P. 1
Www.referat.ro-studii Privind Biosinteza Unui Complex Multienzimatic Utilizabil CA Aditiv Furajer

Www.referat.ro-studii Privind Biosinteza Unui Complex Multienzimatic Utilizabil CA Aditiv Furajer

|Views: 837|Likes:
Published by one_girl20

More info:

Published by: one_girl20 on Oct 15, 2010
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOC, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

05/23/2013

pdf

text

original

www.referat.

ro

www.referat.ro

‘UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRONOMICE ŞI

MEDICINĂ VETERINARĂ BUCUREŞTI FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII SPECIALIZAREA BIOTEHNOLOGII MEDICAL-VETERINARE

PROIECT DE DIPLOMĂ

Şef lucrări dr.chimist LUMINIŢA IONESCU CSI dr. chimist : GETA AVRAM

Absolvent : Marinescu Georgiana

BUCUREŞTI 2010 UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRONOMICE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ – BUCUREŞTI FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII SPECIALIZAREA BIOTEHNOLOGII MEDICAL VETERINARE

STUDII PRIVIND BIOSINTEZA UNUI COMPLEX MULTIENZIMATIC UTILIZABIL CA ADITIV FURAJER

Coordonator Ştiinţific : LUMINIŢA IONESCU CSI dr. chimist : GETA AVRAM

Absolvent : Marinescu Georgiana

BUCUREŞTI
2010

Cuprins

REZUMAT……………………………………………………………………………… …………..3 INTRODUCERE................................................................................................................7 PARTEA I.........................................................................................................................11 STUDII DOCUMENTARE.............................................................................................11 Capitolul 1. Enzime hidrolitice de uz furajer şi microorganisme producătoare.......11 α-amilaza........................................................................................................................11 Celulazele.......................................................................................................................13 1.3. Hemicelulazele....................................................................................................14 1.4. Microorganisme producătoare de enzime hidrolitice de uz furajer....................16 Capitolul 2. Utilizarea deşeurilor şi/sau subproduselor agricole în medii de biosinteză a enzimelor hidrolitice de uz zootehnic........................................................20 Capitolul 3.........................................................................................................................24 CERCETĂRI EXPERIMENTALE...............................................................................27 Capitolul 4. Materiale şi metode.....................................................................................27 4.1 Tulpini de lucru........................................................................................................27 4.2. Obţinerea culturilor de intreţinere...........................................................................27 .................................................................................................27 4.3. Cultivarea în laborator şi testarea activităţii hidrolitice ....................................28 4.4. Determinarea activităţilor enzimatice.................................................................30 4.5. Testarea produsului enzimatic în hrana animalelor de fermă.............................39 Capitolul 5. Rezultate şi discuţii.....................................................................................42 5.1. Compoziţia mediilor pentru cultura de întreţinere .................................................42 5.2 Analiza comparativă a biosintezei enzimelor hidrolitice cu tulpini Aspergillus niger şi Trichoderma viride pe diferite medii.........................................................................42 5.3. Temperatura optimă de cultivare............................................................................45 5.3 Alegerea pH-ului optim de cultivare........................................................................47 5.4. Testarea complexului enzimatic ca aditiv furajer.................................................51 CONCLUZII.......................................................54 BIBLIOGRAFIE .............................................................................................................56

REZUMAT

Numeroase nutreţuri ieftine sunt limitate ca utilizare în hrana animalelor datorită disponibilităţii reduse a nutrientilor pe care îi contin. Astfel, anumite reţete pe bază de cereale, care, de altfel, se folosesc şi în ţara noastră, conţin cantităţi importante de poliglucide neamidonoase PNA (polizaharide fără amidon). Acestea sunt reprezentate în principal de beta-glucani (în orz şi ovăz), arabinoxilani (în grâu şi tărâţe), polimeri pe bază de rafinoză (în şrotul de soia) celuloză şi hemiceluloză (şrotul de floarea soarelui), fapt care limiteaza sever folosirea lor în hrana animalelor. PNA din cereale şi tărâţele acestora manifesta o activitate antinutritivă când sunt prezenţi în cantităţi mari în hrana păsărilor şi porcilor. Ele nu pot fi degradate de enzimele din tubul digestiv al acestor animale. Efectele antinutritive ale PNA se concretizeaza în diminuarea digestibilitatii amidonului, proteinelor şi grăsimilor, determinând astfel un efect general de reducerea ratei de creştere şi de valorificare a hranei. PNA măresc vâscozitatea conţinutului intestinal şi împiedica difuzia enzimelor endogene şi mixarea aceatora în masa continutului digestiv. Având în vedere structura complexă a PNA din materiile prime furajere, este evident că un singur tip de activitate enzimatică nu poate asigura disponibilizarea tuturor substanţelor nutritive din componentele hranei, fiind necesară combinarea mai multor produse diferite (de unde necesitatea obţinerii unor complexe multienzimatice). În acest context, in proiectul de faţã s-a urmărit selecţia unor tulpini fungice cu capacitate crescutã de producere a unui complex de enzime hidrolitice prin utilizarea unor formule noi de substraturi nutritive, precum şi stabilirea condiţiilor optime de biosinteză a acestor enzime cu microorganismele selecţionate. In prima parte a lucrării sunt prezentate studii documentare referitoare la enzime hidrolitice de uz furajer şi microorganisme producătoare ale acestora, utilizarea deşeurilor şi/sau subproduselor agricole în medii de biosinteză a enzimelor hidrolitice de uz zootehnic, caracteristici ale proceselor de fermentatie cu microorganisme producatoare de enzime hidrolitice utilizabile ca aditivi furajeri.

activitatea xilanazică 1366. În scopul determinării condiţiilor optime de cultivare a tulpinii de Aspergillus niger CMGB-401 pentru biosinteza enzimelor hidrolitice (amilaze.27 UC1-Cx/g. în ceea ce priveşte capacitatea acestora de a produce un complex de enzime hidrolitice (proteaze. pH-ul mediului de cultură şi gradul de agitare şi aerare al culturii.33 U/ml). Rezultatele obţinute au evidenţiat capacitatea bioproductivă superioară a tulpinii Aspergillus niger CMGB-401 în ceea ce priveşte complexul enzimatic studiat. au fost cercetaţi o serie de parametrii care au o importanţă semnificativă pentru acest tip de bioprocese şi anume: compoziţia mediul de cultură. cele mai bune rezultate s-au obţinut cu mediul lichid M 4. dintre cele cinci medii testate (patru medii lichide şi un mediu semisolid pe bază de tărâţe de grâu). activitatea proteolitică 1.05%. În ceea ce priveşte compoziţia mediului de cultură. temperatura. xilanaze) utilizabil ca aditiv furajer.6 UDNS/g. concentrare şi adsorbţie pe CaCO3 tehnic) s-a evaluat comparativ cu preparatul KEMZYME®VP DRY (Belgia).În cadrul cercetărilor experimentale prezentate în proiect s-au testat două tulpini de Aspergillus niger şi o tulpină Trichoderma viridae din colecţia Centrului de Biotehnologii Microbiene şi respectiv a Facultăţii de Biologie. xilanaze). Făină de soia-3%.5%. (NH4)2HPO4-0. celulaze. activitatea polienzimatica a mediilor de fermentaţie şi a produselor finite (obţinute prin filtrarea mediului de fermentaţie.95 UP/g. s-a observat că tulpina de Aspergillus niger CMGB-401 conduce cele mai bune activităţi enzimatice. pe 4 medii de cultură preluate din literatura de specialitate. MgSO4x7H2O-0. Cele trei tulpini de fungi au fost cultivate în sistem submers. celulaze. Universitatea Bucureşti.1% În cazul diferitelor variante de pH şi temperatură folosite. . proteaze.5 şi la temperatura de 280C (activitatea amilolitică 141. CaCl2-0. amilaze. în urma cultivării la pH = 5. activitatea celulozolitică 2. având următoarea compoziţie (g%): Făină de porumb-2%.

4. Testarea ca aditiv furajer a produsului polienzimatic condiţionat a evidenţiat faptul că utilizarea acestuia nu a influenţat semnificativ greutatea corporală şi sporul mediu zilnic a purceilor în perioada crizei de înţărcare. alge.52% .04% mai mic faţă de martor. s-a interzis utilizarea pulberilor de origine animalã în furajarea animalelor şi prin urmare s-au căutat alte cãi pentru ca necesarul de proteinã furajerã sã fie acoperit. in funcţie de cantitatea de produs introdusă în raţia zilnică. Printre sursele alternative de proteine furajere se numără: − surse semiconvenţionale. − surse neconvenţionale. Consumul specific la loturile de purcei la care s-a utilizat preparat enzimatic este cu 1. utilizate curent astãzi în diferite ţãri. De peste 60 de ani domeniul aditivilor furajeri este explorat prin numeroase cercetări. tratarea cu CaCO3 a concentratului şi uscarea sub vid a amestecului rezultat. drojdii. Rezultatele obţinute sugerează eficienţa utilizării preparatelor enzimatice în recepturi de nutreţ combinat deficitare în principii nutritive. timp în care au fost elaborate şi testate o multitudine de produse experimentale .Condiţionarea produsului polienzimatic s-a realizat prin concentrarea mediului integral din finalul fermentaţiei. bacterii. cum sunt proteinele furnizate de microorganisme: mucegaiuri. INTRODUCERE Odatã cu integrarea în Uniunea Europeanã. posibil din cauza faptului că nutreţul combinat a fost optimizat în principii nutritivi specifici acestei categorii de porcine. cum sunt proteinele seminţelor de oleaginoase (soia) şi din concentratele de peşte. România s-a aliniat la Standardele Europene în ceea ce priveşte asigurarea calitãţii nutreţurilor cu un impact deosebit asupra sãnãtãţii animalelor şi în consecinţã a oamenilor.

a proceselor de crestere a tesuturilor la animale si pasari. Astfel eficienţa conversiei hranei este redusă şi costul/kg spor este ridicat. Numeroase nutreturi ieftine sunt limitate ca utilizare în hrana animalelor datorita disponibilitatii reduse a nutrientilor pe care îi contin. O soluţie pentru diminuarea efectului negativ al PNA asupra producţiei animaliere este reprezentată de adiţia de enzime în hrana animalelor. polimeri pe bază de rafinozã (în şrotul de soia) celuloză si hemiceluloză (şrotul de floarea soarelui). Efectele antinutritive ale PNA se concretizeaza în diminuarea digestibilitatii amidonului. conţin cantităţi importante de poliglucide neamidonoase PNA (polizaharide fără amidon). cele mai multe pot fi separate si-si pot continua activitatea in vitro. proteinelor si grasimilor. Ca rezultat. arabinoxilani (în grâu si tarâte). Acestea sunt reprezentate în principal de beta-glucani (în orz si ovaz). PNA maresc vâscozitatea continutului intestinal si împiedica difuzia enzimelor endogene si mixarea aceatora în masa continutului digestiv. dejecţii lipicioase sau cu umiditate ridicată (care afectează negativ microclimatul). Ele au rol important in reglarea matabolismului substantelor nutritive. aceasta nouă clasă de compuşi a devenit una din principalele căi de sporire şi eficientizare a performanţelor de valorificare a hranei de către animalele de interes zootehnic. În acelaşi timp pentozanii si betaglucanii se pot combina cu enzime specifice ale tractusului digestiv. . de altfel. Astfel. se folosesc şi în ţara noastră. sporul mediu zilnic fiind redus. Ele nu pot fi degradate de enzimele din tubul digestiv al acestor animale. consum excesiv de apă. fapt care limiteaza sever folosirea lor în hrana animalelor. PNA din cereale si tarâtele acestora manifesta o activitate antinutritiva când sunt prezenti în cantitati mari în hana pasarilor si porcilor. determinând astfel un efect general de reducerea ratei de crestere si de valorificare a hanei. reducându-le activitatea. Desi ele se formeaza si functioneaza ca si catalizatori doar in celule vii. anumite reţete pe bază de cereale.şi comerciale. De la simple substanţe de tipul acizilor organici pâna la sisteme de aditivi cu peste 10 substanţe active încorporate. digestibilitatea nutreţurilor se reduce şi apar o serie de tulburări ca: diaree (simptom asociat frecvent cu prezenta grâului în cantităţi mari în raţii). Enzimele sunt catalizatori biologici de natura proteica care participa la numeroase reactii chimice ce au loc in sistemele vii şi fara de care viata nu ar putea exista. care.

imbunatatirea performantelor productive. Hemiceluloza este o componentă a fracţiunii polizaharidice care se găseşte la un nivel ridicat în peretele celular al plantei. răspunsul animalelor la adiţia de enzime nu depinde numai de substrat dar şi de capacitatea fiziologică a animalelor de a utiliza nutrienţii. chiar dacă pentru cele mai multe din dietele pe bază de proteine vegetale este necesară adăugarea de alfagalactozide şi pectinaze.În ultima perioada. incluzând β-D-glucani necelulozici. De fapt. De exemplu. se poate realiza creşterea performanţelor productive şi. eforturile cercetatorilor din intreaga lume s-au indreptat spre studierea efectului enzimelor de natura exogena in cresterea disponibilitatii si digestibilitatii substantelor nutritive si valorii energetice a nutreturilor. Cerintele noilor enzime furajere sunt: activitati specifice mari in conditiile de lucru impuse.şi glucuronoxilani). activitatea esenţială să fie orientată spre acest substrat. de exemplu. astfel că. heteropolizaharidele cu un grad de polimerizare redus (100 – 200 unităţi) comparativ cu al glucozei (10000 – 14 0000). Având în vedere structura complexă a PNA din materiile prime furajere. Aceste aspecte sunt susţinute de cercetările de specialitate care demonstrează. care sunt asociate cu celuloza si intra in constitutia peretelui celular vegetal. manoză (galactogluco. Prin încorporarea enzimelor exogene specifice în nutreţul combinat pentru porci sau păsări. pH scazut si la actiunea enzimelor proteolitice. reducerea costurilor hranei pe unitatea de produs. sunt în general denumite cu termenul de hemiceluloze. stabilitate marita la pastrare. protejarea mediului prin reducerea conţinutului excretei în azot şi fosfor. Acesta este formată dintr-un grup de heteropolizaharide solubile în mediu alcalin. este evident că un singur tip de activitate enzimatică nu poate asigura disponibilizarea tuturor substanţelor nutritive din componentele hranei. fiind necesară combinarea mai multor produse diferite (de unde necesitatea obţinerii unor preparate enzimatice complexe). Principalii componenţi glucidici ai .şi glucomanani) şi xiloză (arabinoglucurono. rezistenta mare la inactivare prin tratament termic. totodată. costuri scazute de productie. unde predomină arabinoxilanii este necesar ca în complexul enzimatic utilizat. la grâu şi secară. corelaţia între progresul genetic la porc şi schimbările în raţiile specifice categoriei şi vârstei. substanţe pectice (poligalacturonani) şi mai multe heteropolizaharide cum sunt cele formate în mod predominant din galactoză (arabinogalactani).

acidul D-glucuronic. pe baza utilizãrii reziduurilor agricole ca materii prime în procesele fermentative precum şi stabilirea condiţiilor optime de biosinteză a acestor enzime cu microorganismele selecţionate. D-galactoza. . fie pe substraturi solide. L-arabinoza. contribuind la ridicarea eficienţei biologice şi economice a hranei. celulaza. Adiţia enzimelor exogene precum amilaza. cu microorganisme specifice genului Aspergillius. Datele din literatura de specialitate atestă faptul că enzimele hidrolitice susmenţionate se obţin fie prin fermentaţie în sistem submers. acidul D-galacturonic şi mai puţin L-rhamnoza. xilanaza. Dintre aceştia β-glucanii şi arabinoxilanii sunt recunoscuţi ca factori antinutritivi în cereale. D-manoza. În acest context. D-glucoza.heteropolizaharidelor hemicelulozice sunt: D-xiloza. Lfucoza şi diferite glucide O-metilate. proteaza. oferă nutriţioniştilor posibilităţi multiple pentru stimularea proceselor digestive şi metabolice la animale. în dietele furajere. in proiectul de faţã s-a urmărit selecţia unor tulpini fungice cu capacitate crescutã de producere a unui complex de enzime hidrolitice prin utilizarea unor formule noi de substraturi nutritive.

Bacillus subtilis. Ruperea legăturii glicozidice duce la formarea unui ion intermediar oxicarbonic (stare de tranziţie) care este stabilizat de încărcătura negativă a celorlalţi aminoacizi.5) sau α-amilaza bazică din Bacillus licheniformis (pH 9. plante.1. animale) realizând hidroliza substraturilor amidonoase până la oligozaharide. dar poate ajunge până la 70-800C în cazul αamilazelor bacteriene din Bacillus stearothermophilus.000 şi 60.PARTEA I STUDII DOCUMENTARE Capitolul 1. asemănător celui întâlnit în cazul lizozimului. Bacillus licheniformis (tabelul 1). Temperatura optimă de activitate variază şi ea în funcţie de originea enzimei. Această legătură continuă să fie slăbită prin acţiunea unuia din cei doi aminoacizi. În final.1. cu mase moleculare cuprinse între 50. Mecanismul hidrolizei. Enzime hidrolitice de uz furajer şi microorganisme producătoare α-amilaza α-amilazele (α-1. acest ion reacţionează cu o moleculă de apă şi cele două oligozaharide formate părăsesc situsul catalitic (fig.000. care se comportă ca donor de proton pentru O4. Situsul catalitic al α-amilazelor este format din doi aminoacizi (Asp şi Glu) care se găsesc în zona de legare a substratului [2]. Ele sunt sunt proteine mici.9. .0).4-D-glucan-4-glucohidrolaza EC 3. începe printr-o slăbire a legăturii C1-O4 în vederea hidrolizei.8 şi 6. Valori extreme de pH se întâlnesc la α-amilaza acidă din Bacillus subtilis (pH 3.) se întâlnesc în toate organismele vii (microorganisme. Temperatura medie este de 40-500C. pH-ul optim al α-amilazelor depinde de originea acestora. situându-se între 4. Prezenţa ionilor de calciu favorizează uneori creşterea stabilităţii enzimei în condiţii extreme de pH. urmată de formarea complexului enzimă-substrat.2. 1).

Proprietăţile α-amilazelor (E. subtilis A.9 4.500 49.600 pH optim 6.2.4 5.0 5. oryzae Masa moleculara 50.4 5.3 – 6. 3.4 – 6.1 5.000 59. Mecanismul propus pentru reacţia de hidroliză catalizată de α-amilază Tabelul 1.55 65 76 70 50 40 .000 52. licheniformis B.000 47.7 – 5. stearothermophilus B.1.0 – 9.C.500 49.000 22.9 5.5 – 6.1) Originea enzimei Animală Pancreas de porc Vegetala Malţ de orz Microbiană Bacillus amyloliquefqciens B.Figura 1.9 Temperatura optima (0C) 37 50 .

. ele pot fi împărţite în trei clase majore: endoglucanaze sau endo-1.21). cu diferite specificităţi de hidroliză a legăturilor glicozidice. celulazele sun proteine formate din mai multe domenii.C.3. celo-oligozaharide la glucoză. enzimele responsabile de hidroliza celulozei. celobiohidrolaze (E. În funcţie de activitatea lor enzimatică.4-β-glucanaze (E. deseori denumite exoglucanaze. endoglucanazele şi celobiohidrolazele acţionează în mod sinergic.4). Celobiohidrolazele. Celobiohidrolazele indepărtează mono. sunt compuse dintr-un amestec complex de proteine enzimatice. dar detaliile mecanismelor lor de acţiune încă nu sunt cunoscute.3. Se consideră că endoglucanazele.şi dimeri de la capătul lanţului celulozic. β-glucozidaza hidrolizează dimerii şi în anumite cazuri. deseori denumite carboximetilcelulozo (CM)-celulaze iniţiază atacul aleatoriu la multiple situsuri din interiorul regiunilor amorfe ale fibrei celulozice.2.C.1.şi exoglucanaze.91) şi β-glucozidaze (E. formează componenta majoră a sistemului celulazic fungic.3.1.1. deschizând astfel calea celobiohidrolazelor. Definiţia curentă şi clasificarea “adevăratelor” celulaze este încă incertă [3].2. reprezentând aproximativ 40-70% din proteina celulazică totală şi se caracterizează prin faptul că hidrolizează celuloza cristalină. În general. Se pare că microorganismele au mai multe variante distincte de endo.C.Celulazele Celulazele. Ca şi hemicelulazele.2.

3. în special xiloză şi arabinoză şi care mai conţine şi hexoze (în special manoză) şi câţiva acizi glucidici (figura 2). Degradarea enzimatica a celulozei 1. ca multe alte enzime care hidrolizează polizaharide. Hemicelulazele Hemicelulazele. respectiv hemiceluloza. Figura 3. sunt proteine alcătuite din mai multe domenii. în componenţa căruia predomină molecule de glucide cu 5 atomi de carbon. Hemiceluloza este un polimer complex. din peretele celular al plantelor. Structura hemicelulozei .Figura 2.

Acestea din urmă hidrolizează legăturile esterice ale acetatului sau ale esterilor acidului ferulic şi.feruloil esteraze: hidrolizează legătura esterică dintre substituenţii arabinozei si acidul ferulic. . fie de complexe enzimatice precum celulozomul Shallom şi Shoham.β-mananaze: hidrolizează hemicelulazele pe bază de manan → β-1. .2-glicozidică din catena laterală a xilanilor.xilozidaz-arabinozidaze: GHs bifunctionale. în funcţie de omologia secvenţei lor primare. . fie carbohidrat esteraze (CEs)[4].β-xilozidaze: hidrolizeaza xilooligomerii la xiloza.Hemicelulazele conţin în general module catalitice şi necatalitice structural distincte. Feruloil esterazele contribuie la ruperea legaturilor dintre hemiceluloza si . fie de suprafaţa celulei microbiene. liganzi interdomenii şi module dockerin care mediază legarea domeniului catalitic al enzimei. ele au fost grupate în diferite familii.β-manozidaza: hidrolizeaza β-1. hemicelulazele se împart în: . acţionând asupra uneia din legăturile O-5. care actioneaza asupra legaturilor dintre xiloza si arabinoza (Lee şi colab.4-manooligomeri mici. unele au o specificitate largă de substrat. 2003) si au o secventa primara asemanatoare cu unele dintre β-xilozidaze. O-2 si/sau O-3 ale arabinofuranozidelor ca si supra legăturilor O-2 şi O-3 din xilanii dublu substituiţi.alte xilanaze si α-D-glucuronidaze: hidrolizează legătura α-1. formată cu acid 4-O-metil-D-glucuronic ..xilanaze: hemicelulaze majore care ataca legăturile β-1.acetil esteraze: hidrolizează substituenţii acetil de pe molecula xilozei . În funcţie de specificitatea de subtract.4-mano-oligomeri la manoză -α-L-arabinofuranozidaze si α-L-arabinanaze: hidrolizează arabinofuranozilhemicelulozele. prin interacţii de coeziunedockerin. Cele mai importante module necatalitice constau în domenii de legare a carbohidraţilor (CBD) care facilitează fixarea acestora.4-glicozidice din scheletul xilanului → xilooligomeri. . . hemicelulazele sunt fie glicozid-hidrolaze (GHs). În funcţie de secvenţa de aminoacizi sau de acizi nucleici specifică modulelor lor catalitice.

Mãrirea gradului de eficacitate a tehnologiilor de biosintezã se realizeazã astãzi pe scarã largã. Enzime implicate in degradarea hemicelulozei O clasificare comprehensivă a hemicelulazelor şi a altor hidrolaze este disponibilă pe site-ul http:/afmb. 1. Figura 4. cnrs-mrs.lignină. Microorganisme producătoare de enzime hidrolitice de uz furajer O preocupare permanentã a cercetãtorilor din domeniul biotehnologiilor o constituie ridicarea potenţialului productiv al tulpinilor implicate în procesele de biosinteza. prin utilizarea tehnicilor de recombinare geneticã.fr/CAZY. Este cunoscut faptul cã rentabilitatea bioproceselor depine în mare masurã de potenţialul productiv al suşelor producãtoare.4. . polizaharidulul devenind accesibil biodegradării ulterioare de către glicozidhidrolazele specific[5].

Utilizarea mucegaiurilor pentru producerea de enzime hidrolitice prezintã o serie de avantaje: − avand o structurã filamentoasã pot fi separate mai usor din mediul de culturã faţã de drojdii şi bacterii. în ultima perioadã. au un ciclu de viatã sexuat şi sunt denumiţi în mod obişnuit fungi imperfecţi. microorganisme modificate genetic. Fungii apartinând genului Aspergillus sunt alãturi de cei din genul Penicillium.L. capabile sã sintetizeze biocatalizatorul cu o ratã crescutã. sunt utilizate tot mai des mutante. Acest ciclu ambiguu asemãnãtor cu cel sexual. Solomon (1985) în Biology of Industrial Microorganisms [6]: − Diviziunea Anastigomycotina − Subdiviziunea Deuteromycotina − Clasa Deuteromycetes − Subclasa Hypomycotidae − Ordinul Moniliales − Familia Monialiaceae − Genul Aspergillus Majoritatea speciilor din genul Aspergillus prezintã miceliu septat. Datele recente din literaturã indicã obţinerea de enzime hidrolitice în special cu ajutorul fungilor de Aspergillus niger. Din punct de vedere taxonomic. .A. secretã enzime degradative conducând în cele din urma la descompunerea şi transformarea substratului pe care se dezvoltã. studiindu-se posibilitatea îmbunãtãţirii procesului de fermentaţie sau selecţia de noi tulpini producãtoare. microorganisme eucariote. fungii. în special în etapa de recombinare a materialului genetic. într-un timp mai scurt şi pe medii de culturã cât mai ieftine. cu specificaţia cã recombinarea nu are loc în meioza. ci în cursul deviziunii mitotice. pot fi încadrate dupã clasificarea datã de A. Mai pot fi încadrati şi la fungii perfecţi datorita prezenţei ciclului de viaţã parasexual. Tehnicile utilizate în scopul schimbãrii structurii genetice a microorganismelor constau în mutaţii şi selecţii tehnice recombinare in vitro şi tehnici de inginerie geneticã. Fungii filamentoşi invadeaza substraturile solide.În plus. cele mai importante microorganisme folosite în biotehnologiile de obţinere a enzimelor. Demain şi N. ca tulpini producãtoare de enzime.

Mucegaiurile pot fi cultivate pe substraturi lichide sau solide bogate în glucide. β-amilaze. În industria alimentarã xilanazele au fost propuse pentru modificarea celulozei şi hemicelulozei prin hidroliza parţialã. Hidroliza totalã a celulozei în glucozã. ca şi de enzime pectinolitice. fungul mai produce cantitãţi considerabile de hemicelulaze. fiind necesare cantitãţi minime pentru a produce efectul dorit. Penicillium si Rhizopus. Fusarium.− au un conţinut mult mai mic de acizi nucleici decât bacteriile şi drojdiile. arabinani şi arabinogalactani). Aspergillus oryzae). (b) aditivul nu este folosit în exces. pH-ul optim şi greutatea molecularã. incluzand temperatura. proteinaze şi ligninperoxidaze. A fost stabilitã şi standardizatã o metodã de biosintezã a enzimelor celulozolitice cu o tulpinã de Aspergillus niger IBT-90 [7]. A fost . Aceste doua carbohidrolaze au fost izolate şi au fost determinate proprietãţile lor catalitice şi moleculare. Trichoderma (Trichoderma viridae.4-xilanaza hidrolizeazã arabinoxilanul. Enzimele celulozolitice derivate din Aspergillus niger IBT-90 par sã atace celuloza într-un mod sinergic. Carbohidrolazele şi enzimele celulozolitice derivate din Aspergillus niger pot fi utilizate în siguranţa ca aditiv în hrana. în conformitate cu urmãtoarele condiţii: (a) tulpina Aspergillus niger nu este toxicã sau patogenicã pentru oameni sau animale.4-glucanaze si anume celobiohidrolaze si β-glucanaze. Multe dintre microorganismele folosite produc aceste enzime extracelular. Trichoderma reesei. Endo-β-1. un constituent major al peretelui celular al cerealelor şi de curand aceastã enzimã este utilizatã în mare mãsura în procesele biotehnologice. cele mai importante genuri fiind: Aspergillus (Aspergillus niger. se poate finaliza cu cu fermentaţia glucozei la etanol. care nu sunt accesibile drojdiilor. Trichoderma koningii). izopropanol sau butanol.3-glucanaze. Arabinofuranozidazele sunt enzime care scindeazã substituienţii arabinozici din hemiceluloze (arabinoza la arabinoxilani. Studiile asupra activitãţii enzimelor celulozolitice au evidenţiat 2-endoβ-1. 1. − pot asimila din substrat oligozaharidele. ceea ce usureazã foarte mult condiţiile de prelucrare industrială pentru obţinerea de enzime. În afarã de enzimele celulozolitice.

pe diferite substraturi lignocelulozice. Mãrimea inoculului de 52x105 spori/g. Activitatea şi producţia de xilanazã dupã 5 zile de fermentaţie utilizând ca sursã de carbon paie de orez a fost de 5. 3.071 IU/g respectiv 14.5 IU/ml. Aspergillus sp. activitatea xilanazicã a fost de 74. Dupã 4 zile de incubare. a produs xilanaza cu un nivel scazut al activitãţii celulozolitice.790 IU I-1h-1.Y. Procentul de umiditate iniţial. Kamat [9] pentru obţinerea de xilanazã (E.V. Ca substrat lignocelulozic utilizat pentru producţia de xilanazã cel mai bun a fost tãrâţele de grâu.C. Cultura filtratã proaspãtã a fost utilizatã pentru hidroliza diferitelor deşeuri lignocelulozice. cunoscutã ca producãtoare de xilanazã. accentuând potenţialul comercial al producţiei enzimelor xilanazice. preparatele xilanazice au îndepãrtat fracţia hemicelulozicã din toate deşeurile lignocelulozice testate.1% extract de drojdie) la 35ºC şi concentraţia inoculului fiind de 2x107-2x108 spori/5g substrat. facilitând un sistem de purificare al enzimelor relativ simplu[9].484 IU/g de paie de orez [8]. Gawande si M. timpul de cultivare de 5 zile şi de 10 ori mai concentrat mediul bazal care conţine 50% extract de grâu. au reprezentat parametrii optimi pentru producţia de xilanazã prin fermentaţie în stare solidã. S-a demonstrat cã timpul de cultivare şi concentraţia mediului de bazã reprezintã factorii cei mai importanţi care afecteazã activitatea xilanazicã. În timpul zaharificãrii.2. mãrimea inoculului şi concentraţia mediului de bazã au fost optimizate în vederea producţiei de xilanaze de cãtre Aspergillus niger prin fermentaţie în stare solidã. Tulpina de Aspergillus niger 44 .8) prin fermentaţie în stare solidã. a fost studiatã de cãtre P. timpul de cultivare.secvenţializatã parţial şi purificatã arabinofuranozidaza din Aspergillus niger crescut pe mediul de cultura cu pulpa de sfecla de zahar/tãraţe de grâu. Mediul optim pentru Aspergillus niger a fost: tãrâţe de grâu în proporţie 1:5 cu solutţe mineralã Mandels şi Strenberg (continând 0. umiditatea de 65%. . Activitatea xilanazicã estimatã prin modelul polinomial a fost de 5.1.

Celuloza. si 0. păstaie de soia.5 MgSO4x 7H2O. Utilizarea deşeurilor şi/sau subproduselor agricole în medii de biosinteză a enzimelor hidrolitice de uz zootehnic Biomasa lignocelulozicã (în special deşeurile agricole) este cunoscutã ca fiind o excelentã sursã de carbon pentru productia enzimelor microbiene. 3 KH2PO4. reziduuri de banană.pulpă de sfecla de zahăr. S-a constatat că fungul Aspergillus niger 38 poate fi cultivat prin fermentaţie în strat solid pentru obţinerea celulazelor folosind ca sursa de carbon deşeuri agricole uşor de procurat cum ar fi tărâţele de grâu şi paiele de grâu în diferite proporţii. coajă de orez. bazic sau enzimatic a deşeurilor celulozice [10].Capitolul 2. tărâţe de orez. Substratul pe care se cultivă fungii se obţine în urma hidrolizei în mediu acid. Câteva substraturi cum ar fi tărâţe de grâu. Dintre acestea. 0. cocean de porumb. paie de grâu. unele subproduse ale industriei alimentare (pulpe epuizate de fructe. Marele avantaj al acestor surse naturale de carbon este că sunt disponibile în cantităţi industriale şi că au un preţ scăzut. În ultimul deceniu s-au făcut eforturi considerabile în privinţa valorificării superioare a biomasei lignocelulozice(BLC).5 CaCl2xH2O. Mediul de cultură (g/l) a avut urmatoarea compoziţie: 10 (NH4)2SO4. Biomasa lignocelulozicã constituitã din reziduuri agricole (paie. paie de orez. împreună cu hemiceluloza şi lignina intra în structura pereţilor celulelor vegetale. coceni de porumb). resturile de plante medicinale. tãiţei de sfecla de zahãr epuizaţi). sunt utilizate ca surse de carbon în producţia de enzime. furajele şi lemnele neutilizabile reprezintã o rezervã şi insuficient valorificatã de glucide fermentescibile. . ştiulete de porumb. Pentru separarea celulozei din complexul lignocelulozic se aplică tratamente mecanice şi cu vapori de apă. etc. tărâţele de grâu sunt cel mai frecvent utilizate în diferite procese. Reziduurile agro-industriale sunt în general considerate ca cele mai bune substraturi pentru obţinerea de enzime prin fermentaţie în stare solidă.

pentru a produce mediul bazic de tărâţe de grâu.) au fost comparate pentru a vedea capacitatea lor de a produce endopoligalactouranaze în fermentaţie în stare solidă. Tărâţele de grâu au fost utilizate ca suport şi ca unică sursă de carbon peste care s-au adăugat 45 ml soluţie de săruri minerale conţinând (%): KH2PO4 0. utilizând ca substrat reziduuri agricole: ştiulete de porumb.2x10-4 pentru fiecare 100g tărâţe.5. un domeniu al pH-ului de fermentaţie cuprins între 4.0x104 si ZnSO4 6.45.05. Substratul solid a fost reutilizat de cel puţin trei ori în sistem”batch” şi s-a constatat că activitatea celulozolitică cea mai mare a fost obţinută (158 IFPU/g koji) în a doua fermentaţie batch. MnSO4 1.Tărâţele de grâu şi paiele de grâu s-au folosit în proporţii diferite (9:1 la 1:9). nivelele maxime endopoligalacturonase au variat de la 223-876 unităţi/gram pe mediu uscat indicand că trebuie să se aibă grijă când se alege acest component al mediului[12]. Mediul de cultură pentru cresterea microorganismului Trichoderma reesei ZU-02 a avut urmatoarea compoziţie (%): ştiulete de porumb 66. Trei tipuri de pectine comerciale purificate şi patru de pectine neprelucrate au fost folosite pentru a evalua efectul pectinei asupra producţiei de endopoligalacturonase de Aspergillus niger T00050007-2.2.4.5. (NH4)2SO4 0.5-5.1. Cu o umiditate de 74%. MgSO4x7H2O 0. uree 0. producţia de zahăr este peste 84%. Raportul o parte paie de grâu şi nouă părţi tărâţe de grâu a prezentat cea mai bună activitate. deşeuri lignocelulozice din industria xilozei.5 si un raport paie de grâu tărâţe de grâu de de 9:1. s-a obţinut o activiate endonucleazică de 14. Aspergillus awamori NRRL3112 şi Trichoderma sp. CoCl2 0.3x10-4. CaCl2xH2O 0. Maximul activităţii pectolitice a fost atins folosind 6 şi 10 % pectină purificată ca inductor. Când doza de celulază este peste 20 IFPU/g substrat. În funcţie de originea pectinei comerciale folosită ca inductor. FeSO4 6.5. Aspergillus oryzae CCT3940. (NH4)2SO4 2. MgSO4 0. . Enzimele koji produse prin acest proces au putut fi utilizate direct în hidroliza ştiuleţilor de porumb. tărâţe de grâu 30. Alti autori [11] au folosit fungul Trichoderma reesei ZU-0 2 pentru obţinerea de celulază prin fermentatie în stare solidă. Cinci tulpini de fungi filamentoşi (tulpinile Aspergillus niger NRRL 3122 şi T00050007-2. KH2PO4 0. Activitatea pectolitică a fost atinsă după 72 de ore de creştere cele mai bune tulpini de fungi fiind Aspergillus niger T00050007-2 şi Aspergillus oryzae CCT3940.80 UI/ml (unităţi internaţionale/ml).

maximul endopoligalacturonazei a fost de 919 unităţi/gram.80% pentru siloz de porumb. După 14 zile creşterea procentuală cea mai mare în proteină (41%) a fost obţinută din deşeuri de grâu inoculat cu Aspergillus niger. catalaze. grăunţele uscate şi silozul de porumb sunt bioproduse ale prelucrării porumbului şi grâului având un conţinut scăzut de proteină şi un conţinut ridicat de fibre crude. Reducerea procentuală cea mai mare a fost realizată de Aspergillus niger în toate deşeurile agro: 36. Celuloza a fost redusă semnificativ în toate deşeurile agro de către toţi fungii după 14 zile. După 14 zile nivelul zahărului a început să scadă şi nu a mai existat o degradare semnificativă a celulozei. Aspergillus flavus şi Penicillium sp . Aceast proces este realizabil prin utilizarea enzimelor microbiene degradative din fungi.51% pentru deşeuri de grâu.Când pectinele crude au fost folosite ca inductori la aceeasi concentraţie ca pectina purificată. Totuşi. Aceste enzime ajută la degradarea polizaharidelor neamidonoase din substrat până la glucide solubile. necostisitoare şi uşor de adaptat şi utilizarea acestora în hrana păsărilor şi porcilor [14]. . amilaze. sunt menţionate ca fiind cele mai bune surse de celulaze. Este absolut necesar să se sporească valoarea nutritivă a acestor bioproduse prin desfacerea polizaharidelor neamidonoase. glucide şi celuloză a trei bioproduse agro-industriale prin fermentare în stare solidă cu Aspergillus niger. sector care constituie un mare consumator de furaje comerciale[13]. Aspergillus flavus si Penicillium sp. Resturile de grâu. Protenia totală din deşeurile agro-industriale a crescut semnificativ. 35. deschizând astfel posibilitatea scăderii costului mediului pentru producerea de endopoligalacturonaze. prin creşterea procentului de până la 50%. pectinaze şi xilanaze. Aspergillus niger a prezentat cel mai mare procent de reducere al celulozei datorită creşterii sale mai rapide şi prin urmare abilităţii de a produce mai multe enzime celulozolitice într-o perioadă mai scurtă.87% pentru grăunţe uscate şi 35. hemicelulaze. Rezultatele acestui studiu au indicat posibilitatea sporirii valorii nutriţionale a acestor bioproduse printr-o tehnică simplă. Aceşti doi factori limitează utilizarea lor în hrana păsărilor şi porcilor. Aspergillus niger. maximul activităţii pectolitice a fost 250-300 unităţi/gram. Au fost determinate modificări în proteină. Fungii au capacitatea de a produce numeroase enzime.

.

Tărâţele de grâu s-au remarcat ca cel mai bun substrat lignocelulozic utilizat pentru producţia de xilanază. Preparatele enzimatice obţinute sunt complexe. preparatele xilanazice au îndepărtat fracţia hemicelulozică din toate deşeurile lignocelulozice testate. pectinaze. P. niger 44).terreus si A. pentru obţinerea celulazelor folosind ca sursă de carbon deşeuri agricole uşor de procurat cum ar fi tărâţele de grâu şi paiele de grâu în diferite proporţii. Kamat au studiat influenţa temperaturii de cultivare asupra obţinerii de xilanază (E. temperatura şi pH-ul mediului de biosinteză.C. niger. dovedintu-şi astfel potenţialul commercial. . Caracteristici ale proceselor de fermentatie cu microorganisme producatoare de enzime hidrolitice utilizabile ca aditivi furajeri Începand din anul 1970.2. Anterior zaharificării. randamentele de obţinere a preparatului enzimatic sunt mai scăzute [10]. Mediul optim pentru Aspergillus niger a fost: tărâţe de grâu în proporţie 1:5 cu soluţie minerală Mandels şi Strenberg (conţinând 0. conţin pe lângă proteaze şi amilaze (α-amilaza şi glucoamilaza). s-a constatat că maximul producţiei de xilanază.8) prin fermentaţie în stare solidă pe diferite substraturi lignocelulozice.V. Luiza Jecu [16] a constatat că fungul Aspergillus niger 38 poate fi cultivat prin fermentaţie în strat solid. Aspergillus sp.1. celulaze.1% extract de drojdie). (A. facilitând un sistem de purificare al enzimelor relativ simplu.Capitolul 3. a fost atins la temperatura de 35°C. au fost iniţiate studii privind obţinerea de proteaze acide cu mucegaiuri din genul Aspergillus (A. Alături de tulpina microbiană şi compozţtia mediului de cultură. concentraţia inocului fiind de 2x107-2x108 spori /5 g substrat. cu 2 tulpini de Aspergillus sp. xilanaze. precum şi gradul de agitare [15]. oryzae) prin cultivare în sistem submers sau SSF. pentru ambele tulpini de Aspergillus. 3. comparativ cu procedeul de cultivare în sistem SSF. A. În cazul culturilor submerse. printre factorii importanţi care influenţează procesul de biosinteză a enzimelor hidrolitice se numără aeraţia. După terminarea procesului fermentative.Y. Gawande şi M. cunoscute ca producătoare de xilanază. a produs xilanază cu un nivel scăzut al activităţii celulozolitice.

Cu o umiditate de 74% a substratului conţinând paie de grâu/tărâţe de grâu în proporţie de 9/1. în care cele mai multe specii de bacterii nu se dezvoltă. Raportul o parte paie de grâu şi nouă pări tărâţe de grau a prezentat cea mai bună activitate. Pentru corectarea pH-ului la valoarea prescrisă se folosesc diverse substanţe chimice (acizi sau baze)[18]. În cazul fungilor. În general. Fungii prezintă avantajul de a creşte convenabil în medii de cultură acide. sau a altor tipuri de proteine[17]. Formarea produsului dorit în urma procesului poate să fie legată de desfaşurarea bioprocesului într-un domeniu foarte strict de pH. nu în ultimul rând. Temperatura este un factor care acţionează în mod direct asupra microorganismului viu. 3 KH2PO4.5-5. 0. asupra cerinţelor nutritive ale microorganismului şi compoziţiei biomasei obţinute şi. Aceste modificări se pot datora fie consumării unui nutrient.5 CaCl2xH2O. Temperatura mediului în care are loc procesul de biosinteză a enzimelor hidrolitice este un factor extrem de important pentru activitatea microorganismelor. .Mediul de cultură (g/l) a avut urmatoarea compoziţie: 10 (NH 4)2SO4. asupra vitezei de creştere microbiană. si 0.5-6.5. la un pH de 4. Valoarea pH-ului este. Tărâţele de grâu şi paiele de grâu s-au folosit în proporţii diferite (de la 9:1 la 1:9).5 MgSO4x7H2O. precum şi un pH optim de dezvoltare. care pot avea urmări nedorite asupra procesului de biosinteză.5. un parametru important în procesele de biosinteză. Influenţa valorii pH-ului asupra dezvoltarii culturilor microbiene poate fi urmarită în două direcţii principale si anume : asupra vitezei de creştere a microorganismelor şi asupra randamentului de conversie a substratului la produsul polienzimatic. s-a obţinut o activitate endonucleazică de 14. fie producerii unui acid organic de către microorganism.80 UI/ml (unităţi internaţionale/ml). Temperaturile ridicate pot dăuna microorganismelor prin denaturarea enzimelor. Fiecare specie are definit un anumit interval de pH în care poate creşte. pH-ul optim de dezvoltare este cuprins între 4.. Variaţiile de temperatură au efect asupra randamentului de transformare a substratului în produsul finit. microorganismele au un domeniu optim de pH pentru dezvoltare. optimă. alături de temperatură.. în care viteza specifică de creştere atinge valoarea maximă. a proteinelor transportatoare. În timpul dezvoltării unei culturi microbiene apar deviaţii ale pH-ului de la valoarea considerată optimă.

.

Universitatea Bucureşti Facultatea de Biologie .Universitatea Bucureşti 4. tulpinile de Aspergillus niger CBM-1. proteaze. Materiale şi metode 4. NaNO3. Obţinerea culturilor de intreţinere 4.extract de malţ.0.5g . Medii de întreţinere Înainte de utilizare.0g . prezentate in continuare: Denumire tulpină Aspergillus niger CBM-1 Aspergillus niger CMGB-401 Trichoderma viride CMGB-405 .30. xilanaze) s-au utilizat tulpini de fungi din Colectia de Microorganisme a Facultatii de Biotehnologii – USAMV Bucureşti si din Colecţia de Microorganisme a Facultăţii de Biologie a Universităţii Bucureşti. 1. Aspergillus niger CMGB-405 au fost activate prin treceri succesive pe mediu înclinat Czapek-Dox simplu şi pe mediul Czapek-Dox . MgSO4. Trichoderma viride CBGM-405.1 Tulpini de lucru În vederea obţinerii unui complex enzimatic hidrolitic (amilaze. Sursa Facultatea de Biotehnologii – USAMV Bucureşti Facultatea de Biologie .3. .0g .2. celulaze. Mediul Czapek-Dox (g/l) : zaharoză.1.2.PARTEA A II A CERCETĂRI EXPERIMENTALE Capitolul 4.

Au fost testate mai multe medii de cultura având următoarele compoziţii: .5g FeSO4. Apă distilată-1000ml. Conservul vegetativ După verificarea sterilităţii mediului prin menţinerea sa la termostat la 37ºC. eprubetele s-au examinat privind gradul de sporulare al culturii. obţinându-se o suspensie de spori[19]. timp de 48 ore.0. Cultivarea în laborator şi testarea activităţii hidrolitice La nivel de laborator. K2HPO4-1.0g .0 g . După preparare. Mediul Czapek-Dox.0. Extract de malţ 20. Agar. mediul s-a repartizat în eprubete şi s-a sterilizat la 110ºC timp 2.2. Pentru obţinerea inoculului pe mediu solid s-a folosit următoarea tehnică de lucru : peste cultura de întreţinere bine sporulată s-a pipetat 5ml apă distilată sterilă.3. precum şi puritatea acesteia. La sfarşitul perioadei de incubare. Eprubetele cu mediu însamanţat s-au incubat la 28-30ºC timp de 7 zile.4 corectat cu NaOH 40%. acesta s-a însămânţat cu o suspensie de spori în apă distilată. pH-ul mediului fiind de 6. se raclează foarte bine pentru desprinderea sporilor. 4.2. Componentele mediului Czapek-Dox. lucrările s-au axat pe studiul diferitelor medii de cultură în vederea stabilirii unui mediu optim pentru dezvoltarea microorganismului selecţionat şi pentru biosinteza enzimelor hidrolitice precum şi pe stabilirea parametrilor de bioproces optimi. Tuburile corespunzătoare au constituit cultura de întreţinere. După această perioadă sporii se pot utiliza imediat sau se pot conserva la frigider la +4ºC.2.- KCl.extract de malţ (g/l) : de 30 de minute. 4.01g .0g .

s-au însă mânţat cu o cultură de inocul sub formă de suspensie de spori obţinută din cultura de întreţinere. la intervale de 24 ore s-au determinat următorii parametri: .1% MgSO4x7H2O-0.5 ml suspensie pentru 50 ml mediu. mediile de cultură sterilizate şi răcite la 35ºC. Raportul de însamanţare este de 0.5% MgSO4x7H2O.5% CaCl2-0.Mediu 1 (g/100ml) Făină de soia -2% Amidon solubil-1% Tărâţe de greu-0.1% KH2PO4-0. Incubarea s-a făcut la termostat la 28-30ºC.01% Mediu 3 (g/100ml) Amidon solubil -1% Peptonă-0.05% CaCl2-0.5% CaCl2-0.0.1% După preparare.5% KH2PO4 -2.02% CaCl2-0. Cultivarea s-a efectuat 72 ore la baloane agitate(220 rpm) cu 50 ml mediu de cultura/balon.1% Mediu 4 (g/100ml) Făină de porumb-2% Făină de soia -3% (NH4)2HPO4-0.1% MgSO4x7H2O-0.1% MgSO4x7H2O -0. Pentru urmărirea bioprocesului.5% KH2PO4 -0.01% Mediu 2 (g/100ml) Amidon solubil-2% Făină de soia -0.5% Extract drojdie -0.

4. datorită grupărilor reducătoare semiacetalice. Valoarea de pH se verifică cu pH-metrul. cu maximum de adsorbţie la 546nm.72g KH2PO4 + 0.4. Soluţie etalon de maltoză . 4.1.1) Pentru dozarea activiăţii α -amilazei produsă de fungi s-a aplicat metoda descrisă de Hostettler şi colaboratorii [20] metodă care se bazează pe hidroliza enzimatică a amidonului la pH=6. Reactiv acid dinitrosalicilic (DNS).2.5dinitrosalicilic. activitatea enzimatică a mediului .4.2M.1. 2. Hidrolizatul format în special din maltoză reactionează. Concentraţia de acid diaminosalicilic format. Determinarea activităţilor enzimatice 4.9 . cu acidul 3. dezvoltarea macroscopică si microscopică a tulpinii de la care s-a pornit.58g NaCl se dizolvă şi se aduc la 1 litru soluţie cu apă distilată. 3. Soluţie amidon 1% in solutie tampon(1) .16g Na2HPO4 x 12 H2O + 2. . Se adaugă 400ml soluţie NaOH 1N şi 300g tartrat de sodiu şi potasiu. 10g acid dinitrosalicilic se dizolvă la cald în aproximativ 300ml apă distilată. Soluţie tampon fosfat 0. Reactivi necesari : 1. Determinarea activităţii α-amilazice (E. cu formare de acid nitroaminosalicilic de culoare roşie-portocalie.9 si la temperatura de 30ºC.3. măsurată colorimetric. Se aduce la semn într-un balon cotat de 1 litru. Conform acestei metode o unitate amilazică corespunde unui mmol de maltoză eliberat de 1g preparat enzimatic într-un minut la 30ºC.C. este proporţională cu activitatea enzimatică.- pH-ul mediului de cultura. 7.Ph=6.

0. Dozarea activităţii enzimatice Paralel cu proba de analizat se face o probă martor pentru a determina concentraţia de maltoză existentă în probă.5 unităţi DNS. Prepararea diluţiilor de maltoză Număr eprubetă 1 2 3 4 5 6 Vol. soluţie maltoză (ml) 0.1 Conc.48 6. Pe abcisă se trec valorile reprezentând densitatea optică citită la spectrofotometru corespunzătoare concentraţiei de maltoză înscrisă pe ordonată.0 Vol. înainte de începerea reacţiei enzimatice. Mod de lucru Construirea curbei de etalonare Din soluţia etalon de maltoză(4) se pipetează în 6 eprubete după cum urmează : Tabelul 2. astfel încât să conţină 0. 5. Se citeşte densitatea optică la 546nm dupa 20 de minute. Datele oţinute se trec într-un grafic pentru construirea curbei de etalonare. Modul de lucru este prezentat schematic în tabelul 2.8 1. apoi se tine în baie de apă la fierbere 5 minute.4 0. Reprezentarea schematică a modului de lucru pentru dozarea activităţii .5 0. maltoză (µmoli) 2.96 11.3 0.2 1.19g maltoză anhidră) se dizolvă în apă îtr-un balon cotat de 100ml. Soluţie probă de determinat. Proba se dizolvă cu CaCl2.9 0.2 În fiecare eprubetă se adaugă 2ml DNS.5-1.72 8. Se răcesc şi se diluează pana la 12 ml cu apă distilată.1 1. apă distilată (ml) 2.7 1.24 4.6 2.2g maltoză monohidrat (0. Tabelul 3.

D = factorul de diluţie al probei luate în lucru . Soluţie tampon Na2HPO4.5ml proba 2ml DNS(3) -agitare –agitare 0. V = volumul (ml) de soluţie probă luată în lucru . Metoda se bazează pe dozarea glucidelor reducătoare eliberate de enzimă în urma acţiunii asupra substratului respectiv carboximetil celuloza (CMC).5ml proba Incubare 10 minute la 30ºC 2ml DNS Incubare 5 minute pe baie de apă. Reactivi şi soluţii: 1. determinaţi din curba de etalonare ca fiind diferenţa dintre µmoli de maltoză din probă şi µmoli de maltoză din martor .4 .4.1N. Diluare până la 12ml cu apă distilată Citirea valorilor absorbanţei la spectrofotometru la 546 nm Calculul rezultatelor Activitatea enzimatică se calculează şi se exprimă după formula : Unităţi DNS/ml = mxD/vx10 unde : m = µmoli de maltoză. Determinarea activităţii celulazice Principiul metodei Determinarea activităţii celulozolitice se efectuează dupa metoda descrisă de Petterson şi Porath [21]. pH=6.2.α-amilazice Proba de analizat Proba martor 0.5ml soluţie tampon(1) 0. 10 = timpul de incubare (minute). . 4.5ml soluţie tampon(1) 1ml soluţie amidon 1%(2) 1ml soluţie amidon 1% (2) 0.acid citric 0. Răcire.

5. Fiecare probă este însoţită de un martor. 1g carboximetil celuloza se dizolvă în 100ml tampon(1) . notând pe abcisă extincţia citită la spectrofotometru. Glucoză (mg) . iar pe ordonată mg glucoză. Reactiv DNS (20g acid 3. Tabelul 4.5 dinitrosalicilic. 4. Amestecul de reacţie. Probele sunt incubate 15 minute pe o baie de apă la fierbere. soluţie 5 (ml) Vol. 400g tartrat de sodiu şi potasiu). Preparat enzimatic cu activitate celulazică .1% preaparată proaspăt în apă distilată. soluţia se aduce la 2 litri cu apă distilată. Construcţia curbei de etalonare Din soluţia de glucoză 1. apa distilată (ml) Cant. Prepararea diluţiilor de glucoză DNS înaintea preparatului enzimatic cu activitatea celulozolitică. răcite şi colorimetrate faţă de apa distilată. ce constă din 2ml soluţie de substrat (2). Solţtie glucoză 0.2 ml preparat enzimatic (3). după care reacţia enzimatică este stopată cu 3 ml rectiv DNS. răcite şi colorimetrate la 640 nm faţă de apa distilată. Soluţie CMC 1%.0% (5) se fac o serie de diluţii în apa distilată. Calculul rezultatelor Valorile densităţii optice măsurate la spectrofotometru pentru probe şi martori se transformă cu ajutorul curbei etalon în mg glucoză. Probele sunt incubate apoi 15 minute pe o baie de apă la fierbiere. 3. 0. Martorii sunt şi ei colorimetraţi la 640 Vol. care dă cu reactivul DNS acea densitate optică ca 1mg glucoză. Se citesc extincţiile probelor la 640 nm şi se trasează un grafic. 4g fenol proaspat distilat. Se dizolvă în 1 litru NaOH 2%. 1g sulfit de sodiu. este incubat 10 minute la temperatura de 50ºC. în care dozăm glucidele reducătoare preexistente în amestecul de reacţie prin introducerea reactivului nm faţă de apa distilată.mg glucoză martor) x5 x1/10 = U/ml/min/50ºC Unitatea de activitate Cx este acea cantitate de enzimă care în condiţiile metodei eliberează dintr-o solţtie de CM-celuloză o cantitate de glucide reducător. (mg glucoză probă.2. la care se adaugă reactiv DNS (câte 3 ml DNS/eprubeta cu diluţie).

Principiul metodei Enzimele proteolitice catalizează hidroliza caseinei permiţând formarea unor compuşi solubili în acid tricloracetic. pH=7. 2. Tampon fosfat 0.0 1.2 0.4 0. este determinată spectrofotometric cu reactivul Folin-Ciocâlteu. Se aduce la pH-ul dorit şi se completează cu tampon fosfat (pH= 7în cazul proteazelor neutre). Reactiv Folin-Ciocâlteu (se dizolvă 10 g Na2 WO4 x 2H2O + 2.2N . din aceşti compuşi. Soluţie de L. Se neutralizează cu H3PO4 10%.8 0.0.0 2.9 1. 7.6 0. Soluţie HCl 0.7 0.5 0.5N .3.3 0.8 1.0 (39.2 0.4 1.tirozină 1mM ( se dizolvă 181.3 0. Soluţie acid tricloracetic 5% .4 0.0 ml NaH2PO4 0.19 mg de tirozină în 1000ml HCl soluţie 0.06N-0.8 0. Soluţie caseină 1%. Conţinutul în triozina şi triptofan . 5.5 1.2N) .3 1.2 0.7 1.6 0.0 ml soluţie Na2HPO4 0.5 0. 1g de caseină se dizolvă pe un agitator magnetic în cca 30 ml NaOH 1N. 4.6 1.7 0.2M) . şi se aduce la 100ml cu apa . Reactivi şi soluţii: 1. 3.1 0.01N-0.9 1.5g Na2MoO4 x 2 H2O + 15 g Li2SO4 + 10 ml HCl + 5ml H3PO4 conc. adăugat în picături sub continuă agitare.2M + 61.0 4. Soluţie NaOH 0.9 1.4.1 0. 6.2 M .1 2. Determinarea activităţii proteazice Activitatea proteolitică se determină după metoda Anson modificată [22] pe substrat de cazeină.

68 1.80 1.5ml soluţie enzimatică (mediu de cultură separat de biomasă) şi 1 ml solţtie caseină 1% în tampon fosfat 0.84 1. menţionate în tabelul 4.16 0.20 0.2 1.5 N şi reactiv Folin – Ciocâlteu diluat 1 :2.29 0.72 1. Se lasă 30 minute la temperatura camerei şi se măsoară extincţia la 578nm faţă de martor.2 1.2 1. 1 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 11 L-Tyr (ml) 2 0 0.08 0.26 0.2 1. după care.2 1.20 0.88 1.082 0.5N.40 HCl 0.32 0.5ml filtrat se adaugă 0.22 0.64 1.2 M (pH=7) se incubează la 37º C timp de 10 minute. Mod de lucru Amestecul de reacţie format din 0. Obţinerea diluţiilor de L-tirozina Eprubeta nr.450 0. Amestecul de reacţie se menţine 30 minute la temperatura camerei şi apoi se filtrează. Soluţie enzimatică. cu excepţia că în amestecul de reacţie se introduce acid tricloracetic imediat peste soluţia de caseină.2 1.2 1.2 1.28 0.2N(ml) 4 2.2 1.60 NaOH 0.55 0. La proba martor se lucrează asemănător .24 0. În continuare se lucrează identic ca la proba de determinat. HCl 0. se lasă în repaus 30 minute la temperatura camerei şi apoi se introduce soluţia enzimatică.12 0.04 0.2N.375 0. Tabelul 5. NaOH 0. în condiţii de agitare puternică.96 1.34 0.2 1.5N(ml) 5 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 F-C (ml) 6 1. Construirea curbei etalon Se pipetează în 11 eprubete volumele de tirozină.92 1.28 0. La 0.76 1.distilată ).043 0. Înainte de utilizare se diluează o parte din această soluţie cu două părţi apă distilată .26 0.04 0.16 0.40 L-Tyr (µmoli) 3 0 0.2 N.125 0. se introduce reactivul Folin-Ciocâlteu.32 0.24 0.475 . 2ml NaOH 0.12 0.2 Extinctia 7 0.00 1.32 0.08 0.5 ml HCl 0. Reacţia enzimatică se stopează cu 2 ml acid tricloracetic 5%. 8.

5 dinitrosalicilic în 300 ml apă distilată.5 x 0.4. se adaugă 400ml NaOH 1N şi 300g tartrat de sodiu şi potasiu şi se aduce la 1 litru). Determinarea activităţii xilanazice Activitatea xilanazică s-a determinat printr-o metodă combinată.05M. 1/10. Mod de lucru . 0.6% în tampon acetat 3.volumul de lichid cu activitate proteolitică luată în lucru . Tampon acetat de sodiu 0. Soluţie enzimatică în tampon acetat.factorul de transformare pentru un minut de reacţie enzimatică .4. având la bază metoda ‘clasică’ a lui Miller ce foloseşte reactiv DNS [23]. Reactivi şi soluţii: 1.Se lasă la temperatura camerei 30 minute.volumul de lichid filtrat luat în lucru . 5.3 2. O unitate de activitate proteazică este definită ca fiind cantitatea de enzimă care în condiţiile de reacţie indicate eliberează 1µmol tirozină pe minut. Valorile citite pe grafic vor fi introduse în următoarea formulă: (micromoli Tyr proba. pH 5.5. 0. Soluţie de D-xiloza 0. Principiul metodei Xilanaza catalizează hidroliza iar zaharurile reducătoare formate (xiloza) sunt determinate spectrofotometric cu reactiv DNS la 540 nm.micromoli Tyr martor) x 3. Calculul rezultatelor Din curba de etalonare se determină µmoli tirozină corespunzători extincţiei măsurate. Soluţie xilan (Fluka) 0.volum total amestec .5 = micromoli Tyr/ml/min unde: 3.5/10 x 0.0025 M în apă distilată 4. 4. faţă de apa distilată. Reactiv DNS (se dizolvă 10 g acid 3. Se construieşte un grafic cu extincţia citită la 578 nm pe ordonată şi µmoli L-tyr pe abcisă.5.5.apoi se citeşte extincţia la spectrafotomertu Spekol la 578 nm .

se aduce la 5 ml cu apă distilată şi se măsoară extincţia la 540 nm faţă de apa distilată.5 ml substrat (soluţie xilan) şi 1 ml reactiv DNS. În continuare se lucrează identic ca la proba de determinat. cu excepţia că în amestecul de reacţie se introduce reactivul DNS imediat peste soluţia de substrat şi apoi se introduce soluţia enzimatică. .5 ml soluţie enzimatică şi 0. ce se incubează pe baie de apă la 40ºC.5ml soluţie substrat (xilan 0.În eprubetele prevăzute cu dop se introduce amestecul de reacţie format din 0. La proba martor se lucrează asemănător. Amestecul de reacţie se fierbe 5 minute pe baie de apă.3). după care se introduc 0. Reacţia enzimatică se stopează cu 1 ml reactiv DNS. La fiecare probă se face şi un martor.6% în tampon acetat (pH=5. timp de 30 de minute. Construirea curbei etalon Se pipetează în 11 eprubete volumele de soluţie de xiloză menţionate în tabelul 5.

40 0.25 0.5 0.5 0.5 0.35 0.5 0.15 0. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 D-Xiloza (ml) 0 0. apoi se citeşte extincţia la spectrofotometru JASCO la 540 nm .0 1.20 0.5 0.0 1.3285 Se adaugă 3 ml apă distilată şi se lasă la temperatura camerei pentru răcirea eprubetelor.0 Extincţia 0. conform diagramei următoare : Figura 5.0 1.5 DNS (ml) 1.2843 0.35 0.05 0.039 0.50 D-Xiloza (nmoli) 0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 Apa (ml) 0.5 0.30 0.1491 0.0 1.5 0.30 0.10 0.10 0.05 0.1208 0.45 0.00 Xilan (ml) 0.25 0.2351 0.0438 0.5 0.0631 0. faţă de apa distilată.0 1.Tabelul 6.0 1.0 1.5 0.5 0.0 1.1800 0.2200 0.0 1. Se construieşte un grafic cu extincţia citită la 540 nm pe ordonată şi nmoli Dxiloza pe abcisă. Obţinerea diluţiilor de D-xiloza Eprubeta nr.15 0.20 0. Curba etalon de xiloză .40 0.1004 0.0 1.5 0.45 0.

Testarea produsului enzimatic în hrana animalelor de fermă Testarea produsului enzimatic în hrana animalelor de fermă a implicat stabilirea dozei optime.factorul de transformare pentru un minut de reacţie enzimatică . Tineret porcin din loturile experimentale . întocmirea documentaţiei de realizare a furajului. Figura 6. Valorile citite pe grafic vor fi introduse in urmatoarea formula: (nmoli xiloza probă – nmoli xiloza martor) x 1/30= U/ml/min unde 1/30. a schemei şi a procedurii de evaluare a conformităţii [24]. evaluarea efectelor tehnico-economice.Calculul rezultatelor Din curba de etalonare se determină nmoli xiloza corespunzători extincţiei măsurate. 4.5. O unitate de activitate xilanazică este definită ca fiind cantitatea de enzimă care în condiţiile de reacţie indicate eliberează 1nmol xiloza/ml/minut la 40ºC.

36UDNS/g 1. Doza de includere în structura reţetei de nutreţ combinat a fost de 2 respectiv 5 kg / tona de nutreţ combinat.5 kg/ to de . cu înregistrarea zilnică a consumului de nutreţ combinat. proteolitică. E2.95 U/g În scopul cuantificării efectului administrării preparatului enzimatic în hrana animalelor s-au format trei loturi omogene şi s-au elaborat noi soluţii nutriţionale.01 UP/g 1. Schema experimentală Specificaţie Număr de animale (cap) Durata experimentului (zile) Variabila (cantitatea de preparat enzimatic) Kg / tona de NC* *NC.nutreţ combinat M 18 18 - LOT E1 18 18 2 E2 18 18 5 A fost utilizată o receptură de nutreţ combinat unică pentru cele trei loturi. Tabelul 8.Produsul enzimatic realizat în urma cercetărilor abordate în cadrul proiectului. celulozolitică şi xilanayică (tabelul 7). loturile experimentale şi observaţiile fiind realizate în condiţiile de fermă la IBNA Baloteşti. Durata experimentului a fost de 18 zile. Preparatul enzimatic s-a obţinut din culturi de Aspergillus niger şi reprezintă un amestec de enzime cu activitate amilolitică. Tabelul 7.35 U/g 3. Animalele au fost cântărite la începutul şi sfârşitul experimentului. Caracterizarea activităţii enzimatice a preparatului enzimatic Specificaţie Amilolitică Proteolitică Celulozolitică Xilanazica Activitate 105. variabila constituind-o cantitatea de enzima inclusă în premixul vitamino-mineral într-o pondere diferită la cele două loturi experimentale (E1-2 kg /to de NC. Testul biologic s-a derulat pe un număr de 54 purcei din rasa Marele Alb conform schemei experimentale din tabelul 8. a fost verificat în cadrul unui biotest pe tineret porcin.

10 0.00 4.NC) (tabelul 8).00 8.20 0.50 0.81 30.10 1.00 0. Tabelul 9.70 1.20 21.00 15.10 1.50 0.90 1.90 .00 10.10 1.49 0.10 0.90 E2 27.00 8.00 10.10 0.20 0.21 30.00 10.00 0.00 4.50 0.70 1.90 1.00 0.90 1.10 0.00 Indici calitativi 21.00 15.62 3320 13.00 8. Ca ingrediente cerealiere s-a utilizat grâul (acesta fiind caracterizat printr-un conţinut ridicat xilani şi arabinoxilani).10 1.62 3320 13.50 21.00 0.00 0.31 30.10 0.89 1.89 1. ponderea de includere fiind de 30% şi porumbul. în vederea unei mai bune echilibrări energetice a reţetei.00 15.10 0.49 0.00 4.49 0.70 1.10 1.10 1. Structura recepturilor de nutreţ combinat şi indicii calitativi ai acestora pentru purcei Ingrediente % Porumb Grâu Şrot soia Full fat soia Lapte praf Făină peşte Lizină Metionină Premix colină Fosfat monocalcic Carbonat de calciu Sare Premix vitamino-mineral P1 Enzimă Proteină brută (%) Energie metabolizabilă Kcal Mj/kg NC Lizină (%) Metionină + cistină (%) Calciu (%) Fosfor (%) M 28.89 1.20 0.90 LOT E1 28.62 3320 13.

C 3.C şi endo-1. Miceliul este uniform.C 3. Tulpina de Trichoderma viride nu s-a dezvoltat pe mediul Czapek-Dox simplu [25]. celulaze (E. ca termen de comparaţie.1. alb pufos şi un miceliu aerian purtător de conidiofori coloraţi în negru intens.50 Activitate amilolitică UDNS/g 620 Activitate proteolitică U/g 1. pe pe suprafata acestui mediu.3-beta-glucanaze (E. Conţine surse stabilizate de endo-1. alfa-amilaze (E.2. Acesta permite obţinerea unor performanţe deosebite chiar în condiţiile excluderii din alimentaţie a surselor proteice de origine animală.2.8).C 3.28).6).1). Caracterizarea activităţii enzimatice a produsului KEMZYME®VP DRY 3.4.1.4-beta-xilanaze (E.2. la temperatura optimă de dezvoltare (28ºC). bacilolizin (proteaze) (E. KEMZYME®VP DRY Activitatea celulozolitică (C1-Cx) U/g 2. Compoziţia mediilor pentru cultura de întreţinere În urma testării celor doua medii menţionate în capitolul 4 s-a constatat că mediul cu extract de malţ oferă cele mai bune condiţii pentru obţinerea culturilor de întreţinere pentru toate tulpinile testate.1.1. un complex multienzimatic destinat a fi utilizat în reţetele de hrană care conţin un nivel ridicat de cereale şi proteine vegetale (şrot de soia). Rezultate şi discuţii 5. sporulat pe toată suprafata. produsul KEMZYME®VP DRY. după 7 zile.12 . Astfel. 5.1.2 Analiza comparativă a biosintezei enzimelor hidrolitice cu tulpini Aspergillus niger şi Trichoderma viride pe diferite medii Pentru a evalua nivelul de biosinteză a enzimelor componente ale complexului studiat s-a utilizat.C 3. se formează un miceliu bogat. Activitate secundară: lipaza [25] Tabelul 10.Capitolul 5.24.2.4).

1. se observă că tulpina Aspergillus niger CMGB-401 aflată în colecţia Facultăţii de Biologie. care s-a caracterizat din punct de vedere al activităţii enzimatice. Mediul de cultură final de fermentaţie s-a prelucrat integral prin absorbţie pe carbonat de calciu tehnic. Tabelul nr. Din tabelul 13 se observă că tulpina Trichoderma viridae prezintă cea mai bună activitate amilolitică (cuprinsă între 30-46 UDNS/ml). dar activitatea celulozolitică este de aproximativ de 10 ori mai mică. rezultate bune oţinându-se la 48 de ore pe mediul de cultură M4 (activitatea celulozolitică A. Universitatea Bucureşti este producătoare de enzime amilolitice şi celulozolitice.11 Variaţia activităţii enzimatice hidrolitice pe parcursul biosintezei enzimelor cu tulpina de Aspergillus niger CBM-1 per As Me 24 ore 48 ore 72 ore .E. s-a uscat în curent de aer timp de 2 ore la 40ºC şi s-au obţinut 10g produs.= 1. De asemenea s-a constatat ca maximum de activitate amilolitică şi proteolitică s-a obţinut la 48 ore : 12. activitatea celulozolitică fiind considerată satisfăcătoare. Produsul enzimatic solid obţinut cu tulpina de Aspergillus niger CBM-1 prezintă următoarele activităţi enzimatice: Din tabelul 12. cele mai bune rezultate obtinându-se pe mediul de cultură M3.44 UP/ml.18 UC1-Cx/ml) şi la 72 de ore (activitatea amilolitică A.3 UDNS/ml.E.= 40 UDNS/ml). Întrucât se urmăreşte obţinerea unui produs cu activitate amilolitică şi celulozolitică s-a ajuns la concluzia ca cea mai potrivită tulpină pentru scopurile noastre este tulpina de Aspergillus niger CMGB-401 pe mediul de cultură M4. această tulpină a fost luată în considerare în experimentele ulterioare fără a fi considerată cea mai bună.Din tabelul 11 se observă că tulpina de Aspergillus niger CBM-1 are activitate proteolitică şi amilolitică. În tabelul 14 sunt redate valorile activităţii xilanazice pe probe obţinute prin cultivarea timp de 72 de ore a tulpinilor de Aspergillus niger şi Trichoderma viridae pe două variante de mediu: M1 (Aspergillus niger CBM-1 şi Trichoderma viridae CMGB401 uscate pe pat de carbonat de calciu) şi M4 (Aspergillus niger CMGB-401-cultura finală lichidă).

01 0.44 0.20 0.44 5.E amilolitică UDNS/ml A.E amilolitică UDNS/ml A.10 0.E celulozolitic ă (C1-Cx) U/ml A.5 5.0 0.02 0.5 5.0 5.5 0.0 6.12 0.5 5.80 0.1 9.11 6.5 5.5 5.50 0.187 0.15 0.0 5. 12 Variaţia activităţii enzimatice hidrolitice pe parcursul biosintezei enzimelor cu tulpina de Aspergillus niger CMGB-401 Mediul Aspergillus niger CMGB-401 24 ore pH A.28 0.E amilolitică UDNS/ml A.52 1.30 Trichoderma viride CMGB-405 Tabelul nr.01 6 7 11 5 0.E celulozolitică (C1-Cx) U/ml A.4 12.0 5.12 0.5 0.E celulozoliti că (C1-Cx) U/ml 48 ore A.90 2 3.2 0.7 5.E amilolitică UDNS/ml A.2 0.16 0.5 0.gillus niger CBM-1 diul pH A.2 0.11 0.08 0.1 6.6 25.E proteolitică UP/ml pH A.E celulozolitică (C1-Cx) U/ml A.02 0.5 0.07 0.E proteolitică UP/ml 1 2 3 4 6.025 8 9.10 0.32 1.15 31.04 0.0 0.95 0.14 6.E celulozolitică (C1-Cx) U/ml A.E proteolitică UP/ml 1 2 3 4 6.E celulozolitică (C1-Cx) U/ml A.2 8.18 0.5 6.5 5.5 5.E proteolitică UP/ml pH A.40 0.15 0.5 0.8 0.3 5.E amilolitică UDNS/ml A.4 0.0 5.E amilolitică UDNS/ml A.0375 0.5 5.E proteolitică UP/ml pH A.E proteolitică UP/ml pH A.19 0.44 0.6 3.3 6.12 0.02 0.4 6.14 0.0 5.4 0.93 0.5 5.0 5.5 0.4 6.01 0.03 0.0 6.0 6.74 1.0 0.09 0.8 0.5 3.07 8.E celulozolitică (C1-Cx) U/ml A.4 5.67 0.84 Tabelul nr.4 18.4 5.2 4.18 13.39 0.4 46.75 40.0 6.14 0.25 0.E amilolitică UDNS/ml A.0 6.E proteolitică UP/ml pH A.17 .E amilolitică UDNS/ml A.095 0.02 0.26 0.5 5.49 0.49 0.22 0.0 9.E proteolitică UP/ml 1 2 3 4 6.5 0.9 0.6 28 16 13 1.0 6.15 0.20 7.4 1.E celulozolitică (C1-Cx) U/ml A.057 0.1 16 26 36 40 0.E amilolitică UDNS/ml A.E proteolitică UP/ml pH A.8 34.8 0.7 5.28 0.30 0.13 Variaţia activităţii enzimatice hidrolitice pe parcursul biosintezei enzimelor cu tuplina de Trichoderma viride CMGB-405 Mediul 24 ore 48 ore 72 ore pH A.21 6.7 13.E celulozolitică (C1-Cx) U/ml 72 ore A.

Tabelul nr.8 UDNS/g.27 (U/ml) 2.0590 0. Tabel 15.84 UC1-Cx/g). .5061/0.31 (U/g) 2.88 (U/ml) 2.43 UP/g.64 (U/g) 84. 32°C.82 UC1-Cx/g). Temperatura optimă de cultivare Temperatura optimă de cultivare a tulpinii de Aspergillus niger CMGB-401 pe mediul de cultură (M4-făină de soia) s-a urmărit determinând activitatea enzimatică la diferite temperaturi (28°C. activitatea celulozolitică 1.1275/0.2168 0.82 (U/ml) 104.0485 0. totuşi cele mai bune rezultate s-au obţinut prin cultivarea tulpinii Aspergillus niger CMGB-401 la temperatura de 28°C (activitatea amilolitică 124.08 UDNS/g. Variaţia activităţilor enzimatice în funcţie de temperatura de cultivare pe mediul de cultură M4 dupa 48 ore şi dupa condiţionare Temp.29 (U/g) 1.0512 0.43 (U/ml) 1.0635 Activitate xilanazica(U/g) 106 390 280 580 85 330 U/ml PH Timp (ore) Varianta mediu KEMZYME®VP DRY Aspergillus niger CBM-1 Trichoderma viride CMGB-405 Aspergillus niger CMGB-401 6.3.72 (U/g) 1.7 5.5 72 72 72 M1 M1 M4 5.0714 0. 37°C).1259 1 ml ml tampon 5 5 3 1 X4 diluţia X 10 Extincţia 540 nm 0. activitatea proteolitică 2.0 5.98 (U/g) 1.4 (U/g) 2.84 (U/ml) PRODUS CONDIŢIONAT-prin adsorbţie pe CaCO3. crt.1445/0.37 (U/g) Din tabelul 15 şi figura 7 se observă că deşi cultura are activităţi enzimatice şi la 37°C (activitatea amilolitică 82.03 (U/ml) 1. 1 2 3 4 Proba Cantitate (g) 0.6 (U/g) 1.0957/0. Rezultatele obţinute sunt prezentate în tabelul 15.71 (U/g) 99. activitatea celulozolitică 2.27 UP/g.69 (U/ml) 82.8 (U/ml) 1. 28°C 32°C 37°C 28°C 32°C 37°C Activitatea amilolitică Activitatea Proteolitică Activitatea celulozolitică (C1-Cx) 124. 122.08 (U/ml) 2. 14 Determinarea activităţii xilanazice Nr. activitatea proteolitică 1.

de asemenea.82 2.27 2.1978/0.03 1.33 1269.33 345.8 Activitatea proteolitică(U/g) Activitatea celulozolitică(UDNS/g) 2.84 28°C 32°C 37°C Temperatura Figura 7.0941 0.69 1. iar la 370C activitatea scade de cca 4 ori. tampon (ml) 2 2 2 Diluţia X5 X5 X5 Extincţia (540 nm) 0. Variaţia activităţii xilanazice în funcţie de temperatura de cultivare a mediului de cultură (M4-făină de soia) dupa 48 de ore Temperatura 220C 280C 370C Cantitate probă (ml) 2 2 2 Sol. Activitate a enzimatică (U/ml) Activitatea amilolitică(UDNS/ml) 140 120 100 80 60 40 20 0 124. că şi activitatea xilanazică este optimă la 22 -280C. Tabelul 16.0941 0.4749/0. dupa 48 ore .66 Concluzia este că varianta optimă de cultivare a tulpinii Aspergillus niger CMGB401 este cea realizată la temperatura de 28°C.43 1.Din tabelul 16 se observă.08 104. Efectul temperaturii de cultivare a tulpinii Aspergillus niger CMGB-401 pe mediul de cultura (M4-faina de soia) asupra activitatii enzimatice.88 82.4749/0.0941 Activitate xilanazică (U/ml) 1269.

01 (U/g) 1. Varianta 2: pH mediului de cultură =6. pe când pentru celelalte variante (2 şi 3) pH-ul mediilor de cultură a scazut de la 6.5.5 la 5-5.7 (U/g) 1.5 6.15 (U/ml) 1.29 (U/ml) 2. 250 ml mediu cu tărâţe de grâu.36 (U/g) 1.08 (U/g) 1.5.3 Alegerea pH-ului optim de cultivare Experimentele s-au realizat în pahare Erlenmayer cu capacitatea de 250 ml şi 500 ml care conţin 100 ml mediu cu făină de soia respectiv. pH-ul mediului de cultură – sarja 2 (M4-mediu de cultura cu făină de soia) a variat astfel: Varianta 1: pH mediului de cultură=5.35 (U/g) 96 (U/g) 1.5 7.0 Tabelul 17.5.15 (U/ml) 76.6 (U/ml) 1. mediile de cultură au fost condiţionate integral.31 (U/g) După 48 ore.5 Activitatea amilolitică Activitatea proteolitică Activitatea celulozolitică (C1-Cx) 141.5 6. Variaţia activităţilor enzimatice în funcţie de pH-ul mediului de cultură (M4) după 48 ore de fermentaţie şi după condţionare pH 5. Varianta 3: pH mediului de cultură =7.5 7. 105.91 (U/ml) 108 (U/ml) 1.4 (U/g) 0.66 (U/ml) PRODUS CONDIŢIONAT-prin adsorbţie pe CaCO3.95 (U/ml) 2. .5-7.5 5.8 (U/ml) 1.5. Ulterior. Culturile au fost agitate cu ajutorul unui agitator rotativ la 220 rpm timp de 48 de ore.28 (U/g) 77.5. s-a constatat că pH-ul mediului de cultură în cazul primei variante a rămas constant 5-5.

5.6 Activitatea amilolitică(UDNS/ml Activitatea proteolitică(U/g) 108 Activitatea celulozolitică(UDNS/g) 76.95 2. Activitatea enzimatică (U/ml) 160 140 120 100 80 60 40 20 0 141.66 5.5 7.15 1.înainte de sporulare.5 pH Figura 8. dupa 48 ore Din datele prezentate în tabelul 17 şi figura 8 s-a poate observa că tulpina de Aspergillus niger CMGB-401 prezintă cele mai bune activităţi enzimatice la pH-ul mediului de cultură de 5. .29 2. În urma procesului de condiţionare prin adsorbţie pe CaCO3 sa observat o scădere a activităţilor enzimatice aşa cum rezultă din figura 9. prin adsorbţie pe CaCO3.5 6.91 1.15 1. . Variatia activitatii enzimatice a complexului enzimatic obtinut cu tulpina Aspergillus niger CMGB-401 in functie de pH-ul mediului de cultura (M4 faina de soia).8 1.

5 5. funcţie de pH. se observă că aceasta este optimă la un pH 6. iar pentru produsul condiţionat activitatea xilanazică este mai ridicată la pH = 5.5 6.0941 2 2 X5 0. Variaţia activitătii amilolitice după 48 de ore şi după condiţionare pe carbonat de calciu Tabelul 18.0742 2 0.0696 0.0759 2 0.36 5.67 U/mg 5.5 2 2 X5 0.5757/0.33 1674 1595.4 după 48 de ore după condiţionare 105. 0.5 6.5 6.3635/0.0941 PRODUS CONDIŢIONAT-prin adsorbţie pe CaCO3.6 108 96 76.160 Activitate 140 enzimatică 120 100 80 60 40 20 0 141. dar scăderea nu este dramatică la valoarea de pH = 6.5181/0.5. .5040/0.5 ca optim.5963/0.5-7.5 7.5 7.5 pH Figura 9. ceea ce permite a se considera pH-ul 5.0941 2 2 X5 0.0624 În ceea ce priveşte activitatea xilanazică a culturii de Aspergillus niger după 48 de ore.5.8 77. Variaţia activităţii xilanazice în funcţie de pH-ul mediului de cultură după 48 ore şi după condiţionare PH Probă (ml sau g) Soluţie tampon (ml) diluţia Extincţia 540 nm Activitate xilanazică (U/ml) 1366.36 3.95 U/mg 2.

Variaţia activităţii xilanazice în funcţie de pH S-a urmărit variaţia pH-ului mediului de cultură şi în cazul cultivării tulpinii Aspergillus niger CMGB-401 pe mediu semisolid (tărâţe de grâu). . Activitatea xinalazică (U/ml) 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 1366.5 Valoare pH Figura 10.5 7.36 167. Rezultatele obţinute după 48 ore şi după condiţionarea cu carbonat de calciu sunt prezentate în tabelul de mai jos.33 1595.5 6.ţinând cont de faptul că la această valoare şi activitatea celorlalte enzime din complex este mai ridicată.4 5.

05 (U/ml) Activitate xilanazică (U/mg) 5. figura 8). s-a constatat că biosinteza enzimelor hidrolitice (amilaza.05).45 UC1-Cx/g). schimbările în polizaharurile fără amidon.96 (U/ml) Activitatea proteolitică 1.45 (U/ml) 1.48 (U/g) 0. Performanţele au fost îmbunătăţite în cazul loturilor la care a fost inclusă enzima în structura reţetei de nutreţ combinat dar nu s-au semnalat diferenţe semnificative în ceea ce priveşte greutatea corporală şi sporul mediu zilnic (P>0. activitatea proteolitică 1.98 (U/g) 58.5 6. Variaţia activităţilor enzimatice în funcţie de pH-ul mediului semisolid (cu tărâţe de grâu) după 48 ore şi după condiţionare PH Activitatea amilolitică 75.12 (U/ml) 66.4 (U/g) 1.27 (U/ml) PRODUS CONDIŢIONAT-prin adsorbţie pe CaCO3. producţiile endogene.Tabelul 19.5 52.5 7. celulaza) ca şi a xilanazei este favorizată în mediul lichid (M4-făină de soia) la pH=5. 5.88 (U/g) 1. 76.88 (U/g) 50.74 Examinand comparativ rezultatele prezentate în tabelele 17 -19 care redau variaţia activităţilor enzimatice în funcţie de pH pe mediul M4 (stabilit în prima fază ca fiind mediul optim de dezvoltare) şi un mediu semisolid cu tărâţe de grâu ca sursă de carbon (activitatea amilolitică 75.5 5.29 (U/ml) 1.5 6.12 UDNS/g.22 (U/g) 8.55(U/ml) Activitatea celulozolitică (C1-Cx) 1.98 (U/ml) 1. . Mediul lichid este mai avantajos din punct de vedere economic ceea ce îl recomandă pentru folosirea în condiţii de micropilot şi pilot. După 18 zile de la începutul experimentului s-a efectuat cântărirea individuală finală iar rezultatele obţinute au fost prelucrate statistic (tabelul 18. Testarea complexului enzimatic ca aditiv furajer Greutatea medie iniţială a animalelor supuse testării a fost de 8 kg.22 (U/g) 0. degradarea sau schimbarea fibrei[26]. O posibilă explicaţie a îmbunătăţirii performanţelor la purcei prin adăugarea de enzimă ar fi efectul asupra unor factori ca: timpul de tranzit intestinal al hranei.98 UP/g.32 (U/ml) 1.81 (U/g) 1.5.5 7. activitatea celulozolitică 1.4. proteaza.32 (U/g) 1.

23 Figura 10. Performanţe bioproductive M Greutate corporala iniţiala (kg) 8. o uşoară îmbunătăţire în cazul loturilor experimentale (0.09 Consum mediu zilnic de NC (kg) 0.446 1.86 0.96 12. fără ca diferenţele să fie semnificative. finala M E1 E2 8.23 a ± 2.96 13. faţă de 0.83 G.450 1.96 14 12 10 12. 0. .75 8. Se apreciază că enzima ameliorează efectul antinutritiv şi eficientizează producţia [26]. initiala 13.75 a ± 1.05) Specificaţie LOT E1 8.83 a ± 1.229a ± 0. se constată de asemenea.Tabelul 20. respectiv.75 Greutate corporala finală (kg)* 12.237 kg la lotul E1. figura 11).00 *aceeaşi literă diferenţe nesemnificative între loturi (P>0.71 8.439 Consum specific -kg NC /Kg spor 1.222 kg la lotul martor).75 8 6 4 2 0 G. Dinamica greutăţii corporale În ceea ce priveşte sporul mediu zilnic (tabelul 20.94 Spor mediu zilnic (kg) 0.12 0.237a ± 0.222a ± 0.% faţă de martor 100.08 0.90 95.48 E2 8.95 98.90 0.229 kg la lotul E2.71 12.98 .

222 0.446 0. 2.21 smz Figura 11.5 1.450 Consum specific 1.m.23 0.439 0.z NC 0.95 kg NC/kg spor la lotul E1 respectiv.6 0. 1.22 .2 0. Sporul mediu zilnic Consumul mediu zilnic de nutreţ combinat a fost asemănător la cele trei loturi (tabelul 20.8 1. figura 12).98 1.9 0.95 1.229 M E1 E2 0.0. S-a constatat o reducere a consumului specific în cazul loturilor cu adaos de preparat enzimatic (1. Consumul mediu zilnic (kg) şi consumul specific (kg NC/Kg spor) 0.98 kg NC/kg spor la lotul M).3 0 M E1 E2 c.1 1.237 0.90 kg NC/kg spor în cazul lotului E2 comparativ cu 1.24 0.90 M E1 E2 Figura 12 .

temperatura. cele mai bune rezultate s-au obţinut cu mediul lichid M 4. în ceea ce priveşte capacitatea acestora de a produce un complex de enzime hidrolitice (proteaze. dintre cele cinci medii testate (patru medii lichide şi un mediu semisolid pe bază de tărâţe de grâu). În scopul determinării condiţiilor optime de cultivare a tulpinii de Aspergillus niger CMGB-401 pentru biosinteza enzimelor hidrolitice (amilaze. s-a observat că tulpina de Aspergillus niger CMGB-401 conduce cele mai bune activităţi enzimatice. CaCl2-0. celulaze. proteaze. activitatea polienzimatica a mediilor de fermentaţie şi a produselor finite (obţinute prin filtrarea mediului de fermentaţie. Rezultatele obţinute au evidenţiat capacitatea bioproductivă superioară a tulpinii Aspergillus niger CMGB-401 în ceea ce priveşte complexul enzimatic studiat. xilanaze) utilizabil ca aditiv furajer. În ceea ce priveşte compoziţia mediului de cultură. MgSO4x7H2O-0.CONCLUZII În cadrul cercetărilor experimentale prezentate în proiectul de faţă s-au testat două tulpini de Aspergillus niger şi o tulpină Trichoderma viridae din colecţia Centrului de Biotehnologii Microbiene şi respectiv a Facultăţii de Biologie. xilanaze). au fost cercetaţi o serie de parametrii care au o importanţă semnificativă pentru acest tip de bioprocese şi anume: compoziţia mediul de cultură. amilaze.5%. celulaze. pH-ul mediului de cultură şi gradul de agitare şi aerare al culturii.1% În cazul diferitelor variante de pH şi temperatură folosite. Făină de soia-3%. în urma . (NH4)2HPO4-0.05%. Universitatea Bucureşti. având următoarea compoziţie (g%): Făină de porumb-2%. concentrare şi adsorbţie pe CaCO3 tehnic) s-a evaluat comparativ cu preparatul KEMZYME®VP DRY (Belgia). pe 4 medii de cultură preluate din literatura de specialitate. Cele trei tulpini de fungi au fost cultivate în sistem submers.

04% mai mic faţă de martor. Consumul specific la loturile de purcei la care s-a utilizat preparat enzimatic este cu 1. posibil din cauza faptului că nutreţul combinat a fost optimizat în principii nutritivi specifici acestei categorii de porcine. activitatea proteolitică 1. in funcţie de cantitatea de produs introdusă în raţia zilnică. tratarea cu CaCO3 a concentratului şi uscarea sub vid a amestecului rezultat.4. activitatea celulozolitică 2.27 UC1-Cx/g.33 U/ml).95 UP/g.cultivării la pH = 5. activitatea xilanazică 1366. Testarea ca aditiv furajer a produsului polienzimatic condiţionat a evidenţiat faptul că utilizarea acestuia nu a influenţat semnificativ greutatea corporală şi sporul mediu zilnic a purceilor în perioada crizei de înţărcare.6 UDNS/g. Condiţionarea produsului polienzimatic s-a realizat prin concentrarea mediului integral din finalul fermentaţiei. Rezultatele obţinute sugerează eficienţa utilizării preparatelor enzimatice în recepturi de nutreţ combinat deficitare în principii nutritivi.52% . .5 şi la temperatura de 280C (activitatea amilolitică 141.

97-105. Lee. Kamm M. 153-157. 4.nr. Biology of Industrial Microorganisms.1985. Liming Xia. MP Coughlan and GP Hazlewood (Eds).. Schuseil J. Kim.L.. Bielecki Stainslaw. Journal of Applied Microbiology. 12.. Z.. Applied Microbiology and Biotechnology. S.. Stefana Jurcoane.. issue 4. S. 2002.. Chemosphere. 761-766..2000 11. pag.. 10. 6. pag. Schmidt M. Sun Y. J. 2006. 8. 22(2):493-498. International Journal for Food Chemistry.L. 2. Pederson S. 1992. 1999. Rosgaard I.S. Hong. vol. 308-318. Cherry J. 62. Institute of Technical Biochemistry. Cheng J. Process Biochemistry 34. Park. 511.BIBLIOGRAFIE 1.R. Biodegradation: Natural and Synthetic 6. Hemicellulose and Hemicellulases. 2002. 32-38. 7. V. 909-912... 3. pag.B..87. 5. Pedlar S. Technical University of Eoodz. Kamat. pag. Biores. Solomon. A. 9. pag. Portland Press.. 1993. Harris P...A. Ball A. Kamm B.K. 2006 . David Cowan. S. Technol. Rita Pyc. Kelinpeter E. Betts W. vol. 1999. Poland. Puls J. P. Biotechnol Prog. Gawande and M. N. Editura Tehnica Bucuresti. Biotehnologii*Fundamente*Bioreactoare*Enzime. Peilin Cen. Demain.. Kang. Meyer AS.. Dart R. Sarke I..Y.. 83: 1-11. 58.

Ciurescu Georgeta. 18. Cambridge. J.E. Monirussaman M. Luiza Jecu. International Sugar Journal.I. Biotechnol. Costa-Fereira M. Biochimie practica. Malherbe S. vol.A.. Varga E... Dierick. Kanuf M. 5-10.. Rczey K.13. Massachusetts. 1980. Biely P.. J. Press. Moldovan I..P. 257-270. 1974. Environ. 23. Zacchi G. 186-188. 106: 147-150. African Journal of Biotechnology vol. 1:105-114. 31. Lyons& K. 17. 1994.S. Editura Cartea Universitara. 1996..3. 24. 2005.03. 111-116. Chem. Petterson and Porath.Kitchen. 2004 26. Jacques (Ed). 2004 20. N. 22.. Dumitru I.. 16. 1977. Proceedingsa 45th Annual Meeting of EAAP.1959. Appl.F. USA.. Tomar. The MIT Press. Biochem.1959. 1. Sci. Biotechnol. . 2000.2006. 25. 426-428. 2003 19. Levine J. Biochem.. 21. Proceedings of Alltech’s 13th Annual Symposium Nottingham Univ.A. Eustace A. Procedeengs of Bioenergy-I: From concept to Commercial Processes. Supplementary enzymes to improve utilization of pig diets. Industrial Crops and Products. in Biotechology in the Feed Industry. Decuypere. vol. 14. Eur. Miller G. Enzyme applications in corn/soia diets fed pigs. 113:509-523.. Iyayi.pag. D... sp.1-5. pp 35.S (ed). Iordachescu D.. Levine J. Baylei M. Anal.151. 8. L. 15. Biomass burning and global change.... Biotechnol. 23. T. Cloete T. Matos de Sousa J.A. and J. J. Vasile Anca. Portugalia...2004. 11. Edinburgh..

Powered by http://www.referat.ro/ cel mai tare site cu referate .

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->