Sunteți pe pagina 1din 40

Ministerul Sanatatii al Republicii Moldova

U.S.M.F. ,,N.Testemitanu”
Facultatea Farmacie

Catedra chimie farmaceutica si toxicologica

Metode biologice de analiza a substantei medicamentoase

Au pregatit : studentele an 5

Fac.Farmacie
Daranuta Nina
Spac Olga
Sterilizare-distrugerea sau indepertarea microorganismelor vii in forma
vegetativa sau sporulata.
Metoda de sterilizare se alege in functie de proprietatile fizico-chimice ale
produselor,pentru evitarea eventualelor modificari in calitatea
acestora.Eficacitatea metodei de sterilizare depinde de natura produselor
,gradul si natura unei eventuale contaminari microbiene si de conditiile in
care a fost preparat produsul de sterilizat respectiv.
Sterilizarea cu vapori de apa sub presiune si sterilizarea prin caldura uscata
sunt metodele cele mai sigure si trebuie folosite ori de cite ori natura
produsului o permite.
Sterilizare cu vapori de apa sub presiune- se foloseste ori de
cite ori este posibil pentru preparatele apoase,pansamentele
chirurgicale si produsele analoage ale acestora.Se efectueaza in
autoclave incalzite electric sau cu gaz ,in care aerul a fost inlocuit cu
vapori de apa sub presiune.
Sterilizarea se efectueaza la 121º
121 C cel putin 15 min sau la 115º
115 C cel
putin 30 min .Se pot folosi si alte conditii de temperatura si de
timp ,a caror eficacitate este dovedita ,acestea trebuie prevazute in
monografiile respective.Temperatura si presiunea din interiorul
autoclavului in timpul sterilizarii trebuie masurate cu o precizie de
+,- 2 C si respectiv +,- 10 kPa
Autoclave
Sterilizare prin caldura uscata –pentru produsele rezistente la
caldura si pentru produsele neapoase ,care nu pot fi sterilizate cu
vapori de apa sub presiune : produsele uleioase,pulberi,materiale
de laborator din sticla sau portelan ,instrumentar metalic fara
suduri cu cositor .Se efectueaza in etuve incalzite electric ,prin
care aerul incalzit circula astfel incit sa asigure o repartitie
uniforma a caldurii in tot spatiul de sterilizare.
Produsele de sterilizat sint introduse in recipiente care apoi sint
inchise pentru a impiedica o contaminare ulterioara.Temperatura
si timpul de sterilizare se aleg in functie de natura produsului de
sterilizat.
Sterilizarea se efectueaza de obicei la 160º
160 C -3h,170º
-3h,170 C
-1h,180º
-1h,180 C-30min

Etuva EC 50
 Sterilizare prin filtrare –in cazul solutiilor
termolabile.In vederea indepartarii microorganismelor
,filtrarea se efectueaza prin filtre bacteriologice sterile
sau prin membrane filtrante sterile ,respectind precautiile
impuse de acest mod de lucru.Toate operatiunile se
efectueaza in conditii aseptice cu ustensile ,recipiente si
solventi in prealabil sterilizati .Solutiile sint trecute prin
filtre sterile confectionate din derivati de celuloza
,materiale plastice sau din produse sintetizate sau din
combinatii corespunzatoare ale acestora ,sau prin
membrane filtrante sterile confectionate din polimeri
sintetici sau esteri celulozici.Filtrele sau membranele
filtrante folosite nu trebuie sa cedeze din componentele
lor si nu trebuie sa interactioneze fizic sau chimic cu
produsul de sterilizat.Trebuie verificata integritatea
filtrelor inainte si dupa filtrare .Produsul filrat se introduce
in conditii aseptice in recipiente sterilizate care apoi se
inchid etans.
Sterilizare cu gaz - pentru produsele
care nu rezista la temperaturile ridicate
necesare sterilizarii cu vapori de apa sub
presiune sau sterilizarii prin caldura
uscata si care sint compatibile cu gazul
sterilizat .Gazul sterilizat folosit de
obicei este oxidul de etilen,deoarece
este inflamabil in amestec cu aerul
,acesta se foloseste diluat cu un gaz
inert (ex:dioxid de carbon)
Controlul sterilitatii
Sterilitate - absenta microorganismelor ,in forma
vegetativa sau sporulata capabile sa se dezvolte in
conditii adecvate.
Pentru a evita contaminarea accidentala a produselor in
timpul efectuarii controlului sterilitatii ,acesta se
efectueaza in conditii aseptice.
Controlul sterilitatii se poate efectua folosind fie metoda
filtrarii prin membrana sau metoda insamintarii directe in
mediul de cultura .
Metoda filtrarii prin membrana permite separarea
posibilelor microorganisme contaminate de inhibitorii
cresterii lor si se foloseste in special pentru lichidele si
pulberile care prezinta activitate antimicrobiana.Metoda
este adecvata si preferabila in cazul produselor
uleioase ,unguentelor si cremelor care pot fi aduse in
solutie cu diluanti sterili lipsiti de activitatea
antimicrobiana cit si in cazul lichidelor si pulberilor lipsite
de activitatea antimicrobiana
Prelevarea probelor se efectueaza in conditii aseptice .In
cazul fiolelor si flacoanelor ,suprafetele exterioare se
curata cu un agent dezinfectant adecvat si se patrunde
la continut in conditii aseptice.In cazul produselor
conditionate sub vid ,dupa dezinfectarea dopului de
cauciuc se introduce in flacon aer steril cu ajutorul unui
dispozitiv adaptat la o seringa sterila care contine
material de filtrare sterilizat.
Contaminarea microbiana
Controlul contaminarii microbiene urmareste
determinarea numarului total de microorganisme
aerobe sau lipsa unor microorganisme patogene
sau conditionat patogene,prezente in produsele
farmaceutice de la materiile prime pina la formele
finite.
Prelevarea si prelucrarea probelor-controlul
contaminarii microbiene se efectueaza pe 10g sau
10ml proba luata in lucru,rezultata prin
omogenizarea continutului mai multor
recipiente .In functie de natura probei de analizat
,proba luata in lucru se dilueaza,se dizolva ,se
suspenda sau se emulsioneaza intr-un lichid
corespunzator .Daca proba de analizat are
activiatae antimicrobiana aceasta trebuie
indepartata prin diluare,neutralizare sau
filtrare.Prelevarea si prelucrarea probelor se
efectueaza in conditii aseptice.
Controlul eficacitatii conservantilor antimicrobieni
Conservantii antimicrobieni se adauga unor preparate
farmaceutice sterile in scopul evitarii unei eventuale
contaminari microbiene a acestora pe perioada
folosirii,sau unor preparate farmaceutice nesterile in
scopul reducerii incarcaturii microbiene a acestora.
Adaugarea conservantilor antimicrobieni nu exclude
obligativitatea respectarii regulilor de buna fabricatie.
Microorganismele–test folosite pentru controlul
eficacitatii conservantilor antimicrobieni,prevazute in
monografie , sint cele mai fregvent intilnite in timpul
procesului de fabricatie,pe perioada conservarii si a
folosirii produselor ,prezentind un risc crescut pentru
contaminarea preparatelor farmaceutice ,in unele cazuri
pot fi folosite si alte microorganisme-test.
Pentru a evalua aficacitatea conservantilor
antimicrobieni folositi perioada de testare este de cel
putin 28 zile,dupa caz se poate efectua testari repetate.
Controlul eficacitatii conservantilor antimicrobieni se
efectueaza in conditii care permit evitarea unei
contaminari accidentale a preparatului farmaceutic
analizat si fara a afecta microorganismele-test inoculate.
Pentru contaminarile experimentale se folosesc
urmatoarele microorganisme-test:
*Staphylococcus aureus
*Escherichia coli
*Pseudomonas aeruginosa
*Candida albicans
*Aspargillus niger
Activitatea microbiologica a antibioticelor
Determinarea activitatii microbiologice a
antibioticelor prin metoda difuzimetrica- se
bazeaza pe compararea zonelor de inhibitie ale
cresterii unui microorganism-test ,produse de
concentratii cunoscute dintr-un antibiotic –
standart,cu zonele de inhibitie produse de
concentratii presupuse egale ale antibioticului de
analizat.
Activitatea microbiologica a antibioticelor se
exprima in unitati internationale sau in
micrograme pe mg antibiotic de analizat.
Preparea solutiilor-standart(stoc si dilutii de lucru) si a
solutiilor proba(stoc si dilutii de lucru)
 Solutia-standart stoc se prepara prin dizolvarea unei mase
cunoscute de antibiotic-standart (daca e necesar se
usuca)in 100 ml solvent ,conform datelor din tabelul 1
 Dilutia-standart de lucru.Din solutia-standart stoc se
prepara inainte de folosire,doua dilutii standart de lucru
de concentratie precazute in tabelul 1
 Solutia-proba stoc se prepara prin dizolvarea unei mase
din antibioticul de analizat agala cu masa antibioticului
standart in 100 ml de solvent,conform datelor din tabel.
 Dilutii-proba de lucru.Din solutia proba stoc se prepara
,inainte de folosire ,doua dilutii-proba de lucru de
concentratii presupuse egale cu concentratiile dilutiilor-
standart de lucru.La preparare se folosesc solventi
prevazuti in tabel.
Medii de cultura Medii de Conc Solventi Solventi Timp de Concentr
pentru:- cultura entra pentru pentru conservar atia
intertinerea tulpinii pentru tia prepararea preparare e a sol- dilutiilor
de determinar susp sol- a dilutiilor stoc(stan de
microorganism- ea ensi Antibioti stoc(standa de dart si lucru(stan
Antibiot Microor test(A), activitatii eide c rt si proba) lucru(stan proba)la 4 dart si
ic de ganism microbiolo micr- standart dart si C proba in
-obtinerea
analizat -test gice a me- proba) mocrogra
suspensiei-stoc
de spori(B), antibioticel test me sau
-treceri zilnice(C), or:-strat unitati
inferior(i) internatio
-strat nale pe
superior(s) ml

Ampicill Microcc I-A IV -i 10 Ampicilli Tampon Tampon 3 zle 10-20mg


inum ocus I-C XI-s num fosat Ph fosat pH
natricu luteus natricu 7,0 7,0
m m

Ampicill Microco
inum I-A - -
ccus - - -
trihdryc luteus I-C - -
um

Benzyl I-A IV -i Benzylp 1 U.I


Stapylo enicilinu - -
penicili coccus I-C V-s - 2 U.I
num- m-
aureus natricu
natricu
m m

Tabel 1
In mediul de cultura prevazut in tabel pentru a forma
stratul superior al mediului de cultura folosit pentru
determinarea activitatii microbiologice a antibioticelor ,topit
si racit la 50 ºC .in cazul suspensiilor de microrganisme-
test in forma vegetativa sau racita la 60 ºC in cazul
suspensiei de microorganisme-test in forma sporulata se
introduce 1 ml suspensie de microorganisme-test pentru
100 ml mediu de cultura si se amesteca pentru
omogenizare.Concentratiile suspensiilor de
microorganisme-test obtinute prin dilutie conform datelor
anterioare necesare insamintarilor sint prevazute in tabel,5
ml mediu de cultura insamintat e aduc peste stratul inferior
de mediul de cultura solidificat in placile Petri,astfel incit sa
se formeze un strat superior uniform ca grosimea..Dupa
solidificarea stratului superior se aseaza pe suprafata
acestuia la o distanta de aproximativ 28 mm de centrul
placii Petri si la o distanta egala unul fata de celalalt ,4
cilindri din otel inoxidabil sau din alt material adecvat cu
diametrul interior de 7 mm si cu inaltimea de 10 mm.
Se efectueaza cite 3 cintariri atit din
antibioticul-standart cit si din antibioticul de
analizat.Din fiecare cintarire se prepara solutie
stoc (standart si proba) si dilutiile de
lucru.Pentru fiecare din cele 2 dilutii standart de
lucru si cele doua dilutii proba de lucru
efectuate din aceeasi cintarire se folosesc cite 6
placi Petri .Dilutiile de lucru (standart si proba)
se introduc in cei 4 cilindri din fiecare din placile
Petri dupa cum urmeaza :in primele 6 placi
Petri ,in 2 din cilindri se introduc cite 0,4 ml din
prima dilutie standart de lucru si in ceilalti doi
cilindri cite 0,4 ml din prima dilutie proba de
lucru ; in celelalte sase placi Petri se procedeaza
in mod identic cu cea de-a doua dilutie de
lucru(standart si proba)
Interpretarea rezultatelor -se calculeaza
media aritmetica a diametrelor zonelor de
inhibitie pentru fiecare dilutie de lucru
(standart si proba)si se procedeaza conform
prevederilor de la ,,Evaluarea statistica a
determinarilor biologice – Calculul activitatii
biologice prin evaluarea indirecta –Metode
bazate pe raspunsuri gradate”
Proba de analizat este corespunzatoare daca
activitatea microbiologica a acesteia este de
cel putin 90,0% si de cel mult 110,0% fata de
activitatea microbiologica a antibioticului-
standart.Limitele fudiciale de eroare sint
cuprinse intre 80,0% si 125,0%.
Activitatea enzimatica a chimotripsinei

Determinarea activitatii enzimatice a chimotripsineise bazeaza pe


hidroliza esterului etilic al clohidratului de L-tiroozina de catre
chimotripsina la pH 6,2-6,3 si la temperatura 25º 25 C si titrarea ionilor de
hidrogen eliberati cu NaOH.

Unitatea de chimotripsina - este masa enzimei care in conditii


standart,hidrolizeaza un milimol de substrat pe minut

Prepararea substratului - Se dizolva 0,6g ester etilic al clorhidratului de


L-tiroxina si 1,4 g NaOH 1 mol/l,se agita si se completeaza cu apa la
100 ml ,intr-un balon cotat .Solutia se inainte de folosire.
Activitatea enzimatica a chimotripsinei se calculeaza conform formulei:
UCHT(TEE-Hcl)/mg =V*n/m
unde:
V - volumul de NaOH 0,02 mol/l folosit pe minut la titrare,ml
n - 0,02(cantitatea gruparilorcarboxil neutralizate de 1 ml NaOH
0,02 mol/l in molimoli)
m - masa chimotripsinei luate in lucru ,mg
IMPURITATI HIPOTENSIVE
Determinarea se bazeaza pe compararea scaderii presiunii arteriale la
animale de experienta produsa dupa administrarea unui preparat injectabil
cu scaderea presiunii arteriale produsa de o solutie standard de histamina.
Solutie standard : 16.5mg diclorhidrat de histamina se dizolva in apa
distilata si se completeaza cu acelasi solvent la 100ml, intrun balon cotat.
Solutie proba : se prepara conform prevederilor din monografia respectiva
folosind ca solvent clorura de sodiu – solutie izotomica, daca nu sa prevede
altfel.
Tehnica de lucru: se folosesc pisici adulte de ambele sexe, sanatoase, cu
masa corporala de 2 – 3 kg. Animalele se anesteziaza profund cu o
substanta anestezica cu efect prelungit si care nu modifica reglarea
presiunii arteriale. Intimpul determinarii temperatura animalului trebuie
mentinuna in limite fiziologice. Se descopera artera carotita comuna in care
se introduce o canula cu solutie anticuagulanta, pusa in legatura cu un
dispoyitiv care permite inscrierea presiunii arteriale. Toate solutiile se
administreaza intravenos printr-o canula introdusa in vena femurala.
Respiratia artificiala este facultariva
 Pentru verificarea sensibilitatii animalului la histamina se injecteaja din
solutia standart : 0.05;0.1; 0.15 μg histamina pe kg/ masa corporala. Daca
raspunsul hipotensiei la aceste 3 doze este progresiv se mai administreaza
inca de 2 ori cite 0.1 μg histamina pe kg/ masa corporala.Raspunsul la
aceste 2 doze trebuie sa fie aproximativ egal 2.7 kPa.daca aceste conditii nu
sunt indeplinite injecctarile se continue. Administrarile se efctueaza la
intervale regulate, de la cel putin 5 ml si la cel putin 1 min,dupa ce
presiunea arteriela revine la nivelul de inainte de injectarea precedenta.
Solutia proba se administreaza de 2 ori succesiv fiind urmata de
administrarea dozei de 0.1 μg histamina pe kg/ masa corpurala.
Interpretarea rezultatelor: proba de
analizat este corespunzatoare daca media
raspunsurilor obtinute cu solutia-proba este mai
mica decit media raspunsurilor obtinute cu doza
de 0.1 μg histamina pe kg/ masa corporala. In
caz contrar se repeta pe acelasi animal seria de
administrare a solutiei standard si a solutiei
proba.
Proba de analizat este corespunzatoare daca
media raspunsurilor obtinute cu solutia proba
este mai mica decit media raspunsurilor obtinute
cu solutia standard si daca nu mai mult de
jumatate din raspunsurile individuale obtinute cu
sol.proba depasesc media raspunsurilor obtinute
cu 0.1 μg histamina pe kg/ masa corporala.
IMPUTITATI PIROGENE
Controlul impuritatilor pirogene se bazeaza pe urmarirea temperaturii
rectale a iepurilor, dupa administrarea intravenoasa a solutiei de analizat,
pentru decelarea prezentei unor eventuale impuritati cu efect
hipertermizant.
Pentru controlul inpuritatilor pirogene se admit numai animalele care
raspund la testarea reactivitatii termice cu o modificare individuala maxima
de temperatura cuprinsa intre +0,75 ºC si + 1,5 ºC .
Animalele nu sunt folosite pentru controlul impuritatilor pirogene mai des
decit o data la 72h.Acelasi animal nu poate fi folosit la mai mult de 8 probe
de pirogenitate.
Tehnica de lucru: controlul impuritatilor pirogene se efctueaza pe trei
iepuri a care temperatura sa mentinut constanta. La fiecare epure diferenta
masei corporale nu trebuie sa fie nu mai mare decit 300g si diferenta intre
temperaturile initiale nu trebuie sa fie mai mare de 1 ºC . Animalele se
introduc in cutiele de contentie cu cel putin 1h inaintea inregistrarii primei
temperaturi de control.Inaintea administrarii solutiei de analizat se iau 2
temperaturi de control: I - cu 30 – 40min inaintea administrarii, II - imediat
inaintea administrarii; media lor constitue temperatura initiala.
Administrarea se efectueaza intrsvenos in vena marginala a urechei, daca
nu se prevede altfel. Viteza de injectare trebuie sa fie de cel mult 5 ml /min.
Dupa administrare iepurii se mentin in aceleasi conditii timp de trei ore;
masurarea temperaturii se efctueaza de 4 ori, la intervale de 45 min.
Interpretarea rezultatelor: proba de analizat este considerata
corespunzatoare daca suma modificarilor individuale maxime de temperatura
ale celor 3 animale nu depaseste 1,15 ºC ; daca aceasta valoare depaseste
2,65 ºC ,proba este respinsa; daca valoarea este cuprinsa intre 1,15 ºC -2,65
ºC ,determinarea se repeta pe alte trei animale nelucrate care indeplinesc
conditiile pentru controlul impuritatilor pirogene,iar interpretarea rezultatelor se
efectueaza conform prevederilor din tabel

Proba de analizat este


Numar Proba de analizat este considerata considerata
Rind de iepuri corespunzatoare daca suma necorespunzatoare daca
cresterilor maxime de temperatura suma cresterilor maxime
nu depaseste: de temperatura nu
depaseste:

A 3 1.15 ºC 2.65 ºC
B 6 2.80 ºC 4.30 ºC
C 9 4.45 ºC 5.95 ºC
D 12 6.60 ºC 6.60 ºC
IMPURITATI TOXICE

Determinarea impuritatilor toxice se efectueaza pe soareci albi,


sanatosi, cu masa corporala de 18-22 g.
Animale de experienta: soarecii de ambele sexe sunt mentinuti
3-5 zile inaitea determinarii in incaperi cu o temperatura de 22-26 ºC
si la un regim alimentar constant, echilibrat, cu acces liber la hrana
si apa. Animalele sunt cintarite in fiecare din ultimele 3 zile inaintea
determinarii si sunt luate in lucru numai acele animale care in acest
interval nu au prezentat scaderi ale masei corporale.
Tehnica de lucru: proba luata in lucru se dizolva in apa sterila
sau in solventul specificat in monografie, in concentratia prevazuta
in monografia raspectiva.
Daca nu se prevede altfel, se administreaza intravenos, la 5
soareci, cite 0,5 ml solutie- proba, intrun interval de 5-10 s, cu un
debit constant; animalele se tin sub observatie timp de 24 h.
Interpretarea rezultatelor: proba de analizat este
corespunzatoare daca nici un animal nu prezinta fenomene toxice
(convulsii, pareze) imediat dupa injectare si daca toate enimalele
supravetuesc pina la sfirsitul perioadei de observatie .
Dozarea biologica a heparinei
Dozarea biologica a heparinei se bazeaza pe proprietatea acesteia
de a prelungi “in vitro” timpul de coagulare a singelui.
Solutie standard: se cintareste in balanta analitica heparina
sodica necesara obtinerii unei sol.care sa contina 10 U.I.
heparina/ml in tricrezol3g/l. Se conserva la 0-5ºC timp de cel mult 6
luni.
Prin diluarea acestei solutii se obtin urmatoarele sol.pentru
determinare:
sol.I (S1) contine 1,28 U.I. heparina/ml;
sol.II (S2) contine 1,60 U.I. heparina/ml;
sol.III (S3) contine 2,00 U.I. heparina/ml;
Solutia-proba: din proba de analizat se prepara prin diluare cu
apa, o solutie cu o concentratie presupusa de 10 U.I. heparina/ml.
din aceasta sol. Se prepara, prin diluare cu apa, 3 solutii(P1, P2,
P3), care trebuie sa aiba aceleasi concentratii cu acelea ale sol.
Standard diluate.
Recoltarea singelui: se recolteaza 100ml singe de
bovine intr-un flacon de sticla cu git larg si dop rodat
care contine 25 ml sulfat de sodiu anhidru 7g/l.
Extract de creier cu activitate tromboplastinica:
creierul proaspat de bovine ,se curata de vase si tesut
conjuctiv, se taie in bucati mici, se introduce intr-un vas
si se adauga in volum dublu acetona. Se agita si se
indeparteaza acetona.Se tritureaza 30 g din tesutul
prelucrat cu 75ml acetona, in repetate rinduri, pina cind
dupa filtrarea acetonei se obtine o pulbere practic
uscata. Pulberea se tine le termostat aproximativ 2 ore.
La 1,5g pulbere se adauga 60 ml apa, se incalzeste la 50
ºC timp de 15 min.,se centrifugheaza la 1500 rot/min
timp de 2 min si extractul se filtreza.
Tehnica de lucru: in sase eprubete de hemoliza
identice, se introduce cite 1,0 ml din sol.-standard si din
sol.-proba,diluate (respectiv S1, S2, S3,P1, P2, P3). In
fiecare eprubeta se adauga extract de creier ~0,2 ml,
astfel incit cel mai mult timp de coagulare sa fie 9-12
min.Se adauga cite 1,0 ml singe bine omogenizat si
cotinutul eprubetelor se amesteca prin usoara
rasturnare evitindu-se formarea bulelor de aer. Se
urmareste aparitia modificarii fluiditatii singelui, inclinind
eprubeta la un unghi de 30 ºC. Pentru fiecare dilutie se
stabileste timpul din momentul adaugarii singelui pina la
formarea unui cheag care adera de fundul eprubetei,
cind aceasta este rasturnata lent. Momentul coagularii
este apreciat cu o eroare de cel mult 15s. Daca se
observa ruperea cheagului la rasturnarea prematura a
lui, determinarea se anuleaza
Dozarea biologica a Insulinei

Dozarea biologica a insulinei se bazeaza pe proprietatea acesteia de a provoca


hipoglicemie la iepuri.
Solutie-standard: se cintareste la balanta analitica insulina necesara obtinerii unei
sol.cu o concentratie de 40 U.I. insulina/ml. Se dizolva in volumul necesar de clorura
de sodiu-sol.izotonica si care este ajustata la pH 2,5-3,5 cu acid clorhidric 1mol/l. Se
conserva la 0-5ºC timp de cel mult 6 luni.
Prin diluarea acestei solutii se obtin urmatoarele sol.pentru determinare:
sol.I (S1) contine 1 U.I. insulina/ml
sol.II (S2) contine 2 U.I. insulina/ml;
Solutie proba: din proba de analizat se obtine, prin diluare cu aceeasi solventi
amestec de sol.cu o concentratie presupusa de 1U.I. insulina/ml (P1) si o sol.de 2
U.I. insulina/ml (P2).
Animale de experienta: se folosesc iepuri sanatosi, de ambele sexe,din aceeasi
crescatorie,cu masa corparala de 1800-3000g si care nu au prezentat in ultimele 7
zile scaderi in masa corporala.
Tehnica de lucru: cu 24h inaintea determinarii animalele primesc ratia obisnuita de
hrana. Dupa 6h se ridica hrana animalelor,lasind doar apa. Nu se iau in lucru
animalele care in intervalul de 6h nu au consumat ratia de hrana. In ziua testarii,
animalele se pun in dispozitive de contenţie unde se tin fara hrana si apa. Pentru a se
determina valoarea initiala a glicemiei, de la fiecare iepure se recolteaza de la vena
marginala a urechii cite 0,1ml singe. Se iau in lucru cel putin 24 animale, a caror
glicemie este cuprinsa intre 4,99-6,66mmol/l. animalele se impart in 4 loturi egale,
care contin cel puti 6 animale pe lot. Se injecteaza subcutanat cele 2 doze din sol.S1
si S2,precum si P1,P2 la cele 4 loturi de iepuri. Dupa 1h si respectiv 2h si 30 min.de
la injectare se preleveaza de la fiecare iepure cite 0,1ml singe si se determina
glicemia dupa una dim metode:
A Metoda Hagaedorn-Jensen: se recolteaza cu o micropipeta 0,1ml singe .Virful
eprubetei se sterge cu hirie de filtru si singele se introduce intro eprubeta care
contine 5ml sulfat de zinc si 1ml hidroxid de sodiu 0,1mol/l. Amestecul se tine pe
baia de apa timp de 3 min, se filtreaza prin hirtia de filtru spalata de citeva ori cu
apa incalzita la 70 ºC si eprubeta se spala de 2 ori cu 3 ml apa incalzita la 70 ºC,
care se adauga la filtrat. La sol.se adauga 2 ml hexacianoferat de potasiu
0.005mol/l, se tine in baia de apa timp de 15 min.si se raceste. Se adauga 3ml
reactiv Hagaedorn-Jensen, 2ml acid acetic 30g/l, amidon 10g/l in clorura de sodiu-
solutie saturata si se titreza cu tiosulfat de sodiu 0.005mol/l pina la decolorare.
In paralel , se face proba –martor,care nu contine singe.
Valoarea glicemiei, corespunde numarului de mililitri de tiosulfat de sodiu, atit pentru
proba de singe cit si pentru proba-martor se citeste din tabelul corespunzator.
B. Metoda cu o-toluidina: se bazeaza pe formarea unui compus, colorat in verde-
albastru, rezultat din conjugarea aldo- si ceto-hexozelor cu o-toluidina
Solutie-standart de glucoza: 0.1 g glucoza anhidra, cintarite la balanta
analitica, se dizolva in 100 ml acid benzoic-solutie saturata, intr-un balon cotat. Se
conserva la 0-5 ºC timp de cel mult 6 luni.
Tehnica de lucru: in 2 eprubete de centrifuga, proba si standart se introduc in
urmatoarele volume

P S
Acid tricloracetic 50g/l 1 1
Singe 0.1 -
Solutie-standard de glucoza - 0.1
Se amesteca si dupa un repaus de 5 min se centrifugheza la 1500 rot/min. Din
sol. Cetrifugate se introduc in alt lote 2 eprubete urmatoarele volume (in
mililitri):

p s
Supernatant-proba 0.4 -
Supernatant-standard - 0.4
o-toluidina-solutie 2 2
Componentele se amasteca, apoi eprubetele se tin in baia de apa timp de 8
min si se racesc imediat la un curent de apa. Dupa racire se determina
absorbanta solutiei-proba si a solutiei-standard,folosind ca lichid de
compensare o sol.preparata din 0.4ml acid tricloracetic 50g/l si 2 ml o-
toluidina-solutie.
Glicemia se calculeaza conform formulei:
Glucoza (mmoli/1000ml singe )= Ap /As * Cs * 0.0555
In care:
Ap=absorbanta solutie-proba;
As=absorbanta solutiei-standard de glucoza
Cs=concentratia solutie-standard de glucoza ( % m/V ).

 Calculul rezultatelor: se iau in considerare numai animalele care


au putut fi folosite pina la sfirsitul experientei (se elimina animalele
care fac convulsie). Determinarea este valabila daca pina la sfirsit
au ramas in experiment cel putin 4 animale in fiecare lot.
 Pentru fiecare animal se calculeaza o medie a glicemiei obtinute prin
recotarea singelui la o ora si respectiv la 2 ore jumate. Rezultatul
obtinut se scade, pentru fiecare animal in parte , din valoarea
glicemiei initiale, calculindu-se astfel valoarea scaderii glicemiei.
Dozarea biologica a oxitocinei
Dozarea biologica a oxitocinei se bazeaza pe proprietatea acesteia de a contracta
muschiul uterin izolat de sobolan sau de a provoca scaderea presiunii arteriale la
pasari.
Dozarea biologica a oxitocinei se poate efectua prin una din urmatoarele metode:
A) Metode pe uter de sobolan:
Solutie-standard: se cintareste la balanta analiticahipofiza posterioara-pulbere
necesara obtinerii unei suspensii in acid acetic 2.5 g/l, care sa contina 2 U.I.
oxitocina/ml. amestecul se incalzeste, pe baia de apa timp de 5 minute, se raceste la
un curent de apa si se filtreaza. Se conserva la 0-5 ºC timp de cel mult 3 luni.
Solutie-proba: din proba de analizat se prepara, prin diluare cu solutie izotonica
pentru baia de organ izolat, imediat inainte de folosire o solutie cu concentratia de
0,2 U.I. oxitocina/ml.
Solutie-izotonica pentru baia de organ izolat:
Clorura de sodiu (R) 9 g

Clorura de potasiu (R) 0.42 g


Clorura de calciu (R) 0.16 g
Clorura de magneziu (R) 5.3 mg
Hidrogenocarbonat de sodiu (R) 0.5 g
Glucoza anhidra (R) 0.5 g
Apa pina la 1000 ml
Clorurile se dizolva in 500 ml apa, se adauga Hidrogenocarbonatul de sodiu
dizolvat in 100 ml apa, apoi glucoza anhidra si se completeaza cu apa la 1000
ml, intr-un balon cotat.
Tehnica de lucru: Se foloseste un sobolan femel, in diestru, cu masa
corporala de 180-220 g, care se sacrifica prin singerare. Din unul din coarnele
uterine se sectioneaza un fragment de 1-2 cm lungime, care se suspenda in
solutie izotonica pentru baia de organ izolat incalzita la 32 ºC. Fragmentul
uterin nu trebuie sa prezinte contractii spontane, dar sensibilitatea acestuia
trebuie sa fie pastrata. In solutia din baia se barboteaza un amestec de 95%
oxigen (R) si 5% dioxid de carbon (R), cu un debit constant, in bule mici.
Contractiile musculare se inscriu pe un kimograf, prin intermediul unei pirghii
foarte sensibile. Inainte de determinare, organul se lasa in repaus in baie pina
la relaxare completa. Dupa fiecare administrare, organul se spala din
momentul inceperii relaxarii pina la relaxare completa. Sensibilitatea organului
se controleaza cu doze diferite din solutia-standard, urmarind obtinerea de
contractii submaximale. Dupa administrari repetate ale unor doze egale din
solutia-standard trebuie sa se obtina contractii de amplitudine egala. In caz
contrar, se inlocuieste fragmentul uterin; aceste se mai inlocuieste si in cazul
in care prezinta contractii spontane repetate.
Se stabilesc doua doze din solutia-standard care produc efecte sub maximale
net deosebite intre ele, cu amplitutinea cuprinsa intre 30% si 70% din
contractia maximala.
Proba trebuie astfel diluata incit cele doua doze din solutia-proba sa determine
raspunsuri similare cu cele obtinute cu solutia-standard. Raportul dintre dozele
solutiei-standard si dozele solutie-proba trebuie sa fie constant pe toata perioada
determinarii. Timpul de lucru pe un fragment de organ nu trebuie sa depaseasca 2
h de la montarea acestuia in baie. Dupa stabilirea dozelor, se procedeaza la
determinarea propriu-zisa, administrind cele doua doze din solutia-standard si
doua doze din solutia-proba, in cadrul unei serii de patru administrari.
Se inregistreza cel putin patru serii, respectiv 16 administrari.
In cadrul fiecarei serii, ordinea administrarii celor 4 doze trebuie sa fie diferita.
Administrarile se efectueaza la intervale egale, de cel putin 5 min.
Calculul rezultatelor. Inaltimile contractiilor uterine exprimate in milimetri sint
folosite la calculul activitatii oxitocinei, conform prevederilor de la “ Evaluarea
statistica a determinarilor biologice – Calculul activitatii biologice prin evaluarea
indirecta – Metode bazate pe raspunsuri gradate”
B) Metoda prin inscrierea presiunii arteriale la pasare.
Solutie-standard. Se prepara conform prevederilor de la metoda A.
Dilutiile necesare pentru determinare se efectueaza cu clorura de sodiu-
solutie izotonica (R).
Solutie-proba. Din proba de analizat se prepara prin diluarea cu clorura de
sodiu-solutie izotonica (R), inainte de folosire, o solutie cu o concentratie
presupusa de 0.2 U.I. oxitocina/ml.
Tehnica de lucru: Se folosesc cocosi sau gaini de rasa Leghorn, cu masa
corporala de 1.8-2.4 kg. pasarea se anesteziaza prin injectare i.m. (in
muschiul pectoral) a 2 ml pe kg masa corporala dintr-o solutie care contine
fenobarbital sodic (R) 75 mg/ml (anestezia se poate efectua si cu alte
substante, astfel alese incit sa se obtina o anestezie prelungita si sa se
mentina constanta presiunea arteriala). Pasarea se fixeaza in decubit lateral
pe masa de operatie si se indeparteaza penele din zona externa a coapsei
pe o suprafata de 4-5 cm. Pielea si muschiul gluteu se sectioneaza; se
diseca artera poplitee in care se introduc o canula care contine citrat de
sodiu (R) 100 g/l cu adaos de heparina sodica (R) 0.3 % m/V. Canula
arteriala se racordeaza la un manometru cu mercur si se inregistreaza
presiunea arteriala pe un kimograf. In vena crurala se introduce o canula
prin care se administreaza solutia-standard si solutia-proba.
Inainte de determinare se controleaza sensibilitatea pasarii la solutia
standard prin injectarea a 0.5 U.I. oxitocina/ml. Aceasta doza trebuie sa
produca o scadere a presiunii arteriale de aproximativ 50 mmHg. Daca
pasarea este sensibila, se aleg doua doze din solutia-standard si doua doze
din solutia-proba, astfel incit doza mare sa determine o scadere de
aproximativ 40mmHg, iar doza mica o scadere de cel putin 20mmHg.
Volumul injectat pentru o administrare trebuie sa fie
cuprins intre 0.15 ml si 0.40 ml, iar intervalele de timp
dintre administrari trebuie sa fie cuprins intre 0.15 ml si
0.40 ml, iar intervalele de timp dintre administrari trebuie
sa fie constante pe toata perioada administrarii (3-10 min
in functie de revenirea presiunii la nivelul initial).
Se inregistreaza cel putin cite 4 raspunsuri pentru fiecare
din cele 2 doze din solutia-standard si din solutia-proba,
administrate alternativ si in ordine diferita.
Calculul rezultatelor. Se masoara amplitudinea scaderii
presiunii arteriale in milimetri coloana de mercur si se
calculeaza activitatea probei de analizat in functie de
activitatea standardului, conform prevederilor de la
“Evaluarea statistica a determinarilor biologice –Calculul
activitatii biologice prin evaluare indirecta –Metode bazate
pe raspunsuri gradate”.
Dozarea biologica a preparatelor de digitala

Dozarea biologica a preparatelor de digitala se bazeaza pe determinarea


activitatii cardiotoxice a acestora la cobai, comparativ cu activitatea
cardiotoxica a unui standard.
Standard: digitala (pulbere de frunze)
Solutie-standard: pentru fiecare gram de pulbere standard de digitala,
cintarit la balanta analitica imediat dupa deschiderea fiolei, se adauga 10ml
alcool 80%, se agita timp de 24 h, daca temperatura este de 20-30 ºC, sau
timp de 48 h, daca temperatura este sub 20 ºC, apoi se filtreaza. Solutia
obtinuta se conserva in recipiente inchise etans, la intuneric si la o
temperatura cuprinsa intre -5 ºC si +5 ºC, timp de cel mult 30 zile.
In ziua efectuarii determinarii, 6.0-7.5 ml solutie standard se dilueaza cu
clorura de sodiu-solutie izotonica la 100 ml, intr-un balon cotat.
Concentratia optima a solutiei diluate se stabileste prin incercari
mentionate la “Tehnica de lucru”, sa se produca intre 20 min si 30 min.
Solutie-proba. Frunzele de digitala si comprimatele de digitala aduse la
acelasi grad de pulverizare cu digitala (pulbere de frunze) si cu pulberea
titrata de digitala, se prelucreaza conform prevederilor de la prelucrarea
solutiei-standard, cu deosebirea ca se pot folosi, in functie de rezultatul
incercarilor preliminare, mai mult de 7.5 ml solutie extractiva alcooloca
pentru a obtine 100 ml solutie-proba, fara ca in aceasta solutie concentratia
alcoolului sa fie mai mare de 10 % V/V.
Animale de experienta. Pentru o dozare se folosesc doua loturi de cel
putin 6 cobai, de acelasi sex (femelele nu trebuie sa fie in perioada de
gestatiei), cu masa corporala de 250-450 g si care nu au prezentat in
ultimele 5 zile scaderi ale masei corporale. Media masei corporale a
animalelor din lotul folosit pentru solutia-standart nu trebuie sa difere cu
mai mult de 10% fata de aceea a animalelor din lotul folosit pentru solutia-
proba; in cadrul aceluiasi lot nu trebuie sa fie difentele ale masei corporale
mai mari de 50g.
Tehnica de lucru: Animalele se anesteziaza prin injectarea a 7 ml/kg masa
corporala dintr-o solutie de uretan 250g/l, cu 25-30 min inainte de
inceperea perfuziei. Jumatate din doza de uretan se administreaza
intraperitoneal si jumatate subcutanat. Dupa instalarea anesteziei, animalul
se imobilizeaza in decubit dorsal si in vena jugulara descoperita se introduce
o canula care se pune in legatura cu un aparat de perfuzie cu un debit
constant sau cu o microbiureta gradata in sutimi de milimetru.
Solutia-stabdard diluata si solutia-proba, incalzite la 38 ºC , trebuie
administrate pe tot timpul perfuziei cuun debit de 0.65 ml± 0.05 ml pe
kilogram masa corporala si pe minut. Perfuzia se opreste la incetarea
contractiilor inimii, constatata cu ajutorul unui aparat care reda activitatea
electrica a inimii sau prin observare directa, deschizind cutia toracica in
momentul in care bataile inimii neregulate si greu perceptibile. Cind
activitatea inimii a incetat timp de cel putin 30 s inima se considera oprita si
se noteaza volumul solutiei perfuzate (in milimitri).
Determinarea este valabila cind moartea tuturor animalelor din lotul
respectiv se produce intre 20 min si 30 min de la inceputul perfuziei. In caz
contrar, concentratia solutiei de perfuzat trebuie modificata.
Calculul rezultatelor. Se efectueaza conform prevederilor de la
“Evaluarea statistica a determinarilor biologice – Calculul activitatii biologice
prin evaluarea directa”.
Evaluarea statistica a determinarilor biologice

determinarile biologice folosite pentru controlul medicamentelor pot fi


impartite in 2 categorii:
- Determinari calitative, prin care se demonstreaza absenta unor impuritati
(pirogene, toxice, hipotensive);
Determinari cantitative, care stabilesc activitatea unui preparat, in cazurile in
care prin metodele chimice sau fizico-chimice nu se pot obtine informatii
adecvate in aceasta directie.
Determinarile biologice cantitative se bazeaza pe dependenta raspunsului
de marimea dozei aplicate. Pentru testare se folosesc animale intacte
tesutului sau organe izolate, culturi de microorganisme etc.
Spre deosebire de determinarile fizico-chimice, determinarile biologice de
activitate prezinta erori mult mai mari, care au cauze multiple. O parte
dintre acestea, care depind de virsta, sexul, masa corporala, alimentatia,
modul de intretinere al animalelor, pot fi diminuate fixind in cadrul
procedeelor de fixare conditii precise pentru acesti parametri. De asemenea,
pot fi micsorate erorile sistematice (de ex: dilutie, procedeu de
administrare), printr-o acuratete crescuta, precum si erorile de inregistrare
a rezultatelor, prin alegerea unei metode bazate pe un efect usor de
masurat
Chiar dupa reducerea acestor cauze de eroare, marimea
raspunsului la aceeasi doza dintr-un preparat poate diferi
considerabil de la un animal la altul, datorita variabilitatii biologice
individuale.
Pentru a micsora pe cit de posibil efectul variabilitatii biologice
individuale orice determinare biologica a activitatii trebuie efectuata
comparativ cu un standard cu activitate cunoscuta, testarea
efectuindu-se pentru ambele preparate concomitent si in conditii
asemanatoare. Pe baza datelor obtinute se calculeaza coeficientul
de activitate (r) care este raportul dintre activitatea probei de
analizat si activitatea standardului respectiv. Activitatea propriu-zisa
a probei de analizat se obtine inmultind acest coeficient cu
activitatea standardului. Activitatea astfel stabilita trebuie sa se
incadreze in limitele de toleranta ale activitatii prevazute in
monografia fiecarui preparat (de ex: pentru comprimate de digitala
0.85-1.15 U.I./comprimat).
In afara de incadrarea in limitele de toleranta ale activitatii,
intereseaza si precizia cu care s-a efectuat testarea, deci este
necesar sa se calculeze limitele fiduciale ale determinarii, pentru a
vedea daca ele se incadreaza in prevederile metodei. In caz contrar,
rezultatul obtinut nu prezinta suficienta incredere si determinarea
trebuie continuata pe un numar aditional de cazuri, pina ce eroarea
se situeaza in limitele admise pentru metoda respectiva.