Sunteți pe pagina 1din 7

Partea a doua

BACTERIOLOGIE

SI MICOLOGIE SPECIALA

15

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR .AL INFECTIILOR STAFILOCOCICE

15.1. DATE GENERALE

15.1.1. 0 minidefinitie

S tafilocodi sun t coei sferici gram pozitivi, aseza (i in perechi sa u ciorchini. Dimensiunile 1;li capacitatea de a reline coloratia Gram sunt variabile. Sunt imobili, nesporulati. Facultativ anaerobi, ataca zaharurile fermentativ,

15.1. 2. Repere taxonornice

Genul Staphylococcus face parte din familia Micrococcaceae alaturi de alte genuri cum sunt: Micrococcus si Stomatococcus, prezente pe tnvelusurile ornului si animalelor de unde se raspandesc tn mediul ambiant. Microscopic asernanator cu stafilococii este genul Peptococcus cu 0 singura specie: P. niger, strict anaeroba,

Conform clasificarii actuate genul Staphylococcus reuneste 19 specii, pe care, practic,

Ie putem tmparji astfel:

• Stafilococi coagulazopozitivi:

S. aureus, specie antropozoofila S. in termedius, specie zoofila

• Stafilococi coagulazonegativi:

S. hominis }

S. ha.emoly/iCUS specii antropofiie

S. capitis S. a.

s. epidermidis } specii antropozoofile

S. saprophyticus

s. gallinarum } S. caprae S. 3.

Mai frecvent in patologia umaria sunt implicate S. aureus, specie conditional" patogena, S. epiderm idis ~i S. saprophyticus, s pecii acciden tal pa togene, Diferen tierea aces tor specii cu interes pentru microbioiogia rnedicala se face dupa gama de caractere consemnate in tabelul 15.1 .

specii zoofile

166

Caractere

rabelul 15.1. Diferentierea speciilor principale de Slitphy/ococclH

S. epidermldis

S. aureus

Coagulaza

+

Fosfataza

+

+

Argirundehtdrolaza

+

+

Ni tratreductaza

+

+

Perrnentarea manuel

+

Oxidarea:

• manitei

• galactozei

• manozel

• rlbozei

+ + + +

+ +

+

Reztsienia In. novobiocina (CMI",-I·.6pg/mll

s

s

R

S - sensibiJ.R - rezistent,

15.1.3. Habitat

s .. epidermidis este gazduit constant, iar S. saprophyticus ocazional, pe tegumente ~i in nari,

in colectivitatea generala, intre 20 si 40% din persoanele normale gazduiesc S. aureus in nari $i un procent asemanator in intestin, iar la personalul de spital procentuI purtatorilor creste paoa la 70-80. Prezenta S. aureus pe tegumente este tranzitorie, rezervorul nazal, eel intestinal $i leziunile stafilococice sunt cele care contarnineaza tegumentul cu aceasta specie.

Habitatul natural al stafilococilor si rezistenta La uscaciune explica prezenta lor foarte frecventa in aer, in alimente $i pe cele mai variate suprafete din ambianta noastra. Frecvent contarnineaza prelevatele patologice ~i impun criterii ferme pentru argumentarea semnificatiei clinice a tulpinilor izolate de la pacienti,

S. aureus este un important indicator sanitar de contaminate cu secrejii nazotaringiene a aerului si a supraf'etelor din blocul operator, materrntaji, colecrivitau de copii !ji institutii medicale.

15.1.4. Factori de patogenitate

S. aureus este 0 bacterie conditionat patogena invaziva si toxigena eu numerosi, dar fcarte variabili, factori de patogenitate.

Capsula si proteina A au efeete antifagocitare.

Coagulazelc elaborate de peste 96% din tulplni, coaguleaza plasma prin activarea unui factor similar trombinei (coagulaza Iibera) sau direct (coagulaza legata de celula cocilor) , Elaborate in faza logaritrnica de dezvoltare, eoagulazele pot fi antiragocitare prin

167

fibrina depusa pe suprafata stafilococilor, Favorizeaza aparitia trornbilor septici endovenosi in focaruJ de infectie stafilococica.

H emolizinele, in numar de patru (a, jJ, 'Y ~i 0), sunt exotoxine ell efect letal, dermonecrotic §i membranodistructiv asupra hematiilor, leueoeitelor, rnastocitelor, tromboci telor ~i celulelor tisulare,

Leucocidina lezeaza membranele celulare $i lizozomale ale leucocitelor.

Exfoliatina (epiderrnoliztna) este 0 exotoxina, care difuzeaza $i Ia distanta de focarul infectios cutanat $i rupe desrnozomii stratului spinocelular, provocand decolarea paturilor superficiale ale epidermei de stratul granules cu formare de flictene, leziuni lntalnite in «sindromul stafilococie al pielii oparites - boala Ritter, sindrornul Lyell, impetigo bulos.

Toxina 1 a sindromului socului toxic, abreviat TSST-l, numita ~i toxina pirogena, determine febra si un rash scarlatiniform. lnoculata experimental, mareste de 50 000 de ori sensibilitatea iepurilor 1a socul endotoxinic.

En. tero toxin eie , A, B, C, 0, E,si F, iermosta bile si rezisten te la enzimele digestive, actioneaza asupra rnucoasei digestive $i sistemurui nerves central, deterrninand hipersaiivatie, greturi si varsaturi grave, dureri epigastrice si, uneori, diaree apoasa, Doza toxica se realizeaza cand in aliment tulpina enterotoxigena de S. aureus depaseste concentratii de lOSUFC/g (ml): Semnele de boala apar dupa 0 incubatie de 3-6 ore ~i persista 1-2 zile pana la eliminarea toxinei din organism.

Alji factori de patogenitate ai S. aureus sunt: hialuronidaza, factor de difuziurie tisulara, stafilokinaza, fibrinolizina cu rot posibil in genera rea septicopioemiilor stafiloeocice prin liza trornbilor septici endovenosi, lipaze, care ii ex plica tropismul pentru unitatile pilosebacee.

S. epidermidis Si S. saprophyticus au un echipament de patogenitate modest din care putem reline prezenja variabila a hemolizinelor, dar mai ales a glicocalixului cu rol de ligand la epiteliusi suprafata cateterelor.

15.1.5. Receptivitatea la stafilococi

Raportata Ia trecventa portajului, frecventa infectiilor determinate de S. aureus este relativ redusa. Deficiente ale apararii antiinfectioase locale si sistemice deschid calea infecjiilor S fa filococice, Cand aceste deficien te sun f Ioarte im portan te, iSi po I man ifcs ta paten tia I ul de pa togenita te red us chiar si stafilococi j coagulazonega ti vi.

15.1.6. Infectiile stafilococice

S. aureus deterrnina inf'ecjii ell caracter supurativ, piogen: foliculite, furuncule, carbuncul, hid rosad eni 13, panaritii, flegmoane, infectii a Ie plagilor, Infec teaza m ucoasele cu apararea antiinfectioasa cornprornisa: otite, sinuzite (complicate eventual eu meningite) , pneumonii postgripale; endometrite post-partum ~i post-abortum, Intectiile cu S. aureus pot evolua baeteriemic $i septicemic Cll metastaze septice (osteornielite, abcese viscerale) , Uneori este implicat in uretritele si prostatitele nespecifice, Freevente sunt toxiinfectiile alimentare stafilococice, Enterocolitele stafilococice, ca disbioze ale antibioticoterapiei, sunt posibile.

168

S. aureus cauzeaza frecvent cazuri sporadice sau izbucniri epidemice de infectii nozocomiale.

S. epidermidis poate determina foliculite,acnee, blefarite, La pacienti cu proteze valvulare cardiace cauzeaza endocardite subacute. In cursul cateterismelor venoase prelungite genereaza bacteriemii de cateter.

S. saprophyticus este cunoscut ca 0 cauza de cistita Ia femei tinere active sexual.

15.2. INVESTIGATIA ETIOLOGICA A INFECTIILOR STAFILOCOCICE

15.2.1. Diagnosticul microbiologic 15.2.1.1. Prelevate patologice

Prelevatele patologice exarninate sunt in functie de tipul infectiei: puroi, sange, insertia intravenoasa a cateterelor, lichid cefalorahidian, sputa, raclat uterin in endornetrite, urina, materii fecale.

In toxiinfectiile alimentare se preleva probe de alimente, tampoane nazale de la personalul care manipuleaza alimentele, lichidul de lava] al mainilor si ustensilelor din bucatarii.

15.2.1.2. M icroscopia directa

Se etectueaza si se coloreaza Gram frotiuri, care sunt examinate prin obiectivul ell imersie. Se urmareste prezenta cocilor sferici grampozitivi izolati, in perechi sau, caracteristic, in grarnezi neregulate in contextul inflamator caracterizat prin prezenta -leucocitelor, frecvent alterate $i a fibrinei, In functie de produs, pot aparea $i celule tisulare alterate.

In infectii cronicizate stafilococii pot sa apara gramvariabili, de uode riscul confundarii lor cu Neisseria in prelevatele din uretrite, prostatite, cistite,

Microscopia, ca prima etapa, este orientativa, dar indispensabila pentru interpretarea corecta a sernnificatiei stafilococilor izolati in cultura,

15.2.1.3. Izolarea si identificarea

Etapa 1. Se epuizeaza 0 ansa din prelevatul patologic sau tamponul de prelevare pe rnediul de izolare:

- geloza-sange: prelevate necontaminate sau cu contaminare redusa ca puroi, lichid cefalorahidian, tampon nazal etc.;

- hiperclorurat ell lapte .o;;i ou, hiperclorurat ell manitol (Chapman): preleva te hipercontaminate en materii fecale, alimente, sputa.

Etapa II. Dupa incubare aeroba peste noapte la37°C, stafilococii forrneaza

colonii S, cu diametrul de 1-2 mm, bombate, apace, pigmentate auriu, alb sau galben, ell sau fara hernoliza completa pe geloza-sange $1 cu halou opac determinat de lecitinaza pe geloza eu lapte si au. Pe rnediul Chapman coloniile de S. aureus sunt manitopozitive (gal bene prin fermentarea manitei). AI!i stafilococi sunt rnanitonegativi.

169

Un numar de 3-4 colonii tipice, bine izolate, pe geloaa-sange sunt controlate microscopic si repicate pe panta de geloza, pentru a obtine suficienta cultura pura in vederea identificarii. Coloniile sugestive de pe mediile selective hiperclorurate vor fi reepuiza te pe o placa cu geloza-sange, pentru a veri fica puritatea culturii (pot contine bacterii de contaminare inhibate).

Etapa III . Cultura pura, verificata microscopic, este supusa testelor de identificare (tabelul 15.0 .

•. Depistarea coagulazei legate (clumping factor J. Pe 0 lama de microscop, intr-o picatura de apa, se omogenizeaza 0 ansa din cultura pura pentru a obtine 0 suspensie laptoasa. Se lnrnoaie un fir drept in plasma de iepure si se agita, prin rniscare circulara continua, limp de 5 secunde, in suspensie bacteriana, Aglutinarea stafilococilor din picatura in in terva I de 10 secunde sernnifica un test po ziti v . Testul nega tiv, a bsen ta agl u tinari i, trebuie confirrnat prin testul coagulazei libere, in tub.

NOTA: Nu se suspenstoneaza staftlococi in solupe sauoa (cauza de rezultate fals negative cu uncle tulpini). Un exces de plasma (e. g. 0 ansa) poate cauza rezultaje fals poziuve.

• Testul coagulazei libere. lntr-un tub 10/100 mm eu 0,5 ml plasma citratata de iepure dilua Itt 1/4 se suspensioneaza 0 ansa plina din cultura pura. Se incubeaza in baie de apa la 37°C ~i se verifica, prin tnclinarea tubului, dupa 30 minute :;;i 4 ore aparitia cheagului. 10 caz de rezultat negativ in acesr interval, se lasa tubul pima a doua zi 18 temperatura camerei si se urmareste din nou aparitia cheagului.

• Se epuizeaza cuitura pe geloza cu 0,01 % fosfat de Ienolftaleina si se incubeaza peste noapte Ia 37°C. Se expune cultura vaporilor de amoniac (0 bucata de hartie de filtru imbibata cu amoniac Si fixata pe capacui placii Petri). in interval de 1-2 minute coloniile stafilococilor producatori de [osfataui devin roz-rosii.

• Fermentarea sau oxidarea zaharurilor sunt urmarite prin testul alP.

• Rezistenta la novobiocina poate fj testata 0 data eu antibiograma tulpinii semnificativa clinic supusa identificarii.

Diagnosticul s epticemi ilor stafilococice i m pune hemocu 1 turi repeta teo in cond itii de antisepsie Si asepsie stricte, se recolteaza 5-10 ml sange din vena cubitala ~i se tnsamanteaza in 50-IDa ml bulion glucozat (proportia finala - sange: bulion = 1: 10). Hemoculturile incubate la 37°C tim p de 7-10 zile se urrnaresc macroscopic, microscopic si prin repicare pe geloza-sange in zilele I; 2; 3; 5; 7 si 10. Coloniile izolate din hemoculturi se identiftca conform testelor precizate mai sus.

In toxiinfectiile alimentare, S. aureus poate fi demonstrat ca agent etiologic pe baza urmatoarelor criterii:

a) Izolarea S. aureus in concentratii mai mad de 105UPCI g (rnl) de aliment.

b) Izolarea aceluiasi lizovar de S. aureus (vezi rnai jos) din voma sau tecate de la bolnavi, din alimentele incriminate pe baza eelui mai mare indice de atac epidemiologic (torturi , creme, tnghetate, produse lactate ~. a.) si de Ia purtatorii din personalul care a manipulat alimentele,

c) Depistarea enterotoxinelor stafilococice in alimente (reamintim termorezistenta lor), in voma sau culturi prin testul biologic la pui de pisica in greutate de 600-800 g injectate intraperitoneal. Dar testui are 0 reproductibilirate insuficienta, Testul de reterinta este, pentru iaboratoarele care dispun de reactivii necesari, identificarea enterotoxinelor prin imunodifuzie in gel cu seruri antienterotoxice polivalent si monovalente (A, B, C, 0, E, F).

170

15.2.2. Diagnosticul serologic

Poate fi tncercat in stafilocociile cronice, Se dozeaza anti-c-hernolizina. Serul persoanelor normale coniine intre 0 si 2 unitati antitoxice/rnl. in stafilococii titrul antitoxic creste peste 2 UA/ml ser.

15.2.3. Investigarea epldemiologica a intectiilor stafilococice nozocomiale

Demonstrarea filiatiei cazurilor de stafiloeocii in focarul epidemic ~i identificarea sursei de intectie pentru masurile de combatere si profilaxie impune lizotipia conform unei scheme cu truse de bacteriofagi stafilocoeici selectati pentru tulpinile umanesi, respectiv, animale. Izolarea aceluiasi Iizovar stafilococic din prelevatele patologice de la bolnavi, de la purtatori sau din alimente demonstreaza fenomenuI epidemic.

15.2.4. Biopreparate s,i antibiotice pentru diagnosticul de laborator, profilaxia si tratamentul stafilocociilor

• Irnunoglobulina antistafilococica.

• Ser imun antistafilococic.

• Plasma antistafilococica.

• Anatoxina stafilococica.

• Vaccin omorat.

• Autovaeein.

• Seruri antienterotoxice (A, B, C, D, E, F).

• Bacteriofagi stafilococici.

• Antibiotice utile in tratarnentul stafilocociilor:

a) in infectiile eu tulpini neproducatoare de ,B-laetamaze: penicilina G (asociata eu gen tamicina in inf'ecjiile severe si septicemii) . Alterna ti v, pen tru pad en tii sensi bili za 1i la penieiline, eritromicina, lincomicina, cefalosporina, rifampicina, pristinarnicina, vancornicina (rezervata cazurilor determinate de tulpini rezistente la alte antibiorice) ,

b) in infectiile eu tulpini producatoare de ,B-laetamaze: 0 penicilina de semisimeza rezistenta 1a penicilinaza stafilococica (oxacilina etc., asociata ell genramicina in infectiile severe). Antibiotice alternative vezi mai sus.