ESTAPHILOCOCCUS

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INTRODUCCIÓN

Stapylococus: género de bacterias perteneciente a la familia de las

Micrococcaceae, gram positivos, no esporulados, aerobios facultativos,
inmóviles. Su nombre, que en griego significa racimo de granos, deriva del
hecho de que este germen tiende a agruparse en masas desordenadas que
recuerdan los racimos de uva, si bien también se pueden encontrar como
elementos únicos o en pares, en grupos de cuatro o en cadenas cortas de tres
o cuatro células. Se han identificado unos 30 serotipos. Presentan una gran
variedad de enzimas, toxinas, hemolisinas y componentes celulares. Entre los
factores de virulencia de estas bacterias está su actividad coagulasa, siendo
mayor la virulencia cuanta mayor actividad coagulasa tenga. Casi todas las
inflamaciones del cuerpo están asociadas con este germen. Cerca del 80% son
resistentes a la penicilina. Este género de bacterias comprende numerosas
especies: albus, anaerobius, aureus, epidermis, etc.
Se hará un sembrado de Stapylococus en un medio selectivo sólido Baird
Parker y medio Chapman para ello utilizaremos muestras, yema de huevo y
queso fresco comprados del mercado del Callao “Santa Rosa” las muestras se
preparan mediante las diluciones decimales el procedimiento del sembrado y
conteo de colonias se explicara en transcurso del desarrollo del presente
trabajo.

I.-OBJETIVOS

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GENERALES:
• Determinar si existe la presencia de estafilococos en una muestra de
queso fresco y en la yema de huevo
ESPECIFICOS:
• Mediante el método de diluciones decimales se analizará la muestra
• El conteo de bacterias se realizará mediante un método indirecto
Recuento de viables en placa
• Se utilizará medios de cultivos selectivos; Chapman y Agar Baird Parker

II.-GENERALIDADES TEÓRICAS

TAXONOMIA
División II: Firmicutes
Clase I: Firmibacteria
Familia: Micrococcaceae
Género: Staphylococcus

GÉNERO Staphylococcus

El género Staphylococcus comprende microorganismos que están presentes

en la mucosa y en la piel de los humanos y de otros mamíferos y aves,
incluyendo a 32 especies y 15 subespecies, muchas de las cuales se
encuentran en los humanos. Las especies que se asocian con más frecuencia
a las enfermedades en humanos son Staphylococcus aureus (el miembro más
virulento y conocido del género), Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus
saprophticus, Staphylococcus capitis, "Staphylococcus afarensis" y
Staphylococcus haemolyticus.
Según Manual Bergey: 1957 y se clasifican en estafilococos coagulasa
positivos (ECP) y estafilococos coagulasa negativos (ECN) Estafilococo
coagulasa variable. Mencionaremos a los más representativos
Estafilococos coagulasa positivos (ECP)
o S.aureus
o S.intermedius

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o S.delphini
o S.schleiferi subsp coagulans
Estafilococo coagulasa variable
o S.hyicus
Estafilococos coagulasa negativos (ECN)
o S. epidermidis,
o S. warneri
o S. simulans)

CARACTERÍSTICAS GENERALES
Los estafilococos crecen fácilmente sobre casi todos los medios
bacteriológicos, en condiciones aeróbicas se da el mejor crecimiento. Su mayor
velocidad de crecimiento es a 5 - 25 ºC; pero también se puede ver en activa
fisión binaria entre 30 y 27 ºC. Además, producen catalasa, lo que los
diferencia de los estreptococos. Tiene importancia médica principalmente el S.
aureus, y en humanos además de éste, el S. saprophiticus y el S. epidermidis.
sus características mas comunes son:

• Células esféricas de 0,5 – 1,5 µm de diámetro, solos, de apares,

tétradas o grupos irregulares.
• Gram positivos, Inmóviles, no forman esporos.
• Pared celular contiene péptidoglicano y ácido teicoico.
• Anaerobios facultativos.
• Catalasa positivas.
• Metabolismo: RESPIRATORIO/FERMENTATIVO.
• La mayoría de las cepas crecen en presencia de 10 % ClNa, y entre 18 y
40 °C. Óptimo 37 °C/24 horas/atmósfera normal.
• Nutricionalmente, no exigentes. Desarrollan en medios comunes.
• En general presentan pigmentos carotenoides
Hábitat
• Comensal de la piel y mucosas (digestiva y rinofaringe)
• Distribución mundial. Microorganismo más extendido en la naturaleza.

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• Patógenos oportunistas para animales y humanos.

• Pueden aislarse de productos de origen animal (carne, leche, queso) y
ambiental (suelo, polvo, aire)

Recuento
Tipo de
estafilococos
alimento
/g
Ensalada de
1,7 * 106
pollo
Macarrones 2,6 * 107
Hamburguesa 2 * 102
Tarta de
7,3 * 102
chocolate
Negativo
Helado
<100/g

Características culturales de Staphylococcus

• Crecimiento en medio líquido

Turbidez homogénea con abundante depósito en el fondo del tubo.
Crecimiento en forma de anillo en la superficie

• Crecimiento en medio sólido:

Colonias redondas de 1 a 2 mm, bordes netos, superficie lisa, opacas o
mucoides.

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Medios de cultivos selectivos y diferenciales para aislamiento de

estafilococos

• Agar Manitol Salado (manitol, rojo de fenol)

• Agar Staphylo 110
• Agar Baird Parker (yema de huevo, telurito de

MEDIDA DEL NÚMERO DE INDIVIDUOS (conteo de las bacterias)

MÉTODOS DIRECTOS
1) Cámara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos
especial con una graduación en superficie y unas medidas muy concretas:
• Excavación con 0.02 mm de profundidad.
• Área de 1 mm2, dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes.
• Cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 4x4 = 16
cuadrados pequeños.
• sea, la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas (cuadros
pequeños).
La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar
sobre la plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el
número de células en varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno
de los cuadros grandes). Se anota el número n de células observadas en esas
16 celdillas. Entonces, la concentración celular es fácil de establecer:
n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml.

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Ventajas: es un método muy rápido.

Inconvenientes: sólo sirve para suspensiones relativamente concentradas

(>10x106 céls./ml). Por debajo de este valor el número de células vistas en el
campo del microscopio es muy pequeño y poco significativo estadísticamente.
En bacterias móviles, hay que inmovilizarlas previamente, con una mezcla de
alcohol y agua.

2) Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter): Se hace pasar una

suspensión microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente
eléctrica. Cada vez que por un orificio (30 mm diámetro) pasa una partícula (p.
ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo
de registro electrónico, que detecta el número y el tamaño de las partículas que
van pasando. (El tamaño detectado es función de la intensidad del pulso de
voltaje al paso de la partícula).

Comentarios: hay que usar suspensiones absolutamente libres de partículas

extrañas (las pequeñas serían contabilizadas erróneamente como bacterias, y
las mayores pueden obturar el orificio del aparato).

MÉTODOS INDIRECTOS
1) Recuento de viables en placa

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Los métodos de recuento de número de células que hemos visto hasta

ahora (los directos) no distinguen entre células vivas y muertas. En muchos
casos conviene contar las células vivas, y esto en laboratorio se suele hacer
mediante el recuento de viables. (Una célula se define como viable cuando,
colacada en un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar descendencia).
El método habitual de lograr esto es sembrar pequeñas alícuotas de
diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con medio
sólido (con agar). Cada célula viable dará origen a una colonia visible
después del tiempo adecuado de incubación. Contando las colonias
visibles, teniendo en cuenta la dilución de la que proceden y el volumen de
alícuota utilizado, es fácil deducir el número de células viables en la
suspensión original. (Para esto, mira el ejemplo de la diapositiva, y sobre
todo, estate atento a la práctica correspondiente, que se suele realizar en la
3ª tanda).

Mientras tanto, y para luego repasar esa práctica, puedes realizar un

experimento on-line sobre crecimiento bacteriano

Precauciones:
o Para minimizar los errores estadísticos de muestreo, se recomienda
sembrar 5 placas de cada dilución;
o Hay que usar pipetas nuevas en cada dilución;
o Contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias.
o Como no podemos garantizar que cada colonia no proceda de más
de un indiviudo (y esto es especialmente cierto para bacterias que
forman agrupaciones de 2 o más células), el recuento se refiere no a
“células viables reales” sino a “unidades formadoras de colonia”
(UFC). Por lo tanto, una UFC corresponde, como mínimo, a una
bacteria, pero sobre todo en bacterias con agrupaciones, la medida
por siembr en placa infravalora el número real de individuos, porque
cada UFC puede corresponder a dos o más individuos que estaban
juntos al ser sembrados en la placa.

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Recuento de viables por siembra en placas petri

2) Recuento sobre filtros: Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se

hace pasar un gran volumen de suspensión a través de una membrana de
nitrocelulosa o de nylon estériles (con un diámetro de poro que retiene las
bacterias pero permite el tránsito de sustancias). Posteriormente, el filtro se
deposita sobre la superficie de un medio de cultivo sólido. Las colonias se
forman sobre el filtro a partir de las células retenidas. Dichas colonias se
cuentan, deduciéndose la concentración original de viables en función del
volumen de suspensión que se hizo pasar por el filtro.

III.-PROCEDIMIENTO ESPERIMENTAL

MATERIALES

• Pipetas de 1 estériles

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• Estufa de cultivo
• Asa de vidrio estéril
• Asa de cultivo
• Placas de Petri de 90 mm de diámetro

Medios de cultivo y reactivos

• Medio sólido selectivo Baird Parker (B P)

• Medio sólido selectivo Champman
Muestras
• Yema de huevo 10ml
• Queso fresco 10g

PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO BAIRD PARKER

Composición:

• Triptona 10 g
• Extracto de carne 5 g
• Extracto de levadura 1 g
• Piruvato sódico 10 g
• Glicina 12 g
• Cloruro de litio 5 g
• Agar 20 g
• Agua destilada 1.000 mL

Disolver por calentamiento y agitación. Ajustar el pH a 6,9 ± 0,2. Esterilizar en

autoclave a 121 ºC durante 20 minutos. Enfriar a 50ºC y añadir 50g de
emulsión estéril yema de huevo-telurito (apartado siguiente). Mezclar
uniformemente y preparar placas de Petri.

Emulsión de yema de huevo-telurito

Composición

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• Emulsión de yema de huevo 50 g

• Telurito potásico 3,5 por 100
• Sulfametazina 0,2 por 100
• Agua destilada 1.000 mL

La yema de huevo se prepara partiendo de huevos frescos de gallina, bien

lavados y que hayan permanecido en alcohol al 70 por 100, entre 2-3 horas. Se
ex-trae e] huevo asépticamente, y, de la misma forma, se separan las claras de
las yemas. La emulsión se obtiene mezclando 50 mL de yema de huevo con la
misma cantidad de solución salina estéril. La mezcla se homogeneiza en
homogeneizador estéril.

La solución de telurito potásico al 3,5 por 100 se esteriliza por filtración.

Para preparar la solución de sulfametazina, se disuelven 0,5 g del producto

puro en 25 mL de hidróxido sódico Ni] O, completando hasta 250 mL con agua
destilada.

► El cloruro de litio y el telurito potásico que forman parte del medio inhiben el
desarrollo de la flora competitiva; el piruvato sódico y la glicocola favorecen el
crecimiento de los estafilococos.

PREPARACIÓN DEL MEDIO CHAPMAN

Composición (en gramos por litro)

• Extracto de carne 1.00
• Poliptepona 13.00
• D-Manitol 10.00
• Cloruro de sodio 75.00
• Rojo fenol 0.025
• Agar 13.00
- pH final 7,4 +/- 0,2

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► Es selectivo para el aislamiento de estafilococos. La mayoría de las

bacterias que no sean estafilococos, son inhibidas por la alta concentración de
cloruro de sodio. Por lo general los estafilococos coagulasa positiva fermentan
el manitol de éste medio haciéndolo virar al amarillo. Se trata de un medio
altamente selectivo debido a su alta concentración salina. Los estafilococos
coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Paso 1
Asépticamente se pesan 10 g de muestra (queso) y se mide 10ml de yema de
huevo. El queso se triturará en un vaso con una espátula y el huevo se batirá
ligeramente en un vaso.

Paso2
Luego se diluyen en 90 mL de agua peptonada o destilada ambas muestras

Paso3

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Homogenizar la mezcla en el Stomacher durante 1 a 4 minutos (el tiempo varía

segun el tipo de alimento) (defectivamente realizarlo por trituración en un vaso
esterilizado de una trituradora de cuchillas -tipo batidora- a una velocidad
aproximada de 14.000 rpm y en un tiempo medio de 60-90 segundos), pero en
nuestro caso utilizaremos un agitador magnético.

PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES DECIMALES

Paso1
Según el número de microorganismos esperado y sobre la base de la dilución
inicial de 10 g en 90 mL (dilución 10-1), preparar diluciones decimales de 10-2,
10-3, etc., usando pipetas o puntas estériles para cada dilución, tomando 1 mL
de la solución anterior en 9 mL de agua peptonada, y evitando que se forme
espuma

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Paso2

Mezclar mecánicamente cada dilución en un agitador mecánico tipo vortex ( o

manualmente agitándo el tubo 25 veces en 7 segundos con movimientos
ascendentes y descendentes formando un ángulo de abertura aproximado de
60º entre brazo y antebrazo).

SIEMBRA POR EXTENSIÓN EN SUPERFICIE

A partir de la "serie de diluciones decimales" , se siembra con la ayuda del asa

de khole de cada dilución sobre la superficie bien seca de agar Baird-Parker y
en el medio CHAPMAN contenido en placas de Petri, se podria sembrar de las
siguentes formas.

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Incubación de las placas

Invertir las placas de Petri e incubarlas en estufa a 37 ºC durante 48 horas, con
lectura a las 24 horas.

Lectura de las placas y recuentos de colonias

Seleccionar para el recuento las placas inoculadas con la dilución que

contengan entre 20 y 200 colonias típicas.

CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

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En las placas que se ha efectuado el recuento, multiplicar por el inverso de la

dilución y expresar el resultado como Unidades Formadoras de Colonias por g
de alimento (UFC/ml).

N=CxD

Donde:
N= Unidades formadoras de colonia por gramo de muestra (UFC/g o UFC/mL).
C= Media del número de colonias en las dos placas.
D= Factor o inverso de la dilución.

RESULTADOS EXPERIMENTALES

Se sembraron las muestras de dilución 10-5, 10-6, 10-7, en sendas placas petri.

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10-6, 10-7, 10-5, 10-7 respectivamente

HACIENDO UN RECUENTO DE COLONIAS

Recuento de viables en placa:

• en la placa de dilución 10-5, se contaron 150 colonias

• en la placa de dilución de 10-6, se contaron 25 colonias
• en la placa de dilución de 10-7, se contaron 10 colonias

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Aplicando la formula para hallar la Unidades Formadoras de Colonias por g de

alimento (UFC/ml).

N=CxD

N=150x105=15x106 UFC/ml

N=25x106=25x106 UFC/ml

N=10x107=100x106 UFC/ml

CONCLUSIONES

• se concluye que en la muestra de queso fresco existe gran cantidad de

estafilococos esto se puede reconocer porque la coloración del agra
Chapman que inicialmente es rojo se tiñe de amarillo porque el
estafilococos fermenta el manitol produciendo acido.
• Se sembró en una placa la mitad una muestra de queso y la otra mitad
de yema de huevo y se observo que hay más estafilococos en la
muestra de queso.

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REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

• http://www.fcv.unlp.edu.ar/sitios-catedras/97/material/Teorico%20Apo
%20I%20estafilococo.pdf
• http://www.pncq.org.br/biblioteca/actualidades2005_11.pdf
• http://www.higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2019.pdf
• http://enlinea.zaragoza.unam.mx/didacta/biologia/micorrizas/Microbiol.pd
f
• http://www.analizacalidad.com/anmic.pdf
• http://www.brizuela-lab.com.ar/producto.htm
• (http://virus.usal.es/web/demo_microali/Saureus/SaureusPlaca.html)
• ©2005 Laboratorio de Tecnología Educativa. Departamento de
Microbiología y Genética. Universidad de Salamanca.
• http://es.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus

Material profesora

Radiación_rangos

Radiación

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