenger a unei lucrări citate de peste 2500 de ori.
Principiul de izolare şi cultură folosit de majoritatea acestor tehnici speculează
capacitatea MSC de a adera la flask-ul de cultură (din material plastic), într-un mediu cu o
concentraţie de ser fetal bovin (FBS) mult mai mică decât ar fi necesară pentru celulele
hematopoietice, favorizând astfel eliminarea celor din urmă (nu au proprietatea de aderare)
(Dennis 2004). FSB-ul conţine o serie de factori de creştere (PDGF, bFGF sau FGF, EGF etc),
citokine şi factori ce favorizează ataşarea MSC. Eliminarea acestuia din cultură duce la scăderea
numărului de celule aderente. Deşi este o substanţă exogenă ce predispune la dificultăţi de
translaţie a celulelor pentru terapiile umane, prezenţa acestuia nu poate fi substituită prin adaosul
factorilor cunoscuţi. (Pittenger 2008) Probabil FSB conţine şi alte substanţe neidentificate încă,
necesare culturii de MSC.
Simpla izolare a MSC pe baza proprietăţii de aderare la plastic, a arătat că numai o mică
parte din celulele izolate astfel pot avea potenţial de diferenţiere multiliniar. Utilizarea metodei
gradientului de densitate cu Percoll (iniţiate de Caplan şi perfecţionată de Pittenger) a dus la
obţinerea unor populaţii mult mai omogene. MSC umane sunt recoltate în mod obişnuit din
grupul celulelor mononucleare ale MO prin centrifugare în gradient de densitate (Chamberlain
2007).
Izolarea şi separarea MSC se poate face prin cernere (size sieving), prin placare directă
sau prin metoda selecţie în gradient de densitate, respectând următoarele principii: (1) separarea
celulelor mononucleare; (2) recuperarea celulelor aderente (pasajul zero; (3) expandarea celulelor
aderente în cultură.
Pentru izolarea MSC medulare umane se foloseşte tehnica descrisă de Haynesworth
(1992b), sau variante adaptate ale acesteia, care au la bază utilizarea gradientului de densitate.
Iniţial aspiratul medular este diluat cu fosfat-tampon salin (PBS) în raport de 3.5 părţi
PBS la o parte aspirat medular, centrifugat la 900g timp de 10 minute la temperatura camerei.
Peletele rezultate sunt resuspendate în PBS, numărate, iar concentraţia lor este ajustată la 2X107
celule/ml. Celulele sunt apoi centrifugate în gradient de densitate cu Percoll (1.073 g/ml) –
aproximativ 5-10 ml de suspensie celulară se aşează peste 25 ml Percoll, într-un tub de 50 ml.
Flacoanele sunt apoi centrifugate la 1100g timp de 30 de minute. Supernatantul celular este
aspirat, diluat în 25 de ml PBS, centrifugat. Peletul rezultat se combină cu 10 ml mediu de
cultură pentru MSC umane (DMEM low glucose cu 10% ser fetal bovin). Celulele sunt
însămânţate la o concentraţie de 7.5-25x104 celule/cm2, şi cultivate în atmosferă umedă cu 5%
CO2. Mediul se schimba de două ori pe săptămâna (Dennis 2004).
O alternativă constă în utilizarea protocoalelor propuse de Pittenger (2008) (vezi Anexa
I) pentru placarea directă şi izolarea în gradient de densitate, fiind folosite pe scară largă cu
rezultate favorabile privind cantitatea de celule obţinute.
Tehnica pentru izolarea MSC direct din fragmente biopsice medulare este diferită.
Fragmentele de măduvă sunt suspendate în DMEM, iar apoi sunt injectate succesiv prin ace cu
diametru de 18, 20 şi 22G pentru dispersie. Amestecul dispersat este centrifugat la 900g timp de
5 minute, resuspendat în DMEM şi însămânţate la o concentraţie de 7.5-25x104 celule/cm2 în
DMEM cu FBS. După 12-18 zile coloniile formate sunt pasate. MSC sunt spălate cu soluţie
Tyrode, incubate 5 minute cu o soluţie de 0.25% Trypsin-EDTA. Digestia enzimatică este
întreruptă prin adăugarea de FBS 0.5:1 (vol:vol). Celulele sunt centrifugate şi pasate la o
concentraţie de 7.5-25x104 celule/cm2 (Dennis 2004).
Pentru izolarea şi cultura MSC obţinute din ţesut adipos se pot folosi protocoalele
descrise de Dubois (2008) (Anexa II).
Cultivarea celulelor izolate se poate realiza prin cultivare clasică în flask-uri (pentru
obţinerea unor cantităţi moderate de celule) sau în sisteme supradimensionate, de tipul Cell
Factory. În funcţie de modul de cultură folosit izolarea şi manoperele ulterioare vor fi adaptate şi
executate diferenţiat.

  65 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 9]                                                                                                                                      Cultivarea MSC 

O specificaţie importantă pentru obţinerea rapidă a unor culturi cu potenţial de


diferenţiere maximal este reprezentată de însămânţarea la densităţi scăzute (Sekiya 2001),
cuprinse intre 1x104 şi 0.4x106 celule/cm2 (McBride 2003). Condiţiile de cultură influenţează,
atât morfologia (Tropel 2004), cât şi fiziologia celulei. La densităţi scăzute celulele îşi păstrează
aspectul fusiform, însă în confluenţă cultura se stratifică iar celulele se aplatizează (Bobis 2006).
Culturile MSC prezintă trei etape de dezvoltare (Fig. 9.2) similare oricărei culturi de
celule progenitoare, ce se succed ca urmare a modificări a două tipuri de gene (Wnt5a şi Dkk-1)
(Gregory 2003). Durata de viaţă în cultură este limitată, cu toate că Pittenger (1999) a arătat că
celulele izolate din MO îşi menţin starea de nediferenţiere când sunt cultivate in vitro pe
perioade lungi, iar celulele izolate din aceste culturi pot fi diferenţiate osteogenic, adipogenic şi
condrogenic. Celulele pot fi dublate de aproximativ 50 de ori fără a fi afectată capacitatea de
diferenţiere (Ramalho Santos 2002). Examinarea ciclului celulelor din cultură a evidenţiat
existenţa a două populaţii: cca 10% din celule se găsesc în interfază, iar restul în faza G0/G1
(Cognet 1999), ambele prezentând un cariotip normal până la pasajul 12 (Pittenger 1999).

Fig. 9.2. Fazele dezvoltării unei culturi MSC. (Gregory 2003)

Factorii ce influenţează evoluţia MSC în cultură sunt: timpul de ischemie (scurs de la


recoltare/eutanasia animalului de laborator până la contactul cu mediul de cultură – cu cât mai
scurt cu atât mai bine), temperatura substanţelor de lucru (nu mai scăzută faţă de temperatura
camerei), tipurile şi cantităţile de medii folosite, tipurile de substanţe adjuvante utilizate (factori
de creştere, citokine etc.). (da Silva 2006)
Proliferarea în cultură este condiţionată de mai mulţi factori. PDGF, FGF-2 şi EGF
stimulează mitoza acestor celule în timp ce interferonul-alfa şi IL-4 o inhibă (Bruder 1997). Un
mecanism ce favorizează mitoza împiedicând diferenţierea acestor celule este reprezentat de
acţiunea HB-EGF (heparin-binding epidermal growth factor) pe receptorul său HER-1 de pe
suprafaţa MSC (Krampera 2005), fiind astfel un ax critic pentru multiplicarea şi diferenţierea
MSC.
Totuşi cel mai important rol pentru cultură, aşa cum susţine Lennon, îl are serul fetal
bovin (FBS), a cărui prezenţă este esenţială pentru menţinerea potenţialului de diferenţiere
(Dennis 2004).

9.2.1 Metoda de cultură în Cell Factory

Modulele Cell Factory (Fig. 9.3) sunt utilizate pentru culturi la scală mare, pentru
obţinerea de celule necesare biomaterialelor, vaccinurilor etc. Avantajul acestor module, constă
în posibilitatea de a cultiva un număr mare de celule într-un spaţiu redus.
Un astfel de modul este compus din numeroase tăviţe de cultură, suprapuse şi închise
într-un mediu izolat, limitând astfel contaminarea. Suprafaţa acestora este tratată special,
facilitând aderarea celulelor.

  66 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 9]                                                                                                                                      Cultivarea MSC 

Modulele sunt alimentate şi golite de conţinut prin intermediul a doi conectori situaţi
peste nivelul mediului din cultură, şi implică schimbarea poziţiei modului pentru a facilita
contactul conector-mediu.
Există două metode pentru însămânţarea, hrănirea şi recoltarea celulelor (Anexa III).
Acestea se pot face în sistem închis sau deschis, în funcţie de modul în care este manipulat
modulul. Modul deschis este mai ieftin, cel închis utilizând mai multe consumabile. Însă este de
preferat ca sistemul închis să fie utilizat atunci când celulele urmează a fi utilizate în studii
experimentale umane.

Fig. 9.3. Sistemul de cultură Cell Factory.

9.3 Expansiunea în cultură

Aprecierea calităţilor MSC este un proces laborios ce implică mai multe criterii.
O caracteristică importantă a MSC este clonogenitatea, tradusă prin capacitatea fiecărei
celule de a forma colonii fibroblast-like atunci când sunt cultivate. În mod obişnuit MSC sunt
clonogene, atunci când sunt însămânţate în cultură în cantităţi mari (densitate crescută, densitate
non-clonală), ceea ce face ca analiza acestor tipuri de culturi non-clonale să fie lipsită de
însemnătate (Bianco 2008).
Teoretic orice celulă stem mezenchimală adevărată din MO este clonogenă, însă orice
celulă clonogenă din MO nu este celulă stem, întrucât numai o parte din CFU-F sunt
multipotente în urma transplantării in vivo (Gronthos 2003).
Deşi nu există marker-i pentru diferenţierea CFU-F multipotente de celelalte tipuri cu
potenţial restricţionat, frecvenţa cu care CFU-F apar în cultură constituie un indiciu destul de bun
asupra aprecierii unei probe de MO.
MSC clonogene pot fi selectate din populaţie pe baza unor marker-i de suprafaţă precum
Stro-1 (Simmons şi Torok-Storb 1991). Cu toate acestea se pare că diferenţa între populaţiile
rezultate prin această metodă şi cele realizate pe baza aderenţei sunt minime, având aceeaşi
importanţă practică (Sacchetti 2007).
Celule aderente de tipul CFU-F, capabile a creşte în cultură indiferent de densitatea la
care au fost însămânţate au fost identificate în numeroase ţesuturi non-hematopoietice precum
periostul şi pulpa dentară chiar cu o frecvenţă mai mare ca în MO. Totuşi, se apreciază că această
frecvenţă este relativă, întrucât în MO densitatea CFU-F este stabilită în raport cu numărul
celulelor hematopoietice, iar în aceste ţesuturi numărul acestora este foarte scăzut (Bianco 2008).
În laborator, culturile de MSC pot fi obţinute în urma însămânţării la densitate clonală
sau non-clonală. Compoziţia populaţiilor rezultate este diferită între cele două metode. Deşi în
general metoda non-clonală este utilizată mai des, ea generează o populaţie impură, care pe lângă

  67 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 9]                                                                                                                                      Cultivarea MSC 

MSC conţine şi celule aderente non-clonogene cu potenţial de creştere limitat, în timp ce prin
metoda clonală se obţine o populaţie descendentă din CFU-F (Bianco 2008).
Este interesant de reţinut că totuşi omogenitate culturilor clonale este relativă, deoarece
cinetica celulară face să existe în acelaşi moment în cultură celule diferenţiate, senescente sau
apoptotice provenite din progenitorii iniţiali. Acest fapt face ca nici culturile comerciale de MSC
să fie cu adevărat omogene ci mai degrabă sunt descrise ca şi culturi de MSC ce pot conţine o
cantitate variabilă de celule multipotente cu proprietăţi de autoreînnoire (i.e. stem).
Pentru selecţia unei populaţii pure MSC este necesară existenţa unui marker fenotipic al
„stemness-ului”. Însă testul suprem de diagnostic este reprezentat de studiul diferenţierii in vivo
al celulei selectate in vitro pe baza acelui marker care trebuie să fie comun şi celulelor in vivo.
La acest moment un astfel de marker nu există, ceea ce face ca îndoiala să planeze asupra
oricărei culturi de BM-MSC, fără a şti dacă favorizează dezvoltarea MSC sau a întregii populaţii
CFU-F (Bianco 2008).

9.4 Potenţialul de diferenţiere

Potenţialul celulelor din compartimentul stromal al MO (BM-MSC) este controversat,


chiar şi acum după numeroase studii de specialitate.
Deşi studiile lui Friedenstein şi ale altora au arătat că populaţia BM-MSC conţine un
subtip de celule cu caracteristici de multipotenţă (i.e. îndeplineşte un criteriu al celulelor stem),
această multipotenţă este limitată, fiind capabilă de diferenţiere în celule scheletale cu
specificitate de ţesut (osteoblaste – os; condrocite – cartilaj; adipocite – stroma MO; fibroblaste –
periost; celule reticulare adventiceale – stroma MO).
Studiind căile de diferenţiere multiliniară a MSC, Okamoto (2002) a utilizat MSC
„imortalizate” prin transfecţia cu genele E6/E7 HPV, şi a observat că populaţia este eterogenă
conţinând celule uni-, bi- şi tripotente.
Cu toate că există rezultate care indică că aceste celule pot produce şi alte tipuri de celule
mezodermale (fibre musculare striate, netede, cardiomiocite, celule endoteliale) acestea nu sunt
obiective, întrucât studiul nu a implicat transplantul unei singure celule şi urmărirea ei in vivo,ci
a unei populaţii de celule, fiind astfel contestat.
Incertitudini există şi asupra potenţialului de diferenţiere transgermală a BM-MSC
(Beltrami 2007), astfel încât se recomandă utilizarea termenului de „celule stem scheletale”
pentru a denumi celulele multipotente stromale aderente fibroblast-like derivate din MO,
capabile de a produce celule de tip scheletal in vivo (Bianco 2008).
În ceea ce priveşte comportamentul şi potenţa celulelor aderente capabile de creştere în
cultură indiferent de densitatea de însămânţare, acestea sunt diferite între celulele stromale ale
MO şi ale altor organe. Astfel, aceste celule, denumite tot CFU-F (de origine non-
hematopoietica), se comportă diferit în urma transplantării in vivo. Spre exemplu CFU-F din
pulpa dentară tind spre diferenţiere în dentină atunci când sunt inoculate in vivo în aceleaşi
condiţii ca şi BM-MSC (Gronthos 2002).
Acest comportament sugerează mai degrabă că populaţia celulelor stromale fibroblast-
like (MSC), cuprinde mai multe tipuri de progenitori localizaţi în diferite ţesuturi ce au potenţă
specifică ţesutului de origine, decât o singură clasă de MSC ubicuitare (Bianco 2008).
Deşi marea majoritate a acestor celule stromale a fost caracterizată in vitro din punct de
vedere al multipotenţei, rezultatele obţinute se corelează slab cu cele in vivo (Bianco 2006).
Astfel, multipotenţa (proprietate a unei singure celule, nu a unei populaţii) nu poate fi evaluată
corect în culturi non-clonale. Acestea fiind spuse, exprimarea unor marker-i specifici de linie
precum depozitele de alizarin (fenotipul osteogenic), afinitatea pentru marcajul cu oil red O
(fenotipul adipogenetic) sau prezenţa matricei cu afinitate pentru colorarea cu albastru alcian
(fenotipul condrogenic), identificaţi în paralel în culturile non-clonale de BM-MSC, nu constituie
un test apt a confirma multipotenţa (Bianco 2006) (Gronthos 2002), necontribuind la asumarea
caracterului de cultură de celule stem mezenchimale.

  68 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 9]                                                                                                                                      Cultivarea MSC 

9.5 Evaluarea capacităţi de self-renewal

Pe lângă testele in vitro de caracterizare a multipotenţei, şi criteriile de evaluare a


proprietăţii de self-renewal sunt contestate.
Clasic această însuşire se evaluează indirect, prin capacitatea de creştere a culturii şi/sau
prin capacitatea culturii respective de a-şi menţine in vitro stadiul de diferenţiere.
Datele din literatură consideră că la acest moment singurele celule stem ce beneficiază de
o caracterizare indubitabilă a capacitaţii de self-renewal sunt celulele stem hematopoietice, care
au demonstrat in vivo capacitatea de susţinere a hematopoiezei pe toată durata vieţii şoarecilor
iradiaţi letal (Osawa 1996).
Pa lângă aceasta se postulează că in vivo această caracteristică se evaluează prin
capacitatea celulelor introduse de a forma un compartiment fenotipic separat identic cu fenotipul
celulelor inoculate.
Recent, prin studiile lui Dominici (2006) şi Horwitz (2005) s-a demonstrat că populaţia
de BM-MSC conţine şi celule stem bona fides (i.e. adevărate; lat. de bună credinţa).
Rămâne de evaluat dacă şi celelalte populaţii de celule stromale din alte ţesuturi
mezenchimale prezintă celule stem bona fides, cu capacitate de self-renewal demonstrabilă.

9.6 Marker-i folosiţi pentru identificarea şi izolarea MSC

Separarea, izolarea şi identificarea MSC foloseşte pe lângă procedeele fizice şi


capacitatea de aderarea a MSC, o serie de reacţii de identificare a anumitor marker-i structurali
sau funcţionali. Cu toate că reprezintă o unealtă utilă pentru caracterizarea MSC, marker-i nu
sunt incontestabili, astfel încât nu există până la acest moment un marker specific pentru MSC,
deşi există mai mulţi posibili candidaţi.
Marker-i sunt proteine specializate ce acoperă suprafaţa celulelor, funcţionând ca
receptori şi având capacitatea de a se lega selectiv de anumite molecule semnal. In vivo rolul lor
este de a intermedia relaţia celulei cu mediul înconjurător contribuind la relaţionarea cu celelalte
celule şi la realizarea evenimentelor fiziologice. Ei diferă prin structură şi prin afinitatea faţă de
moleculele semnal din mediu, constituind în ansamblul lor o amprentă specifică celulei. Deşi un
marker poate fi întâlnit pe suprafaţa mai multor tipuri celulare, luaţi în ansamblu, receptorii de pe
suprafaţa unei celule îi conferă caracter de unicitate ce poate fi speculat pentru identificarea
acesteia. (Department 2001)
În mod curent se folosesc mai mulţi receptori simultan pentru caracterizarea unei celule.
Aceştia dau identitate unei celule prin prezenţa sau absenţa lor de pe suprafaţă. Astfel, o celulă
stem poate să nu prezinte marker-ul CD34 (este CD34-) sau poate să exprime receptorul Sca-1
(este Sca-1+). În acest sens o amprentă fenotipică a unei celule poate arăta astfel: CD34-/low, c-
Kit+, Sca-1+ (amprentă specifică subpopulaţiei de celule stem numite SP- side population).
(Department 2001)
Practic, identificarea receptorilor se realizează prin utilizarea unor sonde fluorescente
fixate de o moleculă (moleculă semnal) care are specificitate numai pentru receptorul căutat,
vizualizate în lumina UV sau laser (Fig. 9.4). (Department 2001)
Bazându-se pe această metodă, cea mai folosită tehnică de identificare este tehnica FACS
(fluorescence-activated cell sorting) (Fig. 9.4). Prin aceasta se pot separa celulele pe baza
prezenţei anumitor receptori, astfel încât se obţin populaţii fenotipic pure.
O altă metodă ce utilizează sondele fluorescente pentru identificarea receptorilor de
suprafaţă constă în identificarea acestora pe secţiuni de ţesut (ex vivo). Această tehnică este
utilizată în special pentru identificarea celulelor stem posttransplant, însă poate fi utilizată şi pe
celule din cultură.
O altă clasă de marker-i este reprezentată de gene şi factorii de transcripţie (proteine
intracelulare ce reglează activitatea genelor). Aceştia sunt identificaţi prin PCR (polymerase
chain reaction) şi DNA microarray.

  69 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 9]                                                                                                                                      Cultivarea MSC 

Relativ recent, o nouă tehnică de identificare a celulelor stem a apărut, combinând


fluorescenţa şi ingineria genică. Se bazează pe inserţia genelor reporter în genomul celulelor
stem. Gena reporter (ex. GFP – green fluorescence protein) „raportează” atunci când celula este
nediferenţiată şi îşi încetează activitatea când aceasta se diferenţiază. Spre exemplu gena pentru
GFP emite o fluorescenţă verde atunci când celula stem este nediferenţiată. (Department 2001)

Fig. 9.4. Tehnica FACS. (Departament 2001)


Separarea se face cu ajutorul unui fascicul laser şi al unui câmp electric ce selectează din totalul
celulelor din amestec numai pe cele marcate fluorescent pentru un anumit receptor.

MSC reprezintă o populaţie eterogenă din punct de vedere al morfologiei, fiziologiei şi


antigenelor de suprafaţă. Acestea produc o gamă variată de molecule de adeziune, proteine
matriceale extracelulare (fibronectină, laminină şi vimentină), citokine, factori de creştere,
receptori ai factorilor de creştere (Devine 2000) şi antigeni caracteristici altor tipuri celulare
(Bobis 2006). În plus, expresia marker-ilor depinde de substanţele utilizate pentru prelucrarea
celulelor: e.g. CD49d este exprimat când se utilizează EDTA, şi încetează a fi exprimat în
prezenta EDTA + tripsină (da Silva 2006).
MSC sunt considerate încă o populaţie eterogenă fenotipic pentru două motive: (1) încă
de la primele rezultate ale lui Friedenstein s-a observat că nu toate CFU-F sunt înalt proliferative
şi prezintă un potenţial multiplu de diferenţiere, (2) în mod curent se utilizează un panel restrâns
de marker-i pentru identificarea MSC in vivo. (Jones 2008)
Deşi s-a crezut că prezenţa anumitor marker-i poate facilita identificarea şi catalogarea
unor celule ca fiind MSC, acest lucru este discutabil, întrucât o mare varietate de celule
fibroblast-like din ţesuturi variate exprimă marker-ii utilizaţi curent, astfel încât aceştia nu sunt
specifici MSC.
Setul clasic de marker-i pozitivi şi negativi este bogat însă cu specificitate moderată (Tab.
9.1, Fig. 9.5). În mod curent se foloseşte asocierea mai multor astfel de antigene pentru
caracterizarea MSC.
Absenţa antigenelor CD14, CD34 şi CD45, constituie testul de bază pentru a diferenţia aceste
celule de precursorii hematopoietici (Baddoo 2003). Cu toate acestea, MSC izolate din MO sunt
CD34+, însă îşi pierd acest marker prin cultura in vitro. Un marker mai specific este considerat
CD50 care este specific numai HSC. (Waller 1995).
Pe lângă aceste antigene, MSC prezintă pe suprafaţă şi o serie de receptori ce mediază
interacţiunea celulă-matrice sau celulă-celulă, de tipul integrinelor (αVβ3 şi αVβ5), ICAM-1,
ICAM-2, LFA-3 şi L-selectina (Boiret 2005, Cognet 1999, Pittenger 1999).

  70 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 9]                                                                                                                                      Cultivarea MSC 

Tab. 9.1. Marker-i pentru BM-MSC.


Marker-i pozitivi Marker-i negativi
CD10, CD13, CD29, CD44, CD49b, CD49c, CD106 (VCAM-1), CD11b, CD14, CD15, CD18 CD31,
CD166, CD29,CD71, CD73 (SH3 şi SH4), CD90 (Thy-1), CD105 CD33, CD34,CD56, CD133, CD45, c-
(SH2, endoglin), STRO-1, Sca-1, CD80, Flk-1/CD309, CD271 kit,CD80, CD86, CD117, CD40,
(LNGFR) ALK-3 şi ALK-6, BMPR-II, CDCP1, CD51, Nucleostemin, CD40L, FAS-L, H-2Kb, glycophorin-
c-kit, GD2 A, I-Ab
după Baddoo 2003, Boiret 2005, Cognet 1999, Dennis 2002, Gronthos 2003, Asari 2009,
Chamberlain 2007, Jones 2008, Pittenger 1999, Roorda 2009, Asari 2009, Chamberlain 2007
Informaţiile provin din studii efectuate pe mai multe specii. A se lua în calcul variaţiile specie-specifice.

Utilizarea marker-ilor se poate face pentru selecţia negativă sau pozitivă a MSC. Selecţia
pozitivă presupune identificarea unor structuri ce se găsesc la nivelul MSC, în timp ce selecţia
negativă elimină din amestecul de populaţii celulare acele celule ai căror marker-i utilizaţi sunt
specifici doar lor şi nu MSC. Metoda selecţiei negative, îndepărtează din populaţia specimenului,
celulele hematopoietice cu ajutorul marker-ilor specifici acestora: CD31, CD34, CD1 (Rickard
1996).
De-a lungul timpului au fost identificate mai multe structuri, a căror identificare
contribuie la izolarea unor celule cu fenotip pur MSC.
Primul panel de marker-i utilizat, cuprinde 4 structuri: Stro-1, SH2, SH3 şi SH4. Iniţial,
ultimii 3 marker-i au fost consideraţi specifici MSC (Haynesworth 1992b). Studiile ulterioare au
arătat că anticorpul SH2 se leagă de un receptor clasa III pentru TGF-β (Barry 1999), comun
MSC, macrofagelor şi celulelor endoteliale (Dennis 2004), iar Stro-1 reacţionează încrucişat cu
alte celule de la nivelul MO, astfel încât utilizarea lui pentru BM-MSC este restricţionată (Jones
2008).
Ulterior au fost propuse mai multe panel-uri de marker-i utili izolării şi identificării MSC.
Astfel, Pittenger (1999) sugerează că expresia simultană a CD73 şi CD105 este suficientă.
Alsalameh (2004) consideră că expresia CD166 şi CD105 face posibilă izolarea unor precursori
MSC din populaţia celulară matură. În contradicţie cu acestea, analiza CFU-F obţinute din
stroma MO sugerează că MSC pot fi identificate prin marker-i precum: Stro-1, Thy-1, CD49a,
CD10, Muc18/CD146, receptorul pentru PDGF şi EGF (Baddoo 2003, Bonyadi 2003, Dennis
2002, Gronthos 2003, Pittenger 1999). Un alt grup de marker-i utili selecţiei CFU-F din
populaţia celulară a MO, include pe lângă Stro-1 şi marker-ii MCAM şi CD105. Alţi marker-i
utilizaţi pentru MSC din MO: Stro-1 + CD106 (VCAM-1) (Gronthos 2003), profilul
CD34+Sca1+Lin– (selectează MSC capabile de diferenţiere adipogenică, osteogenică,
condrogenică şi miogenică) (Department 2001), glycophorin-A-Stro-1+ (Gronthos 2003), CD105
+ CD73 (Haynesworth 1992b), CD271 (LNGFR – low affinity nerve growth factor receptor; a
izolat celule cu o capacitate de proliferare de cca 1000 de ori mai mare ca a MSC izolate clasic)
(Quirici 2002), W8B2 (Buhring 2007), SSEA-1 şi 4 (stage specific embryonic antigen – marker
pentru celulele mezenchimale medulare primitive umane şi murine) (da Silva 2008), CD271 +
CD56 + MSCA-1 (Battula 2009).

  71 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 9]                                                                                                                                      Cultivarea MSC 

Fig. 9.5. Marker-i specifici MSC şi pericitelor umane. (da Silva 2008)
Mixt - se întâlneşte la om şi animale; Specie non-umană - se întâlneşte doar la animale. 

Un alt profil utilizat poate fi CD45lowCD271+ care este în acelaşi timp pozitiv şi pentru
CD73, CD90 şi CD105. Acest profil contribuie la identificarea unui fenotip medular nou care
respectă criteriile recente privind morfologia MSC proaspăt recoltate (celule mari, cu nucleoli
proeminenţi şi proiecţii veziculare). (Jones 2008)

  72 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 9]                                                                                                                                      Cultivarea MSC 

Totuşi, cel mai folosit marker este Stro-1 (Simmons 1991), fiind folosit cu precădere
pentru izolarea şi identificarea MSC medulare. Celulele izolate folosind acest marker nu
formează colonii CFU-F (Simmons 1991) dar au dovedit proprietăţi osteogenice (Gronthos
1994), condrogenice, adipogenice şi de suport hematopoietic (Dennis 2002), caracteristice MSC.
Cu toate acestea, Stro-1 nu este specific MSC, iar prin cultivarea celulelor se pierde (da Silva
2008).
Cu toate că MSC din cultură beneficiază de anumiţi marker-i pentru caracterizare, foarte
puţini sunt cunoscuţi pentru pentru MSC proaspăt izolate (non-expandate în cultură). În acest
sens studiul lui Boiret (2005) a evidenţiat că pentru MSC din culturile tinere (1-3 zile de
aderenţă) principalii marker-i sunt reprezentaţi de CD73 (100%) şi CD49a (95.2%). Aceleaşi
antigene au fost găsite extensiv şi în preparatele de MSC proaspăt izolate din MO. Aceste
rezultate contestă antigenele CD105 şi CD90 împreună cu Stro-1 ca fiind exprimate exclusiv de
precursorii mezenchimali (Bobis 2006).
Expresia antigenelor de suprafaţă, precum şi a altor factori exprimaţi de către MSC,
prezintă o stare dinamică astfel încât aceştia nu sunt prezenţi pe suprafaţa celulei pe toată durata
vieţii acesteia. Mai mult, prezenţa factorilor de suprafaţă variază datorită condiţiilor de cultură
(Dazzi 2006). În acest sens antigenul CD34 (marker clasic hematopoietic) este prezent pe
suprafaţa MSC proaspăt izolate din plămânul fetal de şoarece însă este absent în cultura in vitro
(Fibbe 2003) dispărând probabil în cursul procesului de maturare (Bobis 2006). Aceeaşi situaţie
a fost observată şi în cazul receptorilor (CCR1, CCR7, CCR9, CXCR4, CXCR5, CXCR6)
exprimaţi de către MSC din MO în timpul pasajului 2, pentru ca în pasajul 12-16 expresia
acestora să dispară complet (Honczarenko 2006). Lipsa expresiei acestor factori a fost însoţită de
scăderea expresiei moleculelor de adeziune (ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, CD157) asociată cu
încetinirea ciclului celular şi activarea cascadei apoptotice (Honczarenko 2006).
Variabilitatea antigenică a fost descrisă şi în cadrul diferenţierii MSC. CD166, exprimat
de MSC nediferenţiate este absent pe suprafaţa celulelor diferenţiate osteogenic din MSC
(Bruder 1998).
Aceeaşi variabilitate se manifestă şi în cazul MSC izolate din ţesuturi sau de la specii
diferite. Analiza realizată de Katz (2005) a descoperit existenţa unor similarităţi între MSC
izolate din MO şi ţesutul adipos (AD-MSC), însă AD-MSC au prezentat în plus expresia
antigenelor CD49d, CD62e şi CD31(Katz 2005, Gronthos 2001). Spre deosebire de MSC umane
care sunt CD34-, MSC murine au o expresie variabilă a acestui marker. În plus, nu trebuie uitat
faptul că profilul fenotipic al MSC depinde de factorii secretaţi de celulele accesorii din cultura
primară şi că marker-ii in vitro nu se corelează neapărat cu cei in vivo (Chamberlain 2007).
Este important ca utilizarea unor marker-i pentru purificarea MSC să se ţină cont şi de
ţesutul de provenienţă. Deşi s-a considerat că CD73, CD105, CD90 şi CD44 sunt specifici pentru
MSC, s-a observat că aceştia sunt exprimaţi şi de fibroblaste, astfel încât aceştia cel mult
orientează dacă celulele obţinute sunt non-hematopoietice şi stromale. Astfel, întrucât nu există
un marker specific MSC, este preferabil ca pentru izolarea MSC din MO să se utilizeze marker-i
cu specificitate diferită de ţesutul de origine (e.g. pentru MO se poate utiliza D7-FIB, CD10 şi
CD13 – marker-i şi pentru fibroblaste – deoarece în MO majoritatea celulelor sunt de natură
hematopoietică şi nu fibroblastică). Un alt marker ce poate fi aplicat pentru placentă este SSEA-
4. (Jones 2008)
Toate aceste observaţii sugerează că MSC sunt eterogene fenotipic, putând cunoaşte
variaţii ce depind de specie, tip de ţesut, mediu de cultură, prezenţa altor celule în cultură şi de
factorii umorali din cultură.
Treptat utilizarea marker-ilor se extinde şi la uzul in situ, în vederea identificării
omoloagelor CFU-F şi urmărirea acestora cu scopul studiului diferenţierii. În acest sens marker-
ul MCAM este foarte potrivit.
Până la acest moment, mai multe studii au prezentat MCAM ca un marker comun MSC,
celulelor adventiceale reticulare (Sacchetti 2007) (Westen şi Bainton 1979) şi pericitelor (Li
2003). Este interesantă această asociere sub aspectul că pericitele sunt bănuite a avea rol de
progenitor al MSC postnatale.

  73 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 9]                                                                                                                                      Cultivarea MSC 

Având în vedere ubicuitatea pericitelor şi că acestea pot reprezenta omoloagele in vivo


ale CFU-F, se poate afirma că de fapt pericitele sunt MSC, iar MCAM poate fi util în
identificarea CFU-F din alte ţesuturi ca fiind pericite sau nu. Astfel, va fi posibil să se
demonstreze ipoteza conform căreia MSC sunt răspândite în toate ţesuturile conjunctive sub
forma pericitelor.
În concluzie, se consideră că MSC nu au marker-i unici şi specifici de suprafaţă (da Silva
2008). Cu toate acestea se recomandă ca pentru caracterizarea MSC să se utilizeze criteriile
ISCT: celule aderente pozitive CD105, CD73 şi CD90, negative CD45, CD34, CD14/11b,
CD79a/CD19 şi HLA-DR, cu potenţial de diferenţiere osteo, condro şi adipogenică.

9.7 Culturi primare vs. linii celulare

Liniile celulare şi culturile primare sunt două surse pentru obţinerea de MSC utile
analizei lor.
Liniile celulare, sunt celule MSC obţinute prin diferite tehnici de selecţie şi inginerie
celulară care au capacitatea de a se multiplica în cultură de-a lungul a numeroase pasaje,
nelimitat (au un comportament similar ESC), fiind practic nemuritoare în cultură, în timp ce
culturile primare provin din izolarea MSC din diferite ţesuturi, dar cu o viaţă a culturii limitată
de procesul de senescenţă şi apoptoză.
Cele două, sunt diferite ca metodă, chiar mai mult, celulele obţinute printr-o metodă sunt
diferite faţă de cele obţinute prin cealaltă metodă. Astfel, se naşte o sumă de critici, în special la
adresa utilizării liniilor celulare în scopuri de cercetare. Capacitatea de proliferare nelimitată,
imortalitate, face ca liniile celulare să fie diferite fenotipic de celulele din care au fost obţinute,
care sunt celule muritoare (Dennis 2004). Termenul de „imortalizare” este sinonim cu
transformarea celulelor primare în linie celulară, ilustrând astfel capacitatea celulelor de a se
divide nelimitat (Dennis 2004).
Deşi există un număr apreciabil de linii celulare MSC în diverse laboratoare, acestea au
fost descoperite întâmplător. Multe dintre ele au fost izolate din MSC fără a se cunoaşte acest
fapt (Dennis 2004) din dorinţa de a analiza componenta stromală suportivă a hematopoiezei
(Deryugina 1993), dovedindu-se că au caracteristici MSC. Astfel, este cazul liniei MBA-15
(Benayahu 1989), care este osteogenică, al liniei MBA-1 care este condrogenică (Benayahu
1989) şi osteogenică, şi al liniei BMS2 (Pietrangeli 1988) – adipogenică şi suportivă a
limfocitelor în cultură.
Se apreciază că metodele de selecţie şi izolare a liniilor celulare au o mare importanţă sub
aspectul genotipic şi fenotipic al celulelor rezultate. Astfel, numeroase linii celulare murine sunt
selectate în urma transformării lor spontane în cultura primară. Procesul de selecţie se bazează pe
supravieţuirea unor celule modificate spontan în cultura primară senescentă. Unele celule nu se
mai divid, îmbătrânesc şi mor, în timp ce altele supravieţuiesc acestei „crize senescente”
căpătând însuşirea de imortalitate, de multiplicare nelimitată, datorită modificărilor genetice
spontane ce au loc în cultură sub forma mutaţiilor şi aberaţiilor cromozomiale, ce cauzează acest
comportament (Dennis 2004). Spre deosebire de acestea, transformate in vitro, anumite linii
celulare sunt izolate din celule tumorale diferenţiate in vivo.
Inducerea caracterului de imortalitate, se poate realiza prin intervenţie agresivă,
cunoscută la nivelul genomului celulelor din cultura primară. O astfel de metodă de
„imortalizare” constă în inducerea genei „SV-40 large T antigen” (Takahashi 1995), însă
influenţa pe care o are asupra fiziologiei celulare nu este documentată pe termen lung.
O metodă elegantă de imortalizare constă în utilizarea genelor „condiţionate”. Astfel,
condiţiile din cultură pot fi influenţate, condiţionând la rândul lor comportamentul celulei. O
astfel de genă este gena termosensibilă pentru SV-40 large T antigen. Temperatura de 33ºC
favorizează expresia genei, în timp ce intervalul 37-39ºC o inactivează. Un pas mai departe a fost
făcut prin inserarea unui promotor capabil de a creşte nivelul expresiei genei în prezenţa unor
substanţe exogene. Acest „produs”, ce are ca promotor un antigen din clasa I de

  74 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 9]                                                                                                                                      Cultivarea MSC 

histocompatibilitate ce are în componenţa sa un element sensibil pentru gama interferon, cuplat


cu gena termosensibilă pentru SV-40 large T antigen, a fost inoculat genomului murin
obţinându-se astfel specia transgenică H-2KbtsA58 (Jat 1991), numită şi „imortomouse”. Deşi nu
toate celulele acestui transgen se comportă identic, avantajele folosirii lor rezidă din faptul că are
o singură genă modificată, exprimată condiţional, ce nu afectează dezvoltarea organismului.
Totuşi, nu trebuie uitat că celulele unui astfel de transgen nu sunt identice cu cele izolate în
populaţia normală, ele exprimând acea genă, a cărei influenţă asupra fiziologiei celulare nu se
cunoaşte (Dennis 2004).
Izolarea MSC din MO a acestui transgen a pus în evidenţă mai multe populaţii MSC cu
potenţial variabil de la unipotenţial până la cvadripotenţial (cu referire la capacitatea osteo,
condro, adipogenică şi de suport hematopoietic) (Dennis 1996) (Dennis 1999).
Gena pentru large T antigen a fost utilizată şi pentru obţinerea de linii celulare umane
(Hicok 1998), ce au demonstrat potenţial osteoblastic şi adipogenic.

9.8 Evaluarea MSC şi a proprietăţilor lor

Caracterizarea MSC constituie o problemă larg dezbătută, întrucât la acest moment nu se


poate vorbi de un set de teste valid, care să realizeze o identificare şi caracterizare irefutabilă a
MSC.
Deşi se cunosc câteva principii de bază, derivate din studiile experimentale, pentru
caracterizarea celulelor stem în general, nu există date suficiente care să caracterizeze fără
echivoc fenotipul stem al MSC. Aceste principii sunt următoarele: (1) stemness-ul este dovedit
in vivo; (2) multipotenţa unei celule este o caracteristică ce trebuie demonstrată la nivel de celulă
individuală, in vivo,şi nu la nivel de cultură; (3) capacitatea de self-renewal reprezintă
proprietatea unei celule stem de a se divide asimetric formând o populaţie de celule stem cu
fenotip identic cu cel al celulei iniţiatoare, şi nu este similară cu capacitatea unei populaţii de
celule de a forma o cultură, chiar cu fenotip identic.

9.9 Caracterizarea plasticităţii MSC

Studii recente au arătat că ţesuturile mezenchimale sunt mult mai plastice (capabile de
transdiferenţiere şi dediferenţiere) decât s-a crezut iniţial (Dennis 2004).
Rezultatele experimentale au ridicat problema plasticităţii fenotipice (Herzog 2003) ca urmare a
observaţiei că celulele stromale medulare se pot diferenţia în fenotipuri specifice sistemului
nervos, sistemului muscular, ţesutului hepatic, ţesutului cardiac.
Pentru susţinerea acestei afirmaţii mai multe studii au dovedit această caracteristică a
MSC (e.g. Bennett a demonstrat că adipocitele se pot diferenţia în osteoblaste (Bennett 1991)).
O observaţie ce validează plasticitatea celulelor şi ţesuturilor mezenchimale, constă în
suprapunerea şi întrepătrunderea fenotipurilor celulelor stromale medulare (Dennis 2004). Astfel,
unele celule izolate din MO murină au dovedit capacitaţi osteogenice, condrogenice şi
adipogenice fără a demonstra că favorizează formarea osteoclastelor (celule derivate din linia
hematopoietică), în timp ce altele favorizează formarea osteoclastelor fără a fi osteogenice
(Dennis 2004). Parcurgând datele din literatură se poate observa descrierea a numeroase
permutaţii posibile de diferenţiere, ce ilustrează plasticitatea celulelor mezenchimale.
Pentru explicarea acestei nestatornicii fenotipice au fost propuse mai multe modele ce
ilustrează diferenţierea MSC, inclusiv cu specificaţii detaliate pentru fiecare cale de diferenţiere
(Minguell 2001), cuprinzând şi modele cumulative, intersectate.
Din această ultimă categorie face parte modelul lui Gimble (1996) (Fig. 9.6). Acesta are
în centru celula de suport stromal, ca progenitor timpuriu al celorlalte linii mezenchimale. Cu
toate că există o suprapunere a fenotipurilor, acest model este incomplet deoarece nu cuprinde şi
transformările plastice ale celulelor mature (Dennis 2004).

  75 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 9]                                                                                                                                      Cultivarea MSC 

Fig. 9.6. Modelul de diferenţiere al


lui Gimble. (Dennis 2004)

Un model teoretic ce ţine cont de această insuficienţă a modelului lui Gimble, este cel a
lui Dennis şi Charbord (2002) (Fig. 9.7). În cadrul acestui model, evoluţia liniilor celulare se
desfăşoară în două compartimente: cel progenitor, în care au loc toate fenomenele legate de
variabilitatea potenţei MSC, şi compartimentul de diferenţiere, ale cărui celule provin din
compartimentul progenitor, dar răspund la stimuli externi, descriind plasticitatea celulelor fixate
într-o linie celulară matură ce pot schimba linia fenotipică. Cele două compartimente nu sunt un
spaţiu fizic delimitat strict la nivel medular ci unul virtual. Mai exact, compartimentul progenitor
reprezintă o stare genetică a potenţialului de diferenţiere. Avantajul acestui model, numit
„Modelul activării/represării stocastice”, constă în capacitatea de a ţine cont de toate
posibilităţile plastice caracteristice MSC (Dennis 2004)
Cu toate acestea, nu se cunoaşte dacă există o singură celulă stem mezenchimală ce dă
naştere la celule diferenţiate mezenchimale sau dacă există un amestec de progenitori pentru
fiecare linie celulară mezenchimală şi non-mezenchimală, reuniţi în populaţia MSC (Bobis
2006).
Studiile in vitro şi in vivo nu au gasit un răspuns unitar la această problemă, ci oferă
rezultate contradictorii. Dacă la început s-a crezut că MSC se pot diferenţia doar în celule
mezodermale, rezultatele actuale au arătat că MSC pot produce şi celule specifice ţesuturilor
non-mezodermale.
Până acum au fost obţinute celule precum: osteoblaste, adipocite, condrocite, fibroblaste,
mioblaste, cardiomiocite, hepatocite, tenocite, neuroni (Bobis 2006).
Deşi nu au fost identificate clar celulele responsabile de diferenţierea multiliniară a
celulelor stromale izolate din MO, bănuielile sunt îndreptate asupra MSC ca urmare a capacităţii
lor de a produce numeroase fenotipuri in vitro specifice mezodermului (Pittenger 1999),
ectodermului (Kopen 1999) şi endodermului (Sato 2005).
În ceea ce priveşte identitatea celulelor responsabile de acest comportament, lucrurile
sunt complicate şi de existenţa mai multor populaţii celulare similare: MAPC – multipotent adult
progenitor cells (Reyes 2001), MIAMI – marrow isolated adult multilineage inducible cells
(D’Ippolito 2004), RS-1 şi RS-2 (recycling stem cells) (Colter 2000) – toate localizate la nivel
medular.

  76 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 9]                                                                                                                                      Cultivarea MSC 

Fig. 9.7. Modelul


Activării/Represării
stocastice al lui
Dennis şi Charbord.
(Dennis 2004)  

Pentru a explica capacitatea MSC de a produce celule diferenţiate specifice celor trei
straturi embrionare au fost reunite mai multe teorii. Acestea vizează fie implicarea unor factori
genetici (reprogramare genetică specifică în cursul dezvoltării celulelor) (Sato 2005) şi/sau
factori solubili (Togel 2005), fie a unei populaţii celulare specifice (MAPC), ce se gaseşte în
MO. Modelul activării/represării stocastice, explică diferenţierea variată a MSC prin existenţa
proceselor de gene silencing ce au loc în cursul dezvoltării acestor celule (Dennis 2002). În plus,
s-a demonstrat prin studii RT-PCR şi DNA microarray că MSC posedă gene specifice atât
celulelor mezodermale cât şi celor ectodermale (Egusa 2005). MAPC, în condiţii specifice
produc celule specifice celor trei straturi embrionare. Cu toate acestea nu se cunosc parametrii
interacţiunii MAPC-MSC, speculându-se că MAPC sunt fie progenitori ai MSC, fie o populaţie
celulară creată şi selectată artificial prin cultură in vitro (Dazzi 2006). O altă ipoteză explică
schimbarea fenotipului MSC prin fuziunea acestora cu celule adulte diferenţiate (Terada 2002).
Pe langă acestea, Pittenger (1999) a arătat că numai o treime din totalul coloniilor CFU-F pot fi
diferenţiate adipogenic şi condrogenic.
Diferenţierea in vitro a MSC (Fig. 9.8, Fig. 9.9) este guvernată de mai mulţi factori:
mediul de cultură, densitatea celulelor, organizarea spaţială a culturii, forţele mecanice din
cultură, factorii de creştere prezenţi şi citokinele (Bobis 2006). Important este faptul că factorii
de creştere şi citokinele conduc diferenţierea MSC nespecific. Astfel, dexametazona favorizează
diferenţierea osteoblastică a MSC umane (Jaiswal 1997) şi diferenţierea adipogenică a MSC
murine (Dennis 1996), în timp ce rhBMP-2 (recombinat human bone morphogenetic protein 2),
stimulează diferenţierea osteogenică a ambelor specii, însă la doze diferite (Bobis 2006).
Un factor ce poate avea o mai mare importanţă in vivo constă în diferenţiere direcţionată
a MSC către un anume timp de celulă matură atunci când aceasta vine în contact direct sau
mediat chimic cu MSC. Astfel, MSC murine se pot diferenţia în miocite atunci când în mediu se
introduce mediu provenit de la miocite lezate, cocultura MSC-osteoblaste creşte potenţialul
osteogenic al MSC, iar hepatocitele pot induce hepatogeneza. Totuşi acestea nu sunt valabile
pentru toate celulele mature; spre exemplu condrocitele induc osteogeneza şi nu condrogeneza.
(Jones 2008)

  77 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 9]                                                                                                                                      Cultivarea MSC 

Fig. 9.8. Potenţialul de diferenţiere al MSC umane pe baza observaţiilor in vitro. (Tuan 2003)
bFGF - basic fibroblast factor; bHLH - basic helix loop helix; BMP - bone morphogenetic protein; Cbfa 1
- core binding factor alpha 1; ECM - extracellular matrix; FGF - fibroblast growth factor; GDF - growth
differentiation factor; IBMX 3 - isobutil 1 metilxantina; LRP - low density lipoprotein receptor related
peptide; MAPK - mitogen activated protein kinase; PDGF - platelt derived growth factor; SMAD -
omologul uman al Drosophila Mad (Mad= mothers against decapentaplegic ); TGF beta - tranforming
growth factor beta; WISP - Wnt-1 inducible protein.

Diferenţierea osteoblastică (Fig. 9.10) se obţine prin tratarea culturilor confluente cu un


amestec de β-glicerolfosfat, acid ascorbic şi dexametazonă timp de 2-3 săptămâni (Dennis 2002).
Alături de aceste substanţe mai intervin şi proteinele BMP 2 şi 6, TGF, IGF, BDGF (Brain
derived growth factor), FGF-2, leptina şi PTHrP (parathyroid hormone related peptide) –
implicate în producerea proteinelor matriceale (Bobis 2006) şi calea de semnalizare Notch.
Dintre factorii transcripţionali implicaţi în proces se menţionează: Cbfa1/Runx2, Osterix,
deltaFosB, Fra-1, Aj18, Osf1(Bobis 2006), Msx2, Dlx5 şi TWIST (Zelzer 2003). Se pare că
pentru MSC umane, procesul osteogenic este condus prin comunicarea încrucişată între căile
Wnt şi BMP ce acţionează pe gena Runx2 (Kolf 2007). Întreg procesul osteogenic poate fi
cuantificat prin dozarea activităţii fosfatazei alcaline şi a încărcării cu calciu (Pittenger 1999).
BMP-2 + FGF – aplicate simultan stimulează osteogeneza in vivo şi in vitro (Hanada 1997).
Fosfaţii organici, în special β-glicerofosfatul sunt importanţi pentru mineralizarea osoasă.
Fosfaţii induc producerea de ARNm şi proteine specifice fenotipului osteogenic (ex.
osteopontina) şi cresc expresia genei cbfa1 (core binding factor alpha 1). (Beck 2000) La acestea
se adaugă rolul telomerazei (stimulează diferenţierea osteogenică in vitro a MSC (Simonsen
2002) şi al coreceptorul LRp-5 (LDL receptro-related peptide 5).
Condrogeneza (Fig. 9.10) se realizează în culturi speciale de MSC (micro-mass cultures),
cu densitate celulară crescută, în mediu serum-free suplimentat cu factori de creştere (TGF-β1 şi
β3, BMP-6, BMP-2, BMP-9) (Tuan 2003). În cadrul procesului, TGF-β semnalizează prin

  78 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 9]                                                                                                                                      Cultivarea MSC 

intermediul MAP kinazelor: ERK-1 (extracellular signal regulated kinase), p38, PKC, Jun
(Sekiya 2002) şi Smad (Tuan 2003). Un potenţial mecanism prin care kinazele MAP mediază
efectul TGF-beta implică molecula de adeziune N-caderina (Tuan 2003). Mai sunt sunt implicate
şi alte proteine regulatorii: BMP, CDMP (cartilage derived morphogenetic proteins) (Dennis
2002), membrii ai familiilor Hedgehog (Yamaguchi 2000) şi Wnt (Wnt-4 şi Wnt-14) (Enomoto
2002). Tot prin intermediul MAP kinazelor se speculează că ar acţiona şi calea de semnalizare a
proteinelor Wnt. În 2002 Hoffman a arătat că stimularea receptorului FGF-3 este unic necesară
pentru a induce diferenţierea condrogenică, acesta activând calea proteinelor Smad. Dintre
factorii transcripţionali implicaţi se citează: Sox9, Msx2, Brachury, Hox, Pax şi Forkhead (Bobis
2006), SP-1 şi Ap-2 (implicaţi în producerea de agrecan) (Tuan 2003).
In vitro, adipogeneza (Fig. 9.10) este declanşată cu ajutorul unui cocktail: dexametazonă,
izobutil-metil-xantina şi indometacin (Dennis 2002) şi insulină (Chamberlain 2007). Acest
amestec stimulează apariţia vacuolelor lipidice şi expresia receptorului peroxisome proliferation-
activated receptor γ2 (PPAR-γ), lipoprotein lipazei şi a fatty acid-binding protein P2
(Chamberlain 2007). Indometacin-ul modulează factorul PPAR-γ care este crucial pentru
adipogeneză (Lehmann 1997). Un rol major îl au proteinele BMP şi bFGF (Noel 2004). Proteina
BMP-2 stimulează procesul in vivo iar receptorul BMPR-1R poate direcţiona diferenţierea MSC
pe linie adipogenică (prin blocare) sau osteogenică (prin stimulare) (Bobis 2006). Alţi factori
implicaţi: C/EBP-alfa şi C/EBP-beta, Wnt-10b, TAZ.
Pentru MSC derivate din plămânul embrionar de şoarece, factorul mecanic (tensiunea şi
întinderea) acţionează crescând nivelul proteinei TIP-3 (tension-induced-inhibited protein 3) ce
favorizează miogeneza (Kolf 2007). Aceasta poate fi indusă şi prin transfecţia MSC cu factorul
Notch-1 activat (Dezawa 2005), însă mecanismul nu este cunoscut în profunzime. Pentru
obţinerea de cardiomiocite, este necesară co-cultura MSC-cardiomiocite, care să favorizeze
contactul între cele două tipuri celulare, şi activarea proteinei Jagged 1 (Li 2006). Dacă sunt
tratate cu 5 azacytidine şi amfotericina B, MSC formează mioblaste ce fuzionează în tubuli ce se
contracta ritmic (Chamberlain 2007).
Pentru diferenţierea MSC în tenocite, proteinele GDF, membre ale familiei TGF-β,
împreună cu încărcarea mecanică a culturii sunt de importanţă majoră. Dintre marker-i genici
implicaţi, se remarcă factorul scleraxis ce codează factorul de transcripţie bHLH, şi factorul R-
Smad8 în corelaţie cu BMP-2. (Kolf 2007)

  79 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 9]                                                                                                                                      Cultivarea MSC 

Fig. 9.9. Căile de reglare ale diferenţierii MSC. (Kolf 2007)


Semnalizarea extracelulară şi inducţia mecanică transduc semnalele prin intermediul receptorilor,
canalelor şi/sau mecanismelor de suprafaţă. Comunicarea încrucişată dintre căile de semnalizare,
precum MAPK şi R-Smad, realizează un nivel de specificitate ce determină diferențierea MSC către
anumite linii celulare cum ar fi condrocitele şi osteoblastele. Diferenţierea specifică poate depinde
şi de recrutarea unor factori de transcripţie cu reglare binară, aşa cum este TAZ (transcripional
coactivator with PDY-binding motif). În funcţie de complexele proteice formate anterior pe calea
de semnalizare, TAZ poate stimula osteogeneza şi inhiba adipogeneza. În plus, pot fi implicate şi
anumite subtipuri de co-regulatori precum TIP (tension-induced-inhibited protein) ce reglează
adipogeneza şi miogeneza. GDF - growth and diferentiation factor; TGF - transforming growth
factor; BMP - bone morphogenetic protein; FA - fatty acid; βcat - βcatenin; PPAR - peroxisome
proliferator-activated receptor; MSK - mitogen and stress-activated protein kinase; PCAF -
p300/CBP-associated factor; Ac - acetil; c - condroblast; o - osteoblast; a - adipoblast; m -
mioblast; cm - cardiomioblast; t - tenoblast.

  80 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 9]                                                                                                                                      Cultivarea MSC 

Fig. 9.10. Aspectul microscopic, după marcare, al celulelor mezenchimale diferenţiate din
MSC provenite din MO. (Pittenger 1999)
Sunt prezentate cele trei fenotipuri mezenchimale definitorii pentru MSC (condrogenic, adipogenic şi
osteogenic). Fenotipul adipogenic: marcaj cu oil red O; fenotipul condrogenic: marcaj cu anticorp
monoclonal C4F6 anti-colagen tip II; fenotipul osteogenic: marcaj pe baza creşterii fosfatazei alcaline
şi a depunerii de claciu. A la I: celule diferenţiate din MSC provenite de la trei donator umani
sănătoşi; J la K: martor negativ reprezentat de către fibroblaste (Hs27) tegumentare de nou-născut;
M la O: martor negativ reprezentat de către fibroblaste (1087Sk) din ţesut mamar adult.

  81 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 10]                                                                           Aplicații ale MSC în domeniul ingineriei tisulare 

10 APLICAŢII ALE MSC ÎN DOMENIUL INGINERIEI


TISULARE

„An idea not coupled with action will never get any
bigger than the brain cell it occupied.”
Arnold H. Glasow

Datorită potenţialului de diferenţiere şi al capacitaţii de cultură, MSC sunt un candidat


ideal pentru terapiile bazate pe celule stem.
Un merit deosebit în utilizarea MSC în cadrul terapiilor celulare, îl au Hillard Lazarus şi
Stan Gerson, oncologi, care au demonstrat siguranţa utilizării acestor celule la om, în cursul unor
transplante medulare în care aceste celule au fost utilizate ca suport al hematopoiezei.
Deşi sunt uşor de obţinut, prin puncţie aspirativă medulară, există anumite obstacole ce
trebuie depăşite pentru o utilizare sigură. Pentru aceasta trebuie ţinut cont de condiţiile de cultură
ce nu trebuie să altereze potenţialul fenotipic şi de diferenţiere, de modalitatea de aplicare la
locul ţintă, de posibilitatea inducerii diferenţieri către fenotipul dorit şi de integrarea ţesutului
nou format în cadrul ţesutului preexistent de la nivelul locului ţintă (Dennis 2004).
MSC sunt utile tehnicilor de inginerie tisulară, datorită unor proprietăţi specifice: (1)
potenţial de proliferare extensivă; (2) capacitate de diferenţiere multiliniară; (3) pot fi izolate
uşor din mai multe ţesuturi; (4) prelucrare facilă in vitro; (5) se pot grefa în mai multe ţesuturi
după inoculare sistemică; (5) prezintă tropism pentru ţesuturile patologice (fracturi, ischemie
cerebrală şi miocardică (Shake 2002), inflamaţie); (6) efect pro-angiogen; (7) efect
imunosupresor; (8) nu sunt imunogene (9) nu generează teratoame; (10) aspect etic neglijabil.
Toate aceste caracteristici le fac utile pentru ameliorarea şi vindecarea unor boli precum:
bolile inflamatorii cardiovasculare, IMA, leziunilor traumatice şi non-traumatice medulare şi
cerebrale, afecţiuni osoase şi cartilaginoase, boala Crohn şi GVHD. Pe lângă implicarea directă
pot servi ca vector, livrând medicamente, gene şi proteine la nivel celular (Tuan 2003).
Întrucât cel mai frecvent, celulele sunt încărcate în anumite materiale biodegradabile
suport, acestea trebuie să prezinte anumite proprietăţi fizico-chimice (aria suprafeţei, porozitate,
acidifierea locală, arhitectura spaţială, integritatea mecanică, caracteristicile de degradare,
posibilitatea de dispersie medicamentoasă) şi biologice (capacitatea de a tolera încărcarea cu
celule, de a facilita proliferarea celulară, diferenţierea celulară, depunerea de matrice
extracelulară, angiogeneza).
Dintre dezavantajele apărute în cazul utilizării MSC (mult mai puţine decât pentru ESC)
se menţionează: (1) fuziunea in vivo cu celulele adulte diferenţiate => celule tetraploide (Spees
2003); (2) incapacitatea de a le direcţiona către un anumit ţesut ţintă cu o eficienţă crescută; (3)
apariţia de tumori în caz de transplant alogen (pe modele animale) (Djouad 2003); (4) suportul
creşterii tumorale; (5) reacţia la serul fetal bovin.
Integrarea MSC exogene în cadrul procesului de regenerare/reparare tisulară presupune
integrarea ţesutului format în morfologia şi fiziologia ţesutului gazdă precum şi integrarea
acestor celule în căile de semnalizare ale gazdei (Bobis 2006).
Mecanismele prin care MSC contribuie la reconstrucţia tisulară sunt: (1) diferenţierea în
fenotipul specific ţesutului gazda; (2) producerea de factori solubili ce stimulează proliferarea
celulelor stem endogene; (3) transferul de mitocondrii şi ADN mitocondrial (rol probabil)
Studiind grefarea acestor celule, Prokop (Lee 2006) a observat că acestea prezintă un
tropism tardiv pentru ţesutul osos (după 35 de zile de la inoculare – rol posibil osteogenic). Pe
lângă aceasta, Lee (2006) a identificat o subpopulaţie MSC numită RS-MSC (rapidly self
renwing MSC, cu celule mici) ce manifestă un tropism crescut faţă de grefarea tisulară într-un
procent mai mare comparativ cu populaţia MSC slow-renewing (SR-MSC, cu celule mari).
Comportamentul RS-MSC a fost explicat prin prezenţa în cantităţi mari pe suprafaţa acestor
celule a receptorilor CXCR4 şi CXCR1. Pentru creşterea populaţiei RS în coloniile CFU-F se

  82 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 10]                                                                           Aplicații ale MSC în domeniul ingineriei tisulare 

recomandă realizarea de pasaje noi când se atinge o confluenţă de 70% şi însămânţarea celulelor
la densitate mică.
Pe lângă acţiunea la nivelul organismului adult, MSC sunt implicate şi în evoluţia
organismului fetal şi neonatal. Când sunt transplantate, ele migrează şi contribuie la diferenţierea
a numeroase ţesuturi. În plus, supravieţuirea lor nu depinde de maturitatea sistemului imun al
organismului la momentul transplantului, putând supravieţui până după maturarea sistemului
imun. Studiile ce au vizat transplantul lor la nivelul organismelor în formare au scos în evidenţă
că evoluţia MSC şi implicarea lor în colonizarea a numeroase ţesuturi se datorează influenţei
semnalelor prezente în organele în dezvoltare. Semnalele unui organism fetal sunt diferite de
cele de la adult, astfel încât există posibilitatea ca MSC să aibă o gamă mai largă de diferenţiere
la nivelul organismelor fetale. (Chamberlain 2007)

10.1 Repararea osoasă

MSC, singure sau integrate în diverse produse/structuri suport (realizate cu ajutorul


ingineriei tisulare), au fost utilizate amănunţit în refacerea şi regenerarea ţesutului osos,
speculând astfel proprietatea osteogenică a acestor celule. Utilizarea MSC în acest domeniu a
parcurs drumul de la utilizarea materialelor biodegradabile non-poroase până la utilizarea
produşilor osteoconductivi celulari (cell-matrix composites) şi terapiilor genice bazate pe MSC.
Mai multe modele experimentale au speculat diferenţierea osteogenică, obţinând rezultate
variabile pe modele animale canine şi de rozătoare.
Unul dintre primele studii în domeniu a comparat rolul a trei tipuri de matrice ceramice în
repararea unui defect osos masiv la şobolan (Kadiyala 1997). Suportul ceramic ce conţinea MSC
a realizat o autoîncărcare cu ţesut osos de circa 19% fiind precedat de matricea ceramică cu
fosfat de calciu şi urmat de matricea ceramică control. Ca o regulă generală, în urma analizei mai
multor studii similare, matricea suport încărcată cu MSC a obţinut rezultate mai bune comparativ
cu controlul fără celule (Bruder 1998) (Perka 2000) (de Bruijn 1999).
Studiile recente au tentat utilizarea unor produse cu conţinut osos preformat, matrice de
fosfat de calciu şi plăci metalice biotolerabile acoperite cu MSC şi cultivate în mediu osteogenic
(de Bruijn 1999).
O altă abordare, a folosit ca sursă de MSC periostul, demonstrând că poate produce ţesut
osos în combinaţie cu matricile ceramice, după implantarea intramusculară (Cong 2001).
Mult mai pragmatic, MSC au fost injectate (cca 50000 celule) sub formă de MO
neprelucrată la locul unor fracturi, obţinându-se rezultate foarte bune (Hernigou 2005), probabil
ca urmare a faptului că MSC în vitro au un potenţial osteogenic mărit (Banfi 2000)
Refacerea ţesutului osos se poate realiza nu numai prin aplicarea locală a MSC ci şi prin
administrarea sistemică a acestor celule. Această cale este dorită a fi utilizată pentru tratarea
afecţiunilor osoase difuze, în mai multe teritorii, datorate vârstei (osteoporoza) sau a unor
afecţiuni precum osteogenesis imperfecta (OI) (Caplan and Bruder 2001) (afecţiune genetică ce
afectează calitatea colagenului I ca urmare a afectării genelor COL1A1 şi COL1A2 de una din
cele 150 de mutaţii identificate; clinic pacienţii prezintă fracturi, deformări osoase, retard de
creştere, hipostaturalitate; până acum singurele rezultate motivante au fost obţinute prin terapia
celulară şi genică (Horwitz 2001), cu toate că observaţiile asupra capacităţii de migrare sistemică
a MSC sunt contradictorii. Astfel, unele studii pe animale au arătat că regenerarea
compartimentului stromal al MO se face pe baza mediului local (Maloney and Patt 1968), în
timp ce altele au arătat că, deşi în foarte mică măsură, componenta stromală se poate reface şi
prin intermediul propagării sistemice a MSC (Maloney 1985).
Aceleaşi incertitudini se prezintă şi pentru studiile umane. Astfel, Keating (1982) a
demonstrat că populaţia celulelor stromale medulare provin de la donor (metoda identificării
cromozomului Y prezent în himerele posttransplant sex-mismatched). În 1990, Athanasou a
afirmat că populaţia stromală are origine în totalitate în celulele gazdei (metoda hibridizării in
situ pentru identificarea cromozomului Y prezent în himere posttransplant sex-mismatched).

  83 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 10]                                                                           Aplicații ale MSC în domeniul ingineriei tisulare 

Deşi există acest background incert, studiile recente tind să încline balanţa către
demonstrarea supravieţuirii MSC după administrarea sistemică. În acest sens, studiile lui Pereira
(1995,1998), utilizând tehnici de PCR, au arătat că MSC ale donatorului supravieţuiesc la nivelul
gazdei. În 1999, Hou a confirmat prezenţa MSC umane în ţesuturile ovine, post-administrare
sistemică.
Pentru OI, Horwitz (1999) a realizat primele transplantări terapeutice de MSC utilizând
aspirat medular neprelucrat. Rezultatele acestuia au indicat o grefare de 1.5-2% la nivelul MO a
receptorului, creşterea funcţiei osteoblastice, creşterea mineralizării osoase, a vitezei de creştere
şi reducerea numărului fracturilor. Însă studiul follow-up a arătat o reducere sau stagnare a
vitezei de creştere cu menţinerea creşterii mineralizării osoase. Prin utilizarea unei populaţii pure
de MSC rezultatele au fost îmbunătăţite (Horwitz 2002).
În 2005, Le Blanc a realizat primul transplant uman terapeutic in utero, utilizând MSC,
pentru OI. MSC au fost recoltate din ficat fetal masculin, HLA-mismatched, şi injectate în vena
ombilicală a unei paciente la vârsta de 32 săptămâni de gestaţie. După naştere, identificarea
genomului masculin a identificat o grefare a celulelor de 7.4%, fără reacţie de rejet. După
introducerea tratamentului cu pamidronat la vârsta de 4 luni, nivelul mineralizării osoase a atins
76% la vârsta de 22 de luni.
Deşi rezultatele ultimilor studii ce se adresează prezenţei MSC în organismul gazdă, sunt
puse pe seama dezvoltării metodelor de identificare, eficacitatea administrării sistemice este
totuşi destul de redusă, fiind lipsită de aplicabilitate clinică extinsă (Dennis 2004).
Toate aceste rezultate dovedesc utilitatea şi fezabilitatea folosirii MSC în domeniul
reconstrucţiei osoase, acest domeniu fiind şi cel mai avansat în ceea ce priveşte aplicaţiile clinice
ale MSC.

10.2 Refacerea tendoanelor şi a cartilajelor

Fiind una din caracteristicile de bază ale MSC, observată încă de la începutul studiului
lor, condrogeneza, a motivat apariţia primelor studii în domeniul reconstrucţiei tendoanelor şi
cartilajelor articulare.
Studiile realizate de Young (1998), Butler şi Awad (1999) în sfera refacerii tendoanelor
au dovedit că MSC transplantate local la nivelul unor matrice de suport se pot integra şi adapta la
nivelul ţesutului restant contribuind la refacerea lui.
Factorii cheie pentru tenogeneză sunt: condiţiile de cultură, factorii de creştere şi
stimularea fizică (încărcarea mecanică). Dintre factorii solubili implicaţi se citează: GDF 5, 6 şi
7 (growth/differentiation factor), membri ai superfamiliei TGF-β, şi BMP-13 (Wolfman 1997).
Fie că au fost utilizate în cadrul unor matrice de suport fibrilare sau gel (Awad 1999),
tendoanele refăcute au prezentat o rezistenţă de aproximativ 65% din rezistenţa unui ţesut
normal, cu circa 30% mai mult faţă de control.
Deşi proprietatea lor condrogenică a fost clar documentată (Yoo 1998a,b) studiile
experimentale ce au vizat regenerarea cartilajului articular (cunoscut a fi instabil şi precar după
regenerarea fiziologică) nu au furnizat rezultate favorabile.
Numeroase materiale au fost utilizate în încercarea de a repara ţesutul cartilaginos.
Polimeri naturali precum colagenul, însămânţaţi cu MSC au fost printre primii produşi utilizaţi
cu rezultate satisfăcătoare (Wakitani 1994).
Dintre polimerii sintetici cu rezultate bune se menţionează: alfa-hidroesterii PLA şi PLG
şi copolimerul acestora PLGA. Folosirea amalgamului PLA-hidrogel alginat ca matrice pentru
MSC, a furnizat in vivo rezultate bune explicate printr-o creştere a încărcării celulare cu
menţinerea morfologiei acestora (forma rotundă) necesară diferenţierii condrogenice, stimulată
de alginat, şi o rezistenţă structurală a compozitului oferită de către PLA (Caterson 2001).
Apariţia unei noi matrice pe bază de PLGA şi poli-ε-caprolactona, cu o structură 3D
similară reţelei naturale de colagen, cu abilitatea de a facilita aderare, proliferarea şi diferenţierea
MSC, încurajează aplicaţiile MSC în domeniul regenerării cartilaginoase.

  84 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 10]                                                                           Aplicații ale MSC în domeniul ingineriei tisulare 

Pentru administrarea celulelor la nivel local, în vederea regenerării tendoanelor, au fost


utilizaţi ca suport diferiţi polimeri precum: acidul hialuronic (Solchaga 1999.2000), colagenul tip
I (Wakitani 1994) şi acidul polilactic (Dounchis 2000).
Deşi rezultatele histologice nu au arătat nicio modificare semnificativă, din punct de
vedere biomecanic utilizarea unui compozit colagen-MSC a îmbunătăţit caracteristicile ţesutului
regenerat (Awad 1999). Observaţiile lui Awad (2000) au arătat că efectul asupra tenogenezei
sunt dependente de concentraţia MSC, descriind un platou la aproximativ 4 mil celule/ml.
Deşi niciunul dintre modelele propuse nu a realizat un ţesut stabil, majoritatea
insatisfacţiilor fiind legate de formarea unui ţesut cicatriceal fibros şi de slabă integrare a neo-
cartilajului în structura ţesutului nativ, se prefigurează o îmbunătăţire a rezultatelor.

10.3 Aplicaţii hematologice

Speculând interacţiunea MSC-HSC, şi capacitatea imunomodulatoare crescută a celor


dintâi, aplicaţiile clinice vizează şi folosirea lor în cadrul transplantului HSC la pacienţii
mieloablaţi. În acest caz MSC au rol suportiv, accelerând recuperarea hematopoiezei, şi
imunomodulator, scăzând amplitudinea sindromului GVHD (graft versus host disease) (Bobis
2006). MSC în cotransplant cu HSC, stimulează grefarea şi potenţialul migrator in vivo al HSC
la primatele non-umane, restaurând potenţialul migrator pierdut de către HSC în urma cultivării
ex vivo (Masuda 2009)

10.4 Aplicaţii în cardiologie

Rezultate favorabile au fost obţinute in vitro şi in vivo pentru repararea miocardului.


Dintre toate populaţiile celulare prezente în MO, numai MSC au dovedit capacitatea de a se
diferenţia în cardiomiocite (Heng 2004).
In vitro, atât MSC umane cât şi cele murine, au prezentat după diferenţiere miofibrile,
miotubuli şi marker-i de suprafaţă specifici cardiomiocitelor (miozina sarcomerica, desmina,
actina) (Makino 1999). MSC s-au diferenţiat in vivo, pe cord normal, în cardiomiocite (Wang
2000) şi au colonizat ţesutul ischemic (Tomita 1999). Alte studii au arătat că MSC injectate
intramiocardic pe cord sănătos sporesc neoangiogeneza la locul de injectare, şi că s-au diferenţiat
în cardiomiocite, celule endoteliale, pericite şi celule musculare netede (Chamberlain 2007).
Cele mai multe studii sunt îndreptate către tratamentul IMA. Studii atât pe animale cât şi
pe om au confirmat rezultate favorabile, marcate de micşorarea leziunii, îmbunătăţirea grosimii
parietale şi a disfuncţiei contractile. Cel mai important aspect legat de IMA, este momentul
transplantului – este de preferat a se realiza aproximativ după 7 zile de la infarct (Jiang 2008)
Pentru cardiomiopatia dilatativă (model murin), Nagaya (2005) a raportat creşterea
densităţii capilare şi inhibarea fibrozei cardiace după transplantul MSC, sugerând un mecanism
mixt din partea MSC: paracrin şi diferenţiere.
Rezultate recente consideră responsabil pentru refacerea cardiacă, efectul paracrin (Salem
2009). Cele mai spectaculoase au fost obţinute când MSC au fost transfectate cu un vector viral
conţinând gena antiapoptotica Akt, regenerând aproximativ 80% din ţesutul ischemic (Mangi
2003).
MSC pot fi utile şi în afecţiunile caracterizate prin scăderea masei musculare cardiace ca
urmare a capacităţii de a produce de novo miocard (Orlic 2001).
În ceea ce priveşte calea de administrare (injectare IV, injectare intramurală, injectare
trans-endocardică sau trans-coronară), rezultatele umane par a orienta către ruta trans-coronară.

  85 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 10]                                                                           Aplicații ale MSC în domeniul ingineriei tisulare 

10.5 Aplicaţii în nefrologie

Datorită potenţialului imunologic şi de homing preferenţial către ţesuturile ischemice,


MSC sunt ideale în tratarea unor boli renale ischemice şi inflamatorii.
Ito (2001) a raportat colonizarea renală într-un model animal de glomerulonefrită la
şobolani, identificând celule GFP+ (transplantate medular) în mezangiul acestora.
În 2004, Morigi a arătat că MSC sunt benefice tratamentului insuficienţei renale acute
având şi rol protector (profilactic) (model experimental murin), MSC putându-se diferenţia în
celule epiteliale tubulare.
Rezultate favorabile au fost obţinute şi pe modele ischemice renale, observându-se
îmbunătăţirea scorului apoptotic şi creşterea proliferării (Togel 2005).
Se profilează ideea că rezultatele obţinute sunt datorate unor efecte paracrine din partea
MSC: scăderea citokinelor pro-inflamatorii: IL-1β, TNF-α, IFN-γ, iNOS, însoţită de o creştere
marcată a citokinelor anti-inflamatorii: IL-10, bFGF, TGF-α, Bcl-2. În plus, la acestea se adaugă
şi efecte datorate fuziunii MSC cu celulele epiteliale renale, în proporţie mai mare de 50%.
(Salem 2009)
Cu toate acestea, rezultate recente au arătat că efectele MSC asupra rinichiului sunt pur
paracrine (Salem 2009).

10.6 Aplicaţii neurologice

MSC izolate din MO, se pot diferenţia în celule neuron-like în prezenţa factorului
neurotrofic derivat din creier (brain-derived neurotrophic factor – BDNF). Capacitatea
proliferativă este îmbunătăţită în prezenţa serului fetal bovin, a bFGF şi a fibronectinei (ca
substrat de creştere). Selectarea MSC CD133+ contribuie, de asemenea, la creşterea potenţialului
neurogen. (Nandoe 2006) Celulele neuron-like obţinute prezintă un potenţial de repaus tipic
neuronal (-20 – -50 mV) (Kohyama 2001). La acestea se adaugă şi observaţia conform căreia
MSC migrează in vivo la nivel cerebral, străbătând bariera hemato-encefalică şi diferenţiindu-se
în neuroni (Cogle 2004).
Aplicaţiile neurologice experimentale ale MSC au dovedit cu succes ameliorarea
leziunilor cerebrale apărute în urma accidentului cerebral de tip stroke pe un model experimental
murin (Li 2001a) (Chopp 2002), a leziunilor traumatice (Chopp 2002) respectiv remiterea
simptomatologiei induse în cadrul unui model indus medicamentos al bolii Parkinson (Li 2001b).
Majoritatea autorilor descriu o creştere a remielinizării zonelor afectate cu creşterea
numărului celulelor gliale şi limitarea morţii celulare. Keilhoff (2006) a arătat că MSC pot
produce celule gliale Schwann-like. Funcţional, aceste celule au remielinizat mai mulţi axoni
simultan (comportându-se ca în SNC) atunci când au fost transplantate pe un model experimental
de întrerupere a nervului sciatic. Beneficii au fost înregistrate şi în cazul leziunilor medulare
subtotale (la şobolan).
Hofstetter, a arătat că MSC de şobolan, injectate la nivelul leziunilor medulare ale unor
şobolani paraplegici au contribuit la formarea unor punţi ce străbat epicentrul leziunii
coordonând regenerarea. În acest caz efectul favorabil în evoluţia subiecţilor este pus pe seama
producerii de factori umorali de creştere şi nu a diferenţierii în neuroni sau celule gliale
(Chamberlain 2007).
MSC au fost utilizate şi pentru refacerea leziunilor nervului sciatic la şobolan. După
cultivarea lor într-un mediu potenţator pe bază de forskolină, FGF, PDGF şi heregulină, urmată
de transplantul la nivelul leziunii s-a observat diferenţierea MSC în celule ce produc proteine
mielinizante (Dezawa 2001).
O caracteristică interesantă este reprezentată de faptul că gradul refacerii nervoase
variază în funcţie de donor (pentru MSC umane). Aceeaşi dependenţă a fost observată şi între
diferite loturi de MSC izolate de la acelaşi donor (Neuhuber 2005).

  86 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 10]                                                                           Aplicații ale MSC în domeniul ingineriei tisulare 

Pentru viitor, viza terapeutică clinică este îndreptată către regenerarea leziunilor medulare
traumatice, soldate cu deficit motor, şi a anomaliilor cu mecanisme moleculare (leziuni
demielinizante, scleroză laterală amiotrofică etc.). Capacitatea de migrare a MSC, funcţia de
neuroprotecţie şi regenerare axonală au demonstrat până acum că MSC pot îmbunătăţii
performanţa motorie după leziuni medulare acute, subacute şi cronice (Nandoe 2006).

10.7 Aplicaţii în hepatologie

Principala adresabilitate a MSC, este îndreptată către bolile cronice hepatice a căror
singură soluţionare o constituie transplantul hepatic (TH). MSC prezintă un spectru de utilitate
mai larg ca TH: (1) pot fi expansionate in vitro, manipulate, crioprezervate, nu necesită
imunosupresie, tehnică chirugicală de infuzie minoră; (2) pot servi la obţinerea de hepatocite
necesare realizării dispozitivelor bio-artificiale bridge-to-transplant.
Deşi unii autori au raportat rezultate negative pentru afecţiunile terminale
(Mohamadnejad 2007), alţii au obţinut rezultate favorabile cu transplantul autolog de MSC prin
injectare intraportală (Terai 2006). În afara afecţiunilor cronice, MSC au fost utilizate şi pentru
tratamentul hepatitei medicamentoase (Gasbarinni 2007).
În aplicarea MSC în terapia gastroenterologică trebuie ţinut cont de faptul că efectul
poate fi tranzitor (prin modulare locală), necesitând administrări repetate, la care se adaugă
observaţia că MSC fuzionează cu unele celule digestive rezultând celule aneuploide posibil
instabile şi cu potenţial malign. (Piscaglia 2008)

10.8 Aplicaţii în oncologie

Primele dovezi că MSC pot fi utilizate pentru a livra agenţi terapeutici împotriva
cancerelor au fost furnizate de către Studeny (2004), care a demonstrat că după injectarea
intravenoasă de MSC modificate pentru a produce IFN-β, acestea se grefează preponderent
tumoral, inhibând creşterea tumorală şi prelungind supravieţuirea.
Rezultate similare au fost raportate şi în cazul utilizării a MSC capabile să producă NK-4
(natural killer transcript 4) sau CX3CL1 (chemokină implicată în mobilizarea celulelor NK şi
LT) (Roorda 2009).
Un pas mai departe a fost făcut de către Stoff-Khalili (2007) care a utilizat MSC ca
vehicul pentru inocularea tumorală a unor virusuri (CRAds – condiţional replicating
adenoviruses) – viroterapie, pentru metastazele pulmonare şi cancerele de sân, virusul fiind
agentul terapeutic.

10.9 Aplicaţii în diabetologie

Funcţiile imunologic active ale MSC le fac utile în tratamentul diabetului. Astfel, se
precizează că acestea pot interfera anumite mecanisme din patogenia diabetului tip 1, debilitând
procesul autoimun prin imunomodulare, principalul mecanism constând în prezentarea de
molecule costimulatoare negativ ce reglează celulele T autoreactive şi celule T reglatorii. Unele
rezultate promiţătoare au apărut încă din 2004 (Tang 2004).

Aplicaţii clinice ale MSC vizează şi alte domenii. Au fost raportate rezultate pentru
regenerarea muşchiului (De Barri 2003), plămânului (Bruder 1997), tegumentului (Badiavas
2003), tubului digestiv (Sîrbu-Boeţi 2008), leziunilor tegumentare postiradiere (Francois 2007);
în plus, a fost arătat că MSC stimulează angiogeneza (Hernigou 2002).

  87 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 10]                                                                           Aplicații ale MSC în domeniul ingineriei tisulare 

10.10 MSC şi terapia genică

Cu toate că supravieţuirea MSC, în urma administrării sistemice este destul de scăzută,


acest lucru poate fi combătut prin modificarea genetică a MSC, astfel încât să producă diverşi
factori solubili care să le autopotenţeze sau să intervină în cadrul mecanismului fiziopatologic al
bolii.
Utilizarea MSC în cadrul terapiei genice este atractivă datorită aceloraşi caracteristici
comune utile şi ingineriei tisulare: (1) sunt uşor de obţinut, cu morbiditate minimă pentru
donator; (2) se pot cultiva şi expansiona foarte uşor; (3) au capacitatea de a se diferenţia în mai
multe fenotipuri; (4) se pot adresa direct ţesuturilor mezenchimale, speculând astfel originea
mezodermală.
Cu toate acestea, folosirea MSC în acest domeniu se loveşte de trei probleme majore: (1)
reintroducerea MSC în gazda; (2) controlul grefării celulelor transgenice; (3) controlul
exprimării produsului genei de interes.
Putând fi modificate genetic, MSC pot livra diverse gene. Chuah (2000) a raportat
utilizarea acestor celule transfectate cu gene pentru factorii VIII şi IX ai coagulării pe un model
experimental murin.
Mai mult echipe au raportat numeroase utilizări ale MSC în cadrul terapiei genice. Astfel,
MSC au fost prelucrate încât să exprime şi să producă factori precum IL-3 umană (model
experimental pe şoarece NOD/SCID) (Allay 1997), factorul IX uman (model experimental
murin) (Gordon 1997) – (model experimental canin) (Horwitz 1999), factorul VIII uman (model
pe şoarece NOD/SCID) (Chuah 2000), eritropoietină umană (model murin) (Bartholomew
2001).
Prin manipulare genică se poate realiza şi autopotenţarea MSC pentru aplicaţii în
domeniul ingineriei tisulare. Un prim rezultat este cel a lui Nixon (2000) care a realizat
transducerea MSC cu gena responsabilă de producerea IGF-1, ce are rol în repararea fiziologică
a cartilajului articular. Capacitatea osteogenică a putut fi îmbunătăţită prin expresia genei pentru
BMP-2 (bone morphogenetic protein 2), fiind deja utilizată în repararea fracturilor la animale
(Lieberman 1999).
MSC modificate au fost utilizate şi în tratamentul bolii Parkinson, pe modele
experimentale murine. MSC de şobolan, ce prezintă două enzime cheie implicate în
metabolismul L-Dopa (tirozin hidroxilaza şi guanozin 5-trifosfat ciclohidrolaza I) au redus
simptomatologia considerabil deşi, după 9 zile de la transplant expresia genelor a încetat
(Schwarz 1999). O altă afecţiune cu posibil tratament bazat pe MSC este sdr. Hurler (Baxter
2002).
Terapia genică utilizând MSC, pentru OI, a fost experimentată de către Russel
(Chamberlaine 2004), modificând ex vivo MSC provenite de la pacienţi cu OI. Celulele au fost
transfectate cu vectorul AAV-COLe1INpA, destinat inactivării exonului 1 al genei mutante
COL1A1. Prin anularea expresiei genei s-a îmbunătăţit stabilitatea şi structura colagenului. MSC
transfectate au fost testate in vivo pentru producerea de ţesut osos şi adipos, demonstrând
păstrarea potenţialului multiliniar.
Alte studii au vizat utilizarea MSC modificate prin inginerie celulară pentru
îmbunătăţirea funcţiei cardiace după IMA (MSC transfectate cu EGF) şi pentru livrarea de IFN-β
în tumori. (Chamberlain 2007)

10.11 Aplicaţii clinice şi trial-uri

La momentul redactării acestei lucrări, website-ul Clinical Trials al National Institute of


Health (http://clinicaltrials.gov), menţionează un număr de 127 trial-uri (searck key:
mesenchymal stem cells), înregistrate la nivel mondial (38 în Europa), vizând o categorie largă
de afecţiuni (Anexa IV) (Fig. 10.1, Fig. 10.2). (Health 2010)

  88 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 10]                                                                           Aplicații ale MSC în domeniul ingineriei tisulare 

Între toate aceste trial-uri cele mai titrate produse pe bază de celule stem, aflate în teste la
ora actuală sunt: Prochymal® (bazat pe MSC, Osiris Therapeutics Inc.) – pentru boala Crohn,
GVHD, diabet tip 1, COPD şi MultiStem® (bazat pe MAPC, Athersys) – pentru IMA, afecţiuni
autoimune. Apariţia a noi trial-uri este alimentată de lipsa citării unor efecte adverse
semnificative, privind utilizarea acestor celule şi de obţinerea unor rezultate primare
satisfăcătoare.
Cu toate acestea, lipsa unei standardizări internaţionale vizând izolarea şi cultura acestor
celule rămâne un obstacol important în desluşirea completă a biologiei acestor celule,
traducându-se printr-o întârziere în implementarea unor terapii celulare în clinică ca tratament
curent.

Fig. 10.1. Numărul de trialuri


ce implică utilizarea MSC,
la nivel global.
(Health 2010)

Fig. 10.2. Numărul de trialuri


ce implică utilizarea MSC,
în Europa.
(Health 2010) 

  89 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 10]                                                                           Aplicații ale MSC în domeniul ingineriei tisulare 

10.12 Siguranţa transplantului MSC

Deşi au un rol imunologic activ, se cunosc puţine lucruri despre supravieţuirea pe termen
lung in vivo a acestor celule şi despre modul de influenţare a sistemului imunitar al gazdei pe
termen lung.
Lipsa efectelor adverse este corelată clasic cu scurta durată de supravieţuire a acestor
celule in vivo, însă date recente ce atestă supravieţuirea lor pe termen lung motivează găsirea
unei alte explicaţii. Ţinând cont de observaţiile cu privire la formarea de ţesuturi ectopice,
transformare malignă şi imunogenitate MSC, survenite în urma administrării sistemice trebuie
analizat atent raportul risc/beneficiu.
MSC, prin homing-ul către ţesuturile afectate generează o imunosupresie locală specifică,
care din punct de vedere clinic este de dorit în comparaţie cu imunosupresia indusă
medicamentos care este generală şi predispune la infecţii oportuniste.
În plus, unele studii arată că transplantul local al MSC, produce o imunosupresie
sistemică la fel ca şi infuzia sistemică de MSC, ce scade răspunsul imun antitumoral (Djouad
2003) favorizând apariţia tumorilor alogene. Imunosupresia este sistemic nespecifică,
independentă de expresia MHC şi manifestată atât pentru MSC autologe cât şi MSC alogene sau
xenogene (Nauta 2007).
Pe lângă aspectul imunosupresie, alte posibile probleme ce trebuie analizate sunt: (1)
producerea de tumori; (2) proliferarea în exces; (3) diferenţierea nedorită; (4) localizarea
aberantă; (5) funcţionarea nesatisfăcătoare. Pentru un control al acestora, manipularea genică
pretransplant oferă o soluţie de reducere a riscului.

10.12.1 Transformarea malignă

Cultura extensivă in vitro poate influenţa negativ caracteristicile funcţionale ale MSC in
vivo. Afectarea datorată MSC depinde de specie şi de tipul ţesutului de origine. Astfel, la om nu
au fost observate transformări sau fenomene de imortalizare in vivo a MSC din MO, aşa cum este
cazul MSC izolate din ţesut adipos uman (Rubio 2005). În ceea ce priveşte specia, MSC umane
sunt mai stabile comparativ cu cele murine faţă de mutaţiile şi aberaţiile cromozomiale survenite
în cultură. În plus,, s-a observat că MSC murine se pot transforma malign în cultură, dând
naştere la osteosarcoame (Tolar 2007), susţinând teoria în care tumorile se pot dezvolta şi în
urma mutaţiilor apărute la nivelul MSC (Miura 2006).
Deşi la pacienţii transplantaţi nu au fost observate fenomene oncogenetice legate de uzul
MSC, testarea cariotipului culturii MSC se impune ca fiind obligatorie pre-transplant.

10.12.2 Formarea de ţesut ectopic

Această reacţie rezidă tocmai din potenţialul de diferenţiere multiliniară a MSC,


caracteristică ce le face utile ingineriei tisulare. Deşi teoretic, diferenţierea MSC în anumite
fenotipuri este coordonată de micromediul ţesutului gazdă, acţionând astfel că un mecanism de
siguranţă, s-a observat că pot genera ţesuturi ectopice la nivelul organelor gazdă. Astfel,
Breitbach (2007) a raportat apariţia de calcificări în cordul şoarecilor trataţi cu MSC post-infarct
miocardic.
Având în vedere aceste rezultate, posibilitatea formării ţesutului ectopic reprezintă un
eveniment de care trebuie ţinut cont în clinică.

  90 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 11]                                                                                                                                  Imunologia MSC 

11 IMUNOLOGIA MSC

„I like to think that when Medawar and his colleagues


showed that immunological tolerance could be
produced experimentally the new immunology was
born. This is a science which to me has far greater
potentialities both for practical use in medicine and for
the better understanding of living process than the
classical immunochemistry which it is incorporating
and superseding.”
Sir Frank Macfarlane Burnet

Rezultatele obţinute în urma transplantărilor experimentale au atras atenţia asupra


proprietăţilor imunomodulatoare exprimate. Astfel, MSC au fost identificate contribuind la
toleranţa periferică, toleranţa posttransplant, autoimunitate, evaziune tumorală şi toleranţă
materno-fetală. (Nauta 2007)
Fenotipul MHC I+, MHC II-, CD80-, CD86- sau CD40- este considerat ca fiind non-
imunogenic, astfel încât transplantul alogen nu necesită imunosupresie. Totuşi complexul MHC
clasa II poate fi exprimat în anumite condiţii (e.g. prezenţa în mediu a IFNγ). (Salem 2009)
Cu toate că le lipsesc moleculele co-stimulatoare a LT, MSC pot funcţiona ca APC,
generând un răspuns imun când sunt stimulate cu IFNγ. (Stagg 2006)
Deşi se cunoaşte rolul suport al MSC pentru HSC la nivelul MO, puţine lucruri sunt
cunoscute despre rolul jucat de MSC în cadrul proceselor imunologice de la acest nivel.
S-a observat că MSC provenite de la pacienţii suferinzi de afecţiuni autoimune (e.g.
anemie aplastică, scleroză sistemică) prezintă deficit în supresia LT şi a eliberării de citokine.
Pe baza acestor observaţii, cumulate cu rezultatele clinice (inhibarea răspunsului imun
posttransplant de către MSC alogene), se poate spune că MSC joacă un rol (neclarificat încă) în
imunologia locală a MO.
În plus, prezenţa MSC în deciduă, lichidul amniotic, sângele fetal şi sângele din cordonul
ombilical indică un posibil rol al acestor celule în procesele de toleranţă fetală.

11.1 Imunologia MSC in vitro

11.1.1 Imunosupresia limfocitelor T

Natura imunosupresoare a MSC a fost observată in vitro (Fig. 11.1, Fig. 11.2) pentru
celulele umane, de şobolan şi de babuin, traducându-se prin supresia marcată a activării şi
proliferării în vitro a LT. (Nauta 2007)
MHC I poate activa LT, însă în lipsa moleculelor costimulatorii (CD40, CD80 şi CD86)
nu va avea loc un răspuns secundar, astfel încât LT rămân anergice. (Chamberline 2007).
MSC inhibă proliferarea LT indusă de aloantigene (Le Blanc 2004), mitogeni (di Nicola
2002) sau de CD3 şi CD28 (Tse 2003). da Silva (2008) consideră că această supresie se
datorează inhibării diviziunilor LT decât inducerii apoptozei. La acestea se adaugă şi inhibarea
LT citotoxice, probabil prin supresia proliferării acestora decât a activităţii lor citolitice
(Maccario 2005).
Imunosupresia LT nu este restricţionată imunologic, rezultate inhibitorii similare
obţinându-se atât pentru MSC autologe cât şi alogene (Le Blanc 2004).

  91 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 11]                                                                                                                                  Imunologia MSC 

Mecanismul supresiei are la bază utilizarea factorilor solubili produşi de MSC în prezenţa
LT, fiind absolut necesară realizarea unei interacţiuni dinamice LT-MSC care să declanşeze
producţia acestora (Nauta 2007). Această interacţiune este susţinută şi de rezultatele lui Djouad
(2003), care a observat că supernatantul de MSC umane sau murine nu are efect inhibitor asupra
LT decât dacă MSC şi LT sunt cultivate în cocultură. MSC posedă o serie de molecule implicate
în interacţiunea cu LT: MHC clasa I, VCAM, ICAM-1, ALCAM, LFA-3 (Salem 2009).
Deşi rezultatele sunt uneori discutabile, mai mulţi factori au fost propuşi a fi implicaţi în
această supresie; cei mai des vehiculaţi fiind TGF-β şi HGF (hepatocyte growth factor) (di
Nicola 2002), PGE2 (prostaglandina E2), monoxidul de azot (da Silva 2008) şi enzima IDO
(indolamina 2,3-deoxigenaza, ce catabolizează triptofanul) (Meisel 2004). IDO, în urma
stimulării MSC de către IFN-γ, degradează triptofanul în kynurenine, responsabile după unii de
apoptoza LT (Plumas 2005).
Un alt mecanism are la bază anergia LT indusă de către MSC ca urmare a lipsei de pe
suprafaţa celor din urmă, a moleculelor costimulatoare CD80 (B7-1) şi CD86 (B7-2) (Nauta
2007).
Inhibarea răspunsului LT se realizează şi prin modularea LT regulatorii. MSC stimulează
formarea LT regulatorii CD8+ responsabile de supresia proliferării LT alogene (Djouad 2003) şi
a LT CD4+CD25+, cu rol supresor (da Silva 2008). Pe lângă aceasta a fost observată şi supresia
LTh1, soldată cu scăderea secreţiei de IFN-γ (da Silva 2008).
Cu toate că MSC inhibă răspunsul LT, componenta executorie a răspunsului imun, unele
rezultate arată că această inhibiţie ar putea fi nespecifică, întrucât MSC inhibă şi proliferarea
anumitor linii celulare tumorale (Ramasamy 2007).

11.1.2 Imunosupresia limfocitelor B

Pe lângă LT, MSC suprimă şi limfocitele B (LB) (Fig. 11.1, Fig. 11.2) şi stimularea
antigenică a acestora, cu menţinerea lor în faza G0/G1 (da Silva 2008). Această observaţie
provine din studii ce au utilizat atât MSC umane cât şi murine.
MSC alogene inhibă proliferarea, activarea şi secreţia IgG1 antigen specifică şi IgM a LB
murine (Asari 2009). La aceasta se adaugă şi influenţarea procesului de diferenţiere, producţiei
de Ac şi a comportamentului chemotactic al LB. (Corcione 2006)
Cel mai important, MSC suprimă diferenţierea terminală a LB în plasmocite
(condiţionată de factorul Blimp-1 – B-lymphocyte induced maturation protein 1) declanşată în
urma stimulării lor de către lipopolizaharide (LPS) (Asari 2009)
Mecanismul imunosupresiei LB nu necesită interacţiunea MSC-LB şi prezenţa IFN-γ
(stimulează producţia enzimei IDO de către MSC – cu presupus efect supresor al LB prin calea
metabolică a triptofanului) (Asari 2009). Asari (2009) a arătat că factorii MCP-1 (monocyte
chemotactic protein 1), IL-1 şi TGF-β nu sunt implicaţi în supresia LB, şi că acest mecanism se
bazează pe factori solubili (necunoscuţi încă) care scad expresia ARNm pentru Blimp-1.

11.1.3 Interacţiunea MSC cu celulele prezentatoare de antigen (APC)

Pe lângă supresia directă a LT şi LB, MSC par a controla in vitro şi celulele prezentatoare
de antigen (Fig. 11.1, Fig. 11.2), un factor cheie implicat în supresia indirectă a LT şi LB.
Dintre APC, MSC interacţionează preferenţial cu celulele dendritice (CD). Interacţiunea
MSC-CD se manifestă la nivelul diferenţierii (suprimând diferenţierea acestora – rezultă CD
imature cu fenotip imunosupresor), maturării şi funcţionarii CD. MSC inhibă diferenţierea
progenitorilor CD34+ în celule dendritice CD1a+, conducând la obţinerea unor celule cu fenotip
asemănător macrofagelor. (Nauta 2007)
MSC inhibă expresia pentru CD1a, CD40, CD80 şi CD86 în cursul maturării celulelor
dendritice. (Salem 2009)

  92 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 11]                                                                                                                                  Imunologia MSC 

CD produse sub influenţa MSC au afectat răspunsul la semnalele de măturare precum şi


expresia CD83, HLA-DR şi a moleculelor costimulatoare (Jiang 2005). La acestea se adaugă şi
alterarea potenţialului citokinelor (i.e. scăderea citokinelor proinflamatorii – TNF-α, IFN-γ şi IL-
12, cu creşterea producţiei pentru citokinele antiinflamatorii – IL-1) (Aggarwal 2005).
Dintre factorii solubili implicaţi în supresia CD, în literatură se citează: IL-6, M-CSF,
PGE2 şi IL-10.
Cu toate că in vitro capacitatea supresoare a MSC la adresa LT şi CD este dovedită, încă
nu a fost observat un corespondent biologic relevant in vivo.

11.1.4 Interacţiunea cu celulele natural killer (NK)

Celulele NK sunt celule ce prezintă activitate citolitică spontană îndreptată în special


asupra celulelor ce nu exprimă molecule HLA clasa I.
Rezultatele experimentale indică faptul că MSC exercită efecte inhibitorii asupra
citotoxicităţii celulelor NK îndreptată asupra celulelor HLA clasa I pozitive (în mod normal mai
puţin susceptibile atacului litic al celulelor NK). Mai exact, MSC inhibă parţial proliferarea
celulelor NK activate (Fig. 11.1, Fig. 11.2) şi împiedică proliferarea celor latente (da Silva
2008).
Mecanismele implicate în reglarea activităţii celulelor NK necesită factori solubili
(pentru scăderea proliferării celulare şi a producţiei de citokine) şi contact intercelular (pentru
inhibarea capacitaţii citotoxice). Producere PGE2 de către MSC afectează capacitatea
proliferativă a celulelor NK, expresia CD56 şi citotoxicitatea fără a influenţa însă producţia de
citokine sau expresia unor receptori activatori (Sotiropoulou 2006). Inhibarea secreţiei TGF-β
restabileşte parţial capacitatea proliferativă a celulelor NK, în timp ce blocarea simultană TGF-β
+ PGE2 restabileşte complet aceeaşi funcţie, sugerând implicarea ambilor factori însă pe căi
diferite.
Sotiropoulou (2006) consideră că efectele asupra celulelor NK sunt de tip combinatorial,
datorându-se contactului MSC-celule NK, producerii de factori solubili de către MSC, implicării
TGF β şi/sau prostaglandinei E2. La acestea se adaugă şi molecula PD-1 (programmed death 1)
care legându-se de liganzii PD-L1 şi PD-L2, poate fi responsabilă de inhibarea celulelor NK şi
LT. (Salem 2009)
Deşi manifestă o activitate supresoare a celulelor NK, MSC pot fi lizate in vitro de către
celulele NK activate, cu toate că exprimă MHC clasa I. Aceasta se datorează expresiei unor
liganzi pe suprafaţa MSC ce interacţionează cu receptorii activatori ai celulelor NK. Tratamentul
MSC cu IFN-γ diminuează susceptibilitatea MSC faţă de activarea celulelor NK prin creşterea
expresiei HLA clasa I pe suprafaţa celor dintâi. (Spaggiari 2006)

  93 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 11]                                                                                                                                  Imunologia MSC 

Fig. 11.1. Efectele imunomodulatorii ale MSC. (Nauta 2007)


CTL - limfocite T citotoxice.

  94 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 11]                                                                                                                                  Imunologia MSC 

Fig. 11.2. Efectele imunomodulatorii ale MSC. (Salem 2009)

  95 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 11]                                                                                                                                  Imunologia MSC 

11.2 Imunologia MSC in vivo

11.2.1 Imunogenitatea MSC

Clasic, MSC erau considerate celule hipoimunogenice, imunoprivilegiate, datorită


expresiei scăzute a antigenului HLA, complexului MHC clasa I şi a lipsei expresiei moleculelor
de costimulare (Tse 2003).
Faptul că MSC suprimă activitatea LT într-o manieră antigen-independentă, la care se
adaugă observaţia că MSC evită in vivo răspunsul imun (Koc 2002), facilitează utilizarea lor în
clinică în lipsa medicaţiei imunosupresoare.
Totuşi, unele studii arată că MSC pot funcţiona ca APC şi pot activa răspunsul imun în
anumite condiţii (Stagg 2006).
Studii ce au vizat xenotransplantul MSC umane au arătat că aceste celule nu sunt
privilegiate imunologic, iar injectarea lor intracoronară la şobolani imunocompetenţi este urmată
de rejet şi asociată cu popularea miocardului cu macrofage în timp ce la controlul
imunoincompetent s-a constatat supravieţuirea lor (Grinnemo 2004). Rezultate similare au fost
obţinute şi în cazul utilizării MSC alogene (Eliopoulos 2005)
Aceste observaţii traduc faptul că MSC alogene se pot grefa în gazde imunocompromise
sau în locuri imunoprivilegiate, însă ele declanşează răspuns imun la gazdele cu sistem imunitar
indemn.
Cu toate acestea, rejetul MSC alogene poate fi util clinic. În acest mod se asigură o
supravieţuire redusă a MSC şi o supresie temporară a sistemului imun al gazdei, reducând riscul
infecţiilor oportuniste, al transformărilor tumorale şi al supresiei fenomenului graft-vs-tumoră.
În plus, există posibilitatea ca aceste observaţii să nu fie aplicabile în totalitate alo/auto-
transplantului MSC umane, şi să fie specifice speciei, întrucât au fost observate pe şoareci şi
şobolani (alo sau xenotransplant).
Indiferent de situaţie, se impune studiul aprofundat al rolului MSC în cadrul răspunsului
imun, iar rejetul lor trebuie luat în calcul chiar şi numai teoretic în cadrul trialurilor.

11.2.2 Observaţii experimentale la animale

Proprietăţile imunomodulatoare ale MSC au fost investigate la animale din punct de


vedere al imunităţii aloreactive (transplant de organ şi transplant celular), al autoimunităţii sau al
imunităţii tumorale.
MSC alogene sau singene au mărit durata de supravieţuire a grefelor tisulare (piele –
babuin (Bartholomew 2002)) sau celulare (celule stem alogene – şoarece (Nauta 2006).
Cu toate acestea, cele mai prolifice rezultate au fost obţinute în tratamentul GVHD.
Rezultatele favorabile au fost asociate cu transplantul precoce al MSC şi cu administrarea mai
multor cure. (Nauta 2007)
MSC au fost utilizate cu succes şi pentru ameliorarea unor procese autoimune (EAE –
encefalită autoimună – şoarece (Zhang 2005)), cu condiţia administrări lor precoce, înainte de
stabilizarea bolii.
Prin acţiunea suportivă manifestată în caz de inflamaţie (e.g. glomerulonefrită, sindrom
ischemie/reperfuzie), MSC confirmă tropismul faţă de ţesuturile afectate ischemic/inflamator
observate in vivo la om şi animale.
Totuşi, există afecţiuni inflamatorii, precum artrita reumatoidă (model experimental
murin – collagen induced arthritis) în care MSC nu au oferit nicio îmbunătăţire a evoluţiei. Se
speculează că efectul imunosupresor al MSC a fost blocat de TNFα din mediu (observaţie in
vitro), astfel încât ar putea fi necesară utilizarea unor MSC prelucrate prin inginerie celulară.
(Chamberlain 2007)

  96 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 11]                                                                                                                                  Imunologia MSC 

Pe lângă efectele favorabile, Djouad (2003) a observat că MSC favorizează dezvoltarea


melanoamelor la gazde murine imunocompetente în caz de cotransplant MSC + celule tumorale.

11.3 Rezultate clinice

Datorită capacitaţii imunosupresive, MSC pot contribui remarcabil în domeniul


transplantului de ţesuturi solide sau celule, pentru prevenirea/tratamentul rejetului sau a GVHD
(posibil tratament celular).
Studiile clinice ce au vizat siguranţa infuziei MSC au arătat că acestea nu prezintă nicio
complicaţie/efect advers pentru pacienţii cu hipofuncţie medulară după tratamente mieloablative
(cancer de sân (Koc 2000), afecţiuni maligne hematologice (Lazarus 2005)).
În 2007, Ball a arătat că transplantul simultan de celule stem haploidentice + MSC
medulare provenite de la donatorul celulelor haploidentice, a accelerat recuperarea leucocitară la
13 copii.
Rezultate ce susţin o aplicabilitate clinică extinsă au fost obţinute în profilaxia şi
tratamentul GVHD. În acest caz, infuzia MSC nu a produs efecte adverse, contribuind la
vindecarea a 50% dintre pacienţi (cu afectare intestinală GVHD) şi îmbunătăţirea statusului a
altor 25% (Le Blanc 2004).
Mecanismele care stau la baza efectelor imunomodulatoare in vivo nu sunt cunoscute,
însă se speculează că se pot corela cu cele observate in vitro. În plus, homing-ul MSC
transplantate este îndreptată către ţesuturile limfatice, MO, capilare pulmonare, ţesuturi
ischemice şi tumorale, şi nu către ţesuturile de origine, sugerând implicarea unor fenomene de tip
contact celulă-celulă sau eliberare de factori solubili după stimularea MSC la nivel local.

  97 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 12]                                                                                                                   Celulele stem şi cancerul 

12 CELULELE STEM ŞI CANCERUL


„Cancer is a problem of developmental biology.”
G. Barry Pierce

Existenţa asemănărilor între celulele stem şi celulele maligne (cea mai importantă fiind
cea de self-renewal), a indus apariţia ipotezelor privind implicarea celulelor stem în originea şi
dezvoltarea proliferărilor maligne.
Se speculează că celulele stem participă la dezvoltarea proceselor proliferative prin mai
multe mecanisme, cunoscute însă parţial. Dintre acestea se remarcă participarea directă a
acestora, prin suportul direct al tumorigenezei sau prin dezvoltarea cancerului direct dintr-o
celulă stem, şi cea indirectă, reprezentată de interacţiunea şi contribuţia celulelor stem la
dezvoltarea nişei celulelor stem maligne (Tab. 12.1).

Tab. 12.1. Tipuri de cancere în care sunt implicate celulele stem.


Tumora Wilms Cancerul de piele
Neuroblastomul Cancerul de sân
Teratocarcinoamele Cancerul de prostată
Cancere de piele Cancerul pulmonar
Adenocarcinoamele Cancerul hepatic
Proliferările hematologice Cancerul genital
după Sell 2004a

12.1 Mecanisme oncogenetice ce implică celulele stem

12.1.1 Teoria resturilor embrionare

La mijlocul anilor 1800, Virchow a observat asemănarea între teratocarcinoame şi


ţesuturile fetale, bănuind astfel o legătură între cele două.
În comparaţie cu ţesuturile normale, cancerele erau considerate atunci ca fiind
dediferenţiate (pentru a explica asemănarea morfologică cu ţesuturile embrio-fetale). Totuşi
acest termen nu este obiectiv, întrucât defineşte un comportament puţin probabil pentru cancere.
(Sell 2004a)
Cohnheim şi Durante au postulat ulterior că originea cancerelor se află în resturile
embrionare ce se găsesc în ţesuturile mature, ca urmare a producerii lor în exces. Pentru că
Cohnheim a afirmat că ţesuturile se regenerează pe baza celulelor stem din sângele circulant, a
apărut teoria conform căreia cancerele provin din celulele stem din sânge. Ulterior, Beard a
extins această idee menţionând că procesele maligne provin din ţesutul placentar displazic sau
din celulele germinale activate, din ţesuturile adulte. (Sell 2004a)
În 1889, Cohneheim a afirmat că pentru a căpăta caracter malign sau benign, un proces
proliferativ depinde de comportamentul organismului gazda, insistând asupra rolului critic al
angiogenezei în transformarea benign-malign. (Sell 2004a)
Mai târziu, la începutul secolului XX, Ribbert a identificat ca factor cheie al exprimării
fenotipului malign, izolarea celulelor proliferative faţă de mediul înconjurător cu rol de control.
Această teorie a fost apoi aplicată de către Rotter care a considerat că celulele germinale, în
timpul călătoriei lor în organismul fetal, se pot grefa accidental în alte organe – altele decât
glandele sexuale, generând tumori (teratocarcinoame).
Având în vedere aceste concepte, este posibil ca originea cancerelor să se găsească în
orice celulă germinală sau embrionară, grefată accidental în alt organ în timpul organogenezei.

  98 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 12]                                                                                                                   Celulele stem şi cancerul 

În plus, celulele stem şi cele maligne prezintă caractere comune: abilitatea de a prolifera,
invada, migra şi dezvolta în ţesuturi diferite faţă de cele de origine.
Pe baza acestor observaţii, Sell (1994) consideră celula stem ca fiind echivalentul
modern al resturilor embrionare clasice, mai ales că cele mai multe tumori îşi au originea în
celule cu maturaţia blocată, provenite din celule stem.

12.1.2 Teoria mutaţiilor/Anaplazia

Teoria resturilor embrionare a început să fie înlocuită la începutul secolului XX de ideea


că factori precum chimicele, virusurile şi factorii fizici acţionează asupra celulelor mature
producând dediferenţierea acestora în procese proliferative.
Pentru aceste celule mature modificate s-a introdus termenul de anaplazie (ana – înapoi,
plasis – a modela), descriind procesul modificărilor celulare ce permit creşterea cancerelor prin
dediferenţiere. Actualmente acest termen descrie pierderea caracterelor morfologice de
diferenţiere. (Sell 2004a)
Cu toate acestea, teoria modernă a cancerului implică modificări genetice ce alterează
funcţia reglatoare a creşterii celulare ca urmare a acţiunii factorilor carcinogenetici capabili de a
produce mutaţii genetice mai degrabă la nivelul progenitorilor celulari aflaţi în diviziune decât
la nivelul celulelor mature (exceptând ficatul, în care celulele mature îşi păstrează proprietatea
de diviziune). Se consideră că mutaţiile apărute la nivelul celulelor stem tisulare, al
progenitorilor tisulari sau celulelor pluripotente circulante pot sta la baza dezvoltării unui
cancer, prin procesul de blocare a maturaţiei (Piscaglia 2008).
Un rol important îl deţine şi apariţia mutaţiilor spontane ce apar în timpul diviziunilor
unei celule progenitoare, acumulându-se rapid în faza de creştere liniară (Frank 2003). Astfel, se
presupune că ţesuturile adulte sunt însămânţate încă de la început cu un număr redus de celule
cu potenţial malign. (Sell 2004a)
Pentru ca o proliferare tumorală să se dezvolte este necesară apariţia unei populaţii
celulare capabile de self-renewal, numită tumor-initiating cells/cancer-initiating cells, ce poate
avea originea în celule stem, celule progenitoare sau celule diferenţiate. Acestea stau la baza
iniţierii procesului malign. Dezvoltarea şi metastazarea acestuia sunt atribuite celulelor stem
canceroase (CSC), celule cu capacitate de self-renewal ce generează toate liniile celulare mature
specifice unui cancer (conform definiţiei date de American Association of Cancer Research).
Teoria stocastică susţine că reînnoirea şi diferenţierea sunt procese haotice astfel încât
fiecare celulă canceroasă are posibilitate de a reţine capacitatea de self-renewal în timp ce teoria
celulelor stem canceroase sustine existenţa unor populaţii funcţionale distincte ierarhizate în
vîrful cărora se află tumor-initiating cells. (Piscaglia 2008)
Sunt cunoscute cel puţin două modalităţi de apariţie a celulelor stem tumorale (Fig.
12.1). În primul rând mutaţiile oncogenetice pot inactiva mecanismele de siguranţă ale
proliferării celulelor stem normale, rezultând celule canceroase. Aceleaşi mutaţii pot influenţa şi
interacţiunile celulei stem normale cu nişa, în special în ceea ce priveşte reglarea capacităţii de
self-renewal. (Clarke 2006)
Ca alternativă, celulele stem maligne pot produce factori proprii pentru a recruta celule
formatoare de nişă. În plus, ele pot activa şi căi de self-renewal aberante la semnale care în mod
normal reglează acest proces. Pe lângă aceasta, celulele stem maligne pot activa mecanisme
intracelulare sau pot exprima liganzi (specifice/i celulelor nişei) şi activa receptorii acestor
liganzi, realizând un proces autonom de self-renewal. (Clarke 2006)
În al doilea rând, mutaţiile oncogenetice permit TAC să îşi continue proliferarea fără a
intra în faza de diferenţiere postmitotică, formând astfel o populaţie de celule auto-replicante în
care se pot acumula mutaţii spontane care să ducă în final la apariţia celulelor canceroase cu
origine în celule mai diferenţiate decât celulele stem. (Clarke 2006)
Mutaţiile pot distruge secvenţa de activare a genelor de diferenţiere, de inhibare a
ciclului celular sau de apoptoză a TAC. O altă variantă include afectarea mecanismelor care

  99 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 12]                                                                                                                   Celulele stem şi cancerul 

limitează diviziunea TAC. Ca rezultat, TAC scapă de sub controlul ce le conferă un număr
limitat de diviziuni, iar pentru că numărul lor este mai mare ca al celulelor stem, proliferarea lor
sub influenţa mutaţiilor este un pas important în formarea tumorilor. (Clarke 2006)
Cancerele pot apărea la orice vârsta, pornind de la TAC. Gradul de diferenţiere al
proliferării depinde de gradul de diferenţiere atins de TAC la momentul acţiunii factorilor
declanşatori. Pe lângă aceasta, şi comportamentul biologic al cancerului depinde de stadiul de
maturare al acestor celule. Astfel, TAC este blocată la acel moment al maturării sale, putând
produce astfel, cancere de la slab (dacă TAC se află la începutul procesului) la bine diferenţiat
(dacă TAC este la finalul procesului).
Pe lângă acestea, pentru ca un proces proliferativ să se dezvolte, trebuie ca modificările
oncogenetice să se producă într-o celulă ce se divide şi care nu poate fi eliminată în cursul
turnover-ului fiziologic (e.g. celulele din mucoasa digestivă ce sunt descuamate fiziologic în
lumen) – rămânând în organism şi proliferând malign. În acest sens celulele stem orientate către
malignizare, prin diviziune asimetrică (putând păstra o fiică modificată malign), îndeplinesc
condiţiile necesare întreţinerii proliferărilor maligne. În plus, toate ţesuturile adulte conţin linii
celulare ce au la bază celule stem specifice şi urmaşi ai acestora (TAC).
În ceea ce priveşte intervenţia genelor în oncogeneză, sunt suspectate genele
responsabile de self-renewal. Una din acestea este gena Bmi1. Studiile pe şoareci au arătat că
aceasta este necesară menţinerii identităţii HSC şi celulelor stem neurale (Park 2003), prin
suprimarea genelor de diferenţiere. Aceeaşi genă este implicată şi în proliferarea celulelor stem
maligne (celule stem-like cu capacitate de self-renewal ce susţin populaţia celulelor tumorale)
(Clarke 2006).
La polul opus sunt genele ce codifică proteine precum p19Arf, p16Ink4a, şi Tp53, gene
supresor tumorale, care sunt inhibate de către Bmi1, şi care fac parte dintr-un mecanism de
siguranţă al celulelor stem sau celulelor progenitoare (Clarke 2006).
Astfel, numeroase tumori pot lua naştere în urma mutaţiilor ce dezorganizează căile
normale de proliferare, culminând cu formarea de celule stem maligne responsabile de evoluţia
ulterioară a tumorii.
Existenţa CSC, celule latente, explică eşecul terapiilor ce ţintesc celulele proliferative,
însă orientează şi asupra unor noi metode: ţintirea căilor de comunicare Wnt, Sonic Hedgehog şi
Notch, implicate în stemness şi responsabile de progresia şi metastazarea cancerului. Aplicarea
unor astfel de terapii necesită cruţarea celulelor stem normale, ce se poate realiza prin utilizarea
unui marker precum CD133 – glicoproteină transmembranară exprimată de către unele celule
stem normale (linia hematopoietică, epitelială şi endotelială) dar şi de CSC ale melanoamelor,
cancerelor de rinichi, colon, ficat şi ovar. (Piscaglia 2008)

  100 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 12]                                                                                                                   Celulele stem şi cancerul 

Fig. 12.1. Modele de origine a celulelor stem maligne prin eludarea controlului nişei
asupra celulelor stem normale. (Clarke 2006)
A. În țesuturile normale, celulele nişei (verde pal) oferă semnale ce stimulează activitatea de
self-renewal (săgeata curbă) a celulelor stem (albastru); celulele progenitoare (roz, galben şi
oranj) nu răspund la aceste semnale, proliferarea lor fiind reglată prin contorizarea numărului de
diviziuni mitotice. B. Expansiunea celulelor ce formează nişa (verde pal) facilitează expansiunea
celulelor stem maligne (roz închis); creşterea nişei se datorează fie modificărilor celulelor stem
maligne sau celulelor ce formează nişa; oricare ar fi varianta corectă, s-a observat că celulele
stem maligne dau naştere unor celule non-maligne cu aberații de diferențiere ce formează masa
tumorală. C. Modificările celulelor stem maligne (roz închis) permit racolarea de celule
alternative formatoare de nişă (verde închis) care să ofere celulelor stem maligne semnale
pentru întreținerea replicării; acest mecanism poate sta la baza invaziei țesuturilor locale şi a
metastazării (NB: Tumorile sunt un amestec de celule stem maligne şi celule non-maligne cu
aberații de diferențiere). D. Shiful-ul celule stem maligne dependente de nişă/celule stem
maligne independente de nişă poate fi asociat cu modificarea unui cancer ce se transforma din
“blând” în agresiv; este posibil ca mutațiile apărute în cursul diviziunilor să transforme celulele
progenitoare în celule stem-like capabile de self-renewal; evenimente ulterioare ce implică
aceste celule transformate pot culmina cu apariția unui neoplasm. În acest exemplu originea
celulelor stem maligne este în celulele progenitoare şi nu stem normale.

  101 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 12]                                                                                                                   Celulele stem şi cancerul 

12.1.3 Recrutarea celulară

În 1889, Stephen Paget a arătat în teoria „seed and soil”, că micromediul înconjurător
este un factor cheie al creşterii tumorale. Aproape la un secol distanţă, Folkman propune ipoteza
în care angiogeneza este elementul vital al proliferării tumorale, astfel încât „switch-ul
angiogenetic” reprezintă o modificare fenotipică critică (Hanahan 1996).
Cercetările ultimilor ani au evidenţiat faptul că proliferarea tumorală se bazează pe
interacţiunea cu alte celule (celule stromale endoteliale, fibroblaste, pericite şi celule
inflamatorii), inclusiv celule progenitoare medulare (Sangai 2005). Acestea părăsesc MO,
migrează în torentul circulator şi se încorporează în mediul tumoral favorizând creşterea
acestuia (de Bont 2001) (Fig. 12.2).
Celulele medulare asociate dezvoltării tumorale reprezintă un grup vast numit „bone
marrow derived tumor stromal cells”, cu origine hemato şi non-hematopoietică. Un subgrup al
acestora, „bone marrow derived tumor associated endothelial cells” îşi au originea în celulele
progenitoare endoteliale (EPC) şi EPC-like (monocite şi macrofage trans-diferenţiate, MAPC şi
MSC (Liu 2007)).

Fig. 12.2. Modularea micromediului tumoral de către celulele derivate din măduva
osoasă. (Roorda 2009)
Celulele stem hematopoietice şi non-hematopoietice produc progenitori celulari care odată pătrunşi
în torentul sangvin pot migra la nivelul tumorilor. TEM - Tie2-expressing monocytes; EPC - celule
progenitoare endoteliale; PPC - celule progenitoare pentru pericite.

Există dovezi ce susţin existenţa unei ierarhii celulare tumorale reminiscente (specifice
ţesutului în care a luat naştere proliferarea) pentru cancerele hematologice şi tumorile solide. În
cadrul acestei ierarhii la bază se găseşte o celulă stem malignă ce produce urmaşi cu potenţial de
replicare limitat (Singh 2004). Existenţa unei astfel de celule are implicaţii clinice şi terapeutice
majore. (Clarke 2006)

  102 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 12]                                                                                                                   Celulele stem şi cancerul 

Progresia cancerelor este dependentă de eşecul mecanismelor normale de dezvoltare


necesare regenerării celulelor cu viaţă scurtă (piele, tub digestive, sânge etc). Cancerele apar
frecvent în organele cu turnover accelerat. Înlocuirea celulelor mature se face pe baza unei
populaţii mici de celule stem ce dau naştere celulelor TAC, care după un număr finit de replicări
produc celule diferenţiate. În acest sistem ierarhic numai celulele stem se pot multiplica liber.
Această proprietate le conferă atât rol de protecţie antitumorală dar şi de precursor malign.
(Clarke 2006)

12.2 Rolul MSC în oncogeneză

Recent, MSC au fost adăugate listei celulelor ce contribuie la micromediul tumoral (Fig.
12.3).
A fost observat că MSC medulare contribuie la conturarea populaţiei fibroblastice în
stroma tumorală (Sangai 2005), ele fiind identificate atât în tumori umane (Direkze 2004) cât şi
animale. Experimental s-a constatat că MSC manifestă un homing preferenţial tumoral după
inoculare intraperitoneală sau intravasculară la şoareci (Roni 2003). În plus, Ramasamy (2007)
a observat că rata de apariţie a tumorilor este mai mare la subiecţii injectaţi cu celule canceroase
+ MSC faţă de cei inoculaţi doar cu celule tumorale, probând astfel rolul MSC în grefarea şi
creşterea tumorală.

Fig. 12.3. Rolul MSC în modularea micromediului tumoral. (Roorda 2009)


MSC sunt precursori ai celulelor stromale tumorale. A. Fibroblastele derivate din MSC facilitează
creşterea tumorală în mod direct (prin producerea de factori ce acționează pe celulele tumorale) sau
indirect (stimulând formarea vaselor tumorale prin producerea de factori tumorali pro-angiogeni).
B. Aceleaşi fibroblaste sunt implicate şi prin trans-diferențiere în celule endothelial-like şi pericyte-
like, ce contribuie la formarea vaselor tumorale. C. Formarea de celule endoteliale adevărate,
provenite din EPC - celule endoteliale progenitoare.

Deşi nu este complet explicat modul în care MSC sprijină proliferările maligne, se
speculează totuşi rolul acestora ca factor imunosupresor (favorizând grefarea şi proliferarea
tumorală) şi de modulator al micromediului tumoral prin stimularea angiogenezei (Roorda

  103 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 12]                                                                                                                   Celulele stem şi cancerul 

2009). MSC suprimă răspunsul imun antitumoral (Djouad 2003). Ramasamy (2007) le atribuie,
în plus, rolul de a participa la formarea nişei stem tumorale protejând astfel celulele tumorale de
apoptoza indusă terapeutic.

12.2.1 Angiogeneza

Este un proces cunoscut parţial în ceea ce priveşte implicarea MSC.


În primul rând, fibroblastele derivate din MSC stimulează creşterea tumorală direct (prin
producerea de factori ce acţionează direct pe celulele tumorale) şi indirect (prin producerea de
factori pro-angiogenetici – VEGF, PDGF, FGF, SDF-1 (Kinnaird 2004) – ce acţionează pe
celulele endoteliale).
În al doilea rând fibroblastele derivate din MSC au capacitatea de a transdiferenţia în
celule endothelial-like şi pericyte-like, implicate în formarea şi stabilizarea vaselor tumorale.
La acestea se adaugă şi capacitatea MSC de a se încorpora fizic în vascularizaţia in vivo.

12.2.2 Crearea nişei stem tumorale

Întrucât MSC contribuie la constituirea nişei stem hematopoietice, s-a propus ideea că
ele au acelaşi rol şi pentru ţesuturile tumorale (Ramasamy 2007).
Cu toate că in vitro, MSC exprimă un efect antitumoral (scad ciclina D2 tumorală
asociată cu menţinerea celulelor în faza G1 şi scăderea apoptozei – celule tumorale latente),
această observaţie este total opusă in vivo.
Se speculează astfel că MSC favorizează supravieţuirea celulelor tumorale protejându-le
de apoptoză. Menţinerea celulelor stem tumorale în stare de latenţă este un factor critic,
deoarece conservă potenţialul de self-renewal şi longevitatea acestora. În acest sens, rezultatele
lui Ning (2008), care a observat o rată de recurenţă crescută la pacienţii trataţi cu cotransplant
HSC + MSC, sunt obiective şi evidenţiază rolul protector al MSC faţă de celulele tumorale.
În plus, Matsunaga (2003) a observat că celulele tumorale umane legate de fibronectina
celulelor stromale medulare, prin intermediul moleculei VLA4 (very late antigen 4) devin
rezistente la apoptoza spontană sau indusă medicamentos.

12.2.3 Mobilizarea celulelor stromale medulare

Pentru a putea susţine creşterea tumorală a procesului proliferativ situat la distanţă, MSC
trebuie să circule.
În acest sens, Kawada (2004) a observat că MSC murine pot fi mobilizate în sângele
periferic condiţionându-le cu G-CSF (granulocyte colony stimulating factor) şi se pot grefa în
ţesutul cardiac ischemic. Mai mult, Bittira (2003) a observat că MSC migrează spontan către
ţesutul miocardic ischemic al şobolanilor.
La om MSC circulante au fost identificate după stimularea cu factori de creştere la
pacienţii cu cancer de sân (Tondreau 2005) dar şi la persoane sănătoase fără stimulare
(Kuznetsov 2001).
Celule stromale medulare pot fi mobilizate sub influenţa factorilor produşi de tumori,
precum: VEGF, angiopoietina-1, SDF-1, GM-CSF, urmând gradientul acestora în torentul
circulator până la nivelul tumorii (Spring 2005).
În ceea ce priveşte integrarea lor tumorală se speculează rolul moleculelor de adeziune şi
al integrinelor (Chamberlain 2007).
Cu toate că unele grupuri nu au reuşit identificarea unor astfel de celule circulante,
rezultatele susţin existenţa unei populaţii MSC circulante (Roorda 2009).

  104 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 12]                                                                                                                   Celulele stem şi cancerul 

12.3 Semnalizarea celulelor stem în cancer

Întrucât cancerul reprezintă o proliferare necontrolată a celulelor, identificarea căilor de


semnalizare implicate în modularea diviziunii este esenţială.
Astfel, au fost recunoscute mai multe căi de comunicare implicate: Oct-4, Wnt/β-
catenină, Notch, BMP, Janus, Hedgehog, dintre care mai atent analizate au fost căile Oct-4 şi
Wnt/β-catenina. (Sell 2004a) Acestea contribuie la selectarea celulelor rezultate din diviziune
pentru parcurgerea procesului de diferenţiere.
Oct-4 este un factor transcripţional specific celulelor stem embrionare şi germinale, fiind
implicat în menţinerea totipotenţei şi a diviziunii pentru celulele stem, dar şi în menţinerea stării
de nediferenţiere a cancerelor (Kraft 1996). Blocarea acestui factor contribuie la diferenţierea
celulelor canceroase promovând un prognostic clinic favorabil (Sell 2004a).
La un moment cronologic mai târziu în dezvoltarea unui cancer, calea Wnt/β-catenina
stimulează proliferarea (Shibata 2003) şi inhibă apoptoza (Ueda 2002), caracteristice cancerului,
probabil prin implicare în alterarea orientării cromozomilor în timpul mitozei, favorizând
apariţia aberaţiilor genetice specifice (Peifer 2000), datorită activării de către β-catenină a
genelor ciclina D1, c-jun şi c-myc (Anna 2003) în urma asocierii cu factorii Tcf şi Lcf (He
1998).

12.4 Mecanisme de protecţie antitumorală

Echilibrul între self-renewal şi diferenţiere trebuie menţinut strict pentru a susţine fondul
de celule stem şi mature nealterat. Deoarece celulele stem şi cele tumorale au în comun
proprietatea de self-renewal, este esenţial ca numărul de celule fiice ce păstrează caracterul stem
să fie controlat atent, împiedicând astfel proliferarea necontrolată a acestora.
Organismele pluricelulare au dezvoltat mecanisme de protecţie antitumorală. Astfel,
pentru a lua naştere un anumit tip de cancer, trebuie ca un anumit număr de mutaţii să se
acumuleze în aceeaşi linie celulară, iar mecanismele de protecţie ale creşterii şi apoptozei să fie
inactive (Fearon 1990).
Pentru că aceste mecanisme singure nu sunt suficiente, organismul se protejează şi prin
limitarea numărului de celule cu potenţial de self-renewal (numai celulele stem) – scăzând astfel
şansele de acumulare a mutaţiilor spontane. (Clarke 2006)
Reglarea strictă a numărului de diviziuni al celulelor TAC este un alt mecanism de
protecţie. Acesta este limitat la câteva cicluri de replicare (diferit de cel al celulelor stem din
care provin, care este nelimitat) până ce aceste celule se diferenţiază, astfel încât garantează
încetarea activităţii progeniturilor înainte de a acumula mutaţii. Deşi există gene ce controlează
acest număr, rolul suprem îi revine micromediului celular (nişa stem) care controlează self-
renewal-ul şi decizia de diferenţiere (Spradling 2001). Rezultatele lui Calvi (2003) arată că nişa
stem joacă un rol important în reglarea expansiunii celulelor stem, în special prin mecanisme
apocrine, feedback negativ pentru semnalele mitogene şi căi de supresie a diferenţierii.
Mecanismele de supresie includ supresia translaţională precum şi regulatorii de cromatină ce
suprimă expresia genelor de diferenţiere terminală a celulelor stem.
Un alt mecanism de protecţie este reprezentat de catalogarea stării de diferenţiere ca
stare bazală propriu-zisă (default state), astfel încât în momentul diferenţierii celulele stem
părăsesc nişa.
Existenţa CSC (faţa neagră a celulelor stem) şi a mecanismelor carcinogenetice ce au la
bază celulele stem normale şi celulele progenitoare, impun o apreciere a balanţei risc-beneficiu
a terapiilor celulare şi o analiză amănunţită a acestora înainte de utilizare.

  105 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 13]                                                                 Metode de caracterizare şi identificare in vivo a MSC 

13 METODE DE CARACTERIZARE ŞI IDENTIFICARE IN


VIVO A MSC

„Science arises from the discovery of Identity amid


Diversity.”
William Stanley Jevons

Dezvoltarea unor metode terapeutice celulare depinde în bună măsură şi de posibilităţile


tehnice de analiză şi urmărire a celulelor transplantate. Dintre acestea se pune accentul pe
procedeele de analiză fenotipică a celulei ce vizează siguranţa sub toate aspectele sale, însă cu
precădere a modificărilor genetice, şi pe tehnicile de monitorizare in vivo şi in situ.
Întrucât realizarea de biopsii multiple nu este fezabilă, cauzând cicatrici şi modificări
locale sau lovindu-se de inaccesibilitatea unor organe ţintă precum inima sau creierul, au fost
dezvoltate numeroase procedee imagistice şi molecular-genetice, care separat sau combinate îşi
propun să contureze o imagine completă asupra comportamentului celulelor posttransplant.
Deşi există o multitudine de tehnici, niciuna nu este câtuşi de aproape de metoda ideală,
modificând mai mult sau mai puţin celula transplantată ceea ce contravine indicaţiilor FDA
(Food and Drug Administration, USA) de a nu introduce elemente exogene în celule de uz uman.

13.1 Metode de caracterizare genetică

13.1.1 Cariotiparea

Reprezintă cea mai facilă metodă de detecţie a aneuploidiilor şi identificare a speciei de


provenienţă a celulelor. Este un prim pas în analiza citogenetică a MSC, putând fi realizată
relativ uşor cu experienţă minimă. Analizează uzual 20 de metafaze/celule: conformaţia
cromozomilor pentru 6 metafaze şi numărul cromozomilor pentru alte 14. (Loring 2007)
Prin convenţie, interpretarea cariotipului notează: numărul cromozomilor, cromozomii
sexuali şi modificările vizibile ale cromozomilor (e.g. 46, XX, del(5p15.2) – femeie cu o deleţie
a benzii 15.2 a braţului p al cromozomului 5 (sdr. cri du chat)). (Loring 2007)
Are câteva dezavantaje: poate fi aplicată doar celulelor în metafază, sunt dificil de
surprins modificările ce nu alterează numărul cromozomilor şi are o rezoluţie de cca 10 Mb.
Alte metode citogenetice cu o rezoluţie mai mare sunt: cariotiparea spectrală (rezoluţie 1-
2 Mb), single nucleotide polimorfism (SNP) şi copy number polymorphism (CNP) fiecare cu o
rezoluţie de 30 kb. (Loring 2007)

13.1.2 Cariotiparea spectrală (SKY)

Este o tehnică diagnostică bazată pe hibridizare, utilizată pentru diagnosticarea aberaţiilor


cromozomiale. Pentru MSC poate detecta rearanjările specifice inter şi intracromozomiale,
precum şi numărul şi identitatea cromozomilor dintr-un nucleu metafazic. (Loring 2007)

13.1.3 Hibridizarea fluorescentă in situ (FISH)

Reprezintă o tehnică similară SKY, ce poate fi utilizată pe celule aflate în interfază (nu se
divid). Poate fi utilizată pentru a identifica prezenţa unei singure secvenţe de acid nucleic

  106 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 13]                                                                 Metode de caracterizare şi identificare in vivo a MSC 

specifică unui anumit cromozom. Are ca dezavantaj spre deosebire de SKY, imposibilitatea
analizei tuturor cromozomilor în aceeaşi sesiune, întrucât necesita sonde FISH specifice, astfel
încât este dificil de detectat rearanjările genomice ale tuturor cromozomilor simultan. (Loring
2007)

13.1.4 Single nucleotide polimorfism (SNP)

Este o metodă genetică cu o rezoluţie foarte mare, ce poate detecta modificări la nivelul
unei singure baze azotate din structura acidului nucleic (e.g. secvenţa AAGCTA vs. AAGCTTA
diferă la cel de al patrulea nucleotid; G şi T sunt alele); identifică mutaţia unei perechi de baze la
un anumit locus. (Loring 2007)

13.1.5 RT-PCR

Reprezintă metoda de bază utilizată pentru analiza expresiei genelor (profilul genic) în
culturile celulare, fiind simplă, senzitivă şi rapidă.
Este utilizată în combinaţie cu imunocitochimia şi/sau teste immunoblot; uzual este
folosită ca metodă de screening pentru expresia unor proteine.

13.1.6 Studiul profilului genic prin microarray

Este cea mai completă şi de încredere tehnologie, utilă analizei profilului genic al
celulelor.
Foloseşte ca principiu hibridizarea unui fragment dublu-catenar de ADNc marcat
fluorescent, realizat din ARNm al probei de interes, cu un corespondent ADNc (sau nucleotide
specifice unei gene) fixat pe lamele de sticlă.
Poate identifica simultan gene din mai multe experimente astfel încât se pot face
comparaţii şi translaţii ale rezultatelor foarte uşor.

13.2 Analiza flow-citometrică

Este utilizată pentru cuantificarea şi separarea subpopulaţiilor celulare dintr-o cultură.


Se bazează pe existenţa diferenţelor optice între celule şi pe existenţa unei
imunoreactivităţi specifice faţă de Ac marcaţi fluorescent, imunoreactivitate dată de existenţa
unui anumit fenotip tradus de exemplu prin existenţa unei anume configuraţii a unor marker-i.
Poate analiza parametri multipli ai unei celule: mărime, conţinut de acizi nucleici,
potenţial de membrană, anumiţi marker-i structurali etc., în funcţie de marcajul fluorescent
utilizat.
Această metodă poate fi utilizată atât pentru analiza celulelor cât şi pentru separarea şi
concentrarea subpopulaţiilor celulare.

13.3 Vizualizarea in vitro a MSC

Este utilizată în special pentru monitorizarea culturilor şi analiza structurală a celulelor.


Cel mai des este utilizată microscopia ranversată cu lumina „alba”. Alături de aceasta mai
rar sunt utilizate metodele de fluorescenţă, microscopia de polarizare, microscopia laser şi
microscopia electronica.

  107 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 13]                                                                 Metode de caracterizare şi identificare in vivo a MSC 

13.3.1 Microscopia de polarizare

Reprezintă o metodă de vizualizare a celulelor ce nu utilizează marcaje fluorescente,


bazându-se pe folosirea luminii polarizate şi pe anizotropia proprietăţilor optice ale
specimenului, precum birefringenţa şi dicroismul. (Goldman 2005)
Această metodă furnizează atât informaţii referitoare la localizarea componentelor
celulare cât şi imagini la nivel submicroscopic privind secvenţa şi ordinea moleculelor în diverse
structuri celulare. Cel mai important avantaj este posibilitatea de a prelua imagini live pe o
perioadă lungă de timp, la cea mai mare rezoluţie a microscopului, cu interferarea minimă a
fiziologiei celulei. (Goldman 2005)

13.3.2 Microscopia laser-scanning multifoton (MPLSM) şi multispectrala


(MSLSM)

Reprezintă o formă evoluată a microscopiei confocale. La fel ca şi aceasta poate utiliza


sonde fluorescente, însă are ca avantaj posibilitatea de achiziţie a informaţiilor în dimensiuni
multi-plan. (Goldman 2005)
MPLSM poate obţine informaţii din mai multe planuri şi într-o cantitate mai mare per
unitate de timp, în timp ce MSLSM identifică spectrul marker-ilor şi îmbunătăţeşte separarea
culorilor ceea ce face ca mai mulţi marker-i să fie vizualizaţi simultan. Ambele metode oferă o
rezoluţie submicron pentru o adâncime de 1 mm. (Goldman 2005)

13.3.3 Microscopia electronică de scanare-transmisie (STEM)

Este o achiziţie recentă în studiul celular, fiind dezvoltată de Diana Peckys (2009) şi
colaboratorii la Universitatea din Tennesee, USA.
Oferă imagini la o rezoluţie de ordinul nanometrilor, fiind ideală pentru studiul
intracelular. Prin această tehnică se poate studia celula în întregime fără a fi necesară secţionarea
specimenului aşa cum se procedează pentru microscopia electronică de transmisie clasică. Celula
este fixată într-o cameră electrono-transparentă cu mediu umed ce permite studierea proceselor
intercelulare în dinamică. (Peckys 2009)

13.4 Vizualizarea in vivo (posttransplant) a MSC

13.4.1 Metode radiologice clasice

Nu reprezintă alegerea de primă intenţie în studiile de imagistică celulară in vivo datorită


rezoluţiei scăzute şi a unor dificultăţi tehnice de marcare a celulelor. Realizarea contrastului
necesită cantităţi mari de materiale cu număr atomic mare. Astfel, pentru marcarea unei celule cu
un metal este nevoie de o cantitate de metal fixată de celulă cel puţin egală cu inversul densităţii
metalului ales. (Frangioni 2004)

13.4.2 Imagistica optică

Beneficiază de o gamă largă de tehnici (Tab. 13.1), dintre care marea majoritate
utilizează bioluminescenţa indusă de luciferază sau altă substanţă şi fluorescenţa. Progrese
remarcabile au fost realizate prin folosirea luminii NIR (near infra red) cu spectrul 650-900 nm

  108 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 13]                                                                 Metode de caracterizare şi identificare in vivo a MSC 

care facilitează pătrunderea în adâncime in vivo. Pentru lumina NIR se utilizează sonde specifice
compuse dintr-un vehicul de livrare a sondei legat de un fluorocrom NIR via o peptidă ce este
substratul unei enzime proteolitice. Proteoliza sondei după intrarea acesteia în celula amplifică
puterea de emisie. (Frangioni 2004)

Tab. 13.1. Metode imagistice optice.


Metoda Adâncimea maximă de Ţinta Potenţial clinic
penetranţă
Microscopia confocală 300 µm Fiziologică, moleculară Experimental
Microscopia two-photon 800 µm Fiziologică, moleculară Experimental
Imageria prin reflexie fluorescentă 5-7 mm Fiziologică, moleculară Da
Tomografia optică difuză 15-20 mm Fiziologică, moleculară Da
Tomografia moleculară fluorescentă 0-15 mm Fiziologică, moleculară Da
Imageria prin bioluminiscenţă 2-3 cm Moleculară Experimental
după Shah 2005

În cazul luciferazei pot fi obţinute rezultate fals-negative datorate absorbţiei crescute a


luminii de către ţesuturile vii (emite în spectrul 400-700 nm). În plus, utilizează ingineria genică
pentru introducerea genelor corespunzătoare, şi injectarea unor cantităţi mari de substraturi
(luciferin sau coelenterazin) cu potenţial imunogen. (Frangioni 2004)
Descoperirea proteinei verzi fluorescente (GFP), în anii ’’60, a facilitat dezvoltarea
tehnicilor de analiză şi urmărire a celulelor. Pe lângă aceasta, au fost descoperite proteine
fluorescente de la mai multe specii, îmbogăţind spectrul de culoare disponibil (fluorescenţă
verde, galbenă, albastru/cian, roşie).
Fluorescenţa se bazează pe producerea unor proteine fluorescente (e.g. GFP sau small-
molecule polymethines) după inserarea genei pentru acestea sau inocularea proteinei ca atare în
celulă. Are avantajul compatibilităţii cu microscopia optică uzuală putând identifica celule unice
pe preparate microscopice. Detecţia in vivo pe baza fluorescenţei este limitată la o penetrabilitate
de 4-10 cm adâncime în spectrul 700-1000 nm. Dezavantajul utilizării acestui tip de fluorescenţă
este reprezentat de diluţia agentului fluorescent odată cu diviziunea celulară, posibilitatea
înglobării lui de către alte celule în urma morţii celulei marcate şi lipsa accesibilităţii unor organe
ţintă. (Goldman 2005)
Uzual secvenţa genică răspunzătoare de sinteza acestor proteine este inserată în genomul
celulei astfel încât să fie exprimată de aceasta, facilitând analiza expresiei unor gene şi
localizarea componentelor celulare. Cea mai utilizată proteină este GFP, care a putut fi inserată
în genomul rozătoarelor de laborator, obţinându-se şoareci şi şobolani ale căror celule sunt
fluorescente (emit lumină verde la excitaţia UV).
Pentru detecţia acestor proteine se utilizează microscoape de fluorescenţă obişnuite sau
confocale, cu sau fără amplificarea semnalului proteinei cu ajutorul unor anticorpi anti-proteină
marcaţi fluorescent.

13.4.3 Microscopia confocală

Este un tip special de microscopie optică utilizată pentru obţinerea unor imagini cu o
claritate şi rezoluţie crescută. Modul de funcţionare a acestor microscoape elimină din imaginea
observată (imaginea in focus) toată informaţia ce distorsionează imaginea (din câmpul
microscopic out of focus). (Goldman 2005)
Faptul că practic „feliază” specimenele observate, şi apoi recompune imaginea, o face
ideală pentru studiul celulelor vii, eliminând astfel artefactele. În plus, rezoluţia foarte mare
constituie un alt avantaj (e.g. pot fi vizualizate detalii intracelulare pe fragmente de ţesuturi).
(Goldman 2005)
Dezvoltarea unei sonde laparoscopice confocale de către Goetz (2008) facilitează detecţia
celulelor stem cu ţintă viscerele abdominale accesibile laparoscopic. Deşi procedeul este la

  109 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 13]                                                                 Metode de caracterizare şi identificare in vivo a MSC 

început, având un dezavantaj important în penetrabilitate redusă la 250 µm adâncime de la


suprafaţa organului aflată în contact cu sonda, se preconizează o îmbunătăţire a sa cu aplicaţii
clinice largi.

13.4.4 Ultrasunetele

Ecografic se pot detecta celule marcate corespunzător cu un contrast acustic de tipul


interfeţei apă/gaz (e.g. microtubuli, perfluorocarbon) cu o rezoluţie de o celulă în condiţiile în
care o unitate de contrast are o dimensiune de 0,25-1 µm în diametru. (Frangioni 2004)
Cu toate acestea, metode robuste de fixare a contrastului la celule nu există. În plus, un
dezavantaj este reprezentat de faptul că prima celulă detectată aruncă o „umbră acustică” peste
următoarea astfel încât numărul acestora nu poate fi apreciat corect. La aceasta se adăugă
posibilitatea diluţiei agentului de contrast, încorporarea lui de către alte celule – similar sondelor
fluorescente, şi accesibilitatea limitată a ecografiei la un număr restrâns de organe. (Frangioni
2004)

13.4.5 Marcarea genetică a celulelor

S-a dezvoltat ca o alternativă a perioadei limitate de urmărire a marcajelor radionucleare.


Astfel, transfecţia celulelor cu gene precum: gena rezistenţei la neomicină, LNGFR sau HSV1-
tk, urmată de detecţia celulelor în sângele circulant prin PCR sau FACS reprezintă o soluţie.
(Gelovani, 2004)
Această metodă a evoluat, fiind utilizată cu succes pentru inoculare unor gene ce exprimă
proteine fluorescente (e.g. GFP, EGFP, luciferază) detectabile prin tehnici de fluorescenţă, sau a
unor gene implicate în detecţia radionucleară metabolică (e.g. HSV1-tk). (Gelovani, 2004)
Practic există trei categorii de gene de transfecţie: gene ce codifică receptori de suprafaţă
ce leagă sonda moleculară, gene ce codifică proteine de transport membranare ce internalizează
sonda şi gene ce codifică enzime ce metabolizează sonda (e.g. HSV1-tk); astfel produsul
expresiei acestor gene poate fi ţintit cu un substrat fluorescent, ducând la vizualizarea celulei.
(Gelovani, 2004)

13.4.6 Tehnici de radiomarcare ex vivo şi imagistică nucleară

Marcarea celulelor cu radiotrasori datează încă din anii 1970, ajungând să fie funcţionale
o serie de metode.
Astfel, limitării ce ţin de marcarea celulelor ex vivo precum: perioada de înjumătăţire a
trasorului care limitează durata de urmărire, nivelul scăzut de radioactivitate obţinut prin
marcajul cu trasori cu echilibrare pasivă, efluxul radiotrasorului din celulă şi radiotoxicitatea au
fost depăşite prin utilizarea unor procedee de transport facilitat, acumulare enzimă-dependentă
sau capturare metabolică a trasorului în combinaţie cu tehnicile PET-CT sau SPECT. (Gelovani,
2004)

Single-photon emission tomography (SPECT). Se bazează pe detecţia radiaţiei gamma


emisă de atomi radioactivi (e.g. 99mTc, 111In, 123I) încărcaţi în celulă, de către o cameră gamma ce
scanează subiectul. (Frangioni 2004)
Contrastul radioactiv este fixat la celulă prin trei posibilităţi: încărcare directă a celulei,
conversie enzimatică şi retenţie a unui substrat radioactiv (cea mai bună tehnică) sau fixare
mediată de receptor. (Frangioni 2004)

  110 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 13]                                                                 Metode de caracterizare şi identificare in vivo a MSC 

Avantaje: este o metodă senzitivă; poate scana întregul organism. Dezavantaje: necesită
modificarea genetică a celulelor pentru introducerea contrastului sau administrarea intravenoasă;
prezenţa radiaţiei ionizante; dificil de cuantificat. (Frangioni 2004)

Positron emission tomography (PET). Utilizează detecţia coincidentă a două raze


gamma anti-paralele de 511 keV emise după anihilarea pozitronului. (Frangioni 2004)
Are o rezoluţie şi o senzitivitate mai bune ca SPECT. Avantaje şi dezavantaje similare
SPECT. Pentru dezavantaje se adaugă: eficacitatea relativ redusă a camerelor de detecţie
SPECT, atenuarea fotonică de către ţesut şi captarea nespecifică a radiotrasorului. (Frangioni
2004)
O piedică majoră pentru SPECT şi PET este dificultatea concentrării unei radioactivităţi
de 0.01% din total per celulă astfel încât aceasta să fie vizibilă peste background. (Gelovani,
2004)
Acest neajuns este diminuat prin utilizarea captării metabolice a sondei radionucleare cu
ajutorul genei HSV1-tk. Aceasta este introdusă în celula ce se doreşte urmărită, prin transfectie
virală sau cu ajutorul lipozomilor, ex vivo sau in vivo. Intracelular, transcrierea genei în ARNm
corespunzător se soldează cu producerea kinazei HSV1-TK. După administrarea (e.g.
intravenoasă) unei sonde reporter (e.g. FIAU sau FHBG), aceasta este captată, concentrată în
celulă şi metabolizată de enzima HSV1-TK (i.e. fosforilată). Sonda reporter fosforilată nu poate
părăsi celula, putând fi detectată cu ajutorul PET-CT sau SPECT dacă sonda este marcată cu 124I,
123
I sau 131I. Astfel, se poate localiza celula sau grupul de celule, dar şi cuantifica nivelul de
transducţie a celulei cu gena HSV1-tk şi expresia acesteia. (Gelovani, 2004)
PET constituie o metodă ce beneficiază de numeroase posibilităţi de implementare
folosind o gamă largă de trasori şi sonde sau gene a căror expresie este condiţionată de procesele
molecular-genetice.

13.4.7 Imagistica prin rezonanţă magnetică (IRM)

Datorită capabilităţii de scanare 3D şi siguranţei crescute, este cea mai utilizată tehnică
de urmărire in vivo a celulelor stem la om, ajungând la o rezoluţie aproape de cea microscopică.
(Gelovani, 2004)
Marcarea celulelor pentru detecţia IRM se poate realiza folosind sistemul gene gun,
magnetofecţia, transfecţia sau electroporaţia. (Frangioni 2004)
Cel mai utilizat contrast pentru celulele stem este în secvenţa T2 şi foloseşte
nanoparticule de oxid de fier superparamagnetic. Nanoparticulele ferice sunt sigure,
biotolerabile, biocompatibile şi nontoxice. Pot fi utilizate pentru urmărirea unor cantităţi minime
de celule timp de câteva săptămâni. Dezavantajele particulelor: diluţia contrastului odată cu
diviziunea celulară, transferul în celule non stem după moartea celulei marcate, susceptibile la
artefactare. Pentru contrastul T1 se utilizează gadoliniul. Dezavantajul acestuia este reprezentat
de cantitatea crescută (50-500 µmol/L) necesară pentru a face celulele vizibile. (Arbab 2009)
Contraindicaţia IRM la pacienţii cu implanturi de pacemaker şi defibrilatoare cardiace,
restrânge utilizarea IRM pentru detecţia de celule stem.

13.4.8 Detecţia multimodală

Deoarece un singur agent de contrast specific unei tehnici are dezavantaje proprii, au fost
creaţi agenţi cu rol dublu.
Astfel este cazul nanoparticulelor monocristaline de oxid de fier marcate cu fluorofluori
ce permit injectarea lor în celule sub ghidaj optic şi identificarea lor în preparate histopatologice
(pe baza fluorescenţei) dar şi in vivo (cu ajutorul IRM). O altă modalitate utilizează inserarea
unei gene HSV1-tk modificate, care poate răspunde la o sondă reporter radiomarcată dar şi emite

  111 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 13]                                                                 Metode de caracterizare şi identificare in vivo a MSC 

fluorescenţă verde prin asocierea cu eGFP, acest ansamblu genetic reporter numindu-se TKGFP.
(Frangioni 2004)
O altă categorie este reprezentată de agenţii trivalenţi: nanoparticule care generează
simultan semnal IRM, ultrasonic şi fluorescent sau semnal IRM, fluorescent şi izotopic. Din
această ultimă categorie face parte marker-ul CLIO-Tat pe bază de nanoparticule supermagnetice
internalizate celular cu ajutorul secvenţei peptidice protein-derivate TAT (utilizată în mod
frecvent pentru introducerea de marker-i în celule) ce facilitează urmărirea o perioadă mai lungă
de timp cu conservarea potenţialului de diferenţiere a celulelor şi posibilitatea de sortare
magnetică a acestora din ţesuturile excizate. (Gelovani, 2004)

13.5 Aplicaţii ale nanoparticulelor pentru MSC

Nanoparticulele sunt materiale cu dimensiuni mai mici de 1000 nm, cu o suprafaţă foarte
mare raportată la volum (suprafaţă mare, volum mic), ce le conferă o reactivitate şi putere
catalitică sporită. În plus, pot fi trecute foarte uşor prin membranele celulare, putând interacţiona
rapid cu sistemele biologice. (Mishra 2008)
Utilitatea nanoparticulelor în biologia MSC este preponderent direcţionată spre folosirea
lor în procesele de analiză şi urmărirea a MSC. La acestea se adaugă conducerea diferenţierii
MSC şi construcţia de matrice (scaffolds) suport pentru MSC în cadrul produselor de inginerie
tisulară.
Cele mai uzitate nanoparticule în ingineria biocelulară a MSC(Mishra 2008) sunt:

Feridex. Nanoparticule inerte de oxid de fier, ce oferă o cale sigură (sunt metabolizate
intrând pe cale metabolică a fierului) de marcare şi urmărire a celulelor, fără toxicitate. Se
utilizează frecvent pentru urmărirea IRM a celulelor stem (homing, localizare), dar şi pentru
identificarea fenotipică şi cell-sorting. Pot fi cuplate cu fluorofori, sporind astfel capacitatea de
detecţie prin combinarea IRM-fluorescenţă.

Nanoparticulele magnetice. Utile ca agenţi de contrast pentru urmărirea IRM şi sortarea


magnetică (quadruple magnetic flow sorting) a celulelor.

Quantum dots. Nanocristale semiconductoare ce pot fi excitate de lumină cu o lungime


de undă variată (UV la infra-rosu) ce emit ca răspuns lumină de lungimi de undă diferite, ce
depinde de mărimea şi compoziţia cristalelor. Sunt utilizate în special ca sonde fluorescente
pentru bioimagistica multiplex, non-invazivă, in vivo, ca urmare a strălucirii lor intense şi a
rezistenţei la photobleaching.

NanoACP şi nanoHAP. Particule nanometrice de fosfat amorf de calciu (ACP) şi


hidroxiapatită (HAP), utilizate preponderent în ingineria tisulară a oaselor pentru refacerea
acestora sau acoperirea unor metale implantate osos. Utilizarea acestora în conjuncţie cu MSC,
mai ales a HAP (stimulează proliferarea, diferenţierea osteoblastică şi adeziunea MSC la
substratul HAP), îmbunătăţeşte considerabil utilitatea MSC în reconstrucţia osoasă.

Ceramidele lipozomale. Utilizate în conjuncţie cu ESC au facilitat menţinerea stării de


nediferenţiere a acestor celule în lipsa celulelor feeder. Menţinerea stării de nediferenţiere pentru
MSC ar fi un câştig important, mai ales pentru acele ţesuturi pentru care rolul suprem al MSC în
regenerare se crede a fi datorat producerii de citokine şi factorilor solubili.

Nanofibre produse prin electrospinning. Sunt fibre artificiale pure extrase electric din
stare lichidă, în lipsa altor agenţi de prelucrare, fapt ce le face utile biologiei celulare.
Nanofibrele servesc ca etapă intermediară pentru obţinerea unor "folii celulare", datorită
capacităţii lor de reversabilitate termică. MSC pot fi cultivate pe aceste fibre ce favorizează

  112 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 13]                                                                 Metode de caracterizare şi identificare in vivo a MSC 

realizarea de conexiuni intercelulare şi producerea unui citoschelet. Tratarea termică a fibrelor le


dezorganizează însă fără a afecta citoscheltul şi conexiunile intercelulare, conducând la obţinerea
unor structuri celulare polymer-free.
Procedeul de electrospinning poate fi utilizat şi pentru obţinerea unor nanobiomatrici
complexe (e.g. din hidroxibutil chitosan reversibil termic) care împreună cu factori de creştere şi
produşi biologici pot realiza structuri 3D necesare refacerii arhitecturii unor ţesuturi şi organe
complexe.

Nanotopografia. Constă în elaborarea unor structuri de tipul unei site, cu spaţii de


ordinul sutelor de microni, utile în special pentru stimularea diferenţierii neuronale a MSC.

  113 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 14]                                                                                                                                              Stemness 

14 Stemness

„So as long as a person is capable of self-renewal, they


are a living being.”
Henri Frederic Amiel

Stemness-ul reprezintă capacitatea celulelor stem de a se autoreplica/self-renewal şi de a


se diferenţia în multiple linii celulare (Wong 2008b).
Deşi prezintă proprietăţi unice, ce le diferenţiază de restul celulelor din organism,
celulele stem (indiferent de tipul lor) prezintă un comportament ale cărui cauze nu sunt
cunoscute în totalitate. În unele cazuri comportamentul lor in vivo şi in vitro poate varia
remarcabil, fără a identifica cu certitudine factorul generator.
La acest moment se acceptă ca termeni definitori clasici pentru o celulă stem, capacitatea
de self-renewal şi diferenţiere multiliniară, postulate de Potten (Potten 1990). Însă aceste două
însuşiri nu sunt specifice celulelor stem, nefiind suficiente pentru atribuirea caracterului „stem”
unei celule.
Cei doi termeni sunt relativi şi nespecifici. Multipotenţa celulelor stem este combătută de
prezenţa în organism a unui grup de celule, celule stem germinale, unipotente ce se pot
autoreplica. Alături de aceasta, nici capacitatea de self-renewal nu este absolută şi specifică.
Acest fapt este argumentat de comportamentul celulelor stem embrionare. In vivo acestea au o
durată limitată de self-renewal (spre deosebire de celulelor stem adulte) până ce se vor diferenţia
în celule diferite, specifice celor trei straturi embrionare, în timp ce in vitro pot perpetua
nelimitat în cultură fără a se diferenţia (Mikkers 2005).
Specificitatea celor doi termeni este infirmată şi de existenţa unui grup special de celule,
numite celule progenitoare ce reprezintă o etapă superioară de diferenţiere a celulelor stem.
Acestea sunt celule multipotente ce se pot replica de câteva ori în evoluţia lor (Back 2004)
(Trentin 2004).
Cele două caracteristici menţionate mai sus, nu oferă răspunsuri satisfăcătoare ce privesc
identificarea factorilor specifici comportamentului „stem”.
Astfel, pentru caracterizarea atributului „stem”, a fost creat termenul de „stemness”.
Acesta cuprinde, însumate în el, toate caracteristicile genetice şi fenotipice, împreună cu
mecanismele moleculare ce le guvernează atât pe ele cât şi interacţiunea cu micromediul, toate
împreună explicând semnificaţia comportamentului „stem”. Explicarea acestuia, aşa cum
cercetările recente au dovedit, nu se rezumă numai la identificarea factorilor individuali, celulari,
ci necesită o extindere ce înglobează şi micromediul celular (i.e. nişa stem) (Mikkers 2005).
Toate aceste mecanisme sunt răspunzătoare de blocajul evolutiv al celulelor stem.
Această sintagmă de blocaj evolutiv se traduce prin rezistenţa celulelor stem la procesul de
diferenţiere şi specializare (Fig. 14.1). (Mikkers 2005).
Primele încercări, cu rezultate notabile, de identificare a factorilor ce guvernează
stemness-ul, au ţintit identificarea factorilor genetici, a factorilor transcripţionali. În 2002, au fost
publicate primele rezultate ale unor studii menite a compara profilul transcripţional al celulelor
stem embrionare, neurale şi hematopoietice (Ivanova 2002) (Ramalho-Santos 2002). Totuşi
niciunul nu a identificat profilul genic răspunzător de comportamentul „stem” al celulelor
studiate. Genele ale căror nivele erau crescute în populaţiile celulare studiate nu sunt specifice
doar acelor celule, apărând ideea că din punct de vedere genetic caracterul „stem” are la bază
interacţiunea mai multor gene şi nu un profil unitar alcătuit din câteva gene (Mikkers 2005).
Chiar mai mult, profilurile provenite din cele două studii se prezintă un număr mic de gene
comune.
Totuşi, deşi s-au speculat diferenţe de cultură, metodă, selecţie şi analiză, s-a reuşit
identificarea a doi factori comuni, Nanog şi Oct4, comuni mai multor studii, ca fiind
contribuitori specifici de „stem” pentru celulele stem embrionare (Ivanova 2002) (Ramalho-

  114 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 14]                                                                                                                                              Stemness 

Santos 2002) (Sperger 2003) (Sato 2003). Prezenţa lor a fost confirmată indiferent de profilul
experimentului şi metodele folosite.

Fig. 14.1. Rezistenţa


celulelor stem faţă de
procesul de diferențiere.
(Mikkers 2005)
A. Celulele in diverse stadii ale
diferențierii lor pot păstra
capacitatea de self-renewal
(săgețile circulare) şi
polipotenţă (săgețile
colaterale); aceste caracteristici
nu sunt unice celulelor stem,
ele întâlnindu-se şi la celulele
progenitoare.
B. Teoria blocajului evolutiv,
susține că celulele stem sunt
menținute în acest stadiu sub
influenţa celulelor nişei stem
(colacul de salvare) ce le
împiedică să se diferențieze
necontrolat. SC - celulă stem;
PC - celulă progenitoare; DiC -
celulă diferențiată. 

Alte studii au identificat pentru MSC factorii Oct-4, Sox-2 şi Rex-1 (comuni şi ESC),
aflaţi în strânsă relaţie funcţională cu proteinele Polycomb şi Trithorax ce reglează expresia
acestor factori (Fig. 14.2). Dintre citokinele implicate se disting: leukemia inhibitory factor
(LIF), fibroblast growth factors (FGFs, în special FGF2 ) şi omologul mamiferelor pentru
Drosophila wingless (Wnts). (Kolf 2007)
Nu poate fi eliminată din ecuaţia definitorie a stemness-ului, interacţiunea celulei stem cu
nişa stem. Nişa constituie micromediul, la nivel tisular, ce facilitează şi întreţine starea celulelor
stem (Spradling 2001). Astfel, s-a avansat ideea că nişa furnizează celulelor stem semnalele
necesare menţinerii acestei stări (Chen 2000). Chiar mai mult, în anumite ipostaze nişa poate
condiţiona celulele progenitoare să revină la condiţia de „stem” (Marshman 2002). Deşi există o
puternică interacţiune nişă-celulă stem, niciuna dintre ele nu concură independent la statutul
„stem”.
Cu toate că, o posibilă soluţie constă în identificarea căilor de semnalizare nişă-celulă
stem, acest lucru nu este suficient. Astfel, au fost identificate mai multe căi de semnalizare
celulară, precum calea Wnt, calea proteinelor BMP şi calea Notch.
Un exemplu convingător, ce arată că simpla interacţiune nişă-celulă stem nu este
suficientă, este oferit de prezenţa celulelor stem intestinale şi a progeniturilor acestora (i.e.
celulele Paneth) în aceeaşi nişa (i.e. criptele intestinale). Astfel, cele două tipuri de celule sunt
expuse aceluiaşi mediu condiţionant. Deşi ambele sunt influenţate prin calea de semnalizare
Wnt, fiecare reacţionează diferit (Sancho 2004).

  115 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 14]                                                                                                                                              Stemness 

Fig. 14.2. Factorii genetici şi


moleculari implicaţi în self-
renewal şi citodiferenţierea
MSC. (Kolf 2007)
Factorii de semnalizare
extracelulari, inclusiv cei de
creştere şi citokinele, pot induce şi
menține starea de self-renewal
pentru MSC in vitro, acţionând
asupra nucleului de factori genetici
ce reglează starea self-renewal a
MSC (Oct-4, Sox-2, şi Rex-1). LIF -
leukemia inhibitory factor; EGF -
epidermal growth factor; HGF -
hepatocyte growth factor; PDGF -
platelet-derived growth factor;
FGF - fibroblast growth factor;
CFU-F - colony forming unit-
fibroblast; c - condroblast; o -
osteoblast; a - adipoblast; m -
mioblast; cm - cardio-mioblast; t -
tenoblast.

În ceea ce priveşte identificarea genelor răspunzătoare de capacitatea de diferenţiere şi


self-renewal a MSC umane, progrese importante au fost făcute de către Song (2006) care într-un
studiu amplu a realizat o comparaţie a profilului genetic pentru MSC nediferenţiate, diferenţiate
condrogenic, adipogenic, osteogenic şi dedifernţiate.
Deşi anterior, mai multe studii au arătat existenţa unor gene (e.g. gena pentru vimentină,
factorul de creştere al ţesutului conjunctiv, colagen tip I α1 şi factorul ETEF 1 α1 – eukaryotic
translation elongating factor) pentru MSC umane nediferenţiate, care pot servi ca semnătură
moleculară, puţine se cunosc despre implicarea funcţională a acestora şi despre reglarea căilor de
semnalizare răspunzătoare de self-renewal şi diferenţiere. (Song 2006)
Folosind RT-PCR cantitativ, transfecţia cu siARN şi analiza Western, Song (2006) a
identificat o serie de gene implicate în proliferarea şi diferenţierea MSC umane.
Un prim rezultat constă în identificarea unui set comun de gene de stemness (expresia lor
scade în cursul diferenţierii şi creşte în cursul dediferenţierii) pentru MSC umane nediferenţiate
şi MSC dediferenţiate din condrocite, adipocite şi osteoblaste. Astfel, au fost identificate 11 gene
comune celor trei fenotipuri dediferenţiate şi MSC nediferenţiate din 460 modificate semnificativ
(Fig. 14.3)
La acestea se adaugă un număr de 12 gene de diferenţiere (expresia lor creşte în cadrul
procesului de diferenţiere, scăzând în cursul dediferenţierii) comune celor trei tipuri de MSC
diferenţiate dintr-un total de 456 modificate (Fig. 14.4). (Song 2006)
Acelaşi studiu a arătat că o mare parte din genele de stemness sunt implicate în căi de
comunicare (e.g. semnalizarea IGF-1, JAK/Stat, TGF-β, Wnt/β-catenina) în timp ce majoritatea
genelor de diferenţiere sunt implicate în procesele de metabolism (e.g. metabolismul
glutamatului şi glutationului). (Song 2006)
Un grup de 91 de gene pentru stemness sunt implicate în codare unor proteine de
suprafaţă şi receptori cu rol în metabolism, carcinogeneză, metastazare, creştere celulară,
dezvoltare, senescenţă şi semnalizare (Fig. 14.5). Selecţia marker-ilor de suprafaţă codaţi de
aceste gene, specifici simultan celor trei linii fenotipice, pot contribui la dezvoltarea unor noi
metode de caracterizare, identificare şi selecţie a MSC in vitro şi in vivo. (Song 2006)

  116 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 14]                                                                                                                                              Stemness 

Fig. 14.3. Gene, comune celor trei


fenotipuri mezenchimale, cu rol în
stemness. (Song 2006) 

Fig. 14.4. Gene, comune celor trei


fenotipuri mezenchimale, implicate
în diferenţiere. (Song 2006)  

Fig. 14.5. Gene de stemness ce


codează marker-i de suprafaţă
pentru MSC umane. (Song 2006)

  117 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 14]                                                                                                                                              Stemness 

Evaluarea funcţională a 5 gene (PTPRF, AFAP, RAB3B, FZD7 şi DKK3) din grupul
celor de stemness, prin blocarea cu siARN a evidenţiat rolul acestora împreună în procesul de
supravieţuire celulară ca factori anti-apoptotici. Blocarea unică sau simultană a acestor gene are
efecte variate şi asupra diferenţierii MSC respective (Tab. 14.1). (Song 2006)

Tab. 14.1. Efectul blocarii genelor de stemness cu siARN asupra diferenţierii MSC.
Gena/Grupul de gene blocate Efect
PTPRF, AFAP, RAB3B, FZD7 sau MSC se pot diferenţia în osteoblaste cu activitate crescută a
DKK3 fosfatazei alcaline
AFAP, FZD7 şi RAB3B Creşte activitatea fosfatazei alcaline a osteoblastelor
DKK3 Stimulează producţia de proteoglicani dar o scade pe cea de
colagen II în cadrul condrogenezei
AFAP şi RAB3B Stimulează dramatic depunerea de colagen II
FZD7 şi PTPRF Scade semnificativ producţia de proteoglicani şi colagen II
PTPRF, AFAP, RAB3B, FZD7 Inhibarea diferenţierii în adipocite
şi/sau DKK3
după Song 2006

Marker-ii clasici de stemness (e.g. Oct-4, Nanog, Sox4 şi FGF4) nu au fost identificaţi
pentru MSC în acest studiu, mai mult, atenţia a fost centrată asupra genei IL1R2 implicată atât în
procesul de apoptoză (i.e. reducerea apoptozei prin blocarea kinazelor MAP2K3 şi p38 MAPK)
cât şi în cel de diferenţiere (i.e. prin scăderea expresiei IL-6). (Song 2006)
În alte studii, deşi s-a încercat identificarea nucleului de gene specifice stemness-ului, nu
au fost obţinute rezultate clare. Astfel, Fortunel a identificat în 3 studii diferite de microarray
pentru ESC o singură genă comună sugerând astfel că fiecare celulă foloseşte mecanisme
distincte pentru self-renewal şi pluripotenţă (Wong 2008b).
În afară de gene, în reglarea diferenţierii, transdiferenţierii şi a proprietăţii de self-
renewal intervin şi o serie de factori transcripţionali nucleari. Dintre aceştia, pentru MSC este
menţionată familia receptorilor nucleari, ce însumează 48 de membrii dintre care majoritatea
sunt receptori activaţi de liganzi. Până la acest moment există o identificare clară a rolului vis-a-
vis de MSC pentru 9 dintrei ei (Tab. 14.2). (Jeong 2009)

Tab. 14.2. Receptorii nucleari implicaţi în procesele de diferenţiere a MSC.


Receptorul nuclear Funcţie
Abreviere uzuală Abreviere după NRNC*
AR NR3C4 Adipogeneză
COUP-TFβ NR2F2 Adipogeneză
GR NR3C1 Adipogeneză; Condrogeneză
NGFI-B NR4A1 Adipogeneză
PAPARδ NR1C2 Transdiferenţiere
PAPARγ NR1C3 Adipogeneză; Osteoblastogeneză;
Transdiferenţiere
RARα şi β NR1B1 şi 2 Condrogeneză; Adipogeneză
VDR NR1I1 Adipogeneză; Condrogeneză
* Nuclear Receptor Nomenclature Committee
după Jeong 2009

Utilizând analiza genetică „gene module map” Wong (2008a) a observat că stemness-ul
nu este reprezentat de un profil genetic comun, ci mai degrabă este specific fiecărei celule în
funcţie de condiţiile de mediu. Prin aceeaşi metodă s-a observat şi că anumite tipuri de cancere
(în special cele agresive) exprimă un pattern transcripţional similar ESC (Wong 2008a).
Studii recente au adus în atenţie o nouă categorie de elemente genetice implicate în
stemness, numite microRNA (miRNA). Acestea sunt fragmente RNA ce conţin cca 19-23
nucleotide, ce derivă dintr-un precursor cu 70 de nucleotide, a căror expresie se consideră a fi
codată de cateva mii de gene. Aceste fragmente intră în constituţia unor complexe (RNA-
induced silencing complex – RISC), având un rol important în mai multe procese celulare.

  118 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 14]                                                                                                                                              Stemness 

Pentru MSC se consideră că sunt implicate în reglarea translaţiei şi stabilităţii mRNA, şi implicit
a multiplicării şi diferenţierii acestor celule. Câteva miRNA au fost elucidate, cunoscându-se
rolul lor: miR-140 (cartilaj), miR-143, 145, 103, 107 (adipogeneză), miR-638, 663 (condrocite),
miR-24, let-7a, let-7b, let-7c, miR-138, 320 (osteocite). Deşi studiile sunt în faza incipientă, se
apreciază că rezultatele obţinute vor constitui o unealtă consistentă în manipularea diferenţierii
MSC. (Lakshmipathy 2008)
În unele cazuri a fost observat că plasticitatea celulelor stem se exercită şi prin fuziunea
acestora cu celule adulte, nu numai prin diferenţierea lor propriu-zisă în baza unui program
genetic condus şi de către factorii de mediu, astfel încât se realizează o reprogramare nucleară
din care rezultă o celulă de novo cu un alt program genetic. Astfel acest mecanism poate duce la
salvarea unor celule adulte prin furnizarea unui material genetic “proaspăt”, o cale de regenerare
mult mai facilă pentru unele organe complexe precum ficatul sau creierul decât crearea de novo a
unei celule adulte dintr-o celulă stem. (Doyonnas 2004)
Cu toate acestea datele existente la acest moment despre genetica celulelor stem sunt
dificil de interpretat deoarece condiţiile de cultură şi factorii exogeni pot modifica rezultatele
astfel încât de cele mai multe ori acestea sunt specifice liniei celulare studiate.
În final, se poate concluziona că deşi factorii de mediu locali sunt critici pentru evoluţia
celulelor stem, aceştia se corelează cu statusul celular dictat genetic, astfel încât gama largă de
variabile implicate în stemness va necesita un aport ştiinţific de mare amploare pentru a fi
decodificată în viitor.

  119 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 15]                                                                                     Etica şi standardele utilizării clinice a MSC 

15 Etica şi standardele utilizării clinice a MSC

„Stem cell research must be carried out in an ethical


manner in a way that respects the sanctity of human
life.”
John Boehner

Pe măsură ce tehnologia celulelor stem progresează către aplicaţii clinice, sistemele de


sănătate – în special cele ce utilizează fonduri publice – vor fi provocate să aplice aceste metode
la scara largă. Utilizarea acestora generează noi probleme de etică, ce impun crearea unui cadru
legislativ şi etic strict. La momentul actual aceste probleme pot fi rezumate sub conceptul
„science leading ethics” (Daar 2004), care se traduce prin rapiditatea cu care ştiinţa terapiilor
celulare se dezvoltă astfel încât normele etice rămân mereu cu un pas în urmă. În contrast,
aceeaşi dezvoltare face ca anumite aspecte etice să devină neglijabile, fiind înlăturate.
Din fericire, până cum, utilizarea MSC a evidenţiat un număr redus de aspecte etice (Tab.
15.1), în mare parte nespecifice, ce trebuie respectate, spre deosebire de folosirea ESC care este
grevată de numeroase probleme morale referitoare la sursa de provenienţă (i.e. embrionul uman).
Totuşi, evoluţia ştiinţei a făcut ca şi în acest domeniu problemele etice să îşi găsească rezolvare,
astfel încât obţinerea unor embrioni prin metoda SCNT (somatic cell nuclear transfer, a.k.a.
clonare terapeutică) face ca utilizarea ESC să fie privită ca un auto-transplant, cu implicaţii etice
mult diminuate.
Utilizarea MSC în clinică, ca metodă curentă, trebuie să ţină cont de 3 parametri:
comunitate, donator şi primitor sub aspectul siguranţei, beneficiului, design-ului experimental şi
consimţământului informat; iar relaţia dintre acestea trebuie intermediată de medic în baza
cadrului etic şi legislativ. Astfel, în orice moment al unui studiu trebuie avută în vedere
respectarea prevederilor unor documente precum Raportul Belmont, Codul Nuremberg,
Declaraţia de la Helsinki pentru cercetarea medicală pe subiecţi umani, Ghidul de etică pentru
cercetarea biomedicală pe subiecţi umani al Organizaţiei Mondiale a Sănătaţii, Directivele pentru
trial-uri clinice ale Comisiei Europene şi Convenţia Ovideo. (ISSCR 2008)
Întrucât niciun astfel de document nu poate lua în calcul toate problemele etice ce se pot
ivi pe parcursul unui studiu, se impune ca rolul cel mai important să fie delegat comisiilor locale
care să acţioneze adaptat problemei în baza documentelor de mai sus. (ISSCR 2008)

Tab. 15.1. Aspecte bioetice, legale şi religioase în transplantul celulelor stem adulte.
Xenotransplant Alo/autotransplant
Etic - este sau nu împotriva naturii -respectarea demnităţii umane
- este moral a sacrifica animale în scop biomedicale -respectarea autonomiei individuale
- libertatea alegerii -respectarea principiului egalităţii şi
- evaluare ştiinţifică premergătoare beneficiului
- raportul risc/beneficiu - evaluare ştiinţifică premergătoare
-raportul risc/beneficiu
-aportul financiar pentru donator
-vârsta donatorului
-screening-ul donatorului

Legal consimţământul informat în raport cu: consimţământul informat în raport cu:


-riscul de transmitere al zoonozelor - utilizarea materialului biologic
-informarea familiei subiectului şi a contacţilor -protecţia persoanelor implicate (donator,
apropiaţi receptor, familie)
- educaţia actualilor şi viitorilor contacţi -anonimatul donatorului
-probleme de sănătate publică
Religios - a îngriji creaţia lui Dumnezeu (omul) vs. omul nu este Dumnezeu (se impune limitarea acţiunilor)
- a face sau nu rau aproapelui cu scopul tratamentului medical
după Shapiro 2008, Chapman 1999, EGE 2000

  120 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 15]                                                                                     Etica şi standardele utilizării clinice a MSC 

15.1 Binele comunităţii

Acest aspect face referire la utilizarea echitabilă a celulelor şi la impactul economic pe


care îl are utilizarea terapiilor celulare asupra sistemului de sănătate.
Echitatea se traduce prin accesul liber şi nediscriminativ al indivizilor pentru care aceste
terapii reprezintă o soluţie. Accesul nu trebuie să ţină cont de vârsta, rasa, religia, etnia, sexul,
puterea economică sau orientarea sexuală a pacienţilor, ci numai de respectarea indicaţiilor şi
criteriilor de selecţie. (Giacomini 2007)
Pentru ca accesul să fie nerestricţionat şi din punct de vedere tehnic, se impune existenţa
unei baze largi de selecţie imunologică a unor donatori care să cuprindă o diversitate
imunologică cât mai mare, lucru ce se traduce prin existenţa băncilor de celule stem. Pe lângă
aceasta este necesară existenţa unor protocoale de lucru cu MSC, standardizate şi unitare la nivel
global. (Giacomini 2007)
În plus, terapiile cu celule stem ar trebui direcţionate către acele sectoare ale patologiei cu
gravitate crescută şi pentru care nu există remedii convenţionale. Acest lucru este susţinut şi de
cel de al doilea aspect, cel financiar. (Giacomini 2007)
Pentru a fi rentabilă, realizabilă şi accesibilă, utilizarea terapiilor celulare necesită un
sistem de sănătate potent economic care să finanţeze domeniul fără a crea neajunsuri în alte
sectoare. Prin urmare, pentru minimalizarea costurilor se impune utilizarea atentă a acestor
metode, pentru cazuri atent selecţionate, şi nu ca metodă curentă de tratament.
Tot pentru limitarea costurilor, este mai rentabil a se utiliza un număr redus de linii
celulare care să fie stocate pe o perioadă scurtă de timp (care se deservească cererea curenta)
decât stocarea a numeroase linii celulare pe o perioadă lungă de timp pentru întâmpinarea unor
probleme posibile în viitor.

15.2 Binele donatorului

Face referire la aspecte legate de anonimatul donatorilor şi siguranţa metodelor de


recoltare.
Anonimatul donatorilor este preferabil, iar dictonul „primum non nocere” trebuie avut
în vedere în ceea ce priveşte exploatarea donatorilor, fiind esenţial ca metodele de recoltare să fie
minim invazive şi să nu pericliteze siguranţa donatorilor.
La acest moment sunt acceptate ştiinţific, etic şi politic pentru recoltarea de celule stem
următoarele surse: embrionii umani rezultaţi din IVF şi SCNT, sângele din cordonul ombilical şi
donatorii postnatali („adulţi”). (Giacomini 2007)
Transplantul MSC, operează cu ultima categorie de donatori, din care fac parte ca surse
copii mici, adolescenţii şi adulţii. Astfel având în vedere normele de protecţie a drepturilor
omului, este necesară reglementarea strictă a condiţiilor în care minorii pot fi utilizaţi ca
donatori. (Giacomini 2007)
Trebuie ţinut cont că donarea ţesuturilor necesare izolării MSC poate fi invazivă,
dureroasă şi generatoare de complicaţii direct proporţional cu tipul şi cantitatea de ţesut donat. În
plus, metodele de recoltare trebuie să conserve sursa donatoare, evitând depleţia acesteia.
Pe lângă acesta trebuie avută în vedere menţinerea integrităţii psihologice şi a coeziunii
sociale, profesionale, familiale şi economice a donatorului, ce pot fi alterate de rezultatele ivite în
cadrul screening-ului diagnostic pentru prevenirea transmiterii unor agenţi infecţioşi sau a unor
anomalii genetice. Aceste rezultate se pot solda cu pierderea intimităţii, apariţia tensiunilor
familiale, discriminare, depresie şi suicid. (Giacomini 2007)

  121 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 15]                                                                                     Etica şi standardele utilizării clinice a MSC 

15.3 Binele primitorului

Deşi până la acest moment nu au fost raportate reacţii adverse, mai ales după inocularea
IV a MSC, care să pună folosirea acestor celule sub semnul îndoielii trebuie acordată atenţie
sporită riscurilor şi efectelor adverse ce pot apărea ca urmare a variabilităţii metodelor de izolare,
expansionare şi transformare în ţesuturi in vitro. Aceasta obligă la standardizarea protocoalelor
de lucru cu MSC. (Giacomini 2007)

În concluzie, dezideratele etice ale utilizării MSC pentru terapiile celulare trebuie să
respecte următoarele puncte: (1) să ofere acces liber; (2) să aibă costuri rezonabile pentru sistem;
(3) să fie utilizate atent, parcimonios; (4) minimalizarea riscurilor donatorului; (5) minimalizarea
riscurilor imunologice; (6) minimalizarea riscului transmiterii unor boli de la donator la primitor.

15.4 Controlul experimentelor ce utilizează celule stem

Experienţele antemergătoare au demonstrat că pentru a parcurge drumul „from bench to


bedside” se impune crearea unor foruri de supraveghere şi control.
Acestea trebuie să existe la nivel local sub forma board-urilor instituţionale şi la nivel
guvernamental sub forma agenţiilor naţionale, ambele desfăşurând activităţii prospective şi de
evaluare a experimentului, cu scopul respectării normelor etice şi legale. În consecinţă, pentru a
întâmpina nevoile curente este necesară dezvoltarea unor instrumente legale care să realizeze un
cadru de desfăşurare a terapiilor celulare. (Sugarman 2007)
Deşi mai multe asociaţii profesionale din domeniu au elaborat guideline-uri pentru aceste
activităţi, ele sunt doar cu titlu de recomandare, restrâns la activitatea ştiinţifică, fără a impune
sancţiuni şi pedepse legale.

15.5 Consimţământul informat

Reprezintă un instrument obligatoriu oricărui experiment ce utilizează subiecţi umani.


Realizarea documentului trebuie să fie clară şi să ţină cont de câteva elemente obligatorii:
natura experimentului, siguranţa, intervenţiile necesare, alternativele studiului, participarea liber
exprimată/voluntară. Analiza corectitudinii documentelor pentru consimţământ cade în sarcina
board-urilor instituţionale. (Sugarman 2007)
Cel mai dificil şi poate cel mai important aspect al consimţământului este reprezentat de
validarea capacitaţii decizionale a voluntarului. Pentru aceasta este esenţial a se ţine cont de
competenţele acestuia iar exprimarea punctelor de mai sus să fie realizată cu un limbaj accesibil.
În acelaşi sens, este necesar să se ia în calcul şi starea psiho-emoţională a subiectului la
momentul exprimării consimţământului ca urmare a unor stări acute (durere, anxietate) sau a
influenţei unor substanţe medicamentoase sau recreaţionale. Astfel, se impune ca în cadrul
procesului de obţinere a consimţământului informat să figureze instrumente de cuantificare a
capacităţii de decizie a subiectului. (Sugarman 2007)
Un alt aspect important specific terapiilor celulare este reprezentat de menţionarea sursei
celulelor stem ce poate interfera cu anumite percepte individuale de ordin moral sau religios.

15.6 Selecţia pacienţilor

Este necesară realizarea unor criterii de selecţie clare privind alegerea pacienţilor pentru
studiul experimental. În primele etape este util acest lucru ca urmare a necesităţii unui număr mic
de pacienţi pentru stabilirea siguranţei protocolului sau a insuficienţei resurselor terapeutice,

  122 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 15]                                                                                     Etica şi standardele utilizării clinice a MSC 

pentru ca în etapele ulterioare să fie necesară uniformizării ştiinţifice a rezultatelor. (Sugarman


2007)
Pe lângă existenţa criteriilor de selecţie, poate cel mai important este a se insista pe
explicarea unor concepţii greşite ale voluntarului. Cea mai frecventă constă în credinţa acestuia
că studiul respectiv este realizat în virtutea îngrijirii lui la un standard înalt şi nu pentru a
răspunde unor întrebări ştiinţifice; o a doua este reprezentată de negarea existenţei randomizării
oarbe în studiu, subiectul fiind convins că medicul curant acţionează în interesul vindecării lui.
Ca urmare, trebuie insistat pe explicarea clară a naturii şi scopului studiului. (Sugarman 2007)

15.7 Conflictul de interese

Întrucât domeniul terapiilor celulare, este atractiv atât din prisma intereselor financiare
cât şi non-financiare (orgoliu ştiinţific, dorinţa de confirmare şi promovare, publicitate, faimă)
este recomandată o urmărire atentă de către forurile instituţionale şi guvernamentale a celor ce
conduc Astfel, de studii.
Astfel, este esenţial ca responsabilii să îşi decline orice legătură de interes cu o terţă parte
implicată în procesul de studiu, finanţare, publicare, aprobare şi marketing. (Sugarman 2007)

15.8 Principiile procesării şi manipulării celulelor stem enunţate de


Societatea Internaţională pentru Cercetarea Celulelor Stem (ISSCR)

15.8.1 Recoltarea

Se va face în conformitate cu prevederile pentru recoltarea sângelui, ţesuturilor şi


organelor, iar în cazul donării pentru utilizare alogenă trebuie bazată pe semnarea unui
consimţământ de către donator care să acopere următoarele aspecte: celulele pot fi stocate pe
termen nelimitat, donatorul poate fi contactat ulterior pentru obţinerea unui acord sau materiale
biologice, celulele pot fi modificate genetic şi utilizate după decizia responsabilului de studiu,
protejarea identităţii donatorului, celulele pot fi utilizate pentru comercializarea unei terapii
celulare pentru care drepturile de proprietate intelectuală aparţin instituţiei ce conduce
experimentul. (ISSCR 2008)
În cazul utilizării alogene se impune ca obligatorie testarea donatorilor pentru agenţi
infecţioşi şi modificări genetice.

15.8.2 Variabilitatea sursei

Întrucât fenotipul celulelor diferă în funcţie de sursă/ţesutul de provenienţa este


importantă caracterizarea acestora după cele mai înalte standarde existente la acest moment.
(ISSCR 2008)

15.8.3 Manipularea celulelor

Recoltarea şi manipulare celulelor trebuie realizată ideal în conformitate cu normele


GMP (Good Manufacturing Practice); minimul necesar presupune respectarea normelor de bază
de sterilitate şi antisepsie. (ISSCR 2008)
Se recomandă utilizarea minimă sau deloc a unor produse de provenienţă animală pentru
prelucrarea celulelor umane.

  123 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 15]                                                                                     Etica şi standardele utilizării clinice a MSC 

Se impune necesitatea testării genetice (ARNm, microARN, expresia proteinelor,


cariotipare, metilare, modificările cromatinei, secvenţierea genomului etc) a celulelor cultivate o
perioadă variabilă de timp, cu interpretare randomizată a datelor, şi caracterizarea acestora
înainte de transplant (Tab. 15.2) (ISSCR 2008).

Tab. 15.2. Normele de siguranţă pentru celulele stem adulte.


Celule stem Celule stem
adulte autologe adulte alogene
Screening-ul donorilor + ++
- agenţi infecţioşi
- evaluarea pedigree-ului
- testare genetică moleculară
Utilizarea unor protocoale standardizate ++ ++
pentru cultura celulelor
Caracterizarea culturilor ++ ++
- morfologie
- antigeni de suprafaţă
- marker-i biochimici
- expresie genică
- evaluarea cariotipului
- activitate biologică
Teste animale preclinice
- integrare celulară ++ ++
- migrare celulară ++ ++
- toxicitate ++ ++
- proliferare + +
Monitorizarea pacientului ++ ++
pe termen lung
++ = important; + = mai puţin important
după Department 2001

15.8.4 Standardizarea

Este utilă pentru realizarea unor protocoale de cooperare internaţională privind


transplantul de celule stem. Se referă la toate procesele la care sunt supuse celule, de la
recoltarea şi până la utilizare. (ISSCR 2008)

15.8.5 Studiile pre-clinice

Studiile pe animale vizează studierea comportamentului celulelor într-un organism,


eficacitatea şi toxicitatea acestora. Rezultatele se recomandă a fi analizate independent într-o
manieră peer review, iar translatarea clinică trebuie să ţină cont de insuficienţele modelelor
animale. (ISSCR 2008)

Eficacitatea. Este elementul central ce îndreptăţeşte realizarea studiilor clinice, pe baza


observaţiilor privind comportamentul şi biologia in vivo a celulelor. În acest moment ar trebui să
se propună dozele, calea de administrare, vârsta optimă şi stadiul de boală pentru care se
intenţionează testarea clinică. (ISSCR 2008)
Utilizarea unor animale mari este preferată în raport cu studiul complexităţii bolii,
dozelor eficiente, răspunsului, migrării, supravieţuirii celulelor, inflamaţiei generate şi barierelor
imunologice. (ISSCR 2008)

Toxicitatea. Reprezintă un aspect important pentru testarea clinică, şi trebuie să facă


referire la toxicitatea infuziei de celule, răspunsul imun aberant, comportamentul neaşteptat al

  124 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 15]                                                                                     Etica şi standardele utilizării clinice a MSC 

celulelor, tumorigeneză etc. Nu trebuie uitat faptul că particularităţile fiziologice ale


organismelor animale nu pot identifica toate reacţiile adverse posibilele la om. (ISSCR 2008)
Pentru controlul tumorigenezei se recomandă testarea genetică a celulelor pentru
identificarea modificărilor răspunzătoare de proliferarea necontrolată şi diferenţierea aberantă.
(ISSCR 2008)
În evaluarea toxicităţii trebuie luat în calcul faptul că efectele adverse pot depinde de
calea de administrare a celulelor. Administrarea locală manifestă preponderent efecte locale, însă
în caz de transplant al unor celule imunogene sau transplant local într-un organ vital (i.e. creier,
inima, ficat) acestea pot periclita viaţa pacientului, mai ales când celulele provin dintr-un organ
sursă diferit de cel gazdă. (ISSCR 2008)

15.8.6 Studiile clinice

Acestea trebuie să respecte principiile internaţionale acceptate privind etica şi protecţia


subiecţilor umani, având ca topic-uri cheie: supravegherea şi controlul studiului de către un
forum, peer review-ul realizat de un grup independent, selecţia candidaţilor, consimţământul
informat şi monitorizarea subiecţilor. (ISSCR 2008)
Din punct de vedere etic, un studiu privind terapiile celulare trebuie să respecte
următoarele criterii: (1) furnizarea informaţiilor ştiinţifice necesare evaluării studiului; (2)
informarea subiecţilor privind provenienţa celulelor; (3) evaluarea riscurilor ce pun în pericol
viaţa; (4) expunerea clară a potenţialelor beneficii privind înrolarea într-un astfel de studiu; (5)
expunerea avantajelor faţă de metodele terapeutice existente; (6) specificarea conflictelor de
interes; (7) monitorizarea pacienţilor în timpul studiului şi pe termen lung pentru surprinderea
efectelor adverse; (8) constituirea unui plan de tratament al reacţiilor adverse, inclusiv
compensaţii materiale
Având în vedere posibilele reacţii adverse necunoscute, testarea pe subiecţi sănătoşi se va
face în condiţii excepţionale.
Studiile trebuie monitorizate atât de organizaţii independente de investigatori cât şi de
grupuri de peer-review din cadrul instituţiei ce desfăşoară studiul (Tab. 15.3).
Pe întreaga durată a studiului, starea de sănătate a subiecţilor va fi monitorizată cu atenţie
de către o comisie de siguranţă. În plus, subiecţii sunt liberi a se retrage din studiu în caz de
apariţie a unor complicaţii, starea lor fiind monitorizată şi după acest moment ca urmare a
persistenţei celulelor în organism. (ISSCR 2008)
În momentul încheierii unui studiu se recomandă, pentru atestarea transparenţei,
publicarea rezultatelor pozitive şi negative şi a reacţiilor adverse, astfel încât aceste date să fie
utilizate şi de către alte studii viitoare. Este de preferat ca rezultatele să fie analizate de către
opinia ştiinţifică, în cadrul conferinţelor şi a publicaţiilor, înainte de a fi făcute publice în presă.
(ISSCR 2008)

Tab. 15.3. Criteriile de peer-review pentru studiile cu celule stem.


Criteriul Aplicare
Balanţa risc-beneficiu - identificarea şi reducerea riscului
- identificarea beneficiilor pentru subiecţi
Selecţia subiecţilor - participarea liberă/nediscriminativă
- stabilirea criteriilor de includere şi excludere
Comparare cu metodele - metoda trebuie să îşi propună a fi superioară metodelor existente ca risc şi
de tratament existente beneficiu
Binefacerea - studiul trebuie să aibă specificitate locală (compararea terapiei celulare cu cele mai
bune metode existente în ţara de desfăşurare) şi aplicabilitatea internaţională (nu
doar în ţara care sponsorizează studiul – poate fi diferită de cea în care se
desfăşoară)
Consimţământul informat - informare clară asupra scopului, metodelor, riscurilor, beneficiilor, drepturilor,
obligaţiilor şi alternativelor terapeutice
- înrolarea subiectului nu trebuie să survină ca o necesitate pentru continuarea

  125 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 15]                                                                                     Etica şi standardele utilizării clinice a MSC 

îngrijirii lui
- în cazul unor subiecţi, pentru care terapia celulară are beneficii considerabile dar
statusul lor cognitiv este afectat se poate recurge la numirea legală a unor
reprezentanţi autorizaţi
- obţinerea permisiunii de autopsiere în caz de deces
după ISSCR 2008

15.9 Distribuţia şi banking-ul celulelor stem

În cazul utilizării transplantului MSC ca metodă de elecţie pentru anumite afecţiuni, este
necesară realizarea unui fond comun reprezentat de băncile de celule stem.
Acest aspect, trebuie să respecte accesul liber al indivizilor la terapiile celulare şi
aspectele imunologice, care pentru MSC sunt neglijabile.
Stocarea celulelor se poate face în sistem de bancă privată (utilizarea celulelor este
restricţionată pentru donator sau familia acestuia) sau bancă publică (destinată utilizării de către
publicul larg), necesară mai ales în momentul utilizării curente a celulelor în clinică. (Giacomini
2007)
Avantajul sistemului de banking este reprezentat de stocarea unui număr nelimitat de
celule cu un background genetic variat, şi poate scurta timpul de administrare a tratamentului,
renunţându-se la etapa de recoltare şi de expandare în vitro a celulelor autologe.
Pentru eficientizarea distribuţiei terapiilor celulare au fost realizate patru modele de
banking ţinând cont de gradul de implicare imunologică şi de disponibilitatea celulelor:
 Modelul personalizat „as needed”: celulele stocate sunt ale pacientului, recoltate
imediat după debutul bolii; expandate „la nevoie” ca tratament al afecţiunii.
 Modelul personalizat „as insurance”: celulele utilizate sunt ale potenţialului
pacient, recoltate în stare de sănătate înainte de debutul bolii; sunt stocate în bancă
în eventualitatea unei posibile afecţiuni.
 Modelul „banked matched”: celulele sunt donate, şi sunt diferite genetic de ale
primitorului; sunt stocate şi utilizate după testarea compatibilităţii.
 Modelul „banked universalized”: sunt stocate celule manipulate genetic a fi
compatibile cu întreaga populaţie deservită.
Dintre modelele prezentate, cel universalizat are cele mai mari şanse de reuşită, întrucât
prevede un raport ridicat eficienţă/cost. Costurile modelelor personalizate şi banked matched
sunt mai mari, fiind direct proporţionale cu mărimea populaţiei deservite. În plus, sistemul de
matching utilizat în prezent la transplantul de organe, nu este cel mai indicat pentru celule în
ideea în care acestea pot fi manipulate genetic şi „universalizate”. (Giacomini2007)

15.10 Turismul medical şi terapiile cu celule stem

Cazul unui băiat israelian care a dezvoltat numeroase tumori benigne la nivelul creierului
şi măduvei spinării după un transplant de celule neurale fetale în Rusia, descris în amănunt în
numărul din 17 februarie 2009 al revistei PLoS Medicine, a scos la iveală o nouă problemă
legată de etica şi legislaţia utilizării celulelor stem, efectele dezastruoase ale turismului medical
şi lipsa cadrului legal internaţional şi naţional. (MacReady 2009)
Turismul medical în ţări precum Rusia, China, Germania, Republica Dominicană şi chiar
SUA, speculează disperarea pacienţilor şi a familiilor acestora, care de cele mai multe ori se
soldează cu rezultate medicale nefavorabile şi ruinarea financiară a aparţinătorilor.
Toate acestea se datorează lipsei unei legislaţii şi a unor foruri de control pe plan local şi
internaţional.
Cazul pacientului israelian a arătat că acesta a primit un cocktail de celule neurale fetale
cu provenienţă de la doi donatori de sexe diferite. Cercetările ulterioare au scos în evidenţă că
rezultatele clinicii erau modificate şi prezentate într-o lumină favorabilă de către medici, evaluate

  126 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 15]                                                                                     Etica şi standardele utilizării clinice a MSC 

subiectiv în lipsa unor controale, cu dorinţa disperată de a găsi ceva favorabil în fiecare caz
tratat. În plus, echipa internaţională de medici care au controlat clinica nu au găsit nici o
înregistrare scriptică amănunţită a tipului de celule utilizate şi a procedurilor la care pacienţii
erau supuşi, demonstrând că nu utilizau celule stem. (MacReady 2009)
De cele mai multe ori aceste clinici îşi racolează pacienţii utilizând internet-ul şi folosind
ca interfaţă pagini web sofisticate, care prezintă mărturii favorabile ale unor pacienţi, care de cele
mai multe ori nu au nimic de a face cu tratamentul aplicat, fără a comunica rezultate agreate şi
dovedite ştiinţific. (MacReady 2009)
Ceea ce frapează, este că în unele locuri aceste abuzuri se desfăşoară cu complicitatea
autorităţilor locale şi a guvernelor care finanţează astfel de activităţi. Legislaţia laxă şi dorinţa
guvernelor de a căpăta un renume în domeniul terapiilor celulare conduc la finanţarea unor
instituţii ce practică tratamente celulare fără nici un fundament ştiinţific. Un astfel de caz este cel
al unei clinici din Rusia (International Institute of Biological Medicine, Moscova), care servea şi
ca for regulator al terapiilor cu celule stem în această ţară, în care se încerca tratamentul
sindromului Down prin implantarea de ţesut fetal în cavitatea peritoneală. (MacReady 2009)
Un alt factor specific acestor ţări este reprezentat de lipsa siguranţei oferită de un
consimţământ informat întocmit riguros şi a forurilor etice afiliate instituţiilor în cauză, ceea ce
facilitează punerea în practică a unor terapii aberante.
Analiza a 7 cazuri ale unor pacienţi cu afectare medulară ce au beneficiat de injecţii cu
creier fetal, realizate de către Dr. Hongyun Huang la o clinică din Beijing, au evidenţiat un lung
şir de complicaţii post-inoculare la aceştia (meningită, alergie medicamentoasă, hemoragii
gastrointestinale, pneumonie) şi un singur beneficiu, o uşoară modificare a funcţiei senzitive şi
motorii la un singur pacient. Rezultatele favorabile raportate de acesta aveau la bază o analiză
subiectivă. (MacReady 2009)
Câştigul financiar apreciabil de pe urma fiecărui caz, contribuie la extinderea acestui
curent şi la menţinerea lui. Costurile pentru o astfel de intervenţie variază între 15000 şi 50000
de euro, un aspect demn de luat în considerare.
Toate aceste fapte duc la apariţia efectului de măr putred în comunitatea ştiinţifică bona
fides a ţărilor respective, făcând un mare defavor acesteia, dar şi domeniului terapiilor celulare la
nivel internaţional, argumentând necesitatea urgentă a unor normative etice şi legale aplicabile şi
sancţionabile la nivel global. (MacReady 2009)
Deşi acestea întârzie să apără, un prim pas a fost realizat de către ISSCR (International
Society for Stem Cell Research) care a emis în 2008 un set de reguli sub titlul „Guidelines for
the Clinical Translation of Stem Cells”, însă cu titlul de recomandare.
În final, este important a realiza diferenţa între terapiile comerciale nedovedite cu celule
stem şi încercările legitime de inovare medicală în afara contextului unui trial; aceasta se bazează
pe scopul experimentului, şi anume testarea siguranţei metodei, şi a beneficiilor rezultate,
îndreptate preponderent în interesul pacientului fără a fi însoţite de beneficii materiale pentru
conducătorul studiului.

  127 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 16]                                                                                                       Viitorul celulelor stem în clinică 

16 Viitorul celulelor stem în clinică

„The only hope [of science]... is in genuine induction.”


Sir Fracis Bacon

Celule stem, datorită potenţialului de diferenţiere pluripotentă şi capacitaţii de self-


renewal reprezintă o alegere justificată pentru terapiile celulare, însă implementarea clinică a
acestora este grevată de obţinerea unor informaţii clare privind rolul acestor celule în organism,
cunoaşterea amănunţită a căilor de interacţiune cu celulele înconjurătoare, genotipul şi fenotipul.
În ceea ce priveşte rolul MSC in vivo, Tuan (2003) expune două teorii: (1) rol de depozit
al potenţialului de diferenţiere (celule ce aşteaptă semnalul potrivit pentru a produce celule
diferenţiate mature necesare înlocuiri celulelor lezate); (2) rol de celule director (in prezenţa
semnalului cheie acestea declanşează diferenţierea celulelor înconjurătoare). Pe viitor aceste
două posibilităţi vor putea fi explorate clinic diferit lărgind spectrul terapeutic celular. Deoarece
cele două teorii exploatează aspecte diferite ale celulelor stem este important a se ţine cont de
acestea când se trece la aplicarea clinică, astfel încât în cel de al doilea caz este important ca
utilizarea lor clinică să se facă în stare nediferenţiată pentru a conserva procesele de reglare şi
comunicare intercelulară.
Având în vedere rolul lor în regenerarea şi reconstrucţia ţesuturilor, se aşteptă numeroase
rezultate experimentale favorabile care să impulsioneze utilizarea clinică curentă a celulelor
stem. Cu toate că este motivantă, obţinerea unor celule diferenţiate in vitro şi utilizarea lor în
clinică, constituie un drum lung ce nu trebuie să se abată de la conceptul de eficacitate, siguranţă
şi accesibilitate. (Daley 2008)
Aplicabilitatea MSC ţinteşte o gamă largă de patologii (e.g. degenerative, traumatice,
imune şi genetice) şi depinde în strânsă relaţie de capacitatea industriei farmaceutice de a
rentabiliza producţia terapiilor bazate pe celule stem, astfel încât să se depăşească stadiul actual
de laborator, destinat unei producţii individualizate fiecărui pacient. La aceasta se adăugă şi
contribuţia rezultatelor oferite de numeroasele trial-uri ce evaluează celulele stem.
Terapiile celulare ale viitorului vor specula două proprietăţi ale celulelor stem ce vor fi
utilizate ca reconstructori ai ţesutului graţie, capacităţii de integrare în ţesuturi, sau ca vehicul de
transport al unor semnale complexe la nivelul ţesuturilor fără a se integra în ţesut (e.g. MSC).
Mergând pe acest model, MSC par a fi ideale ca platforme de administrare a unor efecte
drug-like pentru patologia ischemică cardiacă sau imună (e.g. GVHD) speculând capacitatea
acestora de a genera efecte paracrine dar şi de a putea fi prelucrate genetic pentru exprimarea
unor factori terapeutici (e.g. secreţie de insulină sau chemokine).
Succesul utilizării celulelor stem depinde în egală măsură şi de posibilitatea de control şi
direcţionare a homing-ului spre ţesutul ţintă. Astfel, dezvoltarea metodelor de control al
moleculelor implicate în homing prin manipulare ex vivo a celulelor sau prin ghidarea homing-
ului către o sursă de chemokine inoculată în ţesutul ţintă poate îmbunătăţii localizarea celulelor
la acel nivel şi rezultatul funcţional (Segers 2007).
Celulele stem reţin într-o măsură variabilă capacitatea morfogenetică (e.g. celulele
endoteliale derivate din ESC se pot autoasambla în conducte vasculare iar cardiomiocitele se pot
agrega în unităţi pulsatile) astfel încât în combinaţie cu un carrier potrivit pot contribui la
reproducerea unor structuri tisulare complexe. Acest lucru este dependent de evoluţia ingineriei
tisulare axată pe producţia de matrice suport biocompatibile care să exprime molecule de
semnalizare şi fixare a celulelor stem ce pot coordona o asamblare într-o arhitectură ordonată a
celulelor stem.
Pe măsură ce cunoştinţele şi înţelegerea biologiei celulelor stem evoluează, va fi posibil
ca metodele terapeutice ale viitorului să ţintească şi să utilizeze celulele stem endogene. Întrucât
existenţa acestora este certă pentru numeroase ţesuturi, fiind implicate activ în homeostazia
celulară şi în condiţii selecţionate chiar şi în repararea ţesuturilor, decodificarea căilor de

  128 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 16]                                                                                                       Viitorul celulelor stem în clinică 

semnalizare ale nişei stem va face posibilă modularea farmacologică a acestor celule. În aceste
sens, câteva rezultate experimentale par a susţine această ipoteză. Astfel, stimularea receptorului
pentru PTH al osteoblastelor medulare duce la creşterea numărului de HSC (Adams 2007, Calvi
2003); prostaglandina E2 poate creşte numărul HSC murine, îmbunătăţind rezultatul
transplantării (North 2007) iar factorii circulanţi ai unui organism murin tânăr pot modifica
fenotipul celulelor stem musculare ale unui organism în vârstă, conferindu-le un fenotip juvenil
(Conboy 2005) – având ca mecanism de acţiune calea de semnalizare Wnt ai cărei factori
exprimaţi la un nivel înalt favorizează un status pro-fibrotic în organismele bătrâne (Brack
2007).
Deoarece terapiile celulare, ca şi transplantul de organe, pot întâlni bariere imunologice –
aspect nesemnificativ pentru MSC- coroborat cu necesitatea unor terapii adaptate specific
fiecărui individ, se tentează utilizarea unor tehnici (e.g. SCNT şi reprogramare celulară) ce au ca
scop obţinerea unor celule isogene (i.e. echivalente genetic cu ale pacientului).
O alternativă imunoprotectoare este reprezentată de utilizarea celulelor stem încapsulate.
Deşi la acest moment suscită un interes activ, practic, realizarea microîncapsulării întâmpină
probleme tehnice reprezentate de difuzia necontrolată a nutrienţilor şi semnalelor celulare,
soldate cu alterarea funcţionării celulei, dar care promit a fi remediate pe viitor. (Daley 2008)
Reprogramarea celulară vine ca o soluţie pentru pacienţii cu un fond limitat de celule
stem (datorită afecţiunii de bază) cât şi pentru înlăturarea aspectelor negative legate de SCNT
(e.g. probleme etice, necesitatea unor ovule donate). Se bazează pe transducţia virală a unor
celule somatice adulte/diferenţiate cu genele c-Myc, Klf4, Oct4 şi Sox2, care transformă celula
respectivă într-o celula pluripotentă, numită IPS (induced pluripotent stem cell), similară ESC.
Deşi la acest moment unele gene, c-Myc şi Klf4, sunt asociate cu oncogeneza, potenţialul acestor
celule este tentant, mai ales în perspectiva în care se doreşte transformarea unei celule mature
într-o celulă matură de alt tip fără a fi necesară transformarea ei într-o stare pluripotentă.
Reprogramarea celulară şi IPS par a fi utile în afecţiunile genetice. Hanna (2007) a
raportat transplantarea HSC derivate din IPS obţinute din celulele tegumentare ale unui şoarece
cu anemie falciformă, care s-a soldat cu repararea defectului genetic ca urmare a capacităţii de
multiplicare permanentă a celulelor transplantate.
Arbab (2009) consideră că terapiile celulare vor fi utilizate clinic în două direcţii: (1)
regenerarea şi reconstrucţia ţesuturilor cu celule modificate genetic sau nu, şi (2) împotriva
cancerelor, utilizând celule transgenice ce poartă gene suicidare sau capabile a exprima citokine
citotoxice. În sprijinul celei de a doua variante vin numeroase studii experimentale ce atestă
beneficiul unor astfel de celule, inclusiv MSC, pentru tratarea glioamelor. (Arbab 2009) În
opoziţie cu acestea, Jones (2008) consideră că utilizarea unor MSC cultivate o perioadă lungă nu
ar trebui aplicată în sfera oncologică.
MSC utilizate singure sau în conjuncţie cu ingineria genetică şi tisulară (implicând factori
de creştere şi matrice suport) vor juca un rol important în medicina regenerativă, aducând mai
aproape visul de a obţine ţesuturi şi organe „off-the-shelf”. În aceste sens, principalul obstacol
este reprezentat de reproducerea unei arhitecturi fiziologice şi funcţionale a ţesutului sau
organului. Până atunci, un pas intermediar poate fi realizat prin utilizarea celulelor diferenţiate
din MSC, sub forma încapsulată a unor bioreactoare pentru susţinerea funcţiei unor organe
insuficiente (i.e rinichi/ficat artificial). (Daley 2008)
Tehnologia de realizare a ansamblurilor celule stem-matrice suport evoluează permanent,
astfel încât dezavantaje precum reacţia inflamatorie şi formarea ţesutului fibros ca urmare a
utilizării de matrice suport biodegradabile vor putea fi îndepărtate definitiv prin utilizarea
tehnologiei „cell sheet” ce realizează fixarea celulelor din cultură sub forma unei pelicule ce
poate fi asamblată în produşi 3D. (Daley 2008)
Poate mai mult decât utilizarea celulelor stem exogene pentru tratamentul anumitor boli,
viitorul poate aduce răspunsuri legate de manipularea intrinsecă a celulelor stem umane, in situ,
pentru regenerarea şi reconstrucţia unor organe, având ca model de studiu animale precum
salamandrele – capabile de a regenera organe precum retina, inima sau măduva spinării. (Daley
2008) La acest moment se cunoaşte că regenerarea ţesuturilor acestor animale se realizează prin

  129 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
[CAPITOLUL 16]                                                                                                       Viitorul celulelor stem în clinică 

dediferenţierea celulelor somatice restante şi mai puţin prin recrutarea unor noi celule, astfel
încât descoperirea genelor şi mecanismelor ce conduc acest proces va constitui o realizare
epocală cu un imens potenţial clinic. Un prim pas în această direcţie a fost realizat prin utilizarea
BMP 2 şi 7 împreună cu rPTH pentru tratamentul osteoporozei, presupunându-se că
administrarea lor sistemică acţionează pe MSC in situ (Jones 2008). Importanţa stimulării PTH a
MSC este susţinută şi de hipercalcemia observată la persoanele imobilizate, ce inhibă eliberarea
de PTH (Massagli 2008) având consecinţă scăderea numărului de MSC la nivel medular, tradusă
prin iniţierea greoaie a unor culturi MSC de la aceşti pacienţi.
Tehnicile de inginerie tisulară şi inginerie genică se află la început; cu toate acestea,
câteva domenii par a beneficia în curând de aplicaţii clinice ale studiilor experimentale bazate pe
MSC. Astfel, cel mai probabil, domeniul regenerării ţesutului osos (cel mai avansat, cu referire
la utilizarea MSC) va utiliza aplicaţii clinice standardizate.
Deşi alte domenii, precum refacerea cartilajului, aplicaţiile neurologice şi terapia genică,
fie întâmpină dificultăţi sau se găsesc într-un stadiu incipient de dezvoltare, se preconizează că în
următorii 10 ani se vor face progrese importante din punct de vedere clinic (Dennis 2004)
Utilizarea celulelor stem nu este lipsită de riscuri, însă tehnologiile viitoare vor contribui
la diminuarea şi controlul acestora. Astfel, efecte precum osificarea sau formarea de ţesuturi
ectopice după administrarea de celule stem pot fi controlate prin utilizarea unor celule stem
modificate a fi sensibile la un anumit agent terapeutic.
Potenţialul celulelor stem este foarte variat, contribuind la dezvoltarea unei ştiinţe în sine
dar şi a altora deja existente. Chiar dacă rezultatele obţinute nu vor fi cele scontate, ceea ce este
foarte greu de realizat, impactul avut de aceste celule asupra ştiinţei şi medicinei regenerative
rămâne de necontestat.

  130 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
CONCLUZII 

Concluzii

1. Deşi originea celulelor stem, în general, este controversată, existenţa acestora este certă,
iar potenţialul clinic nu poate fi negat.

2. Existenţa MSC a fost prefigurată încă din 1869 de către Goujon. Ulterior, cele mai
semnificative rezultate au fost cele obţinute de Friedenstein (anii “70), Castro-Malaspina
(anii „80), Caplan şi Pittenger (anii “90).

3. MSC reprezintă o categorie a celulelor stem, izolate iniţial din MO şi ulterior din alte
ţesuturi, ce cuprinde o categorie vastă de celule cu fenotip multiplu, ale cărei criterii de
definire şi caracterizare nu sunt pe deplin definitivate.

4. Lipsa criteriilor de definire a MSC, stă la baza multor discuţii ce vizează identitatea MSC.

5. Variabilitatea acestor criterii stau la baza existenţei unor denumiri variate ce au ca element
comun celule aderente ce formează CFU-F.

6. Testul standard propus de ISCT pentru definirea MSC cuprinde: celule aderente, ce
formează CFU-F, cu potenţial de diferenţiere osteo, condro şi adipogenică, pozitive
CD105, CD73, CD90 şi negative CD45, CD34, CD14/11b, CD79a/CD19 şi HLA-DR.

7. Deşi MO, este rezervorul clasic al MSC, acestea pot fi izolate din numeroase locuri:
muşchi, piele, ţesut adipos, periost şi ţesut patologic articular specific artritei reumatoide,
sânge din cordonul ombilical, placentă, lichid amniotic, sânge periferic, ficat fetal, plămân
fetal, os trabecular şi ţesutul dentar decidual.

8. MSC sunt izolate şi expansionate în cultură facil, manifestând un larg potenţial de


diferenţiere ecto, mezo şi endodermală.

9. Deşi exprimă pe suprafaţa lor o mare varietate de molecule ce pot servi la izolarea lor, nu
a fost identificat încă un marker specific MSC, astfel încât izolarea acestora se bazează pe
un panel cu marker-i multipli.

10. Cu toate că originea lor nu este clară, cele mai multe teorii orientează asupra legăturii
MSC cu pericitele.

11. Se consideră că rolul in vivo al MSC constă în realizarea reţelei stromale structurale şi
funcţionale de susţinere a hematopoiezei, în reparare şi tournover la nivel osos,
progenitoare ale ţesutului cartilaginos, suport vascular, progenitoare ale adipocitelor şi
implicare în repararea tisulară post-lezională.

12. Implicarea MSC în toate aceste procese se face fie direct, fie prin elaborarea unei largi
palete de citokine şi molecule semnal ce acţionează asupra celulelor mature.

13. MSC sunt o categorie de celule interactive apte a realiza numeroase conexiuni moleculare
cu celulele vecine prin intermediul numeroaselor substanţe elaborate şi al prezenţei unui
mare număr de receptori pe suprafaţa lor.

14. Interacţiunea MSC cu nişa stem reprezintă un element critic ce condiţionează


comportamentul acestora.

  131 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                   PARTEA GENERALĂ 
CONCLUZII 

15. MSC sunt capabile de homing, proces controlat la multiple nivele de către celule în sine,
nişa stem şi/sau chemokinele prezente în mediu.

16. MSC manifestă un homing preferenţial pentru ţesuturile inflamate de diferite afecţiuni
(imunologice, ischemice etc.).

17. Cu toate că nu este încă complet elucidat, rolul MSC în cadrul procesului de îmbătrânire şi
efectele acestuia asupra lor constituie un element ce le condiţionează comportamentul.

18. Dintre toate tipurile de celule stem, MSC reprezintă categoria cu raportul beneficiu/risc
cel mai bun.

19. Potenţialul clinic al MSC este bogat, putând servi ca terapie celulară în domenii ca:
reconstrucţia osoasă, a tendoanelor şi cartilajelor, în hematologie, neurologie, cardiologie,
nefrologie, hepatologie, oncologie şi diabet, pretându-se inclusiv la manipulare genică.

20. MSC manifestă un puternic efect imunosupresor ce face inutilă utilizarea


imunosupresoarelor şi le face ideale pentru tratamentul bolilor autoimmune.

21. Până la acest moment nu au fost evidenţiate reacţii adverse majore sau tumorale asociate
uzului MSC la om.

22. Deşi nu s-a evidenţiat producerea de tumori la om, MSC pot accelera posttransplant
evoluţia unor tumori maligne preexistente.

  132 
 

Partea specială

Studiul Experimental

Sutura patch-ului 3D însămânţat cu MSC, destinat reconstrucţiei


tubului digestiv. F1

  133 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                                   Introducere 

INTRODUCERE
Conform definiţiei date de National Institute of Health (U.S.A.) ingineria tisulară
reprezintă un domeniu multidisciplinar cu dezvoltare rapidă ce reuneşte domenii ştiinţifice axate
pe studiul biologiei celulare, moleculare şi ingineriei biomedicale, cu scopul de a dezvolta celule,
ţesuturi şi organe sau substitute ale acestora destinate reparării, înlocuirii sau îmbunătăţirii
structurii şi funcţiei biologice afectate ca urmare a unor defecte congenitale, a rănirii, a bolii sau
a senescenţei.
Ingineria tisulară a tubului digestiv (IT-TD), în special ramura axată pe reconstrucţia
intestinului subţire, îşi datorează începuturile muncii de pionierat desfăşurată de JP Vacanti şi
colegii acestuia la Boston, USA, începând cu anul 1988, când aceştia au realizat primele
tentative de cultivare a enterocitelor pe matrice polimerice biodegradabile. (Markel 2008)
În domeniul reconstrucţiei tubului digestiv, celule stem în general şi MSC în particular
constituie o apariţie exotică venită să realizeze un pas înainte pentru a duce la un nivel superior
utilizarea biomaterialelor acelulare ce au reprezentat unealta de bază o bună perioadă de timp.
Domeniul IT-TD este complex şi nu poate funcţiona fără a reunii ramuri ale cercetării
biomedicale care vizează îmbunătăţirea şi evoluţia constantă a celor trei elemente esenţiale
realizării unui produs de IT: celulele utilizate, biomaterialul (matricea) suport şi bio-moleculele
ce intermediază legătura celulă-biomaterial şi celulă-biomaterial-tesut gazda. (Markel 2008)
Sursa de celule destinate reconstrucţiei digestive, cel puţin teoretic, este variată – putând
apela la enterocite, celule stem embrionare, celule stem mezenchimale, celule stem ombilicale şi
celule stem gastrointestinale. Cu toate acestea, fiecare tip de celule are insuficiente specifice,
astfel încât identificarea celulei stem ideale pentru IT-TD întârzie să apară cu toate că MSC şi
celule stem intestinale promit cele mai bune rezultate.
Celule stem intestinale sunt localizate la nivelul criptelor intestinale şi posedă capacitatea
de a se diferenţia în toate celulele ce intră în componenţa vililor intestinali. Au fost descrise două
localizări ale acestora la nivelul criptei: imediat deasupra celulelor Paneth, pe o distanţă de 4
celule fiind numite +4LRC (+4 label-retaining cells) (Potten 2002) şi la baza criptei, dispersate
printre celulele Paneth şi fiind numite CBC (cript-based columnar cells) şi având potenţialul de a
se diferenţia în toate celulele intestinului (Scoville 2008).
Recent, au fost identificaţi şi marker-i specifici pentru celule stem intestinale: Musashi 1,
Lgr5 (leucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled receptor 5) şi DCAMKL-1 (double
cortin and CaM kinase-like-1), a căror utilizare combinată contribuie la izolarea unor populaţii
celulare pure. (Markel 2008)
Utilizarea celulelor stem intestinale se realizează sub forma „organoizilor” (eng.
organoids) – unităţi multicelulare ce reprezintă structura 3D a vilozităţilor intestinale, derivate
din intestinul neonatal şi care conţin un miez mezenchimal acoperit de epiteliu intestinal
polarizat, furnizând rezultate dintre cele mai bune. Organoizii au fost izolaţi pentru prima dată de
către Weiser în 1973, şi conţin toate celule ce se găsesc pe secţiunea totală a tubului digestiv.
(Markel 2008)
Vacanti a transplantat aceşti organoizi la şobolan, obţinând structuri chistice de neo-
intestin în timp ce alte echipe au arătat ca celule stem intestinale transplantate pe matrice suport
formează neo-intestin ce îşi poate menţine proprietăţile similare celui nativ până la trei luni
posttransplant. Mai mult, s-a observat că utilizarea organoizilor din zona de absorbţie maximă
realizează segmente de neo-intestin cu funcţie absorbtivă. În plus, organoizii fixaţi pe matrice
suport repopulează intestinul şi stimulează proliferarea vasculară şi limfatică. (Markel 2008)
Datorită capacităţii de diferenţiere şi cultivare relativ uşoară, combinate cu aspectele
imunologice şi etice favorabile, utilizarea celulelor stem mezenchimale, în domeniul ingineriei
tisulare cu viză reconstructivă, constituie un atuu şi un arsenal terapeutic ce nu poate fi neglijat.
Fiind capabile a se diferenţia într-o gamă largă de celule mezenchimale, MSC atrag
atenţia asupra utilizării lor în sfera reconstrucţiei tubului digestiv. Pe lângă aceasta, MSC pot
realiza o contribuţie importantă la regenerare şi prin producerea de factori umorali, implicaţi în

  134 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                                   Introducere 

controlul inflamaţiei, şi al efectelor paracrine asupra celulelor diferenţiate înconjurătoare sau


chiar şi asupra celulelor stem intrinseci.
Dezvoltarea IT-TD este dependentă şi de dezvoltarea unor noi polimeri suport pentru
celule. Deşi submucoasa de intestin subţire (SIS) a fost utilizată cu rezultate bune pentru
acoperirea unor defecte, utilizarea ei ca matrice suport pentru celule a oferit rezultate
contradictorii. Mai mult, realizarea unor noi polimeri cu proprietăţi similare SIS, ca urmare a
obţinerii dificile a SIS, de tipul chitosan-ului sau matricelor poliesterice au oferit rezultate
modeste. (Markel 2008)
La acest moment, ingineria tisulară digestivă ţinteşte cu precădere metodele terapeutice
destinate sindromului de intestin scurt, concentrându-se pe obţinerea unor graft-uri care să
realizeze un segment digestiv cu absorbţie şi peristaltică normală (pot fi obţinute numai prin
reproducerea funcţională a tuturor celor 4 straturi ale tubului digestiv). Pe lângă acesta, utilizarea
MSC poate extinde sfera aplicaţiilor incluzând tratamentul fistulelor, bolii Crohn, colitei
ulcerative şi enterocolitei necrotizante.
Deşi promiţătoare, rezultatele experimentale nu au reuşit încă să obţină un neo-intestin
care să rezolve problemele clinice ale sindromului se intestin scurt, însă au permis întrevederea
aplicaţiilor viitoare ale graft-urilor ca tratament pentru o complicaţie postoperatorie devastatoare:
fistula digestivă (Sitges-Serra 1982).
Având în vedere acestea, utilizarea produselor obţinute prin IT pentru tratamentul
fistulelor digestive este mult mai practică decât în cazul sindromului de intestine scurt, deoarece
în acest caz peretele digestiv regenerat nu necesită prezenţa obligatorie a absorbţie şi a
peristalticii normale.
Cu toate că reconstrucţia tubului digestiv a realizat progrese impresionante în ultimele
două decade, evoluţia acesteia a început scrierea unei noi pagini în care celulele stem vor avea
rolul principal, finalizat cu instituirea clinică a unor metode terapeutice celulare menite a rezolva
o patologie extrem de variată şi costisitoare.

  135 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                    Ipoteză/Scop şi obiective 

IPOTEZĂ
Având proliferare extensivă, clonalitate multiliniară şi potenţial de diferenţiere in vitro şi
in vivo pentru a forma celule specifice celor trei straturi germinative (Abdallah 2008) celulele
stem mezenchimale îndeplinesc un rol important în repararea ţesuturilor post-natale, posibilităţile
terapeutice ale acestora fiind teoretic nelimitate; datorită potenţialului de diferenţiere
mezenchimală cumulat cu expresia unei palete variate de factori umorali, s-a presupus că MSC
pot contribui la regenerarea şi reconstrucţia tubului digestiv.
Având în vedere acestea, s-a considerat că peretele digestiv poate fi regenerat cu succes
dacă i se asigură un suport material de susţinere (i.e. scaffold) populat cu celule capabile a se
diferenţia multiliniar (i.e. MSC).
Pe baza acestei ipoteze s-a apreciat că un defect de tipul celui întâlnit în cazul fistulelor
digestive poate fi acoperit cu un patch care să stimuleze reconstrucţia, dacă acesta are o
durabilitate suficientă pentru a permite regenerarea straturilor digestive.

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE LUCRĂRII


Scopul acestui studiu este de a investiga dacă MSC pot avea o contribuţie semnificativă
în cadrul procesului de reparare a defectelor tubului digestiv, putând substitui cu succes lipsa de
substanţă parietală.
Pentru aceasta s-a intenţionat demonstrarea faptului că MSC pot fi recoltate şi
expansionate in vitro cu uşurinţă pentru ca, în final, să fie integrate facil în cadrul unui patch bio-
celular 3D destinat substituirii lipsei de ţesut parietal digestiv.
S-a intenţionat repararea peretelui digestiv dar, şi obţinerea unei structuri regenerate
similară peretelui digestiv nativ care să conţină cele 4 straturi, pentru acoperirea unei fistule
digestiv.
S-a propus că această ipoteză să fie testată pe un model experimental animal de defect
parietal digestiv iatrogen la nivel gastric şi intestinal.

  136 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                        Materiale şi metode 

MATERIALE ŞI METODE
Pentru dezvoltarea unei metode inovative menite a regenera peretele digestiv folosind
MSC a fost necesară realizarea unui design adecvat care să permită supravieţuirea şi
diferenţierea CSM, testare şi analiza acestuia pe un model experimental animal.
Realizarea structurii patch-ului celular 3D a avut în vedere constituirea unui produs
rezistent, biotolerabil, uşor de realizat, care să prezinte o funcţie suport a celulelor ce facilitează
fixarea acestora la patch.
Majoritatea matricei extracelulare, la mamifere, este compusă din colagen, acesta fiind
specific şi diferit de la tendoane la cornee. Aşadar, diferite tipuri de colagen oferă proprietăţi
biologice variate diferitelor tipuri de ţesuturi (Badylak, 2007). Astfel, s-a decis ca acesta să fie
baza scaffold-ului ce susţine celulele.
Colagenul are avantajul de a fi larg răspândit în organism, cu numeroase funcţii
fiziologice, fiind, în plus, şi biotolerabil. Pentru construirea patch-ului, colagenul a fost utilizat
sub două forme: un strat de colagen sintetizat în laborator sub forma unui burete cu o grosime de
3-5 mm şi perete vascular arterial full-thickness. Buretele de colagen are rolul de suport al
celulelor, permiţând localizarea şi proliferarea acestora în porii lui, în timp ce peretele arterial
conferă rezistenţă şi impermeabilitate patch-ului. Astfel, colagenul contribuie la crearea unei
matrice extracelulare ce asigură proprietăţiile mecanice şi biochimice optime celulelor stem
mezenchimale.
În plus, avantajele majore ale bureţilor de colagen includ: capacitatea crescută de a
absorbi exudatul rănilor, aderenţa bună la rănile umede, păstrând microclimatul umed, dar
protejându-l de infecţiile bacteriene. Pe lângă aceste avantaje fizice, colagenul promovează
creşterea şi mobilitatea celulară, astfel ajută la formarea de ţesut nou la locul aplicării.
După inocularea celulelor stem mezenchimale, patch-ul a fost transplantat la şobolani
Wistar în poziţie gastrică sau intestinală pentru a substitui un defect cu diametrul de cca 0.5-0.7
cm.
Pentru evaluarea patch-ului, s-a constituit un lot control de animale, care au fost supuse
aceluiaşi protocol anestezic şi chirurgical, dar al căror defect digestiv a fost acoperit cu un patch
lipsit de MSC (constituit doar din fragmentul arterial şi buretele colagenic).

Realizarea matricei colagenice

Constituirea matricei colagenice se bazează pe liofilizarea unui amestec gel de colagen


tip I şi agaroză (COL-AG) în proporţie de 1:0.5.

Etapele tehnologice
pentru obţinerea matricei
suport. 

Izolarea colagenului din Reconstituirea ex vivo a Sterilizarea şi


tendon bovin şi amestecului COL-AG sub condiţionarea matricei
purificarea acestuia. formă de matrice de COL-AG.
  poroase şi reticularea  
acestora.

  137 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                        Materiale şi metode 

Izolarea şi purificarea colagenului

Colagenul utilizat a fost extras din tendon bovin, utilizat proaspăt sau după congelare,
obţinut de la animale sacrificate în abatoare.
Principalele faze ale procesului de extracţie a proteinei colagenice din ţesut constau în
tratamente preliminare, extracţia propriu-zisă şi purificarea selectivă.
Tratamentele preliminare constau în spălarea ţesutului cu apă potabilă, pentru
îndepărtarea impurităţilor şi a urmelor de sânge, precum şi mărunţirea mecanică a ţesutului
spălat în bucăţi de 3-5mm, pentru a mări suprafaţa de contact cu reactivii.
Pentru extracţie s-a utilizat procedeul enzimatic cu pepsină în acid acetic. Ţesutul
mărunţit s-a incubat cu pepsină dizolvată în acid acetic 0,5M, pH 3, în raport ţesut:enzimă de
10:1, la 4oC timp de 48 de ore. Soluţia de colagen extras s-a recuperat prin centrifugare la 10.000
rpm, la 4oC, timp de 30 de minute şi s-a dializat faţă de acidul acetic 0,5M timp de 48 de ore.
Purificarea soluţiei de colagen obţinute s-a realizat prin precipitare cu NaCl 0.7M,
cristalizată şi mojarată în prealabil, sub agitare continuă, la temperatura camerei. După
centrifugarea precipitatului format, acesta s-a dizolvat în soluţie acidă şi s-a dializat faţă de apa
distilată în vederea eliminării NaCl existente în proba de colagen.

Reconstituirea colagenului extras sub formă de matrice

Agaroza (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) utilizată la fabricarea
matricei 3D se caracterizează printr-o temperatură de gelificare scăzută (390C), conţinut în sulfat
0,7 %, conţinut în cenuşă 0,15 % şi conţinut în apă 8 %.
Soluţia de colagen obţinută în urma dializei se prezintă sub formă de gel care conţine cca
1-1,5% substanţă uscată. Gelul de colagen se diluează la 0,1-0,5% substanţă uscată, se combină
în raport de 1:0.5 cu agaroză şi se liofilizează la un liofilizator Christ Gamma 1-16 LSC.
Congelarea produsului s-a făcut la -40 0C şi presiunea de 0,120 mbar, iar faza finală a uscării
prevede o încălzire a produsului la maxim 30 0C (temperatura de cca 37 0C produce denaturarea
colagenului). Produsul rezultat se prezintă sub forma de burete, având dimensiunea porilor între
10-200 µm (Fig. 1, Fig. 2).

Fig. 1. Aspectul macroscopic al matricei de COL-AG reconstituită sub formă de burete. F1


A. Suprafaţa matricei. B. Detaliu al suprafeţei; mărire X5. C. Detaliu al profilului; mărire X8; grosime
reală: 5 mm.  

  138 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                        Materiale şi metode 

Fig. 2. Imagine ESEM a


unei matrice de COL-AG
reconstituită sub formă
de burete. F2 

Porozitatea biomaterialului de colagen poate fi modificată prin variaţii ale concentraţiei


de colagen, ale ratei de îngheţare, ale tipului de solvenţi utilizaţi la extracţia colagenului sau ale
temperaturii şi pH-ului soluţiei înainte de uscare.
Îmbunătăţirea proprietăţilor mecanice ale colagenului purificat s-a realizat prin expunere
la UV.
În plus, colagenul poate fi combinat cu alte materiale cum ar fi elastina, fibronectina,
glicozaminoglicani, iar materialul rezultat poate fi crosslink-at cu glutaraldehidă sau prin
tratamente termice, în vederea unei rezistenţe mecanice crescute. În acest studiu, matricele
reconstituite sub formă de burete au fost crosslink-ate prin expunere la radiaţii UV, timp de 2
ore.

Caracterizarea colagenului extras

Analiza cantitativă a fost realizată prin determinarea colorimetrică a hidroxiprolinei


(Hyp), aminoacid caracteristic colagenului, după o hidroliză totală a lanţurilor polipeptidice ale
proteinei cu HCl 6M, la 120 0C, timp de 24 h. Hyp eliberată prin hidroliză este oxidată la pirol cu
ajutorul cloraminei B sau T, iar pirolul formează cu p-dimetilaminobenzaldehida un cromofor cu
maximul de absorbţie la 560 nm. Valorile Hyp au fost determinate de pe o curbă standard
utilizând concentraţii de Hyp între 0,0-10,0 µg/ml. Cantitatea de colagen s-a determinat ţinând
cont că 1 mg de colagen conţine, în medie, 0,122 mg Hyp.
Cantitatea totală de proteine s-a determinat prin dozarea azotului total (metoda
Kjeldahl), conform prevederilor FR X. Cantitatea de substanţă proteică este dată de formulă:
substanţa proteică % = azot total % x 5,65

Determinarea greutăţii moleculare medii (M) a probelor de colagen s-a realizat prin
metoda vâscozimetrică ce are la bază relaţia de proporţionalitate directă a M cu vâscozitatea
intrinsecă ([η]) (relaţia Mark-Houwink):

[η] = KMα,

unde K şi α sunt constante specifice colagenului, determinate prin difuzia luminii şi au


valorile K=2,5x10-9 şi α=1,74.

  139 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                        Materiale şi metode 

Vâscozitatea intrinsecă se determină din reologia soluţiilor diluate de colagen. Pentru


aceasta se prepară diferite concentraţii de colagen, într-o soluţie de acid acetic 0,5M şi se
măsoară timpul de curgere al acestor soluţii printr-un vîscozimetru Ubblode cu capilar, având
constanta C=0,036, în mediu termostatat, la 25oC. Se determină apoi vâscozitatea relativă (ηrel) şi
cea specifică (ηsp) după relaţiile:

Ηrel = tproba/tsolvent
Ηsp = ηrel-1

Se trasează graficul ηsp/c=f (c) şi se determină vâscozitatea intrinsecă ca fiind [η] = limc→0
ηsp/c.

Determinarea purităţii colagenului s-a urmărit turbidimetric, după precipitarea


colagenului sub formă de fibrile în condiţii de mediu similare cu cele din ţesut.

Morfologia fibrilelor formate s-a evidenţiat prin microscopie electronică de baleaj


(SEM), la un microscop Philips (ESEM, Quanta 400, FEI, Philips, Olanda) după colorarea
grilelor pe care au fost plasate picături de probă cu o soluţie de acid fosfotungstic 1%. Probele au
fost procesate în modul “vid scăzut” şi vizualizate ca suprafaţă şi în secţiuni transversale.

Densitatea (d) şi porozitatea (ε) bureţilor a fost măsurată prin metoda înlocuirii
volumului cu apă (Zhang 2003). Pe scurt, o probă de greutate cunoscută (g1) este imersată într-
un recipient cu un volum cunoscut de apă, v1. Apoi, volumul total de apă conţinând buretele
impregnat cu apă (v2) şi volumul rezidual de apă după ce buretele impregnat cu apă a fost
îndepărtat (v3) au fost înregistrate. Pentru calcul au fost utilizate următoarele ecuaţii:

D = g1/ (v2-v3)
Ε = (v1-v3) / (v2-v3)x100 %

Gradul de hidratare al bureţilor a fost calculat pentru probe (5 mg) incubate în tampon
fosfat, pH 7.4 (3 ml), la 200C, pentru 24 h, utilizând ecuaţia:

gradul de hidratare = capacitatea de legare a apei/greutate uscată x 100,

unde capacitatea de legare a apei = (greutate umedă – greutate uscată)/greutate uscată

Testul de biodegradare in vitro după reticularea bureţilor a fost realizat cu ajutorul


colagenazei bacteriene (tip IA, Sigma, Germania) (Lee JE 2001) (Moldovan 2009).

Gradul de reticulare al bureţilor a fost determinat prin măsurarea cantităţii de COL


dizolvat în soluţie, prin metoda Bradford.

Biocompatibilitatea in vitro a matricei a fost evaluată prin testarea viabilităţii şi


proliferării fibroblastelor dermale umane într-o cultură in vitro în prezenţa buretelui de colagen.
S-a utilizat metoda de evaluare MTT ([4,5-dimethylthiazol-2yl]2,5-diphenyl tetrazolium
bromide), o metodă ce se bazează pe evaluarea funcţiilor metabolice a celulelor expuse la
biomaterial.
Cultura de celule a fost obţinută din fibroblaste explante din derm uman şi a fost utilizată
pentru experimente la pasajul nr. 4. Matricele poroase utilizate au fost tăiate sub forma unor
cuburi cu latura de 5 mm şi au fost sterilizate. Apoi, au fost plasate pe plăci de cultură din
polistiren de 24 de godeuri, peste care s-au adăugat 500 µl de suspensie celulară în mediu de
cultură DMEM suplimentat cu ser bovin fetal (Sigma) 10%, având o densitate celulară de

  140 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                        Materiale şi metode 

1,2x105 celule/ml. Plăcile au fost menţinute în incubator, în atmosferă cu CO2 5%, la 37 0C, timp
de 48 h şi, respectiv, 72 ore. (Moldovan 2007)
Metoda MTT, o metodă spectrofotometrică, se bazează pe conversia bromurii de
dimetiltiazol-2-il difeniltetrazoliu (MTT) la cristale insolubile albastre de formazan sub acţiunea
dehidrogenazelor mitocondriene din celulele vii (Mossman, 1983). În cadrul experimentului,
după 48 h şi respectiv 72 h de cultivare în prezenţa matricelor poroase, celulele au fost spălate şi
50 µl de soluţie MTT dizolvat în mediul de cultură au fost adăugaţi în fiecare godeu. Incubarea
plăcii s-a realizat la 37 oC, timp de 3h, iar apoi a fost adăugat câte 1 ml izopropanol/godeu pentru
solubilizarea cristalelor de formazan. Absorbanţa a fost măsurată la 570 nm cu un spectrometru
Jasco V-650 (Japonia). Numărul de celule viabile a fost calculat prin raportare la martor (celule
cultivate în absenţa probei) considerate ca având o viabilitate de 100 %.
Pentru analiza morfologiei celulare, fibroblastele cultivate în prezenţa variantelor de
matrice poroase, timp de 72 ore au fost colorate cu hematoxilină-eosina, fiind studiate prin
microscopie optică cu un microscop Zeiss AxioStar Plus echipat cu o cameră color digitală şi
soft Zeiss AxioVision 4.6.

Sterilizarea matricei de colagen

După liofilizare, bureţii de colagen se condiţionează imediat în pungi transparente din


polietilenă, închise etanş prin termosudare. Sterilizarea produsului ambalat s-a realizat prin
tratament cu oxid de etilenă utilizând o etuvă specială (Sterivac 5XL), la temperatura de 37 0C,
presiune de 100 mbarr, timp de 3 ore şi umiditate de cca 60 %.

Vasele arteriale

Deoarece modelul teoretic al patch-ului constă în realizarea unei matrice 3D care să


servească ca pat de inoculare, grefare şi dezvoltare pentru celulele stem, pentru a asigura o
rezistenţă mai mare a graft-ului s-a decis ranforsarea acestuia cu un fragment arterial alo sau
xenogen.
Fragmentele vasculare, aortice sau iliace, au fost recoltate de la donatori umani în moarte
cerebrală sau porci sacrificaţi. Vasele umane ce au provenit de la donatori de organe, au
îndeplinit criteriile minime de donare, iar cele de la suine au fost recoltate steril dintr-un abator
local (S.C. Romsuintest Periş S.A.).
Aorta toracică şi arterele iliace comune de la donatorii umani au fost prelevate în timpul
recoltării celorlalte organe pentru transplant. Fragmentele de aortă au fost rapid imersate în
soluţie de crioprezervare Custodiol® HTK (Methapharm Inc., Brantford, Ontario, Canada),
transportate la temperatura de 4°C. Înainte de conservarea, segmentele arteriale au fost curăţate
chirurgical, în condiţii sterile, de ţesutul conjunctiv perivascular până la nivelul adventicei.
Fragmentele au fost introduse în pungi sterile de polietilenă conţinând o soluţie sterilă de
glicerol, urmând a fi crioprezervare la -196°C până la momentul utilizării (Fig. 3). În vederea
folosirii, arterele au fost decongelate prin imersie bruscă în baie de apă la 37 °C.
Aorta toracică şi abdominală de la porci adulţi au fost recoltate steril şi conservate
imediat în soluţie salină echilibrată Hank’s (HBSS, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA).
Transportul şi stocarea lor a fost similară procedeului folosit pentru fragmentele umane.
Pentru constituirea patch-urilor fragmentele arteriale decongelate au fost imersate în
soluţie de fosfat salin tamponat (PBS) cu penicilină (200 U/ml) şi streptomicină (200 µg/ml)
(Biochrom, Berlin, Germany) şi stocate la 4°C până la momentul asamblării patch-ului.

  141 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                        Materiale şi metode 

Fig. 3. Aspectul grefei vasculare iliace umane, utilizată pentru


obţinerea patch-urilor cu MSC; Banca pentru ţesuturi crioprezervate
(S.C. Pneumatic & Vacuum Technology S.A). F1 

Celulele stem mezenchimale

În cadrul studiului experimental au fost utilizate MSC provenind de la trei donatori


voluntari şi de la şobolani. Ambele tipuri au fost supuse aceloraşi procedee privind analiza şi
biosecuritatea.

Recolatarea MSC umane

Celulele stem mezenchimale umane au fost obţinute aseptic, sub anestezie locală cu
lidocaina 1%, din măduva hematopoietică extrasă prin puncţie medulară de la nivelul spinei
iliace postero-superioare (Fig. 4), utilizând un sistem de puncţie osoasă Biomedical SRL (Italia)
(Fig. 5).
În vederea recoltării, voluntarii au consimţit informat pentru procedură şi au fost supuşi
unui screening pentru identificarea infecţiilor sau a patologiilor maligne. Nu au fost identificate
complicaţii legate de procedura de recoltare.
Aspiratul medular recoltat (cca 30 ml/donator), identificat prin prezenţa grunjilor
medulari, a fost stocat pe durata transportului în eprubete Vacutainer cu EDTA-K3, la 37oC,
fiind prelucrat în cel mult 60 minute de la recoltare.

  142 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                        Materiale şi metode 

Fig. 4. Recoltarea aspiratului medular. F3


A. Realizarea anesteziei locale cu lidocaină 1%, după dezinfectarea zonei cu iodpovidone.
B. Introducerea trocarului de puncţie în spaţiul medular. C. Aspirarea conţinutului medular.
D. Retragerea sistemului de aspirare şi realizarea hemostazei prin compresie.

Fig. 5. Sistemul de
puncţie medulară
Biomedical SRL (Italia)
BIL1817/80, 18G. F1

  143 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                        Materiale şi metode 

Izolarea şi cultura MSC umane

Probele de măduvă osoasă au fost testate pentru următorii agenţi infecţioşi: HBV, HVC,
HTLV-1/2, HIV 1/2, CMV, Treponema, Toxoplasma.
Pentru izolarea MSC s-a aplicat protocolul de selecţie negativă RosseteSep (Fig. 6) care
permite obţinerea unor preparate de MSC mai omogene. Măduva recoltată a fost incubată cu un
cocktail de anticorpi (RosseteSep, StemCell Technologies, Inc., Vancouver, Canada), 50 de µl
pentru fiecare 1 ml de măduvă. Kit-ul implică rozetarea cu ajutorul hematiilor. RossetSep
conţine un amestec de reactivi care formează complexe tetramerice de anticorpi care fixează
celulele nedorite de hematii prin rozetare. Aceste complexe sunt formate din două molecule de
anticorp monoclonal murin tip IgG legate în tetramer prin două molecule de anticorp anti-murin.
Complexele sunt bispecifice. Unul dintre anticorpii murini recunoaşte un antigen de la suprafaţa
celulelor hematopoietice normale, al doilea recunoaşte glicoforina A de pe suprafaţa hematiilor.
Alte complexe din amestec sunt monospecifice pentru glicoforina A. Celulele hematopoietice
nedorite (faţă de care există în amestec anticorpi monoclonali anti-CD specific), sunt legate de
hematii formând rozete. Atunci când sunt centrifugate în prezenţa unui mediu cu gradient de
densitate (Ficoll), celulele rozetate sedimentează împreună cu hematiile libere. Celulele dorite,
nerozetate sunt ulterior uşor de separat de la interfaţa Ficoll:plasmă.

Fig. 6. Etapele separării MSC prin selecţie negativă, conform


protocolulul RosseteSep, şi separare în gradient de densitate. F4 

Avantajele acestei tehnici sunt: (a) posibilitatea de a izola celulele dorite direct din sângele
total sau aspirat medular într-o singură etapă; (b) rapiditatea – metoda durează doar cu 20 minute
mai mult decât o separare standard cu Ficoll (timpul necesar incubării probei cu anticorpii); (c)
are la bază selecţia negativă, drept urmare celulele dorite nu sunt legate cu anticorpi, putând fi
imediat utilizate; (d) este economică, nu necesită echipament special. Dezavantajul metodei
constă în puritatea populaţiei obţinute, aceasta fiind de numai 70-75%.
Amestecul a fost incubat 20 de minute la temperatura camerei, diluat ulterior cu un volum
dublu de tampon fosfat salin care conţine 2% ser fetal bovin şi 1mM EDTA. Proba diluată este
supusă ulterior metodei de separare în gradient de densitate cu Ficoll-Paque (1,007 g/ml) şi
centrifugată la 300 g timp de 25 de minute. Inelul de celule prezent la interfaţa cu mediul de
separare a fost colectat, iar celulele spălate iniţial cu mediu simplu şi ulterior resuspendate în
Dulbecco’s MEM cu 10% ser fetal (Sigma), 200 UI/ml penicilină, 200 µg/ml streptomicină,
suplimentat cu bFGF 10ng/ml (Gibco), EGF 10 ng/ml (Sigma).
Numărul total de celule a fost evaluat în urma colorării 1:1 cu albastru Tripan 0.4%, pentru
a aprecia totodată şi viabilitatea celulelor în urma procedurii de separare. În general aceasta nu a
fost mai mică de 95%.

  144 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                        Materiale şi metode 

Celulele au fost ulterior plasate în plăcuţe de 75 cm2 la densitatea de 2x106 celule/ml şi


incubate la 37°C în atmosferă cu 5% CO2.
Mediul de cultură s-a schimbat la 48 ore iniţial, ulterior la 3-4 zile. Când cultura primară a
ajuns aproape de confluenţă (90%), în aproximativ 2 săptămâni, celulele au fost recuperate prin
digestie cu o soluţie de 0.25% tripsina în 1 mM EDTA (Gibco, Invitrogen, USA) şi cultivate din
nou la o densitate de 5.000-10.000 celule pe cm2.
Cultura se menţine in vitro prin pasaje repetate. În timp se obţine o uniformizare a culturii şi
o purificare a celulelor cu potenţial proliferativ înalt, care se presupune că reprezintă MSC (Fig.
7).

Fig. 7. Celule izolate din maduva osoasă


hematogenă umană, în cultură. F4
A. Pasajul 1; mărire X20. B. Pasajul 2; mărire
X20. C. Pasajul 3; cultură purificată de celule
stem mezenchimale;mărire X20; contrast de
fază.

Recoltarea MSC de la şobolan

De la şobolan, recoltarea celulelor stem mezenchimale s-a realizat de la nivelul oaselor


lungi ale membrelor (humerus şi femur), care au fost recoltate steril după sacrificarea animalelor
(Fig. 8). Pentru întreaga activitate experimentală au fost utilizaţi un număr de şapte subiecţi (trei
femele, patru masculi), în vârstă de 12 săptămâni.
Sacrificarea animalelor s-a făcut în conformitate cu normele etice internaţionale privind
tratamentul aplicat animalelor de laborator. Eutanasia a fost realizată după anestezierea gazoasă a
subiecţilor cu sevoflurane 4%, 4L/minut, prin administararea unei supradoze de ketamină 20
mg/ml.
Timpul operator a fost realizat în întregime în câmp steril în incinta unei hote cu flux
laminar.
Oasele recoltate au fost menţinute, pe durata transportului, în soluţie salină 0,9% cu
Gentamicină 100 µg/ml la temperatura camerei, iar timpul mediu total de ischemie al măduvei a
fost de cca 70 de minute, cu o durată de recoltare a maduvei nu mai lungă de 30 minute.

  145 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                        Materiale şi metode 

Fig. 8. Recoltarea oaselor de la şobolan. F1


Oasele sunt extrase împreună cu muşchii aderenţi după dezarticulare. A. Subiectul eutanasiat este
ras în zona membrelor, iar tegumentul este aseptizat cu soluţie de iodpovidone. B. Aşezarea
câmpurilor sterile; membrele inferioare au fost colectate. C. Recoltarea femurului stâng. D. Aspectul
femurelor (stânga) şi humerusurilor (dreapta) după dezarticulare. E. Aspectul pieselor după
îndepărtarea ţesutului muscular. F. Piese scheletizate aflate în soluţie sterilă salină 0.9% şi
gentamicină 100 µg/ml.

Izolarea şi cultura MSC de la şobolan

Oaselor recoltate li s-au îndepartat epifizele, iar cavitatea medulară a fost spălată prin
injectare sub presiune cu 10 ml tampon fosfat salin cu heparină (10 UI/ml) (Fig. 9, Fig. 10).
După recoltare, hematiile au fost lizate cu o soluţie de NH4Cl/NaHCO3/EDTA.
Pentru culturile primare, celulele au fost resuspendate în Dulbecco’s MEM cu 10% ser fetal
(Sigma), 200 UI/ml penicilină, 200 µg/ml streptomicină, plasate în plăcuţe de 75 cm2 la
densitatea de 2x106 celule/ml şi incubate la 37°C în atmosferă cu 5% CO2.
Mediul de cultură s-a schimbat la 48 ore iniţial, ulterior la 3-4 zile. Când cultura primară a
ajuns aproape de confluenţă (90%), în aproximativ 2 săptămâni, celulele au fost recuperate prin
digestie cu o soluţie de 0.25% tripsină în 1 mM EDTA şi cultivate din nou la o densitate de
5.000-10.000 celule pe cm2.

Fig. 9. Metoda practicată pentru recoltarea


măduvei hematogene din oasele de şobolan. F4

  146 
 
STUDIUL EXPERIMENTAL      
  

Fig. 10. Manopera extracţiei şi izolării MSC din oasele lungi de şoarece (procedeu identic cu cel pentru oasele de şobolan). F4
A, B. Îndepărtarea ţesutului muscular prin răzuire. C. Aspectul oaselor după îndepărtarea stratului muscular. D. Îndepărtarea epifizelor. E. Spălarea sub jet a
cavităţii medulare cu o soluţie tampon fosfat salin cu heparină 10 UI/ml. F, G, H. Centrifugarea, spălarea şi resuspendarea MSC în mediul de cultură.
              Materiale şi metode 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 

147 
I, J. Aspectul culturii primare, plasate în incubator.
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                        Materiale şi metode 

S-au făcut diverse încercări, privind compoziţia mediului de cultură, pentru a genera o
populaţie mai omogenă de MSC. Astfel, culturile au fost suplimentate cu diverşi factori de
creştere adăugaţi separat sau în combinaţie precum: bFGF (basic fibroblast growth factor), EGF
(epidermal growth factor), Tpo, Flt-3, IL-3, SCF (stem cell factor). S-a demonstrat astfel că o
combinaţie între bFGF şi EGF susţine menţinerea capacităţii de diferenţiere multiplă a MSC
împiedicând diferenţierea spre liniile celulare hematopoietice, spre osteoblaste sau adipocite.
Se remarcă în primele zile aspectul polimorf al culturilor iniţiate (Fig. 11), precum şi
formarea unor focare de hematopoieză, chiar şi în absenţa citokinelor exogene, cu aspectul unor
insule de celule sferice, care se maturează şi se desprind de substrat (Fig. 12). Acest lucru se
datorează probabil citokinelor hematopoietice adăugate exogen.

Fig. 11. Cultura primară din măduva osoasă de şobolan. F4


In primele 7 zile după iniţiere cultura are un aspect polimorf conţinând celule endoteliale, macrofage,
adipocite, fibroblaste stromale; mărire X40.

Fig. 12. Focare de hematopoieză formate în culturile de MSC de şobolan. F4


Se observă aspectul unor insule de celule sferice, care se maturează şi se desprind de substrat. A, B
- mărire X20; C, D - mărire X10.  

  148 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                        Materiale şi metode 

Suplimentarea culturilor primare cu o combinaţie de factori de creştere: EGF şi bFGF


conduce la omogenizarea culturii care dobândeşte un aspect fibroblastoid.
Astfel, după realizarea a două pasaje într-un mediu selectiv suplimentat cu ser fetal bovin 10%,
bFGF 10ng/ml (Gibco), EGF 10 ng/ml (Sigma) celulele multiplicate în cultură au devenit
omogene morfologic şi fenotipic, necontaminate cu celule endoteliale, macrofage sau adipocite,
culturile obţinute având aspect fibroblastoid (Fig. 13, Fig. 14).
Tot pentru obţinerea unor culturi mai omogene se poate utiliza procedeul de selecţie
negativă şi separare în gradient de densitate. În acest sens a fost utilizat kit-ul RosseteSep.
Suspensia celulară rezultată după selecţia negativă a fost diluată 1:4 cu HBSS şi centrifugată în
gradient de densitate pe Biocoll (Biochrom, Germania). Fracţia de densitate joasă a fost
colectată, spălată cu HBSS/PBS şi cultivată în Alpha MEM cu 20% ser fetal (Sigma), 200 UI/ml
penicilină, 200 µg/ml streptomicină, suplimentat cu bFGF 10ng/ml (Gibco).
Mediul a fost schimbat iniţial după 24 de ore şi apoi de două ori pe săptămână. Când
celulele au atins o confluenţă de 80%, au fost desprinse folosind o soluţie de 0.25% tripsină cu
0.2% EDTA. Celulele au fost cultivate timp de trei pasaje, MSC fiind selectate prin aderenţă.

Fig. 13. Cultura primară din măduva osoasă de şobolan - pasaje succesive. F4
Se remarcă uniformizarea treptată a morfologiei celulare care devine fibroblastoidă. A. Pasajul 0;
zece zile de cultură; mărire X20. B. Pasajul 1; 14 zile de cultură; mărire X20. C. Pasajul 2; 21 zile de
cultură; mărire X20. D. Pasajul 2; 30 zile de cultură; mărire X40.

  149 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                        Materiale şi metode 

Fig. 14. Cultură de MSC provenite de la şobolan, pasajul 2. F4


Se remarcă aspectul fibroblastic şi uniform al celulelor; mărire X200; contrast de fază.

Punerea în evidenţă a diferenţierii spontane a MSC

O serie de studii au arătat că menţinerea îndelungată a MSC în cultură conduce la


diferenţierea şi pierderea lor. În acelaşi timp diferenţierea osteogenică, adipogenică şi
condroblastică constituie un test ce confirmă calitatea de MSC a celulelor stem utilizate. De
aceea, experimental, au fost menţinute în cultură MSC la pasaje mari, pentru a testa coloraţiile
specific diferenţierii (Fig. 15).

Diferenţierea osteogenică. Pentru diferenţierea osteogenică s-a utilizat coloraţia cu 1%


roşu alizarin S (preparat în 2% etanol) pentru matrixul mineralizat. Mediul a fost îndepărtat, iar
cultura a fost spălată de 2 ori cu PBS la 37°C, fixată în formaldehida 10% pentru 10 minute,
spălată cu apă distilată şi incubată cu roşu alizarin pentru 5 minute. Ulterior, cultura a fost
spălată de cel puţin 5 ori pentru a îndepărta excesul de colorant. Roşu alizarin S, un derivat de
antrachinonǎ, este utilizat pentru identificarea calciului în celule şi ţesuturi. Reacţia nu este strict
specifică pentru calciu, deoarece magneziul, manganul, bariul, stronţiul şi fierul pot interfera;
aceste elemente nu se produc în condiţii de cultură în concentraţii suficiente pentru a interfera cu
coloraţia. Calciul formează complexe alizarin-calciu într-un proces de chelare şi produsul
rezultat este refringent. Ca martor pozitiv s-au utilizat MSC la care s-a indus osteogeneza: 104
MSC/ml au fost cultivate în placi Petri în prezenţa mediului de menţinere suplimentat cu 10 mM
dexametazona, 0,1 µM acid ascorbic-2 fosfat şi 10 mM a-glicerofosfat.

Diferenţierea adipogenicǎ. Pentru diferenţierea adipogenicǎ s-a utilizat coloraţia


albastru Sudan specifică pentru vacuolele adipocitelor. Soluţia stoc 0,3% Sudan s-a preparat în
izopropanol. Mediul a fost îndepărtat, iar cultura a fost spălată de 2 ori cu PBS la 37°C, fixată în

  150 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                        Materiale şi metode 

formaldehidă 10% pentru 30 minute, spălată cu apă distilată şi incubată cu albastru Sudan o oră
la temperatura camerei. Mecanismul colorării lipidelor este datorat proprietăţilor fizice ale
colorantului care este mult mai solubil în lipide decât în lichide. De aceea coloranţii din grupul
poliazo (seria oil red, seria roşu Sudan şi albastru sudan) pot fi substituiţi în metodă. Pentru
inducerea adipogenezei (controlul coloraţie), MSC au fost însămânţate la o concentraţie de 104
MSC/ml şi menţinute în prezenţa a 0.1 µM dexametazonă, 50 µM indometacin şi 5 µg/ml
insulină. Mediul a fost schimbat de 3 ori pe săptămână. La pasaje mari, s-au observat rare celule
diferenţiate.

Fig. 15. Punerea in evidenţă a diferenţierii MSC. F4


A. MSC pasaj 9; coloraţie alizarin; mărire X100. B. MSC pasaj 11; coloraţie albastru sudan; mărire
X200.

Caracterizarea MSC prin citometrie în flux

Identificarea marker-ilor de suprafaţă a MSC cultivate a fost realizată cu un analizor


Epics XL FACS (Beckman Coulter Inc, CA, USA), folosind anticorpi monoclonali marcaţi cu
fluorescein isotiocianat (FITC) specifici pentru CD105, CD90, CD34, CD38, CD3 şi anticorpi
monoclonali marcaţi cu ficoeritrina (PE) specifici pentru CD45 şi CD14 (BD Pharmingen, San
Diego, CA, USA). Pentru aprecierea legării nespecifice s-a folosit un control izotip specific.
Celulele au fost colectate, spălate de două ori în TFS cu 0,1% albumină serică bovină, 0,1%
azidă de sodiu la at 4°C şi fixate în 1 % paraformaldehidă. Zece mii de evenimente au fost
achiziţionate. Analiza a fost realizată cu programul Win MDI 2.8.

Viabilitatea şi proliferarea MSC în matricea COL-AG

Biocompatibilitatea matricei a fost evaluată prin monitorizarea viabilităţii celulare


utilizând testul cu albastru trypan, iar evaluarea capacităţii de proliferare s-a realizat cu testul
Cell Titer 96 (Promega Corporation, Madison, WI, USA), după însămânţarea cu acelaşi număr
de celule (5x104) a două medii de cultură: 2D, respective 3D (patch-ul elaborat).
Pentru numărarea celulelor, matricea 3D a fost complet degradată utilizând colagenază I
0.05% timp de 30 de minute. Dispersia celulară în matrice a fost evaluată prin tehnici de
microscopie de fluorescenţă, după ce matricele 3D însămânţate cu MSC au fost colorate cu
iodură de propidium (0.01 mg/ml la 37°C după tratarea cu etanol).

  151 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                        Materiale şi metode 

Asamblarea patch-ului

Pentru constituirea grefonului s-au utilizat culturi de MSC la pasaj mic pentru a beneficia
de avantajele statusului de celulă nediferenţiată capabilă de a desfăşura diviziuni de self-renewal
şi pentru a evita apariţia modificărilor cromozomiale întâlnite uneori la pasajele mari, precum şi
iniţierea diferenţierii spontane a acestor tipuri de culturi cu formarea de osteoblaşti sau adipocite.
Dat fiind potenţialul imunogen înalt al celulelor endoteliale din structura vaselor (Teebken
2000), a fost necesară o etapă de îndepărtare a acestor celule realizată prin tratarea fragmentelor
cu o soluţie de tripsină 0,1%, 20 minute la 370C cu agitare continuă, care însă nu distruge
arhitectura matricei extracelulare formată din proteine structurale, proteoglicani, colagen şi fibre
de elastină (Teebken 2000) (Fig. 16).
5x104 celule au fost însămânţate într-o matrice 3D de COL-AG cu un diametru de 5-7 mm,
aşezată pe un fragment arterial corespunzător, decelularizat (Fig. 17, Fig. 18). După preparare,
patch-urile au fost menţinute în mediul de cultură celular, timp de câteva ore, pentru a permite
dispersia MSC în întreaga structură.
Pentru testarea biodegradabilităţii, patch-urile 3D au fost supuse digestiei in vitro cu
colagenază I 0.05%, arătând o degradare completă după 30 de minute.
Înainte de transplant, patch-urile au fost testate bacteriologic prin metoda MCPC
(Microbial Community Profiling and Characterization). Tehnica MCPC se bazează pe un
procedeu cunoscut din biologia moleculară, “Restricţia terminală a polimorfismului lungimii
fragmentului”, oferind un instantaneu asupra comunităţilor microbiene prezente într-o probă,
printr-o singură determinare.

Fig. 16. Aspectul


fragmentului aortic
decelularizat.
(Teebken 2000)
În acest exemplu se pot
observa integritatea
structurală a reţelei matriceale
extracelulare şi celulele
endoteliale însămânţate în
matricea arterială. Pentru
patch-ul realizat, matricea
arterială nu a fost
însămânţată cu celule.

Fig. 17. Schema realizării grefoanelor. F4


burete COL-AG 

fragment arteră
decelularizare
injectare MSC

  152 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                        Materiale şi metode 

Fig. 18. Aspectul patch-ului, format din matricea de COL-AG însămânţată cu MSC,
montată pe fragmentul arterial. F3, F4
A. Aspect macroscopic. B. Aspect microscopic; HE, X40: * - matricea colagenică, # - fragmentul
arterial.

Modelul experimental animal

Animalele

Pentru acest studiu au fost utilizaţi un număr de 76 şobolani Wistar (INCDMI


Cantacuzino), masculi şi femele (38:38) în vârstă de 18 săptămâni, cu o greutate de 230-400
grame, împărţiţi în două loturi: lotul control şi cel experimental, fiecare cu câte 38 de subiecţi
şi sex ratio 1:1.
Subiecţii au fost aclimatizaţi condiţiilor uzuale de laborator minimum 7 zile înainte de
utilizare, în cuşti cu ritm circadian al luminii, 23ºC, în tot acest timp fiind hrăniţi ad libitum cu
furaje standardizate (NCG, INCDMI Cantacuzino) pentru rozătoare de laborator.
Timp de 24-36 ore înainte şi după intervenţia chirurgicală animalele au primit numai apă
ad libitum, alimentaţia orală fiind reintrodusă după acest moment.
Toate procedurile au fost derulate în conformitate cu “Guide for the Care and Use of
Laboratory Animals” (National Research Council, Washington, National Academy Press, 1996).

Anestezia

Inducţia anestezică a fost realizată cu un amestec gazos de halotan sau sevofluran 4% şi


oxygen 4L/minut într-o incintă etanşă pentru rozătoare, fiind menţinută cu un cocktail
intramuscular de ketamină şi xylazina. (vezi Anexă V)
Pentru intervenţiile ulterioare de scurtă durată (toaletări de plagă, injectări etc.) s-a folosit
anestezie gazoasă cu halotan sau sevoflurane.

  153 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                        Materiale şi metode 

Pregătirea preoperatorie

Subiecţii anesteziaţi au fost tunşi şi raşi pe toată suprafaţa abdomenului. Tegumentul


expus a fost aseptizat cu Betadine® (Egis Pharmaceuticals PLC.) iar câmpurile chirurgicale sunt
aşezate astfel încât să expună cât mai mult din suprafaţa peretelui abdominal ventral. După
aşezarea câmpurilor, tegumentul este aseptizat din nou, înainte de realizarea inciziei.
Pe toată durata intervenţie subiectul a fost monitorizat EKG (electrozi plasaţi la nivelul
extremitaţilor membrelor), SpO2 termic pentru prevenirea hipotermiei (frecvent întâlnită
intraoperator la şobolani) (Fig. 19), homeotermia, intra şi postoperator, fiind menţinută cu
ajutorul unei perne electrice încălzită la 37ºC, plasată sub subiect.

Fig. 19. Monitorizarea


intraoperatorie. F1
Linia superioară: plasarea electrozilor
pentru monitorizarea EKG (stânga);
aspectul tipic al unei derivaţii EKG de
şobolan în repaus (dreapta) (Mayo
1999). Linia inferioară: parametrii
înregistraţi intraoperator (EKG, AV:
246 bpm; SpO2: 97%; temperatură
intrarectală: 32.9ºC). Pentru SpO2
senzorul a fost plasat la nivelul cozii.

Protocolul chirurgical

Accesul în cavitatea abdominală s-a făcut printr-o laparotomie xifo-pubiana de 3-4 cm


lungime. După depărtarea marginilor inciziei, stomacul sau jejunul au fost identificate şi izolate
cu comprese (Fig. 20).
O porţiune cu diametrul de 5-7 mm a fost îndepărtată de pe faţa anterioară a stomacului
(zona antrală) sau intestinului subţire (faţa antimezenterică) cu ajutorul microfoarfecelor (Fig.
21, Fig. 22). După aseptizarea tranşei de secţiune defectul rezultat a fost acoperit utilizând patch-
ul 3D îmbogăţit cu MSC. Acesta a fost suturat la marginile defectului peretelui digestiv prin
tehnici de microchirurgie utilizând o sutură cu fire separate de Vicryl 8-0 (polyglactin 910)
(Ethicon, Cincinnati, OH, USA). Pentru o apreciere corectă a defectului, s-a utilizat o măsurare
planimetrică a acestuia cu ajutorul software-ului PictZar demo version 5.05.2 build 3 (Fig. 23,
Fig. 24).
Înainte de închiderea cavităţii abdominale, cavitatea peritoneală a fost irigată cu 10-30
ml soluţie salină. Laparorafia a fost realizată prin sutura în două straturi a peretelui abdominal.
Peretele muscular a fost închis cu o sutură continuă tip Ford cu Vicryl (polyglactin 910) 4-0, iar
pielea a fost suturată cu fire separate de mătase 4-0 sau cu stapler-ul (Fig. 25).

  154 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                        Materiale şi metode 

Postoperator şobolanii şi-au revenit după cca 3-4 ore, şi au fost găzduiţi în cuşti
individuale şi le-a fost permis numai consumul de apă ad libitum imediat. După 24-36 de ore
postoperator mâncarea standardizată a fost reintrodusă.
Nu au fost administrate postoperator substanţe antiacide sau gastroprotectoare. Animalele
au fost verificate zilnic pentru identificarea semnelor de suferinţă sau a complicaţiilor. La nevoie
s-a administrat intramuscular metamizol sodic. De asemenea, zilnic au fost monitorizate
consumul de mâncare, temperatura corporală şi evoluţia greutăţii fiecărui subiect.
Patch-urile 3D cu MSC au fost montate pe defecte iatrogenice la nivelul stomacului (21
subiecti) şi jejunului (17 subiecti) (Tab. 1, Tab. 2). Lotul control a beneficiat de aceeaşi
randomizare: 21 de patch-uri control pe stomac şi 17 la nivelul jejunului (Tab. 3, Tab. 4).

Fig. 20. Etapele premergatoare realizării defectului chirurgical digestiv. F1


A. După anesteziere, părul este ras la nivelul abdomenului. B,C. Suprafaţa este aseptizată cu
iodpovidone şi delimitată cu câmpuri sterile adezive. D. Înainte de incizarea tegumentului, acesta
este aseptizat încă o dată. E. Incizarea tegumentului şi identificarea liniei albe. F. Secţionarea
peretelui muscular pe linia albă. G. Depărtarea peretelui abdominal şi expunerea organelor. * - polul
inferior al apendicelui xifoid; # - polul superior al vezicii urinare.

  155 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                        Materiale şi metode 

Fig. 21. Realizarea defectului gastric şi sutura patch-ului. F1 

Fig. 22. Realizarea defectului intestinal şi sutura


patch-ului. F1
* - zona de secţiune delimitată prin electocauterizare, pentru
diminuarea sângerării.

  156 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                        Materiale şi metode 

Fig. 23. Evaluarea planimetrică a defectului şi patch-ului gastric. F1

  157 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                        Materiale şi metode 

Fig. 24. Evaluarea planimetrică a defectului şi patch-ului intestinal. F1

  158 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                        Materiale şi metode 

Fig. 25. Laparorafia. F1

Tab. 1. Numărul de patch-uri transplantate şi compoziţia acestora – lotul experimental.


Localizarea patch- Numărul total de Originea ţesutului Număr Originea Număr
ului cazuri arterial cazuri MSC cazuri
Stomac 21 porcină 13 sobolan 13

umană 8 umană 4
sobolan 4

Jejun 17 porcină 9 sobolan 9

umană 8 umană 5
şobolan 3

Tab. 2. Randomizarea lotului experimental.


Localizarea patch Stomac Jejun
Nr. subiecţi 21 17
Distribuţie pe sexe 10 ♀ 11 ♂ 9♀ 8♂
Origine ţesut arterial

Porcină

Origine

şobolan 6 7 6 3
MSC

şobolan 2 2 1 2
Origine
Umană

MSC

umană 2 2 2 3

Tab. 3. Numărul de patch-uri transplantate şi compoziţia acestora – lotul control


Localizarea patch-ului Numărul total de cazuri Originea ţesutului arterial Număr cazuri
Stomac 21 porcină 13

umană 8

Jejun 17 porcină 9

umană 8

  159 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                        Materiale şi metode 

Tab. 4. Randomizarea lotului control.


Localizarea patch Stomac Jejun
Nr. subiecţi 21 17
Distribuţie pe sexe 10 ♀ 11 ♂ 9♀ 8♂
Porcină 7 6 6 3
Origine

arterial
ţesut

Umană 3 5 3 5

Evaluarea macroscopică a vindecării suturii digestive

Subiecţii au fost eutanasiaţi la intervale de timp prestabilite (3, 10, 27, 48, 80, 120, 180,
350 zile) pentru studiul procesului de regenerare, folosind o supradoză de pentobarbital
intravenos urmată de clorură de potasiu.
Animalele cu aspect clinic anormal sau septic au fost eutanasiate de necesitate.
După deschiderea abdomenului, liniile de sutură au fost identificate, inspectate, iar piesa
de studiu a fost rezecată la 2 cm proximal şi distal faţă de linia de sutură.
Specimenele au fost spălate cu soluţie salină, scheletizate de aderenţele tisulare şi
secţionate longitudinal pentru a permite inspectarea lumenului.

Histologie şi imunofluorescenţă

Piesele excizate de stomac şi jejun au fost imersate în soluţie 10% formol neutru sau
soluţie salină 0.9% pentru studiile ulterioare de microscopie şi respectiv imunofluorescenţă.
Momentele sacrificărilor au favorizat oportunitatea de a examina răspunsul celular acut şi
cronic pentru implanturile xenogene, neoangiogeneza, depozitarea neomatricei, colonizarea
celulară, proliferarea, diferenţierea şi degradarea matricei colagenice exogene.
Pentru examenul histopatologic, probele au fost evaluate în orb pe secţiuni de 4 µm
colorate cu hematoxilin-eozină.
Specimenele provenite de la animale la care s-au folosit patch-uri cu MSC umane au fost
analizate prin imunofluorescenţă. Acestea au fost identificate pe fragmentele de tub digestiv
recoltate prin marcare cu anticorpi anti-umanii HLA-FITC (Sigma, St. Louis, USA).
Fragmentele de ţesut au fost secţionate la criotom după îngheţare. Secţiunile îngheţate cu
o grosime de 6 µ au fost aşezate pe lame Fisher Superfrost şi fixate cu acetonă rece, apoi spălate
şi echilibrate timp de 5 minute cu fosfat tamponat salin (PBS), ph 7.2 (Sigma, St. Louis, USA).
Secţiunile au fost incubate cu 1.5% albumină serică bovină (BSA) (Sigma), 0.05%
TritonX-100 (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany) cu PBS pentru
permeabilizarea şi blocarea locusurilor nespecifice (30 de minute, la temperatura camerei, în
cameră umidificată)
După decantarea soluţiei de blocare şi clătire cu PBS-BSA 1.5%, secţiunile au fost
incubate cu anticorpul conjugat cu FITC diluat în PBS-BSA 1.5%, timp de 2 ore la temperatura
camerei, în cameră umidificată. După spălare, 3x5 minute cu PBS, secţiunile au fost incubate cu
coloraţia Hoechst (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California), 15 minute, la temperatura
camerei, în cameră umidificată, pentru marcarea nucleilor.
În final, secţiunile au fost spălate 3x5 minute cu PBS, contrastate cu hematoxilină şi
montate în mediu de montare pentru fluorescenţă (DakoCytomation Inc., Carpinteria, CA, USA),
apoi examinate la microscopul cu fluorescenţă.

  160 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                        Materiale şi metode 

Microscopia electronică de transmisie (TEM)

Pentru microscopia electronică, fragmentele au fost fixate cu glutaraldehidă 2%, în 0.1%


tampon cacodilat, tăiate în bucăţi de circa 2 mm cubi şi postfixate cu OsO4 1% în tampon timp de
două ore.
Au fost deshidratate în băi successive de etanol şi aşezate în Epon 812. Secţiuni ultrafine
au fost “colorate” cu uranil acetat şi citrat de plumb şi examinate la microscopul electronic de
transmisie (Philips EM 208S).

Analiza statistică

A fost realizată pentru testele de proliferare celulară cu testul paired t test, iar rezultatele
clinice au fost evaluate cu ajutorul testutul Fisher's exact test.

  161 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                    Rezultate 

REZULTATE

Burete

Rezultatele determinărilor analitice şi biochimice pentru caracterizarea colagenului extras


din tendon bovin sunt prezentate în tabelul de mai jos (Tab. 5).

Tab. 5. Rezultatele determinărilor analitice pentru colagenul extras din tendon bovin.
Analiza Colagen din tendon bovin
Procedeu enzimatic
Azot total 14,14 g/100g subst. uscată
Proteine totale 84,36 g/100g subst. uscată
Hidroxiprolină 8,98 g/100g subst. uscată
Colagen 81,00 g/100g subst. uscată
Greutatea moleculară medie 301.000 Da
după Craciunescu 2007

Metoda tratamentului enzimatic este eficientă obţinând un colagen cu o cantitate mare de


Hyp şi cu o greutate moleculară apropiată de cea a tropocolagenului (300.000 Da). Aceasta
demonstrează că prin procedeul de extracţie enzimatică folosit de noi, structura nativă a triplului
helix nu a fost afectată.
Morfologia colagenului sub formă de fibre evaluată electronomicroscopic a demonstrat
că, în timpul asamblării fibrilei, interacţiile intermoleculare fac ca acestea să se asocieze într-un
aranjament ordonat, la o distanţă constantă de aprox. 67 nm (Fig. 26).
Datele obţinute demonstrează reconstituirea colagenului tip I extras de noi din tendon
bovin sub formă de fibrile asemănătoare din punct de vedere morfologic cu cele native;
periodicitatea fibrilelor de colagen reconstituit fiind similară cu cea a colagenului nativ
evidenţiind puritatea acestuia (Moldovan 2001).

Fig. 26. Electronomicrografia fibrilelor de COL-AG formate in vitro. F2

Porozitatea medie a fost de aproximativ 99,5 %. Rezultatele arătând că valorile


densităţilor au variat între 0,0272 şi 0,0428.
În urma examinării prin ESEM a morfologiei bureţilor de COL-AG, s-a observat că
aceştia prezintă o structură tridimensională, poroasă, cu fibre interconectate prezentând o
arhitectură tip fagure, cu pori de aproximativ 10-200 µm în diametru (Fig. 27).

  162 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                    Rezultate 

Fig. 27. Imagine ESEM a


buretelui de COL-AG. F2

Studiind influenţa compoziţiei bureţilor asupra gradului lor de hidratare, s-a observat că
valorile calculate în cazul bureţilor compozit COL-AG sunt mai scăzute decât ale buretelui de
colagen simplu, dar gradul de hidratare este de 70 de ori mai mare comparativ cu greutatea
iniţială, ceea ce reprezintă o valoare acceptabilă pentru un material destinat ingineriei tisulare
(Craciunescu 2004).
Prin măsurarea cantităţii de colagen dizolvat în soluţie se poate stabili gradul de reticulare
al buretelui poros. Rezultatele au indicat că probele iradiate UV au fost mai puţin degradate de
colagenază decât probele netratate, prezentând un grad de reticulare mai mare.

Biocompatibilitatea in vitro a matricei

Rezultatele au indicat o viabilitate celulară ridicată (peste 97 %) atât la timpul de


cultivare de 48 h cât şi la 72 h (Alexandru 2007).
Observaţiile de microscopie optică au arătat că celulele infiltrate în matricile poroase
după 72 de ore de cultivare prezintă o morfologie normală (Fig. 28).

Fig. 28. Imagine de microscopie optică


a celulelor infiltrate în structura
matricei poroase de COL-AG după 72
 
ore de cultivare. F2

  163 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                    Rezultate 

Celule

Caracterizarea MSC prin citometrie în flux

Rezultatele au demonstrat că celulele exprimă CD90, CD105 dar sunt negative pentru
CD34, CD38, CD45, CD3 şi CD14 (Fig. 29).

Fig. 29. Fenotip reprezentativ pentru MSC nediferenţiate. (Sîrbu-Boeţi 2009)


CD105+ CD90+ CD34- CD45- CD3- CD14-. Aria gri reprezintă controlul izotip. Linia roşie reprezintă
expresia marker-ului corespunzăor investigată cu anticorpi monoclonali.

Fenotipul celular (CD105+CD90+CD34-CD45-CD14-CD3-) şi diferenţierea pozitivă pe linie


osteo şi adipogenică, confirmă astfel că celulele izolate şi cultivate sunt celule stem
mezenchimale, fiind în concordanţă cu datele cunoscute din literatură. Acestea nu prezintă un
marker specific, însă exprimă antigene CD90, CD105 fiind în acelaşi timp lipsite de antigenele
hematopoietice tipice CD45, CD34, CD38, CD14, CD3.

Viabilitatea şi proliferarea MSC în matricea COL-AG

Curbele de creştere realizate pornind de la un număr similar de celule cultivate atât în


sisteme 2D cât şi 3D, au demonstrat superioritatea celor din urmă care permit o dublare a
numărului de celule pe aceeaşi suprafaţă de însămânţare într-o perioadă similară de timp (Fig.
30) (p<0.01). Testele de viabilitate şi proliferare au confirmat că matricea colagenică nu a fost
toxică pentru celule, constituind un mediu optim pentru creşterea CSM, aşa cum arată curbele de
proliferare.
Imaginile de microscopie de fluorescenţă au dovedit că dimensiunea porilor este
adecvată, astfel încât celulele pot migra la distanţă faţă de locul de inserţie, asigurându-se astfel
treptat o populare uniformă a matricei însămânţate (Fig. 31).
În concluzie, testele de viabilitate, proliferare şi microscopie au demonstrat că: (1)
produsul biopolimeric nu este toxic pentru celule fapt dovedit de testele de viabilitate utilizând

  164 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                    Rezultate 

albastru tripan; (2) dimensiunea porilor de 50-170 μm permite multiplicarea şi migrarea celulelor
la distanţă faţă de locul de inserţie; (3) produsul este biodegradabil, testul realizat in vitro
indicând o degradare completă în 30 minute sub acţiunea colagenazei I, fără a afecta celulele
rezidente în matrice.

Fig. 30. Analiza


proliferării şi viabilităţii
MSC în sistemul 3D al
matricei. (Sîrbu-Boeţi 2009)
Celulele cultivate în sistem
3D îşi păstrează viabilitatea şi
capacitatea de proli-ferare,
care sunt stimulate de
prezenţa mediului 3D.  

Fig. 31. Imagini de microscopie de fluorescenţă ce arată localizarea MSC în interiorul


matricei colagenice. (Sîrbu-Boeţi 2009)
Imagini ale fibrelor de colagen în reţea (verde) şi ale MSC colorate cu iodură de propidium
(portocaliu) cultivate în matricea 3D; mărire X200, respectiv X400.

Sterilitatea patch-ului

Contaminarea medie stabilită prin MCPC a fost de sub 50 de bacterii per probă,
acceptabilă pentru realizarea activităţilor experimentale. Nicio tulpină din cele identificate nu
este patogenă. Pentru aceleaşi probe, examenul bacteriologic clasic a stabilit că eşantioanele sunt
sterile (Fig. 32).

  165 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                    Rezultate 

  166 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                    Rezultate 

Accession Organism Descr Length_Blue Length_Yellow

UAC575519 uncultured_actinobacterium Uncultured_actinobacterium_partial_16S_rRNA_gene,_clone_SV1-10 80 228

UAC575497 uncultured_actinobacterium Uncultured_actinobacterium_partial_16S_rRNA_gene,_clone_R1 80 228

UAC575498 uncultured_actinobacterium Uncultured_actinobacterium_partial_16S_rRNA_gene,_clone_R2 80 228

UAC575503 uncultured_actinobacterium Uncultured_actinobacterium_partial_16S_rRNA_gene,_clone_R7 80 228

UAC575511 uncultured_actinobacterium Uncultured_actinobacterium_partial_16S_rRNA_gene,_clone_S10 80 228

UAC575515 uncultured_actinobacterium Uncultured_actinobacterium_partial_16S_rRNA_gene,_clone_SV1-1 80 228

UAC575517 uncultured_actinobacterium Uncultured_actinobacterium_partial_16S_rRNA_gene,_clone_SV1-7 80 228

UAC575540 uncultured_actinobacterium Uncultured_actinobacterium_partial_16S_rRNA_gene,_clone_W1 80 228

UAC575520 uncultured_actinobacterium Uncultured_actinobacterium_partial_16S_rRNA_gene,_clone_SV1-11 80 228

UAC575521 uncultured_actinobacterium Uncultured_actinobacterium_partial_16S_rRNA_gene,_clone_SV1-12 80 228

UAC575522 uncultured_actinobacterium Uncultured_actinobacterium_partial_16S_rRNA_gene,_clone_SV1-16 80 228

UAC575533 uncultured_actinobacterium Uncultured_actinobacterium_partial_16S_rRNA_gene,_clone_N6 80 228

UAC575538 uncultured_actinobacterium Uncultured_actinobacterium_partial_16S_rRNA_gene,_clone_D2 80 228

UAC575539 uncultured_actinobacterium Uncultured_actinobacterium_partial_16S_rRNA_gene,_clone_D3 80 228

UAC575516 uncultured_actinobacterium Uncultured_actinobacterium_partial_16S_rRNA_gene,_clone_SV1-3 80 228

AY211075 uncultured_actinobacterium Uncultured_actinobacterium_clone_VC20_16S_ribosomal_RNA_gene,_partialsequ 81 228


ence.

Fig. 32. Exemplu de rezultat obţinut în urma testului MCPC. F3


În imaginea de pe verso (pagina 176) fiecare vârf reprezintă o specie bacteriană; în tabel sunt listate
speciile bacteriene şi fungice identificate.

Evoluţia clinică a şobolanilor transplantaţi

Rezultatele nu au depins de tipul defectului digestiv sau de provenienţa fragmentelor


aortice sau a MSC, aşa cum a demonstrat testul Fischer’s, p<0,5. Ambele loturi şi-au reluat
toleranţa digestivă şi tranzitul intestinal după cca 50 de ore postoperator. Nu au fost identificate
cazuri de malnutriţie ca urmare a utilizării patch-ului cu/fără MSC, la subiecţii transplantaţi.
Pentru lotul experimental, mortalitatea generală a fost de 15.78% (6 din 38 de cazuri).
Cauza deceselor a fost peritonita difuză (5 cazuri; survenite la 24-48 de ore postoperator) şi
abcesul intraabdominal (1 caz; decedat la 15 zile postoperator). Patru cazuri de peritonită s-au
datorat efracţiei conţinutului gastic datorită disjuncţiei suturii; pentru celelalte două cazuri nu au
fost identificate cauzele. La masculi au fost înregistrate 3 cazuri de peritonită, iar la femele 2
cazuri de peritonită şi un caz de abces intraabdominal (Staphylococcus aureus). Pentru celelalte
32 de cazuri nu au existat complicaţii. Provenienţa patch-urilor 3D cu MSC şi evoluţia clinică a
lotului experimental sunt prezentate în Tab. 6.
În cazul lotului control, au fost înregistrate 12 decese (mortalitate 31.57%) cauzate de
peritonită apărută în condiţii similare lotului experimental şi de o formaţiune pseudotumorală
(Tab. 7). În funcţie de sex, cele 12 cazuri au fost distribuite în proporţii egale.
Au fost înregistrate şase cazuri (câte trei în fiecare lot) cu complicaţii postoperatorii,
manifestate prin dehiscenţe ale suturii tegumentare (Fig. 33), dar care nu au influenţat analiza
subiecţilor.

  167 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                    Rezultate 

În ceea ce priveşte distribuiţia deceselor în cele două loturi, acestea au apărut


preponderent (83%) la primele trei intervenţii, ceea ce corespunde curbei de învăţare a tehnicii
chirurgicale (Fig. 33). Odată ce tehnica a fost deprinsă corect, numărul complicaţiilor şi
deceselor s-a diminuat considerabil.

Tab. 6. Decesele înregistrate şi cauza acestora, în funcţie de localizarea patch-urilor transplantate şi


compoziţia acestora – lotul experimental
Localizarea Numărul Originea Număr Originea Număr Decese Cauza deceselor
patch-ului total de ţesutului cazuri MSC cazuri
cazuri arterial
Stomac 21 porcină 13 şobolan 13 2 peritonită

umană 8 umană 4 1 peritonită


şobolan 4

Jejun 17 porcină 9 şobolan 9 1 peritonită

umană 8 umană 5 1 peritonită


porcină 3 1 abces intra-
abdominal

Tab. 7. Decesele înregistrate şi cauza acestora, în funcţie de localizarea patch-urilor transplantate şi


compoziţia acestora – lotul control
Localizarea Numărul Originea Număr Decese Cauza deceselor
patch-ului total de ţesutului cazuri
cazuri arterial
Stomac 21 porcină 13 2 peritonită
1 pseudotumoră gastro-hepatică

umană 8 3 peritonită

Jejun 17 porcină 9 3 peritonită

umană 8 3 peritonită

Fig. 33. Curba de


învăţare pentru
intervenţia
chirurgicală de plasare
a patch-ului. F1

Câte cinci subiecţi din fiecare subgrup al lotului experimental nu au fost sacrificaţi, ei
servind pentru studiul impactului patch-ului asupra duratei de viaţă medie a şobolanilor. S-a
observat că durata de viaţă a acestora nu a fost afectată, ei supravieţuind timp de 30-32 de luni
(Fig. 34) în condiţii de laborator, ceea ce coincide cu datele din literatură privind durata medie de

  168 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                    Rezultate 

viaţă a şobolanilor Wistar (2,5-3 ani). Decesul acestora a survenit în condiţii naturale, necropsiile
efectuate nu au evidenţiat nicio cauză legată de utilizarea acestor patch-uri.

Fig. 34. Analiza Kaplan-Meier a


supravieţuirii subiecţilor martor
din cele două loturi. F1

Regenerarea peretelui digestiv

Lotul experimental

În cazul tuturor animalelor transplantate, suprafaţa extraluminală a patch-urilor a fost


parţial sau total acoperită de organele adiacente sau aderenţe, însă fără a determina manifestări
clinice de tip ocluziv.
În cazul patch-urilor pe stomac, adeziunile dezvoltate au fost între stomac şi ficat sau
marele oment, iar pentru intestinul subţire, au fost întâlnite adeziuni între patch şi alte segmente
de intestin sau epiploon. Adeziunile cu organele înconjurătoare au facilitat identificarea zonei de
aplicare a patch-ului mai uşor (Fig. 35).

Fig. 35. Aderenţe ce marchează zona de


aplicare a patch-ului. F1
A. Stomac, 45 zile postoperator - aderenţă
hepato-gastrică. B. Stomac, 15 zile
postoperator - perimetrul marcat
suprapozabil ariei de proiecţie a patch-ului.
C. Jejun, 300 zile postoperator.

  169 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                    Rezultate 

Macroscopic, pentru acest lot, zona de regenerare a mucoasei stomacului sau a jejunului,
a putut fi identificată cu dificultate începând cu săptămână a 7 postoperator. Aceasta se traduce
printr-un aspect macroscopic similar al zonei regenerate şi al celei adiacente (Fig. 36, Fig. 37).
După această perioadă, singurul indiciu asupra suprafeţei peritoneale regenerate a fost
oferit de existenţa bridelor şi aderenţelor. Diferenţierea între peretele digestiv normal şi regenerat
s-a putut face numai prin inspecţia feţei intraluminale a peretelui digestiv regenerat. În două
cazuri a existat o creastă circulară de mucoasă şi submucoasă gastrică hipertrofică intraluminală.
În ceea ce priveşte modificările de calibru ale tubului digestiv, diametrul stomacului sau
intestinului regenerat nu a fost alterat proximal sau distal de zona de aplicare a patch-ului.

Fig. 36. Aspectul macroscopic al zonei regenerate la nivelul stomacului. F1


A. Stomac, faţa peritoneală, curbură mare, 1/3 medie. B. Stomac, intraluminal, fund gastric.
C. Stomac, intraluminal, zona antrală, faţa anterioară. D. Stomac, intraluminal, 1/3 medie,
zona de tranziţie a mucoasei.

Fig. 37. Aspectul macroscopic al zonei regenerate la nivelul jejunului. F1


A. Jejun, faţa peritoneală anti-mezenterică - macroscopic nu se poate face diferenţa între zona
regenerată (marcată de bridă) şi cea nativă adiacentă. B. Jejun, intraluminal - zona de regenerare
marcată de o identare a suprafeţei mucoasei.

  170 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                    Rezultate 

Prin examinare microscopică, la trei zile postoperator, celulele stem au fost observate la
nivelul patch-ului (Fig. 38A, 38B). Regenerarea peretelui digestiv a fost facilitată de colonizarea
patch-urilor 3D de celule native ale peretelui digestiv (Fig. 38 B), şi de către prezenţa ţesutului
de granulaţie, care în timp s-a modificat în paralel cu reconstrucţia peretelui digestiv.
Regenerarea totală, cu resorbţia completă a peretelui aortic, a tuturor celor patru straturi
(mucoasă, submucoasă, musculară şi seroasă) ale stomacului şi intestinului subţire a fost
observată la 48 de zile postoperator (Fig. 38C, Fig. 39B). Nu au existat diferenţe în regenerarea
stomacului şi a intestinului, ambele organe prezentând microscopic un perete cu o structură
histologică similară celui nativ.
Cu toate acestea, ca particularitate a peretelui digestiv regenerat s-a constatat prezenţa
unui epiteliu metaplazic keratinizat scuamos pluristratificat, a infiltratului inflamator precum şi
lipsa glandelor mucoase (Fig. 38C, Fig. 39B). Infiltratul inflamator a fost semnificativ după
utilizarea patch-urilor cu MSC umane. Aspectul ţesutului digestiv regenerat nu a fost influenţat
de originea vaselor aortice utilizate pentru construcţia patch-urilor. După această perioadă,
examenul microscopic cu coloraţie HE nu a evidenţiat alte modificări, aspectul secţiunilor la 80,
120, 180, şi 350 de zile fiind similar celui de la 48 de zile.

Fig. 38. Examenul HP al peretelui gastric


regenerat. (Sîrbu-Boeţi 2009)
A. Ziua 3: MSC (săgeţi) inclavate în buretele de
COL-AG; HE, mărire X200. B. Ziua 11:
joncţiunea dintre patch şi peretele gastric arată
colonizarea structurii aortice cu celule gazdă
(săgeţi); HE, mărire X100. C. Ziua 48:
regenerarea tuturor celor patru straturi ale
stomacului (mucoasa înlocuită de un epiteliu
scuamos keratinizat) şi zona de tranziţie (săgeţi)
a celor două tipuri de mucoase (normală şi
regenerată); HE, mărire X100. a - perete aortic;
b - buretele 3D de COL-AG îmbogăţit cu MSC.

Pentru a proba supravieţuirea celulelor stem şi rolul acestora în cadrul procesului de


regenerare, celulele umane au fost identificate în peretele digestiv regenerat al şobolanilor cu
sistem imunitar intact. Pentru acest motiv s-a decis utilizarea unui transplant xenogen de celule
umane la şobolan, identificarea acestora fiind mult mai uşoară decât în cazul unui transplant
alogen.

  171 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                    Rezultate 

Fig.39. Examenul HP al peretelui intestinal regenerat. (Sîrbu-Boeţi 2009)


A. Ziua 3: joncţiunea (săgeată dublă) dintre patch şi pertele jejunal; HE, mărire X100. B. Ziua 48:
regenerarea tuturor celor patru straturi ale jejunului; epiteliul (săgeata) este metaplazic (epiteliu
scuamos keratinizat); HE, mărire X100. a - perete aortic; b - buretele 3D de COL-AG îmbogăţit cu
MSC.

Identificarea celulelor de origine umană a fost realizată la 48 de zile prin


imunofluorescenţa cu anticorpi anti HLA-FITC (Fig. 40), demonstrând că pot supravieţui o
perioadă lungă de timp într-un mediu ostil (plaga digestivă aflată în contact cu sucurile
digestive).

Fig. 40. Identificarea prin imunofluorescenţă a celulelor umane (verde) în peretele


intestinal regenerat; 48 de zile postoperator. (Sîrbu-Boeţi 2009)
Imunofluorescenţă anti-human HLA-FITC; nuclei (albastru) contrastaţi cu Hoechst; mărire X600.

La trei zile postoperator celulele stem umane au fost identificate prin microscopie
electronică de transmisie la nivelul feţei luminale a patch-ului (Fig. 41, Fig. 42A). Aspectul
acestor celule este reprezentativ pentru celulele stem: celule cu nuclei mari şi citoplasma săracă.
La zece zile postoperator, o cantitate scăzută de celule rotund-ovalare a fost identificată către
fragmentul aortic (Fig. 42B), şi o cantitate crescută de celule pavimentos-like distribuite la polul
luminal al patch-ului (Fig. 42C). Numeroase conexiuni inter-celulare au fost observate. La 180
de zile postoperator, structura a fost înalt organizată cu prezenţa a numeroase vase de
neoformaţie şi reorganizarea fibrelor de colagen (Fig. 42D).

  172 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                    Rezultate 

Rezultatele microscopiei de transmisie sunt elocvente, susţinând prezenţa şi implicarea


celulelor stem în procesul de reconstrucţie digestivă. Observaţiile realizate pe preparatele
histologice din ziua zece, se corelează cu examenul histopatologic, care a identificat prezenţa
mucoasei metaplazice pavimentoase la nivelul ţesutului regenerat.

Fig. 41. Imagine TEM a unei celule stem mezenchimale infiltrată în structura matricei
poroase de COL-AG, implantată la nivelul intestinului subţire de şobolan, X7100. F2

  173 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                    Rezultate 

Fig. 42. Perete digestiv regenerat, la nivelul patch-ului 3D îmbogăţit cu MSC; TEM.
(Sîrbu-Boeţi 2009)
A. Ziua 3: grup de celule stem la polul luminal al patch-ului; X7100. B. Ziua 10: celule transplantate
(a) lângă fragmentul aortic (b); X2200. C. Ziua 10: grup de celue stem cu formă elongată şi
numeroase conexiuni intercelulare; X2200. D. Ziua 180: neovase şi nou sintetizate fibre de colagen
cu dispoziţie longitudinală şi transversală; X4400.

Lotul control

Din punct de vedere macroscopic, diferenţele sunt semnificative în cadrul lotului de


control. Peste 70% din cazuri au prezentat modificări la nivelul zonei patch-ului.
Astfel, au fost înregistrate defecte distrofice de regenerare (7 cazuri pentru patch-ul
jejunal şi 9 pentru cel gastric), un caz de fistulă gastrică cutanată, deformări pseudodiverticulare
(câte 4 subiecţi pentru fiecare regiune digestivă) şi un caz de formaţiune pseudotumorală gastro-
hepatică (Fig. 43-49).

  174 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                    Rezultate 

Pentru lotul control, nu au fost realizate evaluări microscopice ale defectelor de


regenerare, simpla prezenţă a acestora fiind suficientă pentru a susţine beneficiul utilizării MSC.

Fig. 43. Pseudodiverticul gastric; 40 zile


postoperator. F1
A, B. Stomac, faţa peritoneală. C. Stomac,
aspect intraluminal. a. detaliu A - diverticulul
(alb) şi orificiul diverticular (negru). c. detaliu C -
orificiul diverticular (negru); cicatrice ce
marchează locul de aplicare al patch-ului (alb),
creastă mucoasă (gri).

Fig. 44. Pseudodiverticul cu


agenezie a mucoase gastrice; 29 zile
postoperator. F1
A. Stomac, faţa peritoneală - se observă
aspectul exterior al pseudodiverticulului.
B. Stomac, faţa intraluminală - se
observă orificiul diverticulului şi lipsa
continuităţii mucoasei gastrice la acest
nivel. C. Detaliu B.

  175 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                    Rezultate 

Fig. 45. Displazie inflama-


torie, benignă a mucoasei
gastrice; 25 zile
postoperator. F1
1/3 superioară gastrică; central
se poate observa patch-ul
(săgeţi negre).  

Fig. 46. Fuziunea a două anse jejunale veci-


ne cu reorganizarea lumenului şi expulzia
parţială a patch-ului. F1
A, B. Blocul format de cele două anse fuzionate.
C. Aspectul intraluminal şi patch-ul aplicat, parţial
digerat.

  176 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                    Rezultate 

Fig. 47. Pseudodiverticul


jejunal; 50 zile postoperator. F1
A. Aspectul extern al pseudo-
diverticulului; faţa peritoneală.
B, C. Aspectul intraluminal al pseu-
ododiverticulului.

Fig. 48. Peritonită prin dehiscenţă a


suturi, fistulizare cutanată şi perito-
neală a conţinutului gastric la locul de
aplicare a patch-ului; 46 zile
postoperator. F1
A. Blocul aderenţial conţinând stomacul,
ficatul şi splina; foarfeca indică traiectul
cutanat al fistulei. B. Orificul fistulei
gastrice şi necroza peretelui gastric la locul
de aplicare a patch-ului. C. Aspectul
intraluminal al stomacului cu vizualizarea
orificiului de fistulizare cutanată şi
peritoneală.

  177 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                    Rezultate 

Fig. 49. Formaţiune pseudotumorală gastro-hepatică. F1


Formată prin marirea progresivă a unui pseudodiverticul format pe locul de aplicare a patch-ului,
cauzată de patrunderea conţinutului gastric, ce a condus la comprimarea lobilor hepatici stângi şi
fuziunea acestora la peretele gastric anterior, soldată cu necroza acestora şi blocarea tranzitului
gastric. A. Vedere frontală. B. Vedere lateral stânga. C. Incizia peretelui tumoral. D. Aspectul
conţinutului tumoral - se observă conţinutul gastric pătruns în pseudodiverticul (*). * - tumora; # -
ficat; ^ - ficat necrozat.

Deşi la început, mortalitatea a fost dublă în cadrul lotului control, pe termen lung aceasta
s-a egalizat, astfel încât nu s-a observata o afectare a duratei de viaţa. Nu se poate spune că
mortalitatea crescută se datorează lipsei MSC, ci probabil este legată de curba de învăţare a
tehnicii, lotul control fiind realizat înaintea celui experimental.
Exceptând cazurile de peritonită şi pe cel al pseudotumorei gastro-hepatice, defectele de
regenerare observate au fost compatibile cu viaţa, fară a constitui cauze de deces, unele fiind
detectate la cca 25-30 de luni postoperator.

  178 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                                                                  Discuții/Concluzii 

DISCUŢII
În acest studiu s-a testat pentru prima dată combinaţia dintre MSC şi o matrice
biosintetică dublată de un fragment arterial decelularizat cu scopul regenerării in vivo a peretelui
digestiv. MSC izolate de la nivelul MO, au fost evidente şi stabile în cultură, aşa cum arată
morfologia lor, rezultatele FACS, marcarea fluorescentă şi testul funcţional de diferenţiere
adipogenică şi osteogenică. Mai mult, nu au fost observate efecte adverse cauzate de
administrarea MSC. Suportul matriceal, buretele de COL-AG şi fragmentul arterial, au fost apte
pentru susţinerea celulelor, fără a genera fenomene imune; mai mult structura buretelui este
similară colagenului nativ.
Produsul rezultat, cu o structură bilaminară, a fost utilizat cu succes pentru substituţia şi
regenerarea peretelui digestiv al şobolanilor, făcând parte dintre metodele de inginerie tisulară
menite a repara, întreţine şi îmbunătăţii funcţiile ţesuturilor.
De-a lungul timpului, s-au conturat trei strategii de a crea ţesuturi noi: (1) utilizarea de
celule izolate sau substituenţi celulari, (2) utilizarea de substanţe ce induc apariţia ţesuturilor şi
(3) utilizarea celulelor plasate pe/sau în diverse matrici. (Langer 1997)
Se consideră că biomaterialele joacă un rol important în regenerarea ţesutului, actionând
ca schele utilizate de către ţesut pentru refacerea arhitecturii sale. Clasic, biomaterialele sunt
împărţite în: (1) naturale (colagen, alginat etc); (2) acelulare (mucoasa vezicală urinară,
submucoasa intestinală); (3) sintetice (acid polilactic, poliglicolic etc). (Demirbilek 2003) Cu
toate acestea, suportul ideal pentru reconstrucţia peretelui digestiv încă nu a fost găsit.
În general, se consideră că, graftul ideal trebuie să fie biocompatibil pentru a evita un
răspuns tisular nedorit din partea gazdei, să permită ataşarea celulelor, infiltrarea şi proliferarea,
să favorizeze neovascularizaţia şi astfel dezvoltarea tisulară, să deţină proprietăţi mecanice şi
fizice adecvate pentru a menţine structura şi funcţia în timpul reparării tisulare şi să fie
biodegradabil într-o manieră controlată (Lu 2004). La acestea se poate adăuga rolul de protector
pentru celulele inoculate.
Prima utilizare cu succes a materialelor protetice neabsorbabile ca patch pentru repararea
defectelor peretelui digestiv a fost raportată de Harmon (1979). Aşa cum a fost demonstrat de
alte studii, materialele neresorbabile reprezintă o soluţie deficitară pentru creşterea tisulară
deoarece ţesutul regenerat are o arhitectură dezordonată (Chen 2004), în plus, aducând şi
reacţiile organismului faţă de un corp străin.
Utilizarea materialelor resorbabile a constituit următorul pas firesc. Astfel, Thompson a
investigat pentru prima dată utilizarea unui patch sintetic resorbabil: o meşă din acid poliglicolic
(Thompson 1986). Din păcate matricile polimerice nu pot interacţiona cu celulele în maniera
dorită întrucât suprafaţa lor nu promovează adeziunea celulară şi, de asemenea, poate induce
reacţii inflamatorii şi toxice (Walles 2003). În plus, există o îngrijorare cu privire la potenţialul
infecţios al grafturilor sintetice (Wang 2003).
Actualmente studiile se concentrează asupra biomaterialelor resorbabile care au câteva
avantaje, în plus, faţă de materialele sintetice clasice: sunt biodegradabile în timp, favorizează
interacţiile celulare, creşterea, dezvoltarea tisulară şi sunt rezistente la infecţii.
Succesul suprem al ingineriei tisulare rezidă în alegerea corectă a tipurilor de
biomateriale adecvate (componenta pasivă) şi a componentei active (celulele).
Colagenul este cel mai folosit material pentru cultura celulelor în variate domenii, culturi
celulare 3D fiind obţinute utilizând bureţi de colagen, geluri, filme şi sandwich-uri ale acestora
(Itoh 2001, Feng 2003, Chen 2003). Colagenul este avantajos deoarece conţine structuri ce
facilitează ataşarea celulelor, migrarea, proliferarea şi menţinerea diverselor funcţii (Itoh 2001).
În plus, colagenul exogen poate fi încorporat în ţesutul de granulaţie fiind astfel o materie primă
pentru reconstrucţia tisulară (Mutter 1996).
Biomaterialele pe bază de colagen precum Contigen şi materialele bazate pe matrice
extracelulare ca AlloDerm-ul, submucoasa de intestine subţire, submucoasa de vezică urinară
(UBS) sunt exemple comerciale de produse disponibile. AlloDermu-ul a fost utilizat pentru

  179 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                                                                  Discuții/Concluzii 

acoperirea defectelor esofagului cervical la câini (Isch 2001). SIS a fost utilizată ca patch pentru
regenerarea esofagului (Badylak 2000) şi intestinului subţire (Chen 2001, Wang 2005) pe diverse
modele de xenograft, iar o matrice de tip SIS însămânţată cu MSC provenite din măduva osoasă
a fost utilizată cu succes pentru regenerarea vezicii urinare pe un model canin (Chung 2005).
UBS a fost utilizată ca xenograft resorbabil pentru repararea defectelor esofagiene pe un model
canin (Badylak 2000). S-a dovedit că SIS şi UBS conţin factori angiogeni (e.g. basic fibroblast
growth factor (bFGF), vascular endothelial cell growth factor (VEGF)), şi componente ce susţin
angiogeneza (fibronectină, heparină, colagen I, III, IV, şi V) ce explică rolul important al acestor
matrice în neovascularizaţie (de la Fuente 2003) (Demirbilek 2003). Toate aceste elemente au în
comun aportul matricei extracelulare menită a fi o schelă de construcţie pentru celulele
primitorului. Este important a se ţine cont de faptul că atunci când se utilizează matrice simple
fără celule, reconstrucţia peretelui digestiv este rezultatul autoregenerării. Utilizând matrice
sădite cu celule, refacerea continuităţii digestive este rezultatul ţesutului transplantat şi a celui
gazdă.
Odată cu utilizarea crescută a colagenului în domeniu medical au apărut întrebări ce
privesc imunogenicitatea acestei proteine la oameni. Colagenul este cunoscut pentru
biocompatibilitatea sa excelentă, datorată toxicităţii scăzute şi reacţiei imunogenice slabe, iar
până în 1950 s-a considerat că antigenicitatea colagenului nu există. O posibilă explicaţie ar fi
gradul mare de similitudine a secvenţei de aminoacizi la specii diferite şi conţinutul scăzut în
aminoacizi aromatici. Problemele sunt legate de o posibilă apariţie a unui răspuns imun masiv
care poate avea efecte secundare, cum ar fi lezarea organelor datorită numărului mare de
complexe imune sau reacţii încrucişate ce pot induce o boală autoimună. Trebuie făcută o
distincţie clară între imunogenicitate, inducerea formării de anticorpi, şi antigenicitate, anticorpii
sunt deja prezenţi. Animalele şi oamenii pot produce anticorpi ce se leagă la trei determinanţi din
cadrul moleculei de coalgen: determinanţii terminali sunt localizaţi în regiunea terminală non
helicală (determinanţi P), determinantul central constă în secvenţa de aminoacizi cu conformaţie
triplu-helicala (determinanţi A).
Importanţa fiecărui determinant depinde de natură şi modul de procesare a produsului
bazat pe colagen. De exemplu, îndepărtarea selectivă a componentelor non helicale din molecula
de colagen are ca rezultat scăderea antigenicităţii. Crosslink-uri adiţionale, de exemplu cu
glutaraldehida, duce la scăderea antigenicităţii dar nu o elimină complet. Aşadar, răspunsul imun
declanşat de colagen este dependent de sursa proteinei, de metoda folosită şi de specia de animal
folosită în cadrul experimentului. În ciuda problemelor teoretice care pot apărea, suturile pe bază
de colagen, agenţii hemostatici pe bază de colagen, şi colagenul injectabil sunt considerate
produse fără risc şi slab antigenice, ceea ce fac din colagen un material potrivit pentru domeniul
medical.
Dintre structurile animale bogate în colagen, aorta porcină este cel mai des folosită în
experimente ce ţintesc obţinerea unui substitut vascular (Nerem 2001). Totuşi, aplicaţiile nu sunt
restrânse doar la domeniul vascular, Kajitani reparând un defect duodenal major cu un patch pe
bază de elastină obţinut din aortă porcină (Kajitani 2000). Folosirea aortei porcine este justificată
nu numai de rezistenţa la digestie, ci şi de conţinutul ridicat în colagen şi elastină ce are un
impact pozitiv asupra vindecării ţesuturilor.
Limita xenograft-urilor este reprezentată de antigenicitate care poate fi înlăturată prin
decelularizare. Tehnicile de decelularizare includ mijloace chimice, enzimatice şi mecanice de
îndepărtare a componentelor celulare, lăsând în urmă un material constituit în principal numai
din elemente al matricei extracelulare (Schmidt 2000). Tratamentul enzimatic utilizat în studiu a
fost optimizat printr-o serie de trial-uri cu scopul de a evita ca fragmentele arteriale să devină
prea friabile. Tratamentul a prezervat arhitectura matricei extracelulare alcătuită din proteine
structurale, proteoglicani, fibre de colagen şi elastină, aşa cum rezultă şi din studiul lui Teebken
(2000).
Un pas înainte în ingineria tisulară a tubului digestiv a constat în popularea in vitro a
matricilor sintetice şi biologice cu diverse tipuri de celule în funcţie de ţesutul reparat. Vacanti şi
colaboratorii au fost pionierii în obţinerea unui neointestin prin inginerie tisulară, utilizând

  180 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                                                                  Discuții/Concluzii 

“organoizi” cultivaţi într-o matrice din acid poliglicolic şi polilactic (Organ 1992), studiile lor
fiind bazate pe activitatea lui Evans şi Tait (Evans 1992, Tait 1994). Organoizii intestinali par a
fi superiori celulelor intestinale pentru a fi însămânţate în biomateriale deoarece conţin pe lângă
celulele criptelor gastrice şi elemente stromale ce facilitează generarea neointestinului (Chen
2004). Mai mult, aceşti organoizi conţin celule stem intestinale.
Rolul MSC în regenerarea tisulară este bine cunoscut (Pittenger 1999). Ele au capacitatea
de a se diferenţia, în anumite condiţii in vitro, şi să formeze osteoblaste, condrocite, tenocite,
mioblaste, neuroni şi celule ale mezodermului visceral (celule endoteliale) (Chamberlain 2007).
MSC au abilitatea de a se localiza atât în ţesuturi sănătoase cât şi bolnave şi de a se diferenţia in
vivo în anumite tipuri celulare (Chamberlain 2007).
Eficienţa celulelor stem derivate din măduva osoasă în regenerarea stomacului după
inducerea cu etanol a unor ulcere a fost demonstrată într-un studiu pe şobolani (Komori 2005).
Succesul utilizării acestor celule în tratamentul enteritei postradice (Semont 2006) şi al bolilor
inflamatorii ale intestinului (Garcia-Olmo 2005) atestă implicarea lor în repararea tubului
digestiv.
Potenţialul beneficiu al MSC în repararea întregii grosimi a peretelui digestiv este un
concept nou. Datorită proprietăţilor de multiplicare şi diferenţiere in vitro şi in vivo, s-a presupus
că MSC pot fi de o mare importanţă în repararea defectelor peretelui digestiv.
În prezent, studiile au menirea de a elucida mecanismul de acţiune al MSC în repararea
defectelor peretelui digestiv. Contribuţii recente au arătat contribuţia MSC la solidificarea
digestivă (Han 2005) şi epitelizare (Fu 2006). Însămânţate pe o matrice optimă aceste celule pot
ghida angiogenza şi vindecarea tisulară.
Am pornită de la ipoteza că cea mai potrivită cale de livrare a celulelor pentru repararea
peretelui digestiv este reprezentată de folosirea unui patch local cu un număr mare de MSC.
Folosirea unui număr mare de celule implică o mare disponibilitate. Datorită posibilităţii de
cultivare şi multiplicare in vitro a acestor celule, singurul factor limitativ al disponibilităţii lor
poate fi dependent doar de recoltare. Stroma măduvei oasoase este cea mai utilizată sursă de
celule stem mezenchimale. În acest studiu, recoltarea unei cantităţi suficiente de măduvă osoasă
a necesitat sacrificarea şobolanilor dar pentru animale mai mari aceste celule pot fi recoltate cu
uşurinţă prin aspiraţie medulară.
Deoarece deplasarea celulelor în matricea aortică decelularizata este inadecvată atât in
vitro (Teebken 2000) cât şi in vivo (Walles 2003), aceasta având o organizare foarte strânsă, s-a
decis sădirea MSC într-un burete de COL-AG ce a fost apoi aplicat peste fragmentul arteria. În
plus, ţinând cont de rolurile fiziologice ale colagenului şi cele observate in vitro (facilitează
ataşarea celulelor, migrarea, proliferarea şi menţinerea diverselor funcţii celulare) s-a considerat
că folosirea unei matrice colagenice care să se comporte ca un rezervor de MSC, este ideală sub
raportul beneficiu/cost.
În matricile 3D de COL-AG, MSC rămân viabile şi “sănătoase” (Batorsky 2005). Prin
aceasta metodă inovativă s-a încercat obţinerea unui patch 3D cu proprietăţi specifice:
biocompatibilitate, biodegradabilitate, integritate structurală şi porozitate adecvată. Structura tip
fagure a matricei COL-AG a fost aleasă pentru sădirea celulelor deoarece poate acapara un
număr mare de celule datorită structurii sale specifice cu o arie totală foarte mare (Itoh 2001).
Prin utilizarea matricei de colagen îmbogăţite cu MSC s-a dorit nu numai obţinerea dar şi
accelerarea regenerării adecvate a peretelui digestiv.
După inocularea în organism, MSC au nevoie de un mediu “prietenos” pentru
supravieţuire. Lumenul tubului digestiv este cel mai neprimitor mediu pentru aceste celule,
datorită prezenţei unei cantităţi crescute de enzime, acizi, baze şi germeni. O modalitate de a
proteja aceste celule de a fi ucise de acest mediu ostil este de a le “ambala” într-o matrice
rezistentă la acţiunea enzimelor, acizilor şi bazelor. Pentru acest scop matricea de COL-AG a
fost aleasă, colagenul fiind cel mai rezistent biomaterial la acţiunea secreţiilor digestive
(Aprahamian 1992), iar agaroza este un polizaharid inert la acţiunea enzimelor, acizilor şi
bazelor.

  181 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                                                                  Discuții/Concluzii 

Buretele de COL-AG utilizat în studiul prezent are o porozitate înaltă şi o dimensiune


adecvată a porilor, caracteristici necesare pentru a facilita însămânţarea celulară şi difuzia în
întreaga structură a celulelor şi nutrienţilor. Cu toate acestea utilizarea doar a matricei de COL-
AG îmbogăţită cu MSC nu asigură o rezistenţă suficientă a acoperi defectul peretelui digestiv,
fiind permeabilă. Pentru aceasta, fragmentul arterial decelularizat vine ca o completare, sporind
gradul de rezistenţă şi împiedicând efracţia continutului gastric, ce ar putea avea loc prin porii
matricei colagenice. Utilizarea unui suport cu o rezistenţă mai mare este necesară până la
regenerarea peretelui digestiv, dar biodegradabilitatea este esenţială întrucât matricea trebuie să
fie absorbită de ţesuturile înconjurătoare fără a fi nevoie de o extracţie chirurgicală. Rata cu care
degradarea are loc este similară cu rata de formare a ţesutului. Aceasta înseamnă că matricea este
capabilă să furnizeze integritatea structurală, în timp ce, celulele fabrică propria lor matrice
naturală, pentru că apoi să fie dezintegrată lăsând ţesutul nou format să preia sarcina mecanică.
Regenerarea completă a peretelui digestiv şi degradarea graft-ului poate să dureze până la 90 de
zile, aşa cum a fost descrisă de diferiţi autori cu privire la folosirea diverselor biomateriale (Chen
2001). În studiul realizat regenerarea completă a peretelui digestiv a fost observată la 48 de zile.
În ceea ce priveşte imunogenitatea, ţinând cont de originea vaselor (porc şi om) şi a MSC
(om), patch-urile au fost utilizate ca xenograft-uri. După tratamentul de decelularizare,
segmentele arteriale au fost immunologic inerete. În ceea ce priveşte MSC, acestea sunt
considerate a fi hipoimunogenice, exprimând nivele scăzute ale antigenelor leucocitare umane
(HLA) complexul major de histocompatibilitate (MHC) clasa I fără a exprima HLA clasa II
(Chamberlain 2007). La aceasta se adaugă şi faptul că MSC inhibă răspunsul imun al gazdei,
prin suprimarea funcţiei celulelor T cu memorie, naive şi mature, prin scăderea nivelului TNF şi
stimularea secreţiei IL-10 de către celulele dendritice, prin creşterea numărului de celule T
regulatorii, prin blocarea maturării APC şi secreţia de către acestea a IL-10. Deşi MSC sunt
cunoscute a avea o expresie scăzută a HLA clasa I, imunofluorescenţa intensă observată la 48 de
zile poate fi explicată prin faptul că aceste celule încep să exprime acest antigen odată cu
diferenţierea lor în celule adulte. În acest studiu nu s-au observat efecte ale rejetului patch-urilor
îmbogăţite cu MSC umane la şobolanii fără imunosupresie, deşi studii anterioare cu
xenotransplanturi sugerează că MSC umane nu sunt imuno-privilegiate intrisec şi pot determina
rejectul la gazde cu sistem imun intact (Grinnemo 2004).
Aplicarea locală a transplantului, aduce un befeciu în plus faţă de administrarea sistemică
a celulelor, prin realizarea unei concentraţii crescute la nivelul ţesutului ţintă. Prin această
modalitate, s-a garantat aplicarea locală a unui număr maxim de celule, care nu ar fi putut fi atins
sistemic datorită sechestrării acestora în organe precum plamanii sau splina. Speculând structura
3D a patch-ului, acesta a favorizat migrarea şi ataşarea MSC la ţesutul ţintă, dar, şi colonizarea
inversă a patch-ului, cu celule inflamatorii endogene, realizând o unitate funcţională regenerativă
unică.
Rezultatul utilizării patch-urilor cu MSC a fost reprezentat de regenerarea tuturor celor
patru straturi ale peretelui digestiv. Structura straturilor regenerate, exceptând mucoasa, a fost
similară cu cea nativă. Deşi aspectul mucoasei regenerate (epiteliu pluristratificat keratinizat
pavimentos metaplazic) nu a fost similar celui nativ, acesta nu reprezintă un dezavantaj. Întrucât
patch-ul este destinat acoperirii fistulelor digestive, funcţia absorbtivă a ţesutului regenerat nu
este importantă, punându-se accent pe un ţesut rezistent care să împiedice exteriorizarea
conţinutului digestiv. În plus, patch-ul ar putea fi utilizat şi ca măsură de protecţie pentru unele
din anastomozele digestive la risc.
Rolul MSC, nu s-a rezumat numai la refacerea celularităţii ţesutului regenerat ci şi la
constituirea unei matrice suport pentru noile celule, prin producerea de neo-vase (MSC
stimulează angiogneza) şi producerea de colagen, constituient al matricei extracelulare, aşa cum
se observă în imaginile de micorscopie electronică (Fig. 42D).
Pe lângă rezultatele obţinute, se observă câteva insuficienţe ce necesită o abordare prin
studii ulterioare: (1) nu s-a putut cuantifica rolul şi influenţa celulelor endogene implicate în
repararea tisulară, nefiind posibilă încă blocarea acestora; astfel, este posibil ca rezultatele
obţinute să se datoreze unor efecte paracrine exercitatea de către MSC transplantate asupra

  182 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
STUDIUL EXPERIMENTAL                                                                  Discuții/Concluzii 

celulelor endogene locale şi/sau sistemice; (2) nu a fost posibilă analiza diferenţierii MSC;
identificarea acestora după 48 de zile certifică prezenţa lor la nivelul tesutului, însă nu se poate
spune dacă acestea s-au diferenţiat în celule constituente ale peretelui digestiv sau au stimulat
diferenţierea celulelor endogene; (3) deşi morfologic, structura regenerată a fost urmărită până la
350 zile postoperator, identificarea celulelor a fost realizată pe o perioadă de până la 48 de zile,
ce pledează mai mult pentru efectul paracrin exercitat de MSC; se impune necesitatea unor
studii ulterioare care să urmărească aceste celule pe o perioadă mai lungă de timp; (4) nu a fost
posibilă elucidarea mecanismului de acţiune al MSC, ci doar a beneficiilor utilizării acestora;
(5) nu a fost posibilă o analiză amănunţită a fenomenelor ce au condus la metaplazia
mucoasei prin prezenţa epiteliului pavimentos în locul mucoasei gastrice normale; (6) nu s-a
realizat o analiză a evoluţiei acestor celule, neştiindu-se ce se întâmplă cu acestea după 48 de
zile. Pe viitor, multe din aceste neajunsuri vor putea fi îndepărtatea prin utilizarea unor metode
de marcare genetică combinată cu analiza expresiei anumitor gene specifice.
În acest studiu au fost prezentate rezultatele obţinute în urma folosirii patch-urilor 3D
îmbogăţite cu MSC pentru repararea defectelor iatrogene ale stomacului sau intestinului
demonstrând macroscopic şi microscopic repararea peretelui digestiv la nivelul patch-ului.
Implicaţiile MSC în repararea peretelui digestiv au fost dovedite în acest studiu prin
identificarea celulelor xenotransplantate la nivelul peretelui digestiv regenerat şi prin rezultatul
clinic favorabil. Scopul cercetărilor actuale este de a caracteriza evoluţia acestor celule, a
înţelege implicaţiile MSC în repararea tubului digestiv adult – prin diferenţiere, fuziune celulară
cu celulele adulte şi/sau influenţare a celulelor adulte prin secreţia de citokine – şi de a învăţa
cum aceste celule pot fi manipulate spre a obţine structuri identice celor native.
Rezultatele viitoare vor facilita aplicaţiile patch-urilor 3D cu MSC autoloage ca o soluţie
promiţătoare pentru tratamentul fistulelor digestive, dar şi a altor afecţiuni.

CONCLUZII
Studiul descrie izolarea, cultivarea, caracterizarea MSC obţinute din măduva osoasă şi
pregătirea printr-o procedură inovatoare a unui bioconstruct ce are la bază o matrice de colagen-
agaroza îmbogăţită cu MSC, aşezată pe un fragment aortic, cu scopul transplantării pentru
repararea defectelor peretelui digestive. Rezultatele obţinute arată că patch-urile 3D îmbogăţite
cu MSC promovează repararea defectelor peretelui digestiv cu refacerea celor patru straturi.
Matricea de COL-AG s-a dovedit a fi biocompatibilă şi biodegradabilă, facilitând grefarea MSC.
Componenta aortică a patch-ului a oferit un bun suport mecanic pentru celelalte componente
fiind complet resorbită în ţesutul regenerat. MSC transplantate au îmbunătăţit grefarea patch-ului
facilitând regenerarea completă a ţesuturilor fără nevoia de imunosupresie.
Acest studiu a reprezentat un prim pas în intenţia de a realiza o nouă metodă pentru
tratamentul fistulelor digestive la pacienţii umani, utilizând patch-uri 3D cu MSC autoloage
expandate in vitro.

  183 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
PREZENTARE CAZURI                                                    Cazul I 

PREZENTARE CAZURI
Rezultatele favorabile obţinute în cadrul studiului pe animale, corelate cu datele din
literatură au îndreptăţit testarea produsului experiemntal pe oameni, însă întrucât nu s-au găsit
pacienţi cu fistule digestive care să întrunească criteriile de includere, şi care să accepte acest
tratament experimental, testarea sa a fost realizată pe pacienţi neurologici prezentând escare de
decubit.

Cazul I

Pacient: S.V., 51 ani, bărbat, diagnosticat în Mai 2007 cu scleroză multiplă primară
progresivă.

Prezentare

În aprilie 2008 se internează din ambulatoriu în cadrul secţiei de Neurologie a


Institutului Clinic Fundeni prezentând la examenul neurologic următoarele aspecte clinice:
nevrita optică bilaterală, hipoacuzie bilaterală, diplopie în câmpul central, drept şi stâng,
parestezie facială dreapta, tetrapareza (paraplegie 0/5, dipareza 3/5), anestezie a membrului
inferior stâng, hipotonie, ROT exagerate pe partea dreaptă şi absente pe cea stângă, ataxie,
retenţie urinară, astenie, anxietate, ulceraţie infectată la nivelul maleolei externe stângi şi în
treimea superioară a coapsei pe faţa laterală cu modificări trofice importante.
Diagnosticul la internare: scleroza multiplă primară progresivă EDSS 9 (Expanded
Disability Staus Scale); escare de decubit stadiul IV, infectate, maleola externă stângă şi treime
superioară faţă laterală coapsă (Fig. I.1).

Fig. I.1. Aspectul ulceraţilor la internare. F3


A. Ulceraţia maleolei externe stângi. B. Ulceraţia de la nivelul coapsei stângi, treime superioară, faţa
laterală.

  184 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
PREZENTARE CAZURI                                                    Cazul I 

Antecedente

Martie 2003: se internează în cadrul secţiei de Neurologie a Institutului Clinic Fundeni


pentru: parestezii şi dureri la nivelul membrelor inferioare, parapareză progresivă (piciorul stâng
2/5, piciorul drept 3/5).
Examenul imagistic IRM cerebral indică 3 leziuni mici de demielinizare cu hipersemnal
în secvenţa T2 localizate subcortical în regiunea frontal stânga şi parietal dreapta. La nivelul
măduvei spinării examenul IRM evidenţiază o leziune de demielinizare la nivelul regiunii T2-T3
ce prezintă hipersemnal în secvenţa T2 şi FLAIR şi hiposemnal în secvenţa T1 (Fig. I.2).
Examenul IRM corelat cu cel clinic orientează asupra diagnosticului de scleroză multiplă
– forma spinală cu EDSS 6.5.
Se instituie tratament oral corticoid, urmat de o recuperare parţială, EDSS 6, pacientul
fiind capabil a se deplasa cu ajutor constant.

Fig. I.2. Aspectul IRM. F3


Leziuni mici de demielinizare cu hipersemnal în secvenţa T2, localizate subcortical în regiunea frontal
stânga şi parietal dreapta; la nivelul măduvei spinării se evidenţiază o leziune de demielinizare la
nivelul regiunii T2-T3 ce prezintă hipersemnal în secvenţa T2 şi FLAIR şi hiposemnal în secvenţa T1.

Septembrie 2006: pacientul dezvolta escare de decubit la nivelul halucelui stâng şi a


plantei drepte, ce se remit sub tratament conservator.

Mai 2007: se reinternează, prezentând: nevrita optică a ochiului drept, hipoacuzie


bilaterală (drepata > stânga), paraplegie, sindrom piramidal bilateral, hipoestezie bilaterală a
mebrelor inferioare, radiculalgii bilaterale L5, retenţie urinară şi astenie.
Examenul IRM: fără leziuni medulare cervico-toraco-lombar. EMG normală. Potenţiale
evocate vizuale concludente pentru nevrita optică.
Se stabileşte diagnosticul de scleroză multiplă primară progresivă EDSS 8.5, pentru care
se instituie terapie corticoidă cu Solu-Medrol 1 g/zi i.v. timp de 5 zile, urmată de administrarea
orală de Medrol 32 mg/zi în doză descrescândă şi ciclofosfamidă 200 mg/zi i.v. timp de 5 zile.
După cura injectabilă cu Solu-Medrol pacientul începe a se deplasa singur fără ajutor,
EDSS 5.5, dar la două luni de la întreruperea terapiei orale pacientul devine incapabil a se
mobiliza, EDSS 8. Se instituie tratament cronic de menţinere cu Medrol 8 mg/zi.

  185 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
PREZENTARE CAZURI                                                    Cazul I 

Noiembrie 2007: pacientul este paraplegic prezentând parestezii şi dureri la nivelul


vertebrelor L3-L4.

Februarie 2008: pacientul dezvoltă escare de decubit la nivelul maleolei externe stângi
şi în treimea superioară a coapsei pe faţa laterală, care sunt tratate conservator cu pansamente
uscate.

Conduită

După momentul internării, pacientul este adus în atenţia Centrului de Chirurgie şi


Transplant Hepatic Fundeni din cadrul Institutului Clinic Fundeni pentru evaluarea şi tratamentul
escarelor.
Consultul chirurgical constată prezenţa a două escare de decubit stadiul IV, infectate, cu
localizarea menţionată (cea maleolară de 8/7 cm, iar cea de la nivelul coapsei de cca 3 cm
diametru) şi a unei escare stadiul III la nivelul calcaneului drept de cca 2 cm diametru.
Culturile bacteriene din cele două escare sunt pozitive pentru Staphilococcus aureus şi
Proteus.
S-a instituit antibioterapie sistemică conform antibiogramei, cu Cefazolin i.v. 500 mg x 3
prize/24h, debridare şi lavaj local zilnic cu 500 ml soluţie salină 0.9% cu 20 ml Betadine®,
pansament steril cu Atrauman Ag® capitonat cu Tenderwet Active® sau Sorbalgon® (Fig. I.3,
Fig. I.4).
Pacientul a beneficiat de un consult de chirurgie plastică ce a oferit opţiunea acoperiri
escarelor cu o grefă de piele, însă având în vedere statusul hipotrofic neurogen şi răspunsul
pozitiv al Comisiei de etică a Institutului Clinic Fundeni, pacientului i s-a oferit posibilitatea
acoperirii escarelor cu un pansament biologic pe bază de MSC autologe, pacientul consimţind
informat pentru această variantă.
Tratamentul conservator a fost continuat timp de 20 de zile (Fig. I.5), până la sterilizarea
plăgilor, timp în care pacientul a fost investigat oncologic şi pentru prezenţa infecţiilor virale şi
bacteriente în vederea aplicării pansamentului biologic cu MSC. Investigaţiile negative au
permis recoltarea de aspirat medular de la nivelul spinei iliace postero-superioare în vederea
izolării şi cultivării MSC.

Fig. I.3. Tratamentul conservator al escarei maleolare. F3


A. Plaga acoperită cu Atrauman Ag®. B. Peste Atrauman Ag® se aplică doi bureţi Tenderwet
Active®. Întregul sistem are rol bactericid (prin prezenţa ionilor de Ag din compoziţia Atrauman
Ag®) şi de drenare a plăgii (prin intermediul bureţilor Tenderwet Active®, ce schimbă lichide cu
plaga).

  186 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
PREZENTARE CAZURI                                                    Cazul I 

Fig. I.4. Tratamentul conservator al escarei coapsei. F3


A. Plaga acoperită cu Atrauman Ag®. B. Peste Atrauman Ag® se aplică un material absorbabil pe
bază de alginat, Sorbalgon®. Sistemul are rol bactericid (prin prezenţa ionilor de Ag din compoziţia
Atrauman Ag®) şi de absorbţie a lichidelor din plagă (prin intermediul Sorbalgon®.).

Fig. I.5. Aspectul plăgilor


după 10 (A, B) respectiv 20
de zile (C, D) de tratament
conservator. F3

MSC au fost izolate folosind un protocol bazat pe separarea în gradient de densitate şi


selecţie negativă RossetSep (vezi Partea generală), fiind analizate cariotipic şi fenotipic prin
flow-cytometry în timpul celui de al treilea pasaj. Celulele izolate au prezentat fenotipul clasic
pentru MSC: CD105+, CD90+, CD34+, CD45-, CD3-, CD14-, şi un cariotip normal.
Celulele astfel obţinute au fost folosite pentru obţinerea unui patch similar celui utilizat în
modelul experimental descris, dar la o scală mai mare (cca 8x106 celule, sădite pe o suprafaţă de
20 cm2) (Fig. I.6).
Cele două ulceraţii au fost acoperite cu acest pansament biologic, la 20 de zile de la
prezentare, evoluţia pacientului fiind înregistrată zilnic (Fig. I.7).

  187 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
PREZENTARE CAZURI                                                    Cazul I 

Fig. I.6. Aspectul patch-ului constituit din MSC, matrice colagenică şi perete aortic
decelularizat. F3
MSC au fost impregnate in matricea colagenică care constituie “miezul” sandwich-ului format de
peretele aortic şi plagă. A. Faţa internă, ce intră in contact cu plaga. B. Faţa externă. # - perete
aortic; * - matrice COL-AG cu MSC.

Fig. I.7. Patch-ul aplicat pe escare. F3


A. Escara maleolei externe stângi. B. Escara coapsei.

Follow-up & output

Evoluţia ulceraţiilor posttransplant MSC a fost favorabilă. Fragmentul arterial din


constituţia patch-ului a fost îndepărtat mecanic la patru săptămâni de la aplicare, timp în care
plaga a integrat celule prezente în matricea colagenica, granulându-se.
În decurs de două luni de la aplicare, plaga de la nivelul coapsei s-a închis uniform,
prezentând o cicatrice de dimensiuni similare plăgii, uniforma, cu depresie centrală de cca 2 mm
şi coloraţie rozată (Fig. I.8, Fig. I.9, Fig. I.11).
Plagă maleolară s-a închis în decurs de 5 luni de la aplicare, însă reepitelizarea a fost
observată la cca 5 zile posttransplant. Cicatricea formată a prezentat dimensiuni finale de cca
50% din cele ale plăgii, fără afectare funcţională a articulaţiei (Fig. I.8-I.11)
Ulceraţia de la nivelul calcaneului drept s-a vindecat conservator cu pansament uscat.

  188 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
PREZENTARE CAZURI                                                    Cazul I 

Fig. I.8. Aspectul plăgii la două zile post-transplant. F3


A. Escara maleolară. B. Escara coapsei. * - punte aderentă între ţesutul plăgii şi matricea COL-AG.

Fig. I.9. Aspectul plăgii la şase zile post-transplant. F3


A. Escara maleolară. B. Escara coapsei. Pe masură ce gradul de aderenţă al matricei colagenice la
plagă creşte, fragmentul aortic se decolează putând fi eliminat din plagă prin excizia regiunilor
neaderente.

În paralel cu evoluţia plăgilor, statusul neurologic al pacientului s-a îmbunătăţit progresiv


pe durata a 24 de luni de la transplatnt.
Astfel, începând cu cea de a 14 zi, pacientul a început să prezinte hipoestezie şi parestezii
la nivelul membrului inferior stâng, manifestări ce s-au extins progresiv începând cu zonele
proxime plăgii maleolare, însoţite de creşterea forţei braţelor şi de mobilitatea degetelor ambelor
membre inferioare.
După o lună, s-a recuperat sensibilitatea pentru ambele membre inferioare, pacientul fiind
capabil să se mobilizeaze în pat, cu o îmbunătăţire a scorului EDSS de la 9 la 8 (parapareza 3/5
pentru membrul stâng şi 4/5 pentru cel drept).
După 8 săptămâni, pacientul s-a putut deplasa mergând cu susţinere pe distanţe mici (10
m) iar scorul EDSS a scăzut la 7.
La patru luni, examenul neurologic evidenţiază hipoestezie tactilă şi dureroasă,
parapareza (3/5 membrul stâng, 4/5 cel drept), spasticitate a flexorilor membrelor inferioare, fără

  189 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
PREZENTARE CAZURI                                                    Cazul I 

deficit al braţelor şi ataxie, EDSS 6.5, pacientul fiind capabil să meargă cu ajutor pe distanţe de
aproximativ 40 de m.
Îmbunătăţirea statusului neurologic a fost constantă, astfel încât după 24 de luni pacientul
este apt a realiza activităţi casnice şi să meargă cu bicicletă, în absenţa medicaţiei neurologice.

Fig. I.10. Aspectul escarei maleolare la o lună post-transplant. F3


A. Se observă aderenţa matricei COL-AG la plagă şi detaşarea fragmentului aortic. B. Ţesutul de
reepitelizare la periferia patch-ului.

Fig. I.11. Aspectul final al escarelor. F3


A, B. Escara maleolei externe: A - patru luni
posttransplant; B - 5 luni posttransplant.
C. Escara coapsei, 2 luni posttransplant. 

  190 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
PREZENTARE CAZURI                                                           Cazul II 

Cazul II

Pacient: B.C., 32 ani, bărbat, diagnosticat în aprilie 2003 cu paraplegie flască în urma
unui traumatism medular cu fractură luxaţie T11-T12; sindrom compresiv posttraumatic.

Prezentare

În Septembrie 2008 intră în atenţia Centrului de Chirurgie Generală şi Transplant


Hepatic al Instititului Clinic Fundeni prezentând la nivelul fesei drepte, în regiunea de proiecţie a
tuberozităţii ischiatice o escară de decubit, stadiul IV, neinfectată.
Diagnosticul la internare: escara de decubit stadiul IV (Fig. II.1); paraplegie flască în
urma unui traumatism medular cu fractură luxaţie T11-T12; sindrom compresiv posttraumatic.

Fig. II.1. Aspectul escarei la internare. F3

Antecedente

Aprilie 2003: accident la locul de muncă (lovitură în zona taraco-dorsală cu greutate


căzută de la alt nivel) soldat cu un traumatism vertebro-medular (fractură luxaţie T11-T12) şi
sindrom compresiv ce conduc la paraplegie flască.
Se intervine chirurgical pe data de 24.04.2003: laminectomie T11-T12, decompresie,
rahisinteza posterioară cu plăci metalice.
Pacientul staţionar neurologic (paraplegic) se externează pentru continuarea activităţii de
recuperare într-un centru specializat.

Februarie 2004: intervenţie chirurgicală (cistolitotomie) în cadrul Secţiei de Urologie şi


Transplant Renal a Institutului Clinic Fundeni, pentru litiaza vezicală multiplă. Se externează
vindecat chirugical.

Martie 2007: se internează în cadrul Departementului de Neurochirurgie al Beijing


Xishan Hospital, Beijing, China, în vederea realizării unui transplant celular (ensheathing
olfactory cells).

  191 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
PREZENTARE CAZURI                                                           Cazul II 

Se externează după cca 27 de zile fără progrese clinice notabile în urma procedurii. La
întoarcerea în ţară dezvolta escara fesieră ca urmare a menţinerii poziţiei fixe pe durata zborului.

Conduită

Consultul chirurgical constată prezenţa unei escare de decubit stadiul IV, neinfectată, de
cca 4 cm diametru, tratată conservator, fără ameliorare, timp de 18 luni.
Având acordul Comisiei de etică a Institutului Clinic Fundeni şi al pacientului, acestuia i
se practică acoperirea escarei cu un pansament biologic pe bază de MSC autologe.
MSC au fost recoltate de la nivelul spinei iliace postero-superioare după un screening
amănunţit pentru detectarea infecţiilor sau neoplaziilor. Pentru izolare s- a utilizat un protocol
bazat pe separarea în gradient de densitate (vezi Partea generală), celulele fiind analizate
cariotipic şi fenotipic prin flow-cytometry. Celulele izolate au prezentant fenotipul clasic pentru
MSC: CD105+, CD90+, CD34+, CD45-, CD3-, CD14-, şi un cariotip normal.
Celulele obţinute din al treilea pasaj au fost folosite pentru obţinerea unui patch similar
de cca 13 cm2, ce conţine 4x106 celule (Fig. II.2).

Fig. II.2. Fixarea patch-ul cu MSC. F3


A. Patch. B. Pregătirea ţesutului escarei pentru aplicarea patch-ului
(îndepărtărea ţesutului sclerofibrotic). B, C. Aspectul patch-ului după fixare. 

Follow-up & output

Evoluţia posttransplant a fost favorabilă. Stratul arterial al patch-ului a fost îndepărtat la


două săptămâni de la aplicare.
La trei săptămâni posttransplant, plaga s-a închis în proporţie de 50% prezentând un pat
granular şi un burelet de ţesut alb-sidefiu periferic (Fig. II.3).
Închiderea totală survenit la cca 9 săptămâni posttransplant, rezultând o cicatrice alf-
sidefie de consistenţă moale, mobilă la planurile profunde.

  192 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
PREZENTARE CAZURI                                                           Cazul II 

Nu au fost înregistrate evenimente adverse locale şi sistemice legate de utilizarea MSC


sub forma patch-ului celular; statusul neurologic a rămas staţionar.

Fig. II.3. Evoluţia reepitelizării. F3


A. Două săptămâni posttransplant.
B. Cinci săptămâni posttransplant.
C. Trei luni posttransplant.

  193 
PREZENTARE CAZURI                                                                                                                      PARTEA SPECIALĂ 
    Concluzii 

Discuţii

Cele două cazuri prezentate confirmă rezultatele experimentale privind implicarea MSC
în procesul de vindecare tisulară.
Deşi aplicaţia clinică este diferită de modelul experimental, aceasta a reprezentat
modalitatea cel mai puţin invazivă de testare clinică a produsului.
Folosirea MSC de la nivelul MO, în tratamentul rănilor cutanate pare o soluţie logică,
deoarece realizează un aport de celule inflamatorii, mezenchimale şi multipotente. Celulele
inflamatorii stimulează vindecarea unei plăgi, în timp ce MSC umplu dermul rănii, accelerând
vindecarea. În plus, având în vedere plasticitatea MSC, acestea pot produce celule noi absente
sau deficiente în plaga respectivă. (Badiavas 2003)
Utilizarea MSC pentru tratamentul escarelor de decubit reprezintă o metodă fezabilă ce
poate grăbi vindecarea considerabil, o alternativă viabilă chirurgiei plastice sau metodelor
conservatoare costisitoare, prezentând morbiditate minimă. Cicatricea obţinută, cca 50% din
dimensiunea plăgii inţiale, moale, mobilă, usor elastică, fară afectare funcţională, acoperită de un
epiteliu rezistent, constituie un alt avantaj al metodei.
Într-un studiu similar, Badiavas (2003) a observat că efectul celulelor se manifestă
preponderent la nivelul dermului, producând o uşoară îngroşarea a plăgii, creşterea
vascularizaţiei în patul plăgii şi înconjurător. Asemenea observaţii au fost întâlnite şi în cazul
celor doi pacienţi. Astfel procesul de vindecare are ca punct de plecare dermul, prin furnizarea
acestuia cu celule proaspete sănătoase (din diferenţierea MSC sau racolarea celor endogene pe
baza stimulilor MSC) care le vor înlocui pe cele rezidente, bolnave, inapte a reacţiona în cadrul
procesului de regenerare.
Deoarece punctul de plecare este dermul, se impune o pregătire riguroasă a patului plăgii.
Totuşi, aceasta singură nu este suficientă, aşa cum s-a observat şi în cazul celor doi pacienţi
trataţi, însă oferă un bun acces celulelor la acesta. Astfel, se poate spune că tehnica de izolare şi
cultură a MSC, utilizată pentru cei doi pacienţi, conservă potenţialul dermoregenerativ al MSC,
iar metoda de administrare (patch-ul 3D conţinând buretele de COL-AG cu MSC) favorizează
livrarea celulelor către derm.
În ceea ce priveşte numărul de celule aplicate, Falanga (2007) apreciază că numărul
minim de celule pentru a genera un răspuns este de cca 1 milion/cm2. În opoziţie cu acesta,
pentru cei doi pacienţi s-a utilizat o medie de 350000 de celule/cm2, fără a întâmpina dificultăţi
în rezoluţia procesului lezional.
Cu toate că perioada de vindecare a fost relativ lungă (dar similară cu cea menţionată
pentru studii asemănătoare de către alţi autori (Falanga 2007), rezultatul obţinut şi morbiditatea
procedurii justifică aşteptarea şi utilizarea sa viitoare. În plus, pe termen lung costurile metodei
cu celule stem sunt acceptabile, înlăturând din arsenalul terapeutic pansamentele speciale
destinate escarelor care sunt foarte costisitoare.
In cazul pacientului 1, deşi folosirea MSC, pentru acest pacient a fost strict indicată
ulceraţiilor, rezultatul neurologic a fost neaşteptat, dovedind că la acest moment activitatea MSC
posttransplant nu poate fi controlată precis.
Deşi neaşteptat rezultatul neurologic nu este surprinzător, întrucât MSC au dovedit un rol
terapeutic major în unele afecţiuni autoimune (e.g. GVHD, boala Crohn etc.), astfel încât pot
contribui şi la îmbunătăţirea statusului pacienţilor cu scleroză multiplă.
Totuşi, pentru a susţine ştiinţific acest rezultat, este nevoie că implicarea MSC în scleroza
multiplă să fie studiată pe un număr mai mare de pacienţi, ţintind implicarea moleculară a
acestora în patogenia bolii.
Pentru niciunul din cazuri nu au fost înregistrate evenimente morbide la nivel local sau
sistemic legate de utilizarea MSC sub forma prezentată, până în acest moment
Având în vedere că celulele au fost utilizate sub forma unui pansament biocelular compus
dintr-o matrice de colagen şi ţesut arterial uman decelularizat, se impune testarea acestui produs
pentru identificarea rolului fiecărei componente în cadrul procesului de vindecare.

  194 
PREZENTARE CAZURI                                                                                                                      PARTEA SPECIALĂ 
    Concluzii 

Cu toate că ambii pacienţi au prezentat acelaşi tip de leziune (i.e. escară de decubit
stadiul IV), perioada de regenerarea a fost diferită. Pacientul 2, cu o plagă mai mică, de cca 13
cm2, beneficiind de cca 307000 celule/cm2, a realizat închiderea plăgii după aproximativ 9
săptămâni, în timp ce pacientul 1, cu o plagă de 20 cm2 a primit aproximativ 400000 de
celule/cm2 şi a beneficiat de închiderea plăgii după cca 5 luni. Întrucât concentraţia de celule a
fost apropiată, evoluţia a fost diferită, ceea ce lasă un loc important substratului de implantare.
Astfel, se pare că deşi paraplegici amândoi, statusul autoimun şi afectarea neurală a constituit un
dezavantaj pentru pacientul 1, recuperând mai greu închiderea plăgii. Întrucât mecanismul de
acţiune al acestor celule nu a fost elucidat, un posibil motiv al duratei lungi de timp poate fi
reprezentat de moblizarea celulelor endogene, sub stimulii paracrini ai MSC, celule care oricum
sunt hiporeactive in cazul pacienţilor paraplegici.
Cu toate că nu a existat o analiză paraclinică amănunţită posttransplant a acestor celule,
rolul lor nu poate fi contestat, rezultatul clinic este elocvent, fiind o metodă fezabilă de tratament
a escarelor puţin complicate. Monitorizarea paraclinică, deşi posibilă în aceste cazuri (e.g.
biopsie, marcare a celulelor) nu a fost aplicată din dorinţa de a manipula cât mai puţin aceste
celule, fapt ce s-ar putea exercita asupra comportamentului lor.
În concluzie, utilizarea MSC ca terapie a escarelor de decubit reprezintă o metodă demnă
de investigat pe viitor, putând fi o alternativă mai eficientă vis-a-vis de raportul cost/beneficiu,
raportându-se la metodele conservatoare sau chirurgicale.

Menţiuni

Studiul a fost finanţat de către Ministerul Educaţiei şi Cercetării prin Autoritatea


Naţională de Cercetare Ştiinţifică în cadrul grant-ului CEEX 139/2006 din programul VIASAN.

Activitatea experimentală a fost realizată în cadrul Centrului de Cercetare Experimentală,


aparţinând Institutului Clinic de Boli Digestive şi Transplant Hepatic Fundeni.

  195 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
CONCLUZII      

CONCLUZII

1. Scopul studiului experimental a constat în testarea şi evaluarea MSC ca terapie celulară


pentru refacerea unui model experimental animal de defect digestiv realizat chirurgical.

2. S-a dorit ca acest model terapeutic să fie aplicat pe viitor pentru tratamentul fistulelor
digestive.

3. Utilizarea MSC s-a realizat prin constituirea unui patch 3D, compus din două straturi
fibrilare, perete arterial decelularizat şi un burete de colagen special realizat ce a servit ca
ţesut de acomodare pentru MSC.

4. Patch-ul realizat a fost utilizat pentru acoperirea defectelor digestive realizate pe şobolani,
precum şi pentru accelerarea regenerării tisulare a escarelor a doi pacienţi cu afecţiuni
neurologice.

5. Matricea colagenică extrasă din tendon bovin, utilizată pentru acomodarea MSC, s-a
dovedit a fi de o puritate înaltă, non-imunogenă, morfologic şi chimic similară colagenului
nativ, cu o porozitate ce a facilitat grefarea şi migrarea celulelor stem fără a afecta
viabilitatea acestora.

6. Tehnica de decelularizare a fragmentelor arteriale a condus la obţinerea unor ţesuturi non-


imunogene dar cu o structură rezistentă, adaptată nevoilor de realizare a patch-ului.

7. Procedeul de recoltare a MSC de la şobolan şi om s-a dovedit a fi fiabil, pemiţând izolarea


unui număr suficient de celule pentru iniţierea culturilor primare.

8. Protocolul de selecţie a MSC umane cu kit-ul RossetSep, a favorizat obţinerea unor culturi
primare pure, omogene, cu o viabilitate de peste 95%.

9. Celulele obţinute din ambele surse au fost testate prin flow-citometrie de flux pentru
prezenţa marker-ilor caracteristici MSC precum şi prin teste de diferenţiere, confirmând
că sunt MSC.

10. Testarea sterilităţii patch-urilor prin metoda MCPC, a confirmat sterilitatea acestora,
constituind un instrument rapid şi eficient în testarea bacteriologică.

11. Rezultatele clinice în cazul lotului MSC pozitiv au fost favorabile, subiecţii prezentând
regenerarea defectului realizat.

12. Paraclinic s-a evidenţiat prezenta MSC în ţesutul regenerat, provenit de la aceşti subiecţi.

13. Histologic s-a observat că MSC au contribuit la regenerarea tuturor celor 4 straturi ale
peretelui digestiv.

14. Exceptând regenerarea mucoasei (de tip pluristratificat keratinizat), celelalte trei straturi
digestive au prezentat morfologie normală în cazul lotului MSC pozitiv.

15. În cazul lotului control regenerarea a fost defectuoasă în lipsa MSC, predominând
defectele prin lipsa de substanţă şi cele pseudodiverticulare.

  196 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv                     PARTEA SPECIALĂ 
CONCLUZII      

16. Nu au fost întâlnite complicaţii tumorale asociate utilizării MSC.

17. Rezultatele obţinute atestă beneficiul MSC în regenerarea tubului digestiv.

18. Patch-ul realizat poate constitui o metodă de tratament a pacienţilor cu fistule atent
selecţionaţi, însă pentru moment mai sunt necesare studii de aprofundare.

19. Utilizarea patch-ului la cei doi pacienţi a condus la vindecarea escarelor trenante, cu
obţinerea unor cicatrici de bună calitate.

20. În cazul pacientului diagnosticat cu scleroză multiplă, s-a constatat o evoluţie progresivă,
favorabilă soldată cu remisia disfuncţiei motorii.

21. Deşi nu există o legătură dovedită între rezultatul neurologic şi MSC, rolul acestora de
imunomodulatori poate susţine rezultatul.

22. MSC constituie o alternativă demnă de investigat pe viitor pentru tratamentul escarelor şi
al sclerozei multiple.

  197 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv     ANEXE 
Anexa I 

Anexa I
Protocoalele descrise de Pittenger pentru placarea directă şi izolarea în gradient de densitate a MSC.
(Pittenger 2008)

Reactivi utilizaţi.
1. Tripsină/EDTA: 0.05% tripsină/0.23 mM EDTA
2. Tampon fosfat salin Dulbecco (D-PBS)
3. Gradient de densitate Ficoll sau Percoll 1.073 g/ml
4. Mediu de cultură pentru MSC cu 10% FBS şi antibiotic: 445 ml DMEM cu nivel scăzut de glucoză + 50
ml FCS (stimulator de creştere) pentru MSC + 5 ml amestec antibiotic/antimicotic

Izolarea MSC din aspirat medular prin metoda placării directe.


1. Proba de aspirat medular este diluată cu 3 volume de 2. Se incubează 4-5 zile la 37ºC în mediu
mediu de cultură MSC. Volumul total rezultat se umidificat cu 5% CO2.
împarte egal în câteva flask-uri cu suprafaţa de 75-
80 cm2 (10 ml/flask).
3. Mediul se schimbă la 3 zile. Se aspiră fără a ţine 4. În jurul zilei 5-6 se poate observa apariţia
cont de celulele ce plutesc în el. Acelea reprezintă coloniilor fibroblast-like.
celule non-aderente.
5. După 12-14 zile coloniile au o incidentă crescută şi 6. După aspirarea tripsinei, celule sunt
pot fi subcultivate. Se spălă cultura cu DMEM fără îndepărtate prin spălarea flask-ului cu
ser. Se adăugă 5 ml 0.05% tripsină/0.23 mM EDTA, mediu de cultură. Volumul rezultat se
şi se observă cultura la microscop (în câteva minute împarte în două flask-uri (10 ml/flask) şi
celulele se detaşează). Soluţia de tripsină poate fi se cultivă la 37ºC în mediu umidificat, cu
aspirată din cultură înainte ca celulele să se detaşeze 5% CO2
în întregime sau poate fi inactivată adăugând mediu
de cultură.
7. Înainte de subcultură, densitatea MSC poate fi 8. Supernatantul se îndepărtează lăsând cca
crescută prin centrifugarea amestecului de la punctul 0.5 ml mediu ce acoperă peletul de
5, timp de 5 minute la 800 g şi 20ºCelsius. celule. Peste acesta se adăugă mediu
proaspăt.
9. Celulele continuă să se dividă şi pot fi subcultivate 10. Celulele nu vor fi lăsate să conflueze
la fiecare 7 zile, când ating confluenţa de 75-80%. 100%, deoarece se schimbă proprietăţile
celulelor şi nu se mai divid. Subcultura
celulelor confluente 100% redă
posibilitatea de diviziune, dar celulele
sunt modificate.

Izolarea MSC din aspirat medular prin metoda gradientului de densitate.


1. Proba de aspirat este spălată cu 6-8 volume 2. Fiecare tub este centrifugat 10 minute la 800 g.
D-PBS, în tuburi conice de 50 ml.
3. Supernatantul fiecărui tub este îndepărtat, 4. Cca 4x107 celule/ml (dar nu mai mult de 2x108
iar peletul este resuspendat în 2-3 ml D- celule în 10 ml) se adăugă într-un tub conic de
PBS. Conţinutul tuturor tuburilor se 50 ml ce are la bază 25 ml de Ficoll sau Percoll
combină şi se număra celulele cu 1.073 g/ml. Se centrifughează 30 de minute la
hemocitometrul. 1160 g cu sistemul de frânare oprit, la
temperatura camerei.
5. Stratul superior (aprox. 15-17 ml), ce 6. Fiecare tub se centrifughează 5 minute la 900 g,
conţine celule nucleate, se transferă într-un la temperatura camerei, cu sistemul de frânare
tub nou şi se adăugă două volume D-PBS. pornit.
Se amestecă uşor prin inversie.
7. Supernatantul se aruncă, lăsând cca 1 ml D- 8. Se număra celulele cu hemocitometrul.
PBS să acopere peletul de celule. Se spală
celulele cu 5 ml mediu de cultură.
9. Celulele se însămânţează la o densitate de 10. Celulele se pot pasa după 10-14 zile. după
1.5x105 celule/cm2 şi se incubează la 37ºC primul pasaj celulele se pot hrăni la 3-4 zile şi
în mediu umidificat, cu 5% CO2. Coloniile subcultiva din nou când ating o confluenţă de
vor apărea în 5-7 zile. 75-80%.

  198 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv  ANEXE 
Anexa II 

Anexa II
Izolarea şi cultivarea MSC din ţesut adipos solid şi lipoaspirat. (Dubois 2008)

Prelucrarea ţesutului solid.


1. Fragmentele mari se mărunţesc mecanic, 2. Fragmente de până la 150 mg se pun în
ajungând la dimensiuni de aprox. 150 mg. tuburi de 2 ml, ce conţin 500 µl PBS cald
cu soluţie antibiotic 1%, şi se spală pînă ce
ţesutul conjunctiv şi vasele de sânge se
detaşează.
3. Fragmentele spălate sunt digerate cu soluţie de 4. După digestie, probele se centrifughează 5
colagenază (400 µl soluţie pentru fiecare 150- minute la 300 g la temperatura camerei.
250 mg de ţesut), pe baie de apă la 37ºC sub După centrifugare probele se agită manual
agitaţie continua timp de 60 de minute. şi se recentrifughează.
5. Se îndepărtează supernatantul şi se adaugă cca 6. Se resuspendă celulele în 100 µl mediu
200 µl PBS cald cu 1% BSA. Se centrifughează stromal şi se însămânţează pe placi de
la 300 g 5 minute la temperatura camerei. Se cultură cu 12-24 godeuri care se umplu la
resuspendă celulele în 200 µl mediu stromal şi se capacitate maximă cu mediu de cultură
centrifughează. stromal. Se incubează în mediu umidificat
cu 5% CO2 la 37ºCelsius, timp de 3 zile.
7. Mediul se îndepărtează; cultura se spală cu PBS 8. Mediul se schimbă la fiecare 3 zile până se
cald prin pipetare; se îndepărtează PBS-ul şi se atinge confluenţa de 80-90%
adaugă mediu stromal la capacitatea maximă a
godeului.
9. Pentru recoltare, mediul din godeuri este 10. Se transferă conţinutul godeurilor în tuburi
îndepărtat; cultura se spală cu 250-500 µl PBS; de 2 ml şi se centrifughează la 300 g 5
se îndepărtează PBS-ul şi se adaugă 500 µl minute; se resuspendă celulele în 250 µl
soluţie de tripsină-EDTA 0,5%; se incubează 5- mediu stromal.
10 minute; se adaugă 500 µl de mediu stromal
când s-au detaşat 90% din celule.
11. Se număra celulele după care se pot reînsămânţa
sau utiliza.

Prelucrarea lipoaspiratului.
1. Se adaugă circa 35 de ml de lipoaspirat în câte un 2. Se adaugă un volum de 70 ml de
flask de 225 cm2, peste care se adaugă în volum colagenază caldă în flask; se incubează pe
egal de PBS cald. Se agită bine şi se lasă să se baie de apa 60 de minute la 37ºC sub
separe fazele pentru 3-5 minute. Se îndepărtează agitaţie continuă.
infranatantul şi se repetă spălarea până se obţine
un infranatant clar.
3. După digestie, probele se centrifughează 5 minute 4. Se îndepărtează stratul lipidic şi cel de
la 300 g la temperatura camerei. După centrifugare colagenază ce acoperă peletul celular,
probele se agită manual şi se recentrifughează. care se resuspendă în 10 ml PBS cald cu
1% BSA şi se transferă în tuburi conice
de 50 ml care se centrifughează la 300 g 5
minute la temperatura camerei.
5. Se resuspendă celulele în 10 µl mediu stromal şi se 6. Se resuspendă celulele în 10 µl mediu
centrifughează la 300 g 5 minute la temperatura stromal şi se însămânţează în flask-uri de
camerei. 225 cm2 (2.5 ml de suspensie celulară +
37,5 ml mediu stromal în fiecare flask).
Se incubează în mediu umidificat cu 5%
CO2 la 37ºCelsius, timp de 3 zile.
7. Mediul se îndepărtează după 2 zile; cultura se 8. Mediul se schimbă la fiecare 3 zile până
spală cu PBS cald; se îndepărtează PBS-ul şi se se atinge confluenţa de 80-90%
adaugă mediu stromal la capacitatea iniţială.
9. Pentru recoltare, mediul din godeuri este 10. Se transferă conţinutul flask-ului în tuburi
îndepărtat; cultura se spală cu 10 ml PBS; se de 50 ml şi se centrifughează la 300 g 5
îndepărtează PBS-ul şi se adaugă 10 ml soluţie de minute; se resuspendă celulele în 2 ml
tripsină-EDTA 0,5%; se incubează 5-10 minute; se mediu stromal.
adaugă 10ml de mediu stromal când s-au detaşat

  199 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv  ANEXE 
Anexa II 

90% din celule.


11. Se număra celulele după care se pot reînsămânţa
sau utiliza.

  200 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv  ANEXE 
Anexa III 

Anexa III
Protocoalele de cultură în Cell Factory a MSC. (Wolfe 2008)

Reactivi utilizaţi.
1. αMEM cu L-glutamină, fără ribonucleozide şi deoxiribonucleozide
2. Ser fetal bovin (FBS)
3. L-glutamină, 200 mM
4. Penicilina G (10000 UI/ml) şi streptomicină sulfat (10000 µg/ml) în soluţie de NaCl 0.85%
5. Ficoll-Paque
6. Tampon fosfat salin (PBS), fără Ca++ şi Mg++, ph 7.4
7. Tripsină (0.25%) - EDTA.4NA (0.38 g/L) în HBSS
8. Albastru Trypan 0.4 %
9. Hank’s balanced Salt Solution (HBSS) w/o Ca++ şi Mg++

Mediu de cultură CCM (complete culture medium): 500 ml αMEM, 100 ml FSB (concentraţie finală
aprox. 16.5%), 6 ml L-glutamină (concentraţie finală 2 mM) şi 6 ml penicilină G şi streptomicină sulfat
(concentraţie finala 100 UI/ml penicilină şi 100 µg/ml streptomicină). Se sterilizează prin filtrare la 0.22
µ.

Protocol de izolare (din aspirat medular) şi cultură a MSC umane în Cell Factory.
1. Aspiratul medular recoltat este stocat în eprubete 2. Conţinutul fiecărei eprubete este
Vacutainer de 10 ml anticoagulate cu heparină transferat într-un flacon conic de 50 ml
sodică ce conţin 3 ml de αMEM. Se stochează la şi diluat cu 1xHBSS, până la un volum
gheaţă pe durata transportului. total de cca 15 ml.
3. Fiecare Vacutainer este clătit de două ori cu câte 5 4. Pentru fiecare tub conic cu aspirat se va
ml 1 x HBSS, iar lichidul obţinut se amestecă cu pregăti un tub conic de 50 ml ce conţine
aspiratul diluat. 10 ml de Ficoll (interfaţa de separare) la
temperatura camerei.
5. Cu grijă, se aşează aspiratul peste stratul de Ficoll. 6. Se centrifughează 30 de minute la 1800
g cu sistemul de frânare oprit (dacă
sistemul de frânare nu este oprit,
decelerarea brusca va amesteca
conţinutul separat).
7. După centrifugare, se colectează stratul de celule de 8. Se diluează fiecare tub cu 1 x HBSS,
la interfaţa Ficoll-HBSS, şi se transferă într-un tub până la un volum de 25 ml (raţie de 3:1,
conic de 50 ml. Se va aspira în cantităţi mici pentru volum diluant:volum probă), şi se
a nu transfera şi Ficoll-ul. amestecă prin întoarcere de circa 3-5
ori.
9. Se centrifughează 10 minute la 1000 g cu frâna 10. Se îndepărtează supernatantul, iar
oprită. celulele se resuspendă în 30 ml CCM
preîncălzit.
11. Se transferă celulele în flask-uri de 15 sau 175 cm2 12. Se incubează celulele la 37ºC şi
atmosferă umedă cu 5% CO2, timp de
18-24 ore, pentru aderare.
13. După 24 ore se îndepărtează mediul de cultură şi 14. Se spală celulele de 3 ori cu 10 ml de 1
celulele neaderente prin aspirare. Dacă se întârzie, x PBS preîncălzit.
celule stem hematopoietice aderă şi contaminează
cultura.
15. Se adăugă 30 ml CCM proaspăt în fiecare flask şi se 16. Dacă celulele vor fi expansionate în
incubează la 37ºC şi atmosfera umeda cu 5% CO2, Cell Factory, aceasta trebuie pregătită
timp 5-10 zile. Se examinează cultura zilnic la cu 48 de ore înainte de transfer. Se
microscop. Se schimbă mediul la fiecare 3 zile, se condiţionează prin incubare 48 de ore la
spală cultura cu 10 ml de 1 x PBS preîncălzit care se 37ºC şi atmosferă umedă cu 5% CO2.
arunca şi se adăugă alţi 30 ml CCM. Se continuă
până ce se atinge confluenţa de 60-80%. Nu se va
obţine confluenţă 100%, deoarece alterează
fenotipul.
17. În vederea transferului, se îndepărtează mediul de 18. După ce 80-90% din celulele aderente
cultură şi se clăteşte flask-ul cu 30 ml PBS care se s-au detaşat, flask-ul se agită uşor
arunca. Se adăugă 10 ml de soluţie de Tripsina- pentru recuperarea celulelor restante. Se

  201 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv  ANEXE 
Anexa III 

EDTA preîncălzită ce se distribuie uniform pe toată adaugă 10 ml CCM. Se agită şi se


suprafaţa flask-ului şi se incubează 2-5 minute la transferă conţinutul într-un tub conic de
37ºCelsius. 50 ml. Se clăteşte flask-ul cu 30 ml 1 x
PBS care se adaugă peste conţinutul
transferat.
19. Se centrifughează 10 minute la 480 g cu frâna oprită. 20. Se îndepărtează supernatantul şi se
suspendă celulele în 1-2 ml PBS sau
HBSS
21. Se numără celule cu hemocitometrul şi se determină 22. Se însămânţează celulele după
viabilitatea. numărare, la o densitate de 60-100
celule/cm2. Se pot cultiva în “siguranţă”
timp de 4-5 pasaje.

Protocol de cultură în Cell Factory (sistem deschis).


1. Se prepară 1.2 L CCM. Se stochează în baie 2. Din suspensia de celule destinate însămânţării,
de apă la 37ºCelsius, până la utilizare. se transferă 300.000 sau 600.000 de celule
peste mediul CCM (1.2 L). Se acoperă vasul şi
se omogenizează uşor fără a forma bule de aer.
3. Se umple modulul de cultură Cell Factory cu 4. Se incubează modulul în mediu umidificat cu
celulele aflate în mediul CCM, conform 5% CO2 la 37ºCelsius, timp de 5-10 zile,
specificaţiilor producătorului. verificându-se zilnic la microscop.
5. La fiecare 3 zile, mediul se schimbă cu 1.2 L 6. Se continuă incubaţia până la atingerea
CCM proaspăt, preîncălzit. confluenţei de 60-80%.
7. Pentru recoltare, se îndepărtează volumul de 8. Se adaugă 200 ml PBS cald.
1.2 L CCM.
9. Se agită uşor modulul, pentru o spălare 10. Se îndepărtează PBS-ul din modul.
uniformă.
11. Se adaugă în modul 200 ml tripsină 0.25% cu 12. Se opreşte reacţia când 90% din celule s-au
1 mM EDTA, preîncălzită, şi se incubează 2- desprins, prin adăugarea a 200 ml CCM
5 minute. preîncălzit şi omogenizarea uniforma a
amestecului din modul.
13. Se evacuează conţinutul într-un vas steril de 14. Se spală modulul cu 200 ml PBS, ce se adaugă
1L. în vasul de 1L.
15. Se împarte volumul din vasul de 1L, în 4 16. Se centrifughează la 480 g timp de 10 minute,
tuburi conice de 200 ml fiecare. la temperatura camerei cu sistemul de frânare
oprit.
17. Supernatantul din fiecare tub este îndepărtat. 18. Se combină conţinutul celor 4 tuburi conice
Peletul de celule se resuspenda în 2 ml CCM într-unul singur. Fiecare tub se clăteşte cu 25
sau HBSS, agitându-se cu pipeta de 10-15 ori. ml CCM sau HBSS şi se adaugă peste
suspensia de celule.
19. Se centrifughează la 480 g timp de 10 minute, 20. Se aruncă supernatantul iar celule se
la temperatura camerei cu sistemul de frânare resuspendă în 1-2 ml CCM sau HBSS şi se
oprit. numără.

  202 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv  ANEXE 
Anexa III 

Fig. III.1. Utilizarea modulului Nunc Cell Factory în sistem deschis.

Cultura în Cell Factory (sistem închis).

În sistemul închis, condiţiile de cultură sunt similare celor din sistemul deschis. Diferenţa o face faptul că
toate manevrele de schimbare a mediului se fac conectând şi sigilând la modul pungi preumplute (cu substanţele
necesare) sau de evacuare, astfel încât se limitează contactul culturii cu exteriorul.

  203 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv  ANEXE 
Anexa III 

Fig. III.2. Aspectul unui ansamblu Cell Factory în sistem închis.

  204 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv  ANEXE 
Anexa IV 
Dilated Cardiomyopathy 2 studies
Disorders of Environmental Origin 7 studies
Anexa IV Dry Eye Syndromes 1 study
Dyslipidemias 1 study
Embolism 1 study
Gama de afecţiuni pentru care sunt citate trial-uri Embolism and Thrombosis 1 study
ce utilizează MSC pe http://www.clinicaltrial.gov. Emphysema 1 study
Endocrine System Diseases 11 studies
(Health 2010) Epidermolysis Bullosa 1 study
Erectile Dysfunction 1 study
Acute Disease 1 study Eye Diseases 1 study
Acute Lymphoblastic Leukemia 5 studies Fibrosis 6 studies
Acute Myelocytic Leukemia 4 studies Fistula 1 study
Acute Myeloid Leukemia, Adult 4 studies Follicular Lymphoma 2 studies
Acute Non Lymphoblastic Leukemia 4 studies Foot Ulcer 3 studies
Amyotrophic Lateral Sclerosis 2 studies Fractures, Bone 3 studies
Anemia 2 studies Fractures, Open 1 study
Anemia, Refractory 1 study Fractures, Ununited 1 study
Anemia, Refractory, with Excess of Blasts 1 study Ganglion Cysts 2 studies
Ankylosis 1 study Gastroenteritis 5 studies
Arterial Occlusive Diseases 4 studies Gastrointestinal Diseases 7 studies
Arteriosclerosis 3 studies Genetic Diseases, Inborn 5 studies
Arthritis 7 studies Genital Diseases, Male 1 study
Arthritis, Rheumatoid 1 study Genital Neoplasms, Male 1 study
Atherosclerosis 1 study Gestational Trophoblastic Disease 1 study
Atrophy 1 study Gestational Trophoblastic Neoplasms 1 study
Autoimmune Diseases 12 studies Glomerulonephritis 1 study
Autoimmune Diseases of the Nervous System 4 studies Glucose Metabolism Disorders 8 studies
B-cell Lymphomas 2 studies Graft vs Host Disease 15 studies
Basal Ganglia Diseases 2 studies Heart Diseases 17 studies
Blast Crisis 2 studies Heart Failure 7 studies
Blood Coagulation Disorders 1 study Hematologic Diseases 6 studies
Blood Protein Disorders 1 study Hematologic Neoplasms 2 studies
Bone Cancer 2 studies Hemorrhagic Disorders 1 study
Bone Diseases 9 studies Hemostatic Disorders 1 study
Bone Diseases, Developmental 2 studies Hepatic Insufficiency 2 studies
Bone Diseases, Metabolic 1 study Hodgkin Disease 3 studies
Bone Marrow Diseases 5 studies Hodgkin Lymphoma 3 studies
Bone Neoplasms 2 studies Homologous Wasting Disease 15 studies
Brain Diseases 4 studies Hypercholesterolemia 1 study
Brain Infarction 2 studies Hyperlipidemias 1 study
Brain Ischemia 2 studies Hyperlipoproteinemia Type 2 1 study
Breast Neoplasms 2 studies Hyperlipoproteinemia Type II 1 study
Bronchial Diseases 1 study Hyperlipoproteinemias 1 study
Bronchitis 1 study Hypertension 1 study
Bronchitis, Chronic 1 study Idiopathic Dilated Cardiomyopathy 1 study
Burkitt Lymphoma 2 studies Immunoproliferative Disorders 3 studies
Burns 1 study Infarction 10 studies
Cardiomegaly 2 studies Inflammation 1 study
Cardiomyopathies 3 studies Inflammatory Bowel Diseases 5 studies
Cardiomyopathy, Dilated 2 studies Insulin Resistance 1 study
Cartilage Diseases 2 studies Intestinal Diseases 6 studies
Central Nervous System Diseases 8 studies Ischemia 17 studies
Cerebral Infarction 2 studies Joint Diseases 9 studies
Cerebrovascular Disorders 2 studies Kidney Diseases 2 studies
Chronic Disease 1 study Lacrimal Apparatus Diseases 1 study
Chronic Lymphocytic Leukemia 3 studies Late Acute Graft Versus Host Disease 15 studies
Chronic Myeloid Leukemia 3 studies Leg Injuries 2 studies
Chronic Myelomonocytic Leukemia 2 studies Leg Ulcer 4 studies
Chronic Neutrophilic Leukemia 2 studies Leukemia 7 studies
Collagen Diseases 2 studies Leukemia, B-Cell 1 study
Congenital Abnormalities 4 studies Leukemia, B-cell, Chronic 2 studies
Connective Tissue Diseases 7 studies Leukemia, Lymphocytic, Chronic, B-Cell 3 studies
Coronary Artery Disease 3 studies Leukemia, Lymphoid 5 studies
Coronary Disease 3 studies Leukemia, Myelogenous, Chronic, BCR-ABL Positive 4 studies
Crohn Disease 5 studies Leukemia, Myeloid 5 studies
Degenerative Motor System Disease 2 studies Leukemia, Myeloid, Accelerated Phase 3 studies
Demyelinating Autoimmune Diseases, CNS 4 studies Leukemia, Myeloid, Acute 5 studies
Demyelinating Diseases 4 studies Leukemia, Myeloid, Chronic, Atypical, BCR-ABL Negative 2
Depression 1 study studies
Depressive Disorder 1 study Leukemia, Myeloid, Chronic-Phase 3 studies
Diabetes Complications 3 studies Leukemia, Myelomonocytic, Chronic 2 studies
Diabetes Mellitus 11 studies Leukemia, Neutrophilic, Chronic 2 studies
Diabetes Mellitus, Type 1 5 studies Lipid Metabolism Disorders 1 study
Diabetes Mellitus, Type 2 2 studies Lipid Metabolism, Inborn Errors 1 study
Diabetic Angiopathies 3 studies Liver Cirrhosis 6 studies
Diabetic Foot 3 studies Liver Diseases 7 studies
Diabetic Neuropathies 3 studies Liver Failure 2 studies
Diffuse Scleroderma 1 study Lung Diseases 1 study
Digestive System Diseases 14 studies Lung Diseases, Obstructive 1 study

  205 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv  ANEXE 
Anexa IV 
Lupus Erythematosus, Systemic 2 studies Parkinson Disease 1 study
Lupus Nephritis 2 studies Parkinsonian Disorders 1 study
Lymphatic Diseases 3 studies Pathological Conditions, Anatomical 3 studies
Lymphoblastic Lymphoma 2 studies Periodontal Diseases 1 study
Lymphoma 4 studies Periodontitis 1 study
Lymphoma, B-Cell 2 studies Peripheral Vascular Diseases 1 study
Lymphoma, B-Cell, Marginal Zone 2 studies Phlebitis 1 study
Lymphoma, Follicular 2 studies Postphlebitic Syndrome 1 study
Lymphoma, Large B-Cell, Diffuse 2 studies Postthrombotic Syndrome 1 study
Lymphoma, Large-cell 2 studies Precancerous Conditions 4 studies
Lymphoma, Large-Cell, Immunoblastic 2 studies Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma 5 studies
Lymphoma, Mantle-Cell 2 studies Preleukemia 6 studies
Lymphoma, Non-Hodgkin 3 studies Prostatic Diseases 1 study
Lymphoma, Small Cleaved-cell, Diffuse 2 studies Prostatic Neoplasms 2 studies
Lymphoproliferative Disorders 3 studies Pseudarthrosis 1 study
Mantle Cell Lymphoma 2 studies Pulmonary Disease, Chronic Obstructive 1 study
Menopause 1 study Pulmonary Emphysema 1 study
Mental Disorders 1 study Quality of Life 1 study
Metabolic Diseases 9 studies Recurrence 3 studies
Metabolism, Inborn Errors 1 study Respiration Disorders 1 study
Motor Neuron Disease 2 studies Respiratory Tract Diseases 1 study
Mouth Diseases 2 studies Respiratory Tract Infections 1 study
Movement Disorders 2 studies Rheumatic Diseases 7 studies
Multiple Myeloma 3 studies Salivary Gland Diseases 2 studies
Multiple Sclerosis 4 studies Scleroderma, Diffuse 1 study
Multiple Sclerosis, Chronic Progressive 2 studies Scleroderma, Systemic 1 study
Multiple Sclerosis, Relapsing-Remitting 1 study Sclerosis 7 studies
Multiple System Atrophy 1 study Sepsis 1 study
Multiple Trauma 1 study Sexual Dysfunction, Physiological 1 study
Musculoskeletal Diseases 17 studies Sexual Dysfunctions, Psychological 1 study
Myelodysplastic Syndromes 6 studies Shock 1 study
Myelofibrosis 2 studies Sideroblastic Anemia Pyridoxine-refractory Autosomal Recessive
Myeloid Metaplasia 2 studies 1 study
Myeloproliferative Disorders 3 studies Sjogren's Syndrome 1 study
Myocardial Infarction 8 studies Skin Abnormalities 1 study
Myocardial Ischemia 12 studies Skin Diseases 6 studies
Necrosis 9 studies Skin Diseases, Genetic 1 study
Neonatal Hemochromatosis 3 studies Skin Diseases, Vesiculobullous 1 study
Neoplasm Metastasis 9 studies Skin Ulcer 4 studies
Neoplasms, Germ Cell and Embryonal 2 studies Spinal Cord Diseases 4 studies
Neoplasms, Glandular and Epithelial 2 studies Spinal Cord Injuries 2 studies
Neoplasms, Plasma Cell 3 studies Stomatognathic Diseases 2 studies
Nephritis 2 studies Stroke 2 studies
Neuritis 1 study Systemic Inflammatory Response Syndrome 1 study
Neuroblastoma 2 studies Testicular Cancer 2 studies
Neurodegenerative Diseases 4 studies Testicular Neoplasms 2 studies
Neuroectodermal Tumors 3 studies Thrombosis 1 study
Neuroectodermal Tumors, Primitive 3 studies Tibial Fractures 2 studies
Neuroectodermal Tumors, Primitive, Peripheral 3 studies Trauma, Nervous System 2 studies
Neuroepithelioma 3 studies Trophoblastic Neoplasms 1 study
Neuromuscular Diseases 2 studies Ulcer 4 studies
Optic Neuritis 1 study Urogenital Neoplasms 2 studies
Osteoarthritis 6 studies Urologic Diseases 2 studies
Osteochondritis 1 study Varicose Ulcer 1 study
Osteochondritis Dissecans 1 study Varicose Veins 1 study
Osteochondrodysplasias 2 studies Vascular Diseases 19 studies
Osteogenesis Imperfecta 3 studies Venous Insufficiency 1 study
Osteonecrosis 4 studies Venous Thrombosis 1 study
Osteoporosis 1 study Ventricular Dysfunction 4 studies
Osteoporosis, Postmenopausal 1 study Ventricular Dysfunction, Left 4 studies
Ovarian Epithelial Cancer 2 studies Wounds and Injuries 7 studies
Paraproteinemias 1 study Xerostomia 1 stud

  206 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv  ANEXE 
Anexa V 

Anexa V
Protocol anestezic pentru şobolani de laborator.

* perioada de latenţă – 3-8 minute minute după administrarea complexului anestezic ketamină/ xylazină

* durată ≈ 120 minute

Medicamentaţie Ruta de
administrare
Halotan (Narcotan®, Zentiva As) sau sevofluran (Sevorane®, Abbott Laboratories INHALATOR
LTD.) 4-5 % + O2 4 L/min. timp de 2-3 minute
Atropină (Sulfat de atropină® 1mg/ ml, Biofarm S.A.) 0.1 mg SUBCUTANAT
Ketamină (Ketamine Panapharma® 250mg/5ml, Panapharma) 80 mg/kg corp INTRAMUSCULAR
Xylazină (Xyla® 20 mg/ml, Phoenix Pharmaceutical) 7mg/kg corp INTRAMUSCULAR
Soluţie salină (Ser fiziologic® 0.9 %, Sicomed), glucoză (Glucoza 5%, Sicomed), sau SUBCUTANAT
Voluven® (Fresenius Kabi Gmbh) cald (37ºC) 2.5 ml/subiect

  207 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv  BIBLIOGRAFIE 
 
Benayahu D. [et al.] Bone marrow-derived stromal cell line expressing osteoblastic
phenotype in vitro and osteogenic capacity in vivo [Journal] // J.Cell Physiol. - 1989. - Vol.

BIBLIOGRAFIE 140. - pp. 1-7.


Bianco P, Robey P G and Simmons P J Mesenchymal stem cells: revisiting history,
concepts, and assays [Journal] // Cell Stem Cell. - 04 10, 2008. - Vol. 2. - pp. 313-319.
Bianco P [et al.] Postnatal skeletal stem cells [Journal] // Methods Enzymol. - 0 0, 2006. -
[Online] // Garland Science. - 07 28, 2010. - Vol. 419. - pp. 117-148.
http://www.garlandscience.com/textbooks/cbl/pdflibrary/stemcells_timeline.pdf. Bittira B. [et al.] Mobilization and homing of bone marrow stromal cells in myocardial
[Online] // TimeToast. - 07 28, 2010. - http://www.timetoast.com/timelines/21127. infarction [Journal] // Eur.J.Cardiothorac.Surg. - 2003. - Vol. 24. - pp. 393-398.
[Online] // Explore Stem Cells. - 07 10, 2010. - Bobis S Jarocha D, Majka M. Mesenchymal stem cells: characteristics and clinical
http://www.explorestemcells.co.uk/HistoryStemCellResearch.html. applications. [Journal] // Folia Histochem Cytobiol.. - 2006;. - pp. 44(4):215-30.
"Stem" [Online] // Merriam-Webster Online Dictionary. - October 1, 2009a. - October 1, Boiret Nathalie [et al.] Characterization of nonexpanded mesenchymal progenitor cells from
2009a. - http://www.merriam-webster.com/dictionary/stem. normal adult human bone marrow. [Journal] // Exp Hematol. - 2005. - Vol. 33. - pp. 219-225.
"Stem" [Online] // Dictionary.com. - 2009b. - October 1, 2009b. - Bonyadi Mortaza [et al.] Mesenchymal progenitor self-renewal deficiency leads to age-
http://dictionary.reference.com/browse/stem. dependent osteoporosis in Sca-1/Ly-6A null mice. [Journal] // Proc Natl Acad Sci U S A. -
Abdallah BM, Kassem M. Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical 2003. - Vol. 100. - pp. 5840-5845.
applications. Gene Ther 2008; 15:109-116. Brack A S [et al.] Increased Wnt signaling during aging alters muscle stem cell fate and
Adams G B [et al.] Therapeutic targeting of a stem cell niche [Journal] // Nat Biotechnol. - increases fibrosis [Journal] // Science. - 08 10, 2007. - Vol. 317. - pp. 807-810.
02 0, 2007. - Vol. 25. - pp. 238 -243. Breitbach M [et al.] Potential risks of bone marrow cell transplantation into infarcted hearts
Aggarwal S and Pittenger M F Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic [Journal] // Blood. - 08 15, 2007. - Vol. 110. - pp. 1362-1369.
immune cell responses [Journal] // Blood. - 02 15, 2005. - Vol. 105. - pp. 1815-1822. Bremer S et al. The use of embryonic stem cells for regulatory developmental toxicity
Alexandru V. Albisor D., Coroiu V., Craciunescu O., Moldovan L, Survival and adhesion testing in vitro — the current status of test development. [Journal] // Curr Pharm Des. -
of fibroblasts seeded on different collagenous materials. [Journal] // Romanian Biological 2004. - pp. 10:2733-2747.
Sciences,. - 2007. - pp. V, 1-2, 1-2. Brighton CT et al. The pericyte as a possible osteoblast progenitor cell. [Journal] // Clin
Allay J A [et al.] LacZ and interleukin-3 expression in vivo after retroviral transduction of Orthop Relat Res. - 1992. - pp. 287-299.
marrow-derived human osteogenic mesenchymal progenitors [Journal] // Hum.Gene Ther. - Bruder S. P. [et al.] Mesenchymal stem cell surface antigen SB-10 corresponds to activated
08 10, 1997. - Vol. 8. - pp. 1417-1427. leukocyte cell adhesion molecule and is involved in osteogenic differentiation. [Journal] // J
Allen TD Ultrastructural aspects of in vitro haemopoiesis. - [s.l.] : Cambridge university Bone Miner Res. - 1998. - Vol. 13. - pp. 655-663.
Press, 1978. - p. 217. Bruder S. P., Jaiswal N. and Haynesworth S. E. Growth kinetics, self-renewal, and the
Alsalameh Saifeddin [et al.] Identification of mesenchymal progenitor cells in normal and osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive
osteoarthritic human articular cartilage. [Journal] // Arthritis Rheum. - 2004. - Vol. 50. - pp. subcultivation and following cryopreservation. [Journal] // J Cell Biochem. - 1997. - Vol.
1522-1532. 64. - pp. 278-294.
Angoulvant D [et al.] Human mesenchymal stem cells suppress induction of cytotoxic Butler D L and Awad H A Perspectives on cell and collagen composites for tendon repair
response to alloantigens [Journal] // Biorheology. - 0 0, 2004. - Vol. 41. - pp. 469-476. [Journal] // Clin.Orthop.Relat Res. - 10 0, 1999. - pp. S324-S332.
Anker S Pieternella S [et al.] Mesenchymal stem cells in human second-trimester bone Calvi L M [et al.] Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche [Journal] //
marrow, liver, lung, and spleen exhibit a similar immunophenotype but a heterogeneous Nature. - 10 23, 2003. - Vol. 425. - pp. 841-846.
multilineage differentiation potential. [Journal] // Haematologica. - 2003. - Vol. 88. - pp. 845- Campagnoli C. [et al.] Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-
852. trimester fetal blood, liver, and bone marrow. [Journal] // Blood. - 2001. - Vol. 98. - pp.
Anna C H [et al.] Expression of potential beta-catenin targets, cyclin D1, c-Jun, c-Myc, E- 2396-2402.
cadherin, and EGFR in chemically induced hepatocellular neoplasms from B6C3F1 mice Caplan A I and Bruder S P Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular
[Journal] // Toxicol Appl Pharmacol. - 07 15, 2003. - Vol. 190. - pp. 135-145. medicine in the 21st century [Journal] // Trends Mol.Med. - 06 0, 2001. - Vol. 7. - pp. 259-
Aprahamian M, Damgé C, Kerr-Conte J et al. In vitro resistance of artificial connective 264.
tissues to human bile and pancreatic juice. Biomaterials 1992; 13:697-703. Caplan A I and Dennis J E Mesenchymal stem cells as trophic mediators [Journal] // J.Cell
Arbab A S [et al.] In Vivo Cellular Imaging for Translational Medical Research [Journal] // Biochem. - 08 01, 2006. - Vol. 98. - pp. 1076-1084.
Curr Med Imaging Rev. - 02 01, 2009. - Vol. 5. - pp. 19-38. Caplan A I Review: mesenchymal stem cells: cell-based reconstructive therapy in
Arey LB Developmental anatomy: A textbook and laboratory manual of embryology, 7th ed. orthopedics [Journal] // Tissue Eng. - 07 0, 2005. - Vol. 11. - pp. 1198-1211.
[Book]. - Philadelphia : WB Saunders, 1974. Caplan A. I. [et al.] Principles of cartilage repair and regeneration. [Journal] // Clin Orthop
Asari S [et al.] Mesenchymal stem cells suppress B-cell terminal differentiation [Journal] // Relat Res. - 1997. - pp. 254-269.
Exp Hematol. - 05 0, 2009. - Vol. 37. - pp. 604-615. Caplan AI Mesenchymal stem cells. [Journal] // J Orthop Res. - 1991. - pp. 9:641-650.
Athanasou N A [et al.] Origin of marrow stromal cells and haemopoietic chimaerism Castro-Malaspina H [et al.] Characterization of human bone marrow fibroblast colony-
following bone marrow transplantation determined by in situ hybridisation [Journal] // forming cells (CFU-F) and their progeny [Journal] // Blood. - 08 0, 1980. - Vol. 56. - pp. 289-
Br.J.Cancer. - 03 0, 1990. - Vol. 61. - pp. 385-389. 301.
Awad H A [et al.] Autologous mesenchymal stem cell-mediated repair of tendon [Journal] // Caterson E J [et al.] Three-dimensional cartilage formation by bone marrow-derived cells
Tissue Eng. - 06 0, 1999. - Vol. 5. - pp. 267-277. seeded in polylactide/alginate amalgam [Journal] // J Biomed Mater Res. - 12 0, 2001. - Vol.
Awad H A [et al.] In vitro characterization of mesenchymal stem cell-seeded collagen 57. - pp. 394-403.
scaffolds for tendon repair: effects of initial seeding density on contraction kinetics Chamberlain G [et al.] Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype,
[Journal] // J Biomed Mater Res. - 08 0, 2000. - Vol. 51. - pp. 233-240. differentiation capacity, immunological features, and potential for homing [Journal] // Stem
Back Jonathan [et al.] PU.1 determines the self-renewal capacity of erythroid progenitor Cells. - 11 0, 2007. - Vol. 25. - pp. 2739-2749.
cells. [Journal] // Blood. - 2004. - Vol. 103. - pp. 3615-3623. Chamberlain Joel R [et al.] Gene targeting in stem cells from individuals with osteogenesis
Badiavas Evangelos V and Falanga Vincent Treatment of chronic wounds with bone imperfecta. [Journal] // Science. - 2004. - Vol. 303. - pp. 1198-1201.
marrow-derived cells. [Journal] // Arch Dermatol. - 2003. - Vol. 139. - pp. 510-516. Chan J [et al.] Widespread distribution and muscle differentiation of human fetal
Baddoo Melody [et al.] Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine mesenchymal stem cells after intrauterine transplantation in dystrophic mdx mouse
bone marrow by negative selection. [Journal] // J Cell Biochem. - 2003. - Vol. 89. - pp. 1235- [Journal] // Stem Cells. - 04 0, 2007. - Vol. 25. - pp. 875-884.
1249. Chapman AR [et al.] Stem Cell Research and Applications - Monitoring the Frontiers of
Badylak SF The extracellular matrix as a biologic scaffold material. [Journal] // Biomedical Research , Produced by the American Association for the Advancement of
Biomaterials. - 2007 Sep;. - Vols. 28(25):3587-93. - pp. 28(25):3587-93. Science and Institute for Civil Society, Nov. 1999.
Badylak S [et al.] Resorbable bioscaffold for esophageal repair in a dog model. J Pediatr Charge S B and Rudnicki M A Cellular and molecular regulation of muscle regeneration
Surg 2000; 35:1097-1103. [Journal] // Physiol Rev. - 01 0, 2004. - Vol. 84. - pp. 209-238.
Ball L M [et al.] Cotransplantation of ex vivo expanded mesenchymal stem cells accelerates Chavakis E, Urbich C and Dimmeler S Homing and engraftment of progenitor cells: a
lymphocyte recovery and may reduce the risk of graft failure in haploidentical hematopoietic prerequisite for cell therapy [Journal] // J Mol Cell Cardiol. - Oct 2008. - Vol. 45. - pp. 514-
stem-cell transplantation [Journal] // Blood. - 10 01, 2007. - Vol. 110. - pp. 2764-2767. 522.
Banfi A [et al.] Proliferation kinetics and differentiation potential of ex vivo expanded Chen J [et al.] Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal
human bone marrow stromal cells: Implications for their use in cell therapy [Journal] // Exp cells after cerebral ischemia in rats [Journal] // Stroke. - 04 0, 2001. - Vol. 32. - pp. 1005-
Hematol. - 06 0, 2000. - Vol. 28. - pp. 707-715. 1011.
Barry F P Biology and clinical applications of mesenchymal stem cells [Journal] // Birth Chen J. [et al.] Primitive hematopoietic stem cell function in vivo is uniquely high in the
Defects Res.C.Embryo.Today. - 08 0, 2003. - Vol. 69. - pp. 250-256. CXB-12 mouse strain. [Journal] // Blood.- 2000.- Vol. 96. - pp. 4124-4131.
Barry F P [et al.] The monoclonal antibody SH-2, raised against human mesenchymal stem Chen MK, Beierle EA Animal models for intestinal tissue engineering. Biomaterials 2004;
cells, recognizes an epitope on endoglin (CD105) [Journal] // 25:1675-1681.
Biochem.Biophys.Res.Commun. - 11 0, 1999. - Vol. 265. - pp. 134-139. Chen MK, Badylak SF Small bowel tissue engineering using small intestinal submucoasa as
Bartholomew A [et al.] Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro a scaffold. J Surg Res 2001; 99:352-358.
and prolong skin graft survival in vivo [Journal] // Exp Hematol. - 01 0, 2002. - Vol. 30. - pp. Chen SS [et al.] Multilineage differentiation of rhesus monkey embryonic stem cells in
42-48. three-dimensional culture systems. Stem Cells 2003; 21:281-295.
Bartholomew A. [et al.] Baboon mesenchymal stem cells can be genetically modified to Cheng L. [et al.] Human adult marrow cells support prolonged expansion of human
secrete human erythropoietin in vivo [Journal] // Hum.Gene Ther. - 2001. - Vol. 12. - pp. embryonic stem cells in culture [Journal] // Stem Cells. - 2003. - Vol. 21. - pp. 131-142.
1527-1541. Chopp Michael and Li Yi Treatment of neural injury with marrow stromal cells. [Journal] //
Barzilay R et al. Introducing Transcription Factors to Multipotent Mesenchymal Stem Cells- Lancet Neurol. - 2002. - Vol. 1. - pp. 92-100.
Making Transdifferentiation Possible. [Journal] // Stem Cell. - 2009. - p. Epub ahead of print. Chuah M K [et al.] Long-term persistence of human bone marrow stromal cells transduced
Batorsky A [et al.] Encapsulation of adult human mesenchymal stem cells within collagen- with factor VIII-retroviral vectors and transient production of therapeutic levels of human
agarose microenviroments. Biotechnol Bioeng 2005; 92:492-500. factor VIII in nonmyeloablated immunodeficient mice [Journal] // Hum.Gene Ther. - 03 20,
Battula V L [et al.] Isolation of functionally distinct mesenchymal stem cell subsets using 2000. - Vol. 11. - pp. 729-738.
antibodies against CD56, CD271, and mesenchymal stem cell antigen-1 [Journal] // Chung SY [et al.] Bladder reconstitution with bone marrow derived stem cells seeded on
Haematologica. - 02 0, 2009. - Vol. 94. - pp. 173-184. small intestinal submucosa improves morphological and molecular composition. J Urol 2005;
Baxter M.A. [et al.] Retrovirally mediated correction of bone marrow-derived mesenchymal 174:353-359.
stem cells from patients with mucopolysaccharidosis type I [Journal] // Blood. - 2002. - Vol. Cilloni D [et al.] Limited engraftment capacity of bone marrow-derived mesenchymal cells
99. - pp. 1857-1859. following T-cell-depleted hematopoietic stem cell transplantation [Journal] // Blood. - 11 15,
Beck G R, Zerler B and Moran E Phosphate is a specific signal for induction of 2000. - Vol. 96. - pp. 3637-3643.
osteopontin gene expression [Journal] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 07 0, 2000. - Vol. 97. - Clarke M F and Fuller M Stem cells and cancer: two faces of eve [Journal] // Cell. - 03 24,
pp. 8352-8357. 2006. - Vol. 124. - pp. 1111-1115.
Belema-Bedada F [et al.] Efficient homing of multipotent adult mesenchymal stem cells Cogle C R [et al.] Bone marrow transdifferentiation in brain after transplantation: a
depends on FROUNT-mediated clustering of CCR2 [Journal] // Cell Stem Cell. - 06 05, retrospective study [Journal] // Lancet. - 05 01, 2004. - Vol. 363. - pp. 1432--1437.
2008. - Vol. 2. - pp. 566-575. Cognet Minguell JJ Phenotypical and functional properties of human bone marrow
Beltrami A P [et al.] Multipotent cells can be generated in vitro from several adult human mesenchymal progenitor cells. [Journal] // J Cell Physiol. - 1999. - Vol. 181. - pp. 67-73.
organs (heart, liver, and bone marrow) [Journal] // Blood. - 11 01, 2007. - Vol. 110. - pp. Cole R et al. Cytodifferentiation and embryogenesis in cell colonies and tissue cultures
3438-3446. derived from ova and blastocysts of the rabbit [Journal] // Dev. Biol. - 1966. - pp. 13(3):385-
Bennett J H [et al.] Adipocytic cells cultured from marrow have osteogenic potential 407.
[Journal] // J.Cell Sci. - 05 0, 1991. - Vol. 99 ( Pt 1). - pp. 131-139.

  208 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv  BIBLIOGRAFIE 
 
Colter D. C. [et al.] Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent Edwards RG Steptoe PC, Purdy JM Establishing full-term human pregnancies using
cells from human bone marrow. [Journal] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2000. - Vol. 97. - cleaving embryos grown in vitro. [Journal] // Rr J Obstet Gynaecol.. - 1980. - pp. 87(9):737-
pp. 3213-3218. 56.
Colter D. C., Sekiya I. and Prockop D. J. Identification of a subpopulation of rapidly self- EGE (European Group on Ethics in Science and New Technologies), Ethical aspects of
renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. human stem cells research and use; Reference: Initiative of the Group; Rapporteurs: Anne
[Journal] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2001. - Vol. 98. - pp. 7841-7845. McLaren and Göran Hermerén, 14 Nov. 2000
Conboy IM Rando TA. Aging, stem cells and tissue regeneration: lessons from muscle. Egusa Hiroshi [et al.] Neuronal differentiation of bone marrow-derived stromal stem cells
[Journal] // Cell Cycle. 2005 Mar;4(3):407-10. Epub 2005 Mar 7. - 2005 Mar;. - pp. 4(3):407- involves suppression of discordant phenotypes through gene silencing. [Journal] // J Biol
10. Chem. - 2005. - Vol. 280. - pp. 23691-23697.
Cong Z. [et al.] Repairing segmental bone defects with living porous ceramic cylinders: an Eliopoulos N [et al.] Allogeneic marrow stromal cells are immune rejected by MHC class I-
experimental study in dog femora [Journal] // J.Biomed.Mater.Res. - 2001. - Vol. 55. - pp. and class II-mismatched recipient mice [Journal] // Blood. - 12 15, 2005. - Vol. 106. - pp.
28-32. 4057-4065.
Corcione A [et al.] Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions [Journal] // Enomoto-Iwamoto Motomi [et al.] The Wnt antagonist Frzb-1 regulates chondrocyte
Blood. - 01 01, 2006. - Vol. 107. - pp. 367-372. maturation and long bone development during limb skeletogenesis. [Journal] // Dev Biol. -
Craciunescu O. Balan M., Gaspar A., Stefan L., Moldovan L, Preparation and 2002. - Vol. 251. - pp. 142-156.
characterization of porous collagen-agarose sponges for skin repair, [Journal] // Romanian Episkopou V. SOX2 functions in adult neural stem cells [Journal] // Trends Neurosci. -
Biological Sciences,. - 2007. - pp. V, 1-2, 29-30. 2005. - Vol. 28. - pp. 219-221.
Craciunescu [et al.] The characterization and in vitro testing of a dermal shield containing Evans M. J. and Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from
soluble elastin. [Journal] // Rev Roum Biol. - 2004. - pp. 2, 105-111. mouse embryos. [Journal] // Nature. - 1981. - pp. 292:154-156.
da Silva Meirelles L, Caplan A I and Nardi N B In search of the in vivo identity of Evans GS [et al.] The development of a method for the preparation of rat intestinal epithelial
mesenchymal stem cells [Journal] // Stem Cells. - 09 0, 2008. - Vol. 26. - pp. 2287-2299. cell primary cultures. J Cell Sci 1992; 101:219-231.
da Silva Meirelles L, Chagastelles P C and Nardi N B Mesenchymal stem cells reside in Falanga,V. [et al.] Autologous bone marrow-derived cultured mesenchymal stem cells
virtually all post-natal organs and tissues [Journal] // J Cell Sci. - 06 01, 2006. - Vol. 119. - delivered in a fibrin spray accelerate healing in murine and human cutaneous wounds.
pp. 2204-2213. [Journal] // Tissue Eng. - 2007/06//. - Vol. 13. - pp. 1299- 1312.
Daar A S [et al.] Stem cell research and transplantation: science leading ethics [Journal] // Fearon E R and Vogelstein B A genetic model for colorectal tumorigenesis [Journal] //
Transplant Proc. - 10 0, 2004. - Vol. 36. - pp. 2504-2506. Cell. - 06 01, 1990. - Vol. 61. - pp. 759-767.
Daley G Q and Scadden D T Prospects for stem cell-based therapy [Journal] // Cell. - 02 22, Feng Z [et al.] Investigation on the mechanical proprieties of contracted collagen gels as a
2008. - Vol. 132. - pp. 544-548. scaffold for tissue engineering. Artif Organs 2003; 27:84-91.
Dazzi Francesco [et al.] The role of mesenchymal stem cells in haemopoiesis. [Journal] // Fernández M Simon V, Herrera G, Cao C, Del Favero H, Minguell JJ. Detection of
Blood Rev. - 2006. - Vol. 20. - pp. 161-171. stromal cells in peripheral blood progenitor cell collections from breast cancer patients.
de Bari Cosimo [et al.] Skeletal muscle repair by adult human mesenchymal stem cells from [Journal] // Bone Marrow Transplant. - 1997. - Vol. 20. - pp. 265-271.
synovial membrane. [Journal] // J Cell Biol. - 2003. - Vol. 160. - pp. 909-918. Fibbe Willem E and Noort Willy A Mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cell
de Becker A [et al.] Migration of culture-expanded human mesenchymal stem cells through transplantation. [Journal] // Ann N Y Acad Sci. - 2003. - Vol. 996. - pp. 235-244.
bone marrow endothelium is regulated by matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of Foster K [et al.] Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult
metalloproteinase-3 [Journal] // Haematologica. - 04 0, 2007. - Vol. 92. - pp. 440-449. thymus [Journal] // J Immunol. - 03 01, 2008. - Vol. 180. - pp. 3183-3189.
de Bont E S [et al.] Mobilized human CD34+ hematopoietic stem cells enhance tumor Fraidenraich D et al. Rescue of cardiac defects in id knockout embryos by injection of
growth in a nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mouse model of human embryonic stem cells. [Journal] // Science. - 2004. - pp. 306(5694):247-52.
non-Hodgkin's lymphoma [Journal] // Cancer Res. - 10 15, 2001. - Vol. 61. - pp. 7654-7659. Francois S [et al.] Local irradiation not only induces homing of human mesenchymal stem
de Bruijn JD van den Brink I, Mendes S, Dekker R, Bovell YP, van Blitterswijk CA. cells at exposed sites but promotes their widespread engraftment to multiple organs: a study
Bone induction by implants coated with cultured osteogenic bone marrow cells. [Journal] // of their quantitative distribution after irradiation damage [Journal] // Stem Cells. - 04 0,
Adv Dent Res.. - 1999 Jun;. - pp. 13:74-81. 2006. - Vol. 24. - pp. 1020-1029.
de Coppi P [et al.] Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy [Journal] // Francois S [et al.] Human mesenchymal stem cells favour healing of the cutaneous radiation
Nat Biotechnol. - 01 0, 2007. - Vol. 25. - pp. 100-106. syndrome in a xenogenic transplant model. [Journal] // Ann Hematol. - 01, 2007. - Vol. 86. -
de la Fuente SG [et al.] Evaluation of porcine-derived small intestine submucosa as a pp. 1-8.
biodegradable graft for gastrointestinal healing. J Gastrointest Surg 2003; 7:96-101. Frangioni J V and Hajjar R J In vivo tracking of stem cells for clinical trials in
Dellavalle A. [et al.] Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct cardiovascular disease [Journal] // Circulation. - 11 23, 2004. - Vol. 110. - pp. 3378-3383.
from satellite cells [Journal] // Nat.Cell Biol. - 2007. - Vol. 9. - pp. 255-267. Frank S A and Nowak M A Cell biology: Developmental predisposition to cancer
Demirbilek S [et al.] Using porcine small intestinal submucoasa in intestinal regeneration. [Journal] // Nature. - 04 03, 2003. - Vol. 422. - pp. 494-145.
Pediatr. Surg. Int. 2003; 19:588. Freyman T [et al.] A quantitative, randomized study evaluating three methods of
Dennis J and Caplan, AI Bone morrow mesenchymal stem cell. [Book Section] // stem cell mesenchymal stem cell delivery following myocardial infarction [Journal] // Eur Heart J. - 05
handbook / book auth. Stewart Sell. - Totowa, NJ : Humana Press Inc., 2004. 0, 2006. - Vol. 27. - pp. 1114-1122.
Dennis J E [et al.] A quadripotential mesenchymal progenitor cell isolated from the marrow Friedenstein A. J., Gorskaja J. F. and Kulagina N. N. Fibroblast precursors in normal and
of an adult mouse [Journal] // J.Bone Miner.Res. - 05 0, 1999. - Vol. 14. - pp. 700-709. irradiated mouse hematopoietic organs. [Journal] // Exp Hematol. - 1976. - Vol. 4. - pp. 267-
Dennis J E [et al.] The STRO-1+ marrow cell population is multipotential [Journal] // Cells 274.
Tissues.Organs. - 0 0, 2002. - Vol. 170. - pp. 73-82. Friedenstein A.J., Chailakhjan R.K. and Lalykina K.S. The development of fibroblast
Dennis J E and Charbord P Origin and differentiation of human and murine stroma colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells [Journal] // Cell
[Journal] // Stem Cells. - 0 0, 2002. - Vol. 20. - pp. 205-214. Tissue Kinet. - 1970. - Vol. 3. - pp. 393-403.
Dennis J E and Caplan A I Differentiation potential of conditionally immortalized Fu X [et al.] Enhanced wound-healing quality with bone marrow mesenchymal stem cells
mesenchymal progenitor cells from adult marrow of a H-2Kb-tsA58 transgenic mouse autografting after skin injury. Wound Rep Reg 2006; 14:325-335.
[Journal] // J.Cell Physiol. - 06 0, 1996. - Vol. 167. - pp. 523-538. Galmiche MC et al. Stromal cells from human long-term marrow cultures are mesenchymal
Department of Health and Human Services. Stem Cells: Scientific Progress and Future cells that differentiate following a vascular smooth muscle differentiation pathway.
Research Directions. [Report] : [Journal] // Blood. - 1993. - pp. 82:66-76.
http://stemcells.nih.gov/staticresources/info/scireport/PDFs/appendixe.pdf. - 2001. García-Olmo D [et al.] A phase I clinical trial of the treatment of Crohn's fistula by adipose
Deryugina EI Müller-Sieburg CE. Stromal cells in long-term cultures: keys to the mesenchymal stem cell transplantation. Dis Colon Rectum 2005; 48:1416-1423.
elucidation of hematopoietic development? [Journal] // Crit Rev Immunol.. - 1993;. - pp. Gardner RL Mouse chimeras obtained by the injection of cells into the blastocyst.
13(2):115-50. [Journal] // Nature. - 1968. - pp. 220(5167):596-7.
Devine S. M. and Hoffman R. Role of mesenchymal stem cells in hematopoietic stem cell Gasbarrini A [et al.] Rescue therapy by portal infusion of autologous stem cells in a case of
transplantation. [Journal] // Curr Opin Hematol. - 2000. - Vol. 7. - pp. 358-363. drug-induced hepatitis [Journal] // Dig.Liver Dis. - 09 0, 2007. - Vol. 39. - pp. 878-882.
Dexter T M, Allen T D and Lajtha L G Conditions controlling the proliferation of Gelovani Juri Noninvasive imaging in stem cell therapies. Curent state and future
haemopoietic stem cells in vitro [Journal] // J.Cell Physiol. - 06 0, 1977. - Vol. 91. - pp. 335- perspectives. [Book Section] // Stem Cells Handbook / book auth. Sell S. - Totowa, NJ :
344. Humana Press Inc., 2004.
Dexter TM Stromal cell associated haemopoiesis. [Journal] // J Cell Physiol Suppl. - 1982. - Giacomini M, Baylis F and Robert J Banking on it: public policy and the ethics of stem
pp. ;1:87-94. cell research and development [Journal] // Soc Sci Med. - 10 0, 2007. - Vol. 65. - pp. 1490-
Dezawa M Ishikawa H, Itokazu Y, Yoshihara T, Hoshino M, Takeda S, Ide C, 1500.
Nabeshima Y. Bone marrow stromal cells generate muscle cells and repair muscle Gleiberman AS Michurina T Genetic approaches identify adult pituitary stem cells. - 0 0,
degeneration. [Journal] // Science.. - 2005 Jul 8;. - pp. 309(5732):314-7. 2008. - pp. 6332-6337.
Dezawa M. [et al.] Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro Glennie Sarah [et al.] Bone marrow mesenchymal stem cells induce division arrest anergy
differentiated bone-marrow stromal cells [Journal] // Eur.J.Neurosci. - 2001. - Vol. 14. - pp. of activated T cells. [Journal] // Blood. - 2005. - Vol. 105. - pp. 2821-2827.
1771-1776. Goetz M [et al.] In vivo confocal laser endomicroscopy of the human liver: a novel method
di Nicola M [et al.] Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation for assessing liver microarchitecture in real time [Journal] // Endoscopy. - 07 0, 2008. - Vol.
induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli [Journal] // Blood. - 05 15, 2002. - Vol. 40. - pp. 554-562.
99. - pp. 3838-3843. Goldman R. Spector D. Live cell imaging. A laboratory manual [Book]. - Cold Spring
Dimos JT et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be Harbour, NY : Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2005.
differentiated into motor neurons. [Journal] // Science. - 2008. - pp. 21(5893):1218-21. Gordon E M [et al.] Capture and expansion of bone marrow-derived mesenchymal
D'Ippolito Gianluca [et al.] Marrow-isolated adult multilineage inducible (MIAMI) cells, a progenitor cells with a transforming growth factor-beta1-von Willebrand's factor fusion
unique population of postnatal young and old human cells with extensive expansion and protein for retrovirus-mediated delivery of coagulation factor IX [Journal] // Hum.Gene
differentiation potential [Journal] // J Cell Sci. - 06 0, 2004. - Vol. 117. - pp. 2971-2981. Ther. - 07 20, 1997. - Vol. 8. - pp. 1385-1394.
Direkze N C [et al.] Bone marrow contribution to tumor-associated myofibroblasts and Graham V. [et al.] SOX2 functions to maintain neural progenitor identity [Journal] //
fibroblasts [Journal] // Cancer Res. - 12 01, 2004. - Vol. 64. - pp. 8492-8495. Neuron. - 2003. - Vol. 39. - pp. 749-765.
Djouad Farida [et al.] Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor Greco S J and Rameshwar P Microenvironmental considerations in the application of
growth in allogeneic animals. [Journal] // Blood. - 2003. - Vol. 102. - pp. 3837-3844. human mesenchymal stem cells in regenerative therapies [Journal] // Biologics. - 12 0,
Doherty MJ et al. Vascular pericytes express osteogenic potential in vitro and in vivo. 2008. - Vol. 2. - pp. 699-705.
[Journal] // J Bone Miner Res. - 1998. - pp. 13:828-838. Gregory Carl A [et al.] The Wnt signaling inhibitor dickkopf-1 is required for reentry into
Dominici M. [et al.] Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. the cell cycle of human adult stem cells from bone marrow. [Journal] // J Biol Chem. -
The International Society for Cellular Therapy position statement [Journal] // Cytotherapy. - 2003. - Vol. 278. - pp. 28067-28078.
2006. - Vol. 8. - pp. 315-317. Grinnemo K H [et al.] Xenoreactivity and engraftment of human mesenchymal stem cells
Dounchis J S [et al.] Cartilage repair with autogenic perichondrium cell and polylactic acid transplanted into infarcted rat myocardium [Journal] // J Thorac Cardiovasc Surg. - 05 0,
grafts [Journal] // Clin.Orthop.Relat Res. - 08 0, 2000. - pp. 248-264. 2004. - Vol. 127. - pp. 1293-1300.
Doyonnas [et al.] What is the future for stem cell research. [Book Section] // Stem Cell Groh M E [et al.] Human mesenchymal stem cells require monocyte-mediated activation to
Handbook. / book auth. S.Sell. - Totowa, NJ : Humana Press Inc., 2004. suppress alloreactive T cells [Journal] // Exp.Hematol. - 08 0, 2005. - Vol. 33. - pp. 928-934.
Dubois et al. S Isolation of human adipose+derived stem cells from biopsies and liposuction Gronthos S [et al.] Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem
specimens [Book Section] // Methods in Molecular Biology / ed. DJ BA Bunnell. - [s.l.] : cells derived from human bone marrow [Journal] // J Cell Sci. - 05 01, 2003. - Vol. 116. - pp.
Humana Press, 2008. 1827-1835.
Eder V [et al.] Gamma irradiation induces acetylcholine-evoked, endothelium-independent Gronthos S. [et al.] Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal
relaxation and activates K-channels of isolated pulmonary artery of rats [Journal] // Int J cells. [Journal] // J Cell Physiol. - 2001. - Vol. 189. - pp. 54-63.
Radiat.Oncol Biol Phys. - 12 01, 2004. - Vol. 60. - pp. 1530-1537. Gronthos S [et al.] Stem cell properties of human dental pulp stem cells [Journal] //
J.Dent.Res. - 08 0, 2002. - Vol. 81. - pp. 531-535.

  209 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv  BIBLIOGRAFIE 
 
Gronthos S. [et al.] The STRO-1+ fraction of adult human bone marrow contains the Jones E and McGonagle D Human bone marrow mesenchymal stem cells in vivo
osteogenic precursors [Journal] // Blood. - 1994. - Vol. 84. - pp. 4164-4173. [Journal] // Rheumatology. (Oxford). - 02 0, 2008. - Vol. 47. - pp. 126-131.
Gruh I & Martin, U Transdifferentiation of stem cells: a critical view. [Journal] // Adv. Joyner A L and Zervas M Genetic inducible fate mapping in mouse: establishing genetic
Biochem. Eng. Biotechnol. - 2009. - pp. 114:73-106. lineages and defining genetic neuroanatomy in the nervous system [Journal] // Dev.Dyn. - 09
Ham AW and Harris, WR Repair and transplantation of bone. [Book Section] // The 0, 2006. - Vol. 235. - pp. 2376-2385.
biochemstry and physiology of bone: Development and Growth. / book auth. Bourne GH. - Kadiyala S [et al.] Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess
New York : Academic, 1971. osteochondrogenic potential in vivo and in vitro [Journal] // Cell Transplant. - 03 0, 1997. -
Han SK [et al.] Potential of human bone marrow stromal cells to accelerate wound healing Vol. 6. - pp. 125-134.
in vitro. Ann Plast Surg 2005; 55:414-419. Kajitani M [et al.] Use of a new elastin patch and glue for repair of a major duodenal injury.
Hanada K, Dennis J E and Caplan A I Stimulatory effects of basic fibroblast growth factor ASAIO J 2000; 46:409-414.
and bone morphogenetic protein-2 on osteogenic differentiation of rat bone marrow-derived Kang L et al. iPS cells can support full-term development of tetraploid blastocyst-
mesenchymal stem cells [Journal] // J Bone Miner Res. - 0 0, 1997. - Vol. 12. - pp. 1606- complemented embryos. [Journal] // Cell Stem Cell. - 2009. - pp. 5(2):135-8.
1614. Karp J M and Leng Teo G S Mesenchymal stem cell homing: the devil is in the details
Hanahan D and Folkman J Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch [Journal] // Cell Stem Cell. - 03 06, 2009. - Vol. 4. - pp. 206-216.
during tumorigenesis [Journal] // Cell. - 08 09, 1996. - Vol. 86. - pp. 353-364. Katz Adam J [et al.] Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-
Hanna J [et al.] Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from derived adherent stromal (hADAS) cells. [Journal] // Stem Cells. - 2005. - Vol. 23. - pp. 412-
autologous skin [Journal] // Science. - 12 21, 2007. - Vol. 318. - pp. 1920-1923. 423.
Haynesworth S E [et al.] Characterization of cells with osteogenic potential from human Kawada H [et al.] Nonhematopoietic mesenchymal stem cells can be mobilized and
marrow [Journal] // Bone. - 0 0, 1992a. - Vol. 13. - pp. 81-88. differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction [Journal] // Blood. - 12 01,
Haynesworth S E, Baber M A and Caplan A I Cell surface antigens on human marrow- 2004. - Vol. 104. - pp. 3581-3587.
derived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies [Journal] // Bone. - 0 0, Keating A [et al.] Donor origin of the in vitro haematopoietic microenvironment after
1992b. - Vol. 13. - pp. 69-80. marrow transplantation in man [Journal] // Nature. - 07 15, 1982. - Vol. 298. - pp. 280-283.
Haynesworth S E, Baber M A and Caplan A I Cytokine expression by human marrow- Keilhoff Gerburg [et al.] Transdifferentiation of mesenchymal stem cells into Schwann cell-
derived mesenchymal progenitor cells in vitro: effects of dexamethasone and IL-1 alpha like myelinating cells. [Journal] // Eur J Cell Biol. - 2006. - Vol. 85. - pp. 11-24.
[Journal] // J.Cell Physiol. - 03 0, 1996. - Vol. 166. - pp. 585-592. Khosla S and Eghbali-Fatourechi G Z Circulating cells with osteogenic potential
Harmon JW [et al.] Fate of Dacron prostheses in the small bowel of rabbits. Surg Forum [Journal] // Ann N Y Acad Sci. - 04 0, 2006. - Vol. 1068. - pp. 489-497.
1979; 30:365-366. Kim D [et al.] In vivo tracking of human mesenchymal stem cells in experimental stroke
He Q, Wan C and Li G Concise review: multipotent mesenchymal stromal cells in blood [Journal] // Cell Transplant. - 0 0, 2008. - Vol. 16. - pp. 1007-1012.
[Journal] // Stem Cells. - 01 0, 2007. - Vol. 25. - pp. 69-77. Kinnaird T [et al.] Marrow-derived stromal cells express genes encoding a broad spectrum
He T C [et al.] Identification of c-MYC as a target of the APC pathway [Journal] // of arteriogenic cytokines and promote in vitro and in vivo arteriogenesis through paracrine
Science. - 09 04, 1998. - Vol. 281. - pp. 1509-1512. mechanisms [Journal] // Circ Res. - 03 19, 2004. - Vol. 94. - pp. 678-685.
Health National Institute of Search of: mesenchymal stem cells [Online] // Koc O N [et al.] Allogeneic mesenchymal stem cell infusion for treatment of metachromatic
http://clinicaltrials.gov. - 08 13, 2010. - leukodystrophy (MLD) and Hurler syndrome (MPS-IH) [Journal] // Bone Marrow
http://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=mesenchymal+stem+cells. Transplant. - 08 0, 2002. - Vol. 30. - pp. 215-222.
Heng Boon Chin [et al.] Strategies for directing the differentiation of stem cells into the Koc O N [et al.] Rapid hematopoietic recovery after coinfusion of autologous-blood stem
osteogenic lineage in vitro. [Journal] // J Bone Miner Res. - 2004. - Vol. 19. - pp. 1379-1394. cells and culture-expanded marrow mesenchymal stem cells in advanced breast cancer
Hernigou P [et al.] Percutaneous autologous bone-marrow grafting for nonunions. Influence patients receiving high-dose chemotherapy [Journal] // J Clin Oncol. - 01 0, 2000. - Vol. 18. -
of the number and concentration of progenitor cells [Journal] // J Bone Joint Surg Am. - 07 0, pp. 307-316.
2005. - Vol. 87. - pp. 1430-1437. Kogler G [et al.] A new human somatic stem cell from placental cord blood with intrinsic
Hernigou Philippe and Beaujean Françoise Treatment of osteonecrosis with autologous pluripotent differentiation potential [Journal] // J Exp Med. - 07 19, 2004. - Vol. 200. - pp.
bone marrow grafting. [Journal] // Clin Orthop Relat Res. - 2002. - pp. 14-23. 123-135.
Herzog Erica L, Chai Li and Krause Diane S Plasticity of marrow-derived stem cells Kohyama J [et al.] Brain from bone: efficient "meta-differentiation" of marrow stroma-
[Journal] // Blood. - 0 0, 2003. - Vol. 102. - pp. 3483-3493. derived mature osteoblasts to neurons with Noggin or a demethylating agent [Journal] //
Hicok KC Thomas T, Gori F, Rickard DJ, Spelsberg TC, Riggs BL. Development and Differentiation. - 10 0, 2001. - Vol. 68. - pp. 235--244.
characterization of conditionally immortalized osteoblast precursor cell lines from human Kolf CM Cho E, Tuan RS. Mesenchymal stromal cells. Biology of adult mesenchymal stem
bone marrow stroma. [Journal] // J Bone Miner Res.. - 1998 Feb;13. - pp. (2):205-17. cells: regulation of niche, self-renewal and differentiation. [Journal] // Arthritis Res Ther.. -
Hoffmann A [et al.] The T-box transcription factor Brachyury mediates cartilage 2007;. - p. 9(1):204.
development in mesenchymal stem cell line C3H10T1/2 [Journal] // Journal of Cell Science Komori M [et al.] Efficiency of bone marrow-derived cells in regeneration of the stomach
115,. - (2002). - pp. 769-781. after induction of ethanol-induced ulcers in rats. J Gastroenterol 2005; 40:591-599.
Hofman DI [et al.] Cryopreseved embryos in the United States and their availability for Kopen G. C., Prockop D. J. and Phinney D. G. Marrow stromal cells migrate throughout
research. [Journal] // Fertil. Steril. - 2003. - pp. 79:1063-1069. forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal
Hollands P Differentiation and grafting of haemopoietic stem cells from early mouse brains. [Journal] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1999. - Vol. 96. - pp. 10711-10716.
postimplantation mouse embryos. [Journal] // Development. - 1987. - pp. 99(1):69-76. Koster M.I. [et al.] p63 is the molecular switch for initiation of an epithelial stratification
Honczarenko Marek [et al.] Human bone marrow stromal cells express a distinct set of program [Journal] // Genes Dev. - 2004. - Vol. 18. - pp. 126-131.
biologically functional chemokine receptors. [Journal] // Stem Cells. - 2006. - Vol. 24. - pp. Kraft H J [et al.] Oct-4 regulates alternative platelet-derived growth factor alpha receptor
1030-1041. gene promoter in human embryonal carcinoma cells [Journal] // J Biol Chem. - 05 31, 1996. -
Hooper A F and Hart N H Foundations of animal develoment, 2 ed. - [s.l.] : Oxford Vol. 271. - pp. 12873-12878.
University Press, 0 0, 1985. - pp. 585-592. Kraitchman D L [et al.] Dynamic imaging of allogeneic mesenchymal stem cells trafficking
Horwitz E M [et al.] Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society to myocardial infarction [Journal] // Circulation. - 09 06, 2005. - Vol. 112. - pp. 1451-1461.
for Cellular Therapy position statement [Journal] // Cytotherapy. - 0 0, 2005. - Vol. 7. - pp. Krampera Mauro [et al.] Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of
393-395. naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide. [Journal] // Blood. -
Horwitz E. M. [et al.] Transplantability and therapeutic effects of bone marrow-derived 2003. - Vol. 101. - pp. 3722-3729.
mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfecta. [Journal] // Nat Med. - 1999. - Krebsbach P H [et al.] Bone formation in vivo: comparison of osteogenesis by transplanted
Vol. 5. - pp. 309-313. mouse and human marrow stromal fibroblasts [Journal] // Transplantation. - 04 27, 1997. -
Horwitz Edwin M [et al.] Isolated allogeneic bone marrow-derived mesenchymal cells Vol. 63. - pp. 1059-1069.
engraft and stimulate growth in children with osteogenesis imperfecta: Implications for cell Kucia M [et al.] A population of very small embryonic-like (VSEL) CXCR4(+)SSEA-
therapy of bone. [Journal] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2002. - Vol. 99. - pp. 8932-8937. 1(+)Oct-4+ stem cells identified in adult bone marrow [Journal] // Leukemia. - 05 0, 2006. -
Horwitz E. M. [et al.] Clinical responses to bone marrow transplantation in children with Vol. 20. - pp. 857-869.
severe osteogenesis imperfecta. [Journal] // Blood. - 2001. - Vol. 97. - pp. 1227-1231. Kumar S and Ponnazhagan S Bone homing of mesenchymal stem cells by ectopic alpha 4
Igura K. [et al.] Isolation and characterization of mesenchymal progenitor cells from integrin expression [Journal] // FASEB J. - 12 0, 2007. - Vol. 21. - pp. 3917-3927.
chorionic villi of human placenta. [Journal] // Cytotherapy. - 2004. - Vol. 6. - pp. 543-553. Kuznetsov S A [et al.] Circulating skeletal stem cells [Journal] // J.Cell Biol. - 05 28, 2001. -
Im Gun-Il, Shin Yong-Woon and Lee Kee-Byung Do adipose tissue-derived mesenchymal Vol. 153. - pp. 1133-1140.
stem cells have the same osteogenic and chondrogenic potential as bone marrow-derived Kuznetsov S A [et al.] Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts
cells? [Journal] // Osteoarthritis Cartilage. - 2005. - Vol. 13. - pp. 845-853. form bone after transplantation in vivo [Journal] // J.Bone Miner.Res. - 09 0, 1997. - Vol.
Inoue K. [et al.] The effect of aging on bone formation in porous hydroxyapatite: 12. - pp. 1335-1347.
biochemical and histological analysis. [Journal] // J Bone Miner Res. - 1997. - Vol. 12. - pp. Lajtha L G Haemopoietic stem cells: concept and definitions [Journal] // Blood Cells. - 08 0,
989-994. 1979. - Vol. 5. - pp. 447-455.
Ip J E [et al.] Mesenchymal stem cells use integrin beta1 not CXC chemokine receptor 4 for Lakshmipathy U and Hart R P Concise review: MicroRNA expression in multipotent
myocardial migration and engraftment [Journal] // Mol Biol Cell. - 08 0, 2007. - Vol. 18. - mesenchymal stromal cells [Journal] // Stem Cells. - 02 0, 2008. - Vol. 26. - pp. 356-363.
pp. 2873-2882. Langer R. Tissue engineering: a new field and its challenges. Pharm Res 1997; 14:840-841.
Isch JA [et al.] Patch esophagoplasty using AlloDerm as a tissue scaffold. J Pediatr Surg Lazarus H M [et al.] Cotransplantation of HLA-identical sibling culture-expanded
2001; 36:266-268. mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells in hematologic malignancy patients
ISSCR International Society for Stem Cell Researc Guidelines for the clinical translation [Journal] // Biol Blood Marrow Transplant. - 05 0, 2005. - Vol. 11. - pp. 389-398.
of stem cells [Book]. - 2008. Le Blanc K. [et al.] Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party
Ito T [et al.] Bone marrow is a reservoir of repopulating mesangial cells during glomerular haploidentical mesenchymal stem cells [Journal] // Lancet. - 2004. - Vol. 363. - pp. 1439-
remodeling [Journal] // J Am Soc Nephrol. - 12 0, 2001. - Vol. 12. - pp. 2625-2635. 1441.
Itoh H [et al.] A honeycomb collagen carrier for cell culture as a tissue engineering scaffold. Le Blanc K. and Pittenger M. Mesenchymal stem cells: progress toward promise
Artif Organs 2001; 25:213-217. [Journal] // Cytotherapy. - 2005. - Vol. 7. - pp. 36-45.
Ivanova Natalia B [et al.] A stem cell molecular signature. [Journal] // Science. - 2002. - Lee C C [et al.] Clonal analysis and hierarchy of human bone marrow mesenchymal stem
Vol. 298. - pp. 601-604. and progenitor cells [Journal] // Exp Hematol. - 01 0, 2010. - Vol. 38. - pp. 46--54.
Jain R.K. Molecular regulation of vessel maturation [Journal] // Nat.Med. - 2003. - Vol. 9. - Lee G et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-
pp. 685-693. specific iPSCs. [Journal] // Nature. - 2009. - pp. 461(7262):402-6.
Jaiswal N. [et al.] Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human Lee J Y [et al.] Effect of bone morphogenetic protein-2-expressing muscle-derived cells on
mesenchymal stem cells in vitro. [Journal] // J Cell Biochem. - 1997. - Vol. 64. - pp. 295-312. healing of critical-sized bone defects in mice [Journal] // J.Bone Joint Surg.Am. - 07 0,
Jat P S [et al.] Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 2001. - Vols. 83-A. - pp. 1032-1039.
transgenic mouse [Journal] // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. - 06 15, 1991. - Vol. 88. - pp. 5096- Lee JE Park JC, Hwang YS, Kim JK, Kim JG, Suh H. Characterization of UV-irradiated
5100. dense/porous collagen membranes: morphology, enzymatic degradation, and mechanical
Jeong Y and Mangelsdorf D J Nuclear receptor regulation of stemness and stem cell properties. [Journal] // Yonsei Med J. - 2001 Apr;. - pp. 42(2):172-179..
differentiation [Journal] // Exp Mol Med. - 08 31, 2009. - Vol. 41. - pp. 525-537. Lee Ryang Hwa [et al.] A subset of human rapidly self-renewing marrow stromal cells
Jiang C Y [et al.] Optimal time for mesenchymal stem cell transplantation in rats with preferentially engraft in mice. [Journal] // Blood. - 2006. - Vol. 107. - pp. 2153-2161.
myocardial infarction [Journal] // J Zhejiang.Univ Sci B. - 08 0, 2008. - Vol. 9. - pp. 630-637. Li H Yu B, Zhang Y, Pan Z, Xu W, Li H. Jagged1 protein enhances the differentiation of
Jiang X X [et al.] Human mesenchymal stem cells inhibit differentiation and function of mesenchymal stem cells into cardiomyocytes. [Journal] // Biochem Biophys Res Commun.. -
monocyte-derived dendritic cells [Journal] // Blood. - 05 15, 2005. - Vol. 105. - pp. 4120- 2006 Mar 10;. - pp. 341(2):320-5. Epub 2006 Jan 10.
4126. Li Y [et al.] Treatment of stroke in rat with intracarotid administration of marrow stromal
Jiang Yuehua [et al.] Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. cells [Journal] // Neurology. - 06 26, 2001a. - Vol. 56. - pp. 1666-1672.
[Journal] // Nature. - 2002. - Vol. 418. - pp. 41-49.

  210 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv  BIBLIOGRAFIE 
 
Li Y [et al.] Intracerebral transplantation of bone marrow stromal cells in a 1-methyl-4- Mutter D [et al.] Biomaterial supports for colonic wall defect healing. An experimental
phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson's disease [Journal] // study in the rat. Biomaterials 1996; 17:1411-1415.
Neurosci.Lett. - 12 0, 2001b. - Vol. 316. - pp. 67-70. Nagaya N [et al.] Transplantation of mesenchymal stem cells improves cardiac function in a
Li Q [et al.] Differential expression of CD146 in tissues and endothelial cells derived from rat model of dilated cardiomyopathy [Journal] // Circulation. - 08 23, 2005. - Vol. 112. - pp.
infantile haemangioma and normal human skin [Journal] // J.Pathol. - 10 0, 2003. - Vol. 1128-1135.
201. - pp. 296-302. Nakahara H et al. Culture-expanded periosteal-derived cells exhibit osteochondrogenic
Lieberman J.R. [et al.] The effect of regional gene therapy with bone morphogenetic potential in porous calcium phosphate ceramics in vivo. [Journal] // Clin Orthop Relat Res. -
protein-2-producing bone-marrow cells on the repair of segmental femoral defects in rats 1992. - pp. 291-298.
[Journal] // J.Bone Joint Surg.Am. - 1999. - Vol. 81. - pp. 905-917. Nandoe Tewarie R D [et al.] Bone marrow stromal cells for repair of the spinal cord:
Liu J W [et al.] Characterization of endothelial-like cells derived from human mesenchymal towards clinical application [Journal] // Cell Transplant. - 0 0, 2006. - Vol. 15. - pp. 563--577.
stem cells [Journal] // J Thromb Haemost. - 04 0, 2007. - Vol. 5. - pp. 826-834. Nauta A J [et al.] Donor-derived mesenchymal stem cells are immunogenic in an allogeneic
Longman Letter S [Book Section] // Longman Dictionary of English language and Culture / host and stimulate donor graft rejection in a nonmyeloablative setting [Journal] // Blood. - 09
book auth. Summers D. et al. - Essex : Adsison Wesley Longman, 1998. 15, 2006. - Vol. 108. - pp. 2114-2120.
Loring JF et Wesselschmidt RL Human stem cell Manual [Book]. - [s.l.] : Elsevier, 2007. Nauta A J and Fibbe W E Immunomodulatory properties of mesenchymal stromal cells
Lu Q [et al.] Novel porous aortic elastin and collagen scaffolds for tissue engineering. [Journal] // Blood. - 11 15, 2007. - Vol. 110. - pp. 3499-3506.
Biomaterials 2004; 25:5227-5237. Nerem RM [et al.] Vascular tissue engineering. Annu Rev Biomed Eng 2001; 3:225-243.
Maccario R [et al.] Interaction of human mesenchymal stem cells with cells involved in Neuhuber Birgit [et al.] Axon growth and recovery of function supported by human bone
alloantigen-specific immune response favors the differentiation of CD4+ T-cell subsets marrow stromal cells in the injured spinal cord exhibit donor variations. [Journal] // Brain
expressing a regulatory/suppressive phenotype [Journal] // Haematologica. - 04 0, 2005. - Res. - 2005. - Vol. 1035. - pp. 73-85.
Vol. 90. - pp. 516-525. Ning H [et al.] The correlation between cotransplantation of mesenchymal stem cells and
MacReady N. The murky ethics of stem-cell tourism. [Journal] // The Lancet. - 2009. - pp. higher recurrence rate in hematologic malignancy patients: outcome of a pilot clinical study
10(4):317-8. [Journal] // Leukemia. - 03 0, 2008. - Vol. 22. - pp. 593-599.
Maherali N et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and Nixon A J [et al.] Insulinlike growth factor-I gene therapy applications for cartilage repair
widespread tissue contribution. [Journal] // Cell Stem Cell. - 2007. - pp. 1(1):55-70. [Journal] // Clin.Orthop.Relat Res. - 10 0, 2000. - pp. S201-S213.
Majumdar M K [et al.] Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow- Noël Daniele [et al.] Short-term BMP-2 expression is sufficient for in vivo osteochondral
derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells [Journal] // J.Cell Physiol. - 07 0, differentiation of mesenchymal stem cells. [Journal] // Stem Cells. - 2004. - Vol. 22. - pp. 74-
1998. - Vol. 176. - pp. 57-66. 85.
Makino S. [et al.] Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. North T E [et al.] Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell
[Journal] // J Clin Invest. - 1999. - Vol. 103. - pp. 697-705. homeostasis [Journal] // Nature. - 06 21, 2007. - Vol. 447. - pp. 1007-1011.
Maloney M A and Patt H M Origin in repopulating cells after localized bone marrow North T.E. [et al.] Runx1 is expressed in adult mouse hematopoietic stem cells and
depletion [Journal] // Science. - 07 04, 1968. - Vol. 165. - pp. 71-73. differentiating myeloid and lymphoid cells, but not in maturing erythroid cells [Journal] //
Maloney M A, Lamela R A and Patt H M The question of bone marrow stromal fibroblast Stem Cells. - 2004. - Vol. 22. - pp. 158-168.
traffic [Journal] // Ann.N.Y.Acad.Sci. - 0 0, 1985. - Vol. 459. - pp. 190-197. Nowak J.A. [et al.] Hair follicle stem cells are specified and function in early skin
Mangi Abeel A [et al.] Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and morphogenesis [Journal] // Cell Stem Cell. - 2008. - Vol. 3. - pp. 33-43.
restore performance of infarcted hearts. [Journal] // Nat Med. - 2003. - Vol. 9. - pp. 1195- Ohishi M and Schipani E Bone marrow mesenchymal stem cells [Journal] // J Cell
1201. Biochem. - 02 01, 2010. - Vol. 109. - pp. 277-282.
Markel T A [et al.] Stem cells as a potential future treatment of pediatric intestinal disorders Okamoto T Aoyama T, Nakayama T, Nakamata T, Hosaka T, Nishijo K, Nakamura T,
[Journal] // J Pediatr.Surg. - 11 0, 2008. - Vol. 43. - pp. 1953-1963. Kiyono T, Toguchida J. Clonal heterogeneity in differentiation potential of immortalized
Marko O [et al.] Isolation of a preadipocyte cell line from rat bone marrow and human mesenchymal stem cells. [Article] // Biochem Biophys Res Commun.. - 2002 Jul
differentiation to adipocytes [Journal] // Endocrinology. - 10 0, 1995. - Vol. 136. - pp. 4582- 12;. - 354-61. : Vol. 295(2):.
4588. Okita K, Ichisaka, T & Yamanaka, S Generation of germline-competent induced
Marshman E, Booth C and Potten C S The intestinal epithelial stem cell [Journal] // pluripotent stem cells. [Journal] // Nature. - 2007. - pp. 448(7151):313-7.
Bioessays. - 01 0, 2002. - Vol. 24. - pp. 91-98. Olsen B R, Reginato A M and Wang W Bone development [Journal] // Annu.Rev.Cell
Massagli Teresa L eMedicine Specialties > Physical Medicine and Rehabilitation > Spinal Dev.Biol. - 0 0, 2000. - Vol. 16. - pp. 191-220.
Cord Injury [Online] // emedicine medscape. - 08 19, 2008. - 07 25, 2010. - Omori Y [et al.] Optimization of a therapeutic protocol for intravenous injection of human
http://emedicine.medscape.com/article/322109-overview. mesenchymal stem cells after cerebral ischemia in adult rats [Journal] // Brain Res. - 10 21,
Masuda S [et al.] Cotransplantation with MSCs improves engraftment of HSCs after 2008. - Vol. 1236. - pp. 30-38.
autologous intra-bone marrow transplantation in nonhuman primates [Journal] // Exp Organ GM [et al.] Transplantation of enterocytes utilizing polymer-cell constructs to
Hematol. - 10 0, 2009. - Vol. 37. - pp. 1250-1257. produce a neointestine. Transplant Proc 1992; 24:3011.
Matsunaga T [et al.] Interaction between leukemic-cell VLA-4 and stromal fibronectin is a Orkin S H and Zon L I Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology
decisive factor for minimal residual disease of acute myelogenous leukemia [Journal] // Nat [Journal] // Cell. - 02 22, 2008. - Vol. 132. - pp. 631-644.
Med. - 09 0, 2003. - Vol. 9. - pp. 1158-1165. Orlic D. [et al.] Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. [Journal] // Nature. -
Mayo Patrick R. Fakhreddin Jamali, Methoxyflurane Anesthesia Augments The 2001. - Vol. 410. - pp. 701-705.
Chronotropic And Dromotropic Effects Of Verapamil. [Journal] // J Pharm Pharmaceut Sci. - Osawa M. [et al.] Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-
1999. - pp. 2 (1):30-35, 1999. low/negative hematopoietic stem cell [Journal] // Science. - 1996. - Vol. 273. - pp. 242-245.
Mazo I B [et al.] Total body irradiation causes profound changes in endothelial traffic Owen M Marrow stromal stem cells [Journal] // J Cell Sci Suppl. - 0 0, 1988. - Vol. 10. - pp.
molecules for hematopoietic progenitor cell recruitment to bone marrow [Journal] // Blood. - 63-76.
06 01, 2002. - Vol. 99. - pp. 4182-4191. Owen Maureen Lineage of osteogenic cells and their relationship to the stromal system
McBride C., Gaupp D. and Phinney D. G. Quantifying levels of transplanted murine and [Book Section] // Bone and Mineral Research / book auth. W. Peck. - New York : Elsevier,
human mesenchymal stem cells in vivo by real-time PCR. [Journal] // Cytotherapy. - 2003. - 1985.
Vol. 5. - pp. 7-18. Park I K [et al.] Bmi-1 is required for maintenance of adult self-renewing haematopoietic
McDonald JW et al. Transplanted embryonic stem cells survive, differentiate and promote stem cells [Journal] // Nature. - 05 15, 2003. - Vol. 423. - pp. 302-305.
recovery in injured rat spinal cord. [Journal] // Nature medicine. - 1999. - pp. 5(12):1410-2. Park IH et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. [Journal] // Cell. - 2008. - pp.
McKay R Stem cells in the central nervous system [Journal] // Science. - 04 04, 1997. - Vol. 134(5):877-86.
276. - pp. 66-71. Pechak DG et al. Morphological and histochemical events during first bone formation in
Meisel R [et al.] Human bone marrow stromal cells inhibit allogeneic T-cell responses by embryonic chick limbs. [Journal] // Bone. - 1986. - pp. 7:441-458.
indoleamine 2,3-dioxygenase-mediated tryptophan degradation [Journal] // Blood. - 06 15, Peckys D B [et al.] Nanoscale imaging of whole cells using a liquid enclosure and a scanning
2004. - Vol. 103. - pp. 4619-4621. transmission electron microscope [Journal] // PLoS.One. - 0 0, 2009. - Vol. 4. - pp. e8214-
Menasché P Embryonic stem cells pace the heart. [Journal] // Nature Biotechnology. - 3383.
2004. - pp. 22(10):1237-8. Peifer M and Polakis P Wnt signaling in oncogenesis and embryogenesis-a look outside the
Meyrik B et al. Smooth muscle myosin in precursor and mature smooth muscle cells in nucleus [Journal] // Science. - 03 03, 2000. - Vol. 287. - pp. 1606-1609.
normal pulmonary arteries and the effect of hypoxia. [Journal] // Exp Lung Res.. - 1981. - pp. Pellegrini G Dellambra E p63 identifies keratinocyte stem cells. - 03 13, 2001. - pp. 3156-
2(4):303-13. 3161.
Mikkers H and Frisen J Deconstructing stemness [Journal] // EMBO J. - 08 03, 2005. - Vol. Pereira R F [et al.] Cultured adherent cells from marrow can serve as long-lasting precursor
24. - pp. 2715-2719. cells for bone, cartilage, and lung in irradiated mice [Journal] // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -
Minguell J J, Erices A and Conget P Mesenchymal stem cells [Journal] // Exp.Biol.Med. 05 23, 1995. - Vol. 92. - pp. 4857-4861.
(Maywood.). - 06 0, 2001. - Vol. 226. - pp. 507-520. Pereira R F [et al.] Marrow stromal cells as a source of progenitor cells for
Mishra V.J. et al. Applications of nanomaterials in mesenchymal stem cell engineering. nonhematopoietic tissues in transgenic mice with a phenotype of osteogenesis imperfecta
[Journal] // Digest journal of Nanomaterials and biostructures.. - 2008. - pp. 3,4:203-208. [Journal] // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. - 02 03, 1998. - Vol. 95. - pp. 1142-1147.
Miura M [et al.] Accumulated chromosomal instability in murine bone marrow Perka C [et al.] Segmental bone repair by tissue-engineered periosteal cell transplants with
mesenchymal stem cells leads to malignant transformation [Journal] // Stem Cells. - 04 0, bioresorbable fleece and fibrin scaffolds in rabbits [Journal] // Biomaterials. - 06 0, 2000. -
2006. - Vol. 24. - pp. 1095-1103. Vol. 21. - pp. 1145-1153.
Miura Masako [et al.] SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. [Journal] // Pettis GY et al. Tissue response to composite ceramic hydroxyapatite/demineralized bone
Proc Natl Acad Sci U S A. - 2003. - Vol. 100. - pp. 5807-5812. implants. [Journal] // J Oral Maxillofac Surg. - 1990. - pp. 48:1068-1074.
Mohamadnejad M [et al.] Phase 1 human trial of autologous bone marrow-hematopoietic Picinich S C [et al.] The therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Cell- & tissue-
stem cell transplantation in patients with decompensated cirrhosis [Journal] // World J based therapy [Journal] // Expert.Opin.Biol.Ther. - 07 0, 2007. - Vol. 7. - pp. 965-973.
Gastroenterol. - 06 28, 2007. - Vol. 13. - pp. 3359-3363. Pietrangeli C.E., Hayashi S. and Kincade P.W. Stromal cell lines which support
Moldovan [et al.] Collagen-chondroitin sulfate-hydroxyapatite porous lymphocyte growth: characterization, sensitivity to radiation and responsiveness to growth
composites:preparation, characterization and in vitro biocompatibility testing. [Journal] // factors [Journal] // Eur.J.Immunol. - 1988. - Vol. 18. - pp. 863-872.
Roumanian Biotechnological Letters. - 2009. - pp. Vol. 14, No. 3, pp. 4459-4466. Piscaglia A C Stem cells, a two-edged sword: risks and potentials of regenerative medicine
Moldovan [et al.] Corneal collagen interaction with proteoglycans and glycosaminoglycans. [Journal] // World J Gastroenterol. - 07 21, 2008. - Vol. 14. - pp. 4273-4279.
[Journal] // Roum Biotechn Lett. - 2001. - pp. 6, 2, 137-145. Pittenger M F and DJ Prockop DG p Mesenchymal Stem Cells from adult bone marrow
Moldovan [et al.] Tehnici actuale şi de perspectiva pentru testarea in vitro a [Book Section] // Mesenchymal Stem Cells. Methods and protocols. - [s.l.] : Humana Press,
biocompatibilitatii biomaterialelor colagenice de uz medical [Book Section] // Tehnici 2008.
Experimentale in bioanaliza / book auth. Radu G.L. - [s.l.] : Ed. Printech,, 2007. Pittenger M.F. [et al.] Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells
Montzka K et al. Neural differentiation potential of human bone marrow-derived [Journal] // Science. - 1999. - Vol. 284. - pp. 143-147.
mesenchymal stromal cells: misleading marker gene expression. [Journal] // BMC Neuroci. - Plumas J [et al.] Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells [Journal] //
2009. - p. 10:16. Leukemia. - 09 0, 2005. - Vol. 19. - pp. 1597-1604.
Morigi M [et al.] Mesenchymal stem cells are renotropic, helping to repair the kidney and Potten C S, Owen G and Booth D Intestinal stem cells protect their genome by selective
improve function in acute renal failure [Journal] // J Am Soc Nephrol. - 07 0, 2004. - Vol. segregation of template DNA strands [Journal] // J Cell Sci. - 06 01, 2002. - Vol. 115. - pp.
15. - pp. 1794-1804. 2381-2388.
Mosmann Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to Potten C.S. & Loeffler, M. Stem cells:attributes, cycles, spirals, pitfalls and uncertainties.
proliferation and cytotoxicity assays. [Journal] // J Immunol Methods.. - 1983 Dec 16;. - pp. Lessons for and from the crypt. [Journal] // Development 110. - 1990. - pp. 1001-1020.
65(1-2):55-63. Poulsom R [et al.] Adult stem cell plasticity [Journal] // J.Pathol. - 07 0, 2002. - Vol. 197. -
Muschler G F, Nakamoto C and Griffith L G Engineering principles of clinical cell-based pp. 441-456.
tissue engineering [Journal] // J Bone Joint Surg Am. - 07 0, 2004. - Vols. 86-A. - pp. 1541- Prockop D J Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues [Journal] //
1558. Science. - 04 04, 1997. - Vol. 276. - pp. 71-74.

  211 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv  BIBLIOGRAFIE 
 
Quirici N [et al.] Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells by anti-nerve growth Shibata T [et al.] EBP50, a beta-catenin-associating protein, enhances Wnt signaling and is
factor receptor antibodies [Journal] // Exp Hematol. - 07 0, 2002. - Vol. 30. - pp. 783-791. over-expressed in hepatocellular carcinoma [Journal] // Hepatology. - 07 0, 2003. - Vol. 38. -
Ramalho-Santos Miguel [et al.] "Stemness": transcriptional profiling of embryonic and pp. 178-186.
adult stem cells. [Journal] // Science. - 2002. - Vol. 298. - pp. 597-600. Silberg D.G. [et al.] Cdx1 and cdx2 expression during intestinal development [Journal] //
Ramasamy R [et al.] Mesenchymal stem cells inhibit proliferation and apoptosis of tumor Gastroenterology. - 2000. - Vol. 119. - pp. 961-971.
cells: impact on in vivo tumor growth [Journal] // Leukemia. - 02 0, 2007. - Vol. 21. - pp. Simmons P J and Torok-Storb B CD34 expression by stromal precursors in normal human
304-310. adult bone marrow [Journal] // Blood. - 12 01, 1991. - Vol. 78. - pp. 2848-2853.
Reese J S, Koc O N and Gerson S L Human mesenchymal stem cells provide stromal Simonsen JL Rosada C, Serakinci N, Justesen J, Stenderup K, Rattan SI, Jensen TG,
support for efficient CD34+ transduction [Journal] // J.Hematother.Stem Cell Res. - 10 0, Kassem M. Telomerase expression extends the proliferative life-span and maintains the
1999. - Vol. 8. - pp. 515-523. osteogenic potential of human bone marrow stromal cells. [Journal] // Nat Biotechnol. -. 2002
Reyes M. [et al.] Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal Jun;. - pp. 20(6):592-6.
progenitor cells. [Journal] // Blood. - 2001. - Vol. 98. - pp. 2615-2625. Singh S K [et al.] Identification of human brain tumour initiating cells [Journal] // Nature. -
Rickard D J [et al.] Isolation and characterization of osteoblast precursor cells from human 11 18, 2004. - Vol. 432. - pp. 396-401.
bone marrow [Journal] // J.Bone Miner.Res. - 03 0, 1996. - Vol. 11. - pp. 312-324. Sitges-Serra A [et al.] Management of postoperative enterocutaneous fistulas: the roles of
Rodriguez A M [et al.] Adipocyte differentiation of multipotent cells established from parenteral nutrition and surgery. Br J Surg 1982; 69:147-150.
human adipose tissue [Journal] // Biochem Biophys Res Commun. - 03 05, 2004. - Vol. Sirbu-Boeti M P [et al.] Transplantation of mesenchymal stem cells cultured on biomatrix
315. - pp. 255-263. support induces repairing of digestive tract defects, in animal model [Journal] //
Rolletschek A et al. Embryonic stem cell-derived cardiac, neuronal and pancreatic cells as Chirurgia.(Bucur.). - 01 0, 2009. - Vol. 104. - pp. 55-65.
model systems to study toxicological effects. [Journal] // Toxicol Lett. - 2004. - pp. 149:361- Slack J M Stem cells in epithelial tissues [Journal] // Science. - 02 25, 2000. - Vol. 287. - pp.
369. 1431-1433.
Rombouts W J and Ploemacher R E Primary murine MSC show highly efficient homing to Slack J.M.W. Origin of stem cells in organogenesis // Origin of stem cells in
the bone marrow but lose homing ability following culture [Journal] // Leukemia. - 01 0, organogenesis. - [s.l.] : Science, 2008. - pp. 1498-1501.
2003. - Vol. 17. - pp. 160-170. Solchaga L A [et al.] Hyaluronic acid-based polymers as cell carriers for tissue-engineered
Roni V [et al.] Recruitment of human umbilical vein endothelial cells and human primary repair of bone and cartilage [Journal] // J.Orthop.Res. - 03 0, 1999. - Vol. 17. - pp. 205-213.
fibroblasts into experimental tumors growing in SCID mice [Journal] // Exp Cell Res. - 07 Solchaga L.A. [et al.] Hyaluronan-based polymers in the treatment of osteochondral defects
01, 2003. - Vol. 287. - pp. 28-38. [Journal] // J.Orthop.Res. - 2000. - Vol. 18. - pp. 773-780.
Roorda B D [et al.] Bone marrow-derived cells and tumor growth: contribution of bone Song L [et al.] Identification and functional analysis of candidate genes regulating
marrow-derived cells to tumor micro-environments with special focus on mesenchymal stem mesenchymal stem cell self-renewal and multipotency [Journal] // Stem Cells. - 07 0, 2006. -
cells [Journal] // Crit Rev Oncol Hematol. - 03 0, 2009. - Vol. 69. - pp. 187-198. Vol. 24. - pp. 1707-1718.
Rubio D [et al.] Spontaneous human adult stem cell transformation [Journal] // Cancer Res. - Song Y et al. Transdifferentiation of rat fetal brain stem cells into penile smooth muscle
04 15, 2005. - Vol. 65. - pp. 3035-3039. cells. [Journal] // BJU Int. - 2009. - pp. 104(2):257-62.
Ruster B [et al.] Mesenchymal stem cells display coordinated rolling and adhesion behavior Sotiropoulou P A [et al.] Interactions between human mesenchymal stem cells and natural
on endothelial cells [Journal] // Blood. - 12 01, 2006. - Vol. 108. - pp. 3938-3944. killer cells [Journal] // Stem Cells. - 01 0, 2006. - Vol. 24. - pp. 74-85.
Sacchetti B [et al.] Self-renewing osteoprogenitors in bone marrow sinusoids can organize a Spaggiari G M [et al.] Mesenchymal stem cell-natural killer cell interactions: evidence that
hematopoietic microenvironment [Journal] // Cell. - 10 19, 2007. - Vol. 131. - pp. 324-336. activated NK cells are capable of killing MSCs, whereas MSCs can inhibit IL-2-induced NK-
Sackstein R [et al.] Ex vivo glycan engineering of CD44 programs human multipotent cell proliferation [Journal] // Blood. - 02 15, 2006. - Vol. 107. - pp. 1484-1490.
mesenchymal stromal cell trafficking to bone [Journal] // Nat Med. - 02 0, 2008. - Vol. 14. - Spees Jeffrey L [et al.] Differentiation, cell fusion, and nuclear fusion during ex vivo repair
pp. 181-187. of epithelium by human adult stem cells from bone marrow stroma. [Journal] // Proc Natl
Salem H K and Thiemermann C Mesenchymal Stromal Cells - Current Understanding and Acad Sci U S A. - 2003. - Vol. 100. - pp. 2397-2402.
Clinical Status [Journal] // Stem Cells. - 12 04, 2009. - pp. 841-846. Sperger J M [et al.] Gene expression patterns in human embryonic stem cells and human
Sancho E, Batlle E and Clevers H Signaling pathways in intestinal development and cancer pluripotent germ cell tumors [Journal] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 11 11, 2003. - Vol.
[Journal] // Annu.Rev Cell Dev Biol. - 0 0, 2004. - Vol. 20. - pp. 695-723. 100. - pp. 13350-13355.
Sangai T [et al.] Effect of differences in cancer cells and tumor growth sites on recruiting Spradling A, Drummond-Barbosa D and Kai T Stem cells find their niche [Journal] //
bone marrow-derived endothelial cells and myofibroblasts in cancer-induced stroma Nature. - 11 01, 2001. - Vol. 414. - pp. 98-104.
[Journal] // Int J Cancer. - 07 20, 2005. - Vol. 115. - pp. 885-892. Spring H [et al.] Chemokines direct endothelial progenitors into tumor neovessels
Sasaki M [et al.] Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to [Journal] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 12 13, 2005. - Vol. 102. - pp. 18111-18116.
wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type [Journal] // J Immunol. - 02 Stagg J [et al.] Interferon-gamma-stimulated marrow stromal cells: a new type of
15, 2008. - Vol. 180. - pp. 2581-2587. nonhematopoietic antigen-presenting cell [Journal] // Blood. - 03 15, 2006. - Vol. 107. - pp.
Sato N [et al.] Molecular signature of human embryonic stem cells and its comparison with 2570-2577.
the mouse [Journal] // Dev Biol. - 08 15, 2003. - Vol. 260. - pp. 404-413. Steingen C [et al.] Characterization of key mechanisms in transmigration and invasion of
Sato Noboru [et al.] Maintenance of pluripotency in human and mouse embryonic stem cells mesenchymal stem cells [Journal] // J Mol Cell Cardiol. - 06 0, 2008. - Vol. 44. - pp. 1072-
through activation of Wnt signaling by a pharmacological GSK-3-specific inhibitor. 1084.
[Journal] // Nat Med. - 2004. - Vol. 10. - pp. 55-63. Steptoe PC Edwards RG, Purdy JM. Clinical aspects of pregnancies established with
Sato Yasushi [et al.] Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver are cleaving embryos grown in vitro. [Journal] // Br J Obstet Gynaecol.. - 1980. - pp. 87(9):757-
differentiated into human hepatocytes without fusion. [Journal] // Blood. - 2005. - Vol. 106. - 68.
pp. 756-763. Stoff-Khalili M A [et al.] Mesenchymal stem cells as a vehicle for targeted delivery of
Schenk S [et al.] Monocyte chemotactic protein-3 is a myocardial mesenchymal stem cell CRAds to lung metastases of breast carcinoma [Journal] // Breast Cancer Res Treat. - 10 0,
homing factor [Journal] // Stem Cells. - 01 0, 2007. - Vol. 25. - pp. 245-251. 2007. - Vol. 105. - pp. 157-167.
Schmidt CE [et al.] Acellular vascular tissues: natural biomaterials for tissue repair and Studeny M [et al.] Mesenchymal stem cells: potential precursors for tumor stroma and
tissue engineering. Biomaterials 2000; 21:2215-2231. targeted-delivery vehicles for anticancer agents [Journal] // J Natl Cancer Inst. - 11 03,
Schofield R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the haemopoietic 2004. - Vol. 96. - pp. 1593-1603.
stem cell. [Journal] // Blood Cells. - 1978. - Vol. 4. - pp. 7-25. Sugarman Jeremy Ethics and stem cell therapeuthics for cardiovascular disease [Journal] //
Schuldiner M. et al. Effects of eight growth factors on the differentiation of cells derived Progress in Cardiovascular Diseases. - 2007. - pp. (50) 1: 1-6.
from human embryonic stem cells. [Journal] // Proc Natl Acad Sci U S A.. - 2000. - pp. Surani MA Reprogramming of genome function through epigenetic inheritance. [Journal] //
97(21):11307-12. Nature. - 2001. - pp. 414:122-128.
Schwarz E.J. [et al.] Multipotential marrow stromal cells transduced to produce L-DOPA: Tait IS [et al.] Generation of neomucosa in vivo by transplantation of dissociated postnatal
engraftment in a rat model of Parkinson disease [Journal] // Hum.Gene Ther. - 1999. - Vol. small intestinal epithelium. Differentiation 1994; 56:91-100.
10. - pp. 2539-2549. Takagz Y et al Dopaminergic neurons generated from monkey embryonic stem cells
Scoville D H [et al.] Current view: intestinal stem cells and signaling [Journal] // function in a Parkinson primate model. [Journal] // J. Clin. Invest.. - 2005. - pp. 115(1):102-9.
Gastroenterology. - 03 0, 2008. - Vol. 134. - pp. 849-864. Takahashi K & Yamanaka, S Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic
Segers V F [et al.] Local delivery of protease-resistant stromal cell derived factor-1 for stem and adult fibroblast cultures by defined factors. [Journal] // Cell. - 2006. - pp. 126(4):663-76.
cell recruitment after myocardial infarction [Journal] // Circulation. - 10 09, 2007. - Vol. Takahashi S. [et al.] Development and characterization of a human marrow stromal cell line
116. - pp. 1683-1692. that enhances osteoclast-like cell formation [Journal] // Endocrinology. - 1995. - Vol. 136. -
Segers V F [et al.] Mesenchymal stem cell adhesion to cardiac microvascular endothelium: pp. 1441-1449.
activators and mechanisms [Journal] // Am.J Physiol Heart Circ Physiol. - 04 0, 2006. - Vol. Takashima Y Era T, Nakao K, Kondo S, Kasuga M, Smith AG, Nishikawa S.
290. - pp. H1370-H1377. Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation. [Journal] //
Sekiya I., Colter D. C. and Prockop D. J. BMP-6 enhances chondrogenesis in a Cell.. - 2007 Jun 29;. - pp. 129(7):1377-88.
subpopulation of human marrow stromal cells. [Journal] // Biochem Biophys Res Commun. - Tam PP & Rossant, J Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian
2001. - Vol. 284. - pp. 411-418. development. [Journal] // Development. - 2003. - pp. 130(25):6155-63.
Sekiya Ichiro [et al.] In vitro cartilage formation by human adult stem cells from bone Tang D Q [et al.] In vivo and in vitro characterization of insulin-producing cells obtained
marrow stroma defines the sequence of cellular and molecular events during chondrogenesis. from murine bone marrow [Journal] // Diabetes. - 07 0, 2004. - Vol. 53. - pp. 1721-1732.
[Journal] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2002. - Vol. 99. - pp. 4397-4402. Tavassoli M. Differential response of bone marrow and extramedullary adipose cells to
Sell S. & Pierce, G. B. Maturation arrest of stem cell differentiation is a common pathway starvation [Journal] // Experientia. - 1974. - Vol. 30. - pp. 424-425.
for the cellular origin of teratocarcinomas and epithelial cancers. [Journal] // Lab Invest. - Teebken OE Bader A, Steinhoff G, Haverich A, Tissue engineering of vascular grafts:
1994. - pp. 70(1):6-22. human cell seeding of decellularised porcine matrix. [Journal] // Eur J Vasc Endovasc Surg. -
Sell Stewart Stem cell origin of cancer and differentiation therapy [Journal] // Oncology .2000 Apr;. - pp. 19(4):381-6.
Hematology. - 2004a. - pp. 51:1-28. Terada Naohiro [et al.] Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by
Sell Stewart Stem Cells [Book Section] // Stem cells handbook. - NJ : Humana Press Inc., spontaneous cell fusion. [Journal] // Nature. - 2002. - Vol. 416. - pp. 542-545.
2004b. Terai S [et al.] Improved liver function in patients with liver cirrhosis after autologous bone
Sémont A [et al.] Mesenchymal stem cells increase selfrenewal of small intestinal epithelium marrow cell infusion therapy [Journal] // Stem Cells. - 10 0, 2006. - Vol. 24. - pp. 2292-2298.
and accelerate structural recovery after radiation injury. Adv Exp Med Biol 2006; 585:19-30. Thompson JS [et al.] Growth of intestinal neomucosa on prosthetic materials. J Surg Res
Sethe S, Scutt A and Stolzing A Aging of mesenchymal stem cells [Journal] // Ageing Res 1986; 41:484-492.
Rev. - 02 0, 2006. - Vol. 5. - pp. 91-116. Thomson JA et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. [Journal] //
Shah B S [et al.] Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots Science. - 1998. - pp. 282:1145-1147.
[Journal] // Nano.Lett. - 10 0, 2007. - Vol. 7. - pp. 3071-3079. Thomson JA et al. Isolation of a primate embryonic stem cell line. [Journal] // Proc. Natl.
Shah K and Weissleder R Molecular optical imaging: applications leading to the Acad. Sci. USA. - 1995. - pp. 92:7844-7848.
development of present day therapeutics [Journal] // NeuroRx. - 04 0, 2005. - Vol. 2. - pp. Thomson JA et al. Pluripotent cell lines derived from common marmoset (Callithrix
215-225. jacchus) blastocysts. [Journal] // Biol Reprod. - 1996. - pp. 55:254-259.
Shake Jay G [et al.] Mesenchymal stem cell implantation in a swine myocardial infarct Thrasher JD Analysis of renewing epithelial cell population. [Book Section] // Methods in
model: engraftment and functional effects. [Journal] // Ann Thorac Surg. - 2002. - Vol. 73. - cell physiology, vol. 2 / book auth. Prescott DM. - New York : Academic, 1966.
pp. 1919-25; discussion 1926. Till JE et al. Hemopoietic stem cell differentiation. [Journal] // Biochim Biophys Acta. -
Shamblott MJ Axelman J, Wang S, Bugg EM, Littlefield JW, Donovan PJ, Blumenthal 1980. - pp. 605:431-459.
PD, Huggins GR, Gearhart JD. Derivation of pluripotent stem cells from cultured human Togel F [et al.] Administered mesenchymal stem cells protect against ischemic acute renal
primordial germ cells. [Journal] // Proc Natl Acad Sci U S A.. - 1998 Nov 10;. - pp. failure through differentiation-independent mechanisms [Journal] // Am J Physiol Renal
95(23):13726-31. Physiol. - 07 0, 2005. - Vol. 289. - pp. F31-F42.
Shapiro RS [et al.] Future issues in transplantation ethics [Journal] // Transplantation Tolar J [et al.] Sarcoma derived from cultured mesenchymal stem cells [Journal] // Stem
Reviews. - 2008. - Vol. 22. - pp. 210-214. Cells. - 02 0, 2007. - Vol. 25. - pp. 371-379.

  212 
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv  BIBLIOGRAFIE 
 
Tomita S. [et al.] Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart Yamaguchi A., Komori T. and Suda T. Regulation of osteoblast differentiation mediated
function. [Journal] // Circulation. - 1999. - Vol. 100. - pp. II247-II256. by bone morphogenetic proteins, hedgehogs, and Cbfa1. [Journal] // Endocr Rev. - 2000. -
Tondreau T [et al.] Mesenchymal stem cells derived from CD133-positive cells in Vol. 21. - pp. 393-411.
mobilized peripheral blood and cord blood: proliferation, Oct4 expression, and plasticity Yhao XY et al. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation.
[Journal] // Stem Cells. - 09 0, 2005. - Vol. 23. - pp. 1105-1112. [Journal] // Nature. - 2009. - pp. 461(7260):86-90.
Trentin Andréa [et al.] Self-renewal capacity is a widespread property of various types of Yoo J U [et al.] The chondrogenic potential of human bone-marrow-derived mesenchymal
neural crest precursor cells. [Journal] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2004. - Vol. 101. - pp. progenitor cells [Journal] // J.Bone Joint Surg.Am. - 12 0, 1998a. - Vol. 80. - pp. 1745-1757.
4495-4500. Yoo J U and Johnstone B The role of osteochondral progenitor cells in fracture repair
Trentin JJ et al. Hemopoietic inductive microenvironments. [Book Section] // Stem cells. / [Journal] // Clin.Orthop.Relat Res. - 10 0, 1998b. - pp. S73-S81.
book auth. Cairnie AB et al. - New York : Academic, 1976. Yoon Y S [et al.] Clonally expanded novel multipotent stem cells from human bone marrow
Tropel Philippe [et al.] Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from adult regenerate myocardium after myocardial infarction [Journal] // J Clin Invest. - 02 0, 2005. -
mouse bone marrow. [Journal] // Exp Cell Res. - 2004. - Vol. 295. - pp. 395-406. Vol. 115. - pp. 326-338.
Tsai Ming-Song [et al.] Isolation of human multipotent mesenchymal stem cells from Young R G [et al.] Use of mesenchymal stem cells in a collagen matrix for Achilles tendon
second-trimester amniotic fluid using a novel two-stage culture protocol. [Journal] // Hum repair [Journal] // J.Orthop.Res. - 07 0, 1998. - Vol. 16. - pp. 406-413.
Reprod. - 2004. - Vol. 19. - pp. 1450-1456. Zaret K S and Grompe M Generation and regeneration of cells of the liver and pancreas
Tse WT Pendleton JD, Beyer WM, Egalka MC, Guinan EC. Suppression of allogeneic T- [Journal] // Science. - 12 05, 2008. - Vol. 322. - pp. 1490-1494.
cell proliferation by human marrow stromal cells: implications in transplantation. [Journal] // Zelzer Elazar and Olsen Bjorn R The genetic basis for skeletal diseases. [Journal] //
Transplantation.. - 2003 Feb 15;. - pp. 75(3):389-97. Nature. - 2003. - Vol. 423. - pp. 343-348.
Tuan Rocky S, Boland Genevieve and Tuli Richard Adult mesenchymal stem cells and Zhang [et al.] Synthesis and biocompatibility of porous nano-
cell-based tissue engineering [Journal] // Arthritis Res Ther. - 0 0, 2003. - Vol. 5. - pp. 32-45. hydroxyapatite/collagen/alginate composite [Journal] // Journal of Materials Science:
Tuli Richard A simple, high-yield method for obtaining multipotential mesenchymal Materials in Medicine, VJournal of Materials Science: Materials in Medicine, Volume 14,
progenitor cells from trabecular bone [Journal] // Molecular Biotechonoly. - 2003. - pp. 37- Number 7, July 2003, pp. 641-645(5)). - Volume 14, Number 7, July 2003 ,. - pp. pp. 641-
49. 645(5).
Ueda Y [et al.] Wnt/beta-catenin signaling suppresses apoptosis in low serum medium and Zhang J [et al.] Human bone marrow stromal cell treatment improves neurological
induces morphologic change in rodent fibroblasts [Journal] // Int J Cancer. - 06 10, 2002. - functional recovery in EAE mice [Journal] // Exp Neurol. - 09 0, 2005. - Vol. 195. - pp. 16-
Vol. 99. - pp. 681-688. 26.
Verfaillie C M, Pera M F and Lansdorp P M Stem cells: hyp