10/4/2010

REPLICARE = Sinteza ADN

• Replicare la procariote
- Caracteristici
- Factori necesari
- Etape
• Replicare la eucariote
• Modificări postreplicare
• Inhibiţia replicarii
• Agenţi mutageni. Mecanisme de reparare
• Sinteza de ADN pe matriţă de ARN 1

REPLICARE PROCARIOTE
Caracteristici
• Are loc în timpul diviziunii celulare

• Este semiconservativă
Dintr-o moleculă de ADN “părinte” => 2 molecule “fiice” care conţin un lanţ părinte şi un lanţ
complementar, nou sintetizat.

Asigură stabilitatea genetică a fiecărui

organism şi conservarea informaţiei
genetice de la o generaţie la alta, ȋn
cadrul aceleiaşi specii

1
 10/4/2010

Dovada replicării semiconservative

Experienţa lui Meselson şi Stahl (1957)

Dovada replicării semiconservative

2
 10/4/2010

REPLICARE PROCARIOTE
Caracteristici
• Este bidirecţională
Începe de la origine (“ori C”) prin separarea celor două lanţuri părinte şi formarea a două
furci de replicare.
Cele două furci de replicare se deplasează simultan, în direcţie opusă, până când se
întâlnesc (în punctul “ter” situat pe partea cealaltă a cromozomului, opusă originii)
.

REPLICARE PROCARIOTE
Caracteristici
Prin copierea continuă a lanţului sens (direcţia 3‟-5‟) => “lanţul conducător”,
Prin copierea discontinuă a lanţului antisens (direcţia 5‟-3‟) => “fragmentele Okazaki”
(1000-2000 nucleotide), componente ale “lanţului întârziat”.

3
 10/4/2010

REPLICARE PROCARIOTE
Caracteristici
• Direcţia replicării este 5’→3’

REPLICARE PROCARIOTE
Factorii necesari
• Matriţă (“template”) = fiecare lanţ al ADN părinte, citit în direcţia 3‟-5‟. Necesară pentru
ghidarea legării nucleotidului complementar în vederea formării noului lanţ de ADN;
• Deoxiribonucleotide trifosforilate: dATP, dGTP, dCTP, dTTP (substrate ale ADN
polimerazelor);
• Ribonucleotide trifosforilate: ATP, GTP, CTP, UTP (substrate ale ARN polimerazei);
• Enzime:
- ADN polimeraze ADN-dependente: I, II si III
- ARN polimeraza (primaza): cu activitate 5‟-3‟ polimerazică care sintetizează “primeri”
(oligoribonucleotide), folosind ca matriţă monolanţul de ADN;
- Helicaze: enzime care despiralează ADN părinte (ex. Dna B, proteina rep);
- Topoizomeraze: enzime care elimină suprahelicarea produsă prin despiralare, fie prin
tăierea unui singur lanţ (tipul I), fie prin tăierea ambelor lanţuri (tipul II, ex. giraza);
- ADN ligaza: uneşte capătul 3‟ al unui fragment Okazaki cu fosfatul din capătul 5‟ al altui
fragment Okazaki (folosind ca sursă de energie ATP);
• Proteine:
- dna A: recunoaşte originea replicării şi iniţiază despiralarea ADN;
- SSB (“Single-strand binding protein”): împiedică reasocierea lanţurilor şi acţiunea
enzimelor de clivare a monolanţurilor;
- n, n’, n’’, i, dna C: formează primozomul.
8

4
 10/4/2010

ADN polimeraze ADN-dependente

Tip de Activitate Activitate Rol

polimerază polimerazică exonucleazică
Îndepărtează primerii
POl I 5‟-3‟ 3‟-5‟ şi 5‟-3‟ Repară ADN
Repară ADN
POL II 5‟-3‟ 3‟-5‟
Alungeşte primerii de
POL III 5‟-3‟ 3‟-5‟ ARN folosind dATP,
dGTP, dCTP, dTTP

• Activitatea exonucleazică 3‟-5‟ asigură fidelitatea replicării, este responsabilă

de “proof reading”, respectiv de corectarea greşelilor de citire;

• Activitatea exonucleazică 5‟-3‟ sau activitatea de excizie-reparare este

esenţială pentru îndepărtarea primerilor şi pentru repararea ADN alterat .
9

Activităţile ADN polimerazei III

Functia polimerazica Functia corectoare

Nucleotidul trifosforilat este selectionat si fixat
(prin legaturi de H) de baza complementara din lantul
ADN matrita, apoi este legat (prin legatura 3’-5’ fosfoester)
la capatul 3’ al lantului in curs de sinteza.
polimeraza
Daca ADN polimeraza imperecheaza gresit un
nucleotid, foloseste activitatea 3’-5’ exonucleazica
pentru excizarea lui.

Enzima Enzima
avanseaza revine

Activitate 5’→3’ Activitate 3’→ 5’

polimerazica exonucleazica

ADN
matrita Lant nou sintetizat
Activitatea 3’-5’ exonucleazică permite ADN polimerazei III să corecteze (“proofread”)
lanţul nou sintetizat

10

5
 10/4/2010

Primaza = ARN pol. ADN dependentă

Are activitate 5‟-3‟ polimerazică => sintetizează “primeri” (oligoribonucleotide),
folosind ca matriţă monolanţul de ADN;

11

Rolurile helicazei & topoizomerazei

Helicaza (ex. Dna B, proteina rep) despiralează ADN părinte;

Topoizomeraza elimină suprahelicarea produsă prin despiralare, fie prin tăierea

unui singur lanţ (tipul I), fie prin tăierea ambelor lanţuri (tipul II);

12

6
 10/4/2010

Acţiunea ligazei
ADN ligaza: uneşte capătul 3‟ al unui fragment Okazaki cu fosfatul din capătul 5‟
al altui fragment Okazaki (folosind ca sursă de energie ATP);

13

REPLICARE - Etape

• Iniţiere
• Elongare
• Terminare

14

7
 10/4/2010

REPLICARE – Etapa de iniţiere

Etapa de iniţiere = Etapa de formare a replizomului
• Recunoaşterea “secvenţelor consens” (AT)n din regiunea “ori” de către
dnaA, urmată de împachetarea (tasarea) regiunii şi despiralarea duplexului în
regiunea învecinată, respectiv formarea celor două “furci de replicare”;
• Inserţia complexului dnaB-dnaC;
• Deplasarea furcii de replicare prin acţiunea dnaB şi expulzarea dnaA;
• Stabilizarea porţiunii despiralate prin fixarea proteinei SSB;
• Constituirea primozomului prin ataşarea proteinelor n, n‟, n‟‟, i şi a primazei;
• Sinteza ARN primer (amorsă);
• Constituirea replizomului prin ataşarea polimerazei III şi a helicazei (proteina
rep) la primozom.

15

REPLICARE - Etapa de elongare

Etapa de elongare = etapa de alungire a amorsei (ARN primer)
• Legarea succesivă a deoxiribonucleotidelor de către ADN Pol III
(catalizează atacul nucleofil al OH din capătul 3‟al primerului asupra
grupării α-fosfat al NTP complementar nucleotidului din lanţul matriţă).
ADN Pol III are acţiune 5‟-3‟polimerazică =>numai lanţul sens (3‟-5‟) poate fi
copiat continuu => lantul conducator (“leading strand”).
Copierea lanţului antisens (5‟-3‟) presupune formarea mai multor bucle (pentru
schimbarea sensului) şi sinteza mai multor amorse de ARN prin alungirea
cărora rezultă fragmentele Okazaki (1000-2000 nucleotide).
• Constituirea lanţului întârziat (“lagging strand”) prin acţiunea Pol I (care
înlocuieşte primerii cu deoxiribonucleotide) şi a ligazei (care uneşte
fragmentele Okazaki);
• Înaintarea furcilor de replicare produce în amonte o suprahelicare pozitivă
care necesită intervenţia topoizomerazelor
16

8
 10/4/2010

Copierea lanţului antisens (5’-3’) presupune formarea de

bucle pentru schimbarea sensului

Directia de deplasare
a furcii de replicare

Primozom ARN
primer

ADN ADN
polimeraza polimeraza

Lant Lant
conducator intarziat

17

REPLICARE - Etapa de elongare

Lanţul ȋntârziat este Lanţul conducător este

sintetizat ȋn direcţia sintetizat ȋn direcţia 5’-3’
5’-3’ dinspre furca de către furca de replicare şi
replicare şi necesită necesită un singur primer
mai mulţi primeri

18

9
 10/4/2010

REPLICARE - Etapa de terminare

Etapa de terminare = etapa ȋn care proteina “ter-binding” se

leagă de secvenţele de terminare “ter” situate pe partea
opusă a cromozomului
=> este oprită acţiunea helicazei (Dna B).

INHIBITIA REPLICARII la procariote

Norfloxacina
= inhibitor al ADN girazei (topoizomeraza II) bacteriene
= medicament utilizat pentru tratarea infecţiilor bateriene 19

Recapitulare

Începe la furca de replicare prin

• separarea lanţurilor (facilitată de helicază, SSB, ADN topoizomeraze)
• legarea ADN polimerazei
ADN polimeraza sintetizeaza noile lanţuri ȋn direcţia 5’→3’ folosind
• primeri sintetizaţi de primază
• lanţurile parentale de ADN ca matriţe
Rezultă 2 lanţuri complementare fiice (replicarea este semiconservativă):
• lanţul conducător prin alungirea unui singur primer, ȋn direcţia 5‟→3‟ , către furca de replicare
• lanţul ȋntârziat prin alungirea mai multor primeri, ȋn direcţia 5‟→3‟ , dinspre furca de replicare

20

10
 10/4/2010

REPLICARE - Eucariote
• Are loc numai în faza S a diviziunii celulare

La eucariotele superioare se divid activ un număr

restrâns de celule (ex. celule din piele, cripte
duodenale, foliculi piloşi).
Precursorii eritrocitelor (eritroblaste) se divid de un
număr limitat de ori, apoi îsi pierd nucleul (se
transformă în eritrocite) şi părăsesc ciclul celular.
Majoritatea celulelor sunt reţinute, după mitoză, în
faza G0 de nondiviziune (“resting phase”).
Reintrarea în ciclul celular poate fi determinată de
condiţii de stress şi este controlată de kinazele ciclin-
dependente (CDK).
Aceasta explică regenerarea rapidă (câteva
săptămâni) a ficatului distrus în proporţie de 90%.

21

REPLICARE - Eucariote
• Eucariotele au mai multe polimeraze
Activitate
Tip Rol
exonucleazică

α - Sinteza primerilor şi a “fragmentelor Okazaki”

(200 nucleotide)
Repararea ADN

β - Repararea ADN

γ 3’-5’ Replicarea ADN mitocondrial

δ 3’-5’ Sinteza “lanţului conducător”

ε 3’-5’ Repararea ADN

22

11
 10/4/2010

REPLICARE - Eucariote
• Decurge de 10 ori mai încet (100 de pb/sec) datorită
gradului înalt de condensare;
• Accesul la ADN a proteinelor şi enzimelor necesare
replicării este facilitat prin desfacerea cromatinei (etapa
limitantă de viteză), proces iniţiat de metilarea în poziţia
5 a citozinelor (sub acţiunea ADN-metil transferazei).
• Există mai multe origini (aproximativ 100 pentru fiecare
cromozom);
• Mai multe (20-80) origini situate într-o anumită zonă a
cromozomului formează o unitate de replicare (replicon);
repliconii se activează treptat pe parcursul fazei S a
ciclului celular;

23

REPLICARE - Eucariote

Mai multe origini

Bidirecţională

24

12
 10/4/2010

REPLICARE - Eucariote

Telomeraza
facilitează
replicarea
telomerelor
(capetele
cromozomilor)

25

Modificări postreplicare = Modificări epigenetice

Metilarea “insulelor CpG”

• Se transmite de la o generaţie la alta
• Este specifică fiecărui ţesut
• Este realizată de metilaze SAM-dependente
• Vizează doar citozinele din secvenţe 5'-CpG-3„ (≈ 30000 insule CpG ≈ 1-2 kb )

Demetilarea insulelor CpG determină expresia genelor asociate

Organism 5'-metil citozina (mC)

Animale 2-7%

Plante >25%

↓ 5'- mC => ↑expresia genei

↑ 5'- mC => ↓ expresia genei
26

13
 10/4/2010

REPLICARE - Inhibiţie
Elongarea ADN poate fi blocată prin incorporarea
analogilor de nucleotide proveniţi din analogi de
nucleozide (fosforilaţi de enzimele de “salvare” )
care conţin:
2’deoxiriboză modificată:
- lipsa OH din pozitia 3‟
ex. Dideoxiinozina = didanozina = ddI

- ȋnlocuirea OH din poziţia 3‟ cu azido

ex. Azidotimidina = zidovudina = AZT= antiviral
2’deoxiriboza ȋnlocuită cu arabinoza (epimer)
ex. citozin arabinozid = citarabina = araC = citostatic
adenin arabinozid = vidarabina = araA =antiviral

Analogii de nucleozide ȋncetinesc multiplicarea

ADN-ului celulelor care se divid rapid (canceroase)
şi a virusurilor!
27

Alterarea ADN- Efectul fumatului

28

14
 10/4/2010

Alterarea ADN- Efectul UV

29

REPARARE ADN - Etape

Xeroderma pigmentosum = cancer de piele

cauzat de acumalarea mutatiilor datorita
absentei excinucleazei UV-specifice 30

15
 10/4/2010

Sinteza de ADN pe matriţă de ARN

31

Rolul revers transcriptazei ȋn

infecţia cu retrovirus

32

16