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QUÍMICA BIOLÓGICA. Año 2008

Trabajo Práctico Nº 2:

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS. PROPIEDADES ÓPTICAS DE PROTEÍNAS

Objetivos: Dosar proteínas en diferentes muestras mediante los métodos propuestos y comparar los resultados obtenidos.

PARTE A: Absorbancia de proteínas a 280 nm

Fundamento: Aunque ninguno de los 20 aminoácidos hallados en las proteínas absorbe luz en la región visible del espectro electromagnético, tres de ellos (tirosina, triptofano y fenilalanina) absorben significativamente en la región del UV cercano (alrededor de 280 nm). Dado que las proteínas poseen restos de aminoácidos aromáticos, las medidas de absorción a 280 nm constituyen un método rápido para la determinación del contenido de proteína de una solución.

Técnica:

Realizar el espectro de absorción (entre 200 nm y 600 nm) de muestras de gelatina y ovoalbúmina, de igual concentración. También realizar el mismo espectro para una muestra de sangre de carnero (hemoglobina).

Discusión:

-¿A qué se deben las diferencias en los valores de absorbancia de las muestras? -La medida de absorbancia a 280 nm: ¿Es un método confiable para la determinación de la concentración de proteínas? ¿Se puede aplicar a cualquier proteína? ¿Qué se usa como patrón para la construcción de las curvas de calibración?

PARTE B: Cuantificación de proteínas

Método de Gornall (reacción del Biuret):

Fundamento:

descompone

transformándose en un compuesto llamado “Biuret”, el cual en presencia de Cu 2+ en solución alcalina forma un complejo violáceo. La unión peptídica también reacciona con el Cu 2+ en medio alcalino dando coloración violácea, de ahí que a esta técnica de identificación de proteínas se la llame reacción del Biuret.

Cuando

se

calienta

la

urea

a

180°C

se

1

NH 2

C
C

NH 2

O

o 180 C
o
180 C

NH 3

NH 2 C NH C
NH 2
C
NH
C

O

O

NH 2

Biuret

Se requieren al menos dos enlaces peptídicos para dar positiva esta reacción. El máximo de absorción del complejo proteína - Biuret se produce a 545 nm, cuando se lee la absorbancia frente a un blanco constituido por el reactivo del Biuret.

Reactivo del Biuret: 1,5 g de CuSO 4 .5 H 2 O + 6 g de Tartrato de Na y K .4 H 2 O. Disolver en 500 ml de agua caliente, agregar 300 ml de NaOH 10 %. Llevar a 1 litro con agua.

Técnica:

Agregar distintos volúmenes de la muestra, completando a 0,3 ml con H 2 O, mezclar y adicionar 1 ml de reactivo de Biuret. Respetar el orden del agregado de los reactivos. MEZCLAR y leer absorbancia a 530 nm en un lapso de tiempo de entre 30 minutos y 2 horas.

Testigo: Ovoalbúmina 30 mg/ml

Sensibilidad: 0,2-1,5 mg de proteína en el volumen final de la determinación.

Curva de calibración sugerida: 0,25; 0,5; 0,8; 1; 1,2 y 1,4 mg del testigo.

Método de Bradford

Fundamento: Este método constituye una forma rápida y confiable para la determinación de proteínas. Se basa en la cuantificación de la unión del colorante Azul Brillante de Coomassie a una proteína desconocida y la comparación de esta unión con la de diferentes cantidades de una proteína standard. El complejo colorante - proteína presenta un máximo de absorción a 595 nm.

Coomassie:

de

Coomassie G-250 + 50 ml de etanol al 95 % + 100 ml de ácido fosfórico al 85 %. Llevar a 1 litro con H 2 O. Filtrar con papel Whatman N o 1. Conservar a 4 o C.

Solución

de

Azul

brillante

de

100

mg

de

Azul

Brillante

Técnica:

Agregar distintos volúmenes de la muestra, completando a 0,5 ml con H 2 O, mezclar y adicionar 0,5 ml de Azul Brillante de Coomassie. Respetar el orden

2

del agregado de los reactivos. MEZCLAR y leer absorbancia a 595 nm en un lapso de tiempo de entre 2 minutos y 1 hora.

Testigo: BSA 0,1 μg/μl

Sensibilidad: 1-10 μg de proteína en el volumen final de la determinación.

Curva de calibración sugerida: 1; 1,5; 2; 2,5; 3 y 3,5 μg del testigo.

NOTA: dada la alta sensibilidad del método, verifique antes de comenzar a trabajar que los tubos estén limpios.

Cuantificación de las muestras incógnitas:

Cada grupo deberá realizar la curva de calibración para ambos métodos y determinar la concentración de 2 muestras incógnitas.

Volumen de las muestras incógnitas a utilizar:

Método de Gornall: 150 μl. Método de Bradford: 150 μl.

Discusión:

En base a la sensibilidad de los métodos utilizados y a la concentración de proteína estimada para cada muestra informe el método elegido en cada caso y justifique su elección.

Los resultados obtenidos deberán ser informados de manera grupal.

ATENCIÓN:

Una vez finalizado el práctico cada grupo deberá dejar su lugar de trabajo LIMPIO Y ORDENADO. Los tubos de ensayo deberán ser borrados, enjuagados con alcohol, lavados y finalmente enjuagados con H 2 O destilada; de la misma manera deberán lavarse las pipetas.

MATERIAL PROVISTO POR EL ALUMNO:

alcohol.

papel absorbente.

marcador indeleble.

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