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Año 2008
Trabajo Práctico Nº 2:
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS. PROPIEDADES ÓPTICAS DE PROTEÍNAS
Técnica:
Realizar el espectro de absorción (entre 200 nm y 600 nm) de muestras de
gelatina y ovoalbúmina, de igual concentración. También realizar el mismo
espectro para una muestra de sangre de carnero (hemoglobina).
Discusión:
-¿A qué se deben las diferencias en los valores de absorbancia de las
muestras?
-La medida de absorbancia a 280 nm: ¿Es un método confiable para la
determinación de la concentración de proteínas? ¿Se puede aplicar a cualquier
proteína? ¿Qué se usa como patrón para la construcción de las curvas de
calibración?
1
NH 2
NH 2
o
C O
180 C
C O NH
C O
NH 2
NH 3
NH 2
Biuret
Se requieren al menos dos enlaces peptídicos para dar positiva esta reacción.
El máximo de absorción del complejo proteína - Biuret se produce a 545 nm,
cuando se lee la absorbancia frente a un blanco constituido por el reactivo del
Biuret.
Técnica:
Agregar distintos volúmenes de la muestra, completando a 0,3 ml con H2O,
mezclar y adicionar 1 ml de reactivo de Biuret. Respetar el orden del agregado
de los reactivos. MEZCLAR y leer absorbancia a 530 nm en un lapso de tiempo
de entre 30 minutos y 2 horas.
Curva de calibración sugerida: 0,25; 0,5; 0,8; 1; 1,2 y 1,4 mg del testigo.
Método de Bradford
Técnica:
Agregar distintos volúmenes de la muestra, completando a 0,5 ml con H2O,
mezclar y adicionar 0,5 ml de Azul Brillante de Coomassie. Respetar el orden
2
del agregado de los reactivos. MEZCLAR y leer absorbancia a 595 nm en un
lapso de tiempo de entre 2 minutos y 1 hora.
Discusión:
En base a la sensibilidad de los métodos utilizados y a la concentración de
proteína estimada para cada muestra informe el método elegido en cada caso y
justifique su elección.
ATENCIÓN:
Una vez finalizado el práctico cada grupo deberá dejar su lugar de trabajo
LIMPIO Y ORDENADO. Los tubos de ensayo deberán ser borrados,
enjuagados con alcohol, lavados y finalmente enjuagados con H2O destilada;
de la misma manera deberán lavarse las pipetas.