Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Facultatea de Medicină
Aplicaţii ale celulelor stem mezenchimale în
reconstrucţia tractului digestiv
Autor:
CĂTĂLINIULIAN EFRIMESCU
Bucureşti,
2010
CENTRUL NAŢIONAL ISBN
BIBLIOTECA NAŢIONALĂ A ROMÂNIEI
Str. Ion Ghica nr. 4, sect. 3, cod 030046
Bucureşti - ROMANIA
Tel. +40 21 311.26.35
Fax +40 21 312.49.90
E-mail: isbn@bibnat.ro
Web:www.bibnat.ro/isbn.php
APLICAŢII ALE CELULELOR STEM
MEZENCHIMALE ÎN RECONSTRUCŢIA
TRACTULUI DIGESTIV
(EDIŢIE ONLINE, 2010)
ISBN 9789730090154.
Versiune online a lucrării de licenţă cu acelaşi titlu.
Este intrezisă reproducerea, copierea, editarea şi/sau
prezentarea materialului de faţă (fragment sau integral) , fără
acordul autorului.
Solicitările pot fi transmise pe adresa: catalin_efrimescu@yahoo.com
Citare:
Efrimescu, CI (2010), “Aplicaţii ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucţia tractului digestiv”,
lucrare de licenţă, accesat (data, zi/lună/an ) la adresa: [http://www.__________]
„Omnis cellula e cellula.”
„Orice celulă provine dintr-o altă celulă.”
Stimă şi respect!
Sinceră apreciere celor ce şi-au adus contribuţia
la realizarea acestei lucrări:
În ultima decadă, domeniul celulelor stem a obţinut realizări ce păreau incredibile până
nu demult. Ca rezultat, numeroase ramuri clinice se bucură de metode experimentale ce îşi
aşteaptă aprobarea finală pentru a intra în arsenalul terapeutic general, revoluţia “stem”
culminând în anul 2008 cu obţinerea primei inimi cu activitate electro-mecanică create în
laborator (Doris Taylor, Universitatea Minnesota, USA), forţând astfel intrarea într-o nouă etapa
– crearea organelor în laborator.
Cu toate acestea, celulele stem mai au multe de spus în ceea ce priveşte crearea de
ţesuturi şi utilizarea lor. Mai mult, descoperirea periodică a unor noi tipuri de celule stem,
măreşte considerabil numărul posibilelor întrebuinţări.
Din marea familie a celulelor stem, se distinge de departe grupul celulelor stem
mezenchimale (MSC), care sub aspectul obţinerii şi utilizării reprezintă categoria ce oferă cele
mai multe promisiuni clinice. Ca urmare este absolut necesară testarea în diverse condiţii
experimentale, menite a proba utilitatea şi rolul lor.
În chirurgie, MSC şi-au găsit un rol în tratamentul afecţiunii graft versus host disease şi
al unor afecţiuni ortopedice, însă aplicaţiile lor pot fi utile unei patologii vaste, iar acest fapt
merită explorat.
Întrucât datele din literatură de specialitate privind rolul MSC în regenerarea tubului
digestiv sunt insuficiente şi ţinând cont de potenţialul lor dovedit în studii din alte domenii, am
considerat oportună utilizarea lor în acest sens, având în minte folosirea lor pentru una din
complicaţiile chirurgicale cu o mare morbiditate: fistula digestivă. Astfel, rezultatele obţinute vor
putea sta la baza unor studii viitoare mai amănunţite, care să îşi propună decodarea
mecanismelor interacţiunii celulare şi diferenţierea condusă a acestor celule, în favoarea
reconstrucţiei tubului digestiv.
Având încredere în potenţialul acestor celule, studiul prezent îşi propune să apropie
utilizarea MSC în clinica chirurgicală, contribuind la obţinerea unor metode terapeutice
individualizate fiecărui pacient.
Cătălin-Iulian Efrimescu
CUPRINS
PARTEA GENERALĂ
INTRODUCERE 10
1 ETIMOLOGIE ŞI DEFINIŢII 11
2 ORIGINEA CELULELOR STEM 15
3 CLASIFICAREA CELULELOR STEM 22
4 PLASTICITATEA CELULELOR STEM 30
5 CELULELE STEM MEZENCHIMALE: NOŢIUNI INTRODUCTIVE 32
6 LOCALIZAREA/SURSE MSC 39
7 ORIGINEA MSC 41
8 BIOLOGIA MSC 45
9 CULTIVAREA MSC 63
10 APLICAŢII ALE MSC ÎN DOMENIUL INGINERIEI TISULARE 82
11 IMUNOLOGIA MSC 91
12 CELULELE STEM ŞI CANCERUL 98
13 METODE DE CARACTERIZARE ŞI IDENTIFICARE IN VIVO A MSC 106
14 STEMNESS 114
15 ETICA ŞI STANDARDELE UTILIZĂRII CLINICE A MSC 120
16 VIITORUL CELULELOR STEM ÎN CLINICĂ 128
CONCLUZII 131
PARTEA SPECIALĂ
INTRODUCERE 134
IPOTEZĂ 136
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE LUCRĂRII 136
MATERIALE ŞI METODE 137
REZULTATE 162
DISCUŢII 179
CONCLUZII 183
PREZENTARE CAZURI 184
CONCLUZII 196
ANEXA I 198
ANEXA II 199
ANEXA III 201
ANEXA IV 205
ANEXA V 207
BIBLIOGRAFIE 208
Partea generală
9
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
Introducere
INTRODUCERE
Omul, începând încă din zorii maturităţii sale intelectuale, a fost cuprins de dorinţa de a
învinge senescenţa şi moartea. Dacă până acum se putea interveni numai din exterior, acum a
venit timpul ca omul să îşi poată croi singur destinul biologic, coborând spre a lucra însăşi în
interiorul unităţii fundamentale a organismelor vii, celula.
În ultimele două mii de ani, omul şi-a aprofundat cunoaşterea propriului corp, multe
convingeri au fost astfel infirmate sau confirmate, zguduind din temelii ceea ce se ştie despre om
şi originea sa.
Primele întrebări pertinente asupra originii omului şi evoluţiei vieţii, i-au aparţinut lui
Aristotel (384-322 IHr.), aşa cum menţionează Leslie Brainerd Arey, părintele embriologiei
moderne (Arey 1974). Aristotel a fost cel ce a făcut legătura între primele stadii evolutive ale
omului şi uter. Tot el, a adus în dezbatere şi polemica: omul se formează de novo în pântec sau
se găseşte preformat, şi doar se măreşte în cursul evoluţie sale (Arey 1974). O altă corelaţie,
realizată de Aristotel, a fost aceea conform căreia omul se naşte din sângele menstrual al mamei.
O prezumpţie în conformitate cu credinţa acelor vremuri, în care originea animalelor este în
mâzga primordială sau materia descompusă (teoria generaţiei spontane – populară până în Evul
mediu târziu, mai bine de 2000 de ani).
Această teorie a intrat în dezbatere în secolul al XIX-lea, când a fost combătută de o nouă
idee, susţinută de Leydig în 1855: viaţa nu apare spontan, ci originea vieţii este în viaţă (omne
vivum ex vivo). Ideea a fost apoi preluată, susţinută şi extinsă de Virkow în aceeaşi perioadă:
originea tuturor celulelor organismului uman se află într-o celulă (omnis cellula e cellula). (Sell
2004b)
Oficial, teoria generaţiei spontane, a fost revocată în 1864, de către experimentele lui
Pasteur, care au demonstrat că viaţa nu poate apărea acolo unde nu este viaţă. Astfel, rezumând
principiile lui Leydig, Virchow şi Pasteur, putem concluziona că viaţa este un perpetuum mobile,
iar omul – fiinţa fizică, este un stadiu din acest ciclu. (Sell 2004b)
Deşi numeroase progrese s-au făcut în domeniul ştiinţelor biologice şi cel medical, încă
există numeroase afecţiuni ce nu şi-au găsit răspuns, continuând să facă numeroase victime. În
această privinţă, primele cercetări realizate în sfera celulelor stem au menirea de a furniza
răspunsuri la unele dintre întrebările fundamentale cu scopul de a facilita apariţia unor noi terapii
în clinică.
Celulele stem reprezintă pentru lumea ştiinţifică medicală echivalentul pietrei filosofale a
alchimiştilor. Se aşteaptă ca acestea să ofere un rezervor nelimitat de celule, ţesuturi şi organe
menit a corecta dizabilităţile cauzate de boală. Deşi acest domeniu de cercetare se găseşte în
perioada primei copilării, numeroasele rezultate obţinute dau oamenilor de ştiinţă încrederea că
se va putea găsi tratament unor boli precum traumatismele măduvei spinării (McDonald 1999),
bolilor cardiace (Fraidenraich 2004) (Menasché 2004), bolii Parkinson (Takagz 2005), bolii Lou
Gehrig (Wichterle 2002), diabetului de tip 1, sindroamelor de imunodeficienţă, bolilor ţesutului
osos şi cartilaginos, şi, în final, chiar cancerului. Speranţele multor bolnavi sunt legate de
răspunsurile pe care comunitatea ştiinţifică le poate oferi vizând utilizarea celulelor stem în
medicina clinică.
Pentru a fi utile, fiecare tip de celule stem trebuie analizat în amănunt pentru a descifra
modalităţile de manipulare şi control, iar această activitate continuă să fie principala ocupaţie a
oamenilor de ştiinţă ai acestei epoci.
Odată cu crearea primului organ in vitro şi cu aprobarea primelor trial-uri clinice ce
utilizează celule stem mezenchimale şi derivate din celulele stem embrionare, putem spune ca
omul şi-a sfidat condiţia apropiindu-şi imortalitatea....
10
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 1] Etimologie şi definiții
1 ETIMOLOGIE ŞI DEFINIŢII
Celulele stem mezenchimale suscită un mare interes datorită valorii lor terapeutice, fiind
un instrument cu o largă manevrabilitate în domenii precum medicina regenerativă sau ingineria
tisulară.
Ingineria tisulară/medicina regenerativă reprezintă o arie interdisciplinară a
biotehnologiei, ce are drept scop soluţionarea problemelor medicale critice prin dezvoltarea unor
produse ce pot reanima sau substitui elemente ale organismului uman. Scopul este producerea de
ţesuturi competente din materiale alternative pentru a menţine, restaura şi îmbunătăţi funcţiile
biologice.
Combinaţia inginerie tisulară-MSC constituie o realitate ce accelerază progresul
metodelor terapeutice, cu un cost acceptabil. Raportându-ne la realizările şi dificultăţile întâlnite
de către domeniul transplantologiei, crearea de ţesuturi şi organe funcţionale bazate pe celule
stem va reprezenta o inovaţie salvatoare, mai ales în condiţiile în care transplantul de organ are
unul dintre cele mai scăzute rapoarte cost-eficienţă terapeutică dar şi o disponibilitate limitată.
Celulele stem mezenchimale izolate din măduva hematogenă şi ţesutul adipos sunt
capabile de o diferenţiere variată, producând celule ce pot fi utilizate pentru vitalizarea unor
componente suport ce constituie infrastructura viitoarelor organe şi ţesuturi.
Pentru a dezvolta astfel de tehnici de înlocuire, trebuie luată în considerare necesitatea de
a crea un substrat propice pentru supravieţuirea şi diferenţierea celulară. O strategie pentru
atingerea acestui deziderat este utilizarea implanturilor biocompatibile bazate pe componente ale
moleculelor matricei extracelulare, însămânţate cu celulele auto sau heterologe. În prezent,
eforturile sunt direcţionate către izolarea, expansiunea şi dezvoltarea de sisteme de încapsulare a
MSC în micromedii 3D care conţin un amestec de colagen şi agaroză.
Problemă majoră în crearea unor înlocuitori de ţesuturi şi organe este simularea cât mai
exactă a naturii acestora. Cea mai bună cale pentru atingerea acestui obiectiv este studierea
ţesuturilor şi organelor în timpul embriogenezei şi de-a lungul proceselor normale de reparare,
precum şi modul în care aceste funcţii sunt menţinute.
În cadrul dezvoltării tehnicilor de substituţie a ţesuturilor, trebuie luate în considerare o
serie de factori: (1) necesitatea înlăturării răspunsului imun care poate determina inflamaţia
şi/sau rejetul; (2) realizarea unui substrat propriu pentru supravieţuirea şi diferenţierea celulară;
(3) furnizarea unor condiţii de mediu propice pentru menţinerea ţesutului.
Cu toate acestea, MSC promit a fi un component vital de bază al substitutelor de ţesuturi
şi organe, tehnologia viitorului oferind cercetătorilor posibilitatea de manipulare şi direcţionare
controlată a acestor celule, care vor deveni elementul central în terapie, astfel încât se justifică
orientarea atenţiei asupra MSC.
Utilizarea cuvântului „stem”, în contextul de celulă stem, provine din limba engleză
unde are numeroase sensuri în sfera botanică şi nu numai. Uzual, cuvântul denumeşte partea
centrală a unei plante, situate deasupra pământului ce dă naştere ramurilor, sau porţiunea unei
plante ce susţine frunze sau flori (Longman 1998). Acelaşi cuvânt denumeşte şi suportul
(piciorul) unui pahar sau partea tubulară îngustă a unei pipe, rădăcina unui cuvânt urmată de un
sufix, linia principală de descendenţă a unei familii, originea unei noi linii familiale ("Stem"
2009a), partea centrală a unei pene etc.
11
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 1] Etimologie şi definiții
Originile cuvântului „stem” sunt amestecate. În limba engleză modernă îşi are originea
din engleza veche (apărut înainte de anul 900 d.Hr.) ("Stem" 2009b), din perioada medievală, din
cuvântul stefn, stemn cu referirea botanică menţionată. O posibilă origine în limba engleză poate
fi găsită în limba germană stam=stem sau greacă stamnos=cupă de vin ("Stem" 2009a).
Se observă ca element comun al tuturor definiţiilor ideea de element central, de susţinere,
ce stă la origine (linie genealogică).
Celulele stem sunt celule unice în interiorul corpului uman, ce stau la baza formării
organismului uman şi animal (fiind prezente încă din stadiul de zigot), definite de către Lajtha în
1979 ca celule cu capacitate extensivă de reînnoire şi producere a unor celule fiice capabile de
diferenţiere, având rolul de a regenera şi repara ţesuturile. Sunt celule imature capabile în acelaşi
timp de self-renewal (auto-reînnoire) pe întreaga durată de viaţă a organismului şi generare a
unor celule înalt specializate, însărcinate cu realizarea unor funcţii complexe ce stau la baza
funcţionării organismului uman (ex. neuroni, celule musculare, hepatocite, cardiomiocite, celule
pancreatice etc.).
Principala caracteristică a celulelor stem, indiferent de sursa de provenienţă, care le
diferenţiază capital de restul celulelor din organism, este lipsa specializării şi capacitatea de
diferenţiere. Sunt celule nespecializate, pe întreaga lor durată de viaţă, al căror rol este de a
răspunde la un stimul specific prin self-renewal şi diferenţiere (producerea de celule specializate)
(Fig. 1.1), încât pot genera peste 200 de tipuri de celule specializate identificate în organism.
Semnalele externe ce promovează diferenţierea sunt reprezentate de diverse citokine, contactul
fizic cu celulele vecine şi molecule prezente în micromediu.
12
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 1] Etimologie şi definiții
moment, decât la nivelul unui număr redus de celule (celulele stem hematopoietice – HSC,
celulele stem din epiderma adultă şi epiteliul intestinal); astfel încât se defineşte teoretic un
concept, pe baza unor observaţii ale culturilor celulare, a cărui existenţă in vivo este parţial
demonstrată.
Anul Eveniment
1958 - Jean Dausset descoperă sistemul HLA.
- Leroy Stevens identifică tendinţa la pluripotenţă a teratocarcinoamelor murine.
Anii - Organele sexuale ale şoarecilor conţin celule ce au posibilitatea de a forma alte tipuri de
1960 celule.
- Originea teratocarcinomului se află în celulele germinale embrionare, la şoarece.
- Identificarea celulelor embrionare carcinomatoase (EC), catalogate ca un tip de celule stem.
1966 - Izolarea celulelor stem embrionare din embrioni de iepure (Cole şi Edwards).
1968 - Prima fertilizarea umană in vitro.
- Primul transplant medular.
- Primele himere murine din celule stem embrionare (Gardner).
1970 - EC injectate în blastocişti murini produc şoareci himerici.
- Leroy Stevens observa că celule germinale murine ce stau la baza teratocarcinoamelor se
asemăna cu celulele embrionare.
1975 - Mintz şi Illmensee, demonstrează că aceste celule pot genera organisme nu numai teratoame.
1978 - Descoperirea celulelor stem în sângele din cordonul ombilical uman.
- Primul copil conceput prin fecundare in vitro se naşte în Anglia.
1980 - Primele rezultate privind obţinerea de blasticişti umani după recoltarea ovulelor prin stimulare
gonadotropinică, fecundare in vitro şi cultivare în laborator (Edwards, Steptoe).
1981 - Identificarea primei linii de celule stem murine izolate din blastocişti.
- Celulele stem injectate la şoareci imunosuprimaţi formează teratoame.
- Evans şi Martin cultivă celule stem embrionare murine în mediu condiţionat de celule
generatoare de teratoame.
1984- - Apar linii clonale de EC.
1988 - Diferenţierea EC în celule neuron-like sub influenţa acidului retinoic.
1985- - Hohan şi Donovan descoperă factorii din cultură, specifici, ce determină diferenţierea
1992 celulelor stem embrionare.
1987 - Celulele stem embrionare regenerează măduva osoasă a şoarecilor iradiaţi letal (Hollands).
1988 - Identificarea primei linii de celule stem embrionare la hamster.
1989 - Producerea de ţesuturi specifice celor trei straturi embrionare din EC umane. Capacitate de
diferenţiere limitată.
1994 - Producerea şi cultivarea de blastocişti umani.
- Identificarea celulelor cu morfologie stem like în aceste culturi.
1995 - Izolarea primei linii de celule stem embrionare primate.
1996 - Wilmut o clonează pe Dolly prin transfer nuclear somatic.
1997 - Clonarea unui miel din celule stem.
- Se naşte Cumulina- primul şoarece clonat din celule cumulus ovariene.
- Identificarea originii leucemiei în celulele stem hematopoietice – dovada implicării celulelor
stem în cancere.
1998 - James Thomson publică izolarea primei linii de celule stem embrionare umane din blastocisti
- Cibelli obţine primul blastocist himera om-vaca
1998- - Michael Levesque transplantează 6 milioane de nuroni dopaminergici unui pacient cu boala
2002 Parkinson, proveniţi din 15 celule stem neuronale recoltate de la pacient. Pacientul îşi
îmbunătăţeşte starea cu cca 40% pe scală UPDRS.
1999 - Diferenţierea celulelor stem mezenchimale umane din măduva osoasă pe linie adipogenică,
condrogenică şi adipoblastică.
13
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 1] Etimologie şi definiții
14
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 2] Originea celulelor stem
2.1 Zigotul
Totul, din punct de vedere biologic, începe şi se termină cu o celulă. La linia de start a
vieţii organismului uman se găseşte celula stem supremă, totipotentă, întruchipată de ZIGOT, iar
la punctul de sosire se găseşte celula capabilă a prelungi viaţa cu încă o generaţie, celula
reproducătoare (ovulul şi spermatozoidul).
Evoluţia zigotului, ca element suprem totipotent este consemnată de-a lungul primelor
diviziuni celulare mitotice (clivaj), simetrice, când toate celulele stem rezultate din acesta
(numite blastomere) sunt totipotente (pot produce celule specifice oricărui ţesţut adult sau
embrionar (Fig. 2.1)).
În timpul acestei perioade, celule fiice primesc un set complet de material genetic diploid
în urma diviziunii blastomerelor. Această diviziune este simetrică (Fig. 2.2), adică fiecare celulă
generează două fiice care la rândul lor vor produce fiecare încă două fiice ş.a.m.d., spre
deosebire de diviziunea celulelor stem adulte care este asimetrică (o celulă, “mama”, produce
două celule, dintre care una păstrează caracterul parental, iar cealaltă se va diferenţia producând
o celulă matură) (Fig. 2.2) (Thrasher 1966). Celula ce va intra în cursul procesului de
determinare se numeşte TDTAC (tissue determined transit-amplifying cells )/TAC şi se divide
de câteva ori până la diferenţierea într-o celulă matură. Divizunea asimetrică joacă un rol
important în biologia celulei stem, asigurând perenitatea acesteia. Totuşi mecanismul prin care
aceasta se realizează nu este cunoscut. Cairns (Sell 2004a) a speculat că în cursul diviziunii doar
una din celule primeşte material genetic identic cu cel al „mamei” (celula destinată reînnoirii
fondului stem) în timp ce, celula destinată procesului de determinare primeşte o copie ADN
sintetizată de novo. Rezultatele lui Potten şi Merck par a susţine această explicaţie (Sell 2004a).
15
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 2] Originea celulelor stem
16
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 2] Originea celulelor stem
Fig. 2.3. Tipurile de celule progenitoare ale intestinului în cursul dezvoltării. (Sell 2004b)
17
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 2] Originea celulelor stem
controlat prin intermediul concentraţiei unor factori inductori. Rolul acestora este extrem de
important, deoarece concentraţia lor reglează anumite gene responsabile de alegerea unei
anumite căi (selecţie a căii de dezvoltare), în contextul în care fiecare pas ierarhizat propune mai
multe variante de evoluţie (Slack 2008). Repetarea ordonată a acestui proces promovează
evoluţia organismului complex începând de la stadiul de zigot.
Nu trebuie uitat faptul că originea anumitor organe (implicit a celulelor din structura lor,
incluzând şi celulele stem) se găseşte în mai mulţi muguri embrionari proveniţi din straturi
embrionare diferite. În consecinţă, trebuie ţinut cont de prezenţa mai multor căi în originea
celulelor stem ale unui ţesut adult. Un astfel de exemplu este pancreasul (Zaret 2008) şi
adenohipofiza (Gleiberman 2008).
Slack (2008), consideră apariţia celulelor stem adulte ca o ultimă decizie de dezvoltare şi
evoluţie ierarhizată a unui ţesut. În acest fel celulele stem specifice ţesuturilor, se vor găsi într-o
stare de evoluţie similară ţesutului embrionar de provenienţă. Un rol în menţinerea potenţialului
stem al acestor celule îl are şi interacţiunea cu celulele înconjurătoare ce formează nişa celulelor
stem (Fig. 2.5).
Deşi acest model este doar teoretic, nefiind demonstrat practic, nu este contestat.
Confirmarea sau infirmarea sa necesită compararea unor mostre transcripţionale ale ţesuturilor
embrionare originare pure şi ale profilelor unor populaţii de celule stem adulte pure specifice
ţesutului.
Rolul factorilor de transcripţie în cadrul evoluţiei anumitor organe şi menţinerii celulelor
stem specifice lor este subliniat de rezultatele câtorva studii, constituind un prim pas în
susţinerea acestei teorii (Tab. 2.1).
Deşi momentan, acest model este fezabil şi nu este infirmat, vor fi necesare numeroase
date care să îl desluşească şi să îl confirme. Astfel, principalul factor trenant este reprezentat de
greutatea obţinerii unor profile transcripţionale pure ale ţesuturilor embrionare şi ale celulelor
stem precum şi elaborarea unor metode de marcare a celulelor embrionare şi identificare
ulterioară. Acest ultim neajuns poate fi îndepărtat prin utilizarea metodei CreEr-lox (Fig. 2.6)
(Joyner 2006).
18
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 2] Originea celulelor stem
19
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 2] Originea celulelor stem
Celule stem mezenchimale din ţesutul Pot forma neuroni, cardiomiocite, hepatocite, celule pancreatice.
adipos
Precursori derivaţi din piele (SKP) Izolaţi din derma umană şi murină.
Se pot diferenţia în neuroni, celule gliale, muşchi neted, adipocite.
20
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 2] Originea celulelor stem
Se pune întrebarea, dacă celulele stem, adulte sau embrionare, există in vivo sau sunt doar
o transformare spontană în cultură a anumitor precursori, similară obţinerii celulelor stem
pluripotente induse, ce se petrece stocastic. Totuşi observaţia că anumite celule, precum SKP şi
MSC, sunt izolate cu o frecvenţă crescută şi relativ simplu, sugerează existenţa unor echivalenţi
in vivo (Slack 2008).
Idea fenomenului stocastic, orientează originea celulelor pluripotente adulte către
populaţia celulară a crestei neurale, întrucât în această populaţie evenimentele diferenţierii au loc
după un model stocastic. Mai multe echipe au izolat „celule stem” similare celor din creasta
neurală, din ţesuturi precum: nervul sciatic fetal, intestin adult, inima şi piele. Aceste celule
neurale se pot diferenţia în numeroase tipuri de celule, urmând modelul „dezvoltării ierarhizate”.
În cursul acestor fenomene se poate observa probabilitatea stocastica a evenimentelor (Slack
2008).
Pentru două tipuri de celule, SKP şi MSC din MO, există rezultate asupra originii lor în
celulele crestei neurale. Identificarea marker-ilor Wnt1-Cre (pentru SKP) şi Sox1-Cre şi P0-Cre
(pentru MSC) sugerează originea lor neurală. (Slack 2008)
O altă variantă postulează existenţa unor resturi embrionare responsabile de existenţa
acestor celule, având la bază existenţa numeroaselor resturi embrionare la nivelul organismului
postnatal (uraca, notocordul, punga lui Ratkhe, canalul tireoglos etc.). Astfel, existenţa unor
grupuri de celule provenite din epiblast, care şi-au menţinut starea embrionară, nu poate fi
abandonată. Incidenţa cu care aceste celule sunt identificate, mai frecvent în organismele tinere,
susţine parţial originea lor în resturile embrionare. Totuşi, observaţia conform căreia tumorile cu
caracter embrionar apar preponderent pe traseul de migrare al celulelor primordiale germinale şi
nu oriunde în corp, contestă aspectul originii în resturile embrionare, cu toate că există anumite
tumori cu celule embrionare (pineale şi neurohipofizare) care apar fără a fi localizate pe traseul
de migrare al celulelor primordiale germinale. (Slack 2008)
În concluzie, originea celulelor stem specifice ţesuturilor adulte se consideră a fi la
nivelul precursorilor embrionari ai ţesutului rezultaţi în urma procesului de „dezvoltare
ierarhizată” sub influenţa factorilor transcripţionali controlaţi de către factorii inductori (Slack
2008).
21
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 3] Clasificare celulelor stem
În cursul evoluţiei sale organismul uman interacţionează cu trei tipuri majore de celule
stem: embrionare (ESC), germinale şi somatice (adulte), ultimele două găsindu-se în produsul
final ontogenetic, iar cele dintâi fiind prezente numai pentru o scurtă perioadă.
Celulele embrionare reprezintă precursorul tuturor celulelor din organele adulte, acest
lucru născând ipoteza că tot ele reprezintă şi originea celulelor stem germinale şi somatice. Cele
două categorii de celule stem întâlnite la adult (germinale şi somatice) au roluri diferite. Celulele
germinale se găsesc la nivelul gonadelor producând ovulele şi spermatozoizii, în timp ce celulele
somatice sunt responsabile de regenerarea tisulară.
Deşi celulele stem embrionare sunt considerate prototipul celulelor stem, nu acestea
reprezintă celula stem primordială (ultimate stem cell), ci ovulul fecundat – zigotul. Acesta, prin
intermediu ESC (celule totipotente), în cadrul procesului de determinare (Fig. 3.1) formează
organismul uman.
Fig. 3.1. Evoluția celulelor stem în ţesuturi şi regenerarea tisulară. (Sell 2004a)
Celulele stem reprezintă o mică proporție din celulele unui țesut, şi nu proliferează. Spre deosebire de
un copac ale cărui frunze cad ciclic, reînnoirea unui țesut se realizează continuu.
Spre deosebire de celulele embrionare, care sunt totipotente, cele întâlnite la adult sunt
restricţionate la un nivel inferior al potenţialului de diferenţiere. Totuşi, tumorile pornite de la
celulele germinale (carcinoame embrionare) au arătat că acestea pot forma ţesuturi variate,
inclusiv placentă, ceea ce le plasează ca potenţial de diferenţiere în apropierea ovulului fecundat,
înaintea celulelor stem embrionare (care nu pot produce elemente trofoblastice).
Cu toate că prezenţa celulelor stem în ţesuturile adulte a fost dovedită, numărul acestora
este scăzut, fiind considerate celule de rezervă pentru regenerarea tisulară. Rolul primar în
regenerarea tisulară este îndeplinit de TAC /celulele progenitoare, celule multipotente cu rol în
22
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 3] Clasificare celulelor stem
regenerarea unui organ (se pot diferenţia în celule prezente în organul gazdă), diferite de celule
stem (provin din celulele stem).
În funcţie de vârsta ţesutului de origine, celulele stem, se pot clasifica în celule stem
somatice şi celule stem embrionare. O a treia categorie, recent descoperită, este reprezentată de
celulele stem pluripotente induse (Tab. 3.1).
Celule stem se pot clasifica şi după gradul de plasticitate, putând avea un potenţial ce
variază de la uni la totipotent (vezi capitolul IV).
23
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 3] Clasificare celulelor stem
reînnoire/reparare ţesut/celulă. Numărul acestor celule este destul de restrâns în ţesuturile adulte.
Teoretic, ele formează un compartiment special în cadrul fiecărui ţesut, unde rămân într-o stare
latentă până în momentul activării lor de către o afecţiune sau nevoie intrinsecă de celule. Acest
compartiment poartă numele de „nişa celulelor stem”. Cu toate acestea, originea lor în ţesuturile
adulte este necunoscută.
La nivelul ţesuturilor adulte, rolul lor în reparare şi regenerare (Fig. 3.3) se realizează
prin intermediul celulelor progenitoare/TAC (fiice diferenţiate superior provenite din celulele
stem ale ţesutului respectiv) (Sell 2004b). Acest tip de celule furnizează ţesutului celule
progenitoare mitotic competente ce produc fiice diferenţiate terminal, ce susţin funcţia organului
respectiv. Ulterior acestea nu se mai pot diferenţia şi mor (Sell 1994).
Deşi acest proces este unidirecţional, cel puţin in vivo, studii experimentale au arătat că
acest lucru nu este adevărat. Astfel, celulele progenitoare pot fi capabile de transdiferenţiere sau
dediferenţiere. Un exemplu în acest sens este furnizat de către măduva osoasă care conţine celule
capabile de transdiferenţiere (Wulf 2001).
Multipotenţa clasică a SSC se traduce prin posibilitatea acestora de a produce o gamă
largă de celule specializate, înrudite/asociate cu ţesutul de provenienţă al SSC (ex. celulele stem
hematopoietice generează întregul grup de celule sangvine; celulele stem mesenchimale pot
produce adipocite, condrocite, endoteliu vascular) (Tab. 3.2).
Studii recente au dovedit că acest tip de celule este mult mai flexibil decât a fost
confirmat până acum cu toate că au fost creditate cu un potenţial de self-renewal redus datorită
unor nivele scăzute ale telomerazei (Verfaillie 2002). Astfel, puse într-o nouă lumină, aceste
celule par a fi pluripotente.
O proprietate importantă a acestor celule este plasticitatea, dar mai ales transdiferenţierea
(Tab. 3.3). Numeroasele date ce descriu această posibilitate, oferă o noua imagine asupra
utilizării SSC (Gruh 2009). Prin acest fenomen, ele se pot diferenţia în celule total diferite faţă de
celulele ţesutului de provenienţă, atunci când sunt condiţionate de factorii de transcripţie potriviţi
(Barzilay 2009). De exemplu, celulele stem hematopoietice se pot transforma în cardiomiocite,
celule stem hepatice pot produce celule secretoare de insulină etc.
Până la acest moment SSC au fost identificate în ţesuturi precum măduva osoasă, sânge,
cornee, retină, pulpă dentară, ficat, piele, pancreas şi tub digestiv.
Ca o observaţie generală, utilă în identificarea ţesuturilor ce cuprind în componenta lor
SSC, trebuie ţinut cont de rata de turnover specifică ţesutului respectiv. Cu cât turnover-ul este
mai ridicat, cu atât mai mari sunt şansele ca acel ţesut să conţină celule stem cu un potenţial cât
24
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 3] Clasificare celulelor stem
mai diversificat, deoarece rata de regenerare a ţesutului trebuie să fie egală cu cea de dispariţie a
celulelor, pentru menţinerea unui echilibru funcţional (Sell 2004b) (Tab. 3.4).
Fig. 3.3. Modelul regenerării tisulare, bazat pe celule stem. (Sell 2004b)
În ceea ce priveşte biologia acestor celule, nu trebuie neglijat faptul că aceste celule au un
ciclu celular lent in vivo, motiv pentru care se găsesc într-un număr scăzut în ţesuturi, astfel încât
încercarea de multiplicare in vitro poate fi împotriva naturii lor. În plus, aceste celule nu au
marker-i specifici, aceştia fiind exprimaţi contextual, sub influenţa condiţiilor de cultură; condiţii
care diminueză şi potenţialul de diferenţiere. Aceste observaţii, sugerează caracterul subiectiv al
studiului lor in vitro, care nu reproduce decât într-o foarte mică măsură condiţiile in vivo, posibil
generator al unor rezultate nespecifice. (da Silva 2008)
25
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 3] Clasificare celulelor stem
Reprezintă punctul de referinţă în domeniul celulelor stem. Pentru prima dată, au fost
izolate de către Cole şi Edwards (1966) din blastocişti de iepure, reuşind la acea vreme şi primele
încercări de diferenţiere în insule sangvine, muşchi, ţesut conjunctiv, neuroni şi macrofage (Cole
1966). Un pas important în acest domeniu a fost realizat în 1968, când Gardner a obţinut primele
himere de şoarece utilizând ESC (Gardner 1968).
Deşi au o istorie relativ lungă, ESC au putut fi cultivate şi expansionate nelimitat în
condiţii standardizate începând cu anul 1981, utilizând embrioni murini (M. J. Evans 1981, Cole
1966).
Izolarea celulelor stem embrionare umane a fost realizată abia în 1998 de către Dr. James
Thomson la Universitatea din Wisconsin, USA. În anii ’90 au fost făcuţi primii paşi către
izolarea de ESC umane, prin punerea la punct a protocoalelor de izolare pentru două specii
primate: maimuţa Rhesus (Thomson 1995) şi Callithrix Jacchus (Thomson 1996). Această
realizare a facilitat dezvoltarea unor protocoale şi medii de cultură apte să susţină dezvoltarea
ESC umane. Această realizare are la bază rezultatele lui Steptoe şi Edwards (1980) care au
realizat recoltarea de ovule umane şi fertilizarea lor in vitro punând astfel bazele tratamentelor de
fertilizare in vitro (IVF).
ESC sunt considerate a fi celule stem pluripotente. Ele pot da naştere unor tipuri de
celule specifice fiecărui ţesut ce îşi are originea într-unul din cele trei straturi embrionare, chiar
dacă au fost cultivate o lungă perioadă de timp (Tab. 3.5).
Sursa ESC umane este pre-embrionul în vârstă de 4-5 zile. La această vârstă el se găseşte
în stadiul de blastocist, compus din trei elemente: trofoblast, blastocel şi masa celulară internă, şi
are un diametru de 0.1-0.2 mm şi aproximativ 50-100 de celule în masa internă.
Pentru obţinerea ESC (Fig. 3.4), celulele masei interne sunt aspirate din blastocist şi
cultivate în laborator după tehnici speciale. Tehnica de cultură este extrem de importantă pentru
ESC. Astfel, timpul de cca 18 ani de la izolarea ESC murine şi până la izolarea primelor ESC
umane, a fost folosit pentru punerea la punct a unor metode de cultură adecvate.
În acest moment, blastocişti destinaţi recoltării de ESC umane provin prin donaţie
consimţită, din partea cuplurilor sterile ce apelează la fertilizarea in vitro. Se apreciază existenta
unui număr de 400.000 de blastocişti crioprezervaţi, existenţi la nivelul anului 2003 în USA,
rămaşi neutilizaţi în urma procesului de IVF (Hoffman 2003).
26
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 3] Clasificare celulelor stem
Proprietăţile celor două tipuri de celule stem, fac ca utilizarea lor în clinică să fie încă
limitată.
Întrucât ESC dau naştere celulelor germinale, aceste produc ovule şi spermatozoizi, care
la rândul lor generează un zigot (ou fertilizat), se poate trage concluzia că oricare din aceste
celule cu caracter diploid, în timpul acestui ciclu, pot fi folosite pentru obţinerea de celule adulte
(Sell 2004b).
ESC, pluripotente, oferă o posibilitate terapeutică ridicată. Însă utilizarea lor este dificilă.
Momentan încă nu sunt cunoscute toate căile biochimice implicate în diferenţierea lor,
diferenţiere care necesită numeroşi paşi. În tot acest timp ESC sunt expuse numeroaselor
interacţiuni fizice şi chimice ce pot duce la modificări genetice cu răsunet asupra celulelor fiice.
Rejetul lor, este o posibilitate probabilă, ce îngreunează translaţia lor în clinică. În cele din urmă,
originea acestor celule, embrionul uman, pune probleme de ordin etic şi moral.
O altă dificultate îşi are originea în însăşi evoluţia acestor celule, care este destul de
lungă până la obţinerea unor celule diferenţiate, combinată cu o eficienţă scăzută. O posibilă
soluţie la această problemă este reprezentată de utilizarea unor celule stem adulte (precursoare)
sau de diferenţierea indusă controlată a ESC. Însă pentru aceasta, cultivarea ESC necesită
condiţii speciale, care la acest moment nu sunt cunoscute in totalitate.
Deşi recent s-a descoperit că multipotenţa SSC este relativă, utilizarea SSC în clinică nu
este mai aproape decât a ESC. Celulele stem adulte, în condiţiile potrivite se pot comporta
asemenea celulelor pluripotente, însă nu a fost izolată încă SSC care să producă toate celulele
specifice celor 3 straturi embrionare. Un alt impediment este reprezentat de raritatea acestor
celule în ţesuturile adulte, ceea ce le face dificil de izolat. Şi SSC sunt predispuse la afectări
genetice. Faptul că ele sunt înaintate pe scara diferenţierii, şi au trecut prin mai multe stadii, le
face susceptibile pentru achiziţia de malformaţii genetice în urma expunerii la soare, toxinelor,
erorilor de transcripţie şi replicare.
27
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 3] Clasificare celulelor stem
Reprezintă o achiziţie recentă în familia celulelor stem. Primul pas a fost făcut în 2006 de
către Takahashi şi Yamanaka la Universitatea Kyoto, care utilizând celule murine obţinute prin
inginerie genetică, au demonstrat că prezintă asemănări importante cu ESC (Takahashi 2006 ). În
anul 2007, două grupuri au publicat că aceste celule, în urma introducerii într-un embrion murin
obişnuit pot produce toate ţesuturile şoarecilor rezultaţi, inclusiv gameţi, o trăsătură denumită
germline transmission (Okita 2007) (Maherali 2007). În anul 2007, un grup de cercetători au
descoperit condiţiile optime necesare pentru a transforma celulele adulte somatice umane,
specializate, în celule cu potenţial stem. Procedeul are la bază aplicaţiile reprogramării genetice.
Astfel, celulele specializate (mature, diferenţiate) sunt condiţionate forţat să exprime factori şi
gene embryonic stem cell like (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) introduse cu ajutorul lentivirusurilor
(Kang 2009), conferind unei celule specializate caracterul stem pluripotent. Deşi aceste celule
îndeplinesc condiţiile definitorii pentru celulele stem pluripotente (marker-i specifici, producerea
de celule specifice celor 3 straturi embrionare), momentan nu se ştie dacă, clinic există diferenţe
între cele două tipuri de celule.
Pentru caracterizarea IPSC, oamenii de ştiinţă au preluat un test utilizat pentru
cuantificarea pluripotenţei ESC, numit complementare tetraploidă (CT). Prin acesta, doi pre-
embrioni în stadiul de două celule sunt fuzionaţi electric rezultând o celulă tetraploidă (Tam
2003) ce se poate divide normal, însă rareori poate genera un organism viabil tetraploid.
Utilizând CT, două echipe au reuşit să obţină indivizi murini viabili şi fertili din IPSC (Kang
2009) (Yhao 2009).
Prin acest test, IPSC dovedesc un comportament similar ESC. Acest fapt este confirmat şi
de profilul genic care este similar ESC şi celulelor de provenienţă ale IPSC (Kang 2009).
Până acum, aceste celule s-au dovedit un bun instrument pentru studiul citotoxicităţii
unor medicamente şi realizarea unor modele patogenice. Însă, până la utilizarea lor în
transplantologie este necesar depăşirea barierei impuse de utilizarea vectorilor virali în
producerea lor. În anumite studii animale aceste celule, prin virusul utilizat pentru reprogramarea
lor, au produs cancere.
IPSC reprezintă un model util în studiul bolilor genetice. Deşi au fost produse numeroase
tipuri de IPSC, provenite de la pacienţi cu diferite afecţiuni genetice, nu s-a arătat până acum
dacă evoluţia şi comportamentul acestora este diferit faţă de cel al IPSC provenite de la persoane
sănătoase. Utilizând IPSC provenite de la pacienţi cu disautonomie familială, Lee (2009), a
demonstrat că IPSC afectate de mutaţia genei IKBKAP, cauzatoare a acestei afecţiuni, se
comportă diferit in vitro (exprimă un nivel scăzut al genelor implicate în producerea neuronilor
periferici, produc mai puţini neuroni, celulele precursoare ale crestei neuronale prezintă o
mobilitate scăzută) faţă de cele fără această mutaţie.
Toate acestea vin în sprijinul ipotezei că aceste celule, generând culturi utile în studiul
patogeniei afecţiunilor genetice, sunt un instrument important în producerea unor noi substanţe
menite a corecta deficitele genetice cauzate de anumite mutaţii (Lee 2009).
28
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 3] Clasificare celulelor stem
Acest tip de celule au capacitat atenţia publicului, oferind şanse de vindecare pentru
tratarea unor boli degenerative şi genetice precum scleroza laterala amiotrofică (Dimos 2008),
siclemia (Hanna 2007), sindromul Shwachman-Bodian-Diamond, boala Gaucher, maladia
Duchenne, distrofie musculară Becker, boala Parkinson, diabet tip 1, sindrom Down (Park 2008).
29
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 4] Plasticitatea celulelor stem
Deşi există mai multe tipuri de celule stem cunoscute, nu toate prezintă aceleaşi
proprietăţi; fiecare tip de celulă stem prezintă o capacitate proprie de a se diferenţia într-un
anume tip de celulă specializată.
Plasticitatea se defineşte ca fiind proprietatea celulelor stem sau a celulelor progenitoare
de a produce celule fiice cu fenotipuri mature variate (Sell 2004a).
Pentru a caracteriza plasticitatea celulelor stem, ca urmare a observării evoluţiei acestora
au fost introduşi o serie de temeni ce ilustrează variaţia procesului de diferenţiere pentru unele
celule (Fig. 4.1).
30
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 4] Plasticitatea celulelor stem
scuamos). Pentru MSC se recomandă folosirea termenului de pleopotente deoarece sunt capabile
de a genera numeroase fenotipuri mature, fără a fi însă totipotente. (Sell 2004a)
Capacitatea de diferenţiere a celulelor stem, a fost caracterizată prin studii ce au vizat
urmărirea comportamentului acestor celule in vivo, in vitro şi după transplantarea lor. În funcţie
de capacitatea de diferenţiere, celulele stem se clasifică astfel (Tab. 4.1):
celule totipotente (lat. totus = totul): au potenţialul de a genera toate tipurile de celule din
organism sau necesare dezvoltării sale (inclusiv celulele trofoblastului); astfel de celule
sunt considerate a fi celulele zigotului până în momentul transformării sale în blastocist
(de la fecundare până în ziua 4). Sunt cel mai versatil tip de celule.
celule pluripotente (lat. plures = numeroase): sunt considerate celulele stem care prin
diferenţiere pot produce celule specifice celor 3 straturi embrionare; din această categorie
fac parte celulele stem embrionare (celulele masei interne a blastocistului) care spre
deosebire de celulele totipotente, ele formează întregul organism mai puţin placenta, care
este formată de trofoblast.
celule multipotente (lat. multi = multe): se pot diferenţia într-un număr limitat de celule
specializate, care sunt asociate cu un anumit organ sau funcţie; astfel de celule sunt
celulele stem hematopoietice, care dau naştere hematiilor, leucocitelor, limfocitelor,
plachetelor. Celulele urmaşe acestora, pe linie evolutivă, se numesc celule progenitoare
(pot produce mai multe tipuri de celule, însa şi-au pierdut capacitatea de self-renewal).
N.B. Termenii multipotent şi pluripotent sunt echivalenţi, definind celule ce pot produce
mai multe fenotipuri. După ghidul din 2000 al NIH (National Institute of Health) se
recomandă ca termenul pluripotent să fie aplicat celulelor capabile de a produce cât mai
multe dintre ţesuturile organismului iar cel de totipotent celulelor cu capacitate
nelimitată. (Sell 2004a)
31
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 5] Celulele stem mezenchimale: noțiuni introductive
Celulele stem mezenchimale sunt reprezentantul cel mai notoriu al celulelor stem adulte,
totodată fiind şi cele mai studiate din punctul de vedere al aplicaţiilor clinice, de aşteaptându-se
şi cele mai probabile rezultate terapeutice.
Clasic, MSC nominalizează cu precădere grupul de MSC izolate de la nivelul măduvei
osoase.
5.1 Definiţie
5.2 Nomenclatură
32
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 5] Celulele stem mezenchimale: noțiuni introductive
Glosarul de termeni pentru această noţiune şi acest grup de celule este variat (Tab. 5.1).
În literatura de specialitate se folosesc mai mulţi termeni pentru a denumi celula sau populaţia de
celule cunoscute sub numele de celule stem mezenchimale.
Alături de aceşti termeni, mai există un grup derivat din câmpul de activitate în care a fost
realizat studiul ce a vizat aceste celule. Astfel, în hematologie se foloseşte termenul de „unităţi
colonii formatoarea fibroblastice” (CFU-F), primul nume atestat în literatură pentru aceste celule
de către Friedenstein, pentru a denumi celulele cu caracter mezenchimal izolate din măduva
osoasă. Un alt termen din sfera hematologie, ce poate îngloba în el populaţia de MSC din MO,
este cel de „celule stromale” (Dennis 2004). Tot pentru acestea se poate utiliza şi termenul de
BM-MSC (bone marrow mesenchymal stem cells) insistând pe originea lor medulară.
În literatură, toată această mulţime de termeni sinonimi poate crea confuzie pentru cititor.
Se poate observa din figura de mai jos (Fig. 5.1), cum se impune un trend în literatura de
33
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 5] Celulele stem mezenchimale: noțiuni introductive
Fig. 5.1. Numărul citațiilor PubMed pentru MSC (căutare în toate câmpurile).
34
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 5] Celulele stem mezenchimale: noțiuni introductive
recomandă clarificarea nomenclaturii acestor celule, cu scopul utilizării unui limbaj unitar
standardizat, corect ştiinţific. (Horwitz 2005)
Astfel a fost propus ca celulele aderente la plastic, denumite în mod curent celule stem
mezenchimale să fie redenumite folosind titulatura de celule stromale mezenchimale
multipotente, iar termenul de celule stem mezenchimale să fie utilizat doar pentru a denumi acea
fracţie de celule din populaţie care prezintă indubitabil caracteristici de celulă stem. Indiferent de
tipul de populaţie pentru care se utilizează, se poate folosi abrevierea MSC însă specificând în
text tipul populaţiei la care se face referire. Folosirea abrevierii MSC se justifică pentru
continuarea discursului ştiinţific în articole ca urmare a intrării în vocabularul cercetătorilor.
(Horwitz 2005)
Cuvântul stem a fost îndepărtat din denumire deoarece face referire la proprietăţi ce nu
sunt caracteristice MSC (i.e. self-renewal pe o perioadă nedeterminată şi potenţial de diferenţiere
multiliniară in vivo). Rezultatele actuale care au arătat anumite caractere de multipotenţialitate nu
sunt suficiente pentru a considera aceste celule ca fiind stem. În plus, populaţia MSC nu este
omogenă, eterogenitatea acesteia fiind exprimată şi prin procentul scăzut de celule izolate care
generează CFU-F. (Horwitz 2005)
Prin analogie cu hematologia, aşa cum nu toată populaţia celulelor CD34+ este
considerată stem, deşi conţine celule stem hematopoietice, nici populaţia celulelor plastic-
aderente nu trebuie considerată ca fiind stem. În plus, deşi rezultatele in vitro indică prezenţa
unei celule mezenchimale potenţial stem, in vivo rezultatele privind supravieţuirea nelimitată şi
diferenţierea multiliniară nu sunt concludente. (Horwitz 2005)
Deşi anumite grupuri ştiinţifice consideră termenii MSC şi celule medulare stromale ca
fiind echivalenţi (Prockop 1997), studii amănunţite au arătat că este vorba despre două populaţii
distincte cu caracteristici specifice. MSC – celule omogene, cu aspect fibroblastic, cu rol
suportiv al hematopoiezei mai scăzut decât al celulelor medulare stromale. Celulele medulare
stromale – sunt mai puţin omogene prezentând simultan caracteristici fibroblastice şi rol suportiv
hematopoietic mai important (Tuan 2003). Având acest background, Tuan (2003) consideră pe
baza existenţei acestor celule în acelaşi spaţiu (MO), că celulele stromale medulare sunt celule
primitiv diferenţiate din MSC.
Cu toate că nu este o denumire completă şi corectă, “celula stem mezenchimală” a
depăşit graniţa MO, pentru care fusese iniţial utilizată ajungând să denumească toate populaţiile
de celule stromale fibroblast-like identificate în ţesuturile conjunctive postnatale (e.g. ţesut
adipos). Ca rezultat al acestei incompatibilităţi unii autori au propus termenul de „celule
mezenchimale progenitoare”.
Deşi conceptul existenţei unei celule stem bona fides la nivelul MO a depăşit proba
timpului, fiind motivat mai ales de rezultatele recente, discuţia asupra denumirii corecte încă
rămâne deschisă.
În elaborarea unui termen corect şi complet trebuie să se ţină cont de funcţia celulei,
metoda de analiză şi evaluare, fenotip şi morfologie. Astfel, în ceea ce priveşte funcţia este de
preferat, până în momentul demonstrării că BMSC se pot diferenţia in vivo în alte ţesuturi non-
scheletale, ca denumirea practicată să fie aceea de „celule stem scheletale” (Bianco 2008).
Sub aspectul metodei de cultură, se recomandă ca termenul CFU-F să fie folosit pentru a
desemna celulele clonogene în cultură; pentru a cuprinde şi originile CFU-F, acest termen poate
fi precedat de prefixul ţesutului din care a fost izolat (e.g. AT – pentru ţesutul adipos – AT-CFU-
F sau BM – pentru măduva osoasă – BM-CFU-F, etc.)
Însă, pentru o simplificare şi o exprimare corectă este de preferat a se utiliza termenul de
„celule adulte mezenchimale progenitoare” sau “celule stromale mezenchimale multipotente”,
pentru a denumi populaţia de celule capabilă a se diferenţia într-o mare varietate de ţesuturi
mezenchimale şi non-mezenchimale.
Utilizarea termenului de celule stromale mezenchimale multipotente este cea mai
corectă ştiinţific fără a face referire la caracteristicile biologice sau terapeutice nedovedite
ştiinţific. (Horwitz 2005)
35
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 5] Celulele stem mezenchimale: noțiuni introductive
5.3 Istoric
Prezenţa MSC la nivelul măduvei osoase a fost teoretizată extensiv în a doua jumătate a
secolului al XX-lea, începând cu Owen (1978) (Dennis 2004), care a prezentat conceptul de
celulă stem cu localizare medulară. Doi ani mai târziu, Tiell şi McCulloch, au propus existenţa
unei linii celulare analoage liniei hematopoietice la nivelul MO (Till 1980).
Deşi a doua jumătate a secolului al XX-lea a oferit cea mai mare cantitate de informaţii
referitoare la MSC, ducând la identificarea lor, primele observaţii experimentale ce au dezvăluit
proprietăţile „speciale” ale MO, datează din anul 1869 (Dennis 2004).
Goujon a fost primul care a documentat prezenţa celulelor progenitoare mezenchimale în
MO, demonstrând capacitatea osteogenică a MO în urma transplantului heterotop de MO la
iepure. Rezultatele acestuia au fost confirmate în 1870 de către Biakow (Dennis 2004). Tot în
aceeaşi perioadă, Cohneim a propus existenţa unor fibroblaste medulare implicate în vindecarea
a numeroase ţesuturi periferice (Ohishi 2010).
Începând cu Danis (1960), şi continuând cu Petrakova (1963) şi Friedenstein (1966), o
serie de experimente au reluat teoria osteogenică a MO, demonstrând că MO are capacitatea de a
forma os şi cartilaj, de novo (Dennis 2004).
Cu toate că proprietăţile osteogenice ale fragmentelor de MO fuseseră observate începând
cu 1869 de către Goujon, identificarea propriu-zisă a celulelor responsabile de acest
comportament s-a realizat mult mai târziu, anii 1960-1970, având ca substrat rezultatele lui
Fridenstein care a reuşit identificarea subpopulaţiei celulare osteogenice din MO. În 1976
Friedenstein a descris populaţia celulară clonală, aderentă la flask-ul de cultură, sursă de
diferenţiere osteoblastică, adipogenică şi condrogenică (Friedenstein 1976). Acesta, a lăsat timp
de 4 ore măduva osoasă în placi de cultură. După eliminarea fracţiei lichide, care a îndepărtat
celulele neaderente hematopoietice, a observat că celulele care au aderat sunt eterogene, însă cele
mai aderente au o forma „spindel-shape” formând grupuri de 2-4 celule. După o perioadă de
latenţă de 2-4 zile, acestea se multiplică rapid putându-se diferenţia în colonii cu aspect osos sau
cartilaginos (Chamberlain 2007).
Legătura dintre aceste celule şi compartimentul stromal al MO a fost observată în a doua
jumătate a anilor ’’70 având la bază munca lui Tavassoli, Friedenstein şi Owen. În aceeaşi
perioadă a luat naştere şi conceptul de „nişa a celulelor stem” (Schofield 1978), ce a favorizat
apariţia ideii de asociere şi reglare a comportamentului celulelor stem hematopoietice cu
micromediul celular înconjurător, fapt susţinut de rezultatele obţinute de către Allen (1978),
Dexter (1977) (Bianco 2008).
Cele mai mari eforturi în găsirea grupului de celule răspunzătoare de această proprietatea
a MO, au fost depuse de către Friedenstein. Acesta a reconfirmat proprietăţile osteogenice ale
fragmentelor de măduvă osoasă, prin transplant heterotop (sub capsula renală, la şoareci),
capacitatea de creştere la acel nivel, self-renwal şi de suport hematopoietic. În 1970, a descoperit
capacitatea celulelor stromale medulare de a forma colonii; fiecare celula fiind capabilă a
produce o astfel de colonie, numindu-le CFU-F (colony-forming unit fibroblastic) (Bianco
2008). În 1973, a identificat iniţial celulele din CFU-F, ca fiind cauzatoare ale acestui
comportament al MO. Ulterior (1980) a demonstrat că aceste colonii sunt alcătuite din celule
36
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 5] Celulele stem mezenchimale: noțiuni introductive
individuale capabile a se diferenţia atât în ţesut osos cât şi în ţesut de susţinere hematopoietic,
identificând astfel cel de al treilea fenotip prezent în MO (Dennis 2004). Rezultatele sale au
permis şi dezvoltarea culturilor de celule hematopoietice. Observaţiile privind rolul celulelor
stromale fibroblast-like aderente în suportul hematopoiezei au permis utilizarea acestora ca
feeder layer pentru culturile de MO.
În 1980, Castro-Malaspina a raportat izolarea de CFU-F din MO umană. (Ohishi 2010)
Ulterior Owen (1985) a propus un model pentru linia stromală a MO (Fig. 5.2) ce
cuprindea mai multe compartimente: al celulelor stem, al celulelor progenitoare şi al celulelor
mature. De asemenea, tot el a realizat şi o schemă de diferenţiere a celulelor stromale pe linie
reticulară, fibroblastică, adipocitară şi osteogenică (Dennis 2004).
Având aceste antecedente, actul de naştere al MSC a fost semnat în anul 1991, când
Caplan a propus existenţa unui grup de celule, la nivelul MO, capabil de a genera mai multe
fenotipuri: adipos, tendon, ligament, muşchi, derm (Caplan 1991).
În ceea ce priveşte multipotenţa acestor celule, ea a fost demonstrată de către mai multe
studii realizate de Friedenstein (1970), Bennet (1991), Dennis (1999) şi Caplan (1997). Aceştia
au identificat în populaţia MSC, celule cu potenţă ce variază de la unipotent până la cvadripotent.
Rezultate similare au fost raportate şi în urma utilizării MO umane (Pittenger 1999).
Cu toate că date elocvente referitoare la existenţa celulelor non-hematopoietice medulare
şi posibila relaţie cu celulele stem hematopoietice (HSC), cât şi la capacitatea osteogenică şi
apartenenţa la compartimentul stromal al MO, au fost documentate de numeroase studii în
antecedente, conceptul ce vizează existenţa unei populaţii celulare non-hematopoietice la nivelul
MO nu a fost utilizat extensiv decât după anul 1999 când Pittenger (reprezentând corporaţia
OSIRIS Therapeutics, Inc.) a publicat rezultate asemănătoare cu ale predecesorilor săi (Bianco
2008).
Fig. 5.2. Modelul liniei stromale medulare al lui Owen. (Dennis 2004)
37
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 5] Celulele stem mezenchimale: noțiuni introductive
Popularizarea termenului „mesenchymal stem cells (MSC)” a fost realizată tot în aceeaşi
perioadă, dorind să înlocuiască termenii clasici de „celula stromale” sau „celule osteogenice”
(propus de Caplan în 1991) (Bianco 2008).
Răspândirea termenului s-a realizat concomitent cu apariţia în literatură a datelor
referitoare la ESC, beneficiind astfel de ideea că MSC sunt un tip de celule stem postnatale, cu
potenţă şi aplicaţii asemănătoare ESC. Această presupunere s-a regăsit în numeroase studii ce au
arătat potenţialul transgermal (i.e. plasticitate) (Beltrami 2007) (Poulsom 2002) al acestor celule,
fără a fi însă confirmat şi in vivo.
38
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 6] Localizarea/Surse MSC
6 LOCALIZAREA/SURSE MSC
Ţesuturile postnatale posedă rezervoare specifice ce conţin celule stem: celulele stem
epiteliale din epidermă şi criptele intestinale (Slack 2000), celulele stem din SNC (McKay 1997),
celulele satelite din muşchi (Charge 2004), HSC şi MSC din MO.
La adult principala sursă de MSC este reprezentată de măduva osoasă (bone marrow
MSC – BM-MSC); însă până la acest moment, MSC au fost identificate în mai multe ţesuturi
precum: MO, muşchi, piele (Pettis 1990), ţesut adipos (Gronthos 2001) (Zuk 2001), periost şi
ţesut patologic articular specific artritei reumatoide (Chamberlain 2007), sânge din cordonul
ombilical, placentă (Igura 2004), lichid amniotic (Tsai 2004), sânge periferic (Zvaifler 2000),
ficat fetal (Campagnoli 2001), plămân fetal (Anker 2003) şi ţesutul dentar decidual (Miura
2003). Deşi au fost izolate din numeroase ţesuturi, prezentând capacităţi de proliferare şi
diferenţiere diferite (Tab. 6.1), nu există rezultate complete privind echivalenţa acestor populaţii.
Deşi măduva osoasă reprezintă principalul rezervor pentru MSC (fiind şi cel mai bogat la
adult – Tuan 2003), Pittenger a arătat că numai un mic procent (0.001-0.01%) din totalul
celulelor mononucleare izolate prin gradient de densitate din MO produc colonii celulare
aderente la plastic cu aspect fibroblast-like (Pittenger 1999). După alţii numărul de CFU-F
medulare ar fi între 1/10000 şi 1/100000 de celule mononucleare din MO (Castro-Malaspina
1980). Raportat la întreaga populaţie HSC (1%) medulară, cantitatea de MSC izolate direct este
infimă.
O alternativă la MO este ţesutul osos trabecular (Tuli 2003). Având în vedere
multitudinea ţesuturilor din care au fost izolate MSC, Tuan (2003) afirmă că MO reprezintă sursa
unui fond comun de celule multipotente care capătă acces prin intermediul circulaţiei în diferite
ţesuturi, adoptând caracteristicile necesare regenerării ţesutului respectiv (i.e. fenotip mono sau
bipotent).
Cantitatea de MSC din organism variază cu vârsta (Fibbe 2003) şi prezenţa afecţiunilor
sistemice (Inoue 1997). Astfel, cel mai mare număr de celule se găseşte la nou născuţi, însă pe
durata vieţii acesta scade ajungând la aproximativ 50% la vârsta de 80 de ani (Fibbe 2003).
Acesta poate fi şi motivul pentru care ţesuturile copiilor se vindecă mai uşor. Fiziologic,
scăderea numărului celulelor stem se datorează mai multor factori, precum: diferenţierea în
celule adulte şi senescenţa celulară (Pittenger 2008 carte). În timpul vieţii fetale MSC ating o
valoare maximală în primul trimestru, urmând să scadă în trimestrul al doilea până la 0.0001%.
La naştere în cordonul ombilical se găsesc într-un procent de cca 0.00003% (Campagnoli 2001).
În ultima vreme au fost izolate din MO, celule care în afară de cele trei fenotipuri clasice
(osteoblaste, condroblaste şi adipocite) se pot diferenţia în cultură şi în ţesuturi ecto şi
endodermale. Din acest grup de celule pluripotente fac parte: MAPC (multipotent adult
progenitor cells) (Jiang 2002), hBMSC (human bone marrow derived multipotent stromal cells)
(Yoon 2005), MIAMI (marrow isolated adult multiliniage inducible cells) (D-ippolito 2004),
VSEL (very small embryonic-like stem cells) (Kucio 2006). Celule similare au fost găsite şi în
sângele din cordonul ombilical (USSC – unrestrictioned somatic stem cells) (Kogler 2004),
ţesutul adipos (Rodriguez 2004) şi lichidul amniotic (de Coppi 2007). Întrucât cultivarea în
condiţii speciale in vitro a acestor celule conduce la obţinerea unor celule progenitoare
mezenchimale (dar şi ecto şi endodermale) cu potenţial restricţionat (Verfaillie 2002), cumulată
cu eşecul izolării lor din ţesuturi proaspete, face să planeze dubii asupra existenţei lor in vivo.
39
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 6] Localizarea/Surse MSC
Deşi manifestă potenţial mezenchimal, nu se ştie dacă aceste celule reprezintă subpopulaţii MSC
sau populaţii celulare diferite MSC-like.
40
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 7] Originea MSC
7 ORIGINEA MSC
Încă nu se cunoaşte cu certitudine originea acestor celule, la acest moment existând mai
multe teorii ce speculează acest subiect.
Cea mai răspândită teorie, ce doreşte a explica originea MSC în diferite ţesuturi, face o
legătură între MSC şi linia celulară musculară netedă prin intermediul pericitelor (Galmiche
1993) şi al vascularizaţiei. O dovadă ce sprijină această ipoteză este proprietatea osteogenică
(Brighton 1992) şi condrogenică (Doherty 1998) a pericitelor.
Pericitele, numite şi celule peri-endoteliale sau celule Rouget, sunt celule murale ce se
găsesc în vasele mici (arteriole, venule şi capilare) şi mari, pe suprafaţa abluminală, opuse
celulelor endoteliale cu care au relaţii fizice şi umorale. Există şi categorii de pericite specifice
unor organe, precum celula Ito hepatică, celulele mezangiale renale şi celulele adventiceale
reticulare medulare (ARC) (Tab. 7.1). Deoarece se găsesc în toate vasele, ele realizează o reţea
ce acoperă întreg organismul. Ele sunt definite de următoarele caracteristici: contact fizic cu
celulele endoteliale mediat de joncţiuni tip gap, exprimă cel puţin un marker specific fără a
exprima marker-i pan-endoteliali.
Pericitele pot fi o sursă locală de celule diferenţiate pentru ţesuturi. Studii pe animale au
arătat că sunt implicate în repararea fracturilor prin diferenţiere în condrocite şi osteocite; în plus,
se pot diferenţia în adipocite (contribuind la regenerarea ţesutului lezat) şi celule Leydig. (da
Silva 2008)
Fiind o sursă importantă de celule cu rol în regenerarea ţesuturilor mezenchimale, găsirea
originii MSC beneficiază şi de o explicaţie embriologică. Deşi se speculează că în timpul
dezvoltării sale ontogenetice, organismul uman sădeşte în ţesuturile mezenchimale celule
progenitoare necesare întreţinerii tournover-ului, nu se cunoaşte cu exactitate provenienţa MSC
nici măcar la nivelul MO (Dennis 2004).
Conform teoriei embriologice clasice, MO se formează în urma colonizării cartilajului
hipertrofic de la nivelul treimii medii a oaselor lungi, de către procesul de vascularizaţie (Pechak
1986). Această etapă are loc după ce ţesutul osos nou format ce acoperă acest cartilaj, a fost
mineralizat. Alături de vascularizaţie la acest proces participă şi elementele medulare şi celulele
hematopoietice ce migrează din ficatul fetal (Dennis 2004).
O posibilă explicaţie asupra colonizării MO cu MSC, ilustrează trei posibile căi: (1)
colonizează odată cu vascularizaţia; (2) migrează de la nivelul periostului (care prezintă o
multipotenţialitate documentată (Nakahara 1992)) urmând calea vasculară, după ce procesul de
vascularizaţie s-a încheiat; (3) sosesc pe cale sangvină, ilustrând posibilitatea existenţei MSC
circulante (Dennis 2004).
41
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 7] Originea MSC
Deşi primele două căi sunt înrudite, între ele diferind doar momentul începerii
colonizării, cea de a treia cale oferă o nouă perspectivă asupra originii MSC şi a utilizării lor
terapeutice. Astfel, se poate lua în considerare calea de administrare sistemică în cazul folosirii
lor în clinică.
Primele două mecanisme sunt susţinute de observaţiile experimentale asupra pericitelor
(celule asociate capilarelor) şi celulelor musculare netede medulare. Pericitele exprimă marker-i
specifici celulelor musculare netede şi sunt capabile a se diferenţia în celule musculare netede
(Meyrik 1981), osteoblaste (Brighton 1992) condrocite şi adipocite (Doherty 1998). Localizarea
pericitelor la nivelul periostului, le conferă acestora locul şi momentul potrivit migrării în MO.
Mai mult, au fost puşi în evidenţă marker-i celulari comuni MSC, CFU-F şi pericitelor.
Astfel, este cazul antigenului STRO-1 (Doherty 1998) şi MCAM, exprimat activ de către
pericite.
O dovadă funcţională este reprezentată de funcţia periostului în repararea fracturilor. În
1941, Duhamel du Monceau a identificat periostul ca fiind agentul important în repararea osului,
idee ce a precedat teoria celulară a lui Schleiden şi Schwann. Făcând legătura între proprietăţile
osteogenice ale pericitelor, localizarea lor periosteală şi rolul periostului în repararea fracturilor
se poate obţine un argument solid pentru teoria lui Albrecht von Haller, care a afirmat că sursa
osului este în artere, iar periostul are doar rol de hrănire (Dennis 2004).
În plus, Bianco (2008) a arătat că celulele subendoteliale MCAM/CD146+ (pericite), din
MO, sunt singurele celule medulare care sunt clonogenice in vitro şi pot transfera funcţia de
suport hematopoietic, ectopic.
da Silva (2008) consideră că la nivel medular corespondentele MSC din cultură par a fi
celulele adventiceale reticulare (ARC). Acestea, din punct de vedere funcţional sunt suport al
hematopoiezei (similar MSC), contribuind la realizarea nişei HSC (e.g. secreta SDF-1
(CXCL12)), putând transfera funcţia de suport hematopoietic, ectopic (e.g subcutanat),
asemănător MSC în. În plus, ontogenetic, hematopoieza apare iniţial în oasele lungi, după ce
apar celulele mioide pe suprafaţa abluminală a vaselor ce invadează macheta de ţesut cartilaginos
a viitorului os. Pericitele se pot diferenţia în celule mezenchimale (i.e. adipocite, condrocite şi
osteoblaste) in vitro şi in situ, test caracteristic MSC (demonstrat in vitro, fără a fi confirmat însă
in vivo). Toate acestea susţin corespondenţa MSC-ARC pentru MO. (da Silva 2008)
Capacitatea pericitelor de a avea mai multe fenotipuri in vivo, în funcţie de organul în
care se găsesc, poate justifica comportamentul MSC in vitro de a genera fenotipuri similare
celulelor mature specifice organului gazdă cât şi capacitatea de a-şi însuşi fenotipul celulelor
mature în caz de co-cultură. Totodată această observaţie poate susţine şi influenţa nişei asupra
celulelor stem, condiţionându-le diferenţierea. (da Silva 2008)
Având în vedere aceste rezultate da Silva (2008), propune un model teoretic ce încearcă
să explice originea şi localizarea MSC, realizând o legătură între acestea şi pericite. Modelul său
pleacă de la ipoteză că celulele MSC in vitro sunt de fapt pericite in vivo, mai exact sunt de fapt
celulele progenitoare provenite din celulele stem perivasculare (i.e. pericite). Astfel, MSC se
găsesc în tot organismul sub forma pericitelor, fiind localizate la nivelul unei nişe peri-vasculare
şi având rolul de a stabiliza vasele sangvine şi în homeostazia celulară tisulară; ele sunt eliberate
când vasele de sânge sunt lezate, se divid şi secretă factori umorali (au efect trofic, anti-
apoptotic, inhibă cicatrizarea, stimulează angiogeneza şi pro-mitotic pentru celulele progenitoare
tisulare implicate în repararea ţesutului respectiv). Deşi termenul de celule perivasculare descrie
un amestec de celule stem asociate compartimentului perivascular, numai o parte a acestora pot
genera MSC in vitro. (da Silva 2008)
În ceea ce priveşte localizarea lor, teoretic se citează trei posibilităţi. Prima consideră că
MSC sunt localizate la nivelul unui organ sursă (posibil MO), de unde migrează către alte
ţesuturi, înlocuind celulele apoptotice (această variantă este puţin probabilă, datorită dificultăţii
cu care au fost izolate din sângele periferic). În cea de a doua, MSC se găsesc cantonate în mai
multe organe (se bazează pe succesul izolării lor din acestea). Cea mai recentă variantă provine
din modelul lui da Silva (2008): MSC sunt localizate la nivelul patului perivascular din tot
corpul. Astfel, se poate explica de ce sunt izolate din atât de multe ţesuturi şi de ce au
42
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 7] Originea MSC
43
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 7] Originea MSC
Rezultate recente plasează originea MSC la nivelul crestei neurale. S-a observat că
primele celule cu aspect MSC-like ce apar la embrion sunt generate de neuroepiteliul Sox 1+ din
creasta neurală. Această observaţie este susţinută de faptul că celulele derivate din creasta
neurală migrează către MO prin sânge, fiind prezente în MO la adult şi având potenţial de
diferenţiere neuronal, glial şi miofibroblastic. (Ohishi 2010).
Foster (2008) a arătat că celule derivate din creasta neurală pătrund în timus unde rămân
cantonate sub forma pericitelor. În plus originea neurală a pericitelor cerebrale a fost deja
demonstrată. Aceste rezultate pot susţine speculaţii privind originea neurală a MSC, explicând şi
izolare cu succes a MSC medulare pe baza marker-ului low-affinity nerve growth factor receptor
(LNGFR) şi faptul că MSC au proprietatea de diferenţiere neurală. În plus, ARC sunt pozitive
pentru factorii de creştere neuronali. Se speculează astfel că celulele crestei neurale
supravieţuiesc la adult sub forma pericitelor. (da Silva 2008)
Legătura între cele două teorii este realizată de către următoarea observaţie:
mezangioblastele provin din aorta dorsală embrionară, care se află în contact strâns cu tubul
neural în jurul vârstei de 9 zile, moment în care celulele neuroepiteliale Sox 1+ sunt singurele ce
exprimă caracteristici MSC-like când sunt cultivate. Ipoteza în care celulele neurale pot migra în
aorta dorsală formând mezangioblaste, astfel încât pericitele şi MSC să provină din celule
neurale Sox 1+ nu poate fi contestată. (da Silva 2008)
Deşi se întrevede o legătură susţinută cu dovezi clare, între pericite şi MSC, mai sunt
necesare numeroase studii care să descopere cu exactitate mecanismul de apariţie al MSC.
44
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 8] Biologia MSC
8 BIOLOGIA MSC
Înţelegerea biologiei SSC in vivo este critică pentru dezvoltarea terapiilor celulare bazate
pe celule stem. Cele mai multe date sunt semnificative pentru MSC medulare, al căror studiu
datează încă din a doua jumătate a sec al XIX-lea.
In vivo se presupune că sunt apte pentru a rămâne într-o stare latentă de nediferenţiere
până la acţiunea stimulului triger, replicându-se asimetric şi producând celule diferenţiate
necesare regenerării ţesutului de rezidenţă. (Tuan 2003)
MSC reprezintă o populaţie eterogenă, ale cărei proprietăţi depind de micromediul în care
se află, ce formează în cultură colonii CFU-F. Numărul de colonii obţinut din aspiratul medular
depinde de specie, vârsta donatorului şi condiţiile de cultură (Bobis 2006).
Un aspect specific BM-MSC umane ce le diferenţiază de MSC provenite de la rozătoare
cât şi de ESC umane este reprezentat de lipsa substratului feeder cells necesar ESC umane şi
MSC recoltate de la rozătoare (Bruder 1997) atingerii eficienţei maxime a culturii.
În ceea ce priveşte analiza culturilor MSC, unele studii (Im 2005) au arătat eterogenitatea
acestora, contestând concepţia clasică conform căreia culturile MSC cuprind un singur fenotip
celular (celule fusiforme) (Pittenger 1999). A fost observată în cultură prezenţa a cel puţin două
fenotipuri: celule fusiforme, mici şi celule cuboidale/plate, mari (Im 2005).
Referitor la capacitatea proliferativă există contradicţii. Reyes (2001) identifică un tip
celular cu reînnoire rapidă (celule mici) şi unul cu reînnoire lentă (celule mari). În contrast cu
aceasta Colter (2000) atribuie celulelor mici un fenotip lent în ceea ce priveşte evoluţia ciclului
lor celular (celule mici şi agranulare, numite şi RS-1, cu o capacitate scăzută de a forma colonii).
Cu toate acestea, celulelor RS le-a fost asumată capacitatea de a coordona evoluţia/expansiunea
întregii culturi MSC, precum şi capacitatea de a răspunde la stimulii produşi de MSC mature
jucând astfel rolul de regeneratori ex vivo ai culturii MSC (Colter 2000). În 2001, Colter a
identificat un al treilea fenotip: celule foarte mici (7µ) cu raport nucleu/citoplasma mare,
fusiforme, ce se pot reînnoi rapid, fiind considerate progenitori timpurii cu cea mai mare
capacitate de diferenţiere multiliniară. Acestor celule le-au fost atribuiţi următorii marker-i de
suprafaţa şi proteine: receptorul 2 al VEGF, receptorul pentru tirozin kinază, receptorul pentru
transferină, lipocortina 2, CD117 şi epitopul de rezistenţă multidrog. Un element important îl
constituie lipsa STRO-1, considerat a fi un marker de bază al MSC (Dennis 2002).
Unul dintre cele mai recente studii, (Lee 2010), ce a evaluat capacitatea proliferativă a
MSC la nivelul unei singure celule a identificat patru tipuri celulare: HPP-MCFC (high
proliferativepotential mesenchymal colony-forming cells), cca 7% din totalul coloniilor, cu
fenotip pozitiv pentru SH-3, CD29, CD71, CD90- şi negativ pentru CD14, CD34, CD45; LPP-
MCFC (low proliferativepotential mesenchymal colony-forming cells), cca 29%; MCC
(mesenchymal cell clusters), cca 26%; şi MMC (mature mesenchymal cells), cca 38%. În ceea ce
priveşte potenţialul de diferenţiere, HPP-MCFC au putut fi diferenţiate pe cele trei linii clasice,
LPP-MCFC pe linie osteogenică şi condrogenică slabă, în timp ce, MCC şi MMC au putut fi
diferenţiate cu un randament scăzut în linii osteogenice şi adipogenice. Acest studiu confirmă
eterogenitatea MSC, demonstrând că la baza potenţialului MSC poate sta o singură subpopulaţie
(HPP-MCFC).
În ceea ce priveşte funcţia MSC la nivelul MO, aceasta este variată şi depinde de tipul
fenotipului MSC exprimat (Dennis 2004). Astfel, principalul rol, deşi discutat, constă în
45
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 8] Biologia MSC
realizarea reţelei stromale de susţinere a hematopoiezei, după diferenţierea lor în celule stromale
(Trentin 1976). MSC sprijină hematopoieza acţionând ca feeder layer pentru HSC (Dexter 1982).
La acest moment, nu este cert dacă MSC participă ca suport al hematopoiezei în mod
direct sau prin intermediul progeniturilor lor stromale, deşi după unii autori (Dennis 2004) aceste
două tipuri de celule ar fi identice; însă rezultatele mai multor echipe au arătat că multe dintre
celulele stromale se pot diferenţia în ţesuturi mezenchimale, constituind astfel un rezervor latent
de celule cu fenotip posibil MSC (Dennis 2004).
MSC sunt implicate în susţinerea hematopoiezei prin realizarea unui micromediu
suportiv celular şi prin intermediul asigurării, stabilizării şi întreţinerii reţelei sinusoidale a MO
(Sacchetti 2007). Rolul MSC la nivelul MO a fost demonstrat de numeroase studii experimentale
ce au dovedit persistenţa MSC marcate la nivelul MO precum şi contribuţia acestora la
accelerarea procesului de repopulare medulară în caz de cotransplant MSC + HSC (Koc 2000).
La nivelul MO, MSC secretă factori implicaţi în homing-ul (stromal derived factor 1) sau
proliferarea şi diferenţierea HSC (GM-CSF, SCF, IL-6) (Hoffman 2002). Se speculează ideea că
în cadrul homeostaziei MO, secreţia chemokinelor pentru receptorii CCR9 şi CXCR4 acţionează
autocrin asupra MSC, într-un mod similar HSC (Honczarenko 2006).
La nivelul compartimentului stromal al MO, dar nu numai, MSC produc o paletă largă de
proteine matriceale extracelulare, factori de creştere, chemokine şi citokine (Tab. 8.1). Aceste
substanţe sunt produse atât de celulele latente cât şi după stimulare adecvată (Bobis 2006). În
plus, producerea lor poate fi condiţionată şi de interacţiunea cu alte tipuri celulare(Aggarwal
2005) (Le Blanc 2005) (Groh 2005).
46
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 8] Biologia MSC
Fig. 8.2. Chemokinele şi receptorii din familia CXC, CX3C şi XC. (Chamberlain 2007)
47
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 8] Biologia MSC
pentru a migra selectiv în ţesuturi (i.e. MSC pot utiliza CCR9 pentru a migra la nivel intestinal
sau CCR1 pentru a se localiza la nivelul articulaţiilor inflamate sau al encefalului în scleroza
multiplă). (Chamberlain 2007)
La această vastă gamă de molecule de pe suprafaţa MSC se adaugă şi prezenţa
moleculelor de adeziune precum: integrinele α1, α2, α3, α4, α5, αv, β1, β3, β4, VCAM-1,
ICAM-3, ALCAM, CD105, VLA-4 etc. (Chamberlain 2007)
Alături de participarea la homeostazia hematopoiezei, MSC manifestă un rol important şi
în cadrul răspunsului imunitar. Aceste celule sunt puternic imunomodulatoare influenţând atât
răspunsul imun celular cât şi pe cel umoral. Influenţa asupra limfocitelor T (LT) este inhibitoare.
MSC nu prezintă pe suprafaţa lor molecule din clasa II MHC sau receptori co-stimulatori (CD80,
CD86), neavând astfel funcţie de celulă prezentatoare de antigen (Angoulvant 2004). MSC
provenite de la mai multe specii au manifestat o puternică influenţă inhibatoare asupra
răspunsului LT la stimuli policlonali (di Nicola 2002).
Inhibiţia manifestată este antigen nespecifică şi vizează răspunsul imun primar şi
secundar deopotrivă (Krampera 2003), având la bază inhibarea proliferării celulelor T care sunt
oprite în faza G1 a ciclului celular ca urmare a scăderii nivelului ciclinei D (Glennie 2005).
Acest proces nu este apoptotic şi poate fi reversat (di Nicola 2002). Deşi mecanismul acestei
relaţii nu este cunoscut se speculează implicarea contactului fizic celulă-celulă, precum şi a
factorilor solubili (TGF-β şi HGF) ca urmare a observaţiilor făcute atunci când interacţiunea a
fost blocată prin introducerea în mediul de reacţie a anticorpilor anti TGF-β şi HGF (di Nicola
2002). (pe larg în capitolul XI)
Având potenţial condrogenic şi osteogenic, MSC participă activ atât în cadrul procesului
de reparare a fracturilor cât şi în cel de turnover osos. Conform schemei elaborate de Ham şi
Harris în 1971, MSC colonizează cheagul post-fractură contribuind la formarea calusului şi apoi
la procesul de condrogeneză şi osificare encondrală.
Referitor la turnover-ul osos, MSC participă prin intermediul osteoblastelor – celule
osteogenice diferenţiate din MSC medulare, având astfel rol în procesul de osteosinteză. Se
apreciază că anumite afecţiuni degenerative corelate cu vârsta, ce asociază pierdere de ţesut osos,
pot fi cauzate de diminuare nişei MSC medulare sau de un acces dificil la aceasta (Dennis 2004).
Un alt rol, mult mai controversat, este consemnat de prezenta fenotipului adipocitar în
rândul MSC. Deşi numeroase laboratoare au demonstrat că MSC se pot diferenţia în adipocite,
nu se cunoaşte rolul acestora la nivel medular. Câteva speculaţii se pot face pe marginea acestui
subiect. De exemplu, la şoareci, adipocitele medulare sunt implicate prin intermediul unor
proteine produse în funcţia de termoreglare (Marko 1995).
La om se speculează rolul adipocitelor ca sistem spaţiu-tampon, dinamic, de reglare a
spaţiului medular (prin expansiune sau restricţie adipocitară) invers proporţional cu dezvoltarea
ţesutului hematopoietic (Tavassoli 1974). Această speculaţie este susţinută de observaţia că
adipocitele medulare nu mobilizează lipide ca răspuns la înfometare (Tavassoli 1974).
Exceptând rolul la nivelul MO, studiile ultimilor 10 ani au demonstrat că transplantul
BM-MSC în regiuni non-scheletale au produs refacerea miocardului, creierului şi a altor organe
(Barry 2003). Deşi capacitatea de diferenţiere în neuroni şi cardiomiocite, in vivo, a BM-MSC
transplantate este contestată, o îmbunătăţire a funcţiei acestor organe a fost înregistrata (Picinich
2007).
Se poate afirma că transplantul BMSC poate transfera funcţia de „nursing” medular la
nivelul ţesuturilor non-scheletale, astfel încât şi celulele gazdă să poată beneficia de această
„îngrijire” (Caplan 2006). Clasic, se acceptă 5 roluri principale in vivo pentru MSC medulare: (1)
celule progenitoare pentru reparare şi tournover la nivel osos; (2) progenitoare ale ţesutului
cartilaginos; (3) suport vascular; (4) suport hematopoietic; (5) celule progenitoare ale
adipocitelor (Dennis 2004). Recent au început să apară şi alte roluri ale MSC, în special cu
referire la rolul MSC/pericitelor în cadrul procesului de reconstrucţie tisulară.
Evenimentele implicate în repararea tisulară, ce survin lezării ţesutului, sunt: formarea
cheagului sanguin; activarea plachetelor cu eliberarea de factori de creştere şi chemokine;
declanşarea procesului inflamator; migrarea diferitelor tipuri de celule în ţesut şi proliferare
48
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 8] Biologia MSC
Fig. 8.3. Implicarea MSC în cadrul procesului de reconstrucție tisulară. (da Silva 2008)
A. MSC/pericitele (nucleu bleu) contribuie la homeostazia imunitară, evitând răspunsurile imune
inutile (săgeți). B. Lezarea tisulară afectează interacțiunea MSC/pericite vs. celule endoteliale
(nucleu verde); membrana bazală (roşu) este lezată => cheag; plachetele eliberează molecule
bioactive; celulele imunitare (nucleu roz) sunt atrase la locul leziunii, => răspuns (săgeți roz);
celulele progenitoare circulante (nucleu verde închis) sunt recrutate în focar. C. Evenimentele
precedente conduc la migrarea MSC/pericitelor la nivelul leziunii; se activează (nucleu albastru),
proliferează şi produc factori umorali cu efect anti-apoptotic şi de blocare a răspunsului imun (săgeți
galbene). D. După acest proces, celulele endoteliale şi progenitorii circulanți refac endoteliul şi
membrana bazală. MSC/pericitele au mai multe căi posibile de evoluție ulterioară: 1. îşi pot relua
fenotipul şi se fixează la membrana bazală; 2. celulele care au pierdut contactul cu membrana
bazală intră în apoptoză; 3. unele rețin fenotipul progenitor (nucleu albastru); 4. se pot diferenţia
(nucleu oranj) în celule mezenchimale.
49
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 8] Biologia MSC
50
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 8] Biologia MSC
51
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 8] Biologia MSC
Modalitatea prin care MSC îşi menţin starea de nediferenţiere la nivelul nişei nu este
cunoscută complet. Numeroşi factori observaţi ca având influenţă în culturile de MSC au fost
extrapolaţi ca fiind implicaţi în controlul ciclului celular la nivelul nişei stem. Dintre aceştia cei
mai vehiculaţi sunt: factorii din familia Wnt (împiedică diferenţierea prin creşterea expresiei
factorilor oct-3/4, rex-1 şi Nanog) (Fig. 8.7), Dkk1, Frzb-1, sFRP1 (Sato 2004) împreună cu căile
de semnalizare Notch, Hedgehog şi BMP (Bobis 2006).
MSC sunt mobilizate de la nivelul nişei sub acţiunea anumitor factori specifici, pătrund
în torentul sanguin (Fernandez 1997) şi de aici pot ajunge teoretic oriunde în organism. Filia
acestor celule faţă de un ţesut sau altul este dependentă de producerea anumitor chemokine şi de
prezenţa receptorilor pentru acestea pe suprafaţa lor (Lee 2006). Un astfel de receptor implicat în
homing-ul MSC este CXCR4 (Bobis 2006).
Mobilizarea MSC constituie un concept ce datează de mai bine de 150 de ani (Prockop
1997). Deşi unele studii au arătat la om predispoziţia MSC a se localiza către ţesuturi afectate
patologic, după injectarea sistemică, încă se discută pe tema circulaţiei MSC. Lipsa unor criterii
stricte de evaluare face ca analiza MSC infuzate, bazată pe detecţia unui marker sau pe obţinerea
de CFU-F să fie discutabilă, mai ales că există posibilitatea ca MSC să îşi altereze capacitatea de
aderare după pătrunderea în circulaţie (Khosla 2006).
Deşi Jones (2008) afirmă că nu a reuşit să izoleze colonii CFU-F din sângele unor
persoane sănătoase (prezenţa MSC circulante fiind un lucru foarte rar la om (Fernandez 1997),
Fernandez (1997) a observat prezenţa MSC circulante în sângele pacientelor cu cancer de sân
care au fost tratate cu factori de creştere. Din culturile de MSC izolate din sângele din cordonul
ombilical, Makino (1999) a izolat o subpopulaţie MSC (5-10%) latentă, sugerând astfel existenţa
unor progenitori mezenchimali nediferenţiaţi circulanţi în viaţa fetală. Mai multe rezultate
publicate confirmă capacitatea de homing a MSC la nivelul organelor afectate patologic pentru a
susţine regenerarea acestora: cartilaj (Caplan 1997), muşchi (de Bari 2003), miocard (Shake
2002), cerebel (Kopen 1999) şi os (Horwitz 2002).
Având în vedere acestea, Jones (2008) a încercat să explice anumite caractere legate de
circulaţia MSC native. În primul rând, prezenţa MSC în cantitate crescută în primul trimestru al
dezvoltării fetale urmată de scăderea lor ulterioară, împreună cu localizarea MSC la nivelul
ţesutului moale al cordonului ombilical (nu numai al sângelui din vena ombilicală) sprijină
ipoteza conform căreia după încetarea angiogenezei MSC se metamorfozează în pericite dispuse
perivascular. În al doilea rând, dacă MSC circulă aşa cum se crede, dar într-o cantitate atât de
mică încât greu pot fi detectate atunci este posibil ca rolul lor în organism să nu fie atât de
semnificativ pe cat se crede. Fiind cunoscută relaţia dintre BM-MSC şi adipocitele medulare ce
se pot mobiliza în circulaţie în urma traumelor osoase, Jones (2008) consideră că existenţa MSC
circulante în afara unui context traumatic osos este destul de improbabilă.
Cu toate că unele studii au arătat că MSC se pot deplasa preferenţial către anumite
ţesuturi sub influenţa unor chemokine, dispoziţia ubicuitară a MSC la nivelul scheletului sub
forma pericitelor pledează împotriva necesităţii in vivo de circulaţie a MSC, pe distanţe lungi,
către ţesuturile lezate.
Aceste observaţii, privind circulaţia MSC native, nu afectează importanţa homing-ului şi
circulaţiei MSC injectate în scop terapeutic care sunt susţinute de rezultatele favorabile survenite
post-administrare.
52
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 8] Biologia MSC
53
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 8] Biologia MSC
De un real interes pentru aplicaţiile clinice ale MSC este problema homing-ului acestora
după administrarea lor sistemică (cea mai facilă şi des utilizată metodă în trialuri). În plus,
capacitatea de homing poate înlătura complicaţii legate de administrarea locală a celulelor (e.g.
osificare la locul de injectare în cazul administrării lor la nivelul peretelui cardiac post IMA)
(Salem 2009).
Homing-ul reprezintă migrarea şi blocarea/cantonarea MSC la nivelul capilarelor unui
organ urmată de migrarea acestora trans-endotelial în ţesutul respectiv, consecutiv administrării
sistemice a acestora.
Deşi la nivel internaţional există mai multe trial-uri ce studiază administrarea sistemică a
MSC pentru diferite afecţiuni, puţine lucruri se cunosc despre mecanismele de homing. Această
lipsă de informaţii se traduce prin utilizarea unor cantităţi mari de celule (150-300 milioane) în
cadrul modelelor experimentale de terapii celulare. La acestea se adaugă şi lipsa informaţiilor
referitoare la efectele pe termen lung ca urmare a producerii de către MSC a unor factori
paracrini difuzibili, la nivelul ţesutului în care sunt grefate.
Rezolvarea acestei dileme va trebui să ofere răspunsuri la întrebări legate de mobilizarea
MSC endogene în sângele periferic şi migrarea acestora în ţesuturile
ischemice/inflamatorii/tumorale, de capacitatea MSC exogene de a migra din sângele periferic în
aceleaşi ţesuturi şi care este eficienţa şi mecanismul acestui proces.
Se speculează că traficul MSC se bazează pe gradientul chemokinelor eliberate de
ţesuturile inflamate, fiind mediatorul cheie al homing-ului MSC. Acestea activează receptorii de
pe suprafaţa MSC.
O primă substanţă implicată este SDF-1/CXCL12 (eliberată de ţesuturile lezate) care
interacţionează cu receptorul CXCR4 al MSC; ca răspuns la această stimulare, MSC exprimă o
serie de molecule: CX3CL1, CXCl16, CCl3, CCL19 şi CCL21. Blocarea axului SDF-1/CXCR4
blochează homing-ul celulelor. Se crede că SDF-1 este implicat şi în migrarea MSC către ţesutul
ischemic cardiac, jucând astfel un rol important în traficul MSC către ţesuturile ischemice.
(Salem 2009) Alături de complexul SDF-1/CXCR4, mai este implicat şi sistemul ligand-receptor
hepatoczte growth factor/c-Met (Kolf 2007).
Un alt ax de reglare este cel reprezentat de chemokina CCL21 şi receptorul său CCR7.
Interacţiunea CCL21 (exprimată de către keratinocite)/CCR7 (receptor pe suprafaţa MSC) este
răspunzătoare de migrarea MSC la nivelul leziunilor cutanate. (Sasaki 2008)
Alte căi de comunicare implicate în homing: integrina β1 (migrare la nivel cardiac, IMA),
PODXL şi CD49f (migrare la nivel cardiac şi renal). Un aspect important este legat de MSC cu
fenotip PODXL (hi)/CD49f (hi): reduc riscul de trombembolism pulmonar după administrarea
sistemică şi au un potenţial de diferenţiere mai eficient. (Salem 2009)
Capacitatea de homing poate fi îmbunătăţită prin transducţia virală a celulelor cu
CXCR4, sau utilizarea unor tratamente cu TNFα, IFN-β şi insulin growth factor. La acestea se
adaugă şi selecţia unor MSC ce exprimă Stro-1 în cantităţi mari, observându-se că MSC Stro-1+
sunt mult mai capabile de homing şi grefare decât cele negative (Kolf 2007).
54
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 8] Biologia MSC
Metodele de izolare şi cultură au un rol important în succesul izolării MSC din sânge.
Mai multe studii au arătat că MSC izolate din sânge manifestă fenotipuri diferite de cele ale
MSC izolate din MO (Kuznetsov 2001).
În ceea ce priveşte factorii ce stimulează mobilizarea MSC endogene, Wang (2009) a
observat, la şoarecii răniţi, nivele crescute de MSC circulante corelate cu valori crescute ale
VEGF şi G-CSF în sângele periferic. Mai mult, MSC izolate de la aceştia au prezentat fenotipuri
similare MSC din MO.
Administrarea MSC. Administrarea celulelor într-o cantitate cât mai mare şi cât mai
aproape de momentul ischemic/inflamator creşte gradul de grefare (Chen 2001), fără însă a se
observa o îmbunătăţire crescută faţă de administrarea tardivă (Omori 2008). Cantitatea de celule
injectate suferă un efect tip platou, astfel încât nu se constată o îmbunătăţire superioară dacă se
creşte cantitatea de celule peste o anumită doză optimă (la şoarece) (Wu 2008).
Pe lângă acestea, şi calea de administrare a celulelor influenţează homing-ul. Calea
intracardiacă şi intraarterială (IA) au condus la o grefare sporită în caz de IMA (Freyman 2006).
Administrarea IA cât mai aproape de locul afectat creşte grefarea comparativ cu administrarea
IV distal (Walczak 2008). În plus, calea IA reduce filtrarea celulelor la nivel pulmonar, hepatic şi
splenic (Sackstein 2008) şi favorizează „capturarea pasivă” a MSC la nivelul patului
microvascular (ocluzia capilarelor ca urmare a diferenţei de mărime între celule şi diametrul
capilarelor; se consideră a fi un pas premergător migrării transcapilare din cadrul homing-ului).
Barbash a arătat că MSC de şobolan administrate intraventricular migrează preferenţial în
miocardul ischemic decât cel sănătos, ceea ce sugerează producerea unor molecule semnal de
către ţesutul lezat facilitând homing-ul şi traficul către acesta. Expresia acestor molecule scade
după câteva zile de la leziune, astfel încât este preferabil ca administrarea să se realizeze proxim
faţă de atacul ischemic (2 zile). În plus, administrarea IV a fost însoţită de o rată mare de
sechestrare pulmonară, care poate fi diminuată prin administrare de nitroprusiat de sodiu.
(Chamberlain 2007)
Într-un studiu pe şoareci, calea intraperitoneală a avut rezultate mai bune decât injectarea
IV, pentru tratamentul fetuşilor in utero (Chan 2007).
Deşi injectarea locală asigură cel mai mare număr de celule, în multe cazuri aceasta nu
este aplicabilă (e.g. inimă, creier), iar în plus rata de mortalitate posttransplant a celulelor este
mai mare datorită difuziei limitate a nutrienţilor (Muschler 2004), putând apărea şi complicaţii
de tipul formării de ţesut osos la locul injectării.
55
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 8] Biologia MSC
56
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 8] Biologia MSC
57
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 8] Biologia MSC
Fig. 8.9. Mecanismele de homing şi trafic la nivelul țesutului țintă. (Salem 2009)
Eficienţa grefării MSC depinde de factori intrinseci (ce ţin de interacţiunea celulă-
organism) şi extrinseci (reprezentaţi în principal de metodele şi tehnicile de detecţie utilizate).
Principalele metode de detecţie utilizate pentru MSC administrate sistemic sunt:
marcarea radioactivă, marcarea fluorescentă, transducţia MSC cu gene reporter, transplantul sex-
mismatched sau specie-mismatched via hibridizare fluorescentă in situ sau RT-PCR.
În final aceste metode se reduc la identificarea numerică a celulelor fluorescente sau la
dozarea radioactivităţii relative, putând obţine rezultate nespecifice. Nivelurile diferite de
specificitate a fiecărei tehnici pot fi responsabile pentru rezultatele diferite privind eficienţa
grefării. Aceste metode sunt relative atât prin tehnică în sine cât şi prin lipsa unui control de
eficienţă maximă pentru comparaţie.
Toate aceste metode au arătat că MSC ţintesc cu predilecţie ţesuturile
inflamate/ischemice/tumorale sau MO, iar distribuţia nespecifică este îndreptată către plămân,
ficat, splină şi rinichi.
Utilizarea unor metode de marcare cu nanoparticule superparamagnetice de oxid de fier
sau a metodei “quantum dots” (Shah 2007) pot creşte nivelul de detecţie şi de cuantificare
obiectivă a eficienţei grefării.
58
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 8] Biologia MSC
grefate în acel organ, ci sunt mai probabil în tranzit. Este de importanţă critică să se cunoască
dacă MSC sunt în tranzit, capturate pasiv sau extravazate.
Cel puţin teoretic, până acum, grefarea este sinonimă cu migrarea transendotelială a
celulelor. O altă posibilitate ce poate crea confuzie în ceea ce priveşte homing-ul este
reprezentată de posibilitatea MSC de a fuziona cu celulele gazdă.
Înţelegerea metodelor de trafic ale MSC rămâne parţial cunoscută, iar progresul în acest
domeniu întârzie să apară ca urmare a eşecului izolării MSC native şi continuării utilizării MSC
expansionate in vitro care nu exprimă molecule de interacţiune observate la HSC sau leucocite.
Acestea se sumează cu folosirea unor metode de detecţie nespecifice sau care interferă cu
biologia gazdei.
Cu toate acestea, pe baza rezultatelor de până la acest moment se poate concluziona: (1)
MSC ţintesc preferenţial ţesuturile inflamatorii şi anumite ţesuturi specifice, prin mecanisme
active de homing, parţial cunoscute; (2) nu se poate aprecia încă dacă localizarea MSC în
ţesuturile ţintă este intravasculară (captură pasivă) sau extravasculară (prin transvazare
59
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 8] Biologia MSC
endotelială); (3) identificarea MSC native şi a celor injectate care nu s-au diferenţiat rămâne o
provocare.
Deşi prezintă o serie de proprietăţi necesare îndeplinirii rolului lor terapeutic (i.e.
capacitate de diferenţiere diversă, imunosupresie, homing), trebuie ţinut cont şi de factorii
micromediului gazdă ce pot influenţa evoluţia MSC posttransplant.
Dintre aceştia, o atenţie deosebită este acordată citokinelor pro-inflamatorii (IL-1α/β,
TNFα şi SDF-1α) ce pot fi responsabile de eşecul transplantului MSC. Cu toate că MSC
manifestă un puternic efect imunosupresor, majoritatea informaţiilor provin din studii in vitro
astfel încât cel puţin teoretic se poate vorbi de un posibil eşec al efectului terapeutic.
Într-o măsură mai mică sau mai mare, transplantul local al MSC produce un răspuns
inflamator soldat cu recrutarea unor celule inflamatorii şi producerea de substanţe ce pot afecta
direct MSC sau să determine producerea unor citokine de către MSC responsabile de eşecul
terapeutic. Mai ales în acele ţesuturi în care funcţia de producere a factorilor trofici de către MSC
primează, influenţarea acestora de către citokine şi celule inflamatorii este de importanţă
extremă.
În condiţiile acestea, se preconizează că utilizarea unor molecule ce vizează întreruperea
mecanismelor dependente de cele trei citokine pro-inflamatorii, poate creşte şansa de succes a
terapiei MSC.
IL-1α. MSC prezintă pe suprafaţa lor receptorul IL-1RI, receptor pentru ambele citokine
IL-1, ce se menţine şi pe celulele rezultate în urma diferenţierii. Ca urmare a stimulării IL-1α,
MSC produc neurotransmiţătorul substanţa P (SP) ce are efect stimulator al răspunsului imun
celular. (Greco 2008)
IL-1α are un efect stimulator benefic asupra diferenţierii neuronale a MSC, ce se poate
dovedi benefic în anumite circumstanţe. Totuşi cel mai util, pare să fie efectul paracrin al MSC,
şi ca urmare, blocarea acţiunii IL-1α poate fi necesară. (Greco 2008)
Astfel, utilizarea antagoniştilor pentru receptorul IL-1R, de tipul Anakinra® sau
Kineret®, este utilă transplantului MSC, mai ales dacă se reuşeşte fixarea acestora pe MSC,
evitând administrarea sistemica. În plus, s-a evidenţiat că MSC murine pot secreta in vivo IL-1ra
(antagonist endogen IL-1R) neutralizând efectele IL-1α ceea ce limitează utilizarea exogenă a
antagoniştilor. (Greco 2008)
TNFα. Este o citokină implicată în faza acută a răspunsului inflamator, însă implicată şi
în homingul, proliferarea şi diferenţierea celulelor imune.
MSC prezintă membranar, receptorul TNFα-R1 ce se transmite şi celulelor diferenţiate.
Spre deosebire de IL-1α, efectul TNFα este preferenţial asupra celulelor parţial sau total
diferenţiate, manifestat prin apariţia unui răspuns imun exacerbat împotriva celulelor diferenţiate
transplantate. (Greco 2008)
S-a observat că TNFα stimulează capacitatea chemotactică a MSC, ceea ce nu este
neapărat un efect benefic, mai ales că poate genera o mobilizare continuă a MSC la nivelul
ţesutului, întârziind sau blocând efectul terapeutic. (Greco 2008)
Efectele TNFα pot fi blocate utilizând anatagonişti ca: Remicade®, Humira® sau
Enbrel®. (Greco 2008)
60
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 8] Biologia MSC
proliferarea progenitorilor neurali din cortexul de şobolan, astfel încât excesul de SDF-1α
conduce la blocarea maturării neuronale. (Greco 2008)
Blocarea acestuia se poate realiza cu ajutorul Mozobil® sau AMD3100. În plus,
AMD3100 poate fi utilizat pentru prevenirea localizării nespecifice a MSC, întrucât s-a dovedit
că blochează migrarea MSC către cortexul cerebral la şobolan lezat. (Greco 2008)
Întrucât se consideră că MSC stau la baza regenerării multor ţesuturi, se poate afirma că
tot ele joacă un rol important în procesul de îmbătrânire a organismului uman.
Îmbătrânirea, din punct de vedere celular se defineşte după Sames şi Stolzing ca suma
restricţiilor primare în cadrul proceselor de regenerare a organismelor multicelulare, în timp ce
senescenţa este atribuită celulelor şi este definită de Campisi ca o oprire esenţială ireversibilă a
diviziunii celulare, celula rămânând în viaţă. (Sethe 2006)
Pentru MSC, această îmbătrânire se traduce sub forma modificărilor calitative, cantitative
şi ale capacităţii de mobilizare.
Morfologia. In vitro MSC bătrâne sunt mai mari, emit mai multe prelungiri şi la distanţe
mai mari, conţin mai multe fibre de actină. MSC provenite de la persoanele în vârstă nu au formă
caracteristică spindle-shape, în timp ce, acelea provenite de la tineri o au, însă, o pierd pe măsură
ce îmbătrânesc. (Sethe 2006)
Telomerele. Atunci când telomerele ating o anumită lungime celulele nu se mai divid şi
devin senescente. Reprezintă un mecanism regulator al duratei de viaţă a unei celule şi un
mecanism de protecţie antitumorală. Se pare că MSC pierd între 30-120 de perechi de baze la
fiecare dublare populaţională. Ca mecanism de refacere a telomerelor există telomeraza care are
scopul de a reface bazele pierdute, însă se pare că pentru MSC activitatea acesteia este extrem de
scăzută, iar populaţiile MSC ce prezintă telomerază sunt foarte rare. Transfecţia retrovirală a
MSC umane cu gena telomerazei umane a prelungit viaţa acestor celule de la 35 de dublări (în
mod normal) până la 260, fără a altera starea de diferenţiere sau potenţialul multiliniar.
(Simonsen 2002).
61
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 8] Biologia MSC
TGF-β şi BMP2/4 sunt scăzute în cazul MSC recoltate de la donatori senescenţi, şi sunt
asociate cu fenomenul de switch adipogenic. În opoziţie cu acestea, nivelul producerii IL-6
creşte proporţional cu vârsta, în timp ce IL-7 se pare că menţine un nivel constant. Deşi nivelul
IL-11 este scăzut pentru MSC recoltate de la subiecţi în vârstă, se pare că nivelul său creşte în
vitro după cca 9 zile de cultivare. (Sethe 2006)
La acestea se adăugă nivelurile speciilor reactive de oxigen (ROS) şi ale oxidului nitric
(NO), care în funcţie de situaţie şi ţesut pot avea efect pro sau anti-senescent. În cazul MSC,
ROS sunt implicate în semnalizarea la distanţă, cu diminuarea proliferării celulare şi stimularea
procesului de diferenţiere, în timp ce în cazul leziunilor osoase ROS stimulează procesul de
reparare tisulară. În completarea, NO stimulează diferenţierea în osteoblaste şi adipocite. (Sethe
2006)
În contrast cu toate substanţele pro-senescente se pare că antioxidanţii au un rol benefic
pentru MSC, sporind durata de viaţă şi rata de creştere în culturile suplimentate cu antioxidanţi.
În legătură cu rolul jucat de MSC în îmbătrânire se consideră două ipostaze esenţiale: (1)
efectele îmbătrânirii organismului asupra MSC şi (2) rolul MSC în îmbătrânirea organismului.
Acestea sunt alimentate de teoria intrinsecă (MSC îmbătrânesc ca urmare a unor semnale
interne) şi de teoria extrinsecă (MSC îmbătrânesc ca urmare a unor semnale venite din exterior).
(Sethe 2006)
Deşi cele mai multe dovezi par a susţine teoria extrinsecă, având în minte interacţiunea
MSC cu nişa stem şi modul în care aceasta influenţează celulele stem sub aspectul reţelei
matriceale de susţinere şi al moleculelor semnal prezente, se pare că se ivesc şi probe ce par a
susţine teoria intrinsecă. Astfel, s-a observat că MSC provenite de la donator în vârstă sunt mai
puţin eficiente. În completare, dacă efectul extrinsec este predominant ar trebui să se ţină cont de
vârsta primitorului pentru evaluarea reuşitei transplantului. Totuşi s-a observat că parabioza
şoarece tânăr-şoarece bătrân a crescut rata de regenerare la subiectul senescent, pledând pentru
influenţa extrinsecă bazat pe molecule semnal provenite de la organismul tânăr. (Sethe 2006)
Având în vedere rezultatele obţinute, marea populaţie a MSC poate fi împărţită sub
aspectul îmbătrânirii în trei tipuri celulare majore (Tab. 8.2). Importanţa acestora se va dovedi
critică în aplicarea lor clinică precum şi în studiul aprofundat al îmbătrânirii, întrucât rolul MSC
este major la nivel de organ în ceea ce priveşte procesul de senescenţă şi îmbătrânire. (Sethe
2006)
Toate aceste observaţii sugerează implicarea MSC în procesul de îmbătrânire şi existenţa
unor efecte ale acestui proces ce lovesc direct MSC, astfel încât îmbătrânirea MSC trebuie
privită şi analizată, atât sub aspect extrinsec cât şi intrinsec, privind analitic rezultatele in vitro.
62
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 9] Cultivarea MSC
9 CULTIVAREA MSC
Recoltarea MSC, trebuie să fie un proces uşor realizabil, non-invaziv, care să prezinte
morbiditate minimă, iar sursa să nu fie epuizată.
Recent s-au publicat rezultate favorabile ce au arătat că MSC pot fi izolate şi din alte
ţesuturi precum: sângele periferic (Zvaifler 2000) (Kuznetsov 2001), ţesut adipos (Zuk 2001),
piele (Pettis 1990), muşchi (Lee JY 2001), periost şi ţesut patologic articular specific artritei
reumatoide (Chamberlain 2007), sânge din cordonul ombilical, placentă (Igura 2004), lichid
amniotic (Tsai 2004), ficat fetal (Campagnoli 2001), plămân fetal (Anker 2003) şi ţesutul dentar
decidual (Miura 2003).
Cu toate acestea, cel mai frecvent, MSC sunt recoltate din MO. MO este accesibilă în
urma unei proceduri simple sub anestezie locală, fiind un rezervor regenerabil bogat. MSC se
obţin cel mai uşor din aspiratul medular, recoltat prin puncţie.
Pregătirea preintervenţională a pacientului depinde de statusul biologic şi tipul afecţiunii.
Se recomandă profilaxia antiinfecţioasă (în funcţie de condiţia imună a donatorului), sedarea
moderată urmată de anestezie locală. Fiind o procedură invazivă, pacientul va fi monitorizat
atent post-intervenţional, pentru surprinderea precoce a complicaţiilor (cel mai frecvent
infecţioase şi hemoragice).
Cel mai accesibil loc pentru puncţia medulară este creasta iliacă (Fig. 9.1), în treimea
posterioară, la nivelul spinei iliace postero-superioare. Tegumentul ce se suprapune zonei de
interes este aseptizat corespunzător. Se infiltrează ţesutul moale cu lidocaină pentru a face
intervenţia suportabilă. Accesul la nivelul MO se face prin intermediul unui trocar ce se
introduce cu grijă în creasta iliacă. Trocarul poate fi folosit şi pentru a aspira MO. Însă, pentru a
obţine o cantitate mai mare de măduvă şi nu de sânge, se recomandă ca aspirarea să se realizeze
cu un ac cu diametru mare introdus prin trocar, ac ce va putea fi repoziţionat în cursul procedurii.
Pentru aspirare se va utiliza o seringă heparinată cu cca 3000 UI. Aspirarea se va face brusc, cu
mişcări rapide ale pistonului, astfel scăzând proporţia de sânge aspirat. În timpul aspiraţiei
poziţia acului poate fi modificată, însă fără a-l deconecta de la seringă, menţinând astfel vidul
aspirativ. În cursul unei astfel de proceduri pot fi obţinuţi cca 15-20 de ml de măduvă. Aspirarea
unei cantităţi mai mari va creşte proporţia de sânge aspirat. (Pittenger 2008)
Aspiratul astfel obţinut poate fi utilizat imediat sau stocat la temperatura camerei pentru
cca 36 de ore, fără a influenţa reuşita izolării şi culturii. (Pittenger 2008) Transportul aspiratului
se poate face fie la temperatura camerei (Pittenger 2008) sau la gheaţă în eprubete Vacutainer
heparinate ce conţin 3 ml mediu αMEM (Wolfe 2008).
Pentru animalele mari, procedeul de recoltare de la om poate fi adaptat. Pentru mamifere
mici, precum iepurele, se poate apela la o mică intervenţie chirurgicală care să faciliteze accesul
al nivelul femurului. Pentru o aspiraţie completă se poate introduce pe trocar un tub rigid în
canalul medular, adaptat la seringa de aspirat. Recoltarea de la rozătoare implică eutanasierea
acestora. Se folosesc oasele lungi precum femurul şi humerusul. Acestea sunt curăţate de ţesut
moale şi prelucrate ulterior sub hotă cu flux laminar. Se şterg cu alcool 70% pentru a reduce
contaminarea, iar epifizele sunt îndepărtate cu ajutorul unui cleşte steril. Conţinutul medular este
împins, prin spălare cu jet, în vasul de colectare cu ajutorul unui ac cu diametru potrivit canalului
medular adaptat la o seringă cu soluţie salină. Acul nu trebuie să fie mai mic decât diametrul
canalului medular. Practic, canalul medular este spălat cu soluţie salină pe la un capăt, iar pe la
celălalt se colectează amestecul de măduvă şi soluţie salină. (Pittenger 2008)
63
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 9] Cultivarea MSC
F3
Fig. 9.1. Puncţia spinei iliace în vederea recoltării aspiratului medular.
Recoltarea de ţesut adipos sau lichid de lipoaspiraţie, este mai invazivă şi nu este utilizată
de rutină la pacienţi. Ţesutul adipos solid poate fi ţesut adipos subcutanat sau epiplon, iar
recoltarea se face utilizând anestezie generală şi, de obicei, în cursul unor intervenţii pentru alte
afecţiuni. Pentru obţinerea de ţesut solid se poate utiliza şi biopsia cu ac. Lipoaspiratul poate fi
obţinut de la donatori ce apelează la chirurgia estetică sau de la pacient. Probele pot fi stocate la
temperatura camerei nu mai mult de 24 ore.
Pentru a putea fi utilizate în cadrul terapiilor bazate pe celule stem, MSC recoltate trebuie
mai întâi izolate şi multiplicate. Aceste operaţii pot da naştere la confuzii privind identitatea
celulelor izolate, utilizând metode de izolare şi cultură diferite, nestandardizate, ce duc la selecţia
preferenţială a unor anumite populaţii sau la modificarea fenotipului celulelor izolate (Salem
2009).
Izolarea MSC din MO a fost descrisă pentru prima dată de către AJ Friedenstein (1974-
1976) (Dennis 2004), fiind descrisă pentru specii precum om, şoarece, iepure şi porc de Guineea,
însă primii care au publicat rezultate consistente privind izolarea MSC din ţesuturile umane au
fost Caplan şi Haynesworth (1992a) (Case Western Reserve University).
Ulterior, mai multe laboratoare au publicat tehnici standardizate pentru cultura MSC
umane (Kuznetsov 1997), şoarece (Krebsbach 1997) şi iepure (Wakitani 1994).
64
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 9] Cultivarea MSC
65
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 9] Cultivarea MSC
Modulele Cell Factory (Fig. 9.3) sunt utilizate pentru culturi la scală mare, pentru
obţinerea de celule necesare biomaterialelor, vaccinurilor etc. Avantajul acestor module, constă
în posibilitatea de a cultiva un număr mare de celule într-un spaţiu redus.
Un astfel de modul este compus din numeroase tăviţe de cultură, suprapuse şi închise
într-un mediu izolat, limitând astfel contaminarea. Suprafaţa acestora este tratată special,
facilitând aderarea celulelor.
66
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 9] Cultivarea MSC
Modulele sunt alimentate şi golite de conţinut prin intermediul a doi conectori situaţi
peste nivelul mediului din cultură, şi implică schimbarea poziţiei modului pentru a facilita
contactul conector-mediu.
Există două metode pentru însămânţarea, hrănirea şi recoltarea celulelor (Anexa III).
Acestea se pot face în sistem închis sau deschis, în funcţie de modul în care este manipulat
modulul. Modul deschis este mai ieftin, cel închis utilizând mai multe consumabile. Însă este de
preferat ca sistemul închis să fie utilizat atunci când celulele urmează a fi utilizate în studii
experimentale umane.
Aprecierea calităţilor MSC este un proces laborios ce implică mai multe criterii.
O caracteristică importantă a MSC este clonogenitatea, tradusă prin capacitatea fiecărei
celule de a forma colonii fibroblast-like atunci când sunt cultivate. În mod obişnuit MSC sunt
clonogene, atunci când sunt însămânţate în cultură în cantităţi mari (densitate crescută, densitate
non-clonală), ceea ce face ca analiza acestor tipuri de culturi non-clonale să fie lipsită de
însemnătate (Bianco 2008).
Teoretic orice celulă stem mezenchimală adevărată din MO este clonogenă, însă orice
celulă clonogenă din MO nu este celulă stem, întrucât numai o parte din CFU-F sunt
multipotente în urma transplantării in vivo (Gronthos 2003).
Deşi nu există marker-i pentru diferenţierea CFU-F multipotente de celelalte tipuri cu
potenţial restricţionat, frecvenţa cu care CFU-F apar în cultură constituie un indiciu destul de bun
asupra aprecierii unei probe de MO.
MSC clonogene pot fi selectate din populaţie pe baza unor marker-i de suprafaţă precum
Stro-1 (Simmons şi Torok-Storb 1991). Cu toate acestea se pare că diferenţa între populaţiile
rezultate prin această metodă şi cele realizate pe baza aderenţei sunt minime, având aceeaşi
importanţă practică (Sacchetti 2007).
Celule aderente de tipul CFU-F, capabile a creşte în cultură indiferent de densitatea la
care au fost însămânţate au fost identificate în numeroase ţesuturi non-hematopoietice precum
periostul şi pulpa dentară chiar cu o frecvenţă mai mare ca în MO. Totuşi, se apreciază că această
frecvenţă este relativă, întrucât în MO densitatea CFU-F este stabilită în raport cu numărul
celulelor hematopoietice, iar în aceste ţesuturi numărul acestora este foarte scăzut (Bianco 2008).
În laborator, culturile de MSC pot fi obţinute în urma însămânţării la densitate clonală
sau non-clonală. Compoziţia populaţiilor rezultate este diferită între cele două metode. Deşi în
general metoda non-clonală este utilizată mai des, ea generează o populaţie impură, care pe lângă
67
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 9] Cultivarea MSC
MSC conţine şi celule aderente non-clonogene cu potenţial de creştere limitat, în timp ce prin
metoda clonală se obţine o populaţie descendentă din CFU-F (Bianco 2008).
Este interesant de reţinut că totuşi omogenitate culturilor clonale este relativă, deoarece
cinetica celulară face să existe în acelaşi moment în cultură celule diferenţiate, senescente sau
apoptotice provenite din progenitorii iniţiali. Acest fapt face ca nici culturile comerciale de MSC
să fie cu adevărat omogene ci mai degrabă sunt descrise ca şi culturi de MSC ce pot conţine o
cantitate variabilă de celule multipotente cu proprietăţi de autoreînnoire (i.e. stem).
Pentru selecţia unei populaţii pure MSC este necesară existenţa unui marker fenotipic al
„stemness-ului”. Însă testul suprem de diagnostic este reprezentat de studiul diferenţierii in vivo
al celulei selectate in vitro pe baza acelui marker care trebuie să fie comun şi celulelor in vivo.
La acest moment un astfel de marker nu există, ceea ce face ca îndoiala să planeze asupra
oricărei culturi de BM-MSC, fără a şti dacă favorizează dezvoltarea MSC sau a întregii populaţii
CFU-F (Bianco 2008).
68
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 9] Cultivarea MSC
69
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 9] Cultivarea MSC
70
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 9] Cultivarea MSC
Utilizarea marker-ilor se poate face pentru selecţia negativă sau pozitivă a MSC. Selecţia
pozitivă presupune identificarea unor structuri ce se găsesc la nivelul MSC, în timp ce selecţia
negativă elimină din amestecul de populaţii celulare acele celule ai căror marker-i utilizaţi sunt
specifici doar lor şi nu MSC. Metoda selecţiei negative, îndepărtează din populaţia specimenului,
celulele hematopoietice cu ajutorul marker-ilor specifici acestora: CD31, CD34, CD1 (Rickard
1996).
De-a lungul timpului au fost identificate mai multe structuri, a căror identificare
contribuie la izolarea unor celule cu fenotip pur MSC.
Primul panel de marker-i utilizat, cuprinde 4 structuri: Stro-1, SH2, SH3 şi SH4. Iniţial,
ultimii 3 marker-i au fost consideraţi specifici MSC (Haynesworth 1992b). Studiile ulterioare au
arătat că anticorpul SH2 se leagă de un receptor clasa III pentru TGF-β (Barry 1999), comun
MSC, macrofagelor şi celulelor endoteliale (Dennis 2004), iar Stro-1 reacţionează încrucişat cu
alte celule de la nivelul MO, astfel încât utilizarea lui pentru BM-MSC este restricţionată (Jones
2008).
Ulterior au fost propuse mai multe panel-uri de marker-i utili izolării şi identificării MSC.
Astfel, Pittenger (1999) sugerează că expresia simultană a CD73 şi CD105 este suficientă.
Alsalameh (2004) consideră că expresia CD166 şi CD105 face posibilă izolarea unor precursori
MSC din populaţia celulară matură. În contradicţie cu acestea, analiza CFU-F obţinute din
stroma MO sugerează că MSC pot fi identificate prin marker-i precum: Stro-1, Thy-1, CD49a,
CD10, Muc18/CD146, receptorul pentru PDGF şi EGF (Baddoo 2003, Bonyadi 2003, Dennis
2002, Gronthos 2003, Pittenger 1999). Un alt grup de marker-i utili selecţiei CFU-F din
populaţia celulară a MO, include pe lângă Stro-1 şi marker-ii MCAM şi CD105. Alţi marker-i
utilizaţi pentru MSC din MO: Stro-1 + CD106 (VCAM-1) (Gronthos 2003), profilul
CD34+Sca1+Lin– (selectează MSC capabile de diferenţiere adipogenică, osteogenică,
condrogenică şi miogenică) (Department 2001), glycophorin-A-Stro-1+ (Gronthos 2003), CD105
+ CD73 (Haynesworth 1992b), CD271 (LNGFR – low affinity nerve growth factor receptor; a
izolat celule cu o capacitate de proliferare de cca 1000 de ori mai mare ca a MSC izolate clasic)
(Quirici 2002), W8B2 (Buhring 2007), SSEA-1 şi 4 (stage specific embryonic antigen – marker
pentru celulele mezenchimale medulare primitive umane şi murine) (da Silva 2008), CD271 +
CD56 + MSCA-1 (Battula 2009).
71
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 9] Cultivarea MSC
Fig. 9.5. Marker-i specifici MSC şi pericitelor umane. (da Silva 2008)
Mixt - se întâlneşte la om şi animale; Specie non-umană - se întâlneşte doar la animale.
Un alt profil utilizat poate fi CD45lowCD271+ care este în acelaşi timp pozitiv şi pentru
CD73, CD90 şi CD105. Acest profil contribuie la identificarea unui fenotip medular nou care
respectă criteriile recente privind morfologia MSC proaspăt recoltate (celule mari, cu nucleoli
proeminenţi şi proiecţii veziculare). (Jones 2008)
72
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 9] Cultivarea MSC
Totuşi, cel mai folosit marker este Stro-1 (Simmons 1991), fiind folosit cu precădere
pentru izolarea şi identificarea MSC medulare. Celulele izolate folosind acest marker nu
formează colonii CFU-F (Simmons 1991) dar au dovedit proprietăţi osteogenice (Gronthos
1994), condrogenice, adipogenice şi de suport hematopoietic (Dennis 2002), caracteristice MSC.
Cu toate acestea, Stro-1 nu este specific MSC, iar prin cultivarea celulelor se pierde (da Silva
2008).
Cu toate că MSC din cultură beneficiază de anumiţi marker-i pentru caracterizare, foarte
puţini sunt cunoscuţi pentru pentru MSC proaspăt izolate (non-expandate în cultură). În acest
sens studiul lui Boiret (2005) a evidenţiat că pentru MSC din culturile tinere (1-3 zile de
aderenţă) principalii marker-i sunt reprezentaţi de CD73 (100%) şi CD49a (95.2%). Aceleaşi
antigene au fost găsite extensiv şi în preparatele de MSC proaspăt izolate din MO. Aceste
rezultate contestă antigenele CD105 şi CD90 împreună cu Stro-1 ca fiind exprimate exclusiv de
precursorii mezenchimali (Bobis 2006).
Expresia antigenelor de suprafaţă, precum şi a altor factori exprimaţi de către MSC,
prezintă o stare dinamică astfel încât aceştia nu sunt prezenţi pe suprafaţa celulei pe toată durata
vieţii acesteia. Mai mult, prezenţa factorilor de suprafaţă variază datorită condiţiilor de cultură
(Dazzi 2006). În acest sens antigenul CD34 (marker clasic hematopoietic) este prezent pe
suprafaţa MSC proaspăt izolate din plămânul fetal de şoarece însă este absent în cultura in vitro
(Fibbe 2003) dispărând probabil în cursul procesului de maturare (Bobis 2006). Aceeaşi situaţie
a fost observată şi în cazul receptorilor (CCR1, CCR7, CCR9, CXCR4, CXCR5, CXCR6)
exprimaţi de către MSC din MO în timpul pasajului 2, pentru ca în pasajul 12-16 expresia
acestora să dispară complet (Honczarenko 2006). Lipsa expresiei acestor factori a fost însoţită de
scăderea expresiei moleculelor de adeziune (ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, CD157) asociată cu
încetinirea ciclului celular şi activarea cascadei apoptotice (Honczarenko 2006).
Variabilitatea antigenică a fost descrisă şi în cadrul diferenţierii MSC. CD166, exprimat
de MSC nediferenţiate este absent pe suprafaţa celulelor diferenţiate osteogenic din MSC
(Bruder 1998).
Aceeaşi variabilitate se manifestă şi în cazul MSC izolate din ţesuturi sau de la specii
diferite. Analiza realizată de Katz (2005) a descoperit existenţa unor similarităţi între MSC
izolate din MO şi ţesutul adipos (AD-MSC), însă AD-MSC au prezentat în plus expresia
antigenelor CD49d, CD62e şi CD31(Katz 2005, Gronthos 2001). Spre deosebire de MSC umane
care sunt CD34-, MSC murine au o expresie variabilă a acestui marker. În plus, nu trebuie uitat
faptul că profilul fenotipic al MSC depinde de factorii secretaţi de celulele accesorii din cultura
primară şi că marker-ii in vitro nu se corelează neapărat cu cei in vivo (Chamberlain 2007).
Este important ca utilizarea unor marker-i pentru purificarea MSC să se ţină cont şi de
ţesutul de provenienţă. Deşi s-a considerat că CD73, CD105, CD90 şi CD44 sunt specifici pentru
MSC, s-a observat că aceştia sunt exprimaţi şi de fibroblaste, astfel încât aceştia cel mult
orientează dacă celulele obţinute sunt non-hematopoietice şi stromale. Astfel, întrucât nu există
un marker specific MSC, este preferabil ca pentru izolarea MSC din MO să se utilizeze marker-i
cu specificitate diferită de ţesutul de origine (e.g. pentru MO se poate utiliza D7-FIB, CD10 şi
CD13 – marker-i şi pentru fibroblaste – deoarece în MO majoritatea celulelor sunt de natură
hematopoietică şi nu fibroblastică). Un alt marker ce poate fi aplicat pentru placentă este SSEA-
4. (Jones 2008)
Toate aceste observaţii sugerează că MSC sunt eterogene fenotipic, putând cunoaşte
variaţii ce depind de specie, tip de ţesut, mediu de cultură, prezenţa altor celule în cultură şi de
factorii umorali din cultură.
Treptat utilizarea marker-ilor se extinde şi la uzul in situ, în vederea identificării
omoloagelor CFU-F şi urmărirea acestora cu scopul studiului diferenţierii. În acest sens marker-
ul MCAM este foarte potrivit.
Până la acest moment, mai multe studii au prezentat MCAM ca un marker comun MSC,
celulelor adventiceale reticulare (Sacchetti 2007) (Westen şi Bainton 1979) şi pericitelor (Li
2003). Este interesantă această asociere sub aspectul că pericitele sunt bănuite a avea rol de
progenitor al MSC postnatale.
73
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 9] Cultivarea MSC
Liniile celulare şi culturile primare sunt două surse pentru obţinerea de MSC utile
analizei lor.
Liniile celulare, sunt celule MSC obţinute prin diferite tehnici de selecţie şi inginerie
celulară care au capacitatea de a se multiplica în cultură de-a lungul a numeroase pasaje,
nelimitat (au un comportament similar ESC), fiind practic nemuritoare în cultură, în timp ce
culturile primare provin din izolarea MSC din diferite ţesuturi, dar cu o viaţă a culturii limitată
de procesul de senescenţă şi apoptoză.
Cele două, sunt diferite ca metodă, chiar mai mult, celulele obţinute printr-o metodă sunt
diferite faţă de cele obţinute prin cealaltă metodă. Astfel, se naşte o sumă de critici, în special la
adresa utilizării liniilor celulare în scopuri de cercetare. Capacitatea de proliferare nelimitată,
imortalitate, face ca liniile celulare să fie diferite fenotipic de celulele din care au fost obţinute,
care sunt celule muritoare (Dennis 2004). Termenul de „imortalizare” este sinonim cu
transformarea celulelor primare în linie celulară, ilustrând astfel capacitatea celulelor de a se
divide nelimitat (Dennis 2004).
Deşi există un număr apreciabil de linii celulare MSC în diverse laboratoare, acestea au
fost descoperite întâmplător. Multe dintre ele au fost izolate din MSC fără a se cunoaşte acest
fapt (Dennis 2004) din dorinţa de a analiza componenta stromală suportivă a hematopoiezei
(Deryugina 1993), dovedindu-se că au caracteristici MSC. Astfel, este cazul liniei MBA-15
(Benayahu 1989), care este osteogenică, al liniei MBA-1 care este condrogenică (Benayahu
1989) şi osteogenică, şi al liniei BMS2 (Pietrangeli 1988) – adipogenică şi suportivă a
limfocitelor în cultură.
Se apreciază că metodele de selecţie şi izolare a liniilor celulare au o mare importanţă sub
aspectul genotipic şi fenotipic al celulelor rezultate. Astfel, numeroase linii celulare murine sunt
selectate în urma transformării lor spontane în cultura primară. Procesul de selecţie se bazează pe
supravieţuirea unor celule modificate spontan în cultura primară senescentă. Unele celule nu se
mai divid, îmbătrânesc şi mor, în timp ce altele supravieţuiesc acestei „crize senescente”
căpătând însuşirea de imortalitate, de multiplicare nelimitată, datorită modificărilor genetice
spontane ce au loc în cultură sub forma mutaţiilor şi aberaţiilor cromozomiale, ce cauzează acest
comportament (Dennis 2004). Spre deosebire de acestea, transformate in vitro, anumite linii
celulare sunt izolate din celule tumorale diferenţiate in vivo.
Inducerea caracterului de imortalitate, se poate realiza prin intervenţie agresivă,
cunoscută la nivelul genomului celulelor din cultura primară. O astfel de metodă de
„imortalizare” constă în inducerea genei „SV-40 large T antigen” (Takahashi 1995), însă
influenţa pe care o are asupra fiziologiei celulare nu este documentată pe termen lung.
O metodă elegantă de imortalizare constă în utilizarea genelor „condiţionate”. Astfel,
condiţiile din cultură pot fi influenţate, condiţionând la rândul lor comportamentul celulei. O
astfel de genă este gena termosensibilă pentru SV-40 large T antigen. Temperatura de 33ºC
favorizează expresia genei, în timp ce intervalul 37-39ºC o inactivează. Un pas mai departe a fost
făcut prin inserarea unui promotor capabil de a creşte nivelul expresiei genei în prezenţa unor
substanţe exogene. Acest „produs”, ce are ca promotor un antigen din clasa I de
74
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 9] Cultivarea MSC
Studii recente au arătat că ţesuturile mezenchimale sunt mult mai plastice (capabile de
transdiferenţiere şi dediferenţiere) decât s-a crezut iniţial (Dennis 2004).
Rezultatele experimentale au ridicat problema plasticităţii fenotipice (Herzog 2003) ca urmare a
observaţiei că celulele stromale medulare se pot diferenţia în fenotipuri specifice sistemului
nervos, sistemului muscular, ţesutului hepatic, ţesutului cardiac.
Pentru susţinerea acestei afirmaţii mai multe studii au dovedit această caracteristică a
MSC (e.g. Bennett a demonstrat că adipocitele se pot diferenţia în osteoblaste (Bennett 1991)).
O observaţie ce validează plasticitatea celulelor şi ţesuturilor mezenchimale, constă în
suprapunerea şi întrepătrunderea fenotipurilor celulelor stromale medulare (Dennis 2004). Astfel,
unele celule izolate din MO murină au dovedit capacitaţi osteogenice, condrogenice şi
adipogenice fără a demonstra că favorizează formarea osteoclastelor (celule derivate din linia
hematopoietică), în timp ce altele favorizează formarea osteoclastelor fără a fi osteogenice
(Dennis 2004). Parcurgând datele din literatură se poate observa descrierea a numeroase
permutaţii posibile de diferenţiere, ce ilustrează plasticitatea celulelor mezenchimale.
Pentru explicarea acestei nestatornicii fenotipice au fost propuse mai multe modele ce
ilustrează diferenţierea MSC, inclusiv cu specificaţii detaliate pentru fiecare cale de diferenţiere
(Minguell 2001), cuprinzând şi modele cumulative, intersectate.
Din această ultimă categorie face parte modelul lui Gimble (1996) (Fig. 9.6). Acesta are
în centru celula de suport stromal, ca progenitor timpuriu al celorlalte linii mezenchimale. Cu
toate că există o suprapunere a fenotipurilor, acest model este incomplet deoarece nu cuprinde şi
transformările plastice ale celulelor mature (Dennis 2004).
75
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 9] Cultivarea MSC
Un model teoretic ce ţine cont de această insuficienţă a modelului lui Gimble, este cel a
lui Dennis şi Charbord (2002) (Fig. 9.7). În cadrul acestui model, evoluţia liniilor celulare se
desfăşoară în două compartimente: cel progenitor, în care au loc toate fenomenele legate de
variabilitatea potenţei MSC, şi compartimentul de diferenţiere, ale cărui celule provin din
compartimentul progenitor, dar răspund la stimuli externi, descriind plasticitatea celulelor fixate
într-o linie celulară matură ce pot schimba linia fenotipică. Cele două compartimente nu sunt un
spaţiu fizic delimitat strict la nivel medular ci unul virtual. Mai exact, compartimentul progenitor
reprezintă o stare genetică a potenţialului de diferenţiere. Avantajul acestui model, numit
„Modelul activării/represării stocastice”, constă în capacitatea de a ţine cont de toate
posibilităţile plastice caracteristice MSC (Dennis 2004)
Cu toate acestea, nu se cunoaşte dacă există o singură celulă stem mezenchimală ce dă
naştere la celule diferenţiate mezenchimale sau dacă există un amestec de progenitori pentru
fiecare linie celulară mezenchimală şi non-mezenchimală, reuniţi în populaţia MSC (Bobis
2006).
Studiile in vitro şi in vivo nu au gasit un răspuns unitar la această problemă, ci oferă
rezultate contradictorii. Dacă la început s-a crezut că MSC se pot diferenţia doar în celule
mezodermale, rezultatele actuale au arătat că MSC pot produce şi celule specifice ţesuturilor
non-mezodermale.
Până acum au fost obţinute celule precum: osteoblaste, adipocite, condrocite, fibroblaste,
mioblaste, cardiomiocite, hepatocite, tenocite, neuroni (Bobis 2006).
Deşi nu au fost identificate clar celulele responsabile de diferenţierea multiliniară a
celulelor stromale izolate din MO, bănuielile sunt îndreptate asupra MSC ca urmare a capacităţii
lor de a produce numeroase fenotipuri in vitro specifice mezodermului (Pittenger 1999),
ectodermului (Kopen 1999) şi endodermului (Sato 2005).
În ceea ce priveşte identitatea celulelor responsabile de acest comportament, lucrurile
sunt complicate şi de existenţa mai multor populaţii celulare similare: MAPC – multipotent adult
progenitor cells (Reyes 2001), MIAMI – marrow isolated adult multilineage inducible cells
(D’Ippolito 2004), RS-1 şi RS-2 (recycling stem cells) (Colter 2000) – toate localizate la nivel
medular.
76
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 9] Cultivarea MSC
Pentru a explica capacitatea MSC de a produce celule diferenţiate specifice celor trei
straturi embrionare au fost reunite mai multe teorii. Acestea vizează fie implicarea unor factori
genetici (reprogramare genetică specifică în cursul dezvoltării celulelor) (Sato 2005) şi/sau
factori solubili (Togel 2005), fie a unei populaţii celulare specifice (MAPC), ce se gaseşte în
MO. Modelul activării/represării stocastice, explică diferenţierea variată a MSC prin existenţa
proceselor de gene silencing ce au loc în cursul dezvoltării acestor celule (Dennis 2002). În plus,
s-a demonstrat prin studii RT-PCR şi DNA microarray că MSC posedă gene specifice atât
celulelor mezodermale cât şi celor ectodermale (Egusa 2005). MAPC, în condiţii specifice
produc celule specifice celor trei straturi embrionare. Cu toate acestea nu se cunosc parametrii
interacţiunii MAPC-MSC, speculându-se că MAPC sunt fie progenitori ai MSC, fie o populaţie
celulară creată şi selectată artificial prin cultură in vitro (Dazzi 2006). O altă ipoteză explică
schimbarea fenotipului MSC prin fuziunea acestora cu celule adulte diferenţiate (Terada 2002).
Pe langă acestea, Pittenger (1999) a arătat că numai o treime din totalul coloniilor CFU-F pot fi
diferenţiate adipogenic şi condrogenic.
Diferenţierea in vitro a MSC (Fig. 9.8, Fig. 9.9) este guvernată de mai mulţi factori:
mediul de cultură, densitatea celulelor, organizarea spaţială a culturii, forţele mecanice din
cultură, factorii de creştere prezenţi şi citokinele (Bobis 2006). Important este faptul că factorii
de creştere şi citokinele conduc diferenţierea MSC nespecific. Astfel, dexametazona favorizează
diferenţierea osteoblastică a MSC umane (Jaiswal 1997) şi diferenţierea adipogenică a MSC
murine (Dennis 1996), în timp ce rhBMP-2 (recombinat human bone morphogenetic protein 2),
stimulează diferenţierea osteogenică a ambelor specii, însă la doze diferite (Bobis 2006).
Un factor ce poate avea o mai mare importanţă in vivo constă în diferenţiere direcţionată
a MSC către un anume timp de celulă matură atunci când aceasta vine în contact direct sau
mediat chimic cu MSC. Astfel, MSC murine se pot diferenţia în miocite atunci când în mediu se
introduce mediu provenit de la miocite lezate, cocultura MSC-osteoblaste creşte potenţialul
osteogenic al MSC, iar hepatocitele pot induce hepatogeneza. Totuşi acestea nu sunt valabile
pentru toate celulele mature; spre exemplu condrocitele induc osteogeneza şi nu condrogeneza.
(Jones 2008)
77
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 9] Cultivarea MSC
Fig. 9.8. Potenţialul de diferenţiere al MSC umane pe baza observaţiilor in vitro. (Tuan 2003)
bFGF - basic fibroblast factor; bHLH - basic helix loop helix; BMP - bone morphogenetic protein; Cbfa 1
- core binding factor alpha 1; ECM - extracellular matrix; FGF - fibroblast growth factor; GDF - growth
differentiation factor; IBMX 3 - isobutil 1 metilxantina; LRP - low density lipoprotein receptor related
peptide; MAPK - mitogen activated protein kinase; PDGF - platelt derived growth factor; SMAD -
omologul uman al Drosophila Mad (Mad= mothers against decapentaplegic ); TGF beta - tranforming
growth factor beta; WISP - Wnt-1 inducible protein.
78
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 9] Cultivarea MSC
intermediul MAP kinazelor: ERK-1 (extracellular signal regulated kinase), p38, PKC, Jun
(Sekiya 2002) şi Smad (Tuan 2003). Un potenţial mecanism prin care kinazele MAP mediază
efectul TGF-beta implică molecula de adeziune N-caderina (Tuan 2003). Mai sunt sunt implicate
şi alte proteine regulatorii: BMP, CDMP (cartilage derived morphogenetic proteins) (Dennis
2002), membrii ai familiilor Hedgehog (Yamaguchi 2000) şi Wnt (Wnt-4 şi Wnt-14) (Enomoto
2002). Tot prin intermediul MAP kinazelor se speculează că ar acţiona şi calea de semnalizare a
proteinelor Wnt. În 2002 Hoffman a arătat că stimularea receptorului FGF-3 este unic necesară
pentru a induce diferenţierea condrogenică, acesta activând calea proteinelor Smad. Dintre
factorii transcripţionali implicaţi se citează: Sox9, Msx2, Brachury, Hox, Pax şi Forkhead (Bobis
2006), SP-1 şi Ap-2 (implicaţi în producerea de agrecan) (Tuan 2003).
In vitro, adipogeneza (Fig. 9.10) este declanşată cu ajutorul unui cocktail: dexametazonă,
izobutil-metil-xantina şi indometacin (Dennis 2002) şi insulină (Chamberlain 2007). Acest
amestec stimulează apariţia vacuolelor lipidice şi expresia receptorului peroxisome proliferation-
activated receptor γ2 (PPAR-γ), lipoprotein lipazei şi a fatty acid-binding protein P2
(Chamberlain 2007). Indometacin-ul modulează factorul PPAR-γ care este crucial pentru
adipogeneză (Lehmann 1997). Un rol major îl au proteinele BMP şi bFGF (Noel 2004). Proteina
BMP-2 stimulează procesul in vivo iar receptorul BMPR-1R poate direcţiona diferenţierea MSC
pe linie adipogenică (prin blocare) sau osteogenică (prin stimulare) (Bobis 2006). Alţi factori
implicaţi: C/EBP-alfa şi C/EBP-beta, Wnt-10b, TAZ.
Pentru MSC derivate din plămânul embrionar de şoarece, factorul mecanic (tensiunea şi
întinderea) acţionează crescând nivelul proteinei TIP-3 (tension-induced-inhibited protein 3) ce
favorizează miogeneza (Kolf 2007). Aceasta poate fi indusă şi prin transfecţia MSC cu factorul
Notch-1 activat (Dezawa 2005), însă mecanismul nu este cunoscut în profunzime. Pentru
obţinerea de cardiomiocite, este necesară co-cultura MSC-cardiomiocite, care să favorizeze
contactul între cele două tipuri celulare, şi activarea proteinei Jagged 1 (Li 2006). Dacă sunt
tratate cu 5 azacytidine şi amfotericina B, MSC formează mioblaste ce fuzionează în tubuli ce se
contracta ritmic (Chamberlain 2007).
Pentru diferenţierea MSC în tenocite, proteinele GDF, membre ale familiei TGF-β,
împreună cu încărcarea mecanică a culturii sunt de importanţă majoră. Dintre marker-i genici
implicaţi, se remarcă factorul scleraxis ce codează factorul de transcripţie bHLH, şi factorul R-
Smad8 în corelaţie cu BMP-2. (Kolf 2007)
79
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 9] Cultivarea MSC
80
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 9] Cultivarea MSC
Fig. 9.10. Aspectul microscopic, după marcare, al celulelor mezenchimale diferenţiate din
MSC provenite din MO. (Pittenger 1999)
Sunt prezentate cele trei fenotipuri mezenchimale definitorii pentru MSC (condrogenic, adipogenic şi
osteogenic). Fenotipul adipogenic: marcaj cu oil red O; fenotipul condrogenic: marcaj cu anticorp
monoclonal C4F6 anti-colagen tip II; fenotipul osteogenic: marcaj pe baza creşterii fosfatazei alcaline
şi a depunerii de claciu. A la I: celule diferenţiate din MSC provenite de la trei donator umani
sănătoşi; J la K: martor negativ reprezentat de către fibroblaste (Hs27) tegumentare de nou-născut;
M la O: martor negativ reprezentat de către fibroblaste (1087Sk) din ţesut mamar adult.
81
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 10] Aplicații ale MSC în domeniul ingineriei tisulare
„An idea not coupled with action will never get any
bigger than the brain cell it occupied.”
Arnold H. Glasow
82
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 10] Aplicații ale MSC în domeniul ingineriei tisulare
recomandă realizarea de pasaje noi când se atinge o confluenţă de 70% şi însămânţarea celulelor
la densitate mică.
Pe lângă acţiunea la nivelul organismului adult, MSC sunt implicate şi în evoluţia
organismului fetal şi neonatal. Când sunt transplantate, ele migrează şi contribuie la diferenţierea
a numeroase ţesuturi. În plus, supravieţuirea lor nu depinde de maturitatea sistemului imun al
organismului la momentul transplantului, putând supravieţui până după maturarea sistemului
imun. Studiile ce au vizat transplantul lor la nivelul organismelor în formare au scos în evidenţă
că evoluţia MSC şi implicarea lor în colonizarea a numeroase ţesuturi se datorează influenţei
semnalelor prezente în organele în dezvoltare. Semnalele unui organism fetal sunt diferite de
cele de la adult, astfel încât există posibilitatea ca MSC să aibă o gamă mai largă de diferenţiere
la nivelul organismelor fetale. (Chamberlain 2007)
83
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 10] Aplicații ale MSC în domeniul ingineriei tisulare
Deşi există acest background incert, studiile recente tind să încline balanţa către
demonstrarea supravieţuirii MSC după administrarea sistemică. În acest sens, studiile lui Pereira
(1995,1998), utilizând tehnici de PCR, au arătat că MSC ale donatorului supravieţuiesc la nivelul
gazdei. În 1999, Hou a confirmat prezenţa MSC umane în ţesuturile ovine, post-administrare
sistemică.
Pentru OI, Horwitz (1999) a realizat primele transplantări terapeutice de MSC utilizând
aspirat medular neprelucrat. Rezultatele acestuia au indicat o grefare de 1.5-2% la nivelul MO a
receptorului, creşterea funcţiei osteoblastice, creşterea mineralizării osoase, a vitezei de creştere
şi reducerea numărului fracturilor. Însă studiul follow-up a arătat o reducere sau stagnare a
vitezei de creştere cu menţinerea creşterii mineralizării osoase. Prin utilizarea unei populaţii pure
de MSC rezultatele au fost îmbunătăţite (Horwitz 2002).
În 2005, Le Blanc a realizat primul transplant uman terapeutic in utero, utilizând MSC,
pentru OI. MSC au fost recoltate din ficat fetal masculin, HLA-mismatched, şi injectate în vena
ombilicală a unei paciente la vârsta de 32 săptămâni de gestaţie. După naştere, identificarea
genomului masculin a identificat o grefare a celulelor de 7.4%, fără reacţie de rejet. După
introducerea tratamentului cu pamidronat la vârsta de 4 luni, nivelul mineralizării osoase a atins
76% la vârsta de 22 de luni.
Deşi rezultatele ultimilor studii ce se adresează prezenţei MSC în organismul gazdă, sunt
puse pe seama dezvoltării metodelor de identificare, eficacitatea administrării sistemice este
totuşi destul de redusă, fiind lipsită de aplicabilitate clinică extinsă (Dennis 2004).
Toate aceste rezultate dovedesc utilitatea şi fezabilitatea folosirii MSC în domeniul
reconstrucţiei osoase, acest domeniu fiind şi cel mai avansat în ceea ce priveşte aplicaţiile clinice
ale MSC.
Fiind una din caracteristicile de bază ale MSC, observată încă de la începutul studiului
lor, condrogeneza, a motivat apariţia primelor studii în domeniul reconstrucţiei tendoanelor şi
cartilajelor articulare.
Studiile realizate de Young (1998), Butler şi Awad (1999) în sfera refacerii tendoanelor
au dovedit că MSC transplantate local la nivelul unor matrice de suport se pot integra şi adapta la
nivelul ţesutului restant contribuind la refacerea lui.
Factorii cheie pentru tenogeneză sunt: condiţiile de cultură, factorii de creştere şi
stimularea fizică (încărcarea mecanică). Dintre factorii solubili implicaţi se citează: GDF 5, 6 şi
7 (growth/differentiation factor), membri ai superfamiliei TGF-β, şi BMP-13 (Wolfman 1997).
Fie că au fost utilizate în cadrul unor matrice de suport fibrilare sau gel (Awad 1999),
tendoanele refăcute au prezentat o rezistenţă de aproximativ 65% din rezistenţa unui ţesut
normal, cu circa 30% mai mult faţă de control.
Deşi proprietatea lor condrogenică a fost clar documentată (Yoo 1998a,b) studiile
experimentale ce au vizat regenerarea cartilajului articular (cunoscut a fi instabil şi precar după
regenerarea fiziologică) nu au furnizat rezultate favorabile.
Numeroase materiale au fost utilizate în încercarea de a repara ţesutul cartilaginos.
Polimeri naturali precum colagenul, însămânţaţi cu MSC au fost printre primii produşi utilizaţi
cu rezultate satisfăcătoare (Wakitani 1994).
Dintre polimerii sintetici cu rezultate bune se menţionează: alfa-hidroesterii PLA şi PLG
şi copolimerul acestora PLGA. Folosirea amalgamului PLA-hidrogel alginat ca matrice pentru
MSC, a furnizat in vivo rezultate bune explicate printr-o creştere a încărcării celulare cu
menţinerea morfologiei acestora (forma rotundă) necesară diferenţierii condrogenice, stimulată
de alginat, şi o rezistenţă structurală a compozitului oferită de către PLA (Caterson 2001).
Apariţia unei noi matrice pe bază de PLGA şi poli-ε-caprolactona, cu o structură 3D
similară reţelei naturale de colagen, cu abilitatea de a facilita aderare, proliferarea şi diferenţierea
MSC, încurajează aplicaţiile MSC în domeniul regenerării cartilaginoase.
84
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 10] Aplicații ale MSC în domeniul ingineriei tisulare
85
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 10] Aplicații ale MSC în domeniul ingineriei tisulare
MSC izolate din MO, se pot diferenţia în celule neuron-like în prezenţa factorului
neurotrofic derivat din creier (brain-derived neurotrophic factor – BDNF). Capacitatea
proliferativă este îmbunătăţită în prezenţa serului fetal bovin, a bFGF şi a fibronectinei (ca
substrat de creştere). Selectarea MSC CD133+ contribuie, de asemenea, la creşterea potenţialului
neurogen. (Nandoe 2006) Celulele neuron-like obţinute prezintă un potenţial de repaus tipic
neuronal (-20 – -50 mV) (Kohyama 2001). La acestea se adaugă şi observaţia conform căreia
MSC migrează in vivo la nivel cerebral, străbătând bariera hemato-encefalică şi diferenţiindu-se
în neuroni (Cogle 2004).
Aplicaţiile neurologice experimentale ale MSC au dovedit cu succes ameliorarea
leziunilor cerebrale apărute în urma accidentului cerebral de tip stroke pe un model experimental
murin (Li 2001a) (Chopp 2002), a leziunilor traumatice (Chopp 2002) respectiv remiterea
simptomatologiei induse în cadrul unui model indus medicamentos al bolii Parkinson (Li 2001b).
Majoritatea autorilor descriu o creştere a remielinizării zonelor afectate cu creşterea
numărului celulelor gliale şi limitarea morţii celulare. Keilhoff (2006) a arătat că MSC pot
produce celule gliale Schwann-like. Funcţional, aceste celule au remielinizat mai mulţi axoni
simultan (comportându-se ca în SNC) atunci când au fost transplantate pe un model experimental
de întrerupere a nervului sciatic. Beneficii au fost înregistrate şi în cazul leziunilor medulare
subtotale (la şobolan).
Hofstetter, a arătat că MSC de şobolan, injectate la nivelul leziunilor medulare ale unor
şobolani paraplegici au contribuit la formarea unor punţi ce străbat epicentrul leziunii
coordonând regenerarea. În acest caz efectul favorabil în evoluţia subiecţilor este pus pe seama
producerii de factori umorali de creştere şi nu a diferenţierii în neuroni sau celule gliale
(Chamberlain 2007).
MSC au fost utilizate şi pentru refacerea leziunilor nervului sciatic la şobolan. După
cultivarea lor într-un mediu potenţator pe bază de forskolină, FGF, PDGF şi heregulină, urmată
de transplantul la nivelul leziunii s-a observat diferenţierea MSC în celule ce produc proteine
mielinizante (Dezawa 2001).
O caracteristică interesantă este reprezentată de faptul că gradul refacerii nervoase
variază în funcţie de donor (pentru MSC umane). Aceeaşi dependenţă a fost observată şi între
diferite loturi de MSC izolate de la acelaşi donor (Neuhuber 2005).
86
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 10] Aplicații ale MSC în domeniul ingineriei tisulare
Pentru viitor, viza terapeutică clinică este îndreptată către regenerarea leziunilor medulare
traumatice, soldate cu deficit motor, şi a anomaliilor cu mecanisme moleculare (leziuni
demielinizante, scleroză laterală amiotrofică etc.). Capacitatea de migrare a MSC, funcţia de
neuroprotecţie şi regenerare axonală au demonstrat până acum că MSC pot îmbunătăţii
performanţa motorie după leziuni medulare acute, subacute şi cronice (Nandoe 2006).
Principala adresabilitate a MSC, este îndreptată către bolile cronice hepatice a căror
singură soluţionare o constituie transplantul hepatic (TH). MSC prezintă un spectru de utilitate
mai larg ca TH: (1) pot fi expansionate in vitro, manipulate, crioprezervate, nu necesită
imunosupresie, tehnică chirugicală de infuzie minoră; (2) pot servi la obţinerea de hepatocite
necesare realizării dispozitivelor bio-artificiale bridge-to-transplant.
Deşi unii autori au raportat rezultate negative pentru afecţiunile terminale
(Mohamadnejad 2007), alţii au obţinut rezultate favorabile cu transplantul autolog de MSC prin
injectare intraportală (Terai 2006). În afara afecţiunilor cronice, MSC au fost utilizate şi pentru
tratamentul hepatitei medicamentoase (Gasbarinni 2007).
În aplicarea MSC în terapia gastroenterologică trebuie ţinut cont de faptul că efectul
poate fi tranzitor (prin modulare locală), necesitând administrări repetate, la care se adaugă
observaţia că MSC fuzionează cu unele celule digestive rezultând celule aneuploide posibil
instabile şi cu potenţial malign. (Piscaglia 2008)
Primele dovezi că MSC pot fi utilizate pentru a livra agenţi terapeutici împotriva
cancerelor au fost furnizate de către Studeny (2004), care a demonstrat că după injectarea
intravenoasă de MSC modificate pentru a produce IFN-β, acestea se grefează preponderent
tumoral, inhibând creşterea tumorală şi prelungind supravieţuirea.
Rezultate similare au fost raportate şi în cazul utilizării a MSC capabile să producă NK-4
(natural killer transcript 4) sau CX3CL1 (chemokină implicată în mobilizarea celulelor NK şi
LT) (Roorda 2009).
Un pas mai departe a fost făcut de către Stoff-Khalili (2007) care a utilizat MSC ca
vehicul pentru inocularea tumorală a unor virusuri (CRAds – condiţional replicating
adenoviruses) – viroterapie, pentru metastazele pulmonare şi cancerele de sân, virusul fiind
agentul terapeutic.
Funcţiile imunologic active ale MSC le fac utile în tratamentul diabetului. Astfel, se
precizează că acestea pot interfera anumite mecanisme din patogenia diabetului tip 1, debilitând
procesul autoimun prin imunomodulare, principalul mecanism constând în prezentarea de
molecule costimulatoare negativ ce reglează celulele T autoreactive şi celule T reglatorii. Unele
rezultate promiţătoare au apărut încă din 2004 (Tang 2004).
Aplicaţii clinice ale MSC vizează şi alte domenii. Au fost raportate rezultate pentru
regenerarea muşchiului (De Barri 2003), plămânului (Bruder 1997), tegumentului (Badiavas
2003), tubului digestiv (Sîrbu-Boeţi 2008), leziunilor tegumentare postiradiere (Francois 2007);
în plus, a fost arătat că MSC stimulează angiogeneza (Hernigou 2002).
87
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 10] Aplicații ale MSC în domeniul ingineriei tisulare
88
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 10] Aplicații ale MSC în domeniul ingineriei tisulare
Între toate aceste trial-uri cele mai titrate produse pe bază de celule stem, aflate în teste la
ora actuală sunt: Prochymal® (bazat pe MSC, Osiris Therapeutics Inc.) – pentru boala Crohn,
GVHD, diabet tip 1, COPD şi MultiStem® (bazat pe MAPC, Athersys) – pentru IMA, afecţiuni
autoimune. Apariţia a noi trial-uri este alimentată de lipsa citării unor efecte adverse
semnificative, privind utilizarea acestor celule şi de obţinerea unor rezultate primare
satisfăcătoare.
Cu toate acestea, lipsa unei standardizări internaţionale vizând izolarea şi cultura acestor
celule rămâne un obstacol important în desluşirea completă a biologiei acestor celule,
traducându-se printr-o întârziere în implementarea unor terapii celulare în clinică ca tratament
curent.
89
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 10] Aplicații ale MSC în domeniul ingineriei tisulare
Deşi au un rol imunologic activ, se cunosc puţine lucruri despre supravieţuirea pe termen
lung in vivo a acestor celule şi despre modul de influenţare a sistemului imunitar al gazdei pe
termen lung.
Lipsa efectelor adverse este corelată clasic cu scurta durată de supravieţuire a acestor
celule in vivo, însă date recente ce atestă supravieţuirea lor pe termen lung motivează găsirea
unei alte explicaţii. Ţinând cont de observaţiile cu privire la formarea de ţesuturi ectopice,
transformare malignă şi imunogenitate MSC, survenite în urma administrării sistemice trebuie
analizat atent raportul risc/beneficiu.
MSC, prin homing-ul către ţesuturile afectate generează o imunosupresie locală specifică,
care din punct de vedere clinic este de dorit în comparaţie cu imunosupresia indusă
medicamentos care este generală şi predispune la infecţii oportuniste.
În plus, unele studii arată că transplantul local al MSC, produce o imunosupresie
sistemică la fel ca şi infuzia sistemică de MSC, ce scade răspunsul imun antitumoral (Djouad
2003) favorizând apariţia tumorilor alogene. Imunosupresia este sistemic nespecifică,
independentă de expresia MHC şi manifestată atât pentru MSC autologe cât şi MSC alogene sau
xenogene (Nauta 2007).
Pe lângă aspectul imunosupresie, alte posibile probleme ce trebuie analizate sunt: (1)
producerea de tumori; (2) proliferarea în exces; (3) diferenţierea nedorită; (4) localizarea
aberantă; (5) funcţionarea nesatisfăcătoare. Pentru un control al acestora, manipularea genică
pretransplant oferă o soluţie de reducere a riscului.
Cultura extensivă in vitro poate influenţa negativ caracteristicile funcţionale ale MSC in
vivo. Afectarea datorată MSC depinde de specie şi de tipul ţesutului de origine. Astfel, la om nu
au fost observate transformări sau fenomene de imortalizare in vivo a MSC din MO, aşa cum este
cazul MSC izolate din ţesut adipos uman (Rubio 2005). În ceea ce priveşte specia, MSC umane
sunt mai stabile comparativ cu cele murine faţă de mutaţiile şi aberaţiile cromozomiale survenite
în cultură. În plus,, s-a observat că MSC murine se pot transforma malign în cultură, dând
naştere la osteosarcoame (Tolar 2007), susţinând teoria în care tumorile se pot dezvolta şi în
urma mutaţiilor apărute la nivelul MSC (Miura 2006).
Deşi la pacienţii transplantaţi nu au fost observate fenomene oncogenetice legate de uzul
MSC, testarea cariotipului culturii MSC se impune ca fiind obligatorie pre-transplant.
90
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 11] Imunologia MSC
11 IMUNOLOGIA MSC
Natura imunosupresoare a MSC a fost observată in vitro (Fig. 11.1, Fig. 11.2) pentru
celulele umane, de şobolan şi de babuin, traducându-se prin supresia marcată a activării şi
proliferării în vitro a LT. (Nauta 2007)
MHC I poate activa LT, însă în lipsa moleculelor costimulatorii (CD40, CD80 şi CD86)
nu va avea loc un răspuns secundar, astfel încât LT rămân anergice. (Chamberline 2007).
MSC inhibă proliferarea LT indusă de aloantigene (Le Blanc 2004), mitogeni (di Nicola
2002) sau de CD3 şi CD28 (Tse 2003). da Silva (2008) consideră că această supresie se
datorează inhibării diviziunilor LT decât inducerii apoptozei. La acestea se adaugă şi inhibarea
LT citotoxice, probabil prin supresia proliferării acestora decât a activităţii lor citolitice
(Maccario 2005).
Imunosupresia LT nu este restricţionată imunologic, rezultate inhibitorii similare
obţinându-se atât pentru MSC autologe cât şi alogene (Le Blanc 2004).
91
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 11] Imunologia MSC
Mecanismul supresiei are la bază utilizarea factorilor solubili produşi de MSC în prezenţa
LT, fiind absolut necesară realizarea unei interacţiuni dinamice LT-MSC care să declanşeze
producţia acestora (Nauta 2007). Această interacţiune este susţinută şi de rezultatele lui Djouad
(2003), care a observat că supernatantul de MSC umane sau murine nu are efect inhibitor asupra
LT decât dacă MSC şi LT sunt cultivate în cocultură. MSC posedă o serie de molecule implicate
în interacţiunea cu LT: MHC clasa I, VCAM, ICAM-1, ALCAM, LFA-3 (Salem 2009).
Deşi rezultatele sunt uneori discutabile, mai mulţi factori au fost propuşi a fi implicaţi în
această supresie; cei mai des vehiculaţi fiind TGF-β şi HGF (hepatocyte growth factor) (di
Nicola 2002), PGE2 (prostaglandina E2), monoxidul de azot (da Silva 2008) şi enzima IDO
(indolamina 2,3-deoxigenaza, ce catabolizează triptofanul) (Meisel 2004). IDO, în urma
stimulării MSC de către IFN-γ, degradează triptofanul în kynurenine, responsabile după unii de
apoptoza LT (Plumas 2005).
Un alt mecanism are la bază anergia LT indusă de către MSC ca urmare a lipsei de pe
suprafaţa celor din urmă, a moleculelor costimulatoare CD80 (B7-1) şi CD86 (B7-2) (Nauta
2007).
Inhibarea răspunsului LT se realizează şi prin modularea LT regulatorii. MSC stimulează
formarea LT regulatorii CD8+ responsabile de supresia proliferării LT alogene (Djouad 2003) şi
a LT CD4+CD25+, cu rol supresor (da Silva 2008). Pe lângă aceasta a fost observată şi supresia
LTh1, soldată cu scăderea secreţiei de IFN-γ (da Silva 2008).
Cu toate că MSC inhibă răspunsul LT, componenta executorie a răspunsului imun, unele
rezultate arată că această inhibiţie ar putea fi nespecifică, întrucât MSC inhibă şi proliferarea
anumitor linii celulare tumorale (Ramasamy 2007).
Pe lângă LT, MSC suprimă şi limfocitele B (LB) (Fig. 11.1, Fig. 11.2) şi stimularea
antigenică a acestora, cu menţinerea lor în faza G0/G1 (da Silva 2008). Această observaţie
provine din studii ce au utilizat atât MSC umane cât şi murine.
MSC alogene inhibă proliferarea, activarea şi secreţia IgG1 antigen specifică şi IgM a LB
murine (Asari 2009). La aceasta se adaugă şi influenţarea procesului de diferenţiere, producţiei
de Ac şi a comportamentului chemotactic al LB. (Corcione 2006)
Cel mai important, MSC suprimă diferenţierea terminală a LB în plasmocite
(condiţionată de factorul Blimp-1 – B-lymphocyte induced maturation protein 1) declanşată în
urma stimulării lor de către lipopolizaharide (LPS) (Asari 2009)
Mecanismul imunosupresiei LB nu necesită interacţiunea MSC-LB şi prezenţa IFN-γ
(stimulează producţia enzimei IDO de către MSC – cu presupus efect supresor al LB prin calea
metabolică a triptofanului) (Asari 2009). Asari (2009) a arătat că factorii MCP-1 (monocyte
chemotactic protein 1), IL-1 şi TGF-β nu sunt implicaţi în supresia LB, şi că acest mecanism se
bazează pe factori solubili (necunoscuţi încă) care scad expresia ARNm pentru Blimp-1.
Pe lângă supresia directă a LT şi LB, MSC par a controla in vitro şi celulele prezentatoare
de antigen (Fig. 11.1, Fig. 11.2), un factor cheie implicat în supresia indirectă a LT şi LB.
Dintre APC, MSC interacţionează preferenţial cu celulele dendritice (CD). Interacţiunea
MSC-CD se manifestă la nivelul diferenţierii (suprimând diferenţierea acestora – rezultă CD
imature cu fenotip imunosupresor), maturării şi funcţionarii CD. MSC inhibă diferenţierea
progenitorilor CD34+ în celule dendritice CD1a+, conducând la obţinerea unor celule cu fenotip
asemănător macrofagelor. (Nauta 2007)
MSC inhibă expresia pentru CD1a, CD40, CD80 şi CD86 în cursul maturării celulelor
dendritice. (Salem 2009)
92
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 11] Imunologia MSC
93
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 11] Imunologia MSC
94
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 11] Imunologia MSC
95
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 11] Imunologia MSC
96
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 11] Imunologia MSC
97
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 12] Celulele stem şi cancerul
Existenţa asemănărilor între celulele stem şi celulele maligne (cea mai importantă fiind
cea de self-renewal), a indus apariţia ipotezelor privind implicarea celulelor stem în originea şi
dezvoltarea proliferărilor maligne.
Se speculează că celulele stem participă la dezvoltarea proceselor proliferative prin mai
multe mecanisme, cunoscute însă parţial. Dintre acestea se remarcă participarea directă a
acestora, prin suportul direct al tumorigenezei sau prin dezvoltarea cancerului direct dintr-o
celulă stem, şi cea indirectă, reprezentată de interacţiunea şi contribuţia celulelor stem la
dezvoltarea nişei celulelor stem maligne (Tab. 12.1).
98
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 12] Celulele stem şi cancerul
În plus, celulele stem şi cele maligne prezintă caractere comune: abilitatea de a prolifera,
invada, migra şi dezvolta în ţesuturi diferite faţă de cele de origine.
Pe baza acestor observaţii, Sell (1994) consideră celula stem ca fiind echivalentul
modern al resturilor embrionare clasice, mai ales că cele mai multe tumori îşi au originea în
celule cu maturaţia blocată, provenite din celule stem.
99
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 12] Celulele stem şi cancerul
limitează diviziunea TAC. Ca rezultat, TAC scapă de sub controlul ce le conferă un număr
limitat de diviziuni, iar pentru că numărul lor este mai mare ca al celulelor stem, proliferarea lor
sub influenţa mutaţiilor este un pas important în formarea tumorilor. (Clarke 2006)
Cancerele pot apărea la orice vârsta, pornind de la TAC. Gradul de diferenţiere al
proliferării depinde de gradul de diferenţiere atins de TAC la momentul acţiunii factorilor
declanşatori. Pe lângă aceasta, şi comportamentul biologic al cancerului depinde de stadiul de
maturare al acestor celule. Astfel, TAC este blocată la acel moment al maturării sale, putând
produce astfel, cancere de la slab (dacă TAC se află la începutul procesului) la bine diferenţiat
(dacă TAC este la finalul procesului).
Pe lângă acestea, pentru ca un proces proliferativ să se dezvolte, trebuie ca modificările
oncogenetice să se producă într-o celulă ce se divide şi care nu poate fi eliminată în cursul
turnover-ului fiziologic (e.g. celulele din mucoasa digestivă ce sunt descuamate fiziologic în
lumen) – rămânând în organism şi proliferând malign. În acest sens celulele stem orientate către
malignizare, prin diviziune asimetrică (putând păstra o fiică modificată malign), îndeplinesc
condiţiile necesare întreţinerii proliferărilor maligne. În plus, toate ţesuturile adulte conţin linii
celulare ce au la bază celule stem specifice şi urmaşi ai acestora (TAC).
În ceea ce priveşte intervenţia genelor în oncogeneză, sunt suspectate genele
responsabile de self-renewal. Una din acestea este gena Bmi1. Studiile pe şoareci au arătat că
aceasta este necesară menţinerii identităţii HSC şi celulelor stem neurale (Park 2003), prin
suprimarea genelor de diferenţiere. Aceeaşi genă este implicată şi în proliferarea celulelor stem
maligne (celule stem-like cu capacitate de self-renewal ce susţin populaţia celulelor tumorale)
(Clarke 2006).
La polul opus sunt genele ce codifică proteine precum p19Arf, p16Ink4a, şi Tp53, gene
supresor tumorale, care sunt inhibate de către Bmi1, şi care fac parte dintr-un mecanism de
siguranţă al celulelor stem sau celulelor progenitoare (Clarke 2006).
Astfel, numeroase tumori pot lua naştere în urma mutaţiilor ce dezorganizează căile
normale de proliferare, culminând cu formarea de celule stem maligne responsabile de evoluţia
ulterioară a tumorii.
Existenţa CSC, celule latente, explică eşecul terapiilor ce ţintesc celulele proliferative,
însă orientează şi asupra unor noi metode: ţintirea căilor de comunicare Wnt, Sonic Hedgehog şi
Notch, implicate în stemness şi responsabile de progresia şi metastazarea cancerului. Aplicarea
unor astfel de terapii necesită cruţarea celulelor stem normale, ce se poate realiza prin utilizarea
unui marker precum CD133 – glicoproteină transmembranară exprimată de către unele celule
stem normale (linia hematopoietică, epitelială şi endotelială) dar şi de CSC ale melanoamelor,
cancerelor de rinichi, colon, ficat şi ovar. (Piscaglia 2008)
100
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 12] Celulele stem şi cancerul
Fig. 12.1. Modele de origine a celulelor stem maligne prin eludarea controlului nişei
asupra celulelor stem normale. (Clarke 2006)
A. În țesuturile normale, celulele nişei (verde pal) oferă semnale ce stimulează activitatea de
self-renewal (săgeata curbă) a celulelor stem (albastru); celulele progenitoare (roz, galben şi
oranj) nu răspund la aceste semnale, proliferarea lor fiind reglată prin contorizarea numărului de
diviziuni mitotice. B. Expansiunea celulelor ce formează nişa (verde pal) facilitează expansiunea
celulelor stem maligne (roz închis); creşterea nişei se datorează fie modificărilor celulelor stem
maligne sau celulelor ce formează nişa; oricare ar fi varianta corectă, s-a observat că celulele
stem maligne dau naştere unor celule non-maligne cu aberații de diferențiere ce formează masa
tumorală. C. Modificările celulelor stem maligne (roz închis) permit racolarea de celule
alternative formatoare de nişă (verde închis) care să ofere celulelor stem maligne semnale
pentru întreținerea replicării; acest mecanism poate sta la baza invaziei țesuturilor locale şi a
metastazării (NB: Tumorile sunt un amestec de celule stem maligne şi celule non-maligne cu
aberații de diferențiere). D. Shiful-ul celule stem maligne dependente de nişă/celule stem
maligne independente de nişă poate fi asociat cu modificarea unui cancer ce se transforma din
“blând” în agresiv; este posibil ca mutațiile apărute în cursul diviziunilor să transforme celulele
progenitoare în celule stem-like capabile de self-renewal; evenimente ulterioare ce implică
aceste celule transformate pot culmina cu apariția unui neoplasm. În acest exemplu originea
celulelor stem maligne este în celulele progenitoare şi nu stem normale.
101
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 12] Celulele stem şi cancerul
În 1889, Stephen Paget a arătat în teoria „seed and soil”, că micromediul înconjurător
este un factor cheie al creşterii tumorale. Aproape la un secol distanţă, Folkman propune ipoteza
în care angiogeneza este elementul vital al proliferării tumorale, astfel încât „switch-ul
angiogenetic” reprezintă o modificare fenotipică critică (Hanahan 1996).
Cercetările ultimilor ani au evidenţiat faptul că proliferarea tumorală se bazează pe
interacţiunea cu alte celule (celule stromale endoteliale, fibroblaste, pericite şi celule
inflamatorii), inclusiv celule progenitoare medulare (Sangai 2005). Acestea părăsesc MO,
migrează în torentul circulator şi se încorporează în mediul tumoral favorizând creşterea
acestuia (de Bont 2001) (Fig. 12.2).
Celulele medulare asociate dezvoltării tumorale reprezintă un grup vast numit „bone
marrow derived tumor stromal cells”, cu origine hemato şi non-hematopoietică. Un subgrup al
acestora, „bone marrow derived tumor associated endothelial cells” îşi au originea în celulele
progenitoare endoteliale (EPC) şi EPC-like (monocite şi macrofage trans-diferenţiate, MAPC şi
MSC (Liu 2007)).
Fig. 12.2. Modularea micromediului tumoral de către celulele derivate din măduva
osoasă. (Roorda 2009)
Celulele stem hematopoietice şi non-hematopoietice produc progenitori celulari care odată pătrunşi
în torentul sangvin pot migra la nivelul tumorilor. TEM - Tie2-expressing monocytes; EPC - celule
progenitoare endoteliale; PPC - celule progenitoare pentru pericite.
Există dovezi ce susţin existenţa unei ierarhii celulare tumorale reminiscente (specifice
ţesutului în care a luat naştere proliferarea) pentru cancerele hematologice şi tumorile solide. În
cadrul acestei ierarhii la bază se găseşte o celulă stem malignă ce produce urmaşi cu potenţial de
replicare limitat (Singh 2004). Existenţa unei astfel de celule are implicaţii clinice şi terapeutice
majore. (Clarke 2006)
102
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 12] Celulele stem şi cancerul
Recent, MSC au fost adăugate listei celulelor ce contribuie la micromediul tumoral (Fig.
12.3).
A fost observat că MSC medulare contribuie la conturarea populaţiei fibroblastice în
stroma tumorală (Sangai 2005), ele fiind identificate atât în tumori umane (Direkze 2004) cât şi
animale. Experimental s-a constatat că MSC manifestă un homing preferenţial tumoral după
inoculare intraperitoneală sau intravasculară la şoareci (Roni 2003). În plus, Ramasamy (2007)
a observat că rata de apariţie a tumorilor este mai mare la subiecţii injectaţi cu celule canceroase
+ MSC faţă de cei inoculaţi doar cu celule tumorale, probând astfel rolul MSC în grefarea şi
creşterea tumorală.
Deşi nu este complet explicat modul în care MSC sprijină proliferările maligne, se
speculează totuşi rolul acestora ca factor imunosupresor (favorizând grefarea şi proliferarea
tumorală) şi de modulator al micromediului tumoral prin stimularea angiogenezei (Roorda
103
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 12] Celulele stem şi cancerul
2009). MSC suprimă răspunsul imun antitumoral (Djouad 2003). Ramasamy (2007) le atribuie,
în plus, rolul de a participa la formarea nişei stem tumorale protejând astfel celulele tumorale de
apoptoza indusă terapeutic.
12.2.1 Angiogeneza
Întrucât MSC contribuie la constituirea nişei stem hematopoietice, s-a propus ideea că
ele au acelaşi rol şi pentru ţesuturile tumorale (Ramasamy 2007).
Cu toate că in vitro, MSC exprimă un efect antitumoral (scad ciclina D2 tumorală
asociată cu menţinerea celulelor în faza G1 şi scăderea apoptozei – celule tumorale latente),
această observaţie este total opusă in vivo.
Se speculează astfel că MSC favorizează supravieţuirea celulelor tumorale protejându-le
de apoptoză. Menţinerea celulelor stem tumorale în stare de latenţă este un factor critic,
deoarece conservă potenţialul de self-renewal şi longevitatea acestora. În acest sens, rezultatele
lui Ning (2008), care a observat o rată de recurenţă crescută la pacienţii trataţi cu cotransplant
HSC + MSC, sunt obiective şi evidenţiază rolul protector al MSC faţă de celulele tumorale.
În plus, Matsunaga (2003) a observat că celulele tumorale umane legate de fibronectina
celulelor stromale medulare, prin intermediul moleculei VLA4 (very late antigen 4) devin
rezistente la apoptoza spontană sau indusă medicamentos.
Pentru a putea susţine creşterea tumorală a procesului proliferativ situat la distanţă, MSC
trebuie să circule.
În acest sens, Kawada (2004) a observat că MSC murine pot fi mobilizate în sângele
periferic condiţionându-le cu G-CSF (granulocyte colony stimulating factor) şi se pot grefa în
ţesutul cardiac ischemic. Mai mult, Bittira (2003) a observat că MSC migrează spontan către
ţesutul miocardic ischemic al şobolanilor.
La om MSC circulante au fost identificate după stimularea cu factori de creştere la
pacienţii cu cancer de sân (Tondreau 2005) dar şi la persoane sănătoase fără stimulare
(Kuznetsov 2001).
Celule stromale medulare pot fi mobilizate sub influenţa factorilor produşi de tumori,
precum: VEGF, angiopoietina-1, SDF-1, GM-CSF, urmând gradientul acestora în torentul
circulator până la nivelul tumorii (Spring 2005).
În ceea ce priveşte integrarea lor tumorală se speculează rolul moleculelor de adeziune şi
al integrinelor (Chamberlain 2007).
Cu toate că unele grupuri nu au reuşit identificarea unor astfel de celule circulante,
rezultatele susţin existenţa unei populaţii MSC circulante (Roorda 2009).
104
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 12] Celulele stem şi cancerul
Echilibrul între self-renewal şi diferenţiere trebuie menţinut strict pentru a susţine fondul
de celule stem şi mature nealterat. Deoarece celulele stem şi cele tumorale au în comun
proprietatea de self-renewal, este esenţial ca numărul de celule fiice ce păstrează caracterul stem
să fie controlat atent, împiedicând astfel proliferarea necontrolată a acestora.
Organismele pluricelulare au dezvoltat mecanisme de protecţie antitumorală. Astfel,
pentru a lua naştere un anumit tip de cancer, trebuie ca un anumit număr de mutaţii să se
acumuleze în aceeaşi linie celulară, iar mecanismele de protecţie ale creşterii şi apoptozei să fie
inactive (Fearon 1990).
Pentru că aceste mecanisme singure nu sunt suficiente, organismul se protejează şi prin
limitarea numărului de celule cu potenţial de self-renewal (numai celulele stem) – scăzând astfel
şansele de acumulare a mutaţiilor spontane. (Clarke 2006)
Reglarea strictă a numărului de diviziuni al celulelor TAC este un alt mecanism de
protecţie. Acesta este limitat la câteva cicluri de replicare (diferit de cel al celulelor stem din
care provin, care este nelimitat) până ce aceste celule se diferenţiază, astfel încât garantează
încetarea activităţii progeniturilor înainte de a acumula mutaţii. Deşi există gene ce controlează
acest număr, rolul suprem îi revine micromediului celular (nişa stem) care controlează self-
renewal-ul şi decizia de diferenţiere (Spradling 2001). Rezultatele lui Calvi (2003) arată că nişa
stem joacă un rol important în reglarea expansiunii celulelor stem, în special prin mecanisme
apocrine, feedback negativ pentru semnalele mitogene şi căi de supresie a diferenţierii.
Mecanismele de supresie includ supresia translaţională precum şi regulatorii de cromatină ce
suprimă expresia genelor de diferenţiere terminală a celulelor stem.
Un alt mecanism de protecţie este reprezentat de catalogarea stării de diferenţiere ca
stare bazală propriu-zisă (default state), astfel încât în momentul diferenţierii celulele stem
părăsesc nişa.
Existenţa CSC (faţa neagră a celulelor stem) şi a mecanismelor carcinogenetice ce au la
bază celulele stem normale şi celulele progenitoare, impun o apreciere a balanţei risc-beneficiu
a terapiilor celulare şi o analiză amănunţită a acestora înainte de utilizare.
105
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 13] Metode de caracterizare şi identificare in vivo a MSC
13.1.1 Cariotiparea
Reprezintă o tehnică similară SKY, ce poate fi utilizată pe celule aflate în interfază (nu se
divid). Poate fi utilizată pentru a identifica prezenţa unei singure secvenţe de acid nucleic
106
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 13] Metode de caracterizare şi identificare in vivo a MSC
specifică unui anumit cromozom. Are ca dezavantaj spre deosebire de SKY, imposibilitatea
analizei tuturor cromozomilor în aceeaşi sesiune, întrucât necesita sonde FISH specifice, astfel
încât este dificil de detectat rearanjările genomice ale tuturor cromozomilor simultan. (Loring
2007)
Este o metodă genetică cu o rezoluţie foarte mare, ce poate detecta modificări la nivelul
unei singure baze azotate din structura acidului nucleic (e.g. secvenţa AAGCTA vs. AAGCTTA
diferă la cel de al patrulea nucleotid; G şi T sunt alele); identifică mutaţia unei perechi de baze la
un anumit locus. (Loring 2007)
13.1.5 RT-PCR
Reprezintă metoda de bază utilizată pentru analiza expresiei genelor (profilul genic) în
culturile celulare, fiind simplă, senzitivă şi rapidă.
Este utilizată în combinaţie cu imunocitochimia şi/sau teste immunoblot; uzual este
folosită ca metodă de screening pentru expresia unor proteine.
Este cea mai completă şi de încredere tehnologie, utilă analizei profilului genic al
celulelor.
Foloseşte ca principiu hibridizarea unui fragment dublu-catenar de ADNc marcat
fluorescent, realizat din ARNm al probei de interes, cu un corespondent ADNc (sau nucleotide
specifice unei gene) fixat pe lamele de sticlă.
Poate identifica simultan gene din mai multe experimente astfel încât se pot face
comparaţii şi translaţii ale rezultatelor foarte uşor.
107
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 13] Metode de caracterizare şi identificare in vivo a MSC
Este o achiziţie recentă în studiul celular, fiind dezvoltată de Diana Peckys (2009) şi
colaboratorii la Universitatea din Tennesee, USA.
Oferă imagini la o rezoluţie de ordinul nanometrilor, fiind ideală pentru studiul
intracelular. Prin această tehnică se poate studia celula în întregime fără a fi necesară secţionarea
specimenului aşa cum se procedează pentru microscopia electronică de transmisie clasică. Celula
este fixată într-o cameră electrono-transparentă cu mediu umed ce permite studierea proceselor
intercelulare în dinamică. (Peckys 2009)
Beneficiază de o gamă largă de tehnici (Tab. 13.1), dintre care marea majoritate
utilizează bioluminescenţa indusă de luciferază sau altă substanţă şi fluorescenţa. Progrese
remarcabile au fost realizate prin folosirea luminii NIR (near infra red) cu spectrul 650-900 nm
108
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 13] Metode de caracterizare şi identificare in vivo a MSC
care facilitează pătrunderea în adâncime in vivo. Pentru lumina NIR se utilizează sonde specifice
compuse dintr-un vehicul de livrare a sondei legat de un fluorocrom NIR via o peptidă ce este
substratul unei enzime proteolitice. Proteoliza sondei după intrarea acesteia în celula amplifică
puterea de emisie. (Frangioni 2004)
Este un tip special de microscopie optică utilizată pentru obţinerea unor imagini cu o
claritate şi rezoluţie crescută. Modul de funcţionare a acestor microscoape elimină din imaginea
observată (imaginea in focus) toată informaţia ce distorsionează imaginea (din câmpul
microscopic out of focus). (Goldman 2005)
Faptul că practic „feliază” specimenele observate, şi apoi recompune imaginea, o face
ideală pentru studiul celulelor vii, eliminând astfel artefactele. În plus, rezoluţia foarte mare
constituie un alt avantaj (e.g. pot fi vizualizate detalii intracelulare pe fragmente de ţesuturi).
(Goldman 2005)
Dezvoltarea unei sonde laparoscopice confocale de către Goetz (2008) facilitează detecţia
celulelor stem cu ţintă viscerele abdominale accesibile laparoscopic. Deşi procedeul este la
109
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 13] Metode de caracterizare şi identificare in vivo a MSC
13.4.4 Ultrasunetele
Marcarea celulelor cu radiotrasori datează încă din anii 1970, ajungând să fie funcţionale
o serie de metode.
Astfel, limitării ce ţin de marcarea celulelor ex vivo precum: perioada de înjumătăţire a
trasorului care limitează durata de urmărire, nivelul scăzut de radioactivitate obţinut prin
marcajul cu trasori cu echilibrare pasivă, efluxul radiotrasorului din celulă şi radiotoxicitatea au
fost depăşite prin utilizarea unor procedee de transport facilitat, acumulare enzimă-dependentă
sau capturare metabolică a trasorului în combinaţie cu tehnicile PET-CT sau SPECT. (Gelovani,
2004)
110
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 13] Metode de caracterizare şi identificare in vivo a MSC
Avantaje: este o metodă senzitivă; poate scana întregul organism. Dezavantaje: necesită
modificarea genetică a celulelor pentru introducerea contrastului sau administrarea intravenoasă;
prezenţa radiaţiei ionizante; dificil de cuantificat. (Frangioni 2004)
Datorită capabilităţii de scanare 3D şi siguranţei crescute, este cea mai utilizată tehnică
de urmărire in vivo a celulelor stem la om, ajungând la o rezoluţie aproape de cea microscopică.
(Gelovani, 2004)
Marcarea celulelor pentru detecţia IRM se poate realiza folosind sistemul gene gun,
magnetofecţia, transfecţia sau electroporaţia. (Frangioni 2004)
Cel mai utilizat contrast pentru celulele stem este în secvenţa T2 şi foloseşte
nanoparticule de oxid de fier superparamagnetic. Nanoparticulele ferice sunt sigure,
biotolerabile, biocompatibile şi nontoxice. Pot fi utilizate pentru urmărirea unor cantităţi minime
de celule timp de câteva săptămâni. Dezavantajele particulelor: diluţia contrastului odată cu
diviziunea celulară, transferul în celule non stem după moartea celulei marcate, susceptibile la
artefactare. Pentru contrastul T1 se utilizează gadoliniul. Dezavantajul acestuia este reprezentat
de cantitatea crescută (50-500 µmol/L) necesară pentru a face celulele vizibile. (Arbab 2009)
Contraindicaţia IRM la pacienţii cu implanturi de pacemaker şi defibrilatoare cardiace,
restrânge utilizarea IRM pentru detecţia de celule stem.
Deoarece un singur agent de contrast specific unei tehnici are dezavantaje proprii, au fost
creaţi agenţi cu rol dublu.
Astfel este cazul nanoparticulelor monocristaline de oxid de fier marcate cu fluorofluori
ce permit injectarea lor în celule sub ghidaj optic şi identificarea lor în preparate histopatologice
(pe baza fluorescenţei) dar şi in vivo (cu ajutorul IRM). O altă modalitate utilizează inserarea
unei gene HSV1-tk modificate, care poate răspunde la o sondă reporter radiomarcată dar şi emite
111
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 13] Metode de caracterizare şi identificare in vivo a MSC
fluorescenţă verde prin asocierea cu eGFP, acest ansamblu genetic reporter numindu-se TKGFP.
(Frangioni 2004)
O altă categorie este reprezentată de agenţii trivalenţi: nanoparticule care generează
simultan semnal IRM, ultrasonic şi fluorescent sau semnal IRM, fluorescent şi izotopic. Din
această ultimă categorie face parte marker-ul CLIO-Tat pe bază de nanoparticule supermagnetice
internalizate celular cu ajutorul secvenţei peptidice protein-derivate TAT (utilizată în mod
frecvent pentru introducerea de marker-i în celule) ce facilitează urmărirea o perioadă mai lungă
de timp cu conservarea potenţialului de diferenţiere a celulelor şi posibilitatea de sortare
magnetică a acestora din ţesuturile excizate. (Gelovani, 2004)
Nanoparticulele sunt materiale cu dimensiuni mai mici de 1000 nm, cu o suprafaţă foarte
mare raportată la volum (suprafaţă mare, volum mic), ce le conferă o reactivitate şi putere
catalitică sporită. În plus, pot fi trecute foarte uşor prin membranele celulare, putând interacţiona
rapid cu sistemele biologice. (Mishra 2008)
Utilitatea nanoparticulelor în biologia MSC este preponderent direcţionată spre folosirea
lor în procesele de analiză şi urmărirea a MSC. La acestea se adaugă conducerea diferenţierii
MSC şi construcţia de matrice (scaffolds) suport pentru MSC în cadrul produselor de inginerie
tisulară.
Cele mai uzitate nanoparticule în ingineria biocelulară a MSC(Mishra 2008) sunt:
Feridex. Nanoparticule inerte de oxid de fier, ce oferă o cale sigură (sunt metabolizate
intrând pe cale metabolică a fierului) de marcare şi urmărire a celulelor, fără toxicitate. Se
utilizează frecvent pentru urmărirea IRM a celulelor stem (homing, localizare), dar şi pentru
identificarea fenotipică şi cell-sorting. Pot fi cuplate cu fluorofori, sporind astfel capacitatea de
detecţie prin combinarea IRM-fluorescenţă.
Nanofibre produse prin electrospinning. Sunt fibre artificiale pure extrase electric din
stare lichidă, în lipsa altor agenţi de prelucrare, fapt ce le face utile biologiei celulare.
Nanofibrele servesc ca etapă intermediară pentru obţinerea unor "folii celulare", datorită
capacităţii lor de reversabilitate termică. MSC pot fi cultivate pe aceste fibre ce favorizează
112
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 13] Metode de caracterizare şi identificare in vivo a MSC
113
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 14] Stemness
14 Stemness
114
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 14] Stemness
Santos 2002) (Sperger 2003) (Sato 2003). Prezenţa lor a fost confirmată indiferent de profilul
experimentului şi metodele folosite.
Alte studii au identificat pentru MSC factorii Oct-4, Sox-2 şi Rex-1 (comuni şi ESC),
aflaţi în strânsă relaţie funcţională cu proteinele Polycomb şi Trithorax ce reglează expresia
acestor factori (Fig. 14.2). Dintre citokinele implicate se disting: leukemia inhibitory factor
(LIF), fibroblast growth factors (FGFs, în special FGF2 ) şi omologul mamiferelor pentru
Drosophila wingless (Wnts). (Kolf 2007)
Nu poate fi eliminată din ecuaţia definitorie a stemness-ului, interacţiunea celulei stem cu
nişa stem. Nişa constituie micromediul, la nivel tisular, ce facilitează şi întreţine starea celulelor
stem (Spradling 2001). Astfel, s-a avansat ideea că nişa furnizează celulelor stem semnalele
necesare menţinerii acestei stări (Chen 2000). Chiar mai mult, în anumite ipostaze nişa poate
condiţiona celulele progenitoare să revină la condiţia de „stem” (Marshman 2002). Deşi există o
puternică interacţiune nişă-celulă stem, niciuna dintre ele nu concură independent la statutul
„stem”.
Cu toate că, o posibilă soluţie constă în identificarea căilor de semnalizare nişă-celulă
stem, acest lucru nu este suficient. Astfel, au fost identificate mai multe căi de semnalizare
celulară, precum calea Wnt, calea proteinelor BMP şi calea Notch.
Un exemplu convingător, ce arată că simpla interacţiune nişă-celulă stem nu este
suficientă, este oferit de prezenţa celulelor stem intestinale şi a progeniturilor acestora (i.e.
celulele Paneth) în aceeaşi nişa (i.e. criptele intestinale). Astfel, cele două tipuri de celule sunt
expuse aceluiaşi mediu condiţionant. Deşi ambele sunt influenţate prin calea de semnalizare
Wnt, fiecare reacţionează diferit (Sancho 2004).
115
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 14] Stemness
116
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 14] Stemness
117
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 14] Stemness
Evaluarea funcţională a 5 gene (PTPRF, AFAP, RAB3B, FZD7 şi DKK3) din grupul
celor de stemness, prin blocarea cu siARN a evidenţiat rolul acestora împreună în procesul de
supravieţuire celulară ca factori anti-apoptotici. Blocarea unică sau simultană a acestor gene are
efecte variate şi asupra diferenţierii MSC respective (Tab. 14.1). (Song 2006)
Tab. 14.1. Efectul blocarii genelor de stemness cu siARN asupra diferenţierii MSC.
Gena/Grupul de gene blocate Efect
PTPRF, AFAP, RAB3B, FZD7 sau MSC se pot diferenţia în osteoblaste cu activitate crescută a
DKK3 fosfatazei alcaline
AFAP, FZD7 şi RAB3B Creşte activitatea fosfatazei alcaline a osteoblastelor
DKK3 Stimulează producţia de proteoglicani dar o scade pe cea de
colagen II în cadrul condrogenezei
AFAP şi RAB3B Stimulează dramatic depunerea de colagen II
FZD7 şi PTPRF Scade semnificativ producţia de proteoglicani şi colagen II
PTPRF, AFAP, RAB3B, FZD7 Inhibarea diferenţierii în adipocite
şi/sau DKK3
după Song 2006
Marker-ii clasici de stemness (e.g. Oct-4, Nanog, Sox4 şi FGF4) nu au fost identificaţi
pentru MSC în acest studiu, mai mult, atenţia a fost centrată asupra genei IL1R2 implicată atât în
procesul de apoptoză (i.e. reducerea apoptozei prin blocarea kinazelor MAP2K3 şi p38 MAPK)
cât şi în cel de diferenţiere (i.e. prin scăderea expresiei IL-6). (Song 2006)
În alte studii, deşi s-a încercat identificarea nucleului de gene specifice stemness-ului, nu
au fost obţinute rezultate clare. Astfel, Fortunel a identificat în 3 studii diferite de microarray
pentru ESC o singură genă comună sugerând astfel că fiecare celulă foloseşte mecanisme
distincte pentru self-renewal şi pluripotenţă (Wong 2008b).
În afară de gene, în reglarea diferenţierii, transdiferenţierii şi a proprietăţii de self-
renewal intervin şi o serie de factori transcripţionali nucleari. Dintre aceştia, pentru MSC este
menţionată familia receptorilor nucleari, ce însumează 48 de membrii dintre care majoritatea
sunt receptori activaţi de liganzi. Până la acest moment există o identificare clară a rolului vis-a-
vis de MSC pentru 9 dintrei ei (Tab. 14.2). (Jeong 2009)
Utilizând analiza genetică „gene module map” Wong (2008a) a observat că stemness-ul
nu este reprezentat de un profil genetic comun, ci mai degrabă este specific fiecărei celule în
funcţie de condiţiile de mediu. Prin aceeaşi metodă s-a observat şi că anumite tipuri de cancere
(în special cele agresive) exprimă un pattern transcripţional similar ESC (Wong 2008a).
Studii recente au adus în atenţie o nouă categorie de elemente genetice implicate în
stemness, numite microRNA (miRNA). Acestea sunt fragmente RNA ce conţin cca 19-23
nucleotide, ce derivă dintr-un precursor cu 70 de nucleotide, a căror expresie se consideră a fi
codată de cateva mii de gene. Aceste fragmente intră în constituţia unor complexe (RNA-
induced silencing complex – RISC), având un rol important în mai multe procese celulare.
118
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 14] Stemness
Pentru MSC se consideră că sunt implicate în reglarea translaţiei şi stabilităţii mRNA, şi implicit
a multiplicării şi diferenţierii acestor celule. Câteva miRNA au fost elucidate, cunoscându-se
rolul lor: miR-140 (cartilaj), miR-143, 145, 103, 107 (adipogeneză), miR-638, 663 (condrocite),
miR-24, let-7a, let-7b, let-7c, miR-138, 320 (osteocite). Deşi studiile sunt în faza incipientă, se
apreciază că rezultatele obţinute vor constitui o unealtă consistentă în manipularea diferenţierii
MSC. (Lakshmipathy 2008)
În unele cazuri a fost observat că plasticitatea celulelor stem se exercită şi prin fuziunea
acestora cu celule adulte, nu numai prin diferenţierea lor propriu-zisă în baza unui program
genetic condus şi de către factorii de mediu, astfel încât se realizează o reprogramare nucleară
din care rezultă o celulă de novo cu un alt program genetic. Astfel acest mecanism poate duce la
salvarea unor celule adulte prin furnizarea unui material genetic “proaspăt”, o cale de regenerare
mult mai facilă pentru unele organe complexe precum ficatul sau creierul decât crearea de novo a
unei celule adulte dintr-o celulă stem. (Doyonnas 2004)
Cu toate acestea datele existente la acest moment despre genetica celulelor stem sunt
dificil de interpretat deoarece condiţiile de cultură şi factorii exogeni pot modifica rezultatele
astfel încât de cele mai multe ori acestea sunt specifice liniei celulare studiate.
În final, se poate concluziona că deşi factorii de mediu locali sunt critici pentru evoluţia
celulelor stem, aceştia se corelează cu statusul celular dictat genetic, astfel încât gama largă de
variabile implicate în stemness va necesita un aport ştiinţific de mare amploare pentru a fi
decodificată în viitor.
119
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 15] Etica şi standardele utilizării clinice a MSC
Tab. 15.1. Aspecte bioetice, legale şi religioase în transplantul celulelor stem adulte.
Xenotransplant Alo/autotransplant
Etic - este sau nu împotriva naturii -respectarea demnităţii umane
- este moral a sacrifica animale în scop biomedicale -respectarea autonomiei individuale
- libertatea alegerii -respectarea principiului egalităţii şi
- evaluare ştiinţifică premergătoare beneficiului
- raportul risc/beneficiu - evaluare ştiinţifică premergătoare
-raportul risc/beneficiu
-aportul financiar pentru donator
-vârsta donatorului
-screening-ul donatorului
120
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 15] Etica şi standardele utilizării clinice a MSC
121
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 15] Etica şi standardele utilizării clinice a MSC
Deşi până la acest moment nu au fost raportate reacţii adverse, mai ales după inocularea
IV a MSC, care să pună folosirea acestor celule sub semnul îndoielii trebuie acordată atenţie
sporită riscurilor şi efectelor adverse ce pot apărea ca urmare a variabilităţii metodelor de izolare,
expansionare şi transformare în ţesuturi in vitro. Aceasta obligă la standardizarea protocoalelor
de lucru cu MSC. (Giacomini 2007)
În concluzie, dezideratele etice ale utilizării MSC pentru terapiile celulare trebuie să
respecte următoarele puncte: (1) să ofere acces liber; (2) să aibă costuri rezonabile pentru sistem;
(3) să fie utilizate atent, parcimonios; (4) minimalizarea riscurilor donatorului; (5) minimalizarea
riscurilor imunologice; (6) minimalizarea riscului transmiterii unor boli de la donator la primitor.
Este necesară realizarea unor criterii de selecţie clare privind alegerea pacienţilor pentru
studiul experimental. În primele etape este util acest lucru ca urmare a necesităţii unui număr mic
de pacienţi pentru stabilirea siguranţei protocolului sau a insuficienţei resurselor terapeutice,
122
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 15] Etica şi standardele utilizării clinice a MSC
Întrucât domeniul terapiilor celulare, este atractiv atât din prisma intereselor financiare
cât şi non-financiare (orgoliu ştiinţific, dorinţa de confirmare şi promovare, publicitate, faimă)
este recomandată o urmărire atentă de către forurile instituţionale şi guvernamentale a celor ce
conduc Astfel, de studii.
Astfel, este esenţial ca responsabilii să îşi decline orice legătură de interes cu o terţă parte
implicată în procesul de studiu, finanţare, publicare, aprobare şi marketing. (Sugarman 2007)
15.8.1 Recoltarea
123
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 15] Etica şi standardele utilizării clinice a MSC
15.8.4 Standardizarea
124
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 15] Etica şi standardele utilizării clinice a MSC
125
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 15] Etica şi standardele utilizării clinice a MSC
îngrijirii lui
- în cazul unor subiecţi, pentru care terapia celulară are beneficii considerabile dar
statusul lor cognitiv este afectat se poate recurge la numirea legală a unor
reprezentanţi autorizaţi
- obţinerea permisiunii de autopsiere în caz de deces
după ISSCR 2008
În cazul utilizării transplantului MSC ca metodă de elecţie pentru anumite afecţiuni, este
necesară realizarea unui fond comun reprezentat de băncile de celule stem.
Acest aspect, trebuie să respecte accesul liber al indivizilor la terapiile celulare şi
aspectele imunologice, care pentru MSC sunt neglijabile.
Stocarea celulelor se poate face în sistem de bancă privată (utilizarea celulelor este
restricţionată pentru donator sau familia acestuia) sau bancă publică (destinată utilizării de către
publicul larg), necesară mai ales în momentul utilizării curente a celulelor în clinică. (Giacomini
2007)
Avantajul sistemului de banking este reprezentat de stocarea unui număr nelimitat de
celule cu un background genetic variat, şi poate scurta timpul de administrare a tratamentului,
renunţându-se la etapa de recoltare şi de expandare în vitro a celulelor autologe.
Pentru eficientizarea distribuţiei terapiilor celulare au fost realizate patru modele de
banking ţinând cont de gradul de implicare imunologică şi de disponibilitatea celulelor:
Modelul personalizat „as needed”: celulele stocate sunt ale pacientului, recoltate
imediat după debutul bolii; expandate „la nevoie” ca tratament al afecţiunii.
Modelul personalizat „as insurance”: celulele utilizate sunt ale potenţialului
pacient, recoltate în stare de sănătate înainte de debutul bolii; sunt stocate în bancă
în eventualitatea unei posibile afecţiuni.
Modelul „banked matched”: celulele sunt donate, şi sunt diferite genetic de ale
primitorului; sunt stocate şi utilizate după testarea compatibilităţii.
Modelul „banked universalized”: sunt stocate celule manipulate genetic a fi
compatibile cu întreaga populaţie deservită.
Dintre modelele prezentate, cel universalizat are cele mai mari şanse de reuşită, întrucât
prevede un raport ridicat eficienţă/cost. Costurile modelelor personalizate şi banked matched
sunt mai mari, fiind direct proporţionale cu mărimea populaţiei deservite. În plus, sistemul de
matching utilizat în prezent la transplantul de organe, nu este cel mai indicat pentru celule în
ideea în care acestea pot fi manipulate genetic şi „universalizate”. (Giacomini2007)
Cazul unui băiat israelian care a dezvoltat numeroase tumori benigne la nivelul creierului
şi măduvei spinării după un transplant de celule neurale fetale în Rusia, descris în amănunt în
numărul din 17 februarie 2009 al revistei PLoS Medicine, a scos la iveală o nouă problemă
legată de etica şi legislaţia utilizării celulelor stem, efectele dezastruoase ale turismului medical
şi lipsa cadrului legal internaţional şi naţional. (MacReady 2009)
Turismul medical în ţări precum Rusia, China, Germania, Republica Dominicană şi chiar
SUA, speculează disperarea pacienţilor şi a familiilor acestora, care de cele mai multe ori se
soldează cu rezultate medicale nefavorabile şi ruinarea financiară a aparţinătorilor.
Toate acestea se datorează lipsei unei legislaţii şi a unor foruri de control pe plan local şi
internaţional.
Cazul pacientului israelian a arătat că acesta a primit un cocktail de celule neurale fetale
cu provenienţă de la doi donatori de sexe diferite. Cercetările ulterioare au scos în evidenţă că
rezultatele clinicii erau modificate şi prezentate într-o lumină favorabilă de către medici, evaluate
126
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 15] Etica şi standardele utilizării clinice a MSC
subiectiv în lipsa unor controale, cu dorinţa disperată de a găsi ceva favorabil în fiecare caz
tratat. În plus, echipa internaţională de medici care au controlat clinica nu au găsit nici o
înregistrare scriptică amănunţită a tipului de celule utilizate şi a procedurilor la care pacienţii
erau supuşi, demonstrând că nu utilizau celule stem. (MacReady 2009)
De cele mai multe ori aceste clinici îşi racolează pacienţii utilizând internet-ul şi folosind
ca interfaţă pagini web sofisticate, care prezintă mărturii favorabile ale unor pacienţi, care de cele
mai multe ori nu au nimic de a face cu tratamentul aplicat, fără a comunica rezultate agreate şi
dovedite ştiinţific. (MacReady 2009)
Ceea ce frapează, este că în unele locuri aceste abuzuri se desfăşoară cu complicitatea
autorităţilor locale şi a guvernelor care finanţează astfel de activităţi. Legislaţia laxă şi dorinţa
guvernelor de a căpăta un renume în domeniul terapiilor celulare conduc la finanţarea unor
instituţii ce practică tratamente celulare fără nici un fundament ştiinţific. Un astfel de caz este cel
al unei clinici din Rusia (International Institute of Biological Medicine, Moscova), care servea şi
ca for regulator al terapiilor cu celule stem în această ţară, în care se încerca tratamentul
sindromului Down prin implantarea de ţesut fetal în cavitatea peritoneală. (MacReady 2009)
Un alt factor specific acestor ţări este reprezentat de lipsa siguranţei oferită de un
consimţământ informat întocmit riguros şi a forurilor etice afiliate instituţiilor în cauză, ceea ce
facilitează punerea în practică a unor terapii aberante.
Analiza a 7 cazuri ale unor pacienţi cu afectare medulară ce au beneficiat de injecţii cu
creier fetal, realizate de către Dr. Hongyun Huang la o clinică din Beijing, au evidenţiat un lung
şir de complicaţii post-inoculare la aceştia (meningită, alergie medicamentoasă, hemoragii
gastrointestinale, pneumonie) şi un singur beneficiu, o uşoară modificare a funcţiei senzitive şi
motorii la un singur pacient. Rezultatele favorabile raportate de acesta aveau la bază o analiză
subiectivă. (MacReady 2009)
Câştigul financiar apreciabil de pe urma fiecărui caz, contribuie la extinderea acestui
curent şi la menţinerea lui. Costurile pentru o astfel de intervenţie variază între 15000 şi 50000
de euro, un aspect demn de luat în considerare.
Toate aceste fapte duc la apariţia efectului de măr putred în comunitatea ştiinţifică bona
fides a ţărilor respective, făcând un mare defavor acesteia, dar şi domeniului terapiilor celulare la
nivel internaţional, argumentând necesitatea urgentă a unor normative etice şi legale aplicabile şi
sancţionabile la nivel global. (MacReady 2009)
Deşi acestea întârzie să apără, un prim pas a fost realizat de către ISSCR (International
Society for Stem Cell Research) care a emis în 2008 un set de reguli sub titlul „Guidelines for
the Clinical Translation of Stem Cells”, însă cu titlul de recomandare.
În final, este important a realiza diferenţa între terapiile comerciale nedovedite cu celule
stem şi încercările legitime de inovare medicală în afara contextului unui trial; aceasta se bazează
pe scopul experimentului, şi anume testarea siguranţei metodei, şi a beneficiilor rezultate,
îndreptate preponderent în interesul pacientului fără a fi însoţite de beneficii materiale pentru
conducătorul studiului.
127
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 16] Viitorul celulelor stem în clinică
128
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 16] Viitorul celulelor stem în clinică
semnalizare ale nişei stem va face posibilă modularea farmacologică a acestor celule. În aceste
sens, câteva rezultate experimentale par a susţine această ipoteză. Astfel, stimularea receptorului
pentru PTH al osteoblastelor medulare duce la creşterea numărului de HSC (Adams 2007, Calvi
2003); prostaglandina E2 poate creşte numărul HSC murine, îmbunătăţind rezultatul
transplantării (North 2007) iar factorii circulanţi ai unui organism murin tânăr pot modifica
fenotipul celulelor stem musculare ale unui organism în vârstă, conferindu-le un fenotip juvenil
(Conboy 2005) – având ca mecanism de acţiune calea de semnalizare Wnt ai cărei factori
exprimaţi la un nivel înalt favorizează un status pro-fibrotic în organismele bătrâne (Brack
2007).
Deoarece terapiile celulare, ca şi transplantul de organe, pot întâlni bariere imunologice –
aspect nesemnificativ pentru MSC- coroborat cu necesitatea unor terapii adaptate specific
fiecărui individ, se tentează utilizarea unor tehnici (e.g. SCNT şi reprogramare celulară) ce au ca
scop obţinerea unor celule isogene (i.e. echivalente genetic cu ale pacientului).
O alternativă imunoprotectoare este reprezentată de utilizarea celulelor stem încapsulate.
Deşi la acest moment suscită un interes activ, practic, realizarea microîncapsulării întâmpină
probleme tehnice reprezentate de difuzia necontrolată a nutrienţilor şi semnalelor celulare,
soldate cu alterarea funcţionării celulei, dar care promit a fi remediate pe viitor. (Daley 2008)
Reprogramarea celulară vine ca o soluţie pentru pacienţii cu un fond limitat de celule
stem (datorită afecţiunii de bază) cât şi pentru înlăturarea aspectelor negative legate de SCNT
(e.g. probleme etice, necesitatea unor ovule donate). Se bazează pe transducţia virală a unor
celule somatice adulte/diferenţiate cu genele c-Myc, Klf4, Oct4 şi Sox2, care transformă celula
respectivă într-o celula pluripotentă, numită IPS (induced pluripotent stem cell), similară ESC.
Deşi la acest moment unele gene, c-Myc şi Klf4, sunt asociate cu oncogeneza, potenţialul acestor
celule este tentant, mai ales în perspectiva în care se doreşte transformarea unei celule mature
într-o celulă matură de alt tip fără a fi necesară transformarea ei într-o stare pluripotentă.
Reprogramarea celulară şi IPS par a fi utile în afecţiunile genetice. Hanna (2007) a
raportat transplantarea HSC derivate din IPS obţinute din celulele tegumentare ale unui şoarece
cu anemie falciformă, care s-a soldat cu repararea defectului genetic ca urmare a capacităţii de
multiplicare permanentă a celulelor transplantate.
Arbab (2009) consideră că terapiile celulare vor fi utilizate clinic în două direcţii: (1)
regenerarea şi reconstrucţia ţesuturilor cu celule modificate genetic sau nu, şi (2) împotriva
cancerelor, utilizând celule transgenice ce poartă gene suicidare sau capabile a exprima citokine
citotoxice. În sprijinul celei de a doua variante vin numeroase studii experimentale ce atestă
beneficiul unor astfel de celule, inclusiv MSC, pentru tratarea glioamelor. (Arbab 2009) În
opoziţie cu acestea, Jones (2008) consideră că utilizarea unor MSC cultivate o perioadă lungă nu
ar trebui aplicată în sfera oncologică.
MSC utilizate singure sau în conjuncţie cu ingineria genetică şi tisulară (implicând factori
de creştere şi matrice suport) vor juca un rol important în medicina regenerativă, aducând mai
aproape visul de a obţine ţesuturi şi organe „off-the-shelf”. În aceste sens, principalul obstacol
este reprezentat de reproducerea unei arhitecturi fiziologice şi funcţionale a ţesutului sau
organului. Până atunci, un pas intermediar poate fi realizat prin utilizarea celulelor diferenţiate
din MSC, sub forma încapsulată a unor bioreactoare pentru susţinerea funcţiei unor organe
insuficiente (i.e rinichi/ficat artificial). (Daley 2008)
Tehnologia de realizare a ansamblurilor celule stem-matrice suport evoluează permanent,
astfel încât dezavantaje precum reacţia inflamatorie şi formarea ţesutului fibros ca urmare a
utilizării de matrice suport biodegradabile vor putea fi îndepărtate definitiv prin utilizarea
tehnologiei „cell sheet” ce realizează fixarea celulelor din cultură sub forma unei pelicule ce
poate fi asamblată în produşi 3D. (Daley 2008)
Poate mai mult decât utilizarea celulelor stem exogene pentru tratamentul anumitor boli,
viitorul poate aduce răspunsuri legate de manipularea intrinsecă a celulelor stem umane, in situ,
pentru regenerarea şi reconstrucţia unor organe, având ca model de studiu animale precum
salamandrele – capabile de a regenera organe precum retina, inima sau măduva spinării. (Daley
2008) La acest moment se cunoaşte că regenerarea ţesuturilor acestor animale se realizează prin
129
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
[CAPITOLUL 16] Viitorul celulelor stem în clinică
dediferenţierea celulelor somatice restante şi mai puţin prin recrutarea unor noi celule, astfel
încât descoperirea genelor şi mecanismelor ce conduc acest proces va constitui o realizare
epocală cu un imens potenţial clinic. Un prim pas în această direcţie a fost realizat prin utilizarea
BMP 2 şi 7 împreună cu rPTH pentru tratamentul osteoporozei, presupunându-se că
administrarea lor sistemică acţionează pe MSC in situ (Jones 2008). Importanţa stimulării PTH a
MSC este susţinută şi de hipercalcemia observată la persoanele imobilizate, ce inhibă eliberarea
de PTH (Massagli 2008) având consecinţă scăderea numărului de MSC la nivel medular, tradusă
prin iniţierea greoaie a unor culturi MSC de la aceşti pacienţi.
Tehnicile de inginerie tisulară şi inginerie genică se află la început; cu toate acestea,
câteva domenii par a beneficia în curând de aplicaţii clinice ale studiilor experimentale bazate pe
MSC. Astfel, cel mai probabil, domeniul regenerării ţesutului osos (cel mai avansat, cu referire
la utilizarea MSC) va utiliza aplicaţii clinice standardizate.
Deşi alte domenii, precum refacerea cartilajului, aplicaţiile neurologice şi terapia genică,
fie întâmpină dificultăţi sau se găsesc într-un stadiu incipient de dezvoltare, se preconizează că în
următorii 10 ani se vor face progrese importante din punct de vedere clinic (Dennis 2004)
Utilizarea celulelor stem nu este lipsită de riscuri, însă tehnologiile viitoare vor contribui
la diminuarea şi controlul acestora. Astfel, efecte precum osificarea sau formarea de ţesuturi
ectopice după administrarea de celule stem pot fi controlate prin utilizarea unor celule stem
modificate a fi sensibile la un anumit agent terapeutic.
Potenţialul celulelor stem este foarte variat, contribuind la dezvoltarea unei ştiinţe în sine
dar şi a altora deja existente. Chiar dacă rezultatele obţinute nu vor fi cele scontate, ceea ce este
foarte greu de realizat, impactul avut de aceste celule asupra ştiinţei şi medicinei regenerative
rămâne de necontestat.
130
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
CONCLUZII
Concluzii
1. Deşi originea celulelor stem, în general, este controversată, existenţa acestora este certă,
iar potenţialul clinic nu poate fi negat.
2. Existenţa MSC a fost prefigurată încă din 1869 de către Goujon. Ulterior, cele mai
semnificative rezultate au fost cele obţinute de Friedenstein (anii “70), Castro-Malaspina
(anii „80), Caplan şi Pittenger (anii “90).
3. MSC reprezintă o categorie a celulelor stem, izolate iniţial din MO şi ulterior din alte
ţesuturi, ce cuprinde o categorie vastă de celule cu fenotip multiplu, ale cărei criterii de
definire şi caracterizare nu sunt pe deplin definitivate.
4. Lipsa criteriilor de definire a MSC, stă la baza multor discuţii ce vizează identitatea MSC.
5. Variabilitatea acestor criterii stau la baza existenţei unor denumiri variate ce au ca element
comun celule aderente ce formează CFU-F.
6. Testul standard propus de ISCT pentru definirea MSC cuprinde: celule aderente, ce
formează CFU-F, cu potenţial de diferenţiere osteo, condro şi adipogenică, pozitive
CD105, CD73, CD90 şi negative CD45, CD34, CD14/11b, CD79a/CD19 şi HLA-DR.
7. Deşi MO, este rezervorul clasic al MSC, acestea pot fi izolate din numeroase locuri:
muşchi, piele, ţesut adipos, periost şi ţesut patologic articular specific artritei reumatoide,
sânge din cordonul ombilical, placentă, lichid amniotic, sânge periferic, ficat fetal, plămân
fetal, os trabecular şi ţesutul dentar decidual.
9. Deşi exprimă pe suprafaţa lor o mare varietate de molecule ce pot servi la izolarea lor, nu
a fost identificat încă un marker specific MSC, astfel încât izolarea acestora se bazează pe
un panel cu marker-i multipli.
10. Cu toate că originea lor nu este clară, cele mai multe teorii orientează asupra legăturii
MSC cu pericitele.
11. Se consideră că rolul in vivo al MSC constă în realizarea reţelei stromale structurale şi
funcţionale de susţinere a hematopoiezei, în reparare şi tournover la nivel osos,
progenitoare ale ţesutului cartilaginos, suport vascular, progenitoare ale adipocitelor şi
implicare în repararea tisulară post-lezională.
12. Implicarea MSC în toate aceste procese se face fie direct, fie prin elaborarea unei largi
palete de citokine şi molecule semnal ce acţionează asupra celulelor mature.
13. MSC sunt o categorie de celule interactive apte a realiza numeroase conexiuni moleculare
cu celulele vecine prin intermediul numeroaselor substanţe elaborate şi al prezenţei unui
mare număr de receptori pe suprafaţa lor.
131
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA GENERALĂ
CONCLUZII
15. MSC sunt capabile de homing, proces controlat la multiple nivele de către celule în sine,
nişa stem şi/sau chemokinele prezente în mediu.
16. MSC manifestă un homing preferenţial pentru ţesuturile inflamate de diferite afecţiuni
(imunologice, ischemice etc.).
17. Cu toate că nu este încă complet elucidat, rolul MSC în cadrul procesului de îmbătrânire şi
efectele acestuia asupra lor constituie un element ce le condiţionează comportamentul.
18. Dintre toate tipurile de celule stem, MSC reprezintă categoria cu raportul beneficiu/risc
cel mai bun.
19. Potenţialul clinic al MSC este bogat, putând servi ca terapie celulară în domenii ca:
reconstrucţia osoasă, a tendoanelor şi cartilajelor, în hematologie, neurologie, cardiologie,
nefrologie, hepatologie, oncologie şi diabet, pretându-se inclusiv la manipulare genică.
21. Până la acest moment nu au fost evidenţiate reacţii adverse majore sau tumorale asociate
uzului MSC la om.
22. Deşi nu s-a evidenţiat producerea de tumori la om, MSC pot accelera posttransplant
evoluţia unor tumori maligne preexistente.
132
Partea specială
Studiul Experimental
133
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Introducere
INTRODUCERE
Conform definiţiei date de National Institute of Health (U.S.A.) ingineria tisulară
reprezintă un domeniu multidisciplinar cu dezvoltare rapidă ce reuneşte domenii ştiinţifice axate
pe studiul biologiei celulare, moleculare şi ingineriei biomedicale, cu scopul de a dezvolta celule,
ţesuturi şi organe sau substitute ale acestora destinate reparării, înlocuirii sau îmbunătăţirii
structurii şi funcţiei biologice afectate ca urmare a unor defecte congenitale, a rănirii, a bolii sau
a senescenţei.
Ingineria tisulară a tubului digestiv (IT-TD), în special ramura axată pe reconstrucţia
intestinului subţire, îşi datorează începuturile muncii de pionierat desfăşurată de JP Vacanti şi
colegii acestuia la Boston, USA, începând cu anul 1988, când aceştia au realizat primele
tentative de cultivare a enterocitelor pe matrice polimerice biodegradabile. (Markel 2008)
În domeniul reconstrucţiei tubului digestiv, celule stem în general şi MSC în particular
constituie o apariţie exotică venită să realizeze un pas înainte pentru a duce la un nivel superior
utilizarea biomaterialelor acelulare ce au reprezentat unealta de bază o bună perioadă de timp.
Domeniul IT-TD este complex şi nu poate funcţiona fără a reunii ramuri ale cercetării
biomedicale care vizează îmbunătăţirea şi evoluţia constantă a celor trei elemente esenţiale
realizării unui produs de IT: celulele utilizate, biomaterialul (matricea) suport şi bio-moleculele
ce intermediază legătura celulă-biomaterial şi celulă-biomaterial-tesut gazda. (Markel 2008)
Sursa de celule destinate reconstrucţiei digestive, cel puţin teoretic, este variată – putând
apela la enterocite, celule stem embrionare, celule stem mezenchimale, celule stem ombilicale şi
celule stem gastrointestinale. Cu toate acestea, fiecare tip de celule are insuficiente specifice,
astfel încât identificarea celulei stem ideale pentru IT-TD întârzie să apară cu toate că MSC şi
celule stem intestinale promit cele mai bune rezultate.
Celule stem intestinale sunt localizate la nivelul criptelor intestinale şi posedă capacitatea
de a se diferenţia în toate celulele ce intră în componenţa vililor intestinali. Au fost descrise două
localizări ale acestora la nivelul criptei: imediat deasupra celulelor Paneth, pe o distanţă de 4
celule fiind numite +4LRC (+4 label-retaining cells) (Potten 2002) şi la baza criptei, dispersate
printre celulele Paneth şi fiind numite CBC (cript-based columnar cells) şi având potenţialul de a
se diferenţia în toate celulele intestinului (Scoville 2008).
Recent, au fost identificaţi şi marker-i specifici pentru celule stem intestinale: Musashi 1,
Lgr5 (leucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled receptor 5) şi DCAMKL-1 (double
cortin and CaM kinase-like-1), a căror utilizare combinată contribuie la izolarea unor populaţii
celulare pure. (Markel 2008)
Utilizarea celulelor stem intestinale se realizează sub forma „organoizilor” (eng.
organoids) – unităţi multicelulare ce reprezintă structura 3D a vilozităţilor intestinale, derivate
din intestinul neonatal şi care conţin un miez mezenchimal acoperit de epiteliu intestinal
polarizat, furnizând rezultate dintre cele mai bune. Organoizii au fost izolaţi pentru prima dată de
către Weiser în 1973, şi conţin toate celule ce se găsesc pe secţiunea totală a tubului digestiv.
(Markel 2008)
Vacanti a transplantat aceşti organoizi la şobolan, obţinând structuri chistice de neo-
intestin în timp ce alte echipe au arătat ca celule stem intestinale transplantate pe matrice suport
formează neo-intestin ce îşi poate menţine proprietăţile similare celui nativ până la trei luni
posttransplant. Mai mult, s-a observat că utilizarea organoizilor din zona de absorbţie maximă
realizează segmente de neo-intestin cu funcţie absorbtivă. În plus, organoizii fixaţi pe matrice
suport repopulează intestinul şi stimulează proliferarea vasculară şi limfatică. (Markel 2008)
Datorită capacităţii de diferenţiere şi cultivare relativ uşoară, combinate cu aspectele
imunologice şi etice favorabile, utilizarea celulelor stem mezenchimale, în domeniul ingineriei
tisulare cu viză reconstructivă, constituie un atuu şi un arsenal terapeutic ce nu poate fi neglijat.
Fiind capabile a se diferenţia într-o gamă largă de celule mezenchimale, MSC atrag
atenţia asupra utilizării lor în sfera reconstrucţiei tubului digestiv. Pe lângă aceasta, MSC pot
realiza o contribuţie importantă la regenerare şi prin producerea de factori umorali, implicaţi în
134
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Introducere
135
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Ipoteză/Scop şi obiective
IPOTEZĂ
Având proliferare extensivă, clonalitate multiliniară şi potenţial de diferenţiere in vitro şi
in vivo pentru a forma celule specifice celor trei straturi germinative (Abdallah 2008) celulele
stem mezenchimale îndeplinesc un rol important în repararea ţesuturilor post-natale, posibilităţile
terapeutice ale acestora fiind teoretic nelimitate; datorită potenţialului de diferenţiere
mezenchimală cumulat cu expresia unei palete variate de factori umorali, s-a presupus că MSC
pot contribui la regenerarea şi reconstrucţia tubului digestiv.
Având în vedere acestea, s-a considerat că peretele digestiv poate fi regenerat cu succes
dacă i se asigură un suport material de susţinere (i.e. scaffold) populat cu celule capabile a se
diferenţia multiliniar (i.e. MSC).
Pe baza acestei ipoteze s-a apreciat că un defect de tipul celui întâlnit în cazul fistulelor
digestive poate fi acoperit cu un patch care să stimuleze reconstrucţia, dacă acesta are o
durabilitate suficientă pentru a permite regenerarea straturilor digestive.
136
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Materiale şi metode
MATERIALE ŞI METODE
Pentru dezvoltarea unei metode inovative menite a regenera peretele digestiv folosind
MSC a fost necesară realizarea unui design adecvat care să permită supravieţuirea şi
diferenţierea CSM, testare şi analiza acestuia pe un model experimental animal.
Realizarea structurii patch-ului celular 3D a avut în vedere constituirea unui produs
rezistent, biotolerabil, uşor de realizat, care să prezinte o funcţie suport a celulelor ce facilitează
fixarea acestora la patch.
Majoritatea matricei extracelulare, la mamifere, este compusă din colagen, acesta fiind
specific şi diferit de la tendoane la cornee. Aşadar, diferite tipuri de colagen oferă proprietăţi
biologice variate diferitelor tipuri de ţesuturi (Badylak, 2007). Astfel, s-a decis ca acesta să fie
baza scaffold-ului ce susţine celulele.
Colagenul are avantajul de a fi larg răspândit în organism, cu numeroase funcţii
fiziologice, fiind, în plus, şi biotolerabil. Pentru construirea patch-ului, colagenul a fost utilizat
sub două forme: un strat de colagen sintetizat în laborator sub forma unui burete cu o grosime de
3-5 mm şi perete vascular arterial full-thickness. Buretele de colagen are rolul de suport al
celulelor, permiţând localizarea şi proliferarea acestora în porii lui, în timp ce peretele arterial
conferă rezistenţă şi impermeabilitate patch-ului. Astfel, colagenul contribuie la crearea unei
matrice extracelulare ce asigură proprietăţiile mecanice şi biochimice optime celulelor stem
mezenchimale.
În plus, avantajele majore ale bureţilor de colagen includ: capacitatea crescută de a
absorbi exudatul rănilor, aderenţa bună la rănile umede, păstrând microclimatul umed, dar
protejându-l de infecţiile bacteriene. Pe lângă aceste avantaje fizice, colagenul promovează
creşterea şi mobilitatea celulară, astfel ajută la formarea de ţesut nou la locul aplicării.
După inocularea celulelor stem mezenchimale, patch-ul a fost transplantat la şobolani
Wistar în poziţie gastrică sau intestinală pentru a substitui un defect cu diametrul de cca 0.5-0.7
cm.
Pentru evaluarea patch-ului, s-a constituit un lot control de animale, care au fost supuse
aceluiaşi protocol anestezic şi chirurgical, dar al căror defect digestiv a fost acoperit cu un patch
lipsit de MSC (constituit doar din fragmentul arterial şi buretele colagenic).
Etapele tehnologice
pentru obţinerea matricei
suport.
137
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Materiale şi metode
Colagenul utilizat a fost extras din tendon bovin, utilizat proaspăt sau după congelare,
obţinut de la animale sacrificate în abatoare.
Principalele faze ale procesului de extracţie a proteinei colagenice din ţesut constau în
tratamente preliminare, extracţia propriu-zisă şi purificarea selectivă.
Tratamentele preliminare constau în spălarea ţesutului cu apă potabilă, pentru
îndepărtarea impurităţilor şi a urmelor de sânge, precum şi mărunţirea mecanică a ţesutului
spălat în bucăţi de 3-5mm, pentru a mări suprafaţa de contact cu reactivii.
Pentru extracţie s-a utilizat procedeul enzimatic cu pepsină în acid acetic. Ţesutul
mărunţit s-a incubat cu pepsină dizolvată în acid acetic 0,5M, pH 3, în raport ţesut:enzimă de
10:1, la 4oC timp de 48 de ore. Soluţia de colagen extras s-a recuperat prin centrifugare la 10.000
rpm, la 4oC, timp de 30 de minute şi s-a dializat faţă de acidul acetic 0,5M timp de 48 de ore.
Purificarea soluţiei de colagen obţinute s-a realizat prin precipitare cu NaCl 0.7M,
cristalizată şi mojarată în prealabil, sub agitare continuă, la temperatura camerei. După
centrifugarea precipitatului format, acesta s-a dizolvat în soluţie acidă şi s-a dializat faţă de apa
distilată în vederea eliminării NaCl existente în proba de colagen.
Agaroza (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) utilizată la fabricarea
matricei 3D se caracterizează printr-o temperatură de gelificare scăzută (390C), conţinut în sulfat
0,7 %, conţinut în cenuşă 0,15 % şi conţinut în apă 8 %.
Soluţia de colagen obţinută în urma dializei se prezintă sub formă de gel care conţine cca
1-1,5% substanţă uscată. Gelul de colagen se diluează la 0,1-0,5% substanţă uscată, se combină
în raport de 1:0.5 cu agaroză şi se liofilizează la un liofilizator Christ Gamma 1-16 LSC.
Congelarea produsului s-a făcut la -40 0C şi presiunea de 0,120 mbar, iar faza finală a uscării
prevede o încălzire a produsului la maxim 30 0C (temperatura de cca 37 0C produce denaturarea
colagenului). Produsul rezultat se prezintă sub forma de burete, având dimensiunea porilor între
10-200 µm (Fig. 1, Fig. 2).
138
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Materiale şi metode
Determinarea greutăţii moleculare medii (M) a probelor de colagen s-a realizat prin
metoda vâscozimetrică ce are la bază relaţia de proporţionalitate directă a M cu vâscozitatea
intrinsecă ([η]) (relaţia Mark-Houwink):
[η] = KMα,
139
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Materiale şi metode
Ηrel = tproba/tsolvent
Ηsp = ηrel-1
Se trasează graficul ηsp/c=f (c) şi se determină vâscozitatea intrinsecă ca fiind [η] = limc→0
ηsp/c.
Densitatea (d) şi porozitatea (ε) bureţilor a fost măsurată prin metoda înlocuirii
volumului cu apă (Zhang 2003). Pe scurt, o probă de greutate cunoscută (g1) este imersată într-
un recipient cu un volum cunoscut de apă, v1. Apoi, volumul total de apă conţinând buretele
impregnat cu apă (v2) şi volumul rezidual de apă după ce buretele impregnat cu apă a fost
îndepărtat (v3) au fost înregistrate. Pentru calcul au fost utilizate următoarele ecuaţii:
D = g1/ (v2-v3)
Ε = (v1-v3) / (v2-v3)x100 %
Gradul de hidratare al bureţilor a fost calculat pentru probe (5 mg) incubate în tampon
fosfat, pH 7.4 (3 ml), la 200C, pentru 24 h, utilizând ecuaţia:
140
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Materiale şi metode
1,2x105 celule/ml. Plăcile au fost menţinute în incubator, în atmosferă cu CO2 5%, la 37 0C, timp
de 48 h şi, respectiv, 72 ore. (Moldovan 2007)
Metoda MTT, o metodă spectrofotometrică, se bazează pe conversia bromurii de
dimetiltiazol-2-il difeniltetrazoliu (MTT) la cristale insolubile albastre de formazan sub acţiunea
dehidrogenazelor mitocondriene din celulele vii (Mossman, 1983). În cadrul experimentului,
după 48 h şi respectiv 72 h de cultivare în prezenţa matricelor poroase, celulele au fost spălate şi
50 µl de soluţie MTT dizolvat în mediul de cultură au fost adăugaţi în fiecare godeu. Incubarea
plăcii s-a realizat la 37 oC, timp de 3h, iar apoi a fost adăugat câte 1 ml izopropanol/godeu pentru
solubilizarea cristalelor de formazan. Absorbanţa a fost măsurată la 570 nm cu un spectrometru
Jasco V-650 (Japonia). Numărul de celule viabile a fost calculat prin raportare la martor (celule
cultivate în absenţa probei) considerate ca având o viabilitate de 100 %.
Pentru analiza morfologiei celulare, fibroblastele cultivate în prezenţa variantelor de
matrice poroase, timp de 72 ore au fost colorate cu hematoxilină-eosina, fiind studiate prin
microscopie optică cu un microscop Zeiss AxioStar Plus echipat cu o cameră color digitală şi
soft Zeiss AxioVision 4.6.
Vasele arteriale
141
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Materiale şi metode
Celulele stem mezenchimale umane au fost obţinute aseptic, sub anestezie locală cu
lidocaina 1%, din măduva hematopoietică extrasă prin puncţie medulară de la nivelul spinei
iliace postero-superioare (Fig. 4), utilizând un sistem de puncţie osoasă Biomedical SRL (Italia)
(Fig. 5).
În vederea recoltării, voluntarii au consimţit informat pentru procedură şi au fost supuşi
unui screening pentru identificarea infecţiilor sau a patologiilor maligne. Nu au fost identificate
complicaţii legate de procedura de recoltare.
Aspiratul medular recoltat (cca 30 ml/donator), identificat prin prezenţa grunjilor
medulari, a fost stocat pe durata transportului în eprubete Vacutainer cu EDTA-K3, la 37oC,
fiind prelucrat în cel mult 60 minute de la recoltare.
142
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Materiale şi metode
Fig. 5. Sistemul de
puncţie medulară
Biomedical SRL (Italia)
BIL1817/80, 18G. F1
143
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Materiale şi metode
Probele de măduvă osoasă au fost testate pentru următorii agenţi infecţioşi: HBV, HVC,
HTLV-1/2, HIV 1/2, CMV, Treponema, Toxoplasma.
Pentru izolarea MSC s-a aplicat protocolul de selecţie negativă RosseteSep (Fig. 6) care
permite obţinerea unor preparate de MSC mai omogene. Măduva recoltată a fost incubată cu un
cocktail de anticorpi (RosseteSep, StemCell Technologies, Inc., Vancouver, Canada), 50 de µl
pentru fiecare 1 ml de măduvă. Kit-ul implică rozetarea cu ajutorul hematiilor. RossetSep
conţine un amestec de reactivi care formează complexe tetramerice de anticorpi care fixează
celulele nedorite de hematii prin rozetare. Aceste complexe sunt formate din două molecule de
anticorp monoclonal murin tip IgG legate în tetramer prin două molecule de anticorp anti-murin.
Complexele sunt bispecifice. Unul dintre anticorpii murini recunoaşte un antigen de la suprafaţa
celulelor hematopoietice normale, al doilea recunoaşte glicoforina A de pe suprafaţa hematiilor.
Alte complexe din amestec sunt monospecifice pentru glicoforina A. Celulele hematopoietice
nedorite (faţă de care există în amestec anticorpi monoclonali anti-CD specific), sunt legate de
hematii formând rozete. Atunci când sunt centrifugate în prezenţa unui mediu cu gradient de
densitate (Ficoll), celulele rozetate sedimentează împreună cu hematiile libere. Celulele dorite,
nerozetate sunt ulterior uşor de separat de la interfaţa Ficoll:plasmă.
Avantajele acestei tehnici sunt: (a) posibilitatea de a izola celulele dorite direct din sângele
total sau aspirat medular într-o singură etapă; (b) rapiditatea – metoda durează doar cu 20 minute
mai mult decât o separare standard cu Ficoll (timpul necesar incubării probei cu anticorpii); (c)
are la bază selecţia negativă, drept urmare celulele dorite nu sunt legate cu anticorpi, putând fi
imediat utilizate; (d) este economică, nu necesită echipament special. Dezavantajul metodei
constă în puritatea populaţiei obţinute, aceasta fiind de numai 70-75%.
Amestecul a fost incubat 20 de minute la temperatura camerei, diluat ulterior cu un volum
dublu de tampon fosfat salin care conţine 2% ser fetal bovin şi 1mM EDTA. Proba diluată este
supusă ulterior metodei de separare în gradient de densitate cu Ficoll-Paque (1,007 g/ml) şi
centrifugată la 300 g timp de 25 de minute. Inelul de celule prezent la interfaţa cu mediul de
separare a fost colectat, iar celulele spălate iniţial cu mediu simplu şi ulterior resuspendate în
Dulbecco’s MEM cu 10% ser fetal (Sigma), 200 UI/ml penicilină, 200 µg/ml streptomicină,
suplimentat cu bFGF 10ng/ml (Gibco), EGF 10 ng/ml (Sigma).
Numărul total de celule a fost evaluat în urma colorării 1:1 cu albastru Tripan 0.4%, pentru
a aprecia totodată şi viabilitatea celulelor în urma procedurii de separare. În general aceasta nu a
fost mai mică de 95%.
144
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Materiale şi metode
145
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Materiale şi metode
Oaselor recoltate li s-au îndepartat epifizele, iar cavitatea medulară a fost spălată prin
injectare sub presiune cu 10 ml tampon fosfat salin cu heparină (10 UI/ml) (Fig. 9, Fig. 10).
După recoltare, hematiile au fost lizate cu o soluţie de NH4Cl/NaHCO3/EDTA.
Pentru culturile primare, celulele au fost resuspendate în Dulbecco’s MEM cu 10% ser fetal
(Sigma), 200 UI/ml penicilină, 200 µg/ml streptomicină, plasate în plăcuţe de 75 cm2 la
densitatea de 2x106 celule/ml şi incubate la 37°C în atmosferă cu 5% CO2.
Mediul de cultură s-a schimbat la 48 ore iniţial, ulterior la 3-4 zile. Când cultura primară a
ajuns aproape de confluenţă (90%), în aproximativ 2 săptămâni, celulele au fost recuperate prin
digestie cu o soluţie de 0.25% tripsină în 1 mM EDTA şi cultivate din nou la o densitate de
5.000-10.000 celule pe cm2.
146
STUDIUL EXPERIMENTAL
Fig. 10. Manopera extracţiei şi izolării MSC din oasele lungi de şoarece (procedeu identic cu cel pentru oasele de şobolan). F4
A, B. Îndepărtarea ţesutului muscular prin răzuire. C. Aspectul oaselor după îndepărtarea stratului muscular. D. Îndepărtarea epifizelor. E. Spălarea sub jet a
cavităţii medulare cu o soluţie tampon fosfat salin cu heparină 10 UI/ml. F, G, H. Centrifugarea, spălarea şi resuspendarea MSC în mediul de cultură.
Materiale şi metode
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
147
I, J. Aspectul culturii primare, plasate în incubator.
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Materiale şi metode
S-au făcut diverse încercări, privind compoziţia mediului de cultură, pentru a genera o
populaţie mai omogenă de MSC. Astfel, culturile au fost suplimentate cu diverşi factori de
creştere adăugaţi separat sau în combinaţie precum: bFGF (basic fibroblast growth factor), EGF
(epidermal growth factor), Tpo, Flt-3, IL-3, SCF (stem cell factor). S-a demonstrat astfel că o
combinaţie între bFGF şi EGF susţine menţinerea capacităţii de diferenţiere multiplă a MSC
împiedicând diferenţierea spre liniile celulare hematopoietice, spre osteoblaste sau adipocite.
Se remarcă în primele zile aspectul polimorf al culturilor iniţiate (Fig. 11), precum şi
formarea unor focare de hematopoieză, chiar şi în absenţa citokinelor exogene, cu aspectul unor
insule de celule sferice, care se maturează şi se desprind de substrat (Fig. 12). Acest lucru se
datorează probabil citokinelor hematopoietice adăugate exogen.
148
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Materiale şi metode
Fig. 13. Cultura primară din măduva osoasă de şobolan - pasaje succesive. F4
Se remarcă uniformizarea treptată a morfologiei celulare care devine fibroblastoidă. A. Pasajul 0;
zece zile de cultură; mărire X20. B. Pasajul 1; 14 zile de cultură; mărire X20. C. Pasajul 2; 21 zile de
cultură; mărire X20. D. Pasajul 2; 30 zile de cultură; mărire X40.
149
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Materiale şi metode
150
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Materiale şi metode
formaldehidă 10% pentru 30 minute, spălată cu apă distilată şi incubată cu albastru Sudan o oră
la temperatura camerei. Mecanismul colorării lipidelor este datorat proprietăţilor fizice ale
colorantului care este mult mai solubil în lipide decât în lichide. De aceea coloranţii din grupul
poliazo (seria oil red, seria roşu Sudan şi albastru sudan) pot fi substituiţi în metodă. Pentru
inducerea adipogenezei (controlul coloraţie), MSC au fost însămânţate la o concentraţie de 104
MSC/ml şi menţinute în prezenţa a 0.1 µM dexametazonă, 50 µM indometacin şi 5 µg/ml
insulină. Mediul a fost schimbat de 3 ori pe săptămână. La pasaje mari, s-au observat rare celule
diferenţiate.
151
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Materiale şi metode
Asamblarea patch-ului
Pentru constituirea grefonului s-au utilizat culturi de MSC la pasaj mic pentru a beneficia
de avantajele statusului de celulă nediferenţiată capabilă de a desfăşura diviziuni de self-renewal
şi pentru a evita apariţia modificărilor cromozomiale întâlnite uneori la pasajele mari, precum şi
iniţierea diferenţierii spontane a acestor tipuri de culturi cu formarea de osteoblaşti sau adipocite.
Dat fiind potenţialul imunogen înalt al celulelor endoteliale din structura vaselor (Teebken
2000), a fost necesară o etapă de îndepărtare a acestor celule realizată prin tratarea fragmentelor
cu o soluţie de tripsină 0,1%, 20 minute la 370C cu agitare continuă, care însă nu distruge
arhitectura matricei extracelulare formată din proteine structurale, proteoglicani, colagen şi fibre
de elastină (Teebken 2000) (Fig. 16).
5x104 celule au fost însămânţate într-o matrice 3D de COL-AG cu un diametru de 5-7 mm,
aşezată pe un fragment arterial corespunzător, decelularizat (Fig. 17, Fig. 18). După preparare,
patch-urile au fost menţinute în mediul de cultură celular, timp de câteva ore, pentru a permite
dispersia MSC în întreaga structură.
Pentru testarea biodegradabilităţii, patch-urile 3D au fost supuse digestiei in vitro cu
colagenază I 0.05%, arătând o degradare completă după 30 de minute.
Înainte de transplant, patch-urile au fost testate bacteriologic prin metoda MCPC
(Microbial Community Profiling and Characterization). Tehnica MCPC se bazează pe un
procedeu cunoscut din biologia moleculară, “Restricţia terminală a polimorfismului lungimii
fragmentului”, oferind un instantaneu asupra comunităţilor microbiene prezente într-o probă,
printr-o singură determinare.
fragment arteră
decelularizare
injectare MSC
152
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Materiale şi metode
Fig. 18. Aspectul patch-ului, format din matricea de COL-AG însămânţată cu MSC,
montată pe fragmentul arterial. F3, F4
A. Aspect macroscopic. B. Aspect microscopic; HE, X40: * - matricea colagenică, # - fragmentul
arterial.
Animalele
Anestezia
153
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Materiale şi metode
Pregătirea preoperatorie
Protocolul chirurgical
154
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Materiale şi metode
Postoperator şobolanii şi-au revenit după cca 3-4 ore, şi au fost găzduiţi în cuşti
individuale şi le-a fost permis numai consumul de apă ad libitum imediat. După 24-36 de ore
postoperator mâncarea standardizată a fost reintrodusă.
Nu au fost administrate postoperator substanţe antiacide sau gastroprotectoare. Animalele
au fost verificate zilnic pentru identificarea semnelor de suferinţă sau a complicaţiilor. La nevoie
s-a administrat intramuscular metamizol sodic. De asemenea, zilnic au fost monitorizate
consumul de mâncare, temperatura corporală şi evoluţia greutăţii fiecărui subiect.
Patch-urile 3D cu MSC au fost montate pe defecte iatrogenice la nivelul stomacului (21
subiecti) şi jejunului (17 subiecti) (Tab. 1, Tab. 2). Lotul control a beneficiat de aceeaşi
randomizare: 21 de patch-uri control pe stomac şi 17 la nivelul jejunului (Tab. 3, Tab. 4).
155
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Materiale şi metode
156
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Materiale şi metode
157
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Materiale şi metode
158
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Materiale şi metode
umană 8 umană 4
sobolan 4
umană 8 umană 5
şobolan 3
Porcină
Origine
şobolan 6 7 6 3
MSC
şobolan 2 2 1 2
Origine
Umană
MSC
umană 2 2 2 3
umană 8
Jejun 17 porcină 9
umană 8
159
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Materiale şi metode
arterial
ţesut
Umană 3 5 3 5
Subiecţii au fost eutanasiaţi la intervale de timp prestabilite (3, 10, 27, 48, 80, 120, 180,
350 zile) pentru studiul procesului de regenerare, folosind o supradoză de pentobarbital
intravenos urmată de clorură de potasiu.
Animalele cu aspect clinic anormal sau septic au fost eutanasiate de necesitate.
După deschiderea abdomenului, liniile de sutură au fost identificate, inspectate, iar piesa
de studiu a fost rezecată la 2 cm proximal şi distal faţă de linia de sutură.
Specimenele au fost spălate cu soluţie salină, scheletizate de aderenţele tisulare şi
secţionate longitudinal pentru a permite inspectarea lumenului.
Histologie şi imunofluorescenţă
Piesele excizate de stomac şi jejun au fost imersate în soluţie 10% formol neutru sau
soluţie salină 0.9% pentru studiile ulterioare de microscopie şi respectiv imunofluorescenţă.
Momentele sacrificărilor au favorizat oportunitatea de a examina răspunsul celular acut şi
cronic pentru implanturile xenogene, neoangiogeneza, depozitarea neomatricei, colonizarea
celulară, proliferarea, diferenţierea şi degradarea matricei colagenice exogene.
Pentru examenul histopatologic, probele au fost evaluate în orb pe secţiuni de 4 µm
colorate cu hematoxilin-eozină.
Specimenele provenite de la animale la care s-au folosit patch-uri cu MSC umane au fost
analizate prin imunofluorescenţă. Acestea au fost identificate pe fragmentele de tub digestiv
recoltate prin marcare cu anticorpi anti-umanii HLA-FITC (Sigma, St. Louis, USA).
Fragmentele de ţesut au fost secţionate la criotom după îngheţare. Secţiunile îngheţate cu
o grosime de 6 µ au fost aşezate pe lame Fisher Superfrost şi fixate cu acetonă rece, apoi spălate
şi echilibrate timp de 5 minute cu fosfat tamponat salin (PBS), ph 7.2 (Sigma, St. Louis, USA).
Secţiunile au fost incubate cu 1.5% albumină serică bovină (BSA) (Sigma), 0.05%
TritonX-100 (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany) cu PBS pentru
permeabilizarea şi blocarea locusurilor nespecifice (30 de minute, la temperatura camerei, în
cameră umidificată)
După decantarea soluţiei de blocare şi clătire cu PBS-BSA 1.5%, secţiunile au fost
incubate cu anticorpul conjugat cu FITC diluat în PBS-BSA 1.5%, timp de 2 ore la temperatura
camerei, în cameră umidificată. După spălare, 3x5 minute cu PBS, secţiunile au fost incubate cu
coloraţia Hoechst (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California), 15 minute, la temperatura
camerei, în cameră umidificată, pentru marcarea nucleilor.
În final, secţiunile au fost spălate 3x5 minute cu PBS, contrastate cu hematoxilină şi
montate în mediu de montare pentru fluorescenţă (DakoCytomation Inc., Carpinteria, CA, USA),
apoi examinate la microscopul cu fluorescenţă.
160
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Materiale şi metode
Analiza statistică
A fost realizată pentru testele de proliferare celulară cu testul paired t test, iar rezultatele
clinice au fost evaluate cu ajutorul testutul Fisher's exact test.
161
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Rezultate
REZULTATE
Burete
Tab. 5. Rezultatele determinărilor analitice pentru colagenul extras din tendon bovin.
Analiza Colagen din tendon bovin
Procedeu enzimatic
Azot total 14,14 g/100g subst. uscată
Proteine totale 84,36 g/100g subst. uscată
Hidroxiprolină 8,98 g/100g subst. uscată
Colagen 81,00 g/100g subst. uscată
Greutatea moleculară medie 301.000 Da
după Craciunescu 2007
162
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Rezultate
Studiind influenţa compoziţiei bureţilor asupra gradului lor de hidratare, s-a observat că
valorile calculate în cazul bureţilor compozit COL-AG sunt mai scăzute decât ale buretelui de
colagen simplu, dar gradul de hidratare este de 70 de ori mai mare comparativ cu greutatea
iniţială, ceea ce reprezintă o valoare acceptabilă pentru un material destinat ingineriei tisulare
(Craciunescu 2004).
Prin măsurarea cantităţii de colagen dizolvat în soluţie se poate stabili gradul de reticulare
al buretelui poros. Rezultatele au indicat că probele iradiate UV au fost mai puţin degradate de
colagenază decât probele netratate, prezentând un grad de reticulare mai mare.
163
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Rezultate
Celule
Rezultatele au demonstrat că celulele exprimă CD90, CD105 dar sunt negative pentru
CD34, CD38, CD45, CD3 şi CD14 (Fig. 29).
164
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Rezultate
albastru tripan; (2) dimensiunea porilor de 50-170 μm permite multiplicarea şi migrarea celulelor
la distanţă faţă de locul de inserţie; (3) produsul este biodegradabil, testul realizat in vitro
indicând o degradare completă în 30 minute sub acţiunea colagenazei I, fără a afecta celulele
rezidente în matrice.
Sterilitatea patch-ului
Contaminarea medie stabilită prin MCPC a fost de sub 50 de bacterii per probă,
acceptabilă pentru realizarea activităţilor experimentale. Nicio tulpină din cele identificate nu
este patogenă. Pentru aceleaşi probe, examenul bacteriologic clasic a stabilit că eşantioanele sunt
sterile (Fig. 32).
165
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Rezultate
166
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Rezultate
167
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Rezultate
umană 8 3 peritonită
umană 8 3 peritonită
Câte cinci subiecţi din fiecare subgrup al lotului experimental nu au fost sacrificaţi, ei
servind pentru studiul impactului patch-ului asupra duratei de viaţă medie a şobolanilor. S-a
observat că durata de viaţă a acestora nu a fost afectată, ei supravieţuind timp de 30-32 de luni
(Fig. 34) în condiţii de laborator, ceea ce coincide cu datele din literatură privind durata medie de
168
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Rezultate
viaţă a şobolanilor Wistar (2,5-3 ani). Decesul acestora a survenit în condiţii naturale, necropsiile
efectuate nu au evidenţiat nicio cauză legată de utilizarea acestor patch-uri.
Lotul experimental
169
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Rezultate
Macroscopic, pentru acest lot, zona de regenerare a mucoasei stomacului sau a jejunului,
a putut fi identificată cu dificultate începând cu săptămână a 7 postoperator. Aceasta se traduce
printr-un aspect macroscopic similar al zonei regenerate şi al celei adiacente (Fig. 36, Fig. 37).
După această perioadă, singurul indiciu asupra suprafeţei peritoneale regenerate a fost
oferit de existenţa bridelor şi aderenţelor. Diferenţierea între peretele digestiv normal şi regenerat
s-a putut face numai prin inspecţia feţei intraluminale a peretelui digestiv regenerat. În două
cazuri a existat o creastă circulară de mucoasă şi submucoasă gastrică hipertrofică intraluminală.
În ceea ce priveşte modificările de calibru ale tubului digestiv, diametrul stomacului sau
intestinului regenerat nu a fost alterat proximal sau distal de zona de aplicare a patch-ului.
170
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Rezultate
Prin examinare microscopică, la trei zile postoperator, celulele stem au fost observate la
nivelul patch-ului (Fig. 38A, 38B). Regenerarea peretelui digestiv a fost facilitată de colonizarea
patch-urilor 3D de celule native ale peretelui digestiv (Fig. 38 B), şi de către prezenţa ţesutului
de granulaţie, care în timp s-a modificat în paralel cu reconstrucţia peretelui digestiv.
Regenerarea totală, cu resorbţia completă a peretelui aortic, a tuturor celor patru straturi
(mucoasă, submucoasă, musculară şi seroasă) ale stomacului şi intestinului subţire a fost
observată la 48 de zile postoperator (Fig. 38C, Fig. 39B). Nu au existat diferenţe în regenerarea
stomacului şi a intestinului, ambele organe prezentând microscopic un perete cu o structură
histologică similară celui nativ.
Cu toate acestea, ca particularitate a peretelui digestiv regenerat s-a constatat prezenţa
unui epiteliu metaplazic keratinizat scuamos pluristratificat, a infiltratului inflamator precum şi
lipsa glandelor mucoase (Fig. 38C, Fig. 39B). Infiltratul inflamator a fost semnificativ după
utilizarea patch-urilor cu MSC umane. Aspectul ţesutului digestiv regenerat nu a fost influenţat
de originea vaselor aortice utilizate pentru construcţia patch-urilor. După această perioadă,
examenul microscopic cu coloraţie HE nu a evidenţiat alte modificări, aspectul secţiunilor la 80,
120, 180, şi 350 de zile fiind similar celui de la 48 de zile.
171
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Rezultate
La trei zile postoperator celulele stem umane au fost identificate prin microscopie
electronică de transmisie la nivelul feţei luminale a patch-ului (Fig. 41, Fig. 42A). Aspectul
acestor celule este reprezentativ pentru celulele stem: celule cu nuclei mari şi citoplasma săracă.
La zece zile postoperator, o cantitate scăzută de celule rotund-ovalare a fost identificată către
fragmentul aortic (Fig. 42B), şi o cantitate crescută de celule pavimentos-like distribuite la polul
luminal al patch-ului (Fig. 42C). Numeroase conexiuni inter-celulare au fost observate. La 180
de zile postoperator, structura a fost înalt organizată cu prezenţa a numeroase vase de
neoformaţie şi reorganizarea fibrelor de colagen (Fig. 42D).
172
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Rezultate
Fig. 41. Imagine TEM a unei celule stem mezenchimale infiltrată în structura matricei
poroase de COL-AG, implantată la nivelul intestinului subţire de şobolan, X7100. F2
173
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Rezultate
Fig. 42. Perete digestiv regenerat, la nivelul patch-ului 3D îmbogăţit cu MSC; TEM.
(Sîrbu-Boeţi 2009)
A. Ziua 3: grup de celule stem la polul luminal al patch-ului; X7100. B. Ziua 10: celule transplantate
(a) lângă fragmentul aortic (b); X2200. C. Ziua 10: grup de celue stem cu formă elongată şi
numeroase conexiuni intercelulare; X2200. D. Ziua 180: neovase şi nou sintetizate fibre de colagen
cu dispoziţie longitudinală şi transversală; X4400.
Lotul control
174
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Rezultate
175
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Rezultate
176
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Rezultate
177
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Rezultate
Deşi la început, mortalitatea a fost dublă în cadrul lotului control, pe termen lung aceasta
s-a egalizat, astfel încât nu s-a observata o afectare a duratei de viaţa. Nu se poate spune că
mortalitatea crescută se datorează lipsei MSC, ci probabil este legată de curba de învăţare a
tehnicii, lotul control fiind realizat înaintea celui experimental.
Exceptând cazurile de peritonită şi pe cel al pseudotumorei gastro-hepatice, defectele de
regenerare observate au fost compatibile cu viaţa, fară a constitui cauze de deces, unele fiind
detectate la cca 25-30 de luni postoperator.
178
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Discuții/Concluzii
DISCUŢII
În acest studiu s-a testat pentru prima dată combinaţia dintre MSC şi o matrice
biosintetică dublată de un fragment arterial decelularizat cu scopul regenerării in vivo a peretelui
digestiv. MSC izolate de la nivelul MO, au fost evidente şi stabile în cultură, aşa cum arată
morfologia lor, rezultatele FACS, marcarea fluorescentă şi testul funcţional de diferenţiere
adipogenică şi osteogenică. Mai mult, nu au fost observate efecte adverse cauzate de
administrarea MSC. Suportul matriceal, buretele de COL-AG şi fragmentul arterial, au fost apte
pentru susţinerea celulelor, fără a genera fenomene imune; mai mult structura buretelui este
similară colagenului nativ.
Produsul rezultat, cu o structură bilaminară, a fost utilizat cu succes pentru substituţia şi
regenerarea peretelui digestiv al şobolanilor, făcând parte dintre metodele de inginerie tisulară
menite a repara, întreţine şi îmbunătăţii funcţiile ţesuturilor.
De-a lungul timpului, s-au conturat trei strategii de a crea ţesuturi noi: (1) utilizarea de
celule izolate sau substituenţi celulari, (2) utilizarea de substanţe ce induc apariţia ţesuturilor şi
(3) utilizarea celulelor plasate pe/sau în diverse matrici. (Langer 1997)
Se consideră că biomaterialele joacă un rol important în regenerarea ţesutului, actionând
ca schele utilizate de către ţesut pentru refacerea arhitecturii sale. Clasic, biomaterialele sunt
împărţite în: (1) naturale (colagen, alginat etc); (2) acelulare (mucoasa vezicală urinară,
submucoasa intestinală); (3) sintetice (acid polilactic, poliglicolic etc). (Demirbilek 2003) Cu
toate acestea, suportul ideal pentru reconstrucţia peretelui digestiv încă nu a fost găsit.
În general, se consideră că, graftul ideal trebuie să fie biocompatibil pentru a evita un
răspuns tisular nedorit din partea gazdei, să permită ataşarea celulelor, infiltrarea şi proliferarea,
să favorizeze neovascularizaţia şi astfel dezvoltarea tisulară, să deţină proprietăţi mecanice şi
fizice adecvate pentru a menţine structura şi funcţia în timpul reparării tisulare şi să fie
biodegradabil într-o manieră controlată (Lu 2004). La acestea se poate adăuga rolul de protector
pentru celulele inoculate.
Prima utilizare cu succes a materialelor protetice neabsorbabile ca patch pentru repararea
defectelor peretelui digestiv a fost raportată de Harmon (1979). Aşa cum a fost demonstrat de
alte studii, materialele neresorbabile reprezintă o soluţie deficitară pentru creşterea tisulară
deoarece ţesutul regenerat are o arhitectură dezordonată (Chen 2004), în plus, aducând şi
reacţiile organismului faţă de un corp străin.
Utilizarea materialelor resorbabile a constituit următorul pas firesc. Astfel, Thompson a
investigat pentru prima dată utilizarea unui patch sintetic resorbabil: o meşă din acid poliglicolic
(Thompson 1986). Din păcate matricile polimerice nu pot interacţiona cu celulele în maniera
dorită întrucât suprafaţa lor nu promovează adeziunea celulară şi, de asemenea, poate induce
reacţii inflamatorii şi toxice (Walles 2003). În plus, există o îngrijorare cu privire la potenţialul
infecţios al grafturilor sintetice (Wang 2003).
Actualmente studiile se concentrează asupra biomaterialelor resorbabile care au câteva
avantaje, în plus, faţă de materialele sintetice clasice: sunt biodegradabile în timp, favorizează
interacţiile celulare, creşterea, dezvoltarea tisulară şi sunt rezistente la infecţii.
Succesul suprem al ingineriei tisulare rezidă în alegerea corectă a tipurilor de
biomateriale adecvate (componenta pasivă) şi a componentei active (celulele).
Colagenul este cel mai folosit material pentru cultura celulelor în variate domenii, culturi
celulare 3D fiind obţinute utilizând bureţi de colagen, geluri, filme şi sandwich-uri ale acestora
(Itoh 2001, Feng 2003, Chen 2003). Colagenul este avantajos deoarece conţine structuri ce
facilitează ataşarea celulelor, migrarea, proliferarea şi menţinerea diverselor funcţii (Itoh 2001).
În plus, colagenul exogen poate fi încorporat în ţesutul de granulaţie fiind astfel o materie primă
pentru reconstrucţia tisulară (Mutter 1996).
Biomaterialele pe bază de colagen precum Contigen şi materialele bazate pe matrice
extracelulare ca AlloDerm-ul, submucoasa de intestine subţire, submucoasa de vezică urinară
(UBS) sunt exemple comerciale de produse disponibile. AlloDermu-ul a fost utilizat pentru
179
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Discuții/Concluzii
acoperirea defectelor esofagului cervical la câini (Isch 2001). SIS a fost utilizată ca patch pentru
regenerarea esofagului (Badylak 2000) şi intestinului subţire (Chen 2001, Wang 2005) pe diverse
modele de xenograft, iar o matrice de tip SIS însămânţată cu MSC provenite din măduva osoasă
a fost utilizată cu succes pentru regenerarea vezicii urinare pe un model canin (Chung 2005).
UBS a fost utilizată ca xenograft resorbabil pentru repararea defectelor esofagiene pe un model
canin (Badylak 2000). S-a dovedit că SIS şi UBS conţin factori angiogeni (e.g. basic fibroblast
growth factor (bFGF), vascular endothelial cell growth factor (VEGF)), şi componente ce susţin
angiogeneza (fibronectină, heparină, colagen I, III, IV, şi V) ce explică rolul important al acestor
matrice în neovascularizaţie (de la Fuente 2003) (Demirbilek 2003). Toate aceste elemente au în
comun aportul matricei extracelulare menită a fi o schelă de construcţie pentru celulele
primitorului. Este important a se ţine cont de faptul că atunci când se utilizează matrice simple
fără celule, reconstrucţia peretelui digestiv este rezultatul autoregenerării. Utilizând matrice
sădite cu celule, refacerea continuităţii digestive este rezultatul ţesutului transplantat şi a celui
gazdă.
Odată cu utilizarea crescută a colagenului în domeniu medical au apărut întrebări ce
privesc imunogenicitatea acestei proteine la oameni. Colagenul este cunoscut pentru
biocompatibilitatea sa excelentă, datorată toxicităţii scăzute şi reacţiei imunogenice slabe, iar
până în 1950 s-a considerat că antigenicitatea colagenului nu există. O posibilă explicaţie ar fi
gradul mare de similitudine a secvenţei de aminoacizi la specii diferite şi conţinutul scăzut în
aminoacizi aromatici. Problemele sunt legate de o posibilă apariţie a unui răspuns imun masiv
care poate avea efecte secundare, cum ar fi lezarea organelor datorită numărului mare de
complexe imune sau reacţii încrucişate ce pot induce o boală autoimună. Trebuie făcută o
distincţie clară între imunogenicitate, inducerea formării de anticorpi, şi antigenicitate, anticorpii
sunt deja prezenţi. Animalele şi oamenii pot produce anticorpi ce se leagă la trei determinanţi din
cadrul moleculei de coalgen: determinanţii terminali sunt localizaţi în regiunea terminală non
helicală (determinanţi P), determinantul central constă în secvenţa de aminoacizi cu conformaţie
triplu-helicala (determinanţi A).
Importanţa fiecărui determinant depinde de natură şi modul de procesare a produsului
bazat pe colagen. De exemplu, îndepărtarea selectivă a componentelor non helicale din molecula
de colagen are ca rezultat scăderea antigenicităţii. Crosslink-uri adiţionale, de exemplu cu
glutaraldehida, duce la scăderea antigenicităţii dar nu o elimină complet. Aşadar, răspunsul imun
declanşat de colagen este dependent de sursa proteinei, de metoda folosită şi de specia de animal
folosită în cadrul experimentului. În ciuda problemelor teoretice care pot apărea, suturile pe bază
de colagen, agenţii hemostatici pe bază de colagen, şi colagenul injectabil sunt considerate
produse fără risc şi slab antigenice, ceea ce fac din colagen un material potrivit pentru domeniul
medical.
Dintre structurile animale bogate în colagen, aorta porcină este cel mai des folosită în
experimente ce ţintesc obţinerea unui substitut vascular (Nerem 2001). Totuşi, aplicaţiile nu sunt
restrânse doar la domeniul vascular, Kajitani reparând un defect duodenal major cu un patch pe
bază de elastină obţinut din aortă porcină (Kajitani 2000). Folosirea aortei porcine este justificată
nu numai de rezistenţa la digestie, ci şi de conţinutul ridicat în colagen şi elastină ce are un
impact pozitiv asupra vindecării ţesuturilor.
Limita xenograft-urilor este reprezentată de antigenicitate care poate fi înlăturată prin
decelularizare. Tehnicile de decelularizare includ mijloace chimice, enzimatice şi mecanice de
îndepărtare a componentelor celulare, lăsând în urmă un material constituit în principal numai
din elemente al matricei extracelulare (Schmidt 2000). Tratamentul enzimatic utilizat în studiu a
fost optimizat printr-o serie de trial-uri cu scopul de a evita ca fragmentele arteriale să devină
prea friabile. Tratamentul a prezervat arhitectura matricei extracelulare alcătuită din proteine
structurale, proteoglicani, fibre de colagen şi elastină, aşa cum rezultă şi din studiul lui Teebken
(2000).
Un pas înainte în ingineria tisulară a tubului digestiv a constat în popularea in vitro a
matricilor sintetice şi biologice cu diverse tipuri de celule în funcţie de ţesutul reparat. Vacanti şi
colaboratorii au fost pionierii în obţinerea unui neointestin prin inginerie tisulară, utilizând
180
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Discuții/Concluzii
“organoizi” cultivaţi într-o matrice din acid poliglicolic şi polilactic (Organ 1992), studiile lor
fiind bazate pe activitatea lui Evans şi Tait (Evans 1992, Tait 1994). Organoizii intestinali par a
fi superiori celulelor intestinale pentru a fi însămânţate în biomateriale deoarece conţin pe lângă
celulele criptelor gastrice şi elemente stromale ce facilitează generarea neointestinului (Chen
2004). Mai mult, aceşti organoizi conţin celule stem intestinale.
Rolul MSC în regenerarea tisulară este bine cunoscut (Pittenger 1999). Ele au capacitatea
de a se diferenţia, în anumite condiţii in vitro, şi să formeze osteoblaste, condrocite, tenocite,
mioblaste, neuroni şi celule ale mezodermului visceral (celule endoteliale) (Chamberlain 2007).
MSC au abilitatea de a se localiza atât în ţesuturi sănătoase cât şi bolnave şi de a se diferenţia in
vivo în anumite tipuri celulare (Chamberlain 2007).
Eficienţa celulelor stem derivate din măduva osoasă în regenerarea stomacului după
inducerea cu etanol a unor ulcere a fost demonstrată într-un studiu pe şobolani (Komori 2005).
Succesul utilizării acestor celule în tratamentul enteritei postradice (Semont 2006) şi al bolilor
inflamatorii ale intestinului (Garcia-Olmo 2005) atestă implicarea lor în repararea tubului
digestiv.
Potenţialul beneficiu al MSC în repararea întregii grosimi a peretelui digestiv este un
concept nou. Datorită proprietăţilor de multiplicare şi diferenţiere in vitro şi in vivo, s-a presupus
că MSC pot fi de o mare importanţă în repararea defectelor peretelui digestiv.
În prezent, studiile au menirea de a elucida mecanismul de acţiune al MSC în repararea
defectelor peretelui digestiv. Contribuţii recente au arătat contribuţia MSC la solidificarea
digestivă (Han 2005) şi epitelizare (Fu 2006). Însămânţate pe o matrice optimă aceste celule pot
ghida angiogenza şi vindecarea tisulară.
Am pornită de la ipoteza că cea mai potrivită cale de livrare a celulelor pentru repararea
peretelui digestiv este reprezentată de folosirea unui patch local cu un număr mare de MSC.
Folosirea unui număr mare de celule implică o mare disponibilitate. Datorită posibilităţii de
cultivare şi multiplicare in vitro a acestor celule, singurul factor limitativ al disponibilităţii lor
poate fi dependent doar de recoltare. Stroma măduvei oasoase este cea mai utilizată sursă de
celule stem mezenchimale. În acest studiu, recoltarea unei cantităţi suficiente de măduvă osoasă
a necesitat sacrificarea şobolanilor dar pentru animale mai mari aceste celule pot fi recoltate cu
uşurinţă prin aspiraţie medulară.
Deoarece deplasarea celulelor în matricea aortică decelularizata este inadecvată atât in
vitro (Teebken 2000) cât şi in vivo (Walles 2003), aceasta având o organizare foarte strânsă, s-a
decis sădirea MSC într-un burete de COL-AG ce a fost apoi aplicat peste fragmentul arteria. În
plus, ţinând cont de rolurile fiziologice ale colagenului şi cele observate in vitro (facilitează
ataşarea celulelor, migrarea, proliferarea şi menţinerea diverselor funcţii celulare) s-a considerat
că folosirea unei matrice colagenice care să se comporte ca un rezervor de MSC, este ideală sub
raportul beneficiu/cost.
În matricile 3D de COL-AG, MSC rămân viabile şi “sănătoase” (Batorsky 2005). Prin
aceasta metodă inovativă s-a încercat obţinerea unui patch 3D cu proprietăţi specifice:
biocompatibilitate, biodegradabilitate, integritate structurală şi porozitate adecvată. Structura tip
fagure a matricei COL-AG a fost aleasă pentru sădirea celulelor deoarece poate acapara un
număr mare de celule datorită structurii sale specifice cu o arie totală foarte mare (Itoh 2001).
Prin utilizarea matricei de colagen îmbogăţite cu MSC s-a dorit nu numai obţinerea dar şi
accelerarea regenerării adecvate a peretelui digestiv.
După inocularea în organism, MSC au nevoie de un mediu “prietenos” pentru
supravieţuire. Lumenul tubului digestiv este cel mai neprimitor mediu pentru aceste celule,
datorită prezenţei unei cantităţi crescute de enzime, acizi, baze şi germeni. O modalitate de a
proteja aceste celule de a fi ucise de acest mediu ostil este de a le “ambala” într-o matrice
rezistentă la acţiunea enzimelor, acizilor şi bazelor. Pentru acest scop matricea de COL-AG a
fost aleasă, colagenul fiind cel mai rezistent biomaterial la acţiunea secreţiilor digestive
(Aprahamian 1992), iar agaroza este un polizaharid inert la acţiunea enzimelor, acizilor şi
bazelor.
181
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Discuții/Concluzii
182
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
STUDIUL EXPERIMENTAL Discuții/Concluzii
celulelor endogene locale şi/sau sistemice; (2) nu a fost posibilă analiza diferenţierii MSC;
identificarea acestora după 48 de zile certifică prezenţa lor la nivelul tesutului, însă nu se poate
spune dacă acestea s-au diferenţiat în celule constituente ale peretelui digestiv sau au stimulat
diferenţierea celulelor endogene; (3) deşi morfologic, structura regenerată a fost urmărită până la
350 zile postoperator, identificarea celulelor a fost realizată pe o perioadă de până la 48 de zile,
ce pledează mai mult pentru efectul paracrin exercitat de MSC; se impune necesitatea unor
studii ulterioare care să urmărească aceste celule pe o perioadă mai lungă de timp; (4) nu a fost
posibilă elucidarea mecanismului de acţiune al MSC, ci doar a beneficiilor utilizării acestora;
(5) nu a fost posibilă o analiză amănunţită a fenomenelor ce au condus la metaplazia
mucoasei prin prezenţa epiteliului pavimentos în locul mucoasei gastrice normale; (6) nu s-a
realizat o analiză a evoluţiei acestor celule, neştiindu-se ce se întâmplă cu acestea după 48 de
zile. Pe viitor, multe din aceste neajunsuri vor putea fi îndepărtatea prin utilizarea unor metode
de marcare genetică combinată cu analiza expresiei anumitor gene specifice.
În acest studiu au fost prezentate rezultatele obţinute în urma folosirii patch-urilor 3D
îmbogăţite cu MSC pentru repararea defectelor iatrogene ale stomacului sau intestinului
demonstrând macroscopic şi microscopic repararea peretelui digestiv la nivelul patch-ului.
Implicaţiile MSC în repararea peretelui digestiv au fost dovedite în acest studiu prin
identificarea celulelor xenotransplantate la nivelul peretelui digestiv regenerat şi prin rezultatul
clinic favorabil. Scopul cercetărilor actuale este de a caracteriza evoluţia acestor celule, a
înţelege implicaţiile MSC în repararea tubului digestiv adult – prin diferenţiere, fuziune celulară
cu celulele adulte şi/sau influenţare a celulelor adulte prin secreţia de citokine – şi de a învăţa
cum aceste celule pot fi manipulate spre a obţine structuri identice celor native.
Rezultatele viitoare vor facilita aplicaţiile patch-urilor 3D cu MSC autoloage ca o soluţie
promiţătoare pentru tratamentul fistulelor digestive, dar şi a altor afecţiuni.
CONCLUZII
Studiul descrie izolarea, cultivarea, caracterizarea MSC obţinute din măduva osoasă şi
pregătirea printr-o procedură inovatoare a unui bioconstruct ce are la bază o matrice de colagen-
agaroza îmbogăţită cu MSC, aşezată pe un fragment aortic, cu scopul transplantării pentru
repararea defectelor peretelui digestive. Rezultatele obţinute arată că patch-urile 3D îmbogăţite
cu MSC promovează repararea defectelor peretelui digestiv cu refacerea celor patru straturi.
Matricea de COL-AG s-a dovedit a fi biocompatibilă şi biodegradabilă, facilitând grefarea MSC.
Componenta aortică a patch-ului a oferit un bun suport mecanic pentru celelalte componente
fiind complet resorbită în ţesutul regenerat. MSC transplantate au îmbunătăţit grefarea patch-ului
facilitând regenerarea completă a ţesuturilor fără nevoia de imunosupresie.
Acest studiu a reprezentat un prim pas în intenţia de a realiza o nouă metodă pentru
tratamentul fistulelor digestive la pacienţii umani, utilizând patch-uri 3D cu MSC autoloage
expandate in vitro.
183
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
PREZENTARE CAZURI Cazul I
PREZENTARE CAZURI
Rezultatele favorabile obţinute în cadrul studiului pe animale, corelate cu datele din
literatură au îndreptăţit testarea produsului experiemntal pe oameni, însă întrucât nu s-au găsit
pacienţi cu fistule digestive care să întrunească criteriile de includere, şi care să accepte acest
tratament experimental, testarea sa a fost realizată pe pacienţi neurologici prezentând escare de
decubit.
Cazul I
Pacient: S.V., 51 ani, bărbat, diagnosticat în Mai 2007 cu scleroză multiplă primară
progresivă.
Prezentare
184
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
PREZENTARE CAZURI Cazul I
Antecedente
185
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
PREZENTARE CAZURI Cazul I
Februarie 2008: pacientul dezvoltă escare de decubit la nivelul maleolei externe stângi
şi în treimea superioară a coapsei pe faţa laterală, care sunt tratate conservator cu pansamente
uscate.
Conduită
186
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
PREZENTARE CAZURI Cazul I
187
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
PREZENTARE CAZURI Cazul I
Fig. I.6. Aspectul patch-ului constituit din MSC, matrice colagenică şi perete aortic
decelularizat. F3
MSC au fost impregnate in matricea colagenică care constituie “miezul” sandwich-ului format de
peretele aortic şi plagă. A. Faţa internă, ce intră in contact cu plaga. B. Faţa externă. # - perete
aortic; * - matrice COL-AG cu MSC.
188
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
PREZENTARE CAZURI Cazul I
189
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
PREZENTARE CAZURI Cazul I
deficit al braţelor şi ataxie, EDSS 6.5, pacientul fiind capabil să meargă cu ajutor pe distanţe de
aproximativ 40 de m.
Îmbunătăţirea statusului neurologic a fost constantă, astfel încât după 24 de luni pacientul
este apt a realiza activităţi casnice şi să meargă cu bicicletă, în absenţa medicaţiei neurologice.
190
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
PREZENTARE CAZURI Cazul II
Cazul II
Pacient: B.C., 32 ani, bărbat, diagnosticat în aprilie 2003 cu paraplegie flască în urma
unui traumatism medular cu fractură luxaţie T11-T12; sindrom compresiv posttraumatic.
Prezentare
Antecedente
191
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
PREZENTARE CAZURI Cazul II
Se externează după cca 27 de zile fără progrese clinice notabile în urma procedurii. La
întoarcerea în ţară dezvolta escara fesieră ca urmare a menţinerii poziţiei fixe pe durata zborului.
Conduită
Consultul chirurgical constată prezenţa unei escare de decubit stadiul IV, neinfectată, de
cca 4 cm diametru, tratată conservator, fără ameliorare, timp de 18 luni.
Având acordul Comisiei de etică a Institutului Clinic Fundeni şi al pacientului, acestuia i
se practică acoperirea escarei cu un pansament biologic pe bază de MSC autologe.
MSC au fost recoltate de la nivelul spinei iliace postero-superioare după un screening
amănunţit pentru detectarea infecţiilor sau neoplaziilor. Pentru izolare s- a utilizat un protocol
bazat pe separarea în gradient de densitate (vezi Partea generală), celulele fiind analizate
cariotipic şi fenotipic prin flow-cytometry. Celulele izolate au prezentant fenotipul clasic pentru
MSC: CD105+, CD90+, CD34+, CD45-, CD3-, CD14-, şi un cariotip normal.
Celulele obţinute din al treilea pasaj au fost folosite pentru obţinerea unui patch similar
de cca 13 cm2, ce conţine 4x106 celule (Fig. II.2).
192
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
PREZENTARE CAZURI Cazul II
193
PREZENTARE CAZURI PARTEA SPECIALĂ
Concluzii
Discuţii
Cele două cazuri prezentate confirmă rezultatele experimentale privind implicarea MSC
în procesul de vindecare tisulară.
Deşi aplicaţia clinică este diferită de modelul experimental, aceasta a reprezentat
modalitatea cel mai puţin invazivă de testare clinică a produsului.
Folosirea MSC de la nivelul MO, în tratamentul rănilor cutanate pare o soluţie logică,
deoarece realizează un aport de celule inflamatorii, mezenchimale şi multipotente. Celulele
inflamatorii stimulează vindecarea unei plăgi, în timp ce MSC umplu dermul rănii, accelerând
vindecarea. În plus, având în vedere plasticitatea MSC, acestea pot produce celule noi absente
sau deficiente în plaga respectivă. (Badiavas 2003)
Utilizarea MSC pentru tratamentul escarelor de decubit reprezintă o metodă fezabilă ce
poate grăbi vindecarea considerabil, o alternativă viabilă chirurgiei plastice sau metodelor
conservatoare costisitoare, prezentând morbiditate minimă. Cicatricea obţinută, cca 50% din
dimensiunea plăgii inţiale, moale, mobilă, usor elastică, fară afectare funcţională, acoperită de un
epiteliu rezistent, constituie un alt avantaj al metodei.
Într-un studiu similar, Badiavas (2003) a observat că efectul celulelor se manifestă
preponderent la nivelul dermului, producând o uşoară îngroşarea a plăgii, creşterea
vascularizaţiei în patul plăgii şi înconjurător. Asemenea observaţii au fost întâlnite şi în cazul
celor doi pacienţi. Astfel procesul de vindecare are ca punct de plecare dermul, prin furnizarea
acestuia cu celule proaspete sănătoase (din diferenţierea MSC sau racolarea celor endogene pe
baza stimulilor MSC) care le vor înlocui pe cele rezidente, bolnave, inapte a reacţiona în cadrul
procesului de regenerare.
Deoarece punctul de plecare este dermul, se impune o pregătire riguroasă a patului plăgii.
Totuşi, aceasta singură nu este suficientă, aşa cum s-a observat şi în cazul celor doi pacienţi
trataţi, însă oferă un bun acces celulelor la acesta. Astfel, se poate spune că tehnica de izolare şi
cultură a MSC, utilizată pentru cei doi pacienţi, conservă potenţialul dermoregenerativ al MSC,
iar metoda de administrare (patch-ul 3D conţinând buretele de COL-AG cu MSC) favorizează
livrarea celulelor către derm.
În ceea ce priveşte numărul de celule aplicate, Falanga (2007) apreciază că numărul
minim de celule pentru a genera un răspuns este de cca 1 milion/cm2. În opoziţie cu acesta,
pentru cei doi pacienţi s-a utilizat o medie de 350000 de celule/cm2, fără a întâmpina dificultăţi
în rezoluţia procesului lezional.
Cu toate că perioada de vindecare a fost relativ lungă (dar similară cu cea menţionată
pentru studii asemănătoare de către alţi autori (Falanga 2007), rezultatul obţinut şi morbiditatea
procedurii justifică aşteptarea şi utilizarea sa viitoare. În plus, pe termen lung costurile metodei
cu celule stem sunt acceptabile, înlăturând din arsenalul terapeutic pansamentele speciale
destinate escarelor care sunt foarte costisitoare.
In cazul pacientului 1, deşi folosirea MSC, pentru acest pacient a fost strict indicată
ulceraţiilor, rezultatul neurologic a fost neaşteptat, dovedind că la acest moment activitatea MSC
posttransplant nu poate fi controlată precis.
Deşi neaşteptat rezultatul neurologic nu este surprinzător, întrucât MSC au dovedit un rol
terapeutic major în unele afecţiuni autoimune (e.g. GVHD, boala Crohn etc.), astfel încât pot
contribui şi la îmbunătăţirea statusului pacienţilor cu scleroză multiplă.
Totuşi, pentru a susţine ştiinţific acest rezultat, este nevoie că implicarea MSC în scleroza
multiplă să fie studiată pe un număr mai mare de pacienţi, ţintind implicarea moleculară a
acestora în patogenia bolii.
Pentru niciunul din cazuri nu au fost înregistrate evenimente morbide la nivel local sau
sistemic legate de utilizarea MSC sub forma prezentată, până în acest moment
Având în vedere că celulele au fost utilizate sub forma unui pansament biocelular compus
dintr-o matrice de colagen şi ţesut arterial uman decelularizat, se impune testarea acestui produs
pentru identificarea rolului fiecărei componente în cadrul procesului de vindecare.
194
PREZENTARE CAZURI PARTEA SPECIALĂ
Concluzii
Cu toate că ambii pacienţi au prezentat acelaşi tip de leziune (i.e. escară de decubit
stadiul IV), perioada de regenerarea a fost diferită. Pacientul 2, cu o plagă mai mică, de cca 13
cm2, beneficiind de cca 307000 celule/cm2, a realizat închiderea plăgii după aproximativ 9
săptămâni, în timp ce pacientul 1, cu o plagă de 20 cm2 a primit aproximativ 400000 de
celule/cm2 şi a beneficiat de închiderea plăgii după cca 5 luni. Întrucât concentraţia de celule a
fost apropiată, evoluţia a fost diferită, ceea ce lasă un loc important substratului de implantare.
Astfel, se pare că deşi paraplegici amândoi, statusul autoimun şi afectarea neurală a constituit un
dezavantaj pentru pacientul 1, recuperând mai greu închiderea plăgii. Întrucât mecanismul de
acţiune al acestor celule nu a fost elucidat, un posibil motiv al duratei lungi de timp poate fi
reprezentat de moblizarea celulelor endogene, sub stimulii paracrini ai MSC, celule care oricum
sunt hiporeactive in cazul pacienţilor paraplegici.
Cu toate că nu a existat o analiză paraclinică amănunţită posttransplant a acestor celule,
rolul lor nu poate fi contestat, rezultatul clinic este elocvent, fiind o metodă fezabilă de tratament
a escarelor puţin complicate. Monitorizarea paraclinică, deşi posibilă în aceste cazuri (e.g.
biopsie, marcare a celulelor) nu a fost aplicată din dorinţa de a manipula cât mai puţin aceste
celule, fapt ce s-ar putea exercita asupra comportamentului lor.
În concluzie, utilizarea MSC ca terapie a escarelor de decubit reprezintă o metodă demnă
de investigat pe viitor, putând fi o alternativă mai eficientă vis-a-vis de raportul cost/beneficiu,
raportându-se la metodele conservatoare sau chirurgicale.
Menţiuni
195
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
CONCLUZII
CONCLUZII
2. S-a dorit ca acest model terapeutic să fie aplicat pe viitor pentru tratamentul fistulelor
digestive.
3. Utilizarea MSC s-a realizat prin constituirea unui patch 3D, compus din două straturi
fibrilare, perete arterial decelularizat şi un burete de colagen special realizat ce a servit ca
ţesut de acomodare pentru MSC.
4. Patch-ul realizat a fost utilizat pentru acoperirea defectelor digestive realizate pe şobolani,
precum şi pentru accelerarea regenerării tisulare a escarelor a doi pacienţi cu afecţiuni
neurologice.
5. Matricea colagenică extrasă din tendon bovin, utilizată pentru acomodarea MSC, s-a
dovedit a fi de o puritate înaltă, non-imunogenă, morfologic şi chimic similară colagenului
nativ, cu o porozitate ce a facilitat grefarea şi migrarea celulelor stem fără a afecta
viabilitatea acestora.
8. Protocolul de selecţie a MSC umane cu kit-ul RossetSep, a favorizat obţinerea unor culturi
primare pure, omogene, cu o viabilitate de peste 95%.
9. Celulele obţinute din ambele surse au fost testate prin flow-citometrie de flux pentru
prezenţa marker-ilor caracteristici MSC precum şi prin teste de diferenţiere, confirmând
că sunt MSC.
10. Testarea sterilităţii patch-urilor prin metoda MCPC, a confirmat sterilitatea acestora,
constituind un instrument rapid şi eficient în testarea bacteriologică.
11. Rezultatele clinice în cazul lotului MSC pozitiv au fost favorabile, subiecţii prezentând
regenerarea defectului realizat.
12. Paraclinic s-a evidenţiat prezenta MSC în ţesutul regenerat, provenit de la aceşti subiecţi.
13. Histologic s-a observat că MSC au contribuit la regenerarea tuturor celor 4 straturi ale
peretelui digestiv.
14. Exceptând regenerarea mucoasei (de tip pluristratificat keratinizat), celelalte trei straturi
digestive au prezentat morfologie normală în cazul lotului MSC pozitiv.
15. În cazul lotului control regenerarea a fost defectuoasă în lipsa MSC, predominând
defectele prin lipsa de substanţă şi cele pseudodiverticulare.
196
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv PARTEA SPECIALĂ
CONCLUZII
18. Patch-ul realizat poate constitui o metodă de tratament a pacienţilor cu fistule atent
selecţionaţi, însă pentru moment mai sunt necesare studii de aprofundare.
19. Utilizarea patch-ului la cei doi pacienţi a condus la vindecarea escarelor trenante, cu
obţinerea unor cicatrici de bună calitate.
20. În cazul pacientului diagnosticat cu scleroză multiplă, s-a constatat o evoluţie progresivă,
favorabilă soldată cu remisia disfuncţiei motorii.
21. Deşi nu există o legătură dovedită între rezultatul neurologic şi MSC, rolul acestora de
imunomodulatori poate susţine rezultatul.
22. MSC constituie o alternativă demnă de investigat pe viitor pentru tratamentul escarelor şi
al sclerozei multiple.
197
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv ANEXE
Anexa I
Anexa I
Protocoalele descrise de Pittenger pentru placarea directă şi izolarea în gradient de densitate a MSC.
(Pittenger 2008)
Reactivi utilizaţi.
1. Tripsină/EDTA: 0.05% tripsină/0.23 mM EDTA
2. Tampon fosfat salin Dulbecco (D-PBS)
3. Gradient de densitate Ficoll sau Percoll 1.073 g/ml
4. Mediu de cultură pentru MSC cu 10% FBS şi antibiotic: 445 ml DMEM cu nivel scăzut de glucoză + 50
ml FCS (stimulator de creştere) pentru MSC + 5 ml amestec antibiotic/antimicotic
198
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv ANEXE
Anexa II
Anexa II
Izolarea şi cultivarea MSC din ţesut adipos solid şi lipoaspirat. (Dubois 2008)
Prelucrarea lipoaspiratului.
1. Se adaugă circa 35 de ml de lipoaspirat în câte un 2. Se adaugă un volum de 70 ml de
flask de 225 cm2, peste care se adaugă în volum colagenază caldă în flask; se incubează pe
egal de PBS cald. Se agită bine şi se lasă să se baie de apa 60 de minute la 37ºC sub
separe fazele pentru 3-5 minute. Se îndepărtează agitaţie continuă.
infranatantul şi se repetă spălarea până se obţine
un infranatant clar.
3. După digestie, probele se centrifughează 5 minute 4. Se îndepărtează stratul lipidic şi cel de
la 300 g la temperatura camerei. După centrifugare colagenază ce acoperă peletul celular,
probele se agită manual şi se recentrifughează. care se resuspendă în 10 ml PBS cald cu
1% BSA şi se transferă în tuburi conice
de 50 ml care se centrifughează la 300 g 5
minute la temperatura camerei.
5. Se resuspendă celulele în 10 µl mediu stromal şi se 6. Se resuspendă celulele în 10 µl mediu
centrifughează la 300 g 5 minute la temperatura stromal şi se însămânţează în flask-uri de
camerei. 225 cm2 (2.5 ml de suspensie celulară +
37,5 ml mediu stromal în fiecare flask).
Se incubează în mediu umidificat cu 5%
CO2 la 37ºCelsius, timp de 3 zile.
7. Mediul se îndepărtează după 2 zile; cultura se 8. Mediul se schimbă la fiecare 3 zile până
spală cu PBS cald; se îndepărtează PBS-ul şi se se atinge confluenţa de 80-90%
adaugă mediu stromal la capacitatea iniţială.
9. Pentru recoltare, mediul din godeuri este 10. Se transferă conţinutul flask-ului în tuburi
îndepărtat; cultura se spală cu 10 ml PBS; se de 50 ml şi se centrifughează la 300 g 5
îndepărtează PBS-ul şi se adaugă 10 ml soluţie de minute; se resuspendă celulele în 2 ml
tripsină-EDTA 0,5%; se incubează 5-10 minute; se mediu stromal.
adaugă 10ml de mediu stromal când s-au detaşat
199
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv ANEXE
Anexa II
200
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv ANEXE
Anexa III
Anexa III
Protocoalele de cultură în Cell Factory a MSC. (Wolfe 2008)
Reactivi utilizaţi.
1. αMEM cu L-glutamină, fără ribonucleozide şi deoxiribonucleozide
2. Ser fetal bovin (FBS)
3. L-glutamină, 200 mM
4. Penicilina G (10000 UI/ml) şi streptomicină sulfat (10000 µg/ml) în soluţie de NaCl 0.85%
5. Ficoll-Paque
6. Tampon fosfat salin (PBS), fără Ca++ şi Mg++, ph 7.4
7. Tripsină (0.25%) - EDTA.4NA (0.38 g/L) în HBSS
8. Albastru Trypan 0.4 %
9. Hank’s balanced Salt Solution (HBSS) w/o Ca++ şi Mg++
Mediu de cultură CCM (complete culture medium): 500 ml αMEM, 100 ml FSB (concentraţie finală
aprox. 16.5%), 6 ml L-glutamină (concentraţie finală 2 mM) şi 6 ml penicilină G şi streptomicină sulfat
(concentraţie finala 100 UI/ml penicilină şi 100 µg/ml streptomicină). Se sterilizează prin filtrare la 0.22
µ.
Protocol de izolare (din aspirat medular) şi cultură a MSC umane în Cell Factory.
1. Aspiratul medular recoltat este stocat în eprubete 2. Conţinutul fiecărei eprubete este
Vacutainer de 10 ml anticoagulate cu heparină transferat într-un flacon conic de 50 ml
sodică ce conţin 3 ml de αMEM. Se stochează la şi diluat cu 1xHBSS, până la un volum
gheaţă pe durata transportului. total de cca 15 ml.
3. Fiecare Vacutainer este clătit de două ori cu câte 5 4. Pentru fiecare tub conic cu aspirat se va
ml 1 x HBSS, iar lichidul obţinut se amestecă cu pregăti un tub conic de 50 ml ce conţine
aspiratul diluat. 10 ml de Ficoll (interfaţa de separare) la
temperatura camerei.
5. Cu grijă, se aşează aspiratul peste stratul de Ficoll. 6. Se centrifughează 30 de minute la 1800
g cu sistemul de frânare oprit (dacă
sistemul de frânare nu este oprit,
decelerarea brusca va amesteca
conţinutul separat).
7. După centrifugare, se colectează stratul de celule de 8. Se diluează fiecare tub cu 1 x HBSS,
la interfaţa Ficoll-HBSS, şi se transferă într-un tub până la un volum de 25 ml (raţie de 3:1,
conic de 50 ml. Se va aspira în cantităţi mici pentru volum diluant:volum probă), şi se
a nu transfera şi Ficoll-ul. amestecă prin întoarcere de circa 3-5
ori.
9. Se centrifughează 10 minute la 1000 g cu frâna 10. Se îndepărtează supernatantul, iar
oprită. celulele se resuspendă în 30 ml CCM
preîncălzit.
11. Se transferă celulele în flask-uri de 15 sau 175 cm2 12. Se incubează celulele la 37ºC şi
atmosferă umedă cu 5% CO2, timp de
18-24 ore, pentru aderare.
13. După 24 ore se îndepărtează mediul de cultură şi 14. Se spală celulele de 3 ori cu 10 ml de 1
celulele neaderente prin aspirare. Dacă se întârzie, x PBS preîncălzit.
celule stem hematopoietice aderă şi contaminează
cultura.
15. Se adăugă 30 ml CCM proaspăt în fiecare flask şi se 16. Dacă celulele vor fi expansionate în
incubează la 37ºC şi atmosfera umeda cu 5% CO2, Cell Factory, aceasta trebuie pregătită
timp 5-10 zile. Se examinează cultura zilnic la cu 48 de ore înainte de transfer. Se
microscop. Se schimbă mediul la fiecare 3 zile, se condiţionează prin incubare 48 de ore la
spală cultura cu 10 ml de 1 x PBS preîncălzit care se 37ºC şi atmosferă umedă cu 5% CO2.
arunca şi se adăugă alţi 30 ml CCM. Se continuă
până ce se atinge confluenţa de 60-80%. Nu se va
obţine confluenţă 100%, deoarece alterează
fenotipul.
17. În vederea transferului, se îndepărtează mediul de 18. După ce 80-90% din celulele aderente
cultură şi se clăteşte flask-ul cu 30 ml PBS care se s-au detaşat, flask-ul se agită uşor
arunca. Se adăugă 10 ml de soluţie de Tripsina- pentru recuperarea celulelor restante. Se
201
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv ANEXE
Anexa III
202
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv ANEXE
Anexa III
În sistemul închis, condiţiile de cultură sunt similare celor din sistemul deschis. Diferenţa o face faptul că
toate manevrele de schimbare a mediului se fac conectând şi sigilând la modul pungi preumplute (cu substanţele
necesare) sau de evacuare, astfel încât se limitează contactul culturii cu exteriorul.
203
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv ANEXE
Anexa III
204
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv ANEXE
Anexa IV
Dilated Cardiomyopathy 2 studies
Disorders of Environmental Origin 7 studies
Anexa IV Dry Eye Syndromes 1 study
Dyslipidemias 1 study
Embolism 1 study
Gama de afecţiuni pentru care sunt citate trial-uri Embolism and Thrombosis 1 study
ce utilizează MSC pe http://www.clinicaltrial.gov. Emphysema 1 study
Endocrine System Diseases 11 studies
(Health 2010) Epidermolysis Bullosa 1 study
Erectile Dysfunction 1 study
Acute Disease 1 study Eye Diseases 1 study
Acute Lymphoblastic Leukemia 5 studies Fibrosis 6 studies
Acute Myelocytic Leukemia 4 studies Fistula 1 study
Acute Myeloid Leukemia, Adult 4 studies Follicular Lymphoma 2 studies
Acute Non Lymphoblastic Leukemia 4 studies Foot Ulcer 3 studies
Amyotrophic Lateral Sclerosis 2 studies Fractures, Bone 3 studies
Anemia 2 studies Fractures, Open 1 study
Anemia, Refractory 1 study Fractures, Ununited 1 study
Anemia, Refractory, with Excess of Blasts 1 study Ganglion Cysts 2 studies
Ankylosis 1 study Gastroenteritis 5 studies
Arterial Occlusive Diseases 4 studies Gastrointestinal Diseases 7 studies
Arteriosclerosis 3 studies Genetic Diseases, Inborn 5 studies
Arthritis 7 studies Genital Diseases, Male 1 study
Arthritis, Rheumatoid 1 study Genital Neoplasms, Male 1 study
Atherosclerosis 1 study Gestational Trophoblastic Disease 1 study
Atrophy 1 study Gestational Trophoblastic Neoplasms 1 study
Autoimmune Diseases 12 studies Glomerulonephritis 1 study
Autoimmune Diseases of the Nervous System 4 studies Glucose Metabolism Disorders 8 studies
B-cell Lymphomas 2 studies Graft vs Host Disease 15 studies
Basal Ganglia Diseases 2 studies Heart Diseases 17 studies
Blast Crisis 2 studies Heart Failure 7 studies
Blood Coagulation Disorders 1 study Hematologic Diseases 6 studies
Blood Protein Disorders 1 study Hematologic Neoplasms 2 studies
Bone Cancer 2 studies Hemorrhagic Disorders 1 study
Bone Diseases 9 studies Hemostatic Disorders 1 study
Bone Diseases, Developmental 2 studies Hepatic Insufficiency 2 studies
Bone Diseases, Metabolic 1 study Hodgkin Disease 3 studies
Bone Marrow Diseases 5 studies Hodgkin Lymphoma 3 studies
Bone Neoplasms 2 studies Homologous Wasting Disease 15 studies
Brain Diseases 4 studies Hypercholesterolemia 1 study
Brain Infarction 2 studies Hyperlipidemias 1 study
Brain Ischemia 2 studies Hyperlipoproteinemia Type 2 1 study
Breast Neoplasms 2 studies Hyperlipoproteinemia Type II 1 study
Bronchial Diseases 1 study Hyperlipoproteinemias 1 study
Bronchitis 1 study Hypertension 1 study
Bronchitis, Chronic 1 study Idiopathic Dilated Cardiomyopathy 1 study
Burkitt Lymphoma 2 studies Immunoproliferative Disorders 3 studies
Burns 1 study Infarction 10 studies
Cardiomegaly 2 studies Inflammation 1 study
Cardiomyopathies 3 studies Inflammatory Bowel Diseases 5 studies
Cardiomyopathy, Dilated 2 studies Insulin Resistance 1 study
Cartilage Diseases 2 studies Intestinal Diseases 6 studies
Central Nervous System Diseases 8 studies Ischemia 17 studies
Cerebral Infarction 2 studies Joint Diseases 9 studies
Cerebrovascular Disorders 2 studies Kidney Diseases 2 studies
Chronic Disease 1 study Lacrimal Apparatus Diseases 1 study
Chronic Lymphocytic Leukemia 3 studies Late Acute Graft Versus Host Disease 15 studies
Chronic Myeloid Leukemia 3 studies Leg Injuries 2 studies
Chronic Myelomonocytic Leukemia 2 studies Leg Ulcer 4 studies
Chronic Neutrophilic Leukemia 2 studies Leukemia 7 studies
Collagen Diseases 2 studies Leukemia, B-Cell 1 study
Congenital Abnormalities 4 studies Leukemia, B-cell, Chronic 2 studies
Connective Tissue Diseases 7 studies Leukemia, Lymphocytic, Chronic, B-Cell 3 studies
Coronary Artery Disease 3 studies Leukemia, Lymphoid 5 studies
Coronary Disease 3 studies Leukemia, Myelogenous, Chronic, BCR-ABL Positive 4 studies
Crohn Disease 5 studies Leukemia, Myeloid 5 studies
Degenerative Motor System Disease 2 studies Leukemia, Myeloid, Accelerated Phase 3 studies
Demyelinating Autoimmune Diseases, CNS 4 studies Leukemia, Myeloid, Acute 5 studies
Demyelinating Diseases 4 studies Leukemia, Myeloid, Chronic, Atypical, BCR-ABL Negative 2
Depression 1 study studies
Depressive Disorder 1 study Leukemia, Myeloid, Chronic-Phase 3 studies
Diabetes Complications 3 studies Leukemia, Myelomonocytic, Chronic 2 studies
Diabetes Mellitus 11 studies Leukemia, Neutrophilic, Chronic 2 studies
Diabetes Mellitus, Type 1 5 studies Lipid Metabolism Disorders 1 study
Diabetes Mellitus, Type 2 2 studies Lipid Metabolism, Inborn Errors 1 study
Diabetic Angiopathies 3 studies Liver Cirrhosis 6 studies
Diabetic Foot 3 studies Liver Diseases 7 studies
Diabetic Neuropathies 3 studies Liver Failure 2 studies
Diffuse Scleroderma 1 study Lung Diseases 1 study
Digestive System Diseases 14 studies Lung Diseases, Obstructive 1 study
205
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv ANEXE
Anexa IV
Lupus Erythematosus, Systemic 2 studies Parkinson Disease 1 study
Lupus Nephritis 2 studies Parkinsonian Disorders 1 study
Lymphatic Diseases 3 studies Pathological Conditions, Anatomical 3 studies
Lymphoblastic Lymphoma 2 studies Periodontal Diseases 1 study
Lymphoma 4 studies Periodontitis 1 study
Lymphoma, B-Cell 2 studies Peripheral Vascular Diseases 1 study
Lymphoma, B-Cell, Marginal Zone 2 studies Phlebitis 1 study
Lymphoma, Follicular 2 studies Postphlebitic Syndrome 1 study
Lymphoma, Large B-Cell, Diffuse 2 studies Postthrombotic Syndrome 1 study
Lymphoma, Large-cell 2 studies Precancerous Conditions 4 studies
Lymphoma, Large-Cell, Immunoblastic 2 studies Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma 5 studies
Lymphoma, Mantle-Cell 2 studies Preleukemia 6 studies
Lymphoma, Non-Hodgkin 3 studies Prostatic Diseases 1 study
Lymphoma, Small Cleaved-cell, Diffuse 2 studies Prostatic Neoplasms 2 studies
Lymphoproliferative Disorders 3 studies Pseudarthrosis 1 study
Mantle Cell Lymphoma 2 studies Pulmonary Disease, Chronic Obstructive 1 study
Menopause 1 study Pulmonary Emphysema 1 study
Mental Disorders 1 study Quality of Life 1 study
Metabolic Diseases 9 studies Recurrence 3 studies
Metabolism, Inborn Errors 1 study Respiration Disorders 1 study
Motor Neuron Disease 2 studies Respiratory Tract Diseases 1 study
Mouth Diseases 2 studies Respiratory Tract Infections 1 study
Movement Disorders 2 studies Rheumatic Diseases 7 studies
Multiple Myeloma 3 studies Salivary Gland Diseases 2 studies
Multiple Sclerosis 4 studies Scleroderma, Diffuse 1 study
Multiple Sclerosis, Chronic Progressive 2 studies Scleroderma, Systemic 1 study
Multiple Sclerosis, Relapsing-Remitting 1 study Sclerosis 7 studies
Multiple System Atrophy 1 study Sepsis 1 study
Multiple Trauma 1 study Sexual Dysfunction, Physiological 1 study
Musculoskeletal Diseases 17 studies Sexual Dysfunctions, Psychological 1 study
Myelodysplastic Syndromes 6 studies Shock 1 study
Myelofibrosis 2 studies Sideroblastic Anemia Pyridoxine-refractory Autosomal Recessive
Myeloid Metaplasia 2 studies 1 study
Myeloproliferative Disorders 3 studies Sjogren's Syndrome 1 study
Myocardial Infarction 8 studies Skin Abnormalities 1 study
Myocardial Ischemia 12 studies Skin Diseases 6 studies
Necrosis 9 studies Skin Diseases, Genetic 1 study
Neonatal Hemochromatosis 3 studies Skin Diseases, Vesiculobullous 1 study
Neoplasm Metastasis 9 studies Skin Ulcer 4 studies
Neoplasms, Germ Cell and Embryonal 2 studies Spinal Cord Diseases 4 studies
Neoplasms, Glandular and Epithelial 2 studies Spinal Cord Injuries 2 studies
Neoplasms, Plasma Cell 3 studies Stomatognathic Diseases 2 studies
Nephritis 2 studies Stroke 2 studies
Neuritis 1 study Systemic Inflammatory Response Syndrome 1 study
Neuroblastoma 2 studies Testicular Cancer 2 studies
Neurodegenerative Diseases 4 studies Testicular Neoplasms 2 studies
Neuroectodermal Tumors 3 studies Thrombosis 1 study
Neuroectodermal Tumors, Primitive 3 studies Tibial Fractures 2 studies
Neuroectodermal Tumors, Primitive, Peripheral 3 studies Trauma, Nervous System 2 studies
Neuroepithelioma 3 studies Trophoblastic Neoplasms 1 study
Neuromuscular Diseases 2 studies Ulcer 4 studies
Optic Neuritis 1 study Urogenital Neoplasms 2 studies
Osteoarthritis 6 studies Urologic Diseases 2 studies
Osteochondritis 1 study Varicose Ulcer 1 study
Osteochondritis Dissecans 1 study Varicose Veins 1 study
Osteochondrodysplasias 2 studies Vascular Diseases 19 studies
Osteogenesis Imperfecta 3 studies Venous Insufficiency 1 study
Osteonecrosis 4 studies Venous Thrombosis 1 study
Osteoporosis 1 study Ventricular Dysfunction 4 studies
Osteoporosis, Postmenopausal 1 study Ventricular Dysfunction, Left 4 studies
Ovarian Epithelial Cancer 2 studies Wounds and Injuries 7 studies
Paraproteinemias 1 study Xerostomia 1 stud
206
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv ANEXE
Anexa V
Anexa V
Protocol anestezic pentru şobolani de laborator.
* perioada de latenţă – 3-8 minute minute după administrarea complexului anestezic ketamină/ xylazină
Medicamentaţie Ruta de
administrare
Halotan (Narcotan®, Zentiva As) sau sevofluran (Sevorane®, Abbott Laboratories INHALATOR
LTD.) 4-5 % + O2 4 L/min. timp de 2-3 minute
Atropină (Sulfat de atropină® 1mg/ ml, Biofarm S.A.) 0.1 mg SUBCUTANAT
Ketamină (Ketamine Panapharma® 250mg/5ml, Panapharma) 80 mg/kg corp INTRAMUSCULAR
Xylazină (Xyla® 20 mg/ml, Phoenix Pharmaceutical) 7mg/kg corp INTRAMUSCULAR
Soluţie salină (Ser fiziologic® 0.9 %, Sicomed), glucoză (Glucoza 5%, Sicomed), sau SUBCUTANAT
Voluven® (Fresenius Kabi Gmbh) cald (37ºC) 2.5 ml/subiect
207
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv BIBLIOGRAFIE
Benayahu D. [et al.] Bone marrow-derived stromal cell line expressing osteoblastic
phenotype in vitro and osteogenic capacity in vivo [Journal] // J.Cell Physiol. - 1989. - Vol.
208
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv BIBLIOGRAFIE
Colter D. C. [et al.] Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent Edwards RG Steptoe PC, Purdy JM Establishing full-term human pregnancies using
cells from human bone marrow. [Journal] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2000. - Vol. 97. - cleaving embryos grown in vitro. [Journal] // Rr J Obstet Gynaecol.. - 1980. - pp. 87(9):737-
pp. 3213-3218. 56.
Colter D. C., Sekiya I. and Prockop D. J. Identification of a subpopulation of rapidly self- EGE (European Group on Ethics in Science and New Technologies), Ethical aspects of
renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. human stem cells research and use; Reference: Initiative of the Group; Rapporteurs: Anne
[Journal] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2001. - Vol. 98. - pp. 7841-7845. McLaren and Göran Hermerén, 14 Nov. 2000
Conboy IM Rando TA. Aging, stem cells and tissue regeneration: lessons from muscle. Egusa Hiroshi [et al.] Neuronal differentiation of bone marrow-derived stromal stem cells
[Journal] // Cell Cycle. 2005 Mar;4(3):407-10. Epub 2005 Mar 7. - 2005 Mar;. - pp. 4(3):407- involves suppression of discordant phenotypes through gene silencing. [Journal] // J Biol
10. Chem. - 2005. - Vol. 280. - pp. 23691-23697.
Cong Z. [et al.] Repairing segmental bone defects with living porous ceramic cylinders: an Eliopoulos N [et al.] Allogeneic marrow stromal cells are immune rejected by MHC class I-
experimental study in dog femora [Journal] // J.Biomed.Mater.Res. - 2001. - Vol. 55. - pp. and class II-mismatched recipient mice [Journal] // Blood. - 12 15, 2005. - Vol. 106. - pp.
28-32. 4057-4065.
Corcione A [et al.] Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions [Journal] // Enomoto-Iwamoto Motomi [et al.] The Wnt antagonist Frzb-1 regulates chondrocyte
Blood. - 01 01, 2006. - Vol. 107. - pp. 367-372. maturation and long bone development during limb skeletogenesis. [Journal] // Dev Biol. -
Craciunescu O. Balan M., Gaspar A., Stefan L., Moldovan L, Preparation and 2002. - Vol. 251. - pp. 142-156.
characterization of porous collagen-agarose sponges for skin repair, [Journal] // Romanian Episkopou V. SOX2 functions in adult neural stem cells [Journal] // Trends Neurosci. -
Biological Sciences,. - 2007. - pp. V, 1-2, 29-30. 2005. - Vol. 28. - pp. 219-221.
Craciunescu [et al.] The characterization and in vitro testing of a dermal shield containing Evans M. J. and Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from
soluble elastin. [Journal] // Rev Roum Biol. - 2004. - pp. 2, 105-111. mouse embryos. [Journal] // Nature. - 1981. - pp. 292:154-156.
da Silva Meirelles L, Caplan A I and Nardi N B In search of the in vivo identity of Evans GS [et al.] The development of a method for the preparation of rat intestinal epithelial
mesenchymal stem cells [Journal] // Stem Cells. - 09 0, 2008. - Vol. 26. - pp. 2287-2299. cell primary cultures. J Cell Sci 1992; 101:219-231.
da Silva Meirelles L, Chagastelles P C and Nardi N B Mesenchymal stem cells reside in Falanga,V. [et al.] Autologous bone marrow-derived cultured mesenchymal stem cells
virtually all post-natal organs and tissues [Journal] // J Cell Sci. - 06 01, 2006. - Vol. 119. - delivered in a fibrin spray accelerate healing in murine and human cutaneous wounds.
pp. 2204-2213. [Journal] // Tissue Eng. - 2007/06//. - Vol. 13. - pp. 1299- 1312.
Daar A S [et al.] Stem cell research and transplantation: science leading ethics [Journal] // Fearon E R and Vogelstein B A genetic model for colorectal tumorigenesis [Journal] //
Transplant Proc. - 10 0, 2004. - Vol. 36. - pp. 2504-2506. Cell. - 06 01, 1990. - Vol. 61. - pp. 759-767.
Daley G Q and Scadden D T Prospects for stem cell-based therapy [Journal] // Cell. - 02 22, Feng Z [et al.] Investigation on the mechanical proprieties of contracted collagen gels as a
2008. - Vol. 132. - pp. 544-548. scaffold for tissue engineering. Artif Organs 2003; 27:84-91.
Dazzi Francesco [et al.] The role of mesenchymal stem cells in haemopoiesis. [Journal] // Fernández M Simon V, Herrera G, Cao C, Del Favero H, Minguell JJ. Detection of
Blood Rev. - 2006. - Vol. 20. - pp. 161-171. stromal cells in peripheral blood progenitor cell collections from breast cancer patients.
de Bari Cosimo [et al.] Skeletal muscle repair by adult human mesenchymal stem cells from [Journal] // Bone Marrow Transplant. - 1997. - Vol. 20. - pp. 265-271.
synovial membrane. [Journal] // J Cell Biol. - 2003. - Vol. 160. - pp. 909-918. Fibbe Willem E and Noort Willy A Mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cell
de Becker A [et al.] Migration of culture-expanded human mesenchymal stem cells through transplantation. [Journal] // Ann N Y Acad Sci. - 2003. - Vol. 996. - pp. 235-244.
bone marrow endothelium is regulated by matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of Foster K [et al.] Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult
metalloproteinase-3 [Journal] // Haematologica. - 04 0, 2007. - Vol. 92. - pp. 440-449. thymus [Journal] // J Immunol. - 03 01, 2008. - Vol. 180. - pp. 3183-3189.
de Bont E S [et al.] Mobilized human CD34+ hematopoietic stem cells enhance tumor Fraidenraich D et al. Rescue of cardiac defects in id knockout embryos by injection of
growth in a nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mouse model of human embryonic stem cells. [Journal] // Science. - 2004. - pp. 306(5694):247-52.
non-Hodgkin's lymphoma [Journal] // Cancer Res. - 10 15, 2001. - Vol. 61. - pp. 7654-7659. Francois S [et al.] Local irradiation not only induces homing of human mesenchymal stem
de Bruijn JD van den Brink I, Mendes S, Dekker R, Bovell YP, van Blitterswijk CA. cells at exposed sites but promotes their widespread engraftment to multiple organs: a study
Bone induction by implants coated with cultured osteogenic bone marrow cells. [Journal] // of their quantitative distribution after irradiation damage [Journal] // Stem Cells. - 04 0,
Adv Dent Res.. - 1999 Jun;. - pp. 13:74-81. 2006. - Vol. 24. - pp. 1020-1029.
de Coppi P [et al.] Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy [Journal] // Francois S [et al.] Human mesenchymal stem cells favour healing of the cutaneous radiation
Nat Biotechnol. - 01 0, 2007. - Vol. 25. - pp. 100-106. syndrome in a xenogenic transplant model. [Journal] // Ann Hematol. - 01, 2007. - Vol. 86. -
de la Fuente SG [et al.] Evaluation of porcine-derived small intestine submucosa as a pp. 1-8.
biodegradable graft for gastrointestinal healing. J Gastrointest Surg 2003; 7:96-101. Frangioni J V and Hajjar R J In vivo tracking of stem cells for clinical trials in
Dellavalle A. [et al.] Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct cardiovascular disease [Journal] // Circulation. - 11 23, 2004. - Vol. 110. - pp. 3378-3383.
from satellite cells [Journal] // Nat.Cell Biol. - 2007. - Vol. 9. - pp. 255-267. Frank S A and Nowak M A Cell biology: Developmental predisposition to cancer
Demirbilek S [et al.] Using porcine small intestinal submucoasa in intestinal regeneration. [Journal] // Nature. - 04 03, 2003. - Vol. 422. - pp. 494-145.
Pediatr. Surg. Int. 2003; 19:588. Freyman T [et al.] A quantitative, randomized study evaluating three methods of
Dennis J and Caplan, AI Bone morrow mesenchymal stem cell. [Book Section] // stem cell mesenchymal stem cell delivery following myocardial infarction [Journal] // Eur Heart J. - 05
handbook / book auth. Stewart Sell. - Totowa, NJ : Humana Press Inc., 2004. 0, 2006. - Vol. 27. - pp. 1114-1122.
Dennis J E [et al.] A quadripotential mesenchymal progenitor cell isolated from the marrow Friedenstein A. J., Gorskaja J. F. and Kulagina N. N. Fibroblast precursors in normal and
of an adult mouse [Journal] // J.Bone Miner.Res. - 05 0, 1999. - Vol. 14. - pp. 700-709. irradiated mouse hematopoietic organs. [Journal] // Exp Hematol. - 1976. - Vol. 4. - pp. 267-
Dennis J E [et al.] The STRO-1+ marrow cell population is multipotential [Journal] // Cells 274.
Tissues.Organs. - 0 0, 2002. - Vol. 170. - pp. 73-82. Friedenstein A.J., Chailakhjan R.K. and Lalykina K.S. The development of fibroblast
Dennis J E and Charbord P Origin and differentiation of human and murine stroma colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells [Journal] // Cell
[Journal] // Stem Cells. - 0 0, 2002. - Vol. 20. - pp. 205-214. Tissue Kinet. - 1970. - Vol. 3. - pp. 393-403.
Dennis J E and Caplan A I Differentiation potential of conditionally immortalized Fu X [et al.] Enhanced wound-healing quality with bone marrow mesenchymal stem cells
mesenchymal progenitor cells from adult marrow of a H-2Kb-tsA58 transgenic mouse autografting after skin injury. Wound Rep Reg 2006; 14:325-335.
[Journal] // J.Cell Physiol. - 06 0, 1996. - Vol. 167. - pp. 523-538. Galmiche MC et al. Stromal cells from human long-term marrow cultures are mesenchymal
Department of Health and Human Services. Stem Cells: Scientific Progress and Future cells that differentiate following a vascular smooth muscle differentiation pathway.
Research Directions. [Report] : [Journal] // Blood. - 1993. - pp. 82:66-76.
http://stemcells.nih.gov/staticresources/info/scireport/PDFs/appendixe.pdf. - 2001. García-Olmo D [et al.] A phase I clinical trial of the treatment of Crohn's fistula by adipose
Deryugina EI Müller-Sieburg CE. Stromal cells in long-term cultures: keys to the mesenchymal stem cell transplantation. Dis Colon Rectum 2005; 48:1416-1423.
elucidation of hematopoietic development? [Journal] // Crit Rev Immunol.. - 1993;. - pp. Gardner RL Mouse chimeras obtained by the injection of cells into the blastocyst.
13(2):115-50. [Journal] // Nature. - 1968. - pp. 220(5167):596-7.
Devine S. M. and Hoffman R. Role of mesenchymal stem cells in hematopoietic stem cell Gasbarrini A [et al.] Rescue therapy by portal infusion of autologous stem cells in a case of
transplantation. [Journal] // Curr Opin Hematol. - 2000. - Vol. 7. - pp. 358-363. drug-induced hepatitis [Journal] // Dig.Liver Dis. - 09 0, 2007. - Vol. 39. - pp. 878-882.
Dexter T M, Allen T D and Lajtha L G Conditions controlling the proliferation of Gelovani Juri Noninvasive imaging in stem cell therapies. Curent state and future
haemopoietic stem cells in vitro [Journal] // J.Cell Physiol. - 06 0, 1977. - Vol. 91. - pp. 335- perspectives. [Book Section] // Stem Cells Handbook / book auth. Sell S. - Totowa, NJ :
344. Humana Press Inc., 2004.
Dexter TM Stromal cell associated haemopoiesis. [Journal] // J Cell Physiol Suppl. - 1982. - Giacomini M, Baylis F and Robert J Banking on it: public policy and the ethics of stem
pp. ;1:87-94. cell research and development [Journal] // Soc Sci Med. - 10 0, 2007. - Vol. 65. - pp. 1490-
Dezawa M Ishikawa H, Itokazu Y, Yoshihara T, Hoshino M, Takeda S, Ide C, 1500.
Nabeshima Y. Bone marrow stromal cells generate muscle cells and repair muscle Gleiberman AS Michurina T Genetic approaches identify adult pituitary stem cells. - 0 0,
degeneration. [Journal] // Science.. - 2005 Jul 8;. - pp. 309(5732):314-7. 2008. - pp. 6332-6337.
Dezawa M. [et al.] Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro Glennie Sarah [et al.] Bone marrow mesenchymal stem cells induce division arrest anergy
differentiated bone-marrow stromal cells [Journal] // Eur.J.Neurosci. - 2001. - Vol. 14. - pp. of activated T cells. [Journal] // Blood. - 2005. - Vol. 105. - pp. 2821-2827.
1771-1776. Goetz M [et al.] In vivo confocal laser endomicroscopy of the human liver: a novel method
di Nicola M [et al.] Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation for assessing liver microarchitecture in real time [Journal] // Endoscopy. - 07 0, 2008. - Vol.
induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli [Journal] // Blood. - 05 15, 2002. - Vol. 40. - pp. 554-562.
99. - pp. 3838-3843. Goldman R. Spector D. Live cell imaging. A laboratory manual [Book]. - Cold Spring
Dimos JT et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be Harbour, NY : Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2005.
differentiated into motor neurons. [Journal] // Science. - 2008. - pp. 21(5893):1218-21. Gordon E M [et al.] Capture and expansion of bone marrow-derived mesenchymal
D'Ippolito Gianluca [et al.] Marrow-isolated adult multilineage inducible (MIAMI) cells, a progenitor cells with a transforming growth factor-beta1-von Willebrand's factor fusion
unique population of postnatal young and old human cells with extensive expansion and protein for retrovirus-mediated delivery of coagulation factor IX [Journal] // Hum.Gene
differentiation potential [Journal] // J Cell Sci. - 06 0, 2004. - Vol. 117. - pp. 2971-2981. Ther. - 07 20, 1997. - Vol. 8. - pp. 1385-1394.
Direkze N C [et al.] Bone marrow contribution to tumor-associated myofibroblasts and Graham V. [et al.] SOX2 functions to maintain neural progenitor identity [Journal] //
fibroblasts [Journal] // Cancer Res. - 12 01, 2004. - Vol. 64. - pp. 8492-8495. Neuron. - 2003. - Vol. 39. - pp. 749-765.
Djouad Farida [et al.] Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor Greco S J and Rameshwar P Microenvironmental considerations in the application of
growth in allogeneic animals. [Journal] // Blood. - 2003. - Vol. 102. - pp. 3837-3844. human mesenchymal stem cells in regenerative therapies [Journal] // Biologics. - 12 0,
Doherty MJ et al. Vascular pericytes express osteogenic potential in vitro and in vivo. 2008. - Vol. 2. - pp. 699-705.
[Journal] // J Bone Miner Res. - 1998. - pp. 13:828-838. Gregory Carl A [et al.] The Wnt signaling inhibitor dickkopf-1 is required for reentry into
Dominici M. [et al.] Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. the cell cycle of human adult stem cells from bone marrow. [Journal] // J Biol Chem. -
The International Society for Cellular Therapy position statement [Journal] // Cytotherapy. - 2003. - Vol. 278. - pp. 28067-28078.
2006. - Vol. 8. - pp. 315-317. Grinnemo K H [et al.] Xenoreactivity and engraftment of human mesenchymal stem cells
Dounchis J S [et al.] Cartilage repair with autogenic perichondrium cell and polylactic acid transplanted into infarcted rat myocardium [Journal] // J Thorac Cardiovasc Surg. - 05 0,
grafts [Journal] // Clin.Orthop.Relat Res. - 08 0, 2000. - pp. 248-264. 2004. - Vol. 127. - pp. 1293-1300.
Doyonnas [et al.] What is the future for stem cell research. [Book Section] // Stem Cell Groh M E [et al.] Human mesenchymal stem cells require monocyte-mediated activation to
Handbook. / book auth. S.Sell. - Totowa, NJ : Humana Press Inc., 2004. suppress alloreactive T cells [Journal] // Exp.Hematol. - 08 0, 2005. - Vol. 33. - pp. 928-934.
Dubois et al. S Isolation of human adipose+derived stem cells from biopsies and liposuction Gronthos S [et al.] Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem
specimens [Book Section] // Methods in Molecular Biology / ed. DJ BA Bunnell. - [s.l.] : cells derived from human bone marrow [Journal] // J Cell Sci. - 05 01, 2003. - Vol. 116. - pp.
Humana Press, 2008. 1827-1835.
Eder V [et al.] Gamma irradiation induces acetylcholine-evoked, endothelium-independent Gronthos S. [et al.] Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal
relaxation and activates K-channels of isolated pulmonary artery of rats [Journal] // Int J cells. [Journal] // J Cell Physiol. - 2001. - Vol. 189. - pp. 54-63.
Radiat.Oncol Biol Phys. - 12 01, 2004. - Vol. 60. - pp. 1530-1537. Gronthos S [et al.] Stem cell properties of human dental pulp stem cells [Journal] //
J.Dent.Res. - 08 0, 2002. - Vol. 81. - pp. 531-535.
209
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv BIBLIOGRAFIE
Gronthos S. [et al.] The STRO-1+ fraction of adult human bone marrow contains the Jones E and McGonagle D Human bone marrow mesenchymal stem cells in vivo
osteogenic precursors [Journal] // Blood. - 1994. - Vol. 84. - pp. 4164-4173. [Journal] // Rheumatology. (Oxford). - 02 0, 2008. - Vol. 47. - pp. 126-131.
Gruh I & Martin, U Transdifferentiation of stem cells: a critical view. [Journal] // Adv. Joyner A L and Zervas M Genetic inducible fate mapping in mouse: establishing genetic
Biochem. Eng. Biotechnol. - 2009. - pp. 114:73-106. lineages and defining genetic neuroanatomy in the nervous system [Journal] // Dev.Dyn. - 09
Ham AW and Harris, WR Repair and transplantation of bone. [Book Section] // The 0, 2006. - Vol. 235. - pp. 2376-2385.
biochemstry and physiology of bone: Development and Growth. / book auth. Bourne GH. - Kadiyala S [et al.] Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess
New York : Academic, 1971. osteochondrogenic potential in vivo and in vitro [Journal] // Cell Transplant. - 03 0, 1997. -
Han SK [et al.] Potential of human bone marrow stromal cells to accelerate wound healing Vol. 6. - pp. 125-134.
in vitro. Ann Plast Surg 2005; 55:414-419. Kajitani M [et al.] Use of a new elastin patch and glue for repair of a major duodenal injury.
Hanada K, Dennis J E and Caplan A I Stimulatory effects of basic fibroblast growth factor ASAIO J 2000; 46:409-414.
and bone morphogenetic protein-2 on osteogenic differentiation of rat bone marrow-derived Kang L et al. iPS cells can support full-term development of tetraploid blastocyst-
mesenchymal stem cells [Journal] // J Bone Miner Res. - 0 0, 1997. - Vol. 12. - pp. 1606- complemented embryos. [Journal] // Cell Stem Cell. - 2009. - pp. 5(2):135-8.
1614. Karp J M and Leng Teo G S Mesenchymal stem cell homing: the devil is in the details
Hanahan D and Folkman J Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch [Journal] // Cell Stem Cell. - 03 06, 2009. - Vol. 4. - pp. 206-216.
during tumorigenesis [Journal] // Cell. - 08 09, 1996. - Vol. 86. - pp. 353-364. Katz Adam J [et al.] Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-
Hanna J [et al.] Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from derived adherent stromal (hADAS) cells. [Journal] // Stem Cells. - 2005. - Vol. 23. - pp. 412-
autologous skin [Journal] // Science. - 12 21, 2007. - Vol. 318. - pp. 1920-1923. 423.
Haynesworth S E [et al.] Characterization of cells with osteogenic potential from human Kawada H [et al.] Nonhematopoietic mesenchymal stem cells can be mobilized and
marrow [Journal] // Bone. - 0 0, 1992a. - Vol. 13. - pp. 81-88. differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction [Journal] // Blood. - 12 01,
Haynesworth S E, Baber M A and Caplan A I Cell surface antigens on human marrow- 2004. - Vol. 104. - pp. 3581-3587.
derived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies [Journal] // Bone. - 0 0, Keating A [et al.] Donor origin of the in vitro haematopoietic microenvironment after
1992b. - Vol. 13. - pp. 69-80. marrow transplantation in man [Journal] // Nature. - 07 15, 1982. - Vol. 298. - pp. 280-283.
Haynesworth S E, Baber M A and Caplan A I Cytokine expression by human marrow- Keilhoff Gerburg [et al.] Transdifferentiation of mesenchymal stem cells into Schwann cell-
derived mesenchymal progenitor cells in vitro: effects of dexamethasone and IL-1 alpha like myelinating cells. [Journal] // Eur J Cell Biol. - 2006. - Vol. 85. - pp. 11-24.
[Journal] // J.Cell Physiol. - 03 0, 1996. - Vol. 166. - pp. 585-592. Khosla S and Eghbali-Fatourechi G Z Circulating cells with osteogenic potential
Harmon JW [et al.] Fate of Dacron prostheses in the small bowel of rabbits. Surg Forum [Journal] // Ann N Y Acad Sci. - 04 0, 2006. - Vol. 1068. - pp. 489-497.
1979; 30:365-366. Kim D [et al.] In vivo tracking of human mesenchymal stem cells in experimental stroke
He Q, Wan C and Li G Concise review: multipotent mesenchymal stromal cells in blood [Journal] // Cell Transplant. - 0 0, 2008. - Vol. 16. - pp. 1007-1012.
[Journal] // Stem Cells. - 01 0, 2007. - Vol. 25. - pp. 69-77. Kinnaird T [et al.] Marrow-derived stromal cells express genes encoding a broad spectrum
He T C [et al.] Identification of c-MYC as a target of the APC pathway [Journal] // of arteriogenic cytokines and promote in vitro and in vivo arteriogenesis through paracrine
Science. - 09 04, 1998. - Vol. 281. - pp. 1509-1512. mechanisms [Journal] // Circ Res. - 03 19, 2004. - Vol. 94. - pp. 678-685.
Health National Institute of Search of: mesenchymal stem cells [Online] // Koc O N [et al.] Allogeneic mesenchymal stem cell infusion for treatment of metachromatic
http://clinicaltrials.gov. - 08 13, 2010. - leukodystrophy (MLD) and Hurler syndrome (MPS-IH) [Journal] // Bone Marrow
http://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=mesenchymal+stem+cells. Transplant. - 08 0, 2002. - Vol. 30. - pp. 215-222.
Heng Boon Chin [et al.] Strategies for directing the differentiation of stem cells into the Koc O N [et al.] Rapid hematopoietic recovery after coinfusion of autologous-blood stem
osteogenic lineage in vitro. [Journal] // J Bone Miner Res. - 2004. - Vol. 19. - pp. 1379-1394. cells and culture-expanded marrow mesenchymal stem cells in advanced breast cancer
Hernigou P [et al.] Percutaneous autologous bone-marrow grafting for nonunions. Influence patients receiving high-dose chemotherapy [Journal] // J Clin Oncol. - 01 0, 2000. - Vol. 18. -
of the number and concentration of progenitor cells [Journal] // J Bone Joint Surg Am. - 07 0, pp. 307-316.
2005. - Vol. 87. - pp. 1430-1437. Kogler G [et al.] A new human somatic stem cell from placental cord blood with intrinsic
Hernigou Philippe and Beaujean Françoise Treatment of osteonecrosis with autologous pluripotent differentiation potential [Journal] // J Exp Med. - 07 19, 2004. - Vol. 200. - pp.
bone marrow grafting. [Journal] // Clin Orthop Relat Res. - 2002. - pp. 14-23. 123-135.
Herzog Erica L, Chai Li and Krause Diane S Plasticity of marrow-derived stem cells Kohyama J [et al.] Brain from bone: efficient "meta-differentiation" of marrow stroma-
[Journal] // Blood. - 0 0, 2003. - Vol. 102. - pp. 3483-3493. derived mature osteoblasts to neurons with Noggin or a demethylating agent [Journal] //
Hicok KC Thomas T, Gori F, Rickard DJ, Spelsberg TC, Riggs BL. Development and Differentiation. - 10 0, 2001. - Vol. 68. - pp. 235--244.
characterization of conditionally immortalized osteoblast precursor cell lines from human Kolf CM Cho E, Tuan RS. Mesenchymal stromal cells. Biology of adult mesenchymal stem
bone marrow stroma. [Journal] // J Bone Miner Res.. - 1998 Feb;13. - pp. (2):205-17. cells: regulation of niche, self-renewal and differentiation. [Journal] // Arthritis Res Ther.. -
Hoffmann A [et al.] The T-box transcription factor Brachyury mediates cartilage 2007;. - p. 9(1):204.
development in mesenchymal stem cell line C3H10T1/2 [Journal] // Journal of Cell Science Komori M [et al.] Efficiency of bone marrow-derived cells in regeneration of the stomach
115,. - (2002). - pp. 769-781. after induction of ethanol-induced ulcers in rats. J Gastroenterol 2005; 40:591-599.
Hofman DI [et al.] Cryopreseved embryos in the United States and their availability for Kopen G. C., Prockop D. J. and Phinney D. G. Marrow stromal cells migrate throughout
research. [Journal] // Fertil. Steril. - 2003. - pp. 79:1063-1069. forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal
Hollands P Differentiation and grafting of haemopoietic stem cells from early mouse brains. [Journal] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1999. - Vol. 96. - pp. 10711-10716.
postimplantation mouse embryos. [Journal] // Development. - 1987. - pp. 99(1):69-76. Koster M.I. [et al.] p63 is the molecular switch for initiation of an epithelial stratification
Honczarenko Marek [et al.] Human bone marrow stromal cells express a distinct set of program [Journal] // Genes Dev. - 2004. - Vol. 18. - pp. 126-131.
biologically functional chemokine receptors. [Journal] // Stem Cells. - 2006. - Vol. 24. - pp. Kraft H J [et al.] Oct-4 regulates alternative platelet-derived growth factor alpha receptor
1030-1041. gene promoter in human embryonal carcinoma cells [Journal] // J Biol Chem. - 05 31, 1996. -
Hooper A F and Hart N H Foundations of animal develoment, 2 ed. - [s.l.] : Oxford Vol. 271. - pp. 12873-12878.
University Press, 0 0, 1985. - pp. 585-592. Kraitchman D L [et al.] Dynamic imaging of allogeneic mesenchymal stem cells trafficking
Horwitz E M [et al.] Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society to myocardial infarction [Journal] // Circulation. - 09 06, 2005. - Vol. 112. - pp. 1451-1461.
for Cellular Therapy position statement [Journal] // Cytotherapy. - 0 0, 2005. - Vol. 7. - pp. Krampera Mauro [et al.] Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of
393-395. naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide. [Journal] // Blood. -
Horwitz E. M. [et al.] Transplantability and therapeutic effects of bone marrow-derived 2003. - Vol. 101. - pp. 3722-3729.
mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfecta. [Journal] // Nat Med. - 1999. - Krebsbach P H [et al.] Bone formation in vivo: comparison of osteogenesis by transplanted
Vol. 5. - pp. 309-313. mouse and human marrow stromal fibroblasts [Journal] // Transplantation. - 04 27, 1997. -
Horwitz Edwin M [et al.] Isolated allogeneic bone marrow-derived mesenchymal cells Vol. 63. - pp. 1059-1069.
engraft and stimulate growth in children with osteogenesis imperfecta: Implications for cell Kucia M [et al.] A population of very small embryonic-like (VSEL) CXCR4(+)SSEA-
therapy of bone. [Journal] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2002. - Vol. 99. - pp. 8932-8937. 1(+)Oct-4+ stem cells identified in adult bone marrow [Journal] // Leukemia. - 05 0, 2006. -
Horwitz E. M. [et al.] Clinical responses to bone marrow transplantation in children with Vol. 20. - pp. 857-869.
severe osteogenesis imperfecta. [Journal] // Blood. - 2001. - Vol. 97. - pp. 1227-1231. Kumar S and Ponnazhagan S Bone homing of mesenchymal stem cells by ectopic alpha 4
Igura K. [et al.] Isolation and characterization of mesenchymal progenitor cells from integrin expression [Journal] // FASEB J. - 12 0, 2007. - Vol. 21. - pp. 3917-3927.
chorionic villi of human placenta. [Journal] // Cytotherapy. - 2004. - Vol. 6. - pp. 543-553. Kuznetsov S A [et al.] Circulating skeletal stem cells [Journal] // J.Cell Biol. - 05 28, 2001. -
Im Gun-Il, Shin Yong-Woon and Lee Kee-Byung Do adipose tissue-derived mesenchymal Vol. 153. - pp. 1133-1140.
stem cells have the same osteogenic and chondrogenic potential as bone marrow-derived Kuznetsov S A [et al.] Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts
cells? [Journal] // Osteoarthritis Cartilage. - 2005. - Vol. 13. - pp. 845-853. form bone after transplantation in vivo [Journal] // J.Bone Miner.Res. - 09 0, 1997. - Vol.
Inoue K. [et al.] The effect of aging on bone formation in porous hydroxyapatite: 12. - pp. 1335-1347.
biochemical and histological analysis. [Journal] // J Bone Miner Res. - 1997. - Vol. 12. - pp. Lajtha L G Haemopoietic stem cells: concept and definitions [Journal] // Blood Cells. - 08 0,
989-994. 1979. - Vol. 5. - pp. 447-455.
Ip J E [et al.] Mesenchymal stem cells use integrin beta1 not CXC chemokine receptor 4 for Lakshmipathy U and Hart R P Concise review: MicroRNA expression in multipotent
myocardial migration and engraftment [Journal] // Mol Biol Cell. - 08 0, 2007. - Vol. 18. - mesenchymal stromal cells [Journal] // Stem Cells. - 02 0, 2008. - Vol. 26. - pp. 356-363.
pp. 2873-2882. Langer R. Tissue engineering: a new field and its challenges. Pharm Res 1997; 14:840-841.
Isch JA [et al.] Patch esophagoplasty using AlloDerm as a tissue scaffold. J Pediatr Surg Lazarus H M [et al.] Cotransplantation of HLA-identical sibling culture-expanded
2001; 36:266-268. mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells in hematologic malignancy patients
ISSCR International Society for Stem Cell Researc Guidelines for the clinical translation [Journal] // Biol Blood Marrow Transplant. - 05 0, 2005. - Vol. 11. - pp. 389-398.
of stem cells [Book]. - 2008. Le Blanc K. [et al.] Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party
Ito T [et al.] Bone marrow is a reservoir of repopulating mesangial cells during glomerular haploidentical mesenchymal stem cells [Journal] // Lancet. - 2004. - Vol. 363. - pp. 1439-
remodeling [Journal] // J Am Soc Nephrol. - 12 0, 2001. - Vol. 12. - pp. 2625-2635. 1441.
Itoh H [et al.] A honeycomb collagen carrier for cell culture as a tissue engineering scaffold. Le Blanc K. and Pittenger M. Mesenchymal stem cells: progress toward promise
Artif Organs 2001; 25:213-217. [Journal] // Cytotherapy. - 2005. - Vol. 7. - pp. 36-45.
Ivanova Natalia B [et al.] A stem cell molecular signature. [Journal] // Science. - 2002. - Lee C C [et al.] Clonal analysis and hierarchy of human bone marrow mesenchymal stem
Vol. 298. - pp. 601-604. and progenitor cells [Journal] // Exp Hematol. - 01 0, 2010. - Vol. 38. - pp. 46--54.
Jain R.K. Molecular regulation of vessel maturation [Journal] // Nat.Med. - 2003. - Vol. 9. - Lee G et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-
pp. 685-693. specific iPSCs. [Journal] // Nature. - 2009. - pp. 461(7262):402-6.
Jaiswal N. [et al.] Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human Lee J Y [et al.] Effect of bone morphogenetic protein-2-expressing muscle-derived cells on
mesenchymal stem cells in vitro. [Journal] // J Cell Biochem. - 1997. - Vol. 64. - pp. 295-312. healing of critical-sized bone defects in mice [Journal] // J.Bone Joint Surg.Am. - 07 0,
Jat P S [et al.] Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 2001. - Vols. 83-A. - pp. 1032-1039.
transgenic mouse [Journal] // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. - 06 15, 1991. - Vol. 88. - pp. 5096- Lee JE Park JC, Hwang YS, Kim JK, Kim JG, Suh H. Characterization of UV-irradiated
5100. dense/porous collagen membranes: morphology, enzymatic degradation, and mechanical
Jeong Y and Mangelsdorf D J Nuclear receptor regulation of stemness and stem cell properties. [Journal] // Yonsei Med J. - 2001 Apr;. - pp. 42(2):172-179..
differentiation [Journal] // Exp Mol Med. - 08 31, 2009. - Vol. 41. - pp. 525-537. Lee Ryang Hwa [et al.] A subset of human rapidly self-renewing marrow stromal cells
Jiang C Y [et al.] Optimal time for mesenchymal stem cell transplantation in rats with preferentially engraft in mice. [Journal] // Blood. - 2006. - Vol. 107. - pp. 2153-2161.
myocardial infarction [Journal] // J Zhejiang.Univ Sci B. - 08 0, 2008. - Vol. 9. - pp. 630-637. Li H Yu B, Zhang Y, Pan Z, Xu W, Li H. Jagged1 protein enhances the differentiation of
Jiang X X [et al.] Human mesenchymal stem cells inhibit differentiation and function of mesenchymal stem cells into cardiomyocytes. [Journal] // Biochem Biophys Res Commun.. -
monocyte-derived dendritic cells [Journal] // Blood. - 05 15, 2005. - Vol. 105. - pp. 4120- 2006 Mar 10;. - pp. 341(2):320-5. Epub 2006 Jan 10.
4126. Li Y [et al.] Treatment of stroke in rat with intracarotid administration of marrow stromal
Jiang Yuehua [et al.] Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. cells [Journal] // Neurology. - 06 26, 2001a. - Vol. 56. - pp. 1666-1672.
[Journal] // Nature. - 2002. - Vol. 418. - pp. 41-49.
210
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv BIBLIOGRAFIE
Li Y [et al.] Intracerebral transplantation of bone marrow stromal cells in a 1-methyl-4- Mutter D [et al.] Biomaterial supports for colonic wall defect healing. An experimental
phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson's disease [Journal] // study in the rat. Biomaterials 1996; 17:1411-1415.
Neurosci.Lett. - 12 0, 2001b. - Vol. 316. - pp. 67-70. Nagaya N [et al.] Transplantation of mesenchymal stem cells improves cardiac function in a
Li Q [et al.] Differential expression of CD146 in tissues and endothelial cells derived from rat model of dilated cardiomyopathy [Journal] // Circulation. - 08 23, 2005. - Vol. 112. - pp.
infantile haemangioma and normal human skin [Journal] // J.Pathol. - 10 0, 2003. - Vol. 1128-1135.
201. - pp. 296-302. Nakahara H et al. Culture-expanded periosteal-derived cells exhibit osteochondrogenic
Lieberman J.R. [et al.] The effect of regional gene therapy with bone morphogenetic potential in porous calcium phosphate ceramics in vivo. [Journal] // Clin Orthop Relat Res. -
protein-2-producing bone-marrow cells on the repair of segmental femoral defects in rats 1992. - pp. 291-298.
[Journal] // J.Bone Joint Surg.Am. - 1999. - Vol. 81. - pp. 905-917. Nandoe Tewarie R D [et al.] Bone marrow stromal cells for repair of the spinal cord:
Liu J W [et al.] Characterization of endothelial-like cells derived from human mesenchymal towards clinical application [Journal] // Cell Transplant. - 0 0, 2006. - Vol. 15. - pp. 563--577.
stem cells [Journal] // J Thromb Haemost. - 04 0, 2007. - Vol. 5. - pp. 826-834. Nauta A J [et al.] Donor-derived mesenchymal stem cells are immunogenic in an allogeneic
Longman Letter S [Book Section] // Longman Dictionary of English language and Culture / host and stimulate donor graft rejection in a nonmyeloablative setting [Journal] // Blood. - 09
book auth. Summers D. et al. - Essex : Adsison Wesley Longman, 1998. 15, 2006. - Vol. 108. - pp. 2114-2120.
Loring JF et Wesselschmidt RL Human stem cell Manual [Book]. - [s.l.] : Elsevier, 2007. Nauta A J and Fibbe W E Immunomodulatory properties of mesenchymal stromal cells
Lu Q [et al.] Novel porous aortic elastin and collagen scaffolds for tissue engineering. [Journal] // Blood. - 11 15, 2007. - Vol. 110. - pp. 3499-3506.
Biomaterials 2004; 25:5227-5237. Nerem RM [et al.] Vascular tissue engineering. Annu Rev Biomed Eng 2001; 3:225-243.
Maccario R [et al.] Interaction of human mesenchymal stem cells with cells involved in Neuhuber Birgit [et al.] Axon growth and recovery of function supported by human bone
alloantigen-specific immune response favors the differentiation of CD4+ T-cell subsets marrow stromal cells in the injured spinal cord exhibit donor variations. [Journal] // Brain
expressing a regulatory/suppressive phenotype [Journal] // Haematologica. - 04 0, 2005. - Res. - 2005. - Vol. 1035. - pp. 73-85.
Vol. 90. - pp. 516-525. Ning H [et al.] The correlation between cotransplantation of mesenchymal stem cells and
MacReady N. The murky ethics of stem-cell tourism. [Journal] // The Lancet. - 2009. - pp. higher recurrence rate in hematologic malignancy patients: outcome of a pilot clinical study
10(4):317-8. [Journal] // Leukemia. - 03 0, 2008. - Vol. 22. - pp. 593-599.
Maherali N et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and Nixon A J [et al.] Insulinlike growth factor-I gene therapy applications for cartilage repair
widespread tissue contribution. [Journal] // Cell Stem Cell. - 2007. - pp. 1(1):55-70. [Journal] // Clin.Orthop.Relat Res. - 10 0, 2000. - pp. S201-S213.
Majumdar M K [et al.] Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow- Noël Daniele [et al.] Short-term BMP-2 expression is sufficient for in vivo osteochondral
derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells [Journal] // J.Cell Physiol. - 07 0, differentiation of mesenchymal stem cells. [Journal] // Stem Cells. - 2004. - Vol. 22. - pp. 74-
1998. - Vol. 176. - pp. 57-66. 85.
Makino S. [et al.] Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. North T E [et al.] Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell
[Journal] // J Clin Invest. - 1999. - Vol. 103. - pp. 697-705. homeostasis [Journal] // Nature. - 06 21, 2007. - Vol. 447. - pp. 1007-1011.
Maloney M A and Patt H M Origin in repopulating cells after localized bone marrow North T.E. [et al.] Runx1 is expressed in adult mouse hematopoietic stem cells and
depletion [Journal] // Science. - 07 04, 1968. - Vol. 165. - pp. 71-73. differentiating myeloid and lymphoid cells, but not in maturing erythroid cells [Journal] //
Maloney M A, Lamela R A and Patt H M The question of bone marrow stromal fibroblast Stem Cells. - 2004. - Vol. 22. - pp. 158-168.
traffic [Journal] // Ann.N.Y.Acad.Sci. - 0 0, 1985. - Vol. 459. - pp. 190-197. Nowak J.A. [et al.] Hair follicle stem cells are specified and function in early skin
Mangi Abeel A [et al.] Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and morphogenesis [Journal] // Cell Stem Cell. - 2008. - Vol. 3. - pp. 33-43.
restore performance of infarcted hearts. [Journal] // Nat Med. - 2003. - Vol. 9. - pp. 1195- Ohishi M and Schipani E Bone marrow mesenchymal stem cells [Journal] // J Cell
1201. Biochem. - 02 01, 2010. - Vol. 109. - pp. 277-282.
Markel T A [et al.] Stem cells as a potential future treatment of pediatric intestinal disorders Okamoto T Aoyama T, Nakayama T, Nakamata T, Hosaka T, Nishijo K, Nakamura T,
[Journal] // J Pediatr.Surg. - 11 0, 2008. - Vol. 43. - pp. 1953-1963. Kiyono T, Toguchida J. Clonal heterogeneity in differentiation potential of immortalized
Marko O [et al.] Isolation of a preadipocyte cell line from rat bone marrow and human mesenchymal stem cells. [Article] // Biochem Biophys Res Commun.. - 2002 Jul
differentiation to adipocytes [Journal] // Endocrinology. - 10 0, 1995. - Vol. 136. - pp. 4582- 12;. - 354-61. : Vol. 295(2):.
4588. Okita K, Ichisaka, T & Yamanaka, S Generation of germline-competent induced
Marshman E, Booth C and Potten C S The intestinal epithelial stem cell [Journal] // pluripotent stem cells. [Journal] // Nature. - 2007. - pp. 448(7151):313-7.
Bioessays. - 01 0, 2002. - Vol. 24. - pp. 91-98. Olsen B R, Reginato A M and Wang W Bone development [Journal] // Annu.Rev.Cell
Massagli Teresa L eMedicine Specialties > Physical Medicine and Rehabilitation > Spinal Dev.Biol. - 0 0, 2000. - Vol. 16. - pp. 191-220.
Cord Injury [Online] // emedicine medscape. - 08 19, 2008. - 07 25, 2010. - Omori Y [et al.] Optimization of a therapeutic protocol for intravenous injection of human
http://emedicine.medscape.com/article/322109-overview. mesenchymal stem cells after cerebral ischemia in adult rats [Journal] // Brain Res. - 10 21,
Masuda S [et al.] Cotransplantation with MSCs improves engraftment of HSCs after 2008. - Vol. 1236. - pp. 30-38.
autologous intra-bone marrow transplantation in nonhuman primates [Journal] // Exp Organ GM [et al.] Transplantation of enterocytes utilizing polymer-cell constructs to
Hematol. - 10 0, 2009. - Vol. 37. - pp. 1250-1257. produce a neointestine. Transplant Proc 1992; 24:3011.
Matsunaga T [et al.] Interaction between leukemic-cell VLA-4 and stromal fibronectin is a Orkin S H and Zon L I Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology
decisive factor for minimal residual disease of acute myelogenous leukemia [Journal] // Nat [Journal] // Cell. - 02 22, 2008. - Vol. 132. - pp. 631-644.
Med. - 09 0, 2003. - Vol. 9. - pp. 1158-1165. Orlic D. [et al.] Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. [Journal] // Nature. -
Mayo Patrick R. Fakhreddin Jamali, Methoxyflurane Anesthesia Augments The 2001. - Vol. 410. - pp. 701-705.
Chronotropic And Dromotropic Effects Of Verapamil. [Journal] // J Pharm Pharmaceut Sci. - Osawa M. [et al.] Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-
1999. - pp. 2 (1):30-35, 1999. low/negative hematopoietic stem cell [Journal] // Science. - 1996. - Vol. 273. - pp. 242-245.
Mazo I B [et al.] Total body irradiation causes profound changes in endothelial traffic Owen M Marrow stromal stem cells [Journal] // J Cell Sci Suppl. - 0 0, 1988. - Vol. 10. - pp.
molecules for hematopoietic progenitor cell recruitment to bone marrow [Journal] // Blood. - 63-76.
06 01, 2002. - Vol. 99. - pp. 4182-4191. Owen Maureen Lineage of osteogenic cells and their relationship to the stromal system
McBride C., Gaupp D. and Phinney D. G. Quantifying levels of transplanted murine and [Book Section] // Bone and Mineral Research / book auth. W. Peck. - New York : Elsevier,
human mesenchymal stem cells in vivo by real-time PCR. [Journal] // Cytotherapy. - 2003. - 1985.
Vol. 5. - pp. 7-18. Park I K [et al.] Bmi-1 is required for maintenance of adult self-renewing haematopoietic
McDonald JW et al. Transplanted embryonic stem cells survive, differentiate and promote stem cells [Journal] // Nature. - 05 15, 2003. - Vol. 423. - pp. 302-305.
recovery in injured rat spinal cord. [Journal] // Nature medicine. - 1999. - pp. 5(12):1410-2. Park IH et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. [Journal] // Cell. - 2008. - pp.
McKay R Stem cells in the central nervous system [Journal] // Science. - 04 04, 1997. - Vol. 134(5):877-86.
276. - pp. 66-71. Pechak DG et al. Morphological and histochemical events during first bone formation in
Meisel R [et al.] Human bone marrow stromal cells inhibit allogeneic T-cell responses by embryonic chick limbs. [Journal] // Bone. - 1986. - pp. 7:441-458.
indoleamine 2,3-dioxygenase-mediated tryptophan degradation [Journal] // Blood. - 06 15, Peckys D B [et al.] Nanoscale imaging of whole cells using a liquid enclosure and a scanning
2004. - Vol. 103. - pp. 4619-4621. transmission electron microscope [Journal] // PLoS.One. - 0 0, 2009. - Vol. 4. - pp. e8214-
Menasché P Embryonic stem cells pace the heart. [Journal] // Nature Biotechnology. - 3383.
2004. - pp. 22(10):1237-8. Peifer M and Polakis P Wnt signaling in oncogenesis and embryogenesis-a look outside the
Meyrik B et al. Smooth muscle myosin in precursor and mature smooth muscle cells in nucleus [Journal] // Science. - 03 03, 2000. - Vol. 287. - pp. 1606-1609.
normal pulmonary arteries and the effect of hypoxia. [Journal] // Exp Lung Res.. - 1981. - pp. Pellegrini G Dellambra E p63 identifies keratinocyte stem cells. - 03 13, 2001. - pp. 3156-
2(4):303-13. 3161.
Mikkers H and Frisen J Deconstructing stemness [Journal] // EMBO J. - 08 03, 2005. - Vol. Pereira R F [et al.] Cultured adherent cells from marrow can serve as long-lasting precursor
24. - pp. 2715-2719. cells for bone, cartilage, and lung in irradiated mice [Journal] // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -
Minguell J J, Erices A and Conget P Mesenchymal stem cells [Journal] // Exp.Biol.Med. 05 23, 1995. - Vol. 92. - pp. 4857-4861.
(Maywood.). - 06 0, 2001. - Vol. 226. - pp. 507-520. Pereira R F [et al.] Marrow stromal cells as a source of progenitor cells for
Mishra V.J. et al. Applications of nanomaterials in mesenchymal stem cell engineering. nonhematopoietic tissues in transgenic mice with a phenotype of osteogenesis imperfecta
[Journal] // Digest journal of Nanomaterials and biostructures.. - 2008. - pp. 3,4:203-208. [Journal] // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. - 02 03, 1998. - Vol. 95. - pp. 1142-1147.
Miura M [et al.] Accumulated chromosomal instability in murine bone marrow Perka C [et al.] Segmental bone repair by tissue-engineered periosteal cell transplants with
mesenchymal stem cells leads to malignant transformation [Journal] // Stem Cells. - 04 0, bioresorbable fleece and fibrin scaffolds in rabbits [Journal] // Biomaterials. - 06 0, 2000. -
2006. - Vol. 24. - pp. 1095-1103. Vol. 21. - pp. 1145-1153.
Miura Masako [et al.] SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. [Journal] // Pettis GY et al. Tissue response to composite ceramic hydroxyapatite/demineralized bone
Proc Natl Acad Sci U S A. - 2003. - Vol. 100. - pp. 5807-5812. implants. [Journal] // J Oral Maxillofac Surg. - 1990. - pp. 48:1068-1074.
Mohamadnejad M [et al.] Phase 1 human trial of autologous bone marrow-hematopoietic Picinich S C [et al.] The therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Cell- & tissue-
stem cell transplantation in patients with decompensated cirrhosis [Journal] // World J based therapy [Journal] // Expert.Opin.Biol.Ther. - 07 0, 2007. - Vol. 7. - pp. 965-973.
Gastroenterol. - 06 28, 2007. - Vol. 13. - pp. 3359-3363. Pietrangeli C.E., Hayashi S. and Kincade P.W. Stromal cell lines which support
Moldovan [et al.] Collagen-chondroitin sulfate-hydroxyapatite porous lymphocyte growth: characterization, sensitivity to radiation and responsiveness to growth
composites:preparation, characterization and in vitro biocompatibility testing. [Journal] // factors [Journal] // Eur.J.Immunol. - 1988. - Vol. 18. - pp. 863-872.
Roumanian Biotechnological Letters. - 2009. - pp. Vol. 14, No. 3, pp. 4459-4466. Piscaglia A C Stem cells, a two-edged sword: risks and potentials of regenerative medicine
Moldovan [et al.] Corneal collagen interaction with proteoglycans and glycosaminoglycans. [Journal] // World J Gastroenterol. - 07 21, 2008. - Vol. 14. - pp. 4273-4279.
[Journal] // Roum Biotechn Lett. - 2001. - pp. 6, 2, 137-145. Pittenger M F and DJ Prockop DG p Mesenchymal Stem Cells from adult bone marrow
Moldovan [et al.] Tehnici actuale şi de perspectiva pentru testarea in vitro a [Book Section] // Mesenchymal Stem Cells. Methods and protocols. - [s.l.] : Humana Press,
biocompatibilitatii biomaterialelor colagenice de uz medical [Book Section] // Tehnici 2008.
Experimentale in bioanaliza / book auth. Radu G.L. - [s.l.] : Ed. Printech,, 2007. Pittenger M.F. [et al.] Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells
Montzka K et al. Neural differentiation potential of human bone marrow-derived [Journal] // Science. - 1999. - Vol. 284. - pp. 143-147.
mesenchymal stromal cells: misleading marker gene expression. [Journal] // BMC Neuroci. - Plumas J [et al.] Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells [Journal] //
2009. - p. 10:16. Leukemia. - 09 0, 2005. - Vol. 19. - pp. 1597-1604.
Morigi M [et al.] Mesenchymal stem cells are renotropic, helping to repair the kidney and Potten C S, Owen G and Booth D Intestinal stem cells protect their genome by selective
improve function in acute renal failure [Journal] // J Am Soc Nephrol. - 07 0, 2004. - Vol. segregation of template DNA strands [Journal] // J Cell Sci. - 06 01, 2002. - Vol. 115. - pp.
15. - pp. 1794-1804. 2381-2388.
Mosmann Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to Potten C.S. & Loeffler, M. Stem cells:attributes, cycles, spirals, pitfalls and uncertainties.
proliferation and cytotoxicity assays. [Journal] // J Immunol Methods.. - 1983 Dec 16;. - pp. Lessons for and from the crypt. [Journal] // Development 110. - 1990. - pp. 1001-1020.
65(1-2):55-63. Poulsom R [et al.] Adult stem cell plasticity [Journal] // J.Pathol. - 07 0, 2002. - Vol. 197. -
Muschler G F, Nakamoto C and Griffith L G Engineering principles of clinical cell-based pp. 441-456.
tissue engineering [Journal] // J Bone Joint Surg Am. - 07 0, 2004. - Vols. 86-A. - pp. 1541- Prockop D J Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues [Journal] //
1558. Science. - 04 04, 1997. - Vol. 276. - pp. 71-74.
211
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv BIBLIOGRAFIE
Quirici N [et al.] Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells by anti-nerve growth Shibata T [et al.] EBP50, a beta-catenin-associating protein, enhances Wnt signaling and is
factor receptor antibodies [Journal] // Exp Hematol. - 07 0, 2002. - Vol. 30. - pp. 783-791. over-expressed in hepatocellular carcinoma [Journal] // Hepatology. - 07 0, 2003. - Vol. 38. -
Ramalho-Santos Miguel [et al.] "Stemness": transcriptional profiling of embryonic and pp. 178-186.
adult stem cells. [Journal] // Science. - 2002. - Vol. 298. - pp. 597-600. Silberg D.G. [et al.] Cdx1 and cdx2 expression during intestinal development [Journal] //
Ramasamy R [et al.] Mesenchymal stem cells inhibit proliferation and apoptosis of tumor Gastroenterology. - 2000. - Vol. 119. - pp. 961-971.
cells: impact on in vivo tumor growth [Journal] // Leukemia. - 02 0, 2007. - Vol. 21. - pp. Simmons P J and Torok-Storb B CD34 expression by stromal precursors in normal human
304-310. adult bone marrow [Journal] // Blood. - 12 01, 1991. - Vol. 78. - pp. 2848-2853.
Reese J S, Koc O N and Gerson S L Human mesenchymal stem cells provide stromal Simonsen JL Rosada C, Serakinci N, Justesen J, Stenderup K, Rattan SI, Jensen TG,
support for efficient CD34+ transduction [Journal] // J.Hematother.Stem Cell Res. - 10 0, Kassem M. Telomerase expression extends the proliferative life-span and maintains the
1999. - Vol. 8. - pp. 515-523. osteogenic potential of human bone marrow stromal cells. [Journal] // Nat Biotechnol. -. 2002
Reyes M. [et al.] Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal Jun;. - pp. 20(6):592-6.
progenitor cells. [Journal] // Blood. - 2001. - Vol. 98. - pp. 2615-2625. Singh S K [et al.] Identification of human brain tumour initiating cells [Journal] // Nature. -
Rickard D J [et al.] Isolation and characterization of osteoblast precursor cells from human 11 18, 2004. - Vol. 432. - pp. 396-401.
bone marrow [Journal] // J.Bone Miner.Res. - 03 0, 1996. - Vol. 11. - pp. 312-324. Sitges-Serra A [et al.] Management of postoperative enterocutaneous fistulas: the roles of
Rodriguez A M [et al.] Adipocyte differentiation of multipotent cells established from parenteral nutrition and surgery. Br J Surg 1982; 69:147-150.
human adipose tissue [Journal] // Biochem Biophys Res Commun. - 03 05, 2004. - Vol. Sirbu-Boeti M P [et al.] Transplantation of mesenchymal stem cells cultured on biomatrix
315. - pp. 255-263. support induces repairing of digestive tract defects, in animal model [Journal] //
Rolletschek A et al. Embryonic stem cell-derived cardiac, neuronal and pancreatic cells as Chirurgia.(Bucur.). - 01 0, 2009. - Vol. 104. - pp. 55-65.
model systems to study toxicological effects. [Journal] // Toxicol Lett. - 2004. - pp. 149:361- Slack J M Stem cells in epithelial tissues [Journal] // Science. - 02 25, 2000. - Vol. 287. - pp.
369. 1431-1433.
Rombouts W J and Ploemacher R E Primary murine MSC show highly efficient homing to Slack J.M.W. Origin of stem cells in organogenesis // Origin of stem cells in
the bone marrow but lose homing ability following culture [Journal] // Leukemia. - 01 0, organogenesis. - [s.l.] : Science, 2008. - pp. 1498-1501.
2003. - Vol. 17. - pp. 160-170. Solchaga L A [et al.] Hyaluronic acid-based polymers as cell carriers for tissue-engineered
Roni V [et al.] Recruitment of human umbilical vein endothelial cells and human primary repair of bone and cartilage [Journal] // J.Orthop.Res. - 03 0, 1999. - Vol. 17. - pp. 205-213.
fibroblasts into experimental tumors growing in SCID mice [Journal] // Exp Cell Res. - 07 Solchaga L.A. [et al.] Hyaluronan-based polymers in the treatment of osteochondral defects
01, 2003. - Vol. 287. - pp. 28-38. [Journal] // J.Orthop.Res. - 2000. - Vol. 18. - pp. 773-780.
Roorda B D [et al.] Bone marrow-derived cells and tumor growth: contribution of bone Song L [et al.] Identification and functional analysis of candidate genes regulating
marrow-derived cells to tumor micro-environments with special focus on mesenchymal stem mesenchymal stem cell self-renewal and multipotency [Journal] // Stem Cells. - 07 0, 2006. -
cells [Journal] // Crit Rev Oncol Hematol. - 03 0, 2009. - Vol. 69. - pp. 187-198. Vol. 24. - pp. 1707-1718.
Rubio D [et al.] Spontaneous human adult stem cell transformation [Journal] // Cancer Res. - Song Y et al. Transdifferentiation of rat fetal brain stem cells into penile smooth muscle
04 15, 2005. - Vol. 65. - pp. 3035-3039. cells. [Journal] // BJU Int. - 2009. - pp. 104(2):257-62.
Ruster B [et al.] Mesenchymal stem cells display coordinated rolling and adhesion behavior Sotiropoulou P A [et al.] Interactions between human mesenchymal stem cells and natural
on endothelial cells [Journal] // Blood. - 12 01, 2006. - Vol. 108. - pp. 3938-3944. killer cells [Journal] // Stem Cells. - 01 0, 2006. - Vol. 24. - pp. 74-85.
Sacchetti B [et al.] Self-renewing osteoprogenitors in bone marrow sinusoids can organize a Spaggiari G M [et al.] Mesenchymal stem cell-natural killer cell interactions: evidence that
hematopoietic microenvironment [Journal] // Cell. - 10 19, 2007. - Vol. 131. - pp. 324-336. activated NK cells are capable of killing MSCs, whereas MSCs can inhibit IL-2-induced NK-
Sackstein R [et al.] Ex vivo glycan engineering of CD44 programs human multipotent cell proliferation [Journal] // Blood. - 02 15, 2006. - Vol. 107. - pp. 1484-1490.
mesenchymal stromal cell trafficking to bone [Journal] // Nat Med. - 02 0, 2008. - Vol. 14. - Spees Jeffrey L [et al.] Differentiation, cell fusion, and nuclear fusion during ex vivo repair
pp. 181-187. of epithelium by human adult stem cells from bone marrow stroma. [Journal] // Proc Natl
Salem H K and Thiemermann C Mesenchymal Stromal Cells - Current Understanding and Acad Sci U S A. - 2003. - Vol. 100. - pp. 2397-2402.
Clinical Status [Journal] // Stem Cells. - 12 04, 2009. - pp. 841-846. Sperger J M [et al.] Gene expression patterns in human embryonic stem cells and human
Sancho E, Batlle E and Clevers H Signaling pathways in intestinal development and cancer pluripotent germ cell tumors [Journal] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 11 11, 2003. - Vol.
[Journal] // Annu.Rev Cell Dev Biol. - 0 0, 2004. - Vol. 20. - pp. 695-723. 100. - pp. 13350-13355.
Sangai T [et al.] Effect of differences in cancer cells and tumor growth sites on recruiting Spradling A, Drummond-Barbosa D and Kai T Stem cells find their niche [Journal] //
bone marrow-derived endothelial cells and myofibroblasts in cancer-induced stroma Nature. - 11 01, 2001. - Vol. 414. - pp. 98-104.
[Journal] // Int J Cancer. - 07 20, 2005. - Vol. 115. - pp. 885-892. Spring H [et al.] Chemokines direct endothelial progenitors into tumor neovessels
Sasaki M [et al.] Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to [Journal] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 12 13, 2005. - Vol. 102. - pp. 18111-18116.
wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type [Journal] // J Immunol. - 02 Stagg J [et al.] Interferon-gamma-stimulated marrow stromal cells: a new type of
15, 2008. - Vol. 180. - pp. 2581-2587. nonhematopoietic antigen-presenting cell [Journal] // Blood. - 03 15, 2006. - Vol. 107. - pp.
Sato N [et al.] Molecular signature of human embryonic stem cells and its comparison with 2570-2577.
the mouse [Journal] // Dev Biol. - 08 15, 2003. - Vol. 260. - pp. 404-413. Steingen C [et al.] Characterization of key mechanisms in transmigration and invasion of
Sato Noboru [et al.] Maintenance of pluripotency in human and mouse embryonic stem cells mesenchymal stem cells [Journal] // J Mol Cell Cardiol. - 06 0, 2008. - Vol. 44. - pp. 1072-
through activation of Wnt signaling by a pharmacological GSK-3-specific inhibitor. 1084.
[Journal] // Nat Med. - 2004. - Vol. 10. - pp. 55-63. Steptoe PC Edwards RG, Purdy JM. Clinical aspects of pregnancies established with
Sato Yasushi [et al.] Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver are cleaving embryos grown in vitro. [Journal] // Br J Obstet Gynaecol.. - 1980. - pp. 87(9):757-
differentiated into human hepatocytes without fusion. [Journal] // Blood. - 2005. - Vol. 106. - 68.
pp. 756-763. Stoff-Khalili M A [et al.] Mesenchymal stem cells as a vehicle for targeted delivery of
Schenk S [et al.] Monocyte chemotactic protein-3 is a myocardial mesenchymal stem cell CRAds to lung metastases of breast carcinoma [Journal] // Breast Cancer Res Treat. - 10 0,
homing factor [Journal] // Stem Cells. - 01 0, 2007. - Vol. 25. - pp. 245-251. 2007. - Vol. 105. - pp. 157-167.
Schmidt CE [et al.] Acellular vascular tissues: natural biomaterials for tissue repair and Studeny M [et al.] Mesenchymal stem cells: potential precursors for tumor stroma and
tissue engineering. Biomaterials 2000; 21:2215-2231. targeted-delivery vehicles for anticancer agents [Journal] // J Natl Cancer Inst. - 11 03,
Schofield R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the haemopoietic 2004. - Vol. 96. - pp. 1593-1603.
stem cell. [Journal] // Blood Cells. - 1978. - Vol. 4. - pp. 7-25. Sugarman Jeremy Ethics and stem cell therapeuthics for cardiovascular disease [Journal] //
Schuldiner M. et al. Effects of eight growth factors on the differentiation of cells derived Progress in Cardiovascular Diseases. - 2007. - pp. (50) 1: 1-6.
from human embryonic stem cells. [Journal] // Proc Natl Acad Sci U S A.. - 2000. - pp. Surani MA Reprogramming of genome function through epigenetic inheritance. [Journal] //
97(21):11307-12. Nature. - 2001. - pp. 414:122-128.
Schwarz E.J. [et al.] Multipotential marrow stromal cells transduced to produce L-DOPA: Tait IS [et al.] Generation of neomucosa in vivo by transplantation of dissociated postnatal
engraftment in a rat model of Parkinson disease [Journal] // Hum.Gene Ther. - 1999. - Vol. small intestinal epithelium. Differentiation 1994; 56:91-100.
10. - pp. 2539-2549. Takagz Y et al Dopaminergic neurons generated from monkey embryonic stem cells
Scoville D H [et al.] Current view: intestinal stem cells and signaling [Journal] // function in a Parkinson primate model. [Journal] // J. Clin. Invest.. - 2005. - pp. 115(1):102-9.
Gastroenterology. - 03 0, 2008. - Vol. 134. - pp. 849-864. Takahashi K & Yamanaka, S Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic
Segers V F [et al.] Local delivery of protease-resistant stromal cell derived factor-1 for stem and adult fibroblast cultures by defined factors. [Journal] // Cell. - 2006. - pp. 126(4):663-76.
cell recruitment after myocardial infarction [Journal] // Circulation. - 10 09, 2007. - Vol. Takahashi S. [et al.] Development and characterization of a human marrow stromal cell line
116. - pp. 1683-1692. that enhances osteoclast-like cell formation [Journal] // Endocrinology. - 1995. - Vol. 136. -
Segers V F [et al.] Mesenchymal stem cell adhesion to cardiac microvascular endothelium: pp. 1441-1449.
activators and mechanisms [Journal] // Am.J Physiol Heart Circ Physiol. - 04 0, 2006. - Vol. Takashima Y Era T, Nakao K, Kondo S, Kasuga M, Smith AG, Nishikawa S.
290. - pp. H1370-H1377. Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation. [Journal] //
Sekiya I., Colter D. C. and Prockop D. J. BMP-6 enhances chondrogenesis in a Cell.. - 2007 Jun 29;. - pp. 129(7):1377-88.
subpopulation of human marrow stromal cells. [Journal] // Biochem Biophys Res Commun. - Tam PP & Rossant, J Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian
2001. - Vol. 284. - pp. 411-418. development. [Journal] // Development. - 2003. - pp. 130(25):6155-63.
Sekiya Ichiro [et al.] In vitro cartilage formation by human adult stem cells from bone Tang D Q [et al.] In vivo and in vitro characterization of insulin-producing cells obtained
marrow stroma defines the sequence of cellular and molecular events during chondrogenesis. from murine bone marrow [Journal] // Diabetes. - 07 0, 2004. - Vol. 53. - pp. 1721-1732.
[Journal] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2002. - Vol. 99. - pp. 4397-4402. Tavassoli M. Differential response of bone marrow and extramedullary adipose cells to
Sell S. & Pierce, G. B. Maturation arrest of stem cell differentiation is a common pathway starvation [Journal] // Experientia. - 1974. - Vol. 30. - pp. 424-425.
for the cellular origin of teratocarcinomas and epithelial cancers. [Journal] // Lab Invest. - Teebken OE Bader A, Steinhoff G, Haverich A, Tissue engineering of vascular grafts:
1994. - pp. 70(1):6-22. human cell seeding of decellularised porcine matrix. [Journal] // Eur J Vasc Endovasc Surg. -
Sell Stewart Stem cell origin of cancer and differentiation therapy [Journal] // Oncology .2000 Apr;. - pp. 19(4):381-6.
Hematology. - 2004a. - pp. 51:1-28. Terada Naohiro [et al.] Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by
Sell Stewart Stem Cells [Book Section] // Stem cells handbook. - NJ : Humana Press Inc., spontaneous cell fusion. [Journal] // Nature. - 2002. - Vol. 416. - pp. 542-545.
2004b. Terai S [et al.] Improved liver function in patients with liver cirrhosis after autologous bone
Sémont A [et al.] Mesenchymal stem cells increase selfrenewal of small intestinal epithelium marrow cell infusion therapy [Journal] // Stem Cells. - 10 0, 2006. - Vol. 24. - pp. 2292-2298.
and accelerate structural recovery after radiation injury. Adv Exp Med Biol 2006; 585:19-30. Thompson JS [et al.] Growth of intestinal neomucosa on prosthetic materials. J Surg Res
Sethe S, Scutt A and Stolzing A Aging of mesenchymal stem cells [Journal] // Ageing Res 1986; 41:484-492.
Rev. - 02 0, 2006. - Vol. 5. - pp. 91-116. Thomson JA et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. [Journal] //
Shah B S [et al.] Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots Science. - 1998. - pp. 282:1145-1147.
[Journal] // Nano.Lett. - 10 0, 2007. - Vol. 7. - pp. 3071-3079. Thomson JA et al. Isolation of a primate embryonic stem cell line. [Journal] // Proc. Natl.
Shah K and Weissleder R Molecular optical imaging: applications leading to the Acad. Sci. USA. - 1995. - pp. 92:7844-7848.
development of present day therapeutics [Journal] // NeuroRx. - 04 0, 2005. - Vol. 2. - pp. Thomson JA et al. Pluripotent cell lines derived from common marmoset (Callithrix
215-225. jacchus) blastocysts. [Journal] // Biol Reprod. - 1996. - pp. 55:254-259.
Shake Jay G [et al.] Mesenchymal stem cell implantation in a swine myocardial infarct Thrasher JD Analysis of renewing epithelial cell population. [Book Section] // Methods in
model: engraftment and functional effects. [Journal] // Ann Thorac Surg. - 2002. - Vol. 73. - cell physiology, vol. 2 / book auth. Prescott DM. - New York : Academic, 1966.
pp. 1919-25; discussion 1926. Till JE et al. Hemopoietic stem cell differentiation. [Journal] // Biochim Biophys Acta. -
Shamblott MJ Axelman J, Wang S, Bugg EM, Littlefield JW, Donovan PJ, Blumenthal 1980. - pp. 605:431-459.
PD, Huggins GR, Gearhart JD. Derivation of pluripotent stem cells from cultured human Togel F [et al.] Administered mesenchymal stem cells protect against ischemic acute renal
primordial germ cells. [Journal] // Proc Natl Acad Sci U S A.. - 1998 Nov 10;. - pp. failure through differentiation-independent mechanisms [Journal] // Am J Physiol Renal
95(23):13726-31. Physiol. - 07 0, 2005. - Vol. 289. - pp. F31-F42.
Shapiro RS [et al.] Future issues in transplantation ethics [Journal] // Transplantation Tolar J [et al.] Sarcoma derived from cultured mesenchymal stem cells [Journal] // Stem
Reviews. - 2008. - Vol. 22. - pp. 210-214. Cells. - 02 0, 2007. - Vol. 25. - pp. 371-379.
212
Aplicații ale celulelor stem mezenchimale în reconstrucția tractului digestiv BIBLIOGRAFIE
Tomita S. [et al.] Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart Yamaguchi A., Komori T. and Suda T. Regulation of osteoblast differentiation mediated
function. [Journal] // Circulation. - 1999. - Vol. 100. - pp. II247-II256. by bone morphogenetic proteins, hedgehogs, and Cbfa1. [Journal] // Endocr Rev. - 2000. -
Tondreau T [et al.] Mesenchymal stem cells derived from CD133-positive cells in Vol. 21. - pp. 393-411.
mobilized peripheral blood and cord blood: proliferation, Oct4 expression, and plasticity Yhao XY et al. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation.
[Journal] // Stem Cells. - 09 0, 2005. - Vol. 23. - pp. 1105-1112. [Journal] // Nature. - 2009. - pp. 461(7260):86-90.
Trentin Andréa [et al.] Self-renewal capacity is a widespread property of various types of Yoo J U [et al.] The chondrogenic potential of human bone-marrow-derived mesenchymal
neural crest precursor cells. [Journal] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2004. - Vol. 101. - pp. progenitor cells [Journal] // J.Bone Joint Surg.Am. - 12 0, 1998a. - Vol. 80. - pp. 1745-1757.
4495-4500. Yoo J U and Johnstone B The role of osteochondral progenitor cells in fracture repair
Trentin JJ et al. Hemopoietic inductive microenvironments. [Book Section] // Stem cells. / [Journal] // Clin.Orthop.Relat Res. - 10 0, 1998b. - pp. S73-S81.
book auth. Cairnie AB et al. - New York : Academic, 1976. Yoon Y S [et al.] Clonally expanded novel multipotent stem cells from human bone marrow
Tropel Philippe [et al.] Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from adult regenerate myocardium after myocardial infarction [Journal] // J Clin Invest. - 02 0, 2005. -
mouse bone marrow. [Journal] // Exp Cell Res. - 2004. - Vol. 295. - pp. 395-406. Vol. 115. - pp. 326-338.
Tsai Ming-Song [et al.] Isolation of human multipotent mesenchymal stem cells from Young R G [et al.] Use of mesenchymal stem cells in a collagen matrix for Achilles tendon
second-trimester amniotic fluid using a novel two-stage culture protocol. [Journal] // Hum repair [Journal] // J.Orthop.Res. - 07 0, 1998. - Vol. 16. - pp. 406-413.
Reprod. - 2004. - Vol. 19. - pp. 1450-1456. Zaret K S and Grompe M Generation and regeneration of cells of the liver and pancreas
Tse WT Pendleton JD, Beyer WM, Egalka MC, Guinan EC. Suppression of allogeneic T- [Journal] // Science. - 12 05, 2008. - Vol. 322. - pp. 1490-1494.
cell proliferation by human marrow stromal cells: implications in transplantation. [Journal] // Zelzer Elazar and Olsen Bjorn R The genetic basis for skeletal diseases. [Journal] //
Transplantation.. - 2003 Feb 15;. - pp. 75(3):389-97. Nature. - 2003. - Vol. 423. - pp. 343-348.
Tuan Rocky S, Boland Genevieve and Tuli Richard Adult mesenchymal stem cells and Zhang [et al.] Synthesis and biocompatibility of porous nano-
cell-based tissue engineering [Journal] // Arthritis Res Ther. - 0 0, 2003. - Vol. 5. - pp. 32-45. hydroxyapatite/collagen/alginate composite [Journal] // Journal of Materials Science:
Tuli Richard A simple, high-yield method for obtaining multipotential mesenchymal Materials in Medicine, VJournal of Materials Science: Materials in Medicine, Volume 14,
progenitor cells from trabecular bone [Journal] // Molecular Biotechonoly. - 2003. - pp. 37- Number 7, July 2003, pp. 641-645(5)). - Volume 14, Number 7, July 2003 ,. - pp. pp. 641-
49. 645(5).
Ueda Y [et al.] Wnt/beta-catenin signaling suppresses apoptosis in low serum medium and Zhang J [et al.] Human bone marrow stromal cell treatment improves neurological
induces morphologic change in rodent fibroblasts [Journal] // Int J Cancer. - 06 10, 2002. - functional recovery in EAE mice [Journal] // Exp Neurol. - 09 0, 2005. - Vol. 195. - pp. 16-
Vol. 99. - pp. 681-688. 26.
Verfaillie C M, Pera M F and Lansdorp P M Stem cells: hype and reality [Journal] // Zuk PA et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based
Hematology.Am.Soc.Hematol Educ.Program. - 0 0, 2002. - pp. 369-391. therapies. [Journal] // Tissue Eng. - 2001. - pp. 7:211-228.
Wakitani S [et al.] Mesenchymal cell-based repair of large, full-thickness defects of articular Zvaifler N. J. [et al.] Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals.
cartilage [Journal] // J.Bone Joint Surg.Am. - 04 0, 1994. - Vol. 76. - pp. 579-592. [Journal] // Arthritis Res. - 2000. - Vol. 2. - pp. 477-488.
Walczak P [et al.] Dual-modality monitoring of targeted intraarterial delivery of
mesenchymal stem cells after transient ischemia [Journal] // Stroke. - 05 0, 2008. - Vol. 39. - Bibliografie foto
F1
pp. 1569-1574. - Din colecţia personală.
F2
Walles T [et al.] Influence of scaffold thickness and scaffold composition on bioartificial - Din colecţia doamnei Dr. Lucia Moldovan.
F3
graft survival. Biomaterials 2003; 24:1233-1239. - Din colecţia doamnei Dr. Mirela-Patricia Sîrbu-Boeţi.
F4
Waller E K [et al.] The "common stem cell" hypothesis reevaluated: human fetal bone - Din colecţia doamnelor Dr. Mihaela Chivu şi Coralia Bleotu.
marrow contains separate populations of hematopoietic and stromal progenitors [Journal] //
Blood. - 05 01, 1995. - Vol. 85. - pp. 2422-2435.
Wang J A [et al.] Anoxic preconditioning: a way to enhance the cardioprotection of Partea a I-a
mesenchymal stem cells [Journal] // Int J Cardiol. - 04 17, 2009. - Vol. 133. - pp. 410-412. http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Research-Tools/Image-Gallery/Image-
Wang J. S. [et al.] Marrow stromal cells for cellular cardiomyoplasty: feasibility and Detail.1199.html
potential clinical advantages. [Journal] // J Thorac Cardiovasc Surg. - 2000. - Vol. 120. - pp. Fig. 1.1
999-1005. http://www.kumc.edu/stemcell/intro.html
Wang Z.Q. [et al.] Morphologic evaluation of regenerated small bowel by small intestinal Fig. 3.2
submucosa. J Pediatr Surg 2005; 40:1898-1902. http://www.kumc.edu/stemcell/mature.html
Wang Z.Q. [et al.] Experimental assessment of small intestinal submucosa as a small bowel Fig. 3.4
graft in a rat model. J Pediatr Surg 2003; 38:1596-1601. http://www.kumc.edu/stemcell/early.html
Westen H and Bainton D F Association of alkaline-phosphatase-positive reticulum cells in Tab. 5.1
bone marrow with granulocytic precursors [Journal] // J.Exp.Med. - 10 01, 1979. - Vol. 150. - http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi?key=CFU-F
pp. 919-937. http://en.wikipedia.org/wiki/Pericyte
Wichterle H et al. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Fig. 8.7
[Journal] // Cell. - 2002. - pp. 110(3):385-97. www.rndsystem.com - Products for Wnt Research
Wilmut I et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. [Journal] // Fig. 9.1
Nature. - 1997. - pp. 385:810-813. http://www.riversideonline.com/source/images/image_popup/r7_bonemarrowaspiration.jpg;h
Wolfe M.et al. Isolation and culture of Bone Marrow-Derived Human Multipotent stromal ttp://www.rch.org.au/emplibrary/kidsinfo/BMA-
cells [Book Section] // Methods in Molecular Biology / ed. DJ BA Bunnell. - [s.l.] : Humana KidsHealthInfoRCH.jpg;http://farm2.static.flickr.com/1311/1384588528_e0e115aa48.jpg;
Press, 2008. Fig. 9.3
Wolfman N M [et al.] Ectopic induction of tendon and ligament in rats by growth and http://www.sigmaaldrich.com/prodimages/z/z720895.jpg;
differentiation factors 5, 6, and 7, members of the TGF-beta gene family [Journal] // J Clin http://images.google.ro/imgres?imgurl=http://www.sigmaaldrich.com/prodimages/z/z720895.
Invest. - 07 0, 1997. - Vol. 100. - pp. 321-330. jpg&imgrefurl=http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do%3FD7%3D0%26N5
Wong D J [et al.] Module map of stem cell genes guides creation of epithelial cancer stem %3DSEARCH_CONCAT_PNO%257CBRAND_KEY%26N4%3DZ720909%257CSIGMA
cells [Journal] // Cell Stem Cell. - 04 10, 2008a. - Vol. 2. - pp. 333-344. %26N25%3D0%26QS%3DON%26F%3DSPEC&usg=__eLn2ntO3H7NxmE1at7Snv8J9ww
Wong D J, Segal E and Chang H Y Stemness, cancer and cancer stem cells [Journal] // Cell M=&h=418&w=640&sz=111&hl=ro&start=4&um=1&tbnid=CJW32i67bMr8PM:&tbnh=89
Cycle. - 12 0, 2008b. - Vol. 7. - pp. 3622-3624. &tbnw=137&prev=/images%3Fq%3Dnunc%2Bcell%2Bfactory%26imgsz%3Dm%26imgtbs
Wu J [et al.] Intravenously administered bone marrow cells migrate to damaged brain tissue %3Dz%26hl%3Dro%26client%3Dfirefox-a%26channel%3Ds%26rls%3Dorg.mozilla:en-
and improve neural function in ischemic rats [Journal] // Cell Transplant. - 0 0, 2008. - Vol. US:official%26sa%3DG%26um%3D1
16. - pp. 993-1005. Anexa III. Fig,1.
Wulf G et al. Somatic stem cell plasticity: current evidence and emerging concepts. http://www.nuncbrand.com/us/frame.aspx?ID=10781
[Journal] // Exp. Hematol. - 2001. - pp. 29(12):1361-70. Fig 2.
http://www.genengnews.com/media/images/articles/block_6610.jpg
213
ISBN 9789730090154.