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PRELEVEMENTS
GENITAUX
COLLECTION TECHNIQUES
MICROBIOLOGIQUES
K.RAHAL
A.BENSLIMANI
Edition Pirates
EDITIONS PIRATES
PRELEVEMENTS
GENITAUX
COLLECTION : TECHNIQUES
MICROBIOLOGIQUES
1
Benslimani A. (EHS Dr Maouche).
Rahal K. (I.P.A)
BACTERIOLOGIE
HEMOBIOLOGIE
MYCOLOGIE
BACTERIOLOGIE
VIROLOGIE
PARASITOLOGIE
IMMUNOLOGIE
LES MANUELS DE BIOLOGIE
BIOLOGIE CLINIQUE
MOLECULAIRE
BIOCHIMIE
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
2
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
PRELEVEMENTS
PRELEVEMENTS
GENITAUX
COLLECTION : TECHNIQUES MICROBIOLOGIQUES
Benslimani A. (EHS Dr Maouche).
Rahal K. (I.P.A)
3
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
I-Sommaire
Préface P13
Introduction 15
Chapitre I-Généralités : 16
1-Chez l’homme : 26
2-Chez la femme : 29
3-Chez l’enfant : 33
A-Préliminaires : 35
B-Technique de prélèvement : 37
1-Chez l’homme : 37
2-Chez la femme : 39
2-2-Prélèvement vulvaire 39
2-5-prélèvement du stérilet : 40
3-Chez l’enfant 41
4
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
1-prélèvements complémentaires : 44
C-Conservation et transport : 46
1-Neisseria gonorrhoeae : 46
2-Chlamydia trachomatis : 46
3-Mycoplasmes génitaux : 46
5-Haemophilus ducreyi : 46
A-Ecoulements génitaux 47
I-Chez l’homme : 47
1-Prélèvement urétral : 47
1-1-Examens directs : 47
1-2-1-Neisseria gonorrhoeae : 47
1-2-2-Germes banals : 48
1-2-3-Mycoplasmes génitaux : 49
1-2-3-2 : La culture de Mycoplasmes par galerie Mycoplasma DUO (Sanofi Diagnostic Pasteur) : 51
1-2-4-Chlamydia trachomatis : 52
2- Spermoculture : 58
2-1-Examens directs : 58
5
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
2-2-culture 58
3-Secrétions prostatiques 59
3-1-Examens directs : 59
3-2-Cultures 59
4-Orchi-épididymite : 59
5-2-Recherche de chlamydia trachomatis au niveau d’un frottis conjonctival par coloration Giemsa : 60
II-Chez la femme : 62
1-Prélèvements cervico-vaginaux : 62
1-1-Généralités : 62
1-3-Culture 66
2-Prélèvements vulvaires : 68
4-1-prélèvement endo-utérins : 69
I-Chancre syphilitique : 71
Le matériel : 71
Observation de l’échantillon : 71
Interprétation : 72
II-Chancre Mou : 73
6
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
1-Examens directs : 73
2-Milieux de culture : 73
III-Donovanose : 74
1-Examens directs 74
2-Diagnostic bactériologique 74
IV-Ulcérations herpétiques : 75
Equipements et réactifs : 75
Mode opératoire : 75
Lecture : 75
Réactifs : 76
Mode opératoire : 76
Lecture 76
7
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
A-Ecoulements génitaux : 80
I-Chez l’homme : 80
1-L’examen direct : 80
2-La culture 80
6-La spermoculture : 82
II-Chez la femme : 83
A-Neisseria gonorrhoeae 87
B-Gardnerella vaginalis : 87
D-Candida Albicans : 88
E-Haemophilus ducreyi : 88
F-Mobiluncus : 89
I-principe : 90
II-Mode opératoire : 90
1-Les antibiotiques : 91
2-Standardisation de l’inoculum 92
8
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
3-Distribution de l’inoculum : 92
III-Lecture : 92
I-Antibiotiques à tester : 93
II-Inoculum : 93
I-Principe : 94
II-techniques : 95
1-1-Matériel et réactifs : 95
1-2-Mode opératoire : 95
1-3-Lecture et interprétation : 95
2-Technique RPR : 96
2-1-Matériel et réactifs : 96
2-2-Mode opératoire 96
Test qualitatif : 96
Test qualitatif : 96
3-le TPHA : 98
3-1-Matériel et réactifs : 98
3-2-Mode opératoire : 98
Réaction qualitative : 98
Témoin négatif : 99
Témoin Positif : 99
La lecture : 100
Interprétation : 100
9
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Réaction quantitative : 101
Lecture : 101
4-2-Réactifs : 102
4-4-Interprétation : 103
1-1-principe : 106
1-3-Technique : 106
2-1-Principe : 108
2-3-Technique : 108
10
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
3-Par méthode ELISA : 110
3-1-Principe : 110
Conclusion 115
Bibliographie 116
Annexe A 120
Annexe B 134
11
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
12
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Préface :
Nous, groupe de microbiologistes professionnels avons décidé de rédiger plusieurs fascicules
de techniques microbiologiques afin de faciliter le travail :
Dans chaque fascicule de 50 à 100 pages, un seul sujet sera traité ; chaque fascicule sera mis
au fur et à mesure de sa parution, a la disposition des biologistes.
Ces techniques seront adaptées au contexte algérien, cependant nous traiterons également des
techniques appliqués dans les pays développés. Chacun, selon ses moyens, pourra ou non les
mettre en application.
Ces techniques devront être améliorées et par conséquent, seront réactualisées cinq ans après
leur parution
13
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Principales abréviations
Ac Anticorps
BCP Gélose au bromocrésol Pourpre
CMV Cytomégalovirus
CMP Chloramphénicol
CE Corps élémentaires
CR Corps réticulés
E.C.P Effet cytopathogéne
FR Facteur rhumatoïde
GN Gélose nutritive
GSF Gélose au sang frais
GSC Gélose au sang cuit
GC Gélose GC
GR Globule rouge
HIV Human immunodeficiency Virus.
HSV Herpes virus
HPV Papillomavirus
HCA Hôpital central de l’armée
IFD Immunofluorescence directe
LGV Lymphogranulomatose vénérienne.
LPS Lipopolysacharides.
MGG May Grunwald Giemsa
MH Mueller-Hinton
NR Nitrate –Réductase.
Nal Acide nalidixique
ONPG Ortho-Nitro-Phényl-Galactopyranoside
PVX Polyvitex
PAL Phosphatase Alcaline
P.U. Prélèvement urétral
PV Prélèvement vaginal
PN Polynucléaires
P20 et P100 Micropipettes de 20 ul et 100 ul
RM Test au rouge de méthyle
SVF Sérum de veau fœtal
TSA Trypto-caséine Soja Agar
TSB Trypto-caséine Soja Broth
TGY Tryptose glucose yeast
UNG Urétrite non gonococcique
VRS Virus respiratoire syncitial
VP Réaction de Voges Proskauer
14
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Introduction
F
ace à une infection génitale, le microbiologiques avec, le plus souvent des
médecin est orienté vers tel ou tel examens sérologiques.
agent étiologique par des
manifestations cliniques plus ou moins En effet, la diversité et l’intrication des
évocatrices. manifestations cliniques d’infection
Ainsi, la classique goutte urétrale matinale génitale, les imprévisibles associations de
caractérise l’infection gonococcique plusieurs agents pathogènes ( car « un
masculine. germe peut en cacher un autre ») ainsi que
De même des leucorrhées blanchâtres et le risque de résistance bactérienne
caillebottées font penser à priori à une plasmidique, font de ce type d’analyse une
mycose vaginale, alors qu’un écoulement étape primordiale dans la prise en charge
spumeux et verdâtre évoque plutôt une des infections génitales.
trichomonase. Par ailleurs, la majorité de ces infections
D’autres motifs de consultation, tel une ou sont des maladies sexuellement
plusieurs ulcérations génitales, des transmissibles qui font payer un lourd
condylomes ou encore une dermatose de la tribut à la société et dont le diagnostic
sphère génitale, orientent vers un certain étiologique correct passe obligatoirement
nombre d’agents étiologiques. par une analyse microbiologique
exhaustive.
Le médecin s’appui alors sur
l’interrogatoire et l’examen clinique Enfin, l’exploration des cas de stérilité, les
minutieux du patient, comme première infections génitales chez l’enfant et la
étape du diagnostic et point de départ du surveillance d’une grossesse sont des
choix thérapeutique. indications fréquentes de ce type d’analyse
biologique.
En effet, les infections génitales font
généralement l’objet d’une prescription de Ce manuel retrace les étapes du diagnostic
première intention, basée sur des de laboratoire des infections génitales.
algorithmes construits pour orienter le Le diagnostic des maladies sexuellement
diagnostic et le traitement des MST (en transmissibles sans manifestations
majorité, avec localisation génitale). cliniques d’infection génitale (SIDA,
Cependant, il reste souhaitable de faire Hépatites…) n’y sera pas abordé.
précéder le traitement antibiotique, de
prélèvements génitaux pour analyse
15
Chapitre I-Généralités :
A-rappel anatomique et physiologique de
l’appareil génital :
C
hez l’homme, l’appareil génital se Exocol
confond avec le bas appareil urinaire. Culs de sac antérieur, latéraux et
En effet, l’urètre de l’homme est long, postérieur.
comprend une portion antérieure ou distale qui Cavité vaginale
traverse le corps spongieux et une portion Clitoris
postérieure (traverse la prostate) et l’uretère Petites lèvres
membraneux. Grandes lèvres
Les secrétions prostatiques et le liquide La flore vaginale commensale varie en
séminal se déversent dans le canal urétral. fonction de l’âge, de l’état immunitaire, de la
Alors que les vésicules séminales, le canal période du cycle ovarien, de la prise d’anti-
déférent, l’épididyme et les testicules sont infectieux par voie locale et générale.
stériles, la flore génitale se localise au niveau Chez la femme en période d’activité sexuelle,
du gland et de l’urètre distal. la flore vaginale comprend bactéries Aéro-
Il s’agit d’une flore commensale poly anaérobies et autant de bactéries anaérobies
microbienne voisine des flores entériques et strictes par gramme de sécrétion vaginale.(12)
cutanée.(12-20). Certaines d’entre elles sont des saprophytes
Chez la femme : l’appareil génital est sans potentiel pathogène, d’autre sont
totalement distinct de l’appareil urinaire. pathogènes opportunistes.
1-Flore aérobie :
Staphylococcus aureus
Streptococcus B
Streptococcus D
Entérobactérie
Pseudomonas aeruginosa
Gardnerella vaginalis
C Albicans et d’autres levures
Mycoplasmes sp
Listeria monocytogenes
2-Flore anaerobie
Peptococcus
Peptostreptococcus
Bacteroides
Clostridium perfringens
Mobiluncus sp
Prevotella sp
Actinomyces sp
17
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Groupe I : espèces bactériennes dont le portage est habituel : 98 à100 % des flores normales
Groupe II : espèces bactériennes dont le portage est fréquent : 5 à 30 % des flores normales.
Chez l’enfant de sexe masculin : non circoncis, Sur le plan physiologique, l’épithélium vaginal
on peut parfois retrouver une malformation est constitué d’une seule couche de cellules
telle un phimosis à l’origine d’infections uro- basales car non stimulé par les œstrogènes.
génitales
Privé de glycogène, son pH est alcalin ce qui le
Chez la petite fille : les organes génitaux rend favorable à l’implantation d’une flore
présentent des particularités anatomiques et mixte non spécifique :
physiologiques qui protègent mal contre le
développement d’infections. Staphylococcus coagulase (-)
Streptococcus alpha et non
Sur le plan anatomique on note la proximité de hémolytiques
l’anus par rapport à l’orifice génital, la béance Entérobactéries
de l’orifice hyméneal, l’orientation verticale de Corynebacterium sp
la vulve et le non développement des petites Anaérobies strictes.
lèvres.
18
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
19
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
VHB Hépatite B
20
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Levure :
Candida Albicans et autres levures
Parasites :
Trichomonas vaginalis
Virus :
HSV 2 et 1 – adénovirus –coxsackivirus
HPV des voies génitales : condylome accuminata type 16-11
HPV associé au carcinome cervical (surtout les types 16 et 18 , de même que de nombreux autres)
21
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
22
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Infection Post chirurgie Apres Hystérectomie Par exemple Cocci gram + aérobies
gynécologique Cellulite pelvienne Bacilles Gram –
Abcès pelvien Anaérobies (Peptostreptococcus)
Mycoplasmes génitaux.
Chancre génitale o ulcération Chancre localisé à la vulve avec ou sans Treponema pallidum
adénopathie inguinale fistulisée ou non. Haemophilus ducreyi
Chlamydia trachomatis L1.L2.L3.
Calymmatobacterium granulomatis
Condylome génitaux localisation à la vulve et au niveau du col signe de HPV : les types les plus fréquents sont 6-11-16.
exophytiques ou plats colpite et de cervicite à minima.
Dermatose des organes génitaux Signes de grattage ++++ Phtirius pubis et Sarcoptes scabei
23
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Prénatal Virus
CMV, Rougeole, Parvovirus B19 et entérovirus
Parasites :
Toxoplasma gondii
Bactéries
streptocoque B
E coli
Ascendante listeria monocytogenes
C trachomatis
Mycoplasmes génitaux
Virus
CMV, HSV
Bactéries
Streptocoque B
Natale Au passage de la filière E coli
génitale C trachomatis
Listeria monocytogenes
N.gonorrhoeae
Virus
CMV, HSV, HPV, entérovirus, HBV, HIV
Post-natale Toutes les voies précédentes Tous les agents précédemment cités avec, en plus des
ou à partir de l’environnement agents de l’environnement y compris les BGN et les virus
tel VRS.
24
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Candida Albicans
Staphylococcus aureus
Streptococcus Beta-hémolytique et autres germes pyogènes ;
Neisseria gonorrhoeae (abus sexuels, perversion dans la tranche 12-15 ans).
La fillette : les vulvites de la petite fille représentent une des préoccupation des pédiatres car elles son
souvent recidivantes.les agents incriminés sont :
Streptococcus pyogènes
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influanzae
Neisseria gonorrhoeae qui fait évoquer l’abus sexuel
Candida Albicans
Autres : trichomonas vaginalis, chlamydia trachomatis (abus sexuels).
2-soit des agents commensaux ou saprophytes de la flore périnéale, retrouvé en culture mixte, souvent
associés à une oxyurose ou à un corps étranger intra-vaginal :
Staphylococcus aureus
E coli
Klebsiella sp
Proteus sp
Anaérobies stricts
25
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
En Algérie, quelques travaux rapportent les taux de prévalence des agents incriminés dans les urétrites
chez l’homme et les leucorrhées pathologiques chez la femme et ce, au cours de la dernière décade.
1-Chez l’homme :
dans les urétrites évaluées en milieu militaire entre 1990 et 1993 (NAIM thèse 1995) N gonorrhoeae
vient en 1ère position avec une prévalence de 17.47% à l’HCA et de 33.78 % à l’hôpital militaire de
Tindouf.
Il est suivi par C trachomatis pour lequel est rapportée une prévalence de 16.50 % à l’HCA et de 14.86
% à Tindouf.
Les autres agents d’urétrite masculine isolés au cours de ce travail sont rapportés dans le tableau 8 :
Tableau 8 : prévalence des germes pathogènes retrouvés dans les prélèvements urétraux
(M.NAIM ,1995) :
HSV1 0.38 0
26
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Les associations d’agents pathogènes dans les urétrites ne sont pas rares. Ainsi le professeur NAIM
rapporte dans sa thèse 36 cas (Tableau 9).
Pour ce qui concerne les associations « Urétrite-autre MST », le professeur NAIM rapporte 10 cas
parmi les échantillons étudiés (Tableau 10).
Toujours dans la population militaire, le chancre mou représenterait l’étiologie la plus fréquente des
ulcérations génitales. Ainsi ,80 % des cas diagnostiqués à l’HCA entre 1989 et 1998 seraient dus à cet
agent. Cette observation est corroborée par une étude plus ancienne réalisée dans la région de Tlemcen
sur 3 ans (1988-1991) et qui retrouve 76 % de cas de chancre mou (8).
Les données rapportées par NAIM concernent une population masculine à risque de MST, en
l’occurrence la population militaire.
Même si les chiffres obtenus ne reflètent pas fidèlement ce qui se passe dans la population masculine
algérienne, ils ont un intérêt certain dans l’évaluation de la place respective des agents de MST en
Algérie.
27
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
A noter que dans une récente publication (19), Naim et coll classent en pourcentages les étiologies des
urétrites en Algérie comme suit.
Gonocoque : 25 %
Chlamydia trachomatis : 17 %
Mycoplasme sp : 7%
Autres : 18 %.
Indéterminée : 33 %
L’enquête prospective du Dr BELABED (thèse 1999) vient apporte un complément au travail du Pr.
Naim en évaluant la place des mycoplasmes dans les prélèvements génitaux chez l’homme.
Elle montre que les taux d’isolement des mycoplasmes génitaux dans les prélèvements masculins
(urètre, sperme) ne sont pas négligeables, avec un pourcentage plus élevé pour Ureaplasma
urealyticum. (Tableau 11)
28
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
2-Chez la femme :
Les études étiologiques prospectives ou rétrospectives concernant notre population féminine sont là
encore limitées.les agents microbiens retrouvés dépendent du type de population recrutée (exposée ou
non aux MST), des sites génitaux ayant fait l’objet de prélèvements (vaginal, cervical, endometrial) et
des techniques mises en œuvre.
Ainsi une étude rétrospective des résultats d’analyses microbiologiques de prélèvements vaginaux
pratiqués durant l’année 1990 à l’hôpital Parnet, a passé en revue des agents microbiens isolés dans
une série de 387 prélèvements effectués chez des femmes consultant pour des symptômes d’infection
génitale (5).
Le taux de positivité était de 31 % et les germes isolés se repartissent entre 50 % de bactéries, 35% de
levures et 15 % de trichomonas vaginalis.
Parmi les 120 PV « positifs »,24 % montraient une double association de germes : 4% à candida-
trichomonas vaginalis, 9% à bactérie-Trichomonas vaginalis, 11 % à candida-bactérie. A noter une
triple association E coli + candida Albicans+Trichomonas vaginalis
Les 196 germes isolés se répartissaient par ordre décroissant de fréquence comme suit :
L’analyse des prélèvements a comporté, en plus des agents bactériens aérobies, une recherche
systématique des bactéries anaérobies strictes. Le taux de positivité a été de 87 %.
29
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Les bactéries anaérobies strictes, au nombre de 21 souches, ont été isolées 11 fois seules ou associées
entre elles et 10 fois associées à l’un des agents précédemment cités.
Propionibacterium acnes : 4
Lactobacillus jensenii : 3
Lactobacillus fermentum : 3
Peptococcus spp : 2
Streptococcus intermedius : 2
Bacteroides spp : 1
Non identifié : 6
Cette 2ème enquête s’est intéressée plus particulièrement aux anaérobies et à leur fréquence
d’isolement dans les prélèvements génitaux féminins.
A souligner que ces agents ont été souvent associés à des leucorrhées verdâtres, abondantes, fétides (4
fois sur 5), au port du stérilet (2 fois sur 3) et à des antécédents d’avortement (1 fois).
Par contre, aucune Gardnerella vaginalis n’a été isolée, ce qui est en contradiction avec les données de
la littérature qui associent fréquemment cette bactérie aux anaérobies stricts.
A travers ces 2 études, on peut apprécier l’importance de candida Albicans comme agent d’infection
génitale chez la femme. De même trichomonas vaginalis est souvent retrouvé.
Quant aux agents commensaux ou saprophytes de la flore vaginale, ce sont surtout les streptocoques,
staphylocoques et entérobactéries qui ont été le plus souvent incriminés.
Les bactéries anaérobies strictes agents de la flore vaginale normale, peuvent se multiplier
anormalement au dépend du reste de la flore si des conditions locales particulière sont présentes (Ex
stérilet).
A noter le très faible taux d’isolement de Gardnerella vaginalis, agent pourtant bien connu de vaginite
non spécifique.
Aucun gonocoque n’a été retrouvé, probablement en raison du type de recrutement des patientes
(population à bas risque de MST).
Nous rapportons également les résultats d’une autre étude microbiologique de prélèvements génitaux,
effectuée au HCA et qui a porté sur 1455 prélèvements positifs (19).
Dans cette enquête, C Albicans est en tête des étiologies avec 39.17% des cas.
Les autres agents isolés se classent loin derrière avec une fréquence d’isolement allant de 13.25% à
0.41 % (voir tableau n°12).
Ici encore, on peut noter que les streptocoques, Trichomonas et les entérobactéries restent les micro-
organismes les plus isolés après C .Albicans.
30
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Mycoplasmes, Chlamydia trachomatis et N gonorrhoeae ont été recherchés mais peu souvent
retrouvés.
Tableau N°12 : Nature et fréquence des germes retrouvés dans les prélèvements génitaux féminins
(Naim et coll, 2000)
Nombre Pourcentage
Candida Albicans 570 39.17
Streptococcus B 193 13.25
E coli 177 12.16
Trichomonas vaginalis 115 7.90
Ureaplasma urealyticum 102 7.01
Klebsiella sp 85 5.84
chlamydia trachomatis 58 3.98
proteus sp 54 3.71
staphylococcus sp 40 2.74
Mycoplasma hominis 22 1.51
Pseudomonas sp 18 1.20
Enterobacter sp 9 0.61
N gonorrhoeae 6 0.41
Acinetobacter sp 6 0.41
Les autres agents responsables de symptômes de la sphère génitale mais peu ou non connus comme
sexuellement transmis, n’ont pas faits l’objet de recherche.
Tableau 13 : agents de MST isolés chez la femme Algérienne à Alger, Oran et Mostaganem
(ADDAD ,1993).
31
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
A noter que, dans cette étude, des associations de MST on été fréquemment retrouvées,
particulièrement chez les femmes à haut risque (prostituées : 36% et incarcérées : 8.4%)
La place des mycoplasmes a été également évaluée par BELABBED dans un échantillon représentatif
de la population féminine algérienne (Tableau 14)
Tableau 14 : répartition des agents microbiens dans les prélèvements génitaux féminins (BELABED
,1999) :
Echantillon N 353 87
Type de prélèvement PV P. vulvaire
Levures 68 13
corynebacterium sp 45 7
trichomonas vaginalis 23 4
Haemophilus sp 22 2
streptococcus B 6 0
E coli 5 0
Streptococcus D 2 0
Klebsiella 2 0
Staphylococcus doré 1 0
streptococcus NG 3 1
N.gonorrhoeae 0 0
Mycoplasma hominis 82 17
U.urealyticum 112 30
Pour ce qui concerne l’isolement des mycoplasmes génitaux, les chiffres rapportés par BELABED
sont résumés à travers le tableau 15 :
Sur 133 PV positifs, il ya eu 104 associations de mycoplasmes avec des bactéries ou des
levures (29.4% de l’ensemble des échantillons).
Sur 21 P. vulvaires positifs, 9 sont des associations avec des mycoplasmes (10.34 % de
l’ensemble des échantillons).
32
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
3-Chez l’enfant :
Des données concernant l’infection génitale chez la fillette sont rapportées par une enquête étiologique
prospective effectuée en 1993 au niveau des consultations pédiatriques de l’hôpital Parnet et du CHU
Béni-Messous (A. Benslimani et coll, résultats communiqués durant le congrès maghrébin de
Pédiatrie, 1996).
Ainsi, 87 cas de vulvites symptomatiques (âge moyen des enfants : 6 an et demi) ont faits l’objet de
prélèvements microbiologiques et parasitologique.
Entérobactérie : 15 Entérobactérie : 4
7 E coli 2 E coli
4 P mirabilis 1 P mirabilis
2 S flexneri 1 S flexneri
2 K pneumoniae Haemophilus influanzae : 3
Streptocoques : 11 Streptocoques : 3
staphylocoques : 8 staphylocoques : 2
Haemophilus influanzae : 3 C.Albicans :1
levures : 3
divers : 3
En définitive, même s’ils ne sont pas toujours représentatifs de la population générale, les différents
échantillons ayants fait l’objet des enquêtes rapportées, ont permis d’aboutir à certains résultats.
Chez une population masculine exposée au risque de MST (militaire), les UNG prédominent sur les
urétrites gonococciques.
A noter cependant que Neisseria gonorrhoeae vient en tête des étiologies d’urétrite, suivi de chlamydia
trachomatis.
Quant aux mycoplasmes génitaux, ils sont surtout représentés par Ureaplasma urealyticum
Enfin des associations de plusieurs agents d’urétrite sont souvent rapportées, de même que dans
associations d’urétrite avec d’autres MST.
Dans la population féminine, candida Albicans st l plus souvent isolé comme agent d’infection
génitale.
Parmi les agents de la flore vaginale pathogène opportuniste, les streptocoques, staphylocoques et
entérobactéries sont régulièrement incriminés.
33
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Les agents spécifiques de MST, s’ils sont recherchés au sein d’une population féminine exposée au
risque (prostituée, incarcérées) sont dominés par chlamydia trachomatis, suivi de N .gonorrhoeae.
Quant aux mycoplasmes génitaux dans la population féminine, on note encore la prédominance
d’U.urealyticum sur M hominis.
Chez la petite fille, la vulvo-vaginite est fréquemment causée ou aggravée par une parasitose sous-
jacente : l’oxyurose.
A souligner cependant que ceci ne doit pas faire oublier la possibilité de l’abus sexuel qui doit être le
premier souci du pédiatre devant ce type d’infection.
34
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Il serait souhaitable que tout laboratoire d’analyses médicales dispose d’une pièce (avec lavabo et
sanitaires) réservée aux prélèvements génitaux.
On doit y trouver :
Au moment de la prise de rendez vous pour prélèvements génitaux ,une fiche de recommandations est
remise à la patiente.
Elle comporte :
35
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
La femme doit se présenter immédiatement avant ou après les menstruations (sauf en cas
d’indication d’une culture de BK, qui doit être pratiquée sur sang menstruel).
La fiche de renseignements cliniques est primordiale et il serait souhaitable qu’elle soit remplie par le
médecin ou le gynécologue traitant. (Voir prototype en annexe A).
En pratique courante, les prélèvements génitaux féminins sont effectués par le gynécologue et
adressés au laboratoire d’analyse par le biais de la patiente.
36
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
B-Technique de prélèvement :
I- Les écoulements génitaux :
1-Chez l’homme :
1-1-Le prélèvement urétral :
Apres nettoyage du méat urétral à la compresse stérile imbibée d’eau stérile , on procede comme suit :
On utilise une anse bactériologique stérilisée et refroidie dans un tube d’eau physiologique
puis introduite à 3-4 cm dans le canal urétral.
En cas d’écoulement discret ou absent demander au patient de masser le trajet de l’urètre en
direction du méat pour ramener le maximum de sécrétions.
Le prélèvement peut aussi se faire à l’aide d’une pipette pasteur boutonnée ou d’un écouvillon
fin en alginate.
Il ne faut jamais utiliser d’écouvillon classique.
Il faut proscrire l’auto-prélèvement.
Le pus urétral prélevé servira aux cultures et étalement sur lame (frottis).
Chlamydia trachomatis : on ramène des cellules urétrales en introduisant u écouvillon type
CYTOBRUSH ou BACTOPICK à 2-3 cm dans le canal urétral et en le faisant pivoter.
L’écouvillon sera ensuite exprimé sur 2 lames pour IF.
Un second écouvillon du même type, destiné à la culture, sera plongé dans un milieu de
transport type 2SP. Une fois le liquide qu’il contient totalement exprimé dans le milieu,
l’écouvillon pourra être retiré du tube.
Ureaplasma urealyticum : si l’écoulement urétral n’est pas franc, d’autres types de
prélèvement seront préférés (spermoculture, 1er jet urinaire).
En cas de goutte abondante, on peut en prélever un échantillon sur un écouvillon en coton que
l’on exprime immédiatement dans le milieu A3.
Lavage des mains à l’eau et au savon puis rinçage des mains à l’eau suivi d’alcool.
Réaliser une toilette soigneuse des organes génitaux à l’aide d’eau et de savon, suivi d’un
rinçage abondant à l’eau.
Se laver les mains une 2ème fois à l’eau et au savon, se rincer les mains à l’eau puis à l’alcool.
Le prélèvement de sperme est recueilli après masturbation dans un flacon en plastique stérile
qui ne sera ouvert qu’au moment du prélèvement et pas avant.
Refermer aussitôt le flacon et le remettre rapidement au personnel du laboratoire qui procédera
immédiatement aux examens microscopiques.
37
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
On distingue :
On prélève 4 échantillons
Procédure :
Il faut éviter toute contamination par le prépuce chez le sujet jeune non circoncis. Pour cela,
maintenir le méat bien dégagé pendant toute la procédure ;
Il faut éviter toute contamination par le savon utilisé lors de la toilette.
Nettoyer le gland avec du savon et rincer abondamment à l’eau stérile. Sécher le gland avec
une compresse stérile ;
Recueillir les 10 premiers ml d’urine dans un tube stérile ;
Pendant que le sujet continue à uriner, retirer le tube.
Attendre qu’il urine approximativement 200 ml et insérer le 2ème tube pour y collecter les 10
ml du milieu du jet.
Immédiatement après, le patient doit stopper sa miction et éliminer toute gouttelette d’urine du
méat urétral.
Le patient se met alors en position genu-pectum et place un flacon stérile à large ouverture
sous le méat. Le médecin pratique un massage prostatique et les gouttes de liquide prostatique
tombent directement dans le flacon, sous la pulsion pratiquée par le médecin sur l’urètre
bulbaire (EPS).
Apres collection des secrétions prostatiques, le patient urine et les 10 premier ml sont collectés
dans un 4ème flacon. (VB3).
Objectif de cette technique des 4 prélèvements : poser le diagnostic d’une prostatite, différencier une
urétrite d’une prostatite.
38
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
2-Chez la femme :
2-1-Prélèvements cervico-vaginaux : (7.10)
Mettre en place un spéculum stérile non lubrifié mais seulement humidifié à l’eau tiède ;
Nettoyer soigneusement le col à l’aide d’une compresse stérile montée sur une pince et imbibée d’eau
stérile.
Site « 1 » : endocol.
Site »2 » : cul de sac postérieur.
Site « 3 » : vagin ou exocol.
Utiliser 3 écouvillons pour chacun des sites « 1 » et « 2 » et 1 seul écouvillon pour le site « 3 ».
2-2-Prélèvement vulvaire :
Dans les cas ou les prélèvements cervico-vaginaux ne peuvent être effectués (vierge, prépubert,
hystérectomisée), le prélèvement vulvaire peut permettre la détection du ou des agents
d’infection génitale mais au prix d’un risque accru de contamination par la flore cutanéo-
muqueuse de voisinage.
On recommande à la patiente d’éviter toilette vulvo-vaginale depuis 24 h et toute médication
locale ou générale depuis au moins 3 jours.
Le prélèvement dans les zones inflammatoires de la région vulvaire , de préférence au sein des
secrétions purulentes. On prélève 4 écouvillons au moins (+ cytobrosse si recherche de
Chlamydia).
Chez la petite, un scotch test vulvaire et anal doit être effectué à distance du prélèvement
vulvaire, dés le lever (expliquer la procédure à la mère et lui remettre 2 lames propres).
Le matin, avant la toilette, mettre l’enfant en position genu-pectum .déplisser la marge anale et
appliquer un morceau de scotch transparent dessus.
Puis décoller délicatement le scotch et le coller sur un lame de microscope.
39
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Mettre ensuite l’enfant en position génitale et appliquer cette fois un second morceau de scotch
sur l’orifice génital. De même le scotch , une fois délicatement décollé , est appliqué sur la
deuxième lame du microscope.
Les lames seront examinées au microscope à l’objectif x10 et x40 , à lla recherche d’œufs
d’oxyures.
2-5-prélèvement du stérilet :
Le stérilet retiré est immédiatement placé dans un tube contenant 1 ml de Bouillon Schaedler ou
TGY pour recherche de bactéries anaérobies strictes.
40
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
3-Chez l’enfant
En cas de suspicion d’abus sexuel, après un examen clinique méticuleux par le médecin, les différents
sites génital, anal et pharyngé feront l’objet de prélèvements microbiologiques et tous les agents
infectieux pouvant être sexuellement transmis seront recherchés par les techniques les plus sensibles, y
compris par la culture.
C’est le cas par exemple pour chlamydia trachomatis, car les méthodes de détection des antigènes sont
moins sensibles chez l’enfant que chez l’adulte et leurs spécificité n’est pas de 100 %.
A noter aussi qu’un prélèvement sanguin est effectuer pour déterminer le profil sérologique précoce de
la victime vis-à-vis des agents sexuellement transmissibles bactériens et viraux, ces données étant
complétées par la suite par un second voir un 3ème prélèvement sanguin pour déterminer le profil
sérologique tardif de la victime (dossier médico-légal).
41
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Le diagnostic de la Donovanose est basé, non seulement sur le tableau clinique mais aussi sur la
détection de calymmatobacterium granulomatis ou corps de Donovan par des techniques cytologique
et histologique sur des frottis ou des empreintes de tissu colorés et examinés au microscope.
42
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
L’aide d’un laboratoire spécialisé se justifie lorsque le tableau clinique est atypique et qu’un
diagnostic différentiel avec le chancre mou s’impose, ou encore si un terrain particulier est signalé
(grossesse, affection immunosuppressive, traitement immunodépresseur…)
Le diagnostic direct est basé sur la culture du virus ou, plus rapidement, sur la technique
d’immunofluorescence directe aux anticorps monoclonaux.
Le prélèvement est immédiatement appliqué sur 2 alvéoles d’une lame pour IF séchée à l’air et fixée à
l’acétone.
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Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Elle a son importance dans la population homosexuelle et chez l’enfant victime d’abus sexuels.
Chez le nouveau né, une conjonctivite purulente doit faire suspecter une étiologie gonococcique.
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Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
On distingue 3 situations :
Cervicite et colpite : on prélève les cellules pavimenteuses par grattage à la spatule en bois ou à
l’écouvillon, au niveau de la jonction endocol-exocol.
3-2-Dermatoses génitales :
Leur diagnostic est essentiellement clinique.
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Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
C-Conservation et transport :
Dans le cas ou les prélèvements sont effectués à distance du laboratoire d’analyse, deux situations sont
possibles :
Transporter les prélèvements à température ambiante dans un délai ne dépassant pas 30 mn.
1-Neisseria gonorrhoeae :
On plonge l’écouvillon dans un milieu de Stuart modifié ou d’Amies au charbon. Ces milieux
pourront ainsi être gardés au maximum 12 h à t° ambiante (pas plus de 30°C) jusqu'à mise en culture.
Toute réfrigération est à proscrire.
2-Chlamydia trachomatis :
On utilise le milieu 2SP dans lequel l’écouvillon destiné à la culture est plongé. Le transport se fait
dans la glace.
3-Mycoplasmes génitaux :
Le prélèvement est acheminé le plus rapidement possible au laboratoire pour y être immédiatement
traité. Si le traitement est différé, on met en suspension le prélèvement dans un milieu de transport
liquide (A3 ou 2SP) lequel peut être gardé à +4°C moins de 24 h avant inoculation. Si on conserve
plus longtemps, la congélation du prélèvement à -70°C est nécessaire.
5-Haemophilus ducreyi :
En cas de mise en culture différée, on utilise un milieu de transport tel un milieu à base de
Thioglycolate et d’Hémine et contenant de la L-glutamine et de l’albumine bovine.
46
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Chapitre III
Analyse microbiologique de prélèvements
génitaux
A-Ecoulements génitaux
I-Chez l’homme :
1-Prélèvement urétral :
A partir du produit de prélèvement on effectue :
1-1-Examens directs :
Frottis coloré au bleu de méthylène : rechercher des PN et des diplocoques intra et / ou
extracellulaires.
La présence de plus de 5 leucocytes par champs au grossissement X 1000 est fortement indicatrice
d’une urétrite chez l’homme.
Frottis coloré au Gram : rechercher des diplocoques à gram négatif en « grains de café » intra et/ou
extra-leucocytaires.
Elle se fait simultanément sur un milieu non sélectif et un milieu sélectif (voir composition en annexe
B).
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Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Milieu sélectifs :
Milieu de THAYER MARTIN : c’est une gélose chocolat avec supplément d’enrichissement
et renfermant un mélange d’antibiotique et d’antifongique.
Ou
Milieu avec supplément G et mélange inhibiteur.
Ou
Milieu de THAYER MARTIN modifié (MTM) : Gélose GC + supplément d’enrichissement
+ Hémoglobine + V.C.A.T. (Vancomycine, Colistine, Amphotericine B et Triméthoprim).
Ou
Milieu de MARTIN-LEWIS : identique au milieu de THAYER MARTIN modifié mais a
nystatine est remplacée par l’anisomycine à 10 ug/ml.
Ou
Milieu NEW YORK CITY (N.Y.C) : permet également la culture rapide des mycoplasmes.
Apres avoir roulé l’écouvillon de prélèvement sur un quadrant de gélose de la boite, l’inoculum est
étalé à l’anse de platine en utilisant la technique des quadrants pour obtenir des colonies isolées dans
le premier quadrant afin de vérifier la pureté de la culture et d’observer la forme des colonies.
La majorité des souches cultivent en 16 à 18 H, cependant les colonies pouvant être fines, une
deuxième lecture serait faite à la 48 éme heure. A noter cependant que les techniques d’identification
seront pratiquées sur la culture la plus jeune possible.
1-2-2-Germes banals :
Ils englobent les streptocoques, les staphylocoques, les Haémophilus, les entérobactéries et autres
agents bactériens pathogènes non spécifiques.
Aux milieux précédemment cités, on ajoute une gélose COLUMBIA avec 5% de sang frais.
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Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
1-2-3-Mycoplasmes génitaux :
La recherche de mycoplasmes génitaux se fait par la technique classique ou par galerie miniaturisé.
Matériel et réactifs :
Milieux de culture :
Milieu de transport A3.
Pour M.hominis : milieu de Hayflick liquide (M42) et milieu Hayflick solide (A7).
Pour U.urealyticum : milieu de Shepard liquide (U9) et milieu de Shepard solide (A7).
Pipettes graduées de 1 et 2 ml stériles.
Tubes de Kahn stériles avec bouchons.
Mode opératoire :
0.3 ml de prélèvement ou
l’écouvillon
0.1 Ml
1 ml
U9
1 ml de milieu A3
0.1 Ml
1 ml
M42
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Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
A3
20 ul 1 goutte
Gélose
A7
L’incubation :
Lecture :
U.urealyticum :
50
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
M.hominis :
On bserve la gélose à la loupe binoculaire : les colonies d’U.urealyticum sont petites , de couleur brun
noir et ont une forme de « pelote de laine ».
On denombre les colonies en gélose et on determine le nombre moyen de colonies par champ à
l’objectif X 10 :
Composition :
Traitement du prélèvement :
51
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Interprétation :
1-2-4-Chlamydia trachomatis :
1-2-4-1-Recherche de chlamydia par IFD sur frottis de prelevement :
Principe :
Les chlamydia sont des bacteries intracellulaires strictes regroupées sous forme d’inclusions dans le
cytoplasme des cellules infectées.
En appliquant le prelevement directement sur la lame , ces inclusions intracellulaires sont éclatées ce
qui permet d’observer les bacteries au stades de CE et CR libres.
Equipement et réactif :
Lames dépolies ;
Lamelles
Acétone
Lames de controle
Anticorps monocloaux
Microscope à épifluorescence avec objectif X 40 et X 100 ;
Réfrigérateur.
Congélateur à – 20 °C.
Technique :
Au moment du prelevement, bien appliquer l’ecouvillon directement (sans tromper dans aucun
milieu ) sur les puits d’une lame téflonnée ou à l’interieur d’un cercke gravésur une lame
ordinaire ;
Le frottis ne doit pas etre trop epais.
Marquer le nom du malade sur la lame ( ou le N° du malade);
Laisser secher le frottis à la temperature du laboratoire ;
Fixer à l’acetone 10 mn à +4°C ;
Si la technique est temporisée ,conserver les lames à – 20 °C dans du papier Joseph ;
Recouvrir le frottis avec 30 ul d’anticorps monoclonal anti-Chlamydia trachomatis specifique
de l‘espece , marqué à la fluorescéine ;
Incuber la lame 15 mn à temperature ambiante en chambre humide ;
Laver la lame à l’eau distillé pendant 20 secondes ;
Secouer délicatement la lame pour éliminer l’excés d’eau et laisser sécher à l’air.
52
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Monter dans une solution tampon Phosphates-glycérol (50 :50) poser une lamelle sur le puits
et examiner au microscope à fluorescence à l’objectif X40 ou X100.
Toujours inclure un témoin positif et un témoin négatif.
Lecture
Les corps elementaires apparaissent de couleur vert pomme sur fond de cellules colorées en rouge.
Sensibilité et specificité :
N.B : il existe dans le commerce des coffrets pour IFD Chlamydia avec lame, témoin (+) , Témoin (-
), écouvillon et fixateur.
53
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Principe :
C’est la culture sur cellules sensibles qui represente la méthode de reference dans le diagnostic positif
des infections à chlamydia.
Réactifs et milieux :
Equipements :
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Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Mode opératoire :
Y maintenir les cellules à 37°C sous 5 % de CO2 dans le milieu de croissance EAGLE ;
Des que le tapis cellulaire est continu, procéder à la trypsination :
Rejeter le milieu EAGLE.
Laver rapidement le tapis cellulaire au HANKS ;
Ajouter 10 ml de trypsine –laisser agir 1 min ;
Rejeter la trypsine, tapoter le flacon, le tapis cellulaire commence à se détacher ;
Verser quelques ml de EAGLE dans le flacon pour inactiver l’enzyme. Les cellules
sont mises en suspension par agitation modérée et peuvent être transférées dans un
autre flacon ;
Coloration au MGG :
Apres 48 h :
55
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Techniques d’IF :
Plus sensible que la précédente surtout quant le nombre d’inclusions est peu élevé.
Précautions à prendre :
Utiliser impérativement le milieu de transport 2SP pour le recueil des prélèvements génitaux ;
Vérifier la qualité des supports plastiques pour les cultures cellulaires ;
Respecter une concentration maintenue en 5 % de CO2, de l’atmosphère d’incubation car une
concentration supérieure acidifierait trop les milieux d’où réduction de la sensibilité des cellules
en cultures ;
Vérifier la confluence des cellules au moment de l’inoculation car il y a risque de perte de
sensibilité des cellules dans le cas contraire ;
Vérifier l’humidification des étuves à CO2 pour éviter une dessiccation des plaques d’où
changement de pH.
Interprétation
Quant technique d’IFD et culture de chlamydia sont effectués simultanément, les 2 résultats sont
rendus en même temps :
Résultats identiques
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Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Principe :
La plupart des tests disponibles détectent les lipopolysacharides (LPS) de Chlamydia, qui sont extraits
des cellules du prélèvement par la chaleur ou l’utilisation d’une solution détergente.
Les tests immuno-enzymatiques nécessitent un personnel moins expérimenté que dans la méthode par
IF et permettent de détecter des chlamydia viables ou non.
WELLCOZYME Chlamydia
CHLAMYDIAZYME ABBOTT :
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Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
2- Spermoculture :
2-1-Examens directs :
Deux frottis sur lame, colorés au bleu de méthylène et au gram : noter la présence de
polynucléaires et de germes
Un état frais à la recherche de Trichomonas vaginalis.
2-2-culture :
Elle est effectuée à partir du sperme non dilué et dilué au 1/100ème.
NB: les anaérobies (à recherché dans le sperme non dilué) et les Chlamydia (à rechercher dans le
sperme dilué dans le milieu 2SP) sont rarement incriminés.
58
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
3-Secrétions prostatiques :
Nous rappelons que le diagnostic de prostatite se base sur l’analyse microbiologique de 4
échantillons :
3-1-Examens directs :
Examen cytologique de chaque échantillon d’urine avec dénombrement des leucocytes par mm3
(cellule Malassez).
Frottis sur lame de chacun des 4 échantillons VB1, VB2, EPS et VB3 à colorer au Gram, à la
recherche de germes.
3-2-Cultures
Une quantité de 0.1 ml de chaque échantillon est étalé à l’aide d’un râteau, sur la surface d’une gélose
sèche on utilise pour chaque échantillon : 1 GN, 1 GSF,1 GSC,1 BCP. GN et BCP sont incubés 24 h à
37° Cependant 48h avec lecture à 24 et 48 h.
4-Orchi-épididymite :
Tableau 18 : sites à prélever en cas d’orchi-épididymite
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Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Un état frais au microscope à fond noir (recherche de tréponèmes, s’il existe un chancre suspect)
3 frottis sur lame, colorés au bleu de méthylène (leucocytes) et au gram et Giemsa (H.ducreyi, autres
germes).
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Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
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Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
II-Chez la femme
1-Prélèvements cervico-vaginaux :
1-1-Généralités :
Nous réceptionnons pour chaque patient 7 écouvillons simples + 1 écouvillon type cytobrosse
(cytobrush).
Endocol :
Les 3 écouvillons sont repartis comme suit :
62
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Vagin :
L’écouvillon servira à :
Complété éventuellement par un frottis à colorer au MGG ainsi qu’une culture de Diamond et de
Roiron.
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Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
La présence de plus de 10 PN/champ est une assez bonne indication de l’existence d’une cervicite
mucco-purulente, le plus souvent à N.gonorrhoeae et/ou chlamydia trachomatis
Bleu : note l’abondance des leucocytes, une flore vaginale normale renferme moins de 5 leucocytes
par champs.
Gram
Evalue l’équilibre de la flore vaginale : on classe les flores vaginales en 4 types :
Flore de type II : Lactobacilles présents mais flore de substitution sans type morphologique
prédominant.
Flore de type III : lactobacilles rares et flore de substitution avec un type morphologique prédominant.
La cytologie vaginale est variable selon le stade du cycle menstruel. Ainsi on distingue :
La période proliférative : qui se situe au milieu du cycle et durant laquelle les cellules
vaginales éliminées dans les leucorrhées sont nombreuses, à noyau pycnotique et acidophiles
alors que les polynucléaires y sont peu nombreux.
La période sécrétoire : qui se situe avant les règles et durant laquelle les polynucléaires sont
éliminés en abondance et les cellules vaginales sont basales ou intermédiaires.
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Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Ce sont des cellules vaginales desquamés, recouvertes de multitude de coccobacilles gram variable,
qui correspondent à Gardnerella vaginalis.
Cet aspect de clue cells s’accompagne d’une raréfaction en lactobacilles de la flore vaginale.
Vagin :
Etat frais sur une goutte de prélèvement avec une goutte d’eau physiologique. Mettre entre lame et
lamelle et examiner au microscope : recherche de T.vaginalis, levure et Clue cells.
65
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
1-3-Culture
Neisseria gonorrhoeae
L’ensemencement se fait sur :
1 milieu enrichi : gélose chocolat + 1% de polyvitex.
1 milieu sélectif de Thayer Martin
A noter que d’autres milieux équivalents peuvent être utilisés.
L’incubation se fait à 37 °C, toujours en atmosphère humide contenant 5 à 10 % de CO2
(sachet générateur de CO2 ou jarre à bougie).
La majorité des souches cultivent en 16 à 18 h, cependant les colonies peuvent être fines, une
deuxième lecture sera faite à la 4ème heure. A noter cependant que les techniques
s’identification seront pratiquées sur la culture la plus jeune possible.
Gardnerella vaginalis :
L’isolement du germe par culture est facultatif puisque le diagnostic positif de vaginose à
G.vaginalis est posé par l’association de plusieurs critères (voir lecture en P.72)
Cette bactérie donnant une beta hémolyse sur sang humain, on peut effectuer un isolement sur
gélose Columbia ou MH au sang humain frais.
L’incubation se fait à 37°C sous 5 % CO2 pendant 48 h.
Germes banals :
Ils englobent les streptocoques, les staphylocoques, les Haémophilus, les entérobactéries et
autres agents bactériens pathogènes non spécifiques.
On ensemence une gélose base ou COLUMBIA avec 5% de sang frais et une gélose au sang
cuit (chocolat).
L’incubation se fait à 37°C pendant 24 h en atmosphère enrichie de 5-10 % de CO2.
Mobiluncus sp :
Les 2 espèces M.curtesi et M.mulieris sont souvent retrouves dans les vaginoses, en association avec
des anaérobies .leur association avec des anaérobies .leur isolement se fait sur gélose COLUMBIA +
5% sang de cheval ou de mouton. L’incubation se fait en
anaérobiose pendant 3-5 j au minimum.
Levures :
on ensemence le milieu de sabauraud additionné de chloramphénicol, milieu gélosé incliné en tube
ainsi que le même milieu avec actidione. L’incubation se fait à 30°C pendant 72 h.
66
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Trichomonas vaginalis :
La culture de ce parasite est la méthode de diagnostic actuellement la plus sensible. Les
milieux utilisés actuellement sont ceux de Diamond et de Roiron.
La culture se fait mieux en anaérobiose, en 2-4 jours.
1 écouvillon Ensemencer
Neisseria gonorrhoeae 1 chocolat + 1% polyvitex
Mycoplasmes 1 milieu de Thayer Martin
Germes banals 1 gélose MH + Sang humain
Levures 1 Sabauraud + Chloramphénicol.
1 Sabauraud + CMP + Actidione.
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Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
2-Prélèvements vulvaires :
Tableau 21 : analyse microbiologique de prélèvements vulvaires
Les examens directs renseignent très peu sur l’agent responsable de la vulvite.
Ils peuvent détecter : Trichomonas vaginalis, Levures bourgeonnantes.
68
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Neisseria gonorrhoeae 1 gélose chocolat +1% PVX 37° 48H sous CO2
1 milieu de Thayer- martin
Neisseria gonorrhoeae 1 gélose chocolat +1% PVX 37° 48H sous CO2
1 milieu de Thayer- martin
69
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
EN RESUME
Tableau 25 : Tableau récapitulatif des germes incriminés dans les infections génitales
féminines :
Germes banales
1 gélose au sang cuit 37°C 24 à 48h atmosphère ordinaire
1 gélose au sang frais
Mobiluncus sp et Columbia + 5 % sang frais 37 ° 2 à 5 j
bactéries anaérobies 1 boite en aérobiose
strictes 1 boite en anaérobiose
70
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
L’agent Treponema pallidum, est détectable au niveau du chancre grâce au microscope a fond noir.
Les autres étapes de la maladie non traitée, ne s’accompagnent pas de manifestations génitales
(syphilis latente, secondaire et tertiaire).
La détection des anticorps sériques est une étape obligatoire dans le diagnostic de cette maladie et les
techniques mises à la disposition des laboratoires différent par leur sensibilité et leurs spécificités.
Observation de l’échantillon :
Mettre quelques gouttes d’huile à immersion sur le condenseur d’un microscope à fond noir
préalablement réglé.
Placer la lame (avec la préparation) sur la platine et amener le condenseur jusqu'à ce qu’il y ait
contact entre la goutte d’huile et la face inferieure de lame. Ne pas mettre d’huile sur la
lamelle.
Eviter soigneusement la formation de bulles d’air dans l’huile, à la face inferieur de la lame.
La mise au point sur l’échantillon se fait à l’objectif X10.
Régler la lumière a son maximum (vis latérale placée dans le condensateur) puis régler le
condenseur en montant ou descendant jusqu’à l’obtention du plus petit diamètre de lumière.
Examiner à l’objectif X 40 à sec la totalité de la lame.
Treponema pallidum est un micro-organisme caractérisé par une morphologie, une taille et des
mouvements évocateurs. Il est fin (0.25 um-0.30 um de diamètre) , mesurant 5 à 20 um de
71
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
long, avec 6 à 14 spires réguliers d’amplitude identique. Il est doué d’une mobilité en « tire-
bouchon » associée à un mouvement d’ondulation vers la moitié du corps. Contrairement à cet
agent, les autres spirochètes atypiques sont plus épais et plus courts avec une spire lâche et une
mobilité différente.
Interprétation :
La présence de tréponèmes de morphologie et de mobilité caractéristiques de l’espèce
pallidum constitue un diagnostic positif de la syphilis primo-secondaire.
Un examen négatif au microscope à fond noir n’exclue pas le diagnostic de syphilis.
Quelque soit le résultat de l’examen au microscope à fond noir, une sérologie de la syphilis est
obligatoire (voir paragraphe sérologie).
72
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
II-Chancre Mou :
L’agent du chancre mou, Haemophilus ducreyi, présente des exigences nutritives complexes imposant
la préparation de milieux de culture très riches.
Le diagnostic de certitude en est difficile, d’autant que l’examen microscopique de frottis du chancre
n’est pas d’une grande aide.
1-Examens directs :
A partir des prélèvements, on confectionne 3 frottis sur lame pour la coloration au bleu de méthylène,
au gram et au Giemsa.
Le bacille de ducreyi apparait comme un bacille à gram négatif, trapu, à bouts arrondis, à coloration
bipolaire. Les bacilles apparaissent groupés en bancs de poisson, les longues chainettes étant rarement
observées.
Les prélèvements doivent être mis en culture immédiatement (donc dés leur obtention) et l’incubation
doit être faite sous CO2.
2-Milieux de culture :
On utilise en parallèle :
Deux milieux solides : 1 gélose base GC enrichie et 1 gélose chocolat à base de milieu MH enrichi de
sérum de veau fœtal
L’incubation se fait en atmosphère microaérophiles, humidifiée, à une température comprise entre 33°
et 35°C.
73
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
La durée d’incubation des cultures est d’au moins 48 h avant la lecture. Si aucune culture n’est
décelée, il faut conserver les boites 5 jours avant de les considérer comme négatives.
Après 24 h, on examine le milieu liquide : un précipité blanc granuleux au fond du tube est prélevé à
l’aide d’une pipette pasteur et étalé sur une lame puis coloré au bleu de méthylène et au gram.
On ensemence alors les milieux solides à partir de cet enrichissement. Le milieu liquide est réexaminé
après 48 h.
III-Donovanose :
1-Examens directs :
Le frottis sur lame du prélèvement est coloré à la coloration de Leishman :
Recouvrir la lame avec le colorant de leishman pendant 7 à 10 mn ;
Eliminer le colorant par lavage à l’eau courante ou au PBS (PH 7.0-7.2) et recouvrir d’eau
pendant 2 ou 3 mn.
Sécher à l’air chaud ;
Lecture : on détecte des coccobacilles dans les vacuoles cytoplasmiques à l’intérieur de
certaines cellules mononuclées.
« Les bactéries colorés ressemblent à des épingles de sureté fermés »
2-Diagnostic bactériologique
Il n’existe pas de technique d’isolement de cet agent, ni de technique valable de sérologie.
74
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
IV-Ulcérations herpétiques :
1-Diagnostic par IFD :
Equipements et réactifs :
Microscope à fluorescence
Lame pour immunofluorescence.
Acétone.
Anticorps monoclonaux HSV1 et HSV2 conjugués à la fluorescéine.
PBS—Eau distillée ---liquide de montage.
Mode opératoire :
Le prélèvement est immédiatement appliqué sur 2 alvéoles d’une lame pour IF.
Fixer à l’acétone.
Si le prélèvement a été plongé dans un milieu de transport , on centrifuge pour concentrer les
cellules en suspension (500 tours/ mn pendant 5 mn) puis on étale les culots sur 2 alvéoles
d’une lame pour IF et on fixe à l’acétone.
Ajouter 1 goutte d’anticorps monoclonal anti – HSV 1 dans l’alvéole 1.
Ajouter 1 goutte d’anticorps monoclonal anti – HSV 2 dans l’alvéole 2.
Incuber 30 mn à 36 °C en chambre humide.
Laver 3x dans le PBS pendant 10 mn à chaque fois.
Rincer dans l’eau distillée pendant 2 mn.
Laisser sécher- monter avec un liquide de montage (50 % glycérol – 50 % PBS).
Examiner à la recherche d’une immunofluorescence intracellulaire.
Lecture :
Si (+) : coloration vert pomme fluorescente des cellules positives.
Si (-) : coloration rouge orangée des cellules négatives.
N.B : on peut utiliser un anticorps monoclonal reconnaissant les antigènes communs à HSV1 et
HSV2, ce qui permet de détecter seulement le frottis qui contient de l’Hérpesvirus.
75
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Traiter à la diamiobenzidine.
Observer au microscope ordinaire : la présence de granules brun rouge signe un résultat
positif. (Sensibilité et spécificité similaire à celles de l’IFD)
Réactifs :
Milieu de culture (annexe)
Solution tampon (PBS + 5% SVF).
Mode opératoire :
Les cellules sont cultivées jusqu’à obtenir une monocouche cellulaire dans les tubes pour
culture de tissus.
Retirer le milieu de culture et inoculer 2 tubes par échantillon de prélèvement (0.25 ml de
prélèvement mélangé au Vortex).
Laisser 1 h d’absorption à 36° C en position horizontale.
Ajouter 2 ml de milieu complet (+ 2% SVF) par tube.
Incuber à 36 °C dans une atmosphère contenant 5 % de CO2.
Examiner les tubes au microscope stéréoscopique tous les jours pendant 7 jours à la recherche
d’un ECP.
76
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Lecture
On note la présence de cellules arrondies qui se détachent en grappes du support, avec un aspect
réfringent. Des foyers de nécrose cellulaire peuvent s’observer avec, en bordure, les cellules multi
nucléés (syncitia) »
77
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Ce critère de diagnostic est accessible aux pays sous développés, ou la culture reste ainsi
facultative.(23).
En général, on peut poser le diagnostic de vaginose à Gardnerella vaginalis si 3 critères des 4 suivants
sont respectés :
78
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
79
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
80
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
La culture
De N gonorrhoeae permet cependant de procéder à la recherche immédiate d’une pénicillinase et de
préconiser ou de contre indiquer la prescription d’une pénicilline.
Interprétation : (16)
81
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Si VB2 supérieur à On administre au patient Nitrofurantoin 100 mg toutes les 6 h ou Peni orale 250 mg
10 bact/ml toutes les 6 h.
(ces antibiotiques ne diffusent pas dans la prostate donc ne modifient pas la
numération microbienne dans l’EPS).
sous ce traitement antibiotique , on refait la procédure de prélèvement avec culture
immédiate des échantillons EPS et VB3.
puisque les urines sont cette fois stérilisées par l’antibiotique, la présence de
bactéries dans EPS et VB3 même à faible concentration signe la prostatite
bactérienne.
La spermoculture :
La culture de sperme non dilué recherche des agents microbiens que l’on incrimine facilement :
gonocoque, Gardnerella, levures, mycoplasmes à condition que le protocole de prélèvement soit
correctement suivi et qu’il y’ai corrélation avec l’examen direct.
La culture de sperme dilué au 1/100permet d’incriminer un agent de la flore locale (staph, strepto,
entérobactéries…). Les chiffres relevés dans la littérature sont variables : la plupart des auteurs
préconisent un seuil de positivité de 3000 à 5000 germes totaux par ml de germe.(30)
82
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
II-Chez la femme :
La culture des boites de culture doit se faire en passant en revue :
Une infection associant plusieurs pathogènes stricts n’est pas exclue (gonocoque+Gardnerella
vaginalis)
Neisseria gonorrhoeae.
Trichomonas vaginalis
Chlamydia trachomatis
2 situations :
83
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Groupe II (score compris entre 7 et 10) : Disparition des lactobacilles remplacés par
une flore monomorphe composée d’innombrables petits bacilles à gram négatif ou à
gram variable avec présence de Clue-cells :flore évocatrice de vaginose bactérienne.
Dans une vaginite à bactérie pathogène opportuniste (BPO), le tableau clinique est souvent
évocateur : les leucorrhées sont épaisses et jaunâtres et des signes urinaires sont fréquemment
associés. Le frottis de pertes montre une forte réaction inflammatoire, la disparition des
lactobacilles et la présence presque exclusive de l’agent.
Pour ce qui concerne Staphylococcus aureus, il aurait été incriminé dans des tableaux de choc
toxique chez la femme utilisant des tampons intra vaginaux contaminés. (10).
84
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Dans les infections sur stérilet, dont l’actinomycose utérine représente le tableau le plus
insidieux et le plus grave (évolution vers l’abcès tubo-ovarien), la présence d’un sterilet, un
écoulement vaginal malodorant avec douleurs au bas ventre, une fièvre et à l’examen direct
des leucorrhées, des amas de bacilles à gram positif, filamenteux et rigides, plus ou moins
ramifiés, évoquent fortement le diagnostic. (10)
A l’examen direct :
1 +++ + +/++
2 ++ ++ +++/++
3 + +++
4 0 ++++
85
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
On peut avoir une association de plusieurs infections au niveau d’une ulcération génitale.
86
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Du genre Neisseria :
D’espèce gonorrhoeae :
B-Gardnerella vaginalis :
Gélose base riche (Columbia ou MH) + 5 % sang humain frais : repérer les colonies de petites taille,
bombées, luisantes et régulières, béta-hémolytique, cultivant en 48 h, ne poussant pas sur GN.
Gram : coccobacilles à gram négatif, fins et courts, très proches des corynebacteries.
Oxydase (-), catalase(-).
Aéro-anaerobie.
Test à l’hippurate +
Sensible au SPS, sensible au métronidazole à 50 ug.
Résistant à la colistine 10 ug.
Compléter la galerie par Api 20 STREP, API ZYM.
Identification par IFD sur colonies, avec comme conjugué, un anticorps polyclonal anti-
Gardnerella vaginalis adsorbé sur corynebacterium sp et lactobacillus sp : Test rapide, sensible
(95 %) mais peu spécifique.
87
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Streptococcus B :
Cocci à gram + en chainettes
Catalase (-)
Camp test (+)
Sérogroupe B de Lancefield.
Listeria
Bacille à gram +, asporulé
Mobile à 28 °C, immobile à 37°C.
Oxydase (-)
Catalase (+).
Aéro-anaerobie facultatif.
NR (-).
VP(+) et RM(+)
Esculine (+).
D-Candida Albicans :
Sabauraud + chloramphénicol : repérer les colonies blanches, crémeuses de Candida.
Test de filamentation : les levures bourgeonnent en présence de sérum humain en 3 h à 37°C
(voir Annexe B).
Chlamydosporulation : les levures forment des chlamydospores sur milieu PCB incubé une
nuit à 30°C.
Ces 2 tests confirment le diagnostic d’espèce Albicans.
S’ils sont négatifs, on procède à l’identification d’espèce par la galerie biochimique ou
Auxanogramme.
E-Haemophilus ducreyi :
Gélose GC enrichie ou gélose chocolat enrichie : les colonies sont jeunes grisatres, surélevées,
granulaires et glissant le long de la gélose à l’anse. Elles sont polymorphes et donnent l’impression
d’une culture contaminée.
L’identification passe par les tests suivants : (voir mode opératoire en Annexe B)
88
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
F-Mobiluncus :
Gélose au sang incubée 4 jours en anaérobiose à 37°C : on repère les colonies petites
translucides.
Identification : bacilles à gram négatif plus ou moins incurvés, anaérobies strictes, mobiles
oxydase (-) catalase (-).
89
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
« Les conditions habituelles de la sensibilité des bactéries aux antibiotiques ne sont pas applicables
aux mycoplasmes. Leurs exigences nutritionnelles et surtout la très petite taille de leurs colonies font
que les méthodes de diffusion en gélose ne peuvent être utilisées.
On relève ainsi une extrême variabilité des CMI et pourcentages de résistance révélés dans la
littérature. (4)
I-principe :
La technique décrite ici, utilise des microplaques disponibles dans le commerce.
La croissance des mycoplasmes étant révélée par leur activité métabolique qui conduit à
l’alcalinisation du milieu de culture, le milieu vire au rouge (alcalin) si le germe est résistant à
l’antibiotique testé et il reste jaune si le germe est sensible.
II-Mode opératoire :
La miniplaque comprend 02 rangées de 8 cupules dans lesquelles sont déposés les différents
antibiotiques qui sont réhydratés au moment de la distribution de l’inoculum.
Les concentrations d’antibiotiques dans les cupules étant voisines des concentrations critiques, on peut
classer les souches testées en sensible, intermédiaire ou résistante pour chaque antibiotique. (4).
90
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
1-Les antibiotiques :
Choisis sont ceux habituellement actifs contre les mycoplasmes :
SCHEMA DE LA MINIPLAQUE
O O Tc TC
DIAGNOSTICS PASTEUR
S.I.R MYCOPLASMA
O O DO4 DO8
Date :……………………………..
M.hominis
U.ureaplasma
PATIENT REF
O O MNO4 MNO8
O O LM4 LM8
O O JM4 JM8
O O E1 E4
O O CM2 PT2
O O OFX1 OFX4
91
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
2-Standardisation de l’inoculum
Pour obtenir l’inoculum de 10 à 10 UCC/ml, on fait une préculture du milieu de transport
ensemencé avec le prélèvement. Cette incubation pendant 16 à 20 h à 37°C conduit à une
multiplication des mycoplasmes jusqu'à un titre maximum de 10 à 10 UCC/ml.
On dilue
3-Distribution de l’inoculum :
Distribuer 100 ul (3 gouttes de pipette pasteur) dans chaque cupule de la plaque SIR
MYCOPLASMA ;
Recouvrir 2 gouttes d’huile de paraffine (ou de vaseline) et mettre à incuber à 37° C pendant
24-48 h.
III-Lecture :
L’interprétation de l’antibiogramme se fait dés que les cupules témoins de la croissance (Tc) virent du
jaune au rouge.
92
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Le milieu utilisé est le MH enrichi de 5 % de sang de cheval laqué, 0.1 % de glucose, 0.01 % de
glutamine et de 0.025 % de L-cystéine.
Un autre milieu plus simple et mieux adapté est le milieu MH (ou GC) + 1% d’hémoglobine + 5 % de
sérum de veau fœtal + 1 % Supplément HD (voir composition en annexe B).
I-Antibiotiques à tester :
Sulfamethoxazol et Triméthoprim, seuls et en association.
Tétracycline ;
Chloramphénicol ;
Erythromycine ;
Streptomycine ;
Ciprofloxacine ;
Ceftriaxone ou Cefotaxime.
II-Inoculum :
Il est préparé dans du TSB pour obtenir 10 UFC/ml (Préparation d’une suspension correspondant à
l’étalon 0.5 de l’échelle Mc Farland puis dilution dans le TSB au 1/10).
93
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
94
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
II-techniques :
1-la technique VDRL :
1-1-Matériel et réactifs :
Sérum frais ou sérum inactivé ou plasma.
Eau physiologique.
Solution tamponnée à pH6.
Antigène VDRL : stable, conservable en suspension colloïdale pendant 12 mois donc prêt à
l’emploi. Il est gardé au réfrigérateur (3 à 10°C) mais il doit être ramené à la température du
laboratoire 30 mn avant son utilisation.
Lames de verre avec zones circulaires creusées dans l’épaisseur du verre.
Agitateur de plaques avec minuterie.
Microscope optique à fond clair avec objectif au grossissement x 100.
1-2-Mode opératoire :
1ère Etape : Réaction qualitative :
Distribuer 50 ul de sérum ou plasma sur une zone circulaire de la lame de verre.
Ajouter 12 ul d’antigène prêt à l’emploi, réchauffé à température ambiante.
Placer la plaque sur agitateur pendant 6 mn.
Lire immédiatement au microscope avec objectif sec.
Prévoir dans chaque série un témoin positif connu et un témoin antigène ou l’eau
physiologique remplace le sérum du malade.
1-3-Lecture et interprétation :
La lecture se fait au microscope (x100).
Elle est facilitée par l’addition de charbon ou de particules de latex , ce qui donne des
agglutinations colorées.
Le titre des anticorps anti-Tréponema est l’inverse de la plus forte dilution donnant une
agglutination.
95
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
2-Technique RPR :
2-1-Matériel et réactifs :
« RPR Card Kit « : il renferme
La suspension d’antigène.
Une aiguille calibrée (0.9 mm)
Une bouteille de plastique distribuant l’antigène.
Des cartes plastifiées avec des cercles gravés.
Des pipettes plastiques jetables pour 50 ul de volume.
Bâtonnets de bois ou de plastique.
Solution saline.
2-2-Mode opératoire
Test qualitatif :
Déposer à la pipette 50 ul de sérum dans un cercle de la carte, en étalant la goutte sur a totalité
du cercle avec l’autre bout de la pipette ou avec un bâtonnet. Utiliser une pipette et un
bâtonnet neufs à chaque échantillon.
Laisser tomber une seule goutte (50 ul) de la suspension d’antigène sur le cercle-ne pas agiter.
Placer la carte (10 tests par carte) sur l’appareil rotatif sous un couvercle contenant un
morceau de coton mouillé (humidificateur).
Faire tourner le temps indiqué par le fabricant.
Lire à l’œil nu sous une source de lumière, immédiatement après la rotation en faisant tourner
et basculer la carte.
Noter les résultats :
Positifs : agglutination petites ou grandes (floculation)
Négatif : pas d’agglutination ou très faible rugosité
Titrer les sérums positifs.
Test qualitatif :
Pour chaque sérum à tester, utiliser 5 cercles de la carte (une rangée).
Déposer 50 ul de solution saline dans les cercles 2, 3, 4,5 et ne pas étaler.
Déposer 50 ul d sérum dans les cercles 1 et 2.
Mélanger la solution saline et le sérum dans le cercle 2 en faisant aller et venir 5 ou 6 fois le
mélange dans une pipette. Eviter les bulles.
Transférer 50 ul du cercle 2 (dilution ½) au cercle 3 et mélanger puis transférer 50 ul du
cercle 3 (¼) au cercle 4 et mélanger puis transférer 50 ul du cercle 4 (1/8) au cercle 5 (1/16),
mélanger et rejeter 50 ul.
96
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
A l’aide d’un bâtonnet, étaler la plus haute dilution (cercle 5) jusqu’au bord du cercle. Avec
le même bâtonnet, effectuer la même manipulation dans les cercles 4.3.2 et 1.
Laisser tomber une seule goutte de suspension antigénique par cercle pour les 5 cercles
1.2.3.4.5.
Placer la carte sur le dispositif rotatif sous un couvercle avec un humidificateur et faire
tourner le temps indiqué par le fabricant.
Lire les réactions à l’œil nu sous une source de lumière.
Noter la plus haute dilution une réactivité.
Si la dilution 1/16 est toujours réactive, continuer le test comme suit :
Préparer une dilution du sérum au 1/16ème :100 ul de sérum sont additionnées à 1.5 ml de
solution saline. Mélanger
Déposer 50 ul de sérum non réactif dans les cercles 2, 3,4 et 5 d’une carte.
Déposer 50 ul de la dilution 1/16 du sérum dans les cercles 1 et 2
Mélanger dans le cercle 2 en évitant les bulles.
Transférer 50 ul du cercle 2 (dilution 1/32) au cercle 3 et mélanger transférer 50 ul du
cercle 3 (1/64) au cercle 4 (1/128) et mélanger. Transférer 50 ul du cercle 4 (1/128) au
cercle 5 (1/256). Mélanger et rejeter 50 ul.
Etaler jusqu’au bord du cercle et avec le même bâtonnet, en partant du cercle 5 au
cecle1.
Lâcher 1 goutte par cercle de suspension antigénique pour les 5 cercles 1.2.3.4.5.
Placer la carte sur un dispositif rotatif sous un couvercle avec humidificateur et faire
tourner le temps indiqué par le fabriquant.
Lire les réactions à l’œil nu sous une source de lumière immédiatement après la rotation
en faisant tourner et basculer la carte.
Le titre d’anticorps est l’inverse de la plus haute dilution de sérum donnant une
agglutination.
97
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
3-le TPHA :
3-1-Matériel et réactifs :
Diluant d’absorption : mélange dans du PBS :
Ce diluant est utilisé pour absorber les sérums des malades et pour réparer les dilutions de travail des
GR sensibilisées et non sensibilisées.
3-2-Mode opératoire :
Réaction qualitative :
Déposer pour chacun des sérums à tester 25 ul de diluant d’absorption dans les puits 1.3.4 et 5 de la
rangée correspondante et 100 ul dans le puit 2.
98
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Puits 1 2 3 4 5
Diluant d’absorption (ul) 25 100 25 25 25
Sérum du patient 25 25 - 25 25
- - 25 - -
Recouvrir la microplaque incuber 30 mn à température ambiante
GR non sensibilisés (ul) - - 75 - -
GR sensibilisés (ul) - - - 75 75
Témoin négatif :
1 puits : 25 ul de diluant absorbant + 75 ul de suspension de GR sensibilisées.
Témoin Positif :
Porter 25 ul de diluant absorbant dans les 5 puits d’une rangée
Ajouter 25 ul de sérum témoin réhydraté (1/80) dans le puit 1 (1/160)
Mélanger et transferer 25 ul du puit 1 dans le puit 2 (1/320) ,puis du puit 2 dans le puit 3 (1/640)
puis du puit 3 dans le puit 4 (1/1280) puis du puit 4 dans le puit 5 (1/2560).
Ajouter 75 ul de suspension de GR sensibilisées dans les 5 puits
Les dilutions finales du témoin (+) sont : 1/640, 1/1280, 1/2560, 1/5210 et 1/10240.
Puits 1 2 3 4 5
99
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
La lecture :
Se fait à l’œil nu : on détecte l’aspect du dépôt constitué de GR.
Résultat négatif : absence d’hémagglutination : on observe un point rouge, bien limité au fond de
la cupule.
Résultat positif : aspect d’hémagglutination : on note un léger voile rose au centre de la cupule
avec un contour plus foncé.
Résultat douteux : les GR sédimentent en formant un halot au centre de la cupule et un contour
granuleux en périphérie.
Interprétation :
Sérum positif hémagglutination avec hématies sensibilisées et absence d’hémagglutination avec
hématies non sensibilisées.
Hémagglutination avec GR non sensibilisées refaire le test après absorption avec diluant
d’hémadsorption si le problème persiste : faire FTA abs.
100
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Réaction quantitative :
Porter 25 ul de diluant dans les puits 1 et 3 à 10 d’une même rangée de plaque.
Porter 100 ul dans le puit 2.
Ajouter 25 ul de sérum dans le puit 1 (1/2).
Mélanger et transférer 25 ul du puit 1 dans le puit 2 (1/10)
Mélanger et transférer 25 ul du puit 2 dans le puit 4 (1/20).
Faire de même dans les puits restants et rejeter 25 ul du puit 10
Changer d’embout : transférer 25 ul du puit 2 dans le puit 3 (1/20),mélanger et rejeter 25 ul du
puit 3.
Incuber la plaque 30 mn à la T° ambiante.
Ajouter 75 ul de suspension de GR non sensibilisées dans le puit 3 et 75 ul de suspension de
GR sensibilisées dans les puits 4 à 10.
Les dilutions finales vont de 1/8 à 1/5120.
Les témoins positif et négatif sont traités de la même façon que dans la réaction qualitative.
Puits 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Diluant d’absorption 25 100 25 25 25 25 25 25 25 25
(ul)
Sérum du malade 25 25 25 25 25 25 25 25 25
(ul)
Dilutions du sérum 1/2 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280
du malade
25
(1/20)
Incuber la
INCUBER LA PLAQUE A LA TEMPERATURE AMBIANTE PENDANT AU MOINS 30 mn plaque à T°
ambiante au
moins 30 mn
GR non sensibilisées 75
(1/80)
GR sensibilisées 75 75 75 75 75 75 75 (1/5120)
(1/80) (1/160) (1/320) (1/640) (1/1280) (1/2560)
Lecture :
Les résultats correspondant à la plus haute dilution du sérum donnant une réaction positive.
101
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
4-2-Réactifs :
Antigène Treponema pallidum : suspension lyophilisée de Tréponema pallidum (souche Nichols).
On fixe la lame dans l’acétone pendant 10 mn et on laisse sécher à l’air. Ces lames peuvent ainsi être
conservées ainsi à -20°C ou, à la plus basse température , enveloppées dans du papier aluminium.
A noter que les lames prêtes à l’emploi (avec antigène préfixé) sont disponibles dan le commerce.
Réactif absorbant : suspension de treponema souche Reiter obtenue par culture, présentée sous forme
lyophilisée ou à l’état liquide.
Conjugué : globuline anti-humaine conjuguée à la fluorescéine, anti-IgG, A, M : dont le titre doit être
confirmé au laboratoire.
Sérum témoin positif : dans chaque série, il faut introduire un témoin (+) ou mieux 2 témoins (+).
Fortement (+) : fluorescence intense à la dilution ai 1/5e dans le PBS ou le liquide d’absorption.
4-3-Mode opératoire :
Chauffer les témoins et les sérums des malades à 56 °C pendant 30 mn.
Diluer chaque sérum au 1/5e dans du liquide d’absorption (25 ul de sérum dans 100 ul de
liquide d’absorption, dans les puits d’une microplaque).
Bien mélanger.
Distribuer 30 ml de chaque sérum dilué (malades et témoins) dans les alvéoles de lames.
Ajouter 30 ul de PBS dans une des alvéoles et 30 ul de liquide d’absorption dans un autre
(témoin(-)).
102
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Mettre les lames dans une chambre humide et incuber à 35-36°C pendant 30 mn.
Plonger les lames dans un bain de PBS et rincer pendant 5 mn-répéter le rinçage plusieurs fois
en renouvelant le PBS.
Rincer les lames dans l’eau distillée.
Faire sécher délicatement en tamponnant les lames avec du papier filtre.
Diluer le conjugué dans le PBS et distribuer 30 ul dans chaque alvéole.
Incuber et rincer comme précédemment ;
Déposer quelques gouttes du liquide de montage sur la lame et recouvrir d’une lamelle de
même taille ;
Examiner les lames immédiatement au microscope à fluorescence en commençant d’abord par
les témoins (+).
4-4-Interprétation :
On interprète comme suit :
103
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Un anticorps monoclonal anti IgM est fixé dans les puits d’une plaque de microtitration;
Le sérum du patient dilué de façon appropriée (1/25) est ajouté à ces puits ;
Incubation ;
Puis on ajoute dans les puits les GR de mouton sensibilisées à un antigène purifié extrait de
Treponema pallidum ;
Lecture : sérum positif hémagglutination.
Le sérum du patient dilué de façon approprié (1/50) est ajouté à ces puits ;
Incubation ;
Le complexe formé est détecté par réaction colorée qui se produit en présence du substrat
tetraméthylbenzine : coloration bleu+/- intense en fonction de la quantité des IgM anti-Treponema
sériques.
104
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Si l’une des réactions ou les 2, sont positives, elles seront quantifiées et éventuellement complétées par
des tests de confirmation.
105
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
1-Par IFI :
1-1-principe :
On détecte les IgG, IgA ou IgM spécifiques anti-Chlamydia trachomatis en mettant en contact le
sérum du patient avec un antigène spécifique de Chlamydia trachomatis.
1-2-Equipements et réactifs :
Lame avec antigène préfixé :
PBS
Anti-Ig humaine totale marquée à l’isothiocyanate de fluorescéine, diluée au demi dans du Glycérol
bi-distillé et conservé à +4°C.
Microplaque stérile
Microscope à épifluorescence.
1-3-Technique :
Diluer le sérum du malade de demi en demi dans du PBS ;
Déposer une goutte de chaque dilution sur chaque spot d’une lame sèche.
Commencer le dépôt des spots à partir de la dilution 1/128ème .
Incuber la lame 30 mn à 37°C en chambre humide ;
Laver 2 fois pendant 5 mn à chaque fois, au PBS.
Déposer, sans sécher, une goutte d’anti-Ig humaine totale marquée à l’isothiocyanate de
fluorescéine, après dilution au 1/100ème dans du PBS + bleu d’Evans (1/10000e).
Incuber 30 mn à 37°C en chambre humide.
106
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
NB pour toutes les Ig à détecter, les incubations sont effectuées à 37°C sauf pour les IgM (température
du laboratoire).
1-4-Lecture et interprétation :
Spot positif : inclusions intra-cytoplasmiques fluorescentes ou CE fluorescents parfaitement ronds et
réguliers.
Très fugaces.
Sur la spécificité :
107
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Les IgG, IgA ou IgM sont détectées par le biais d’une immunoperoxydase.
2-2-Equipements et réactifs :
Lame avec cellules infectées (souche de chlamydia trachomatis L2) préfixées en spots
Sérum du patient
Tampon PBS.
Anti-IgG, IgM ou IgA marquée à la peroxydase (conjugué).
Substrat chromogène.
Microscope photonique objectif x20.
2-3-Technique :
1ère étape :
2ème étape :
3ème étape :
2-4-Lecture et interprétation :
Monter la lame avec liquide de montage.
Lire au microscope photonique objectif x20
Interprétation : Réaction (+) si précipité bleu à bleu intense dans la cellule infectée.
Interprétation identique à celle de l’IFI.
108
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
109
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
3-2-Mode opératoire :
L’enzyme utilisée est la phosphatase alcaline.
3-3-Lecture et interprétation :
Visuellement par comparaison d’une intensité de coloration des échantillons avec un
calibrateur (Kit immunocombs EIA).
Au spectrophotomètre.
3-4-Sensibilité et spécificité :
Cas d’une sérologie précoce : Elisa moins sensible que IFI
ELISA ne détecterait pas les anticorps correspondants à certains sérovar de chlamydia
trachomatis.
Réactions croisées avec anticorps anti C. pneumoniae.
110
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
2-Autres techniques :
1. Technique immuno-enzymatique :
2. Technique de Western Blot :
3. Technique de neutralisation.
111
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Chapitre VIII
Limites des techniques utilisées-Nouvelles
techniques de diagnostic (6.13.17.28.32)
112
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
En définitive, les nouvelles techniques de TEST » (Biomed Diagnostics, San José, CA).
détection appliquant l’outil de biologie C’est un milieu sélectif, fongicide et
moléculaire semblent plus sensibles et aussi bactéricide, enrichi de protéase-peptone. Il
plus spécifiques que la culture. détecte de l’ordre de 4 organismes /ml et peut
se conserver 1 an à T° ambiante. Ce test in
Elles ont l’avantage d’être utilisables dans les vitro a démontré des capacités uniques comme
urines, ce qui facilite l’acceptabilité des milieu de transport et de culture. Sa procédure
prélèvements lors des programmes de offre une grande simplicité d’application et de
dépistage. De plus, les résultats sont obtenus détection de ce parasite.
plus rapidement.
Par ailleurs des méthodes de diagnostic sans
Leur principal inconvénient reste leur cout culture ont été décrites. Elles mettent en
encore élevé, ce qui les limite à certains évidence l’antigène directement dans le
laboratoires seulement.(2.32) prélèvement génital par IF, agglutination Latex
et ELISA, avec une grande sensibilité (> 90 %)
Dans le cas des Uréthrites gonococciques, une
(6).
excellente détection des gonocoques serait
obtenue quand les prélèvements sont Les méthodes sans culture : différentes
ensemencés directement sur des systèmes avec méthodes sans culture peuvent être utilisées
incubation incorporée (self contained pour diagnostiquer les infections du tractus
incubation Systems) tels les JEMBEC génital, incluant les techniques sérologiques,
PLATES. l’agglutination au latex, les techniques
d’hybridation d’acide nucléique, les techniques
Le système JEMBEC , qui génère sa propre d’amplification et EIA.
atmosphère de CO2 par le biais de la tablette
de bicarbonate de Sodium incorporé, est Les vaginoses bactériennes (VB) incriminent
inoculé par une strie en « N ». La même de nombreux micro-organismes.
procédure est utilisée pour les levures,
streptococci et Mycoplasmes. Un des milieux A coté du gram, les VB peuvent être
gélosés utilisé est la gélose Columbia base diagnostiqués par une augmentation du rapport
+5% de sang de mouton + colistine + acide succinic/Lactic acid dans les sécrétions
nalidixique.(34) vaginales, détecté par la chromatographie Gaz
liquide Directe.
Pour prévenir le risque d’infection néonatale à
Streptococcus du groupe B , on en effectue un Actuellement une technique d’hybridation
dépistage chez la femme enceinte entre la 35ème (Affirm VPIII Microbial Identification
et la 37ème semaine de gestation. Test/Firme Becton Dickinson Microbiology
Systems) est disponible dans le commerce pour
Pour cela, un écouvillon de la zone péri-anale diagnostiquer la vaginose bactérienne, de
est roulé sur une gélose sélective (mélange Nal même que les infections du Tractus génital
+ colistine) puis plongé dans un bouillon causées par Candida spp et Trichomonas
d’enrichissement TODD HEWITT + sang + vaginalis.
Genta +Nal, à partir duquel on effectuera
ensuite des subcultures, à la recherche du La sensibilité et la spécificité de cette
streptocoque B. (13,17). technique sont intéressantes.
T.vaginalis peut être cultivé sur milieu de A partir d’un seul prélèvement et en 1 h. ce test
Diamond. Il existe cependant un test de différencie les 3 causes majeures de vaginite.
détection de ce parasite : le « INPOUCH TV
113
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Elles pourront être utilisées chez les femmes Technique de Southern : méthode de
enceintes asymptomatiques, contaminées juste référence.
avant l’accouchement de même que dans la Hybridation in situ sur filtre.
surveillance des nouveaux nés exposés à Hybridation par « Dot Blot ».
l’infection.
Actuellement, l’amplification par PCR, de
L’ADN viral est détecté directement par certaines séquences cibles de l’ADN fait
hybridation avec des sondes radio-marquées ou l’objet de travaux de recherche.(33)
marquées à la biotine. A noter cependant que
les techniques de PCR restent plus sensibles.
(33)
114
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX
Conclusion
Une analyse microbiologique correcte et fiable de prélèvements génitaux exige
la détection de tous les agents microbiens susceptibles d’être à l’origine des
symptômes de l’infection génitale.
Par ailleurs, ils incriminent de façon abusive des agents de la flore commensale
génitale, faciles à cultiver et qui n’ont souvent aucun rapport avec l’infection.
115
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX
Bibliographie
1. Addad B. : Enquête sur des maladies sexuellement transmissibles chez la femme algérienne à
Alger, Oran et Mostaganem : Thèse DESM 1993
116
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX
117
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX
118
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX
32.Van Dyck E., Leven M, Pattyn S., Van Damme L., Laga M.: Detection of
Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae by enzyme
immunoassay, culture and three nucleic acid amplification tests Journal of
Clinical Microbiology 2001, May, 39(5):1751-6.
119
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX
ANNEXE A
120
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX
Mettre en suspension 20 g dans 1 litre d’eau distillée puis dissoudre complètement par ébullition et
distribuer en tubes à vis ou en flacons.
Refroidir immédiatement dans l’eau froide pour conserver le charbon en suspension uniforme.
121
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX
Mettre en suspension 36 g de gélose base GC dans 500 ml d’eau distillée, agiter, porter à ébullition,
autoclaver et refroidir les solutions autour de 50-55°C.
Ajuter l’hémoglobine au milieu, puis ajouter 10 ml d’Isovitalex (ou autre milieu d’enrichissement) à
ce mélange agiter distribuer en boites de Pétri.
Gélose base GC
Supplément G additionné à la gélose base à la concentration de 15 à 20 %.
Composition du supplément G :
Milieu de THAYER-MARTIN
Gélose chocolat enrichie en supplément (1%) et additionné d’un mélange d’antibiotique et
d’antifongique ou mélange VCN
Vancomycine 3 ug/ml
122
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX
Ajouter une ampoule de VCAT (OXOID) et une ampoule de supplément à l’autolysat de levure.
Pré-sécher correctement les milieux (une nuit à T° ambiante ou 1 heure à 35° - 37°C,
couvercle entre ouvert)
Conserver jusqu'à 3 semaines au réfrigérateur en sacs plastiques scellés.
Tester une souche témoin de gonocoque pour vérifier l’aptitude du milieu à la culture.
Cette méthode a été abandonnée au profit de techniques rapides, sensibles et plus spécifiques.
Ses limites :
123
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX
124
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX
Chlamydia trachomatis
Milieu de transport SACCHAROSE-PHOSPHATE
(2SP) :
K2HPO4 2.1 g
KH2PO4 1.1 g
Saccharose 68.5 g
Eau distillée 1000 ml
Cette solution peut se conserver congelée pendant des mois à -20 °C.
125
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX
Mycoplasmes génitaux
1-le milieu A3 :
Milieu de base :
Bouillon trypticase 2.3 g
NaCl 1.5 g
KH2PO4 0.06 g
Eau distillée 275 ml
PH : 5.5
Milieu complet :
Milieu de base 275 ml
Sérum de cheval 20 ml
Extrait de levures à 25% 5 ml
L-Cystéine (HCL) 1 % 3 ml
Pénicilline G 200000 U/ml 3 ml
Le milieu U9 :
Milieu de base :
Bouillon trypticase 2.3 g
NaCl 1.5 g
KH2PO4 0.06 g
Eau distillée 275 ml
Milieu complet :
Milieu de base 275 ml
Sérum de cheval 20 ml
Extrait de levures à 25% 5 ml
Urée à 10 % 1.5 ml
L-Cystéine (HCL) 1 % 3 ml
Rouge de phénol 1 % 1.4 ml
Pénicilline G 200000 U/ml 3 ml
126
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX
Complement
Extrait de levure à 25 % 50 ml
Sérum de poulain (30 mn à 56 °) 200 ml
Ampicilline 1 g
Glucose à 25 % 40 ml
Arginine à 10 % 40 ml
CVA (Gibco) ou Isovitalex 20 ml
Rouge de phénol à 0.5 % 10 ml
Acétate de thallium 15 ml
Chauffer 3 minutes au bain marie
Ph final: 6.0
4-Le Milieu A7
Milieu de base :
Mycoplasma broth Base (Oxoid) 53.3 g
Agar purifié (Oxoid) 26.0g
Eau distillée 2100 ml
Complement
Sérum de poulain (non chauffé) 200 ml
Extrait de levure à 25 % 120 ml
Arginine à 10 % 2.5 ml
Ampicilline 1 g
Urée à 10 % 31.5 ml
L.Cystéine à 4% 9.0 ml
Glucose à 25 % 22.5 ml
Sulfate de manganèse (stérile) 12.5 ml
127
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX
Haemophilus ducreyi
1-Gélose pour gonocoque additionné de sérum de veau
fœtal :
Gélose base GC
1 % hémoglobine bovine
1 % Isovitalex (BBL) ou autre supplément poly vitaminique (Gibco)
5 % sérum de veau fœtal
3 mg/l Vancomycine.
Peser 36 g de gélose base GC, dissoudre dans 450 ml d’eau distillée (dans 1 flacon d’1 litre).
Dans un 2ème flacon, peser 10 g de poudre d’hémoglobine dans 500 cc d’eau distillée.
Dissoudre 38 g de milieu MH dans 900 ml d’eau distillée. Mélanger et porter à ébullition. Autoclaver
puis ramener à 80°C au bain marie. Ajouter 50 ml de sang de cheval. Mélanger puis ramener à 50-
55°C dans un autre bain marie.
128
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX
3-Giemsa
Colorant :
Dissoudre 0.5 g de poudre de Giemsa dans 33 ml de méthanol pur sans trace d’acétone. Mélanger et
conserver à T° ambiante. Préparer une dilution de travail en ajoutant 1 ml de cette solution mère à 40
ml de diluant.
Diluant :
Préparer un tampon phosphate à 67 mmol/l, pH 7.2 de la manière suivante : mélanger 72 ml d’une
solution contenant 9.5 g de dihydrogénophosphate de disodium par litre à 28 ml d’une solution
contenant 9.2 g de phosphate monosodique par litre. Ajouter 900 ml d’eau distillée.
Coloration :
Le frottis de prélèvement, séché à l’air, fixé au méthanol absolu pendant au moins 5 mn puis séché de
nouveau, est recouvert de la solution de Giemsa pendant 1 heure.
129
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX
Exigences en hémine :
On pratique le test à la porphyrine.
Faire une suspension bactérienne dense dans 0.5 ml de solution à 2 mmol/l de chlorhydrate d’acide δ-
aminolévulinique dans un tampon phosphate pH 6.9 à 0.1 mol/l contenant 0.8 mmol/l de sulfate de
magnésium.
Exposer le substrat à la lumière d’une lampe de Wood (LO=360 nm) en chambre noire
Lecture : une fluorescence rouge indique la présence de porphyrine c'est-à-dire l’absence d’exigence
en hémine. (Résultat(-) avec H ducreyi).
PAL
Faire une suspension bactérienne dense (étalon 3 à l’échelle de Mc Farland) dans un tube
contenant 0.5 ml de phosphate disodique sans phénol à 0.3 g/l dans un tampon citrate-
hydroxyde de sodium de Sorensen, pH 5.6 à 0.01mol/l.
Incuber le tube 4 h au bain marie à 37°C.
Ajouter 4 gouttes de 2.6-dibromoquinone-4-chlorimide à 5 g/l dans le méthanol.
Agiter.
Laisser reposer 15 mn à T° ambiante.
Ajouter 0.3 ml de n-butanol.
Agiter et laisser reposer 5 mn.
Lecture : une coloration bleu –violet de la couche de butanol indique une réaction positive.
130
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX
Trichomonas vaginalis :
1-milieu de ROIRON (Biodiagnostic)
Formule pour 1 litre :
NaCl 6.0 g
KCl 0.1 g
Ca Cl2 0.1 g
NaHCO3 0.1 g
Peptone (protéose n°3)(Difco) 2.0 g
Maltose 5.0g
Extrait de foie (Bacto-Liver)(Difco) 2.0g
Acide ascorbique 1.0g
Extrait de Liebig-peser dans un petit erlenmeyer et diluer dans un peu d’eau 3.0 g
Asparagine-chauffer dans un peu d’eau
Ajuster le ph à 6.0 -6.6.
Repartir en flacons de 500 ml.
Stériliser à l’autoclave.
Porter 3 jours au réfrigérateur à +4°C pour permettre la précipitation complète.
Centrifuger à 3500 t/mn pendant 20 mn.
Autoclaver.
Ajouter pour 500 ml
Sérum de cheval 100 ml
Streptomycine 1g
Pénicilline 1 000 000 UI
Le milieu (4.5 ml) est distribué dans des tubes de 9.5 sur 1 cm de large, bouchés avec un
bouchon à vis en aluminium.
2-Milieu de DIAMOND :
Formule pour 1litre :
Trypticase 20.0 g
Extrait de levure 10.0 g
Maltose 5.0 g
Chlorhydrate de L- cystéine 1.0g
Acide L ascorbique 0.2 g
Hydrogénophosphate de dipotassium 0.8 g
Dihydrogénophosphate de potassium 0.5 g
Gélose 0.5 g
131
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX
Gardnerella vaginalis :
Le test à la potasse :
Mélanger un échantillon de sécrétion vaginale avec une goutte de KOH sur une lame et porter à
proximité des narines, à la recherche d’une odeur caractéristique de « poisson pourri » (volatilisation
des polyamines type cadavérine et putrésceine produits par les bactéries anaérobies).
Corps de Donovan
Colorant de Leishman :
Solution mère :
Poudre de Leishman 1.5g
Méthanol 1000 ml
Solution de travail
Solution mère 1 partie.
Eau peptonée 2 parties.
Ajouter la poudre de leishman au méthanol et bien mélanger au moyen de plaques de billes de verre.
Préparer chaque jour une solution de travail fraiche en diluant une partie de la solution mère dans 2
parties d’eau distillée tamponnée avec 3.76 g/l d’Hydrogénophosphate de di-sodium et 2.10 g/l de
Dihydrogénophosphate de potassium pH 7.0 -7.2.
Candida Albicans
Test de filamentation :
Emulsionner une colonie dans 0.5 ml de sérum de cheval ou de sérum humain.
Incuber 4h à 37°C
Lire en présence d’un témoin négatif : C Albicans montre des hyphes latéraux courts.
132
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX
Treponema :
Coloration de Vago :
Réaliser un frottis du prélèvement pathologique, ne pas fixer.
Recouvrir la lame d’une solution fixée de mercurochrome à 2 % pendant 3 à 5 mn.
Laver à l’eau distillée ;
Colorer pendant 5 mn avec une solution filtrée de vert de méthyle à 2%.
Laver à l’eau distillée, laisser sécher.
Examiner à l’objectif 100 : les tréponèmes apparaissent en violet clair sur un fond presque
incolore.
Solution de vert de méthyle à 2 % : broyer très finement (important) 1 g de vert de méthyle dans
un mortier. Ajouter 50 ml d’eau distillée tiède. Agiter et laisser reposer puis filtrer. Conserver en
flacon brun en filtrant de temps à autre.
133
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX
ANNEXE B
134
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX
Circonstances de survenue :
Si leucorrhée préciser :
Traitement antérieur :
……………………………………………………………………………………………..............................…...................................
Examen gynécologique :
135
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX
Au verso de la fiche de renseignements cliniques, une fiche d’analyse, réservée au laboratoire permet
de suivre les étapes techniques :
Examens directs :
Leucocytes :
Cellules épithéliales
Bactéries
Clue-cells
Levures
Cultures :
Germes banals
N gonorrhoeae
Gardnerella v.
Levures
Mycoplasmes génitaux
136
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX
SIGNES CLINIQUES
Pertes génitaux
Ecoulement urétral
Ulcération génitale
Tumeur(s) génitale(s)
Autres……………….
SIGNES GENITAUX
Endocol Vulve Endomètre
Exocol Glande de Bartholin Pièce biopsique
GERMES IDENTIFIES
N.gonorrhoeae : Mycoplasma :
Trichomonas vaginalis : Levure :
Treponema pallidum : Autre :
Chlamydia trachomatis :
INTERPRETATION
137
Molluscum contagiosum Treponema pallidum-Haemophilus ducreyi-Agent de Donovan-
Papillomavirus Chlamydia trachomatis
Ulcération
Urétrite aigue Urétrite subaigüe Prostatite Orchi- Condylomes
génitale
ou chronique épididymite
Fond de l’ulcère
Urètre Urètre 1er jet Urètre 1er jet adénopathie
urinaire-urine urinaire-sperme
SITES DE Urètre anus et satellite
post massage- Biopsie
PRELEVEMENT pharynx
sperme
Polynucléaires
Polynucléaires Polynucléaires T pallidum
PN Diplocoques Bactéries Polynucléaires Bactéries Bactéries
gram – intra ou Bactéries
EXAMENS extra cellulaire
DIRECTS T vaginalis
N.gonorrhoeae Papillomavirus
N.gonorrhoeae Anaérobies Treponema
Ureaplasma strictes pallidum
urealyticum Staphylocoques Haemophilus
N.gonorrhoeae Staphylocoques Entérobactérie ducreyi
Anaérobies
Trichomonas .v Entérobactérie Gardnerella v Trichomonas .v
strictes
AGENTS Chlamydia. Calymmatobactri
Chlamydia Staphylocoques
RECHERCHES Trachomatis um granulomatis
trachomatis Entérobactérie
Ureaplasma Gardnerella v
urealyticum