Sunteți pe pagina 1din 50

UNIVERSITATEA “OVIDIUS” CONSTANŢA FACULTATEA DE ŞTIINTE ALE NATURII ŞI ŞTIINTE AGRICOLE ŞCOALA DOCTORALĂ DOMENIUL BIOLOGIE SPECIALIZARE BIOCHIMIE

TEZĂ DE DOCTORAT

Rezumat

CERCETĂRI BIOCHIMICE ŞI CITOLOGICE ÎN DETERMINAREA CALITĂŢII EMBRIONILOR MANIPULAŢI IN VITRO LA OVINE ŞI CAPRINE

Doctorand, ŞOGORESCU ELENA

Conducător de doctorat, Prof . univ.dr. ROŞOIU NATALIA

Constanţa 2009

CUPRINS

OBIECTIVELE ŞI SCOPUL LUCRĂRII …………………………………………

pagina

1

PARTEA I. STADIUL CUNOAŞTERII PRIVIND PRODUCEREA IN VITRO A EMBRIONILOR LA MICILE RUMEGĂTOARE

Capitolul 1. Recoltarea oocitelor şi studierea statusului morfo - fiziologic al oocitelor recoltate, la micile rumegătoare

4

Capitolul 2. Maturarea in vitro a oocitelor la ovine şi caprine

6

Capitolul 3. Capacitarea şi reacţia acrozomală a spermatozoizilor de berbec şi ţap

14

3.1 Reacţia de capacitare a spermatozoizilor

 

15

3.2 Reacţia acrozomală a spematozoizilor

19

3.3 Metode de evaluare a reacţiei de capacitare a spermatozoizilor

20

Capitolul 4. Fecundaţia in vitro a oocitelor la micile rumegătoare

20

4.1 Fertilizarea oocitelor in vitro la oaie

 

21

4.2

Fertilizarea oocitelor in vitro la capră

……………

28

PARTEA A II-A CONTRIBUŢII PERSONALE

Capitolul 1. Materiale, metode şi tehnici de lucru

 

33

Capitolul 2. Rezultate şi discuţii

55

Capitolul 3. Concluzii Bibliografie selectivă Lucrări publicate şi elaborate de doctorand pe tematica abordată Alte lucrări publicate şi comunicate de doctorand Stadii de specializare realizate de doctorand Participări la conferinţe naţionale şi internaţionale

123

OBIECTIVELE ŞI SCOPUL LUCRĂRII

În lucrarea de doctorat intitulată „Cercetări biochimice şi citologice în determinarea calităţii embrionilor manipulaţi in vitro la ovine şi caprine” obiectul cercetării ştiinţifice se bazează pe experimentele ştiinţifice realizate pe oocite, spermatozoizi şi embrioni de la micile rumegătoare care sunt sisteme bioinformaţionale. Deşi domeniul biotehnologiei fertilizării in vitro a oocitelor (FIV) este foarte bine cunoscut, realizarea lucrării de doctorat se bazează pe aspecte etice, îndeosebi pe protejarea statusului fiziologic al micilor rumegătoare deoarece experimentele din cadrul acestei lucrării se desfăşoară pe culturi celulare (oocite şi embrioni) ce au în vedere monitorizarea activităţii celulare (oocite, spermatozoizi şi embrioni) prin studierea mecanismelor de procesare a informaţiilor la nivel biologic, în urma acţiunii unor agenţi bioinformaţionali şi fizico-chimici (medii de cultură simple, sau suplimentate cu sucuri naturale, EGF, hormoni, pH, concentraţia de dioxid de carbon, temperatura, agenţi patogeni) asupra dezvoltării competenţei celulare. Testarea de medii îmbogăţite cu sucuri naturale în locul serului fetal bovin, asupra maturării, fertilizării oocitelor, capacitării spermatozoizilor şi culturării embrionilor micromanipulaţi – reprezintă noutate pe plan internaţional în domeniul producerii de embrioni in vitro, fiind utilizate pentru observarea mecanismelor biochimice şi citologice implicate în aceste procese. Scopul tematicii abordate este de a realiza modele experimentale de producere in vitro a embrionilor la micile rumegătoare şi observarea transformărilor biochimice şi citologice pe care le suferă oocitele pentru a ajunge la stadiul de blastocist. Obiectivele principale sunt:

1- Realizarea de metode experimentale de colectare a oocitelor de la micile rumegătoare (puncţie foliculară in vivo şi in vitro şi disecţia foliculilor mari in vitro); 2- Determinarea viabilităţii oocitelor şi studiul morfo-citologic al oocitelor recoltate de la micile rumegătoare, acţiunea unor factori informaţionali (medii simple şi complexe suplimentate cu sucuri naturale, hormoni, EGF) asupra competenţei de maturare a oocitelor; 3- Studierea indicilor biologici (viabilitate, motilitate şi indicele de supravieţuire al spermatozoizilor) în urma acţiunii unor medii de capacitare complexe suplimentate cu diferiţi aditivi (sucuri naturale, EGF) asupra capacităţii fecundante a spermatozoizilor de berbec şi ţap. 4- Realizarea de variante experimentale de fertilizare in vitro a oocitelor de oaie şi capră puse în contact cu spermatozoizii capacitaţi de berbec şi ţap în diferite medii de cultură simple sau complexe. 5- Influenţa mediilor de culturare complexe asupra dezvoltării zigoţilor până la stadiul de blastocist. 6- Identificarea impedimentelor tehnico-ştiintifice care acţionează în biotehnologia de producere in vitro a embrionilor la micile rumegătoare.

PARTEA I. STADIUL CUNOAŞTERII PRIVIND PRODUCEREA IN VITRO A EMBRIONILOR LA MICILE RUMEGĂTOARE

Biotehnologiile de reproducţie folosesc organisme vii pentru ameliorarea, modificarea sau producerea pe scară largă a unor produse sau procese importante precum inseminarea artificială, fertilizarea in vitro, sexarea spermei şi a embrionilor, obţinerea de animale transgenice, clonarea, transferul nuclear, utilizarea de ADN recombinat. Dintre aceste biotehnologii, fertilizarea in vitro, sexarea spermatozoizilor şi embrionilor şi bisectarea embrionilor pentru obţinerea de animale identice genetic, s-au dezvoltat cel mai mult aplicându-se în practică la bovine şi în condiţii experimentale la ovine şi caprine. Producerea in vitro a embrionilor la micile rumegătoare se realizează prin următoarele etape:

recoltarea şi maturarea in vitro a oocitelor (MIV- maturare in vitro )  in vitro a oocitelor (MIV- maturare in vitro)

colectarea şi capacitarea spermatozoizilor;in vitro a oocitelor (MIV- maturare in vitro )  fecundaţia in vitro a oocitelor, (FIV-

fecundaţia in vitro a oocitelor, (FIV- fertilizare in vitro ); in vitro a oocitelor, (FIV- fertilizare in vitro);

cultura zigoţilor până la stadiul de blastocist (CIV- cultură in vitro ). (Zamfirescu şi Şonea, 2004). in vitro). (Zamfirescu şi Şonea, 2004).

Capitolul 1. Recoltarea oocitelor şi studierea statusului morfo - fiziologic al oocitelor recoltate, la micile rumegătoare

Colectarea oocitelor se face diferit în funcţie de specie. Colectarea de oocite se face, după stimulare ovariană, prin puncţia foliculului ovarian şi aspirarea lichidului folicular care va conţine complexe oocit-cumulus . În 80% din cazuri oocitele sunt prezente în lichidul folicular, fiind observabile cu stereolupa. La începutul cercetărilor, s-au folosit oocite colectate după ovulaţie spontană, stadiu în care oocitele erau fecundabile. La animale oocitele sunt recoltate din ovarele femelelor sacrificate în abator (scroafă, oaie şi capră), de la animalele vii prin metoda “pick-up“ prin metoda chirurgicală (vaca şi bivoliţă) sau sub control laparoscopic (la toate speciile de animale). Superovulaţiile la animale se obţin după tratamente cu gonadotropine hipofizare (FSH) sau serice (eCG) administrate la mijlocul şi la sfârşitul fazei luteale, care sunt urmate de colectarea oocitelor în primele ore după ovulaţie. Aceasta este o alternativă de obţinere a unui număr mare de oocite maturate, nefecundate care pot fi fertilizate in vitro. Cercetările efectuate la începutul anilor 1980- 1990 au susţinut ideea că, ovulaţia indusă favorizează disocierea celulelor cumulus datorită secreţiei excesive de estrogeni. Oocitele prelevate prin ovulaţie indusă şi fecundate in vitro transferate la femele au dat naştere la embrioni normali în proporţie de 38-50% (Cognie, 2003). Metoda de colectare a oocitelor prin aspirarea conţinutului folicular din ovarele prelevate de la femelele sacrificate în abator, cu ajutorul trompei de vid, permit obţinerea a 6-8 compexe de oocite-cumulus /ovar (Bols şi colab., 1996). Numărul acestora poate fi mărit cu 4-5 oocite prin aplicarea metodei de secţionare seriate a ovarului. Indiferent de metoda de colectare folosită oocitele din foliculii mici sunt mai puţin apte pentru dezvoltare după FIV (Ryan şi colab., 1991). Colectarea oocitelor la capră şi oaie se realizează prin puncţie şi aspirare foliculară. După stimularea cu FSH-p (Tervit, 1996; Tervit şi colab., 1996), se recuperează prin această metodă 6-8 oocite/femelă, iar după maturare, FIV şi transfer de blastocişti obţinuţi după culturare, rezultă la naştere 1,5 miei/oaie/puncţie. La mieluţele impubere stimulate cu FSH + eCG timp de 36 de ore prin colectarea laparoscopică, numărul de oocite a fost mult mai mare faţă de numărul de oocite colectate de la oile adulte donatoare. Viabilitatea embrionilor de la femelele prepubele obţinuţi după FIV a fost scăzută, fiind de 3 miei fătaţi pentru 30 zigoţi transferaţi (Baldassare şi colab., 2002).

Capitolul 2. Maturarea in vitro a oocitelor la ovine şi caprine

Primul pas în producerea de embrioni in vitro îl reprezintă maturarea in vitro a oocitelor la micile rumegătoare. Maturarea oocitelor implică: maturarea nucleară (reluarea meiozei şi trecerea către metafaza II); maturarea citoplasmatică (modificări morfologice, funcţionale şi biochimice necesare pentru fertilizare şi dezvoltarea embrionară incipientă). Chiar dacă există numeroase protocoale de producere a embrionilor, mai mult de 60% din oocitele maturate in vitro ajung la stadiul de blastocist după fecundarea in vitro (FIV) şi embriocultură (CIV). Ca răspuns la acţiunea gonadotropinelor, în oocite se produce reluarea meiozei caracterizată prin spargerea veziculei germinale, condensarea cromosomilor, formarea primului fus meiotic, expulzarea primului globul polar şi oprirea în metafază a celei de a 2-a diviziuni meiotice. Pentru maturare se aleg numai oocitele care au citoplasmă omogenă, transparentă cu mai multe straturi compacte de cumulus. Ca mediu de maturare se poate folosi TCM 199 + 100mg/ml + FSH + gentamicină + 20% lichid folicular. Maturarea in vitro a oocitelor se realizează în picături de 50 µl de mediu de maturare acoperit de ulei mineral. Mediul de maturare poate fi M199 suplimentat cu LH (0,02 U/ml), FSH (0,02 U/ml), estradiol β-17 (1µg/ml), piruvat de sodiu (0,2 mM), kanamicină (50µg/ml) şi 10% ser estral inactivat la 57 0 C. MIV se efectuează la temperatura de 39 o C, în atmosferă umidificată cu 5% CO 2 , timp de 18-19 ore. Celulele cumulusului expandat au fost parţial îndepărtate din COCs prin pipetări repetate sau utilizând secţionarea folosind un ac special (Cognie şi Poulain, 2000).

Expansiunea celulelor cumulus, expulzarea globului polar şi trecerea în metafaza II sunt semnele morfologice ale maturării. Cu toate acestea, procentul de dezvoltare până la stadiul de blastocist după FIV rămâne scăzut, de 20-35% în funcţie de specie. Utilizarea oocitelor mature ovulate, permit creşterea considerabilă a procentului de dezvoltare in vitro. Aceste observaţii arată că etapele de FIV şi DIV sunt performante atunci când se utilizează oocite de bună calitate, iar această calitate a oocitelor provine din maturarea competenţei oocitare, de care va depinde ulterior producţia de embrioni. Competenţa de maturare oocitară scăzută are două cauze: lipsa pregătirii oocitelor colectate, când sunt recoltate prea devreme, sau când nu sunt asigurate condiţii de maturare, ceea ce nu va permite o maturare citoplasmatică bună a oocitelor (Mermillod şi colab., 1996).

Capacitatea oocitară - reprezintă ansamblul de evenimente ce au loc la sfârşitul foliculogenezei contribuind la obţinerea de către oocit a competenţei sale de dezvoltare. Aceasta se realizează consecutiv obţinerii competenţei meiotice de către oocite. Oocitele provenite din foliculii puncţionaţi sunt capabile de meioză şi incapabile pentru dezvoltare, datorită decalajului observat între nivelele de maturare nucleară şi citoplasmatică (Guerin şi colab., 1997). Mecanismele moleculare legate de capacitarea oocitară nu sunt bine elucidate dar se poate crede că în timpul acestei perioade oocitul acumulează transcrieri şi proteinele implicate în metabolismul embrionar de-a lungul dezvoltării precoce, astfel încât genomul embrionar nu se exprimă decât odată cu începerea stadiului de clivaj. Utilizarea de coculturi de celule tecale şi celule granuloase oferă condiţii similare oocitului cu acelea asigurate de cumulus. Odată reluată meioza, oocitul trebuie să aibă învelişuri favorabile pentru acumularea competenţei de dezvoltare. Un mediu ce conţine semnalizatori hormonali paracrinici favorizează acumularea proteică oocitară şi dobândirea competenţei de maturare (Lonergan şi colab., 2003).

Condiţiile de maturare in vitro sunt cele mai importante pentru obţinerea de embrioni in vitro. Mediile de cultură utilizate pentru maturarea in vitro conţin hormoni (FSH, LH, steroizi), proteine (albumină bovină) şi fluide complexe (ser, lichid folicular). După testarea separată a mai multor aditivi s-a arătat că serul fetal bovin a avut efect benefic asupra capacităţii de dezvoltare a oocitelor (Ling, 1992). În cazul oocitelor denudate, acest efect a

fost observat în cazul folosirii factorului de creştere epidermică (EGF) care este mai bun decât serul fetal bovin (FCS), fiind capabil să stimuleze maturarea nucleară. Aceasta demostrează că reluarea meiozei este un fenomen spontan pentru oocitele cultivate in vitro, ele fiind totuşi sub dependenţa unor anumiţi factori precum modificarea arhitecturii matricei celulare, migrarea sau eliberarea de granule corticale şi modificările metabolismului glutationului din timpul maturării oocitelor (Lonergan şi colab., 2004).

Efectul mărimii foliculilor asupra competenţei oocitare a fost demonstrat, dar există probabil şi alte caracteristici foliculare capabile să influenţeze această competenţă. O analiză a caracteristicilor foliculare şi a competenţei oocitare a fost realizată de Cognie (1998), care a arătat că atrezia, dominanţa foliculară, conţinutul steroidian, conţinutul de factor de creştere, sunt parametrii care influenţează capacitarea oocitară. Oocitele provenite de la femelele impubere prezintă o competenţă de dezvoltare mai mică. Studiul oocitelor asemănătoare din punct de vedere fiziologic oferă indicaţii asupra mecanismelor responsabile de competenţa oocitară (Duquesnel şi colab., 1992). Cunoştinţele asupra mecanismului de blocaj meiotic au arătat că oocitele sunt menţinute în blocaj meiotic datorită creşterii sintezei de cyclohexamidă sau de fosforilare a 6- DMAP care scad nivelul de AMP ciclic. O metodă eficientă pentru reluarea meiozei oocitelor este aceea bazată pe folosirea de coculturi cu celule tecale şi celule granuloase sau a unor medii sintetice cu suplimente de FSH, LH şi EGF (Paria şi Dey, 1990). Pe durata creşterii foliculare, lichidul folicular şi microvascularizarea peretelui folicular suferă modificări care sunt importante pentru maturarea oocitelor, pentru ovulaţie şi pentru formarea corpului luteal. Funcţia specifică a lichidului folicular nu este cunoscută, dar se consideră că acest lichid poate fi un protector al oocitelor faţă de factorii care induc reluarea prematură a meiozei. Lichidul folicular protejează oocitele de atacul proteolitic, favorizează terminarea ovulaţiei, creşterea atracţiei pentru spermatozoizi, inducerea hipermotilităţii şi a reacţiei acrozomale la spermatozoizi (Rodriguez, 2002). Matrixul celulelor cumulus expandat este bogat în acid hialuronic şi poate fi digerat cu hialuronidază, în timp ce zona pellucida poate fi digerată cu pronază. Prezenţa heparinei în mediul TCM 199 pe durata maturării in vitro a oocitelor nu a avut un efect diferenţiat asupra dezvoltării embrionare. Rata de clivare a zigoţilor şi rata de obţinere a blastociştilor cu sau fără heparină a fost de 84% vs. 81% şi respectiv de 30% vs. 31%. Rata de transformare în blastocişti a fost scăzută după maturarea in vitro a oocitelor în lichid folicular nediluat. Rata crescută a oocitelor nefertilizate şi rata crescută a polispermiei sunt tipice pentru oocitele maturate cu lichid folicular.Este posibil ca granulele solide din celulele cumulusului expandat să creeze o barieră mecanică la penetrarea spermatozoizilor în oocit (Sjoblom şi colab., 2005). Ca şi sângele, lichidul folicular reprezintă o parte a sistemului hemostatic care formează depozite asemănătoare fibrinei. Heparina prevene formarea granulelor, dar nu le dizolvă pe cele deja formate, crezându-se că materialul ataşat de celulele cumulusului este asemănător cu fibrina şi că sistemul de coagulare a fost activat local. Concentraţia proteică a lichidului folicular este asemănătoare cu cea din ser, ceea ce înseamnă că oocitele tolerează un micromediu bogat în proteine.

Denaturarea proteinelor şi formarea amoniacului din acizii aminici determină probabil diferite grade de toxicitate asupra oocitelor, pe durata MIV. Serul suplimentat cu aminoacizi esenţiali şi factori de creştere, au efecte benefice, printre care şi proprietăţi antioxidante. Suplimentul de ser fetal bovin (FCS) în mediul de cultură embrionar, poate fi o cauză potenţială de acumulare anormală a picăturilor lipidice citoplasmatice (Fernandez- Gonzales şi colab., 2004). Antioxidanţii sunt aditivi benefici pentru mediile de cultură sintetice, deoarece servesc la eliminarea O 2 reactiv din mediile respective. Ali şi colab., 2002 a experimentat modul în care oocitele de oaie au fost maturate in vitro cu sau fără supliment de cisteină, N-acetil-L-cisteină ( NAC), catalază şi superoxid-

dismutază (SOD). Durata FIV, prin adiţia de antioxidanţi (cisteină sau NAC 0,6 mM, catalază 127 U/ml, SOD 100 U/ml) reduce semnificativ rata de dezvoltare embrionară la stadiul de morulă şi blastocist. Mediul suplimentat cu cisteină îmbunătăţeşte rata de dezvoltare embrionară, în contrast cu antioxidanţii extracelulari ca SOD, catalaza care nu aduc îmbunătăţiri în dezvoltarea embrionilor. Glutationul redus (GSH) este un antioxidant natural prezent în ambii gameţi, dar cu nivele variate. O creştere a concentraţiei de GSH intracelular demonstrază progresul oocitelor mature în stadiul de vezicula germinală în metafaza II. GSH este redus cantitativ în stadiul pronuclear. GSH joacă un rol important în protecţia celulară faţă de distrucţiile oxidative. Nivelele de GSH găsite în oocite la sfârşitul maturării sunt considerate markeri biochimici buni pentru evaluarea viabilităţii oocitelor (Abeydeera, 1998). În oocite precursorul GSH este cisteina care jucă un rol important de antioxidant în sistemul de cultură in vitro. Cisteina are rol şi în decondensarea nucleară a spermatozoizilor. Oocitele denudate, expuse la concentraţii

crescute de spermatozoizi vii sau moarţi, rolul antioxidanţilor este pozitiv în ceea ce priveşte supravieţuirea embrionilor. Antioxidanţii (cisteina, NAC, catalaza sau SOD) aflaţi în diferite concentraţii, pot fi în beneficiul sau în detrimentul dezvoltării oocitelor (Ali şi colab., 2002). Cisteina adăugată în mediul de maturare care conţine o concentraţie scăzută de glucoză şi atmosferă ridicată în O 2 , creşte semnificativ dezvoltarea zigoţilor la stadiul de morulă şi blastocist. Cercetările efectuate de De Matos şi col., (1995) demonstrează că β-mercaptoetanolul, cisteina şi cistina adăugate pe durata MIV îmbunătăţeşte rata dezvoltării embrionare. Mediul MIV suplimentat cu

o concentraţie crescută de glucoză în atmosferă de 20% O 2 , împiedică dezvoltarea competenţei oocitelor ca rezultat

al creşterii ROS (reactive oxygen species) şi scăderii GSH. Cantitatea redusă a anionului superoxid (O 2 - ) are efect benefic pentru oocite în timpul MIV. Efectul antioxidanţilor extracelulari este anulat de celulele cumulus cu rol protector, izolând oocitele de mediul extracelular. Numeroase studii au raportat efectul benefic al SOD în dezvoltarea embrionilor in vitro (Thompson şi colab., 1996). Efectul pozitiv al SOD este observat când embrionii sunt culturaţi în mediu ce conţine o concentraţie crescută de glucoză (5,56- 8,3 mM) şi o atmosferă ridicată de O 2 (Thompson şi colab., 1991). Tehnicile de maturare a oocitelor in vitro (MIV) prin care s-au obţinut miei şi iezi, au fost simplificate şi ameliorate pe măsură ce cunoştinţele despre maturare a oocitelor şi despre primele stadii de dezvoltare embrionară au avansat. După FIV şi culturarea embrionilor timp de o săptămână, 50- 75% pentru oocitele maturate in vitro se dezvoltă până la stadiul de blastocist comparativ 70-80% din oocitele maturate in vivo. Există două strategii de dezvoltare a randamentului pentru oocitele maturate in vitro. Prima constă în selectarea oocitelor cu competenţe de dezvoltare şi cea de a doua constă în adaptarea unui mediu de maturare pentru nevoile oocitelor. Competanţa oocitelor se termină spontan, după maturarea nucleilor în meioză, foliculii rezultaţi au diametul mai mare de 2 mm. Competenţa de dezvoltare (maturare citoplasmatică) creşte progresiv cu mărimea foliculului pentru oocitul respectiv (Cognie şi colab., 1998).

Capitolul 3. Capacitarea şi reacţia acrozomală a spermatozoizilor

In vivo spermatozoizii devin fecundabili după capacitarea lor în tractul genital feminin, în care probabil, se

elimină treptat un compus proteic numit factor de decapacitare. Aceşti compuşi sunt preluaţi din lichidul seminal

şi au rolul de a bloca acţiunea enzimelor proteolitice acrozomale.

După prelevarea spermei, se realizează diluţia, spălareade plasmă seminală şi centrifugarea spermatozoizilor. Sedimentul astfel obţinut este suspendat în mediul de capacitare. Concentraţia finală trebuie să fie de 5.000 - 10.000 de spermatozoizi mobili pe 1 ml. Se consideră că hipotonia mediului ar fi cea care induce capacitarea in vitro, prin înlăturarea compuşilor proteici de pe suprafaţa spermatozoizilor. Capacitarea

spermatozoizilor se desfăşoară timp de 1 oră sau 1 oră şi 30 minute, la 38,5 o C în atmosferă uscată controlată de 5% CO 2. Capacitarea reprezintă totalitatea transformărilor suferite de spermatozoizi în timpul rezidenţei în tractul genital femel în scopul obţinerii capacităţii fecundante. Rezultatul capacitării este creşterea şanselor spermatozoizilor de a lua contact cu ovulul şi de a penetra zona pellucida. Transformările suferite de spermatozoizi în procesul de capacitare sunt:

- îndepărtarea factorului decapacitor, deoarece glicoproteinele prezente la suprafaţa spermatozoizilor interferează fecundarea. - reacţia acrozomului, care are ca efect eliberarea unor enzime hidrolitice (hialuronidaza şi acrozina) cu rol în penetrarea zonei pellucida a ovulului - intensificarea respiraţiei, a glicolizei şi a ciclului acizilor tricarboxilici. În timpul fertilizării in vitro a oocitelor, spermatozoizii au două funcţii importante:

transmit oocitului setul haploid de gene necesar unei dezvoltări normale;a oocitelor, spermatozoizii au două funcţii importante: induc activarea oocitului şi iniţiază ulterior procesele

induc activarea oocitului şi iniţiază ulterior procesele metabolice caracteristice dezvoltării embrionare. Mulţi cercetători au studiat în detaliu funcţia spermatozoizilor în fertilizare şi principalele procese care . Mulţi cercetători au studiat în detaliu funcţia spermatozoizilor în fertilizare şi principalele procese care preced capacitarea (Bedford, 1991, 1994; Sidhu şi Guraya, 1989; Yamaginachi, 1994, Zamfirescu şi Anghel, 1994; Cojocaru şi colab., 1995). La mamiferele placentare, după ovulaţie în mod normal, ovulul are un înveliş alcătuit dintr-o substanţă de natură extracelulară numită zona pellucida şi este înconjurat de o masă întinsa de celule granuloase, foliculare cunoscute sub denumirea de cumulus. Pentru a fertiliza ovulul, spermatozoidul trece printre celulele cumulus şi penetrează zona pellucida. După ce are loc fuziunea celor două celule sexuale sunt iniţiate procesele nucleare şi citoplasmatice ce constituie activarea oocitului, care va duce în final la singamie şi la dezvoltarea zigotului. Pentru fertilizare sunt esenţiale două funcţii ale spermatozoizilor: exocitaza acrozomală (reacţia acrozomală) şi expresia mişcării hiperactive a flagelului flexibil (motilitatea hiperactivă). Reacţia acrozomală expune conţinutul acrozomului (component al spermatozoidului cu ajutorul căruia pătrunde în ovul în timpul fecundaţiei) enzimelor hidrolitice care lizează componentele zonei pellucida şi fac posibilă penetrarea. Exocitoza acrozomală favorizează fuziunea membranei plasmatice din regiunea ecuatorială a capului spermatozoidului cu plasmalema oocitului. Motilitatea hiperactivă generează o împunsătură extraprogresivă, care se consideră a fi fundamentală pentru penetrarea zonei pellucida, pentru că ajută spermatozoidul să pătrundă printre celulele cumulus. La contactul cu membrana ovulului spermatozoizii reacţionează prin proiectarea filamentului acrozomului în partea anterioară a capului şi, în general, spre vitelus însoţită, de modificări ale formei acrozomului. Deseori se produce şi o schimbare simultană a poziţiei piesei intermediare. Toate aceste perturbări de formă şi structură pe care celula spermatică le suferă în prezenţa oocitului au fost denumite reacţia acrozomului. La spermatozoizii care sunt încă mobili se poate observa o ridicare evidentă a acrozomului, pierderea contrastului vizual şi, mai târziu, o detaşare parţială ori chiar completă a structurilor membranoase. Procesul acrozomal eliberează agentul litic (enzima hialuronidaza) ce ajută la penetrarea zonei pellucida şi la dobândirea propietăţilor necesare spermatozoidului pentru a fuziona cu membrana plasmatică a ovulului (Yanagimachi, 1994). O fertilizare eficientă presupune fuziunea unui singur spermatozoid cu oocitul. Contactul ovulului cu mai mult de un spermatozoid – polispermia – conduce în mod inevitabil la moartea embrionului. La numeroase mamifere (şobolan, şoarece, iepure, cârtiţă) blocarea polispermiei are un rol important deoarece în spaţiul perivitelin al oocitelor în curs de fecundare se găsesc, deseori, spermatozoizi suplimentari.

La hamster chinezesc, câine, oaie, porc şi om, oocitele în curs de fecundare prezintă foarte rar spermatozoizi suplimentari şi trebuie să aibă un mecanism care să împiedice aceşti spermatozoizi suplimentari să pătrundă în spaţiul perivitelin. La aceste animale este evident că se produce o schimbare în zona pellucida care o face impermeabilă pentru spermatozoizi, schimbare denumită reacţie zonală. Oocitele de mamifere posedă două mecanisme de protecţie împotriva polispermei cu importanţă diferită în funcţie de specie. Reacţia zonală, la fel ca şi blocarea polispermiei, are caracterele unei schimbări propagate dar, mecanismul său precis de producere este încă un subiect de discuţie.

Capitolul 4. Fecundaţia in vitro a oocitelor la micile rumegătoare

Fecundaţia in vitro se efectuează prin introducerea oocitelor maturate în mediul de cultură, în care se adaugă spermatozoizii capacitaţi. Mediile de fertilizare conţin o serie de substanţe necesare procesului de

fertilizare cum ar fisăruri minerale, aminoacizi esenţiali şi neesenţiali, piruvat sau lactat de sodiu, substanţe energetice, albumină serică sau ser matern inactivat şi hormoni estrogeni sau gonadotropine; pH mediului este uşor alcalin. Spermatozoizii şi oocitele se culturează în atmosferă controlată timp de 24 de ore (umiditate 98%, CO 2 5%, temperatură 38,5%). Pe această cale, fecundaţia efectuată nu diferă de aceea in vivo şi rezultatele pozitive sunt în proporţie de 50-78%. După fecundaţie, începe faza de segmentaţie care se desfăşoară normal la aproximativ

90% din oocitele fertilizate. La 52 de ore după fecundaţie, se formează patru blastomerela 68 ore - 8 blastomere, la 78 ore- 16 blastomere. În zile a 4 şi a 5 se face trecerea de la stadiul de morulă compactată la stadiul de blastocist, evoluţia corespunzând strict celei in vitro. Ultima etapă o constituie transferul în uterul femelelor al zigotului sau embrionului FIV. Unii cercetători pledează pentru transferul timpuriu, în faza de 4 blastomere, deoarece menţinerea prelungită a zigotului în mediul de cultură ar putea fi defavorabilă dezvoltării embrionare ulterioare (Cognie, 1998).

4.1 Fertilizarea oocitelor de oaie in vitro

Cunoştinţele acumulate despre creşterea foliculară, maturarea oocitară, fecundarea in vitro şi dezvoltarea embrionilor în cultură au fost posibile datorită tehnicilor de biologie moleculară cunoscute (Thibault, 2001). Aceste cunoştinţe au simplificat tehnicile, făcându-le operaţionale şi la micile rumegătoare. Producerea de embrioni in vitro este o alternativă la producerea embrionilor care facilitează utilizarea noilor biotehnologii.

Oussaid şi colab, 1999, au testat efectul administrării Gn-RH în mediu de cultură asupra capacităţii de fertilizare a oocitelor. Ovarele au fost colectate de la animale sacrificate în abator. Complexul cumulus- oocit a fost maturat timp de 24 ore în mediu TCM-199 suplimentat cu 10% ser fetal bovin, FSH şi LH, sub ulei de parafină la 38,5 0 C, în atmosferă umidificată cu 5% CO 2 . Spermatozoizii utilizaţi pentru fertilizarea in vitro au fost separaţi printr-un gradient de densitate şi apoi incubaţi în soluţie de heparină sodică (10µl/ml). Fertilizarea in vitro a oocitelor a fost realizată în mediu Fert-TALP suplimentat cu 6 mg/ml BSA, 0,2 mg/ml epinefrină, 1 mg/ml hipotaurină. Gonadotropina a fost adăugată în mediu de culturare într-o concentraţie de 0,8 µg/ml. După 20 de ore, celulele cumulusului au fost îndepărtate prin vortexare, iar zigoţii au fost culturaţi în mediu SOF suplimentat cu albumină serică bovină şi aminoacizi, acoperit de un film de ulei de parafină, în atmosferă de 0 2 redus 5%. Numărul blastociştilor a atins un număr record în a 7-a zi de postfertilizare. După naşterea primilor miei prin fertilizare in vitro (Crozet, 1987) această tehnică a fost simplificată şi ameliorată pe măsura cunoştinţelor ştiinţifice dobândite în domeniul maturării oocitare şi a primelor stadii de dezvoltare embrionară. Oocitele reprezintă expresia potenţialului reproducător al femelelor şi al ameliorării, iar cunoaşterea maturării oocitare, fertilizarea in

vitro a oocitelor şi dezvoltarea in vitro a culturii embrionilor, congelarea şi transferul de embrioni la receptoare, constituie un avantaj în cunoaşterea reproducţiei la animale.

Realizările obţinute au permis amplificarea folosirii biotehnologiilor in vitro în zootehnie şi cunoaşterea patologiilor reproducţiei animalelor. În practică se pot considera trei etape distincte ale acestei producerii in vitro a embrionilor (PIV): maturarea in vitro a oocitelor (MIV), fecundarea in vitro a oocitelor (FIV) şi dezvoltarea in vitro (DIV) a zigoţilor obţinuţi până la stadiul blastocist pentru realizarea transferului la o femelă receptoare.

La unele specii se cunoaşte faptul că transferul embrionilor produşi in vitro care au fost cultivaţi în prezenţa serului poate duce la obţinerea unor descendenţi foarte dezvoltaţi (de dimensiuni mari) şi că aceasta este asociată cu mărirea duratei de gestaţie şi creşterea mortalităţii postnatale datorită incidenţei mari a distociei. Apariţia

descendenţilor foarte mari (7 kg) este considerabil redusă atunci când serul este înlocuit în faza de cultură postfertilizare in vitro cu aminoacizi şi albumină, sugerând existanţa în ser a unor factori mitogenici foarte activi (Sinclair şi colab., 1999). Dezvoltarea embrionară poate fi influenţată de alterarea metabolică sau de intensificarea răspunsului mediat de factorul de creştere. Embrionii cultivaţi în prezenţa a 20% ser fetal de vacă (FCS) conţin în citoplasmă un număr sporit de picături lipidice de dimensiuni mari, care se crede că apar datorită deteriorării funcţiei mitocondriale. Nu toţi embrionii de oaie cultivaţi în prezenţa serului (de oaie) conduc la obţinerea unor descendenţi de dimensiuni mari, aşa cum nici cultivarea embrionilor de oaie într-un mediu conţinând aminoacizi + BSA nu elimină complet incidenţa apariţiei mieilor cu dimensiuni mari. Rămân încă neelucidate cauzele care determină ca unii embrioni să fie mai susceptibili decât alţii la factorii care produc intensificarea diviziunii celulare in vitro şi efectele acestora în uter (Pareira, 1995). Există puţine informaţii publicate privind creşterea şi dezvoltarea postnatală a unor asemenea descendenţi de dimensiuni mari. S-a studiat eficacitatea unui sistem de cultivare in vitro pentru producerea embrionilor de oaie, sistem în care s-au utilizat ca sursă de proteină serul ovin, comparându-se viabilitatea embrionilor obţinuţi din oocitele recoltate de la oi adulte cu a celor obţinuţi din oocitele recoltate de la mieluţe. S-au evaluat rata de gestaţie a oilor receptoare, greutăţile la fătare, ratele de supravieţuire şi de creştere a mieilor rezultaţi, obsevându-se că aceştii parametrii au fost mai crescuţi în cazul folosirii oocitelor recoltate de la oile adulte. Producţia redusă de blastocişti din oocitele recoltate de la mieluţe este asociată cu gradul de dezvoltare a foliculilor ovarieni şi a oocitelor din aceştia, care variază corespunzător expunerii anterioare la gonadotropine endogene. Tratamentul cu gonadotropine a tineretului femel ovin şi bovin a indus maturarea oocitelor in vivo astfel încât un procent mare din acestea sunt fertilizate şi formează blastocişti atunci când ele sunt recoltate şi cultivate in vitro. Prin urmare sistemul de cultură este benefic prin creşterea cantităţii de gonadotropine din mediul de maturare şi/sau mărirea timpului de maturare in vitro care să conducă la maximizarea numărului de oocite viabile pentru cultură recolate de la mieluţe. Producţia de blastocişti obţinuţi din oocitele recolate de la mieluţe a fost redusă, competenţa lor de dezvoltare în uter (din punctul de vedere al ratei de gestaţie şi al procentului de embrioni transferaţi care au devenit fetuşi) a fost mai mare decât a celor transferaţi şi produşi din oocitele recoltate de la oile adulte (Sinclair şi colab., 1999). Un procent mai mare de miei (în special gemeni) obţinuţi din prima sursă de oocite (mieluţe) au supravieţuit la înţărcare (81% faţă de 12,5%), reprezentând un indiciu al viabilităţii mai mari al acestor embrioni. Competenţa de dezvoltare, aparent mai mare, a blastociştilor produşi din oocitele recoltate de la mieluţe poate fi o consecinţă a ratei mai lente de dezvoltare a acestora, însă nu se cunoaşte exact modul în care această rată poate influenţa viabilitatea embrionară (Zamfirescu şi colab., 2001). Există diferenţe în cazul procedurilor şi a componentelor

utilizate în cadrul diferitelor sisteme de embriocultură şi a variaţiei privind calitatea oocitelor din ovarele obţinute de la abatoare, ratele actuale ale FIV şi ale producţiei de blastocişti viabili în ziua a 7-a – a 8-a de cultură (utilizând oocitele de la oile mature) sunt comparabile cu cele rezultate din sistemele iniţiale de cultură în care s-au utilizat ca sursă de proteină, serul uman, FCS sau serul de oaie. Rezultate bune au fost obţinute folosindu-se mediul SOF (fluid sintetic din oviduct) îmbogăţit cu ser, pentru culturarea in vitro a embrionilor de oaie. Cercetările efectuate arată că acest mediu permite ca peste 80% din embrioni cu 2-4 celule să se dezvolte la stadiul de blastocist în timpul a 6 zile de cultură, dar cu o slabă supravieţuire după transfer. Dezvoltarea embrionilor în mediul de cultură fără ser se face pentru aprecierea stadiului de dezvoltare şi îmbunătăţirea eficienţei procedeelor de MIV şi FIV. Datele experimentale arată că embrionii ovini pot fi culturaţi în mediu simplu mai eficient decât în M199 condiţionat. Condiţiile specifice de mediu din oviductul de oaie asigură dezvoltarea embrionilor de la stadiul de 2-4 celule. Proporţia embrionilor care se dezvoltă normal într-o cocultură cu substrat celular din oviduct (CC) sau mediul condiţionat din oviduct (CM) este similar şi la bovine. Complexele cumulus - oocite au fost recuperate din ovarele de la animale sacrificate, fiind maturate 24 de ore în mediu B 2 Menezo suplimentat cu 10% lichid folicular ovin, LH, FSH şi E 2 la temperatura de 39 0 C. După o oră de capacitare a spematozoizilor congelaţi - decongelaţi (concentraţie 1 x 10 6 spermatozoizi) au fost puşi în contact cu oocitele MIV denudate în 1ml mediu BSA + 20% ser estral de oaie. După FIV oocitele au fost fixate pentru aprecierea ratei de fertilizare (Mermillod şi colab.,

1996).

4.2 Fertilizarea oocitelor de capră in vitro

Biotehnologiile FIV sunt esenţiale pentru clonarea embrionilor de capră, pentru transferul de gene şi pentru obţinerea de gemeni identici iar în ultimul timp şi pentru obţinerea de celule stem. Modificările biotehnologice au avut un impact important asupra calităţii laptelui şi cărnii de capră: carnea de capră de tip „broiler” conţine o cantitate scăzută de lipide, fosfor şi vitamina B12, însă conţine mai mult calciu, potasiu, tiamină (Fieni, 1991), iar laptele de capră este tot mai mult apreciat datorită calităţilor dietetice şi antialergice pe care le posedă. Conservarea şi transferul de embrioni la capră a fost cercetat şi extins şi în Europa de Chemineau (1986, citat de Zamfirescu şi Şonea, 2004), concluzionând că metodele de superovulaţie şi tehnologiile de crioconservare permit obţinerea de rezultate bune. Ratele de gestaţie care se obţin la capră după transferul de embrioni sunt de 55- 75% iar supravieţuirea embrionilor este de 53-60%. Primii iezi normali rezultaţi din embrioni FIV au fost obţinuţi de Crozet (1987). Competenţa de dezvoltarea a oocitelor de capră provenite din diferite categorii de mărimi ale foliculilor ovarieni a fost studiată de Crozet (1987). Oocitele sunt colectate din foliculi ovarieni de mărime cunoscută, din ovarele femelelor abatorizate. Astfel oocitele s-au colectat din foliculi de 2- 3 mm (foliculi mici),

3,1-5 mm (foliculi medii) şi 5 mm (foliculi mari), fiind selectate oocitele cu cumulus compact. În funcţie de dimensiunea foliculilor oocitele s-au maturat în proporţie de 70%, 80% şi 97% aflate în metafaza II. După MIV (24 ore) acestea sunt fecundate (24 ore) apoi se dezvoltă timp de 7 zile in vitro. Rata oocitelor ce ating stadiul de blastocist după dezvoltare in vitro este de 25-30%, acest procentaj reflectând lipsa de competenţă a dezvoltării in vitro a oocitelor. Embrionii clivaţi din foliculi mici s-au oprit din dezvoltare la stadiul de 8- 16 celule într-o proporţie de 84% faţă de 53%, 45% şi 39% cât s-a realizat din oocitele colectate din foliculii medii, mari. Proporţia de morule şi blastocişti obţinută a fost de 10% şi 6% din foliculii mici, 35% şi 12% din foliculii medii şi 29% şi 26% din foliculii mari.

O sursă importantă de oocite pentru FIV o reprezintă mieluţele sacrificate. Colectarea de oocite de la femele prepubertate este o metodă de creştere a sporului genetic ca urmare a reducerii intervalului între generaţii.

O serie de cercetări au prezentat abilitatea de dezvoltare a oocitelor prepubertale la oaie, observând că are loc

maturarea nucleară la fel ca la oocitele recoltate de la femelele adulte, însă ratele de fertilitate şi dezvoltare sunt

mai reduse. Aceeaşi calitate este atribuită maturării anormale a citoplasmei (Graff, 2000). Tot Crozet (1987) arată că prin superovularea ieduţelor cu FSH se obţine o medie de 9 complexe oocite- cumulus/ ovar. În ceea ce priveşte maturarea în cultură a oocitelor şi a embrionilor de capră, Zamfirescu (1997) recomandă folosirea de lichid folicular caprin şi FSH ovin (100ng/ml). Capacitarea spermatozoizilor de ţap

congelaţi-decongelaţi se realizează în mediu TALP (soluţie Tyrode cu 3% BSA, lactat, piruvat). Adăugarea de heparină în mediul de fertilizare ce conţine ser de oaie, măreşte capacitatea de penetrare a spermatozoizilor (Alok, 2001). Embrionii FIV (morule sau blastocişti) s-au dezvoltat bine în coculturi cu celule oviductale însă după anul 1996 s-au elaborat tehnologii de culturare în mediu sintetic SOF (syntetic oviduct fluid) suplimentat cu aminoacizi

şi ser în atmosferă controlată (5% oxigen, 5%CO 2 , 90%N 2 ). În aceste condiţii s-a realizat în prezent o dezvoltare

oocite- morule- blastocişti de 56% şi s-au simplificat şi metodele de culturare ale acestora. FIV la capră este influenţată de mai mulţi factori: se pare că nu există diferenţe semnificative între ratele de maturare ale oocitelor indiferent dacă sunt maturate la 24, 27 sau 30 de ore dar ratele de fertilizare scad semnificativ. Rate mari de morule - blastocişti s-au obţinut din oocite maturate timp de 24-27 de ore, iar rate

scăzute au fost obţinute din oocite maturate timp de 21 ore sau timp de 30 de ore. Ratele de fertilizare morule - blastocişti din oocitele cumulus-expandat de 3-4 grade au fost mai mari decât la oocitele cu grade de expandare 0

şi 1. Îndepărtarea mecanică a celulelor cumulus înainte de maturarea in vitro afectează fertilizarea in vitro şi

dezvoltarea în morule – blastocişti, la capră. Îndepărtarea completă sau parţială a celulelor cumulus înainte de fertilizare nu a afectat rata de fertilizare şi clivajul oocitelor, însă aceasta a fost afectată dacă celulele granuloase sunt îndepărtate înainte de maturare. În ceea ce priveşte congelarea embrionilor obţinuţi prin FIV la capră, rezultatele sunt satisfăcătoare. Factorii care influenţează rata de supravieţuire sunt: timpul şi concentraţia crioprotectorului şi rata de congelare – decongelare. După transfer la receptoare morulele FIV determină o rată de

gestaţie de 11 % cu o supravieţuire embrionară de 3 %, în timp ce blastociştii FIV determină o rată de gestaţie de 90% şi o supravieţuire embrionară de 47 % (Nowshari, 1995). Comparând rezultatele după transferul de embrioni FIV congelaţi-decongelaţi s-a constatat că transferul a 24 de embrioni la 12 capre a determinat o gestaţie de 54 % când s-au transferat morule şi 75 % când embrionii transferaţi au fost în stadiul de blastocist.

O dată cu dezvoltarea tehnologiilor de manipulare in vitro a embrionilor, a crescut şi necesitatea de evaluare

a viabilităţii acestora (măsura obiectivă a capacităţii de dezvoltare a embrionilor) care duce la creşterea şi

accelerarea progresului genetic selectiv la animale, prin utilizarea embriotransferului şi a biotehnologiilor asociate,

a crioprezervării şi manipulării genetice şi a procedurilor de manipulare in vitro. Multitudinea de factori care influenţează ratele de transformare a oocitelor în morule şi blastocişti determină elaborarea unor tehnologii proprii pentru fiecare din laboratoarele ce studiază această problemă. Concluziile multor cercetări demonstrează că specia caprină a crescut numeric pe plan internaţional cu peste 15 % în ultimii ani, existând aproximativ 750 milioane de capre. Selecţia şi ameliorarea continuă a caprelor pentru lapte folosind biotehnologii avansate de reproducţie au condus la crearea de populaţii superspecializate pentru producţia de lapte (Alpină, Saanen), pentru carne (Boer) şi pentru fibră mohair (Angora şi Cashmire). Biotehnologiile asociate transferului de embrioni au un rol important în reproducţie, putând să crească sporul genetic cu 15 – 40 % în turmele mici şi peste 100% în turmele mari. Ţinând

cont de rezultatele prezentate în domeniul biotehnologiilor avansate se consideră că acestea pot fi cercetate în condiţiile specifice ţării noastre şi aplicate la speciile caprină şi ovină pentru ameliorarea rapidă a raselor locale pentru lapte sau carne.

PARTEA A II-A CONTRIBUŢII PERSONALE

CAPITOLUL 1. MATERIALE, METODE ŞI TEHNICI DE LUCRU

Cercetările ştiinţifice s-au realizat în cadrul Laboratorului de Reproducţie şi Biotehnologii, Institutul de Cercetare- Dezvoltare pentru Creşterea Ovinelor şi Caprinelor, Palas, Constanţa, sub îndrumarea prof. univ. dr. Zamfirescu Stela.

1. FERTILIZAREA IN VITRO A OOCITELOR DE LA MICILE RUMEGĂTOARE RECOLECTATE PRIN METODA CHIRURGHICALĂ

Animale

Cercetările ştiinţifice din experimentul 1 s-au realizat pe două loturi experimentale de oi, în perioadele 5.02 - 28.03.2007, prin stimularea hormonală a oilor de rasă Merinos de Palas (n=7), în vârstă de 4-7 ani care au făcut obiectul reformei datorită vârstei, reproducţiei sau stării de sănătate. În cazul loturilor experimentale de capre, cercetările ştiinţifice s-au realizat pe patru loturi experimentale în perioada 20.04. - 25.07.2007, prin colectarea de oocite de la capre rasa Carpatină (n=9) stimulate hormonal. Animalele supuse tratamentelor hormonale aparţin Laboratorului de Reproducţie şi Biotehnologii din cadrul Institutului de Cercetare- Dezvoltare pentru Creşterea Ovinelor şi Caprinelor, Palas, Constanţa. Tratamentele hormonale s-au aplicat diferenţiat pe două serii experimentale. Seria experimentală 1 de oi a fost supusă unui tratament de superovulaţie cu eCG 500 UI prin injectare la 7 zile, după aplicarea bureţilor vaginali. Pentru două oi din seria experimentală 1 (numerele matricole 83045 şi 43001) s-a aplicat un tratament de superovulare cu FSH, fiind injectate cu doze de 25 UA administrate în concentraţii descrescătoare de 12,5 UA, 8,34 UA şi 4,16 UA de FSH dimineaţa şi seara, timp de trei zile (în a 12, 13, 14-a zi). Celelalte două oi din seria experimentală 1 (numerele matricole 01487 şi 33044) sunt tratate superovulator în ziua a 14 –a cu eCG 1000 UI odată cu retragerea bureţilor vaginali. Oile din a II-a serie experimentală (numerele matricole 03061, 00045 şi 03001) au fost tratate pentru superovulaţie cu FSH, folosindu- se aceleaşi doze ca în cazul lotului 1 experimental. Rezultatele obţinute s-au comparat cu oile martor cărora li s-au introdus bureţi Chronogest, iar după scoaterea bureţilor li s-a administrat de 400 UI de eCG.

La capre, tratamentul hormonal s-a aplicat diferenţiat la 4 variante experimentale, astfel:

Caprele din loturile experimentale 1 şi 3 au fost supuse unui tratament de superovulaţie cu FSH 25 mg doză totală, iar caprele din loturile experimentale 2 şi 4 au fost supuse unui tratament de superovulaţie cu PMSG (1000 UI). Toate caprele din aceste loturi experimentale s-au injectat la 7 zile, după aplicarea bureţilor, cu eCG în doză de 1000 UI. Caprele din loturile experimentale 1 şi 3 ( numere matricole 29514, 29520, 29509 şi 29518), s-au injectat cu 6 doze descrescătoare de FSH, respectiv de 6,25; 6,25; 4,17; 4,17; 2,8 şi 2,8 UA de FSH dimineaţa şi seara, timp de trei zile. Caprele din loturile experimentale 2 şi 4 (numerele matricole 29513, 29507 şi 09503) s-au

tratat în ziua a 14 –a cu eCG 1000 UI după retragerea bureţilor vaginali. Caprele martor (n=2, 19502 şi 09508) au fost supuse tratamentului progesteronic pentru inducerea estrului (Bureţi Chronogest 11 zile şi eCG 400 UI). Prepararea mediilor de recoltare, maturare şi fertilizare a oocitelor Mediu de colectare: În tuburi Falcon se introduc 23 ml HAM, 45 ml TCM 199 şi 10 μg/ml streptomicină, apoi se incubează la temperatura de 37 0 C într-un incubator cu atmosferă controlată de 5% CO 2 . Se adaugă 2 μl heparină pentru fiecare 1 ml mediu de colectare. Mediu de maturare: În tuburi Falcon se introduc 9,0 ml TCM 199, 4,6 ml HAM şi 0,2 ml lichid folicular. Mediu de spălare: În tuburi Falcon se pun 10 ml TCM 199, 4 μl gentamicină. Mediul de spălare se introduce în plăci Petri, apoi sunt incubate la temperatura de 38 0 C, în atmosferă controlată de 5% CO 2 .

Mediu de fertilizare - SOF:

Se aleg 2 vase Erlenmayer cu dopuri sterile- unul de 500 ml şi altul de 250 ml. În cel de 250 ml se pun 125

ml apă distilată, în care se dizolvă 0,126 g CaCl 2 x 2 H 2 O, se agită, apoi se dizolvă 0,0049g de MgCl 2 x 6 H 2 O. În

vasul Erlenmayer de 500 ml se pun 250 ml apă distilată şi se dizolvă pe rând 3,147 g NaCl, 0,267 g KCl, 0,0081 g

KH 2 PO 4 , 1,053 g Na HCO 3 , 141μl lactat de natriu, 0,0017 piruvat de natriu, 0,65 ml roşu fenol, 10 ml aminoacizi

esenţiali şi 5 ml de acizi neesenţiali. Seomogenizează. Se scoate flaconul de glutamină de la frigider, se încălzeşte şi se măsoară 2,5 ml. Conţinutul primului vas se transvazează în cel de al doilea, se amestecă foarte bine. Se toarnă conţinutul într-un cilindru gradat şi se ajustează până la 500 ml cu apă distilată. Se măsoară 125 ml mediu SOF şi

se pun într-un vas şi se adaugă 0,037g BSA. Se măsoară presiunea osmotică pentu mediul cu BSA la un

osmometru. Presiunea osmotică trebuie să se încadreze între valorile 280-320 mosmoli. Valoarea presiunii osmotice obţinute de noi este de 285 mos. Se măsoară pH, care trebuie să fie între 7,2-7,3. Recoltarea oocitelor de capră şi oaie prin metoda chirurgicală Femelele au fost supuse unei anestezii totale cu xilazină. Acestea sunt toaletate şi dezinfectate la locul de elecţie cu betadină. În zona mid-ventrală s-a făcut o incizie de 5 cm cu un bisturiu electric. După scoaterea la exterior a uterului cu ovare se evaluează reacţia ovariană prin numărarea foliculilor ovarieni. Fiecare folicul a fost aspirat cu ajutorul unei seringi sterile cu ac de 18 G care conţine 2 ml mediu de spălare. Complexele oocite- cumulus sunt transportate în seringi cu mediu de colectare până în laboratorul de culturi celulare. Complexele oocite-cumulus sunt introduse în plăci Petri şi se vizualizează la stereolupa Nikon (figura 1). Se fac aprecieri asupra statusului morfo-fiziologic al oocitelor, eliminându-se oocitele degenerate. Complexele oocite-cumulus se spală de 3-4 ori în mediu de spălare, apoi sunt introduse în mediu de maturare. Se incubează 24 de ore la temperatura de 38 0 C, umiditate 98-100%, în atmosferă controlată de 5% CO 2 .

Prepararea mediului de capacitare

Într-un tub Falcon se pun 10 ml ser ovin estral 10%, apoi se adaugă 25 ml mediu SOF fără BSA şi 4 μg/ml streptomicină. Se filtrează mediul de capacitare cu un fitru micropor montat la seringă, apoi mediul este transferat într-un alt tub Falcon steril. Se decongelează 2 paiete cu spermă de berbec şi ţap, menţinându-se 2 minute la temperatura de 38 0 C. Se depozitează conţinutul celor două paiete cu spermă în 2 tuburi Falcon cu gradient Percoll şi se centrifughează la 900 g timp de 10 minute. Spermatozoizii morţi se găsesc la suprafaţă, iar cei vii se găsesc pe fundul tubului Falcon. Se aspiră mediul Percoll împreună cu spermatozoizii morţi, apoi operaţia de centrifugare se mai repetă încă o dată, dar în mediu HAM, timp de 5 minute.

Figura 1: Recuperarea şi vizualizarea la stereolupă a complexelor oocite-cumulus de oaie şi capră (Laboratorul

Figura 1: Recuperarea şi vizualizarea la stereolupă a complexelor oocite-cumulus de oaie şi capră (Laboratorul de embriologie- ICDCOC Palas, Constanţa)

Fertilizarea in vitro a oocitelor de oaie şi capră

Câteva plăci Petri cu oocite de oaie şi capră sunt scoase din incubator şi cu aspipetorul sunt transferate oocitele în godetele altor plăci Petri cu mediu de spălare poaspăt. Din tuburile pentru capacitare spermatozoizilor se iau spermatozoizi din fracţiunea superioară şi se vizualizează la microscop, evaluându-se viabilitatea lor. O picătură de 50 μl mediu cu spermatozoizi capacitaţi corespunde pentru 20-30 oocite maturate. Oocitele maturate selectate pentru fertilizarea in vitro sunt introduse în plăci Petrii cu godete cu mediu SOF, peste care se adaugă 50 μl mediu cu spermatozoizi capacitaţi, incubându-se la temperatura de 38 0 C, în atmosferă controlată de 5% CO 2 . În plăcile Petrii de fertilizare se adaugă 50 μl mediu cu spermatozoizi capacitaţi pentru a se obţine o concentraţie optimă de 1x 10 6 spermatozoizi/ml. După 18 ore de la contactul oocitelor de capră sau oaie cu spermatozoizii de ţap sau berbec, oocitele sunt spălate şi sunt introduse în mediu de cultură. 2. INFLUENŢA SUCURILOR NATURALE ASUPRA CAPACITĂRII SPERMATOZOIZILOR DE BERBEC ŞI ŢAP Obiectivul cercetărilor ştiinţifice efectuate în perioada 5.08.- 15.08.2008 a fost testarea unor medii de capacitare noi, originale, pentru capacitarea spermei de berbec şi ţap. Pentru capacitarea spermatozoizilor de berbec şi ţap s-au realizat 15 variante experimentale de medii, dintre care 12 sunt bazate pe sucuri naturale. Primele 6 variante experimentale au avut ca mediu de bază, mediu TCM 199 şi 10 μg/ml gentamicină fiind suplimentate cu 10% suc de: măr, castravete, portocală, grefă, kiwi şi morcov. Alte 6 variante de medii pe baza de sucuri naturale au avut ca mediu elementar, mediu RPMI şi 50 μl FSH şi aceleaşi sucuri naturale menţionate anterior. Alte 3 medii de capacitare au fost: mediu TCM 199 suplimentat cu 10% ser estral ovin, mediu RPMI suplimentat cu 50 μl FSH şi 10 μg/ml gentamicină şi mediu RPMI suplimentat cu 50 μl EGF şi 10 μg/ml gentamicină. Sucurile naturale au fost obţinute cu ajutorul unui storcător de fructe, sucul integral obţinut s-a filtrat prin filtru dublu, apoi sau întrebuinţat proaspăte sau congelate, nediluate.

Au fost testate 5 variante de medii de centrifugare pentru spermatozoizii de berbec şi ţap:

de centrifugare pentru spermatozoizii de berbec şi ţap: mediu TCM 199 suplimentat cu 10% ser estral

mediu TCM 199 suplimentat cu 10% ser estral ovin, 10 μl albumină serică bovină şi 10 μg /ml gentamicină; gradient Percoll 20-80%; gradient Percoll 45-90%; mediu RPMI suplimentat cu 10 μl EGF şi 10 μg/ml gentamicină; mediu RPMI suplimentat cu 50 μl albumină serică bovină şi 10 μg/ml gentamicină.

Prepararea gradientului Percoll 20-80% s-a realizat din soluţie 80% Percoll (8 ml Percoll diluat cu 2 ml ser fiziologic 9%) şi soluţie 20 % Percoll (4 ml SOF şi 1 ml soluţie Percoll 80%). În tubul Falcon cu soluţie 20% Percol se adaugă pe fundul tubului 1 ml soluţie Percoll 80% pentru realizarea gradientului. Pentru prepararea gradientului 45 - 90% Percoll se utilizează soluţie 90% Percoll (9 ml Percoll şi 1 ml ser fiziologic 9%) cu soluţie 45% Percoll (2 ml SOF şi 1 ml soluţie Percoll 90% ). În tubul Falcon cu soluţie 45% Percol se adaugă pe fundul tubului 1 ml soluţie Percoll 90% pentru realizarea gradientului. Se decongelează 20 paiete cu spermă de berbec şi ţap la temperatura de 38 0 C. Se depozitează conţinutul a câte 4 paiete cu spermă rasa Merinos de Palas sau metisi Carpatina în tuburi Falcon pentru fiecare din cele 5 medii experimentale de centrifugare. Se centrifughează la 3500 rot/min timp de 10 minute. Mediile de capacitare concepute s-au testat in vitro urmărindu-se motilitatea, viabilitatea şi indicele de supravieţuire pentru spermatozoizii utilizaţi.

3. INFLUENŢA SUCURILOR NATURALE, A HORMONILOR ŞI A FACTORILOR DE CREŞTERE ASUPRA MATURĂRII IN VITRO ŞI FERTILIZĂRII IN VITRO A OOCITELOR DE CAPRĂ

Cercetările ştiinţifice din experimentul al III-lea s-au efectuat pe capre de rasa Carpatina aparţinând unui crescător privat de ovine şi caprine, fiind sacrificate de necesitate (n= 2). După recoltarea ovarelor de capră şi transportul lor în laboratorul de culturi s-a realizat recoltarea oocitelor de capră prin puncţie foliculară şi prin secţionare seriată a ovarelor.

Prepararea mediilor pentru maturarea oocitelor de capră

S-au realizat 7 variante de medii de maturare bazate pe extracte naturale, hormoni şi factori de creştere:

1. TCM 199 (soluţie stoc 1,5 g/250dl), 50 ng/ml FSH-p, 10 ng/ml LH, 100 µl/ml estradiol şi 10% extract castravete; 2. TCM 199 (soluţie stoc 1,5 g/250dl), 50 ng/ml FSH-p, 10 ng/ml LH, 100 µl/ml estradiol şi 10% extract morcov; 3. TCM 199 (soluţie stoc 1,5 g/250dl), 20 ng/ml factor de creştere, 50 ng/ml FSH-p şi 10% extract morcov; 4. TCM 199 (soluţie stoc 1,5 g/250dl), 20 ng/ml factor de creştere, 50 ng/ml FSH-p şi 10% extract castravete; 5. Soluţie Hank’s (soluţie stoc 50 ml/500dl), 40ng/ml insulină (Actrapid), 20 ng/ml FSH-p şi 10% extract morcov; 6. Soluţie Dulbecos (soluţie stoc 2,5 g/250dl), 100 µl/ml cisteamină şi 10% extract morcov; 7. PBS 100 µl/ml cisteamină , 20 ng/ml factor de creştere şi 50 ng/ml FSH-p. Se măsoară pH, care trebuie să fie între 7,2-7,3. Ajustarea pH s- a făcut cu soluţie suprasaturată de Triss dacă pH a fost acid, iar dacă pH mediului a fost bazic, ajustarea s-a făcut cu soluţie suprasaturată de acid citric (figurile 2, 3, 4 şi 5). Medii de capacitare a spermatozoizilor de ţap Se realizează 4 variante de medii experimentale pentru studierea condiţiilor optime de capacitare a spermatozoizilor de ţap:

1. mediu PBS cu HEPES, 100 ng/ml pFSH şi 10% extract de morcov

2. mediu PBS cu HEPES, 20 ng/ml EGF şi 10% extract de castravete

3. mediu SOF suplimentat cu BSA.

4.

mediu SOF suplimentat cu BSA, 100 ng/ml Folliculotropin şi 10% castravete

Colectarea oocitelor prin puncţie şi disecţie foliculară din ovarele de la animalele sacrificate

Ovarele sunt prelevate în recipiente de sticlă cu ser fiziologic şi antibiotic (streptomicină, figura 7) la temperatura de 37 0 C. În laboratorul de culturi celulare, recipientele cu ovare sunt introduse într-o baie Marie, la temperatura de 37 0 C. Foliculii ovarieni sunt puncţionaţi şi se aspiră complexele oocite-cumulus cu ajutorul unor seringi cu ace de 18 G cu mediu de recoltare. Se evaluează numărul de oocite recoltate în funcţie de diametrul foliculilor ovarieni (figura 8). Complexele oocite-cumulus sunt examinate din punct de vedere morfo-citologic la o stereolupă Nikon, fiind apoi spălate de 3-4 ori în mediu de spălare, apoi sunt introduse în mediu de maturare (figurile 9 şi 10).

sunt introduse în mediu de maturare (figurile 9 şi 10). Figura 2: Pregătirea şi sterilizare cu

Figura 2: Pregătirea şi sterilizare cu radiaţii UV a materialelor de lucru pentru realizarea mediilor de recoltare, maturare, fertilizare a oocitelor (laborator FIV, ICDCOC Palas, Constanţa)

a oocitelor (laborator FIV, ICDCOC Palas, Constanţa) Figura 4: Recoltarea oocitelor din foliculii ovarieni de la

Figura 4: Recoltarea oocitelor din foliculii ovarieni de la caprele sacrificate (laborator FIV, ICDCOC Palas, Constanţa)

sacrificate (laborator FIV, ICDCOC Palas, Constanţa) Figura 3: Prepararea mediilor de recoltare şi maturare a

Figura 3: Prepararea mediilor de recoltare şi maturare a oocitelor de capră (laborator FIV, ICDCOC Palas, Constanţa)

de capră (laborator FIV, ICDCOC Palas, Constanţa) Figura 5: Recoltarea oocitelor de capră prin disecţie

Figura 5: Recoltarea oocitelor de capră prin disecţie foliculară şi puncţie foliculară (laborator FIV, ICDCOC Palas, Constanţa)

Maturarea in vitro a oocitelor de capră

Pentru maturare oocitele recoltate din ovarele prelevate de la caprele sacrificate au fost selectate din punct

de vedere morfologic. Oocitele trebuie să prezinte citoplasmă clară şi nucleu evidenţiat. Oocitele se lasă la incubat

timp de 17-24 ore la temperatura de 38 0 C în atmosferă controlată de 5% CO 2. Oocitele maturate cu cumulus

expandat sunt selectate pentru fertilizare in vitro. Mai întâi se îndepărtează celulele granuloase prin vortexare, iar

apoi oocitele cu citoplasmă clară, nucleu evidenţiat sunt puse în contact cu spermatozoizii capacitaţi.

Fertilizarea in vitro a oocitelor de capră

Oocitele de capră spălate sunt transferate cu ajutorul micropipetorului în plăci Petrii cu mediu de fertilizare

SOF. Se introduc la incubator la temperatura de 38 0 C în atmosferă de 5% CO 2 . Spermatozoizii de ţap viabili

capacitaţi sunt introduşi în plăcile Petrii peste oocitele de capră. Înainte de punerea în contact a spermatozoizilor

cu oocitele se observă motilitatea şi viabilitatea spermatozoizilor la microscopul optic. Din eprubetele pentru

capacitare se iau fracţiuni de spermă de ţap şi se pune pe lamă pentru vizualizează la microscop în scopul evaluării

viabilităţii spermatozoizilor de ţap. După 18 ore de la contactul spermatozoizilor de ţap cu oocitele de capră,

gameţii sunt spălaţi şi puşi în mediu proaspăt de cultură (SOF +BSA).

4. REALIZAREA DE VARIANTE EXPERIMENTALE PRIVIND PRODUCEREA IN VITRO A EMBRIONILOR DE OAIE

Cercetările ştiinţifice din experimentul al IV-lea s-au efectuat pe oi rasa Merinos de Palas aparţinând unui

crescător privat de ovine şi caprine, fiind sacrificate de necesitate (n= 3), iar recoltarea oocitelor de oaie s-a realizat

prin puncţie foliculară şi prin secţionarea seriată a ovarelor recuperate de la animale sacrificate.

Prepararea mediilor pentru maturarea oocitelor

Într-o eprubetă Falcon se pun 10 ml TCM 199 cu concentraţia soluţie stoc 1,5g/250dl. Se măsoară pH, care

trebuie să fie între 7,2-7,3 (figura 6).

Colectarea oocitelor de oaie prin puncţie şi disecţie foliculară

După scoaterea la exterior a uterului cu ovare, se recoltează ovarele de oaie, acestea fiind introduse în ser

fiziologic cu antibiotic. În laboratorul de culturi se evaluează reacţia ovariană prin numărarea foliculilor ovarieni

apoi se aspiră fiecare folicul în parte cu ajutorul unei seringi sterile cu ac de 18 G care conţine mediu de spălare.

După realizarea puncţiei foliculare, se realizează disecţia fiecărui folicul în parte cu ajutorul unui microbisturiu. Se

evaluează numărul de oocite recoltate în funcţie de diametrul foliculilor ovarieni (figura 7).

Medii de capacitare a spermatozoizilor de berbec

Se realizează 7 variante de medii experimentale pentru studierea condiţiilor optime de capacitare a

spermatozoizilor de berbec:

5. mediu PBS cu HEPES, 50 ng/ml pFSH

6. mediu Hank’s, 20 ng/ml EGF

7. mediu Dulbecos, 20 ng/ml pFSH şi 20 ng/ml LH

8. mediu complet Folliculotropin

9. mediu Hank’s, 50 ng/ml pFSH şi 50 ng/ml LH

10. mediu Hank’s, 50 ng/ml EGF

11. mediu Hank’s şi 50 ng/ml pFSH.

Figura 6: Prepararea mediilor de recoltare şi maturare a oocitelor de oaie (laborator FIV, ICDCOC
Figura 6: Prepararea mediilor de recoltare şi maturare a oocitelor de oaie (laborator FIV, ICDCOC

Figura 6: Prepararea mediilor de recoltare şi maturare a oocitelor de oaie (laborator FIV, ICDCOC Palas, Constanţa)

Mediu de fecundare in vitro a oocitelor şi de cultură a zigoţilor Pentru fetilizarea oocitelor de oaie s-a folosit mediu simplu Hank’s. Se măsoară pH, care trebuie să fie între 7,2-7,3. După 18 h de la contactul spermatozoizilor de berbec cu oocitele de oaie, gameţii sunt spălaţi şi puşi în mediu proaspăt de cultură (Hank’s+BSA+ Folliculotropin).

Figura 7: Recoltarea oocitelor din foliculii ovarieni de la oile sacrificate (laborator FIV, ICDCOC Palas, Constanţa)

CAPITOLUL 2. REZULTATE ŞI DISCUŢII

1. FERTILIZAREA IN VITRO A OOCITELOR DE LA MICILE RUMEGĂTOARE RECOLTATE PRIN METODA CHIRURGHICALĂ

După realizarea tratamentelor de superovulaţie, se apreciază reacţia foliculară atât la capre cât şi la oi (figurile 13 şi 14), apoi se realizează recoltarea complexelor oocite- cumulus de oaie şi capră prin metoda chirurgicală. Complexele oocite- cumulus de oaie şi capră se analizează din punct de vedere morfo - fiziologic cu ajutorul unei stereolupe Nikon (figurile 8 şi 9). Numărul total de complexe oocite- cumulus recoltate de la oile şi caprele supuse experimentelor cât şi caracteristicile morfo-fiziologice sunt prezentate în figurile 10 şi 11.

morfo-fiziologice sunt prezentate în figurile 10 şi 11. Figurile 8-9: Reacţia foliculară la oile şi caprele
morfo-fiziologice sunt prezentate în figurile 10 şi 11. Figurile 8-9: Reacţia foliculară la oile şi caprele

Figurile 8-9: Reacţia foliculară la oile şi caprele experimentale supuse operaţiei chirugicale de recoltare a oocitelor (Sala de operaţii- ICDCOC Palas, Constanţa)

În urma prelucrării rezultatelor obţinute în cazul recuperării oocitelor de capră şi oaie s-a observat faptul

că din foliculii ovarieni mari (diametrul de 3-7 mm) s-a recuperat un număr mai mare de complexe oocite –

cumulus viabile (n=42- oaie şi n=45 - capră) comparativ cu foliculii mici (n=23- oaie şi n=24 – capră). Oile au

reacţionat mai bine la tratamentele hormonale comparativ cu caprele, având o reacţie foliculară mai bună,

recoltându-se un număr mai mare de oocite.

mai bună, recoltându-se un număr mai mare de oocite. Figura 10: Complexe oocite –cumulus de oaie

Figura 10: Complexe oocite –cumulus de oaie

recoltate prin metoda chirurgicală

–cumulus de oaie recoltate prin metoda chirurgicală Figura 11: Complexe oocite-cumulus de capră prin metoda

Figura 11: Complexe oocite-cumulus de capră prin

metoda chirurgicală

În figura 12 sunt prezentate caracteristicile oocitelor de oaie din punct de vedere morfo-citologic,

arătându-se că procentul oocitelor cu cumulus parţial recuperate prin puncţie foliculară a fost mai mare atât pentru

foliculii mari (42,85%) cât şi pentru cei mici (60,86%) comparativ cu procentul de recuperare al oocitelor cu

cumulus total şi denudate (foliculii mari CT- 19,04% vs OD-33,33% şi foliculii mici CT- 17,39% vs OD-21,73%).

În cazul recoltării oocitelor de capră (figura 13 ) procentul de recuperare al oocitelor cu cumulus parţial a fost mai

mare pentru foliculii mari (48,88%) cât şi pentru cei mici (45,83%) în comparaţie cu procentul de recuperare al

oocitelor cu cumulus total şi denudate (foliculii mari CT- 22,22% vs OD-20% şi foliculii mici CT- 33,33% vs OD-

20,83%). Procentul de oocite atrezice recoltate a fost mai mic de 10% (4,76% - oaie şi 8,88% - capră).

70 60 50 40 30 20 10 0 CP OD CT calitatea oocitelor foliculi mari
70
60
50
40
30
20
10
0
CP
OD
CT
calitatea oocitelor
foliculi mari
foliculi mici
dimensiunile foliculilor
60 50 40 30 20 10 0 CP OD CT calitatea oocitelor foliculi mari foliculi
60
50
40
30
20
10
0
CP
OD
CT
calitatea oocitelor
foliculi mari
foliculi mici
diametrul foliculilor

Legendă: CT- oocite cu cumulus total; CP- oocite cu cumulus parţial, OD- oocite denudate.

Figura 12: Rezultatele obţinute în urma colectării

oocitelor de la oile donatoare în funcţie de calitatea

oocitelor şi de dimensiunea foliculilor

Figura 13: Rezultatele obţinute în urma colectării

oocitelor de la caprele donatoare în funcţie de calitatea

oocitelor şi de dimensiunea foliculilor

Ca metodă de recoltare a oocitelor se poate folosi metoda de aspirare prin puncţionare cu ajutorul unei pompe de vid, metodă mult mai rapidă şi eficientă decât cele clasice de aspirare cu seringa (Bols şi colab., 1996). Complexele oocite-cumulus recoltate prin puncţie foliculară in vivo de la animalele donatoare au fost supuse maturării. Pentru suplimentarea mediului de maturare s-a folosit lichid folicular (LF) şi cisteamină sau EGF (factor de creştere) pentru a se observa efectul acestora asupra calităţii complexelor oocite-cumulus recoltate. Complexele oocite-cumulus s-au menţinut în cultură pe grupe morfologice, iar oocitele degenerate au fost eliminate din experiment. Procentul de maturare al complexelor de oocite-cumulus la oi şi capre a fost de 76,24% (n=50) şi de 74,3% (n=52). Pentru maturarea complexelor de oocite-cumulus de oaie şi capră s-a folosit mediu TCM 199 suplimentat cu: 1. cu LF şi cisteamină (lichid folicular); 2. cu EGF (factor de creştere, Şogorescu şi colab., 2007). După cum se poate observa în figura 32 rata de maturare a oocitelor de oaie culturate în cele două medii de maturare a fost de 68,75% (TCM 199 suplimentat cu EGF, n=22) şi de 84,84% (TCM 199 suplimentat cu LF şi cisteamină, n=28, figura 14). În cazul maturării oocitelor de capră, rata maturării a fost de 73,52% pentru mediul de maturare TCM 199 suplimentat cu EGF (n=25) şi de 77,14% pentru TCM 199 suplimentat cu LF şi cisteamină (n=27, figura 15). Aspecte morfo-fiziologice ale maturării in vitro a oocitelor de oaie şi capră sunt reprezentate în figurile 16-17. Procentul de oocite degenerate obţinut după maturare a fost mai mic de 35% atât pentru oi (30%) cât şi pentru capre (32,69%).

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 numarul si procentul de oocite
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
numarul si procentul de oocite

Nr. OR

Nr. OM

% OM

caracteristicile oocitelor

% OA

oaie capra
oaie
capra

Legendă: Nr. OR- numărul total de oocite recoltate; % OM - procentul de oocite maturate; Nr. OM- numărul total de oocite maturate, % OA- numărul total de oocite recoltate atrezice.

Figura 14: Corelaţie între numărul de oocite maturate şi numărul de oocite recoltate la oi şi capre

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 TCM +EGF TCM +LF+CIS
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
TCM +EGF
TCM +LF+CIS
medii de maturare
oaie
capra
procentul de oocite maturate

Legendă: TCM +LF+CIS- procentul de oocite maturate în mediul TCM 199 suplimentat cu LF şi cisteamină; TCM+EGF- procentul de oocite maturate în mediul TCM 199 suplimentat cu EGF.

Figura 15: Corelaţie între rezultatele obţinute în diferite medii de maturare la oi şi capre

Cognie, 2003, prezintă ca mediu pentru maturarea oocitelor in vitro- mediul TCM 199 suplimentat cu FSH, LH, estradiol şi 10% ser fetal bovin, iar pentru maturarea oocitelor in vitro, la capre, este folosit mediul TCM 199 suplimentat cu oFSH 100 ng/ml şi lichid folicular (Cognie, 2002). Ca şi în cazul oocitelor altor specii: porcine, hamster, oocitele de capră sunt influenţate pozitiv de prezenţa cisteaminei în mediul de maturare. Adăugarea cistaminei în mediul de maturare al oocitelor are rol important în creşterea competenţei de dezvoltare a acestora in vitro (Kelly şi colab, 2004). O creştere a ratei de maturare a oocitelor se obţine prin suplimentarea mediului de maturare cu BSA, estradiol, cisteamină şi gonadotropine (Marques şi colab., 2000).

Figura 16: Complexe oocite –cumulus de capră maturate 1. Oocite viabile (→); 2. Oocite viabile

Figura 16: Complexe oocite –cumulus de capră maturate 1. Oocite viabile (→); 2. Oocite viabile cu conţinut citoplasmatic crescut în lipide (=>)

cu conţinut citoplasmatic crescut în lipide (=>) Figura 17: Complexe oocite –cumulus de oaie maturate 1.

Figura 17: Complexe oocite –cumulus de oaie maturate 1. Oocite viabile (→); 2. Oocite viabile cu conţinut citoplasmatic crescut în lipide

Există două strategii de dezvoltare a randamentului pentru oocitele maturate in vitro. Prima constă în selectarea oocitelor cu aptitudini de dezvoltare şi cea de a doua constă în adaptarea unui mediu de maturare pentru nevoile oocitelor (Ryan şi colab., 1991). Competenţa de dezvoltare (maturare citoplasmatică) creşte progresiv cu mărimea foliculară. La oi, oocitele prelevate din foliculii mai mari de 5 mm diametru au o mai mare aptitudine pentru dezvoltare după fecundare în sezonul normal decât în perioada de contrasezon deoarece foliculii prelevaţi sunt de talie mică (Mermillod şi colab., 1990). Identificarea precisă a factorilor foliculari care reglează competenţa pentru dezvoltarea oocitelor trebuie realizată împreună cu mai mulţi factori, precum acţiunea factorului de creştere, hormonilor sau peptidelor intraovariene asupra competenţei de maturare a oocitelor (Bevers şi colab., 1999). O prima metodă utilizată pentru maturarea oocitelor a constat în cocultivarea timp de 24 de ore a complexului oocite-cumulus cu celule granuloase într-un mediu suplimentat cu FSH, LH, estradiol şi ser fetal de viţel. Această metodă a fost simplificată, maturarea oocitelor s-a făcut într-un mediu complet suplimentat cu 10% lichid folicular şi 100 ng/ml de FSH ovin. O altă metodă pentru realizarea maturării in vitro a oocitelor a fost înlocuirea lichidului folicular în mediul de maturare cu 10ng/ml EGF şi 100 μl cisteamină. În aceste condiţii de maturare, după realizarea fertilizării in vitro a oocitelor şi 7 zile de culturare a oocitelor fertilizate, cel puţin 50% din zigoţii obţinuţi se dezvoltă până la stadiul de blastocist (Baril şi colab., 2001). După maturarea complexelor de oocite-cumulus de oaie şi capră, acestea s-au vortexat pentru îndepărtarea celulelor cumulus (n =102). Fertilizarea in vitro s-a realizat pe oocite denudate (n=102) (n=50 - oaie şi n= 52 -capră), plasate în tuburi Ependorff. În tuburile de fertilizare cu mediu s-au transferat oocitele maturate peste care s-a adăugat 5 μl de suspensie de spermatozoizi de berbec sau ţap după caz. După 18 h de la contactul oocitelor cu spermatozoizii, gameţii s-au spălat şi s-au pus în 2 medii de cultură- mediul SOF suplimentat cu 10% lichid folicular de oaie şi mediul SOF suplimentat cu 5 μg / ml EGF. Aceste culturi au fost menţinute în incubator cu atmosferă controlată (CO 2 5%; O 2 5%; N 90%, umiditate 100%, T= 38,5 o C). Rata de fecundare a oocitelor la oi şi capre este mai mică de 50%. Rata de fecundare pentru oi (43,07%, n=28) este mai crescută decât la capre (37,68%, n=26). Rata de fecundare a oocitelor la oaie recuperate din foliculii mari a fost de 42, 85% (n=18) şi de 43,47% (n=10) pentru oocitele recuperate din foliculii mici. La caprine rata de fecundare (%) este de 39,13% (n=8) pentru oocitele recoltate din foliculii ovarieni cu diametrul mai mic de 3 mm şi de 40% (n=18) pentru oocitele

provenite din foliculii ovrieni cu diametrul 3-7 mm. Prin examinarea morfologică a embrionilor de oaie şi capră la stereomicroscopul Nikon s-a pus în evidenţă clivajul în stadiul de 2 celule a gameţilor culturaţi în mediul SOF suplimentat cu 10% LF (n=26, din care n=12- oaie şi n= 14 -capră) şi gameţilor culturaţi în mediul SOF suplimentat cu 5 μl / ml EGF (n=21 din care n=10 -oaie şi n=11- capră). Rata de clivare în 2 celule a fost scăzută atât pentru oi (19,81%) cât şi pentru capre (22,72%). Ratele de fecundare a oocitelor de capră şi oaie şi respectiv de clivare a zigoţilor de capră şi oaie în stadiul de 2 celule au fost scăzute. S-a observat apariţiei unor anomalii de fecundaţie- polispermia- caracteristică sistemelor de cultură in vitro a embrionilor, cât şi prezenţa în mediul de cultură a unui agent patogen (Staphiloccocus sp.). Datorită problemelor enunţate zigoţii obţinuţi în stadiul de 2 celule nu s-au putut diferenţia în morule şi blastocişti, astfel încât embrionii de oaie şi capră au rămas în blocaj meiotic de 2 celule. Problemele întâlnite de noi au fost observate de numeroşi cercetători ştiinţifici din lumea întreagă pe care literatura de specialitate îi prezintă. După cum se cunoaşte, în cazul sistemelor de producere in vitro a embrionilor, eficacitatea operaţiilor de spălare şi tratament cu antibiotice pentru eliminarea bacteriilor de genul Streptococcus agalactiae, Actinomyces pyogenes şi Escherichia coli este scăzută (Otoi şi colab., 1992). Cei mai obişnuiţi agenţi patogeni întâlniţi în sistemele FIV sunt Pseudomonas spp., Streptococcus spp, Staphylococcus spp. şi ciupercile rezistente la antibiotice. Prezenţa acestor bacterii determină o rata de fecundaţie scăzută, degenerarea şi moartea embrionilor (Bielanski şi Stewart, 1996). Originea contaminării cu aceşti agenţi patogeni este foarte greu de stabilit. Alţi patogeni precum Pseudomonas aeroginosa sunt întâlniţi de cele mai multe ori în spermă contaminând ulterior sistemul FIV ajungând până la coculturile de embrioni cu celule epiteliale utero-tubulare. În stadiul actual putem formula ipoteze referitor la bacteriile patogene care afectează direct dezvoltarea embrionară producând toxine care infectează embrionii şi mediile de cultură. Numărul crescut de agenţii patogeni pot interrelaţiona cu oocitele şi embrionii rezultaţi in vitro. Este bine ştiut că producerea embrionilor prin FIV se poate asocia cu agenţi patogeni şi nu s-a găsit încă nici o metodă care să asigure cele mai bune rezultate (Stringfellow şi Wrathall, 1995). 2. INFLUENŢA SUCURILOR NATURALE ASUPRA CAPACITĂRII SPERMATOZOIZILOR DE BERBEC ŞI ŢAP După decongelarea spermei de ţap şi berbec se observă motilitatea spermatozoizilor la microscop, calculându-se indicele de supravieţuire al spermatozoizilor la congelare. Motilitatea spermatozoizilor de berbec înainte de congelare a fost mai mică cu 5% decât în cazul spermatozoizilor de ţap (90 vs 95%), iar indicele de supravieţuire al spermatozoizilor la congelare a fost calculat în funcţie de viabilitatea spermatozoizilor după congelare şi motilitatea spermatozoizilor înainte de congelare astfel încât IS pentru sperma de ţap a fost mai crescut cu 4% decât pentru sperma de berbec (83,10% vs 79,48%). Sperma de ţap şi berbec decongelată a fost repartizată în tuburi Falcon cu diferite medii de centrifugare. Sperma de ţap a fost introdusă în următoarele medii de centrifugare: gradient Percoll 20-80%; Mediu RPMI 10% suplimentat cu ser estral ovin, 10 μl albumină serică bovină şi 10 μg/ml gentamicină; mediu RPMI suplimentat cu 10 μl EGF şi 10 μg/ml gentamicină. Sperma de berbec a fost introdusă în două medii de centrifugare: gradientul Percoll 45-90% şi mediul RPMI suplimentat cu 50 μl albumină serică bovină şi 10 μg/ml gentamicină. După realizarea centrifugării s-au studiat următorii indicatori: motilitatea, viabilitatea şi IS (indice de supravieţuire al spermatozoizilor) atât pentru sperma de ţap cât şi pentru sperma de berbec.

După centrifugarea spermei de ţap şi berbec s-au facut următoarele observaţii în privinţa gradientelor de centrifugare:

În cazul spermei de ţap, pentru gradientul de centrifugare 20-80% s-a obţinut un sediment de culoare galbenă de spermatozoizii morţi (figura 18) la suprafaţa gradientului 20% şi un sediment de culoare albă cu spermatozoizi viabili la suprafata gradientului 80%;În cazul spermei de berbec, pentru gradientul de centrifugare 45-90% s-a observat formarea unui depozit

În cazul spermei de berbec, pentru gradientul de centrifugare 45-90% s-a observat formarea unui depozit de spermatozoizi viabili la suprafata gradientului de 90% şi un depozit de spermatozoizi morţi la suprafaţa gradientului de 45% (figura 19).cu spermatozoizi viabili la suprafata gradientului 80%; Figura 18: Centrifugarea spermei de ţap în gradient

morţi la suprafaţa gradientului de 45% (figura 19). Figura 18: Centrifugarea spermei de ţap în gradient

Figura 18: Centrifugarea spermei de ţap în gradient Percoll 20-80% (laborator de biochimie, ICDCOC Palas, Constanţa)

20-80% (laborator de biochimie, ICDCOC Palas, Constanţa) Figura 19: Centrifugarea spermei de berbec în gradient

Figura 19: Centrifugarea spermei de berbec în gradient Percoll 45-90% (laborator de biochimie, ICDCOC Palas, Constanţa)

Spermatozoizii de ţap viabili din gradientul Percoll 20-80% au fost introduşi în tuburi de capacitare de 2 ml în cele 6 variante experimentale de medii bazate pe sucuri naturale şi antibiotic. Sperma viabilă de ţap din mediile de centrifugare: mediul TCM 199 suplimentat cu 10% ser estral ovin, 10 μl albumină serică bovină şi 10 μg/ml gentamicină şi mediul RPMI şi 10 μl EGF şi 10 μg/ml gentamicină au fost repartizate în mediile de capacitare:

mediul TCM 199 suplimentat cu 10% ser estral ovin şi mediu RPMI supliementat cu 50 μl FSH şi 10 μg/ml gentamicină. Spermatozoizii de berbec viabili din gradientul Percoll 45-90% au fost repartizaţi în cele 6 variante experimentale de medii bazate pe sucuri naturale, antibiotic şi FSH. Sperma viabilă de berbec obţinută în urma centrifugării în mediul RPMI suplimentat cu 50 μl EGF şi 10 μg/ml gentamicină a fost adăugată în mediul de capacitare RPMI suplimentat cu 50 μl albumină serică bovină şi 10 μg/ml gentamicină. După 2 ore şi jumătate de incubare în atmosferă de 5% CO 2 şi temperatură de 37 0 C s-au făcut aprecierii privind calitatea şi eficienţa prezenţei extractelor naturale şi a antibioticelor în mediile de capacitare, calculându-se viabilitatea, motilitatea şi IS după terminarea capacitării (figura 20). Pentru sperma de ţap indicatorii biologici privind motilitatea, viabilitatea şi IS au avut valorile cele mai crescute pentru mediul de centrifugare în gradient Percoll 20-80% (65%; 40,18% şi 76,05%) comparativ cu mediul de centrifugare TCM 199 suplimentat cu factor de creştere şi gentamicină (60; 38,19%; 63,72%) şi mediul de centrifugare RPMI suplimentat cu ser estral ovin şi gentamicină (50%; 35,17% şi 57,23%). Indicatorii biologici

pentru sperma de berbec au avut valorile cele mai crescute pentru gradientul Percoll 45-90% comparativ cu mediul RPMI suplimentat cu BSA şi gentamicină (60; 41,97% 72,41% vs 50%; 38,13% şi 63,09%, figura 21).

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 %MDC %V IS indicatori
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
%MDC
%V
IS
indicatori criobiologici
P20-80
TCM EGF G
RPMI SEO G
valorile indicatorilor

Legendă: TCM EGF G- mediu TCM 199 cu EGF şi gentamicină; RPMI SEO G- mediu RPMI cu ser estral ovin şi gentamicină; P 20-80- gradient Percoll 20-80%. IS- indice de supravietuire a spermatozoizilor la centrifugare; V%- viabilitatea spermatozoizilor; MDC%- motilitatea spermatozoizilor.

Figura 20: Indicatori spermatici la ţap pentru medii diferite de centrifugare

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 %MDC %V IS P45-90
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
%MDC
%V
IS
P45-90
RPMI BSA G
indicatori criobiologici
valorile indicatorilor

Legendă: P 45-90- gradient Percol 45-90%; RPMI BSA G- mediu RPMI cu albumină serică bovină şi gentamicină; IS- indice de supravietuire a spermatozoizilor la centrifugare; V%- viabilitatea spermatozoizilor; MDC %- motilitatea spermatozoizilor.

Figura 21: Indicatori biologici determinaţi pentru sperma de berbec în diferite medii de centrifugare

După realizarea capacitării spermatozoizilor de berbec şi ţap s-au studiat motilitatea, viabilitatea şi IS în medii diferite bazate pe extracte naturale şi antibiotice. După cum se observă în figurile 22 şi 23 concentraţia de antibiotice utilizată în mediile de capacitare nu influenţează negativ capacitarea spermatozoizilor, dar nu poate ameliora capacitatea fecundantă a spermatozoizilor de berbec şi ţap, limitându-se doar la protejarea mediilor de cultură împotriva acţiunii negative a factorilor externi. Concentraţiile de antibiotice care au fost folosite se încadrează în limitele de concentraţie acceptate de IETS (Societatea Internaţională de Transfer Embrionar). Concentraţia de gentamicină utilizată a fost de 10 µg /ml fiind încadrată în limitele citate de literatură de specialitate, respectiv 10-200 µg /ml. Ca şi în cazul congelării spermei de berbec şi ţap (Ghiţă şi colab., 2007; Şogorescu şi colab., 2008), sucurile naturale au efect benefic asupra capacitării spermatozoizilor de ţap şi berbec, în special când acestea sunt asociate cu FSH (Şogorescu şi colab., 2009). Pentru sperma de berbec cea mai crescută motilitate, viabilitate şi IS a spermatozoizilor a fost înregistrată în mediul RPMI suplimentat cu 50 µl FSH şi 10% suc de morcov (40%; 37,12% şi 62,01%), iar valorile cele mai scăzute au fost observate în cazul mediului RPMI suplimentat cu 10 µl EGF şi 10 µl gentamicină (20%; 13,14% şi 26,28%). Pentru sperma de ţap cele mai crescute valori ale motilităţii, viabilităţii şi IS au fost înregistrate pentru mediul RPMI suplimentat cu 50 µl FSH şi 10 µl gentamicină (40%; 37,13% şi 61,61%) iar cele mai scăzute valori au fost observate pentru mediile TCM 199 suplimentat cu 10% suc de de castravete, cu suc de de portocală, suc de de kiwi şi gentamicină (10%; 5,32% ; 8,18% vs 10% ; 4,14%; 6,36% vs 10% ; 4,92%; 7,56%).

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
%M
%V
IS
medii de capacitare
valo rile pro centuale
80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1
2
3
4
5
6
medii de capacitare
%M
%V
IS
valo rile procentu ale

Legendă: IS- indice de supravietuire a spermatozoizilor la capacitare; V%- viabilitatea spermatozoizilor; M%- motilitatea spermatozoizilor; 1- TCM 199 cu 10% suc de măr şi 10 µl gentamicină; 2- TCM 199 cu 10% suc de castravete şi 10 µl gentamicină; 3- TCM 199 cu 10% suc de portocală şi 10 µl gentamicină; 4- TCM 199 cu 10% suc de grefă şi 10 µl gentamicină; 5- TCM 199 cu 10% suc de kiwi şi 10 µl gentamicină;6- TCM 199 cu 10% suc de morcov şi 10 µl gentamicină; 7- TCM 199 cu ser estral ovin şi 10 µl gentamicină; 8- RPMI cu 50 µl FSH şi 10 µl gentamicină; 9- RPMI cu 10 µl EGF şi 10 µl gentamicină.

Legendă: IS- indice de supravietuire a spermatozoizilor la capacitare; V%- viabilitatea spermatozoizilor; M%- motilitatea spermatozoizilor; 1- RPMI cu 50 µl FSH şi 10% suc de măr; 2- RPMI cu 50 µl FSH şi 10% suc de castravete; 3- RPMI cu 50 µl FSH şi 10% suc de portocală; 4- RPMI cu 50 µl FSH şi 10% suc de grefă; 5- RPMI cu 50 µl FSH şi 10% suc de kiwi şi 6- RPMI cu 50 µl FSH şi 10% suc de morcov.

Figura 23: Indicii biologici ai spermei de berbec şi ţap după capacitare în diferite medii care nu conţin

Figura 22: Indicii biologici ai spermei de berbec şi ţap după capacitare in diferite medii care conţin antibiotice

antibiotice S-a observat faptul că prezenţa FSH în mediul de capacitare determină o motilitate şi viabilitate mai crescută cu 10-15% mai mult decât în cazul absenţei sale. Cele mai bune medii de capacitare au fost cele bazate pe FSH şi sucuri naturale (morcov, măr, castravete), mediile fiind clare, iar spermatozoizii au fost activi. La berbec albumina serică protejează lipidele celulelor spermatice de peroxidare şi le menţine în stare de excelentă mobilitate. Spermă proaspătă de berbec capacitată în mediul TCM-199 suplimentat cu ser de oaie, fecundează 80% din oocitele puse în contact cu aceşti spermatozoizi (Cojocaru şi colab., 1995). Crozet şi colab., (1987) au obţinut rezultate bune pentru rata de fecundaţie şi rata de fătare utilizând spermatozoizi de berbec capacitaţi în mediu salin suplimentat cu 20% ser de oaie. Absolut necesari sunt ionii esenţiali (preponderent concentraţia de K + ), serul, albumina şi metaboliţii utilizaţi de spermatozoizd ca: lactat, piruvat şi mai puţin glucoza. Posibilitatea de a obţine procente ridicate de fecundaţie cu ajutorul unor tehnici diverse de capacitare in vitro a spermatozoizilor indică faptul că fertilizarea in vitro nu se realizează prin mecanisme identice cu cele in vivo. Viabilitatea spermatozoizilor supuşi tratamentelor cu diferite medii pe bază de TCM – 199, se schimbă după primele 15 minute de experimentare. În intervalul de timp 15 minute– 30 minute, cea mai bună viabilitate a spermatozoizilor de 81,89%, s-a înregistrat pentru mediul TCM suplimentat cu 0,12mg FSH. După 30 minute de la debutul experienţei se observă mişcări de înaintare în zig-zag pentru spermatozoizii din mediul TCM suplimentat cu 10% ser estral ovin şi mişcări energice de înaintare sunt realizate de

spermatozoizii din mediul TCM suplimentat cu 0,12 mg LH. În intervalul de timp 30 minute – 45 minute rata de viabilitate se reduce cu 10% iar, spermatozoizi sunt energici, descriind o înaintare rectilinie. În ultimul sfert al primei ore de experiment spermatozoizii supuşi acestui tratament se mişcă energic înaintând în zig-zag. Între 60 minute şi 75 minute viabilitatea populaţiilor de spermatozoizi scade, mai ales la cele din mediul PBS suplimentat cu 0,12 mg LH şi mediul PBS suplimentat cu 0,12 mg FSH, înregistrându-se valoarile de 57% şi, respectiv 54%. Spre sfârşitul experimentului se înregistreză un număr semnificativ de spermatozoizi morţi, aglutinaţi, care elimină în mediu enzime hidrolitice şi toxine. Aceste substanţe determină scăderea pH cu efect direct asupra celulelor spermatice vii care realizează mişcări haotice. Substanţele nutritive conţinute de mediul TCM-199 susţin activitatea unui număr mai mic de celule spermatice la parametrii optimi pentru supravieţuire şi pe o durată de timp mai scurtă decât mediul PBS. Dintre aditivii introduşi în mediul de capacitare al spermatozoizilor, rezultate semnificative privind menţinerea spermatozoizilor în stare activă au fost obţinute în cazul mediului TCM-199 suplimentat cu LH şi mediu PBS suplimentat cu FSH. Hiperactivitatea celulelor spermatice este indusă rapid şi eficient de serul estral ovin, LH (mediu TCM) şi LF, FSH (mediu PBS, Zamfirescu şi Anghel, 1994). 3: INFLUENŢA SUCURILOR NATURALE, A HORMONILOR ŞI A FACTORILOR DE CREŞTERE ASUPRA MATURĂRII IN VITRO ŞI FERTILIZĂRII IN VITRO A OOCITELOR DE CAPRĂ

După sacrificarea caprelor experimentale, se apreciază reacţia foliculară, se evaluează numărul de oocite de capră obţinut în funcţie de numărul de foliculi observaţi. Se apreciază caracteristicile morfo-fiziologice ale oocitelor de capră recoltate (figurile 24 - 25 ). Numărul cel mai crescut de foliculi ovarieni au fost cei cu diametrul folicular de 3-4 mm. În figura 26 este prezentat procentul de oocite de capră obţinut prin metodele: puncţie foliculară şi disecţie foliculară cât şi caracteristicile morfologice observate la oocitele recoltate de la caprele sacrificate. La capre, prin metoda disecţiei foliclilor mari s-au obţinut: 40, 62% (n=13) oocite denudate, 21, 87% (n=7) oocite cu cumulus parţial şi 12,5% (n=4) oocite cu cumulus total, iar prin puncţie foliculară – 15,62% (n=5) oocite cu cumulus parţial şi 9,37% (n=3) oocite denudate.

Complexele oocite-cumulus recoltate (n=32) sunt distribuite în plăcii Petrii, în diferite medii de maturare. După 17 ore de la maturare într-un incubator cu atmosferă controlată de 5% CO 2 şi temperatură de 38 0 C se evaluază complexele oocite-cumulus de capră din punct de vedere cito-morfologic (tabel 1, figura 27).

Rata de maturare a complexelelor oocite-cumulus de capră la 17 ore de incubare a fost de 93,75% (n=30). Rata de maturare după 24 de ore a complexelor oocite-cumulus de capră a fost de 65,62% (figura 28). După 24 de ore de la maturarea complexelelor oocite-cumulus de capră s-au observat 11 oocite degenerate (câte 2 oocite degenerate în mediile de maturare 1, 2, 4, 5 şi 6 şi câte 1 oocit degenerat în mediul de maturare 4).

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 NF diametrul foliculilor ovarieni
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
NF
diametrul foliculilor ovarieni
1-2 mm
2-3 mm
7 mm
3-4 mm
num[rul foliculilor ovarieni

Legendă: NF- numărul foliculilor recoltaţi; 1-2 mm- foliculi cu dimensiunea de 1- 2 mm; 2-3 mm - foliculi cu dimensiunea de 2-3 mm; 3-4 mm - foliculi cu dimensiunea de 3-4 mm; 7 mm - foliculi cu dimensiunea de 7 mm.

Figura 24: Aprecierea reacţiei foliculare la ovarele recoltate de la caprele sacrificate

50 40 30 20 10 0 CP CT OD -10 DF PF caracteristicile oocitelor procentul
50
40
30
20
10
0
CP
CT
OD
-10
DF
PF
caracteristicile oocitelor
procentul de oocite

Legendă: PF- puncţie foliculară; DF- disecţie mecanică a foliculilor mari; OD- oocite denudate; CT- oocite cu cumulus total; CP – oocite cu cumulus parţial.

Figura 26: Caracteristicile morfo-citologice ale complexelor oocite-cumulus de capră recoltate prin puncţie foliculară şi disecţie foliculilor mari

prin puncţie foliculară şi disecţie foliculilor mari Figura 25: Complexe oocite- cumulus de capră (cu 1-

Figura 25: Complexe oocite- cumulus de capră (cu 1- 2 straturi de cumulus, laborator FIV, ICDCOC, Palas, Constanţa)

de cumulus, laborator FIV, ICDCOC, Palas, Constanţa) Figura 27: Oocite de capră maturate care prezintă cumulus

Figura 27: Oocite de capră maturate care prezintă cumulus expandat (laborator FIV, ICDCOC Palas, Constanţa)

Tabel 1: Aspecte cito-morfologice ale oocitelor de capră înainte şi după maturare

Placa

Observaţii cito- morfologice ale

Observaţii cito-morfologice ale

 

Mediu de maturare

Petrii

oocitelor înainte de maturare

oocitelor după maturare

Godeta 1- mediu 1- TCM 199

1.

(soluţie stoc 1,5 g/250dl), 50 ng/ml p FSH,

10 ng/ml LH, 100 µl/ml estradiol şi 10% extract castravete

Godeta 2- mediu 2- TCM 199

1.

(soluţie stoc 1,5 g/250dl), 50 ng/ml p FSH,

10 ng/ml LH, 100 µl/ml estradiol şi 10% extract morcov

Godeta 3- mediu 3- TCM 199

1.

(soluţie stoc 1,5 g/250dl), 20 ng/ml factor de creştere, 50 ng/ml p FSH şi 10% extract morcov

Godeta 4- mediu 4- TCM 199

1.

2.

2.

(soluţie stoc 1,5 g/250dl), 20 ng/ml factor de creştere, 50 ng/ml p FSH şi 10% extract castravete

Godeta 1- mediu 5- Soluţie

Hank’s (soluţie stoc 50 ml/500dl), 40ng/ml insulină (Actrapid), 20 ng/ml p FSH şi 10% extract morcov

Godeta 2- mediu 6- Soluţie

Dulbecos (soluţie stoc 2,5 g/250dl), 100 µl/ml cisteamină şi 10% extract morcov

Godeta 3- mediu 7- PBS 100

2.

µl/ml cisteamină , 20 ng/ml factor de creştere şi 50 ng/ml p FSH.

5 oocite- 2 oocite

denudate, 2 oocite cu cumulus parţial, 1 oocit cumulus total

5 oocite- 1 oocit denudate, 3 oocite cu cumulus parţial, 1 oocit cumulus total

5

oocite cu cumulus parţial

5

oocite - 1 oocit cu

cumulus parţial şi 4 denudate

4 oocite- 3 oocite cu

dimensiuni medii şi un oocit cu dimensiuni mari; 2 oocite denudate şi 2 oocite cu cumulus total

2

2

oocite denudate

oocite denudate

2 oocite denudate, 2 oocite cu cumulus parţial expandat (2-3 rânduri de cumulus), citoplasmă clară; 1 oocit degenerat

2 oocite mari şi 3 oocite mici;

2 oocite mari cu cumulus parţial expandat (1 oocit cu 4-5 straturi de cumulus; 1 oocit cu 2-3 straturi de cumulus, citoplasmă clară); 1 oocit mic denudat şi 2 oocite mici cu cumulus parţial expandat (2 oocite mici cu 1-2 straturi de cumulus, citoplasmă clară)

5 oocite cu cumulus parţial expandat (2

oocite cu 2-3 straturi de cumulus, citoplasmă clară şi 2 oocite cu 1-2 straturi de cumulus);

1 oocit cu cumulus parţial expandat (1 oocit cu 3-4 straturi de cumulus; citoplasmă clară) şi 4 oocite denudate

2 oocite denudate şi 2 oocite cu cumulus parţial expandat (2 oocite cu 2-

3 rânduri de cumulus, citoplasmă clară)

1 oocit denudat cu citoplasmă clară; 1

oocit denudat cu conţinut retractat (citoplasmă granulară)

2 oocite denudate cu citoplasmă clară

120 100 80 60 40 20 0 NTO 24 h NTO 17 h %OM NT
120
100
80
60
40
20
0
NTO 24 h
NTO 17 h
%OM
NT
interval de timp
procent si numar de oocite

Legendă: % OM- rata de maturare a oocitelor de capră; NT oocite- numărul de oocite maturate; NTO 17 ore- numărul total de oocite maturate după 17 ore; NTO 24 ore- numărul total de oocite maturate după 24 ore.

Figura 28: Rata de maturare a oocitelor în funcţie de perioada de incubare

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 OV 17 h ONV 17
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
OV 17 h
ONV 17 h
OV 24 h
ONV 24 h
-1
interval de timp
M1
M2
M3
M4
M 5
M6
M7
num arul de oocite m aturate

Legendă: OV 17 h - numărul total de oocite viabile după 17 ore de la maturare; ONV 17 h- numărul total de oocite

neviabile după 17 ore de la maturare; OV 24 h- numărul total de oocite viabile după 24 ore de la maturare; ONV 24 h- numărul total de oocite neviabile după 24 ore de la

maturare; M1

M7- variantele experimentale de medii de maturare.

Figura 29: Numărul de complexelelor oocite- cumulus de capră viabile înainte de maturare şi numărul de complexelelor oocite-cumulus de capră neviabile maturate după 17 şi 24 ore în cele 7 variante de medii de maturare

Cel mai bun mediu de maturare după 17 ore şi respectiv 24 de ore de incubare a complexelelor oocite- cumulus de capră a fost mediul 7- mediul PBS suplimentat cu 100 µl/ml cisteamină, 20 ng/ml factor de creştere şi 50 ng/ml p FSH ( figura 29, Şogorescu şi colab., 2009). După 17 ore de maturarea complexelelor oocite-cumulus de capră mediile experimentale de maturare au înregistrat rezultate bune în ceea ce priveşte asigurarea vibiabilităţii oocitelor de capră. Mediile de maturare în care s-au observat apariţia complexelelor oocite-cumulus de capră degenerate au fost în mediile 1 şi 6. Toate variantele experimentale asigură condiţii optime de maturare a oocitelor pentru 17 ore de incubare în atmosferă controlată de 5% CO 2 . După 24 de ore de maturare procentul oocitelor degenerate creşte, mediile optime de maturare fiind mediul PBS suplimentat cu 100 µl/ml cisteamină , 20 ng/ml factor de creştere şi 50 ng/ml p FSH (mediul 7) şi mediul TCM 199 (soluţie stoc 1,5 g/250dl) suplimentat cu 20 ng/ml factor de creştere, 50 ng/ml p FSH şi 10% extract castravete (mediul 4). Acţiunea pozitivă a cisteaminei în mediul de maturare a fost semnalat şi de literatura de specialitate, observându-se existenţa unei relaţii între glutation şi competenţa de dezvoltare a oocitelor la ovine şi bovine (De Matos şi colab.,1995, De Matos şi colab., 2002) fiind apoi confirmată şi la capre când mediul de maturare a fost suplimentat cu cisteamină care este un precursor al glutationului. Rezultatele obţinute în ceea ce priveşte maturarea in vitro la capre confirmă rezultatele obţinute de literatura de specialitate. Competenţa de dezvoltare a oocitelor este influenţată de foliculogeneză, mărimea foliculilor şi atrezia foliculară (Mermillod şi colab., 1999). Cel mai obişnuit sistem de maturare in vitro a oocitelor este format din mediu de cultură suplimentat cu FSH, LH , estradiol and 10% ser fetal bovin (FCS). În

primul rând trebuie optimizate condiţiile de maturare (Moor şi Trounson 1977). Pentru maturarea in vitro a oocitelor de oaie şi capră se utilizează lichid folicular recuperat din foliculii mari (> 4 mm) pentru suplimentarea mediului TCM 199 ce conţine şi 100 ng/ml of FSH-o (Topoleanu şi colab., 2007). În timpul maturării in vitro a oocitelor eliberarea primului globul polar se face (metafaza II) în primele 16 - 24 h după începerea maturării

(Cognie şi colab., 2003). Efectorii moleculari care mediază influenţa pozitivă asupra dezvoltării foliculare nu a fost încă elucidată. S-a observat că mediile semidefinite suplimentate cu BSA sau definite care nu conţin ser sau BSA

pot fi suplimentate cu factori de creştere, hormoni sau peptide intraovariene. Adiţia în mediul de maturare

semidefinit a rLH nu are effect asupra meiozei oocitelor de oaie (Accardo şi colab., 2004). Meioza şi rata clivării

este ameliorată prin adiţia în mediu de maturare a 100 ng/ml oFSH sau 10 ng/ml factor de creştere pentru mediul de maturare definit, iar 100 ng factor de creştere insulinic (IGF -I)/ml nu are nici un efect asupra maturării

oocitelor (Guler şi colab., 2000). Adiţia licidului folicular, FSH şi EGF au influenţă pozitivă asupra potenţialului

de dezvoltare al oocitelor, indicând prezenţa unor molecule reglatoare ale acţiunii acestora. Suplimentarea cu FSH

a mediului TCM 199 ce conţine şi estradiol 17 beta (100 ng/ml) determină o creştere a producţiei de blastocişti.

Totuşi acest efect pozitiv nu s-a observat în cazul prezenţei în mediul de maturare a lichidului follicular în care au fost eliminaţi steroizii (Guler şi colab., 2000 ). La alte specii (porcine Abeydeera şi colab., 1998, bovine De Matos

şi colab.,1995, hamster Zulke şi colab., 1990) conţinutul de glutation din oocitele de capră reprezintă un indicator

bun pentru competenţa oocitară de maturare, iar adiţia cisteaminei în mediul de maturare ameliorează eficacitatea

MIV

la capre comparativ cu adiţia lichidului folicular în mediu de maturare (Cognie şi colab., 2002). Utilizarea

unor

medii de maturare semidefinite sau nedefinite, precum şi prezenţa în mediul de maturare a lichidului

folicular, factorului de creştere (Izadyar şi colab.,1996), activinul sau inhibinul (Stock şi colab., 1997) stimulează maturarea oocitelor la bovine iar subunitatea α a inhibinului scade potenţialul de dezvoltare al oocitelor (Silva şi colab., 1999). După realizarea maturării oocitelor de capră, oocitele cu citoplasmă clară şi cumulus expandat sunt selectate pentru a fi puse în contact cu spermatozoizii de ţap capacitaţi. Motilitatea spermatozoizilor de ţap, după centrifugarea în gradient Percoll 45-90% a spermei refrigerate şi congelate este prezentată în figura 30.

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 SC SR starea de
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
SC
SR
starea de prezentare a spermei
%M
%V
procentul valorilor indicatorilo

Legendă: % M- motilitatea spermatozoizilor; %V viabilitate spermatozoizilor; SR- spermă refrigerată; SC- spermă congelată.

Figura 30: Indici spermatici determinaţi la ţap

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 M% motilitatea spermatozoizilor M1 M2
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
M%
motilitatea spermatozoizilor
M1
M2
M3
M4
p ro cen tu l m otilitatii

Legendă: M%- motilitatea spermatozoizilor; M1-M4- medii de capacitare.

Figura 31: Motilitatea spermatozoizilor de ţap în cele 4 variante experimentale de capacitare

Spema refrigerată de ţap ( număr matricol 700) de 24 de ore prezintă o motilitate mai crescută cu 25% (75% vs 50%) şi respectiv o viabilitate cu 22,56% (63,45% vs 40,89%) decât sperma congelată de ţap (număr matricol 029). Spermatozoizii de ţap viabili centrifugaţi sunt capacitaţi în 4 variante de medii de capacitare pentru o oră şi 30 de minute la temperatura de 38 0 C în atmosferă controlată de 5% CO 2 . Motilitatea spermatozoizilor de ţap a fost mai mare pentru mediul de capacitare 4 (65%, mediu SOF suplimentat cu BSA, 100 ng/ml Folliculotropin şi 10% suc de castravete). Mediul de capacitare pentru care spermatozoizii au avut procentul de motilitate cel mai scăzut a fost cel bazat pe mediu PBS cu HEPES, 100 ng/ml pFSH şi 10% suc de morcov (35%). Rezultatele obţinute sunt prezentate în figura 31. Capacitarea spermatozoizilor de ţap congelaţi-decongelaţi se realizează în mediu TALP (soluţie Tyrode cu 3% BSA, lactat, piruvat) care realizează o rată de penetrare de 70- 85%. Adăugarea de heparină în mediul de capacitare măreşte rata de penetrare a spermatozoizilor, dacă este adăugat la mediul de fertilizare ce conţine ser de oaie (Alok, 2001). După 18 ore de la incubare zigoţii sunt spălaţi, sunt caracterizaţi din punct de vedere morfologic şi citologic (tabel 2), fiind apoi introduşi în mediu de cultură (SOF cu BSA). Tabel 2: Caracteristicile oocitelor de capră fertilizate înainte de introducerea lor în cultură

Placa Petrii

Godeta

Observaţii

1

1

4 oocite; 3 oocite cu MP înconjurate de spermatozoizi, citoplasme clare,1 oocit cu citoplasma închisă la culoare

1

2

2 oocite; 2 oocite cu MP înconjurate de spermatozoizi, 1 oocit cu citoplasmă clară şi 1 oocit cu citoplasmă închisă la culoare

1

3

2 oocite; 2 oocite cu MP înconjurate de spermatozoizi, citoplasmă clară

1

4

3 oocite; 2 oocite cu MP înconjurate de spermatozoizi, citoplasmă clară, 1 oocit cu citoplasmă retractă

2

1

2 oocite; 2 oocite cu MP înconjurate de spermatozoizi, citoplasmă clară

2

3

2 oocite; 2 oocite cu MP înconjurate de spermatozoizi,

1 oocit cu citoplasmă

 

clară, 1 oocit cu citoplasmă retractă

2

4

2 oocite; 2 oocite cu MP înconjurate de spermatozoizi, 2 oocite cu citoplasmă retractată

Oocitele de capră au fost puse în contact cu spermatozoizii de ţap (n=21), iar după fertilizare timp de 18 ore s-au selectat oocite viabile fertilizate (n=17) care au fost introduse în mediul de cultură SOF cu BSA (figura 32). Din numărul total de oocite puse în contact cu spermatozoizii s-a obţinut un procent de 53,12% zigoţi (n=17, oocite fecundate, figura 33), iar procentul de zigoţi în stadiul de 2 celule a fost de 15,62% (n=5) din care nu a rezultat nici un stadiu de morulă sau blastocist). Crozet (1987) a investigat efectul mărimii foliculilor de unde s- au colectat oocitele de capră. Astfel oocitele s-au colectat din foliculi de 2- 3 mm (foliculi mici), 3,1-5 mm (foliculi medii) şi 5 mm (foliculi mari), fiind selectate oocitele cu cumulus compact. În funcţie de dimensiunea foliculilor oocitele s-au maturat în proporţie de 70%, 80% şi 97% aflate în metafaza II. După fertilizarea in vitro a oocitelor s-a observat clivarea la 40 ore, la 69% din foliculii mari şi 75% la oocitele ovulate. Embrionii clivaţi din foliculi mici s-au oprit din dezvoltare la stadiul de 8- 16 celule într-o proporţie de 84% faţă de 53%, 45% şi 39% cât s-a realizat din oocitele colectate din foliculii medii, mari şi oocite ovulate. Proporţia de morule şi blastocişti obţinută a fost de 10% şi 6% din foliculii mici, 35% şi 12% din foliculii medii şi 29% şi 26% din foliculii mari. Pentru maturarea in vitro a oocitelor şi culturarea in vitro a embrionilor se recomandă (Zamfirescu şi colab., 1995) folosirea de lichid folicular caprin şi FSH ovin (100ng/ml).

Figura 32: Oocite de capră maturate puse în contact cu spermatozoizi capacitaţi de ţap (laborator

Figura 32: Oocite de capră maturate puse în contact cu

spermatozoizi capacitaţi de ţap (laborator FIV,

ICDCOC, Palas, Constanţa)

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 procentul de oocite
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
procentul de oocite

OVM

ODM

OVF

caracteristicile oocitelor

ODF

Legendă: OVM- oocite viabile maturate; ODM- oocite degenerate maturate; OVF- oocite viabile fertilizate; ODF- oocite degenerate fertilizate.

Figura 33: Corelaţie între procentul de oocite maturate

şi procentul de oocite fertilizate in vitro

Embrionii FIV (morule sau blastocişti) s-au dezvoltat foarte bine în coculturi cu celule oviductale, după anul

1996, când s-au elaborat tehnologii de culturare în mediul sintetic SOF (syntetic oviduct fluid) suplimentat cu

aminoacizi şi ser în atmosferă controlată (5% oxigen, 5%CO 2 , 90%N 2 ). În aceste condiţii s-a realizat în prezent o

dezvoltare oocite- morule- blastocişti de 56% şi s-au simplificat şi metodele de culturare ale acestora.

EXPERIMENTUL 4. REALIZAREA DE VARIANTE EXPERIMENTALE PRIVIND PRODUCEREA IN VITRO A EMBRIONILOR DE OAIE

După sacrificarea oilor, se apreciază reacţia foliculară, se evaluează numărul de complexe oocite-cumulus

obţinute în funcţie de numărul de foliculi observaţi. Se apreciază caracteristicile morfo-fiziologice ale complexelor

oocite-cumulus recoltate (figurile 34 şi 35).

Din numărul total de complexe oocite –cumulus de oaie recuperate viabile (n=38) s-a obţinut o rată de

recuperare oocitară mai mare prin puncţie foliculară de 57,89% (n=22) comparativ cu disecţia mecanică a

foliculilor mari 42,10% (n=16). Prin puncţie foliculară s-a obţinut 31,57 % (n=12) oocite cu cumulus parţial,

2,63% (n=1) oocite cu cumulus total şi 23,68% (n=9) oocite denudate. În cazul disecţiei foliculare s-au obţinut

28,94% (n=11) oocite cu cumulus parţial, 2,63% (n=1) oocite cu cumulus total şi 10,52% (n=4) oocite denudate.

Oocitele atrezice eliminate din experiment au fost în procent de 9,52%.

Complexele oocite-cumulus viabile sunt selectate pentru maturare (n=38). După 17 ore de maturare a

complexelor oocite-cumulus într-un incubator cu atmosferă controlată de 5% CO 2 se evaluază oocitele din punct

de vedere cito-morfologic (tabel 3). Rata de maturare a complexelor oocite-cumulus la 17 ore de incubare a fost

de 92,10%.

Figura 34: Complex oocit-cumulus de oaie (5-7 straturi de cumulus, Laborator FIV, ICDCOC Palas, Constanţa)

Figura 34: Complex oocit-cumulus de oaie (5-7 straturi de cumulus, Laborator FIV, ICDCOC Palas, Constanţa) vizualizat la microscop

40 35 30 25 20 15 10 5 0 DF PF metode de recoltare a
40
35
30
25
20
15
10
5
0
DF
PF
metode de recoltare a oocitelor
OD
CP
CT
procentul de oocite

Legendă: DF- disecţia mecanică a foliculilor mari; PF- aspirarea

foliculară a oocitelor de oaie; CP- oocite cu cumulus parţial; OD-

oocite denudate; CT – oocite cu cumulus total.

Figura 35: Caracteristicile morfologice ale oocitelor de oaie recoltate prin aspirare foliculară şi disecţia foliculilor mari

Tabel 3: Aspecte cito-morfologice ale oocitelor de oaie înainte şi după maturare

Placa

Petrii.

Godeta

Observaţii cito-morfologice ale oocitelor înainte de maturare

Observaţii cito-morfologice ale oocitelor după maturare

1.1

1.2

10 oocite- 4 oocite denudate, 6 oocite cu cumulus parţial (2-3 straturi de cumulus)

7 oocite- 3 oocite mici denudate, 3 oocite

cu cumulus parţial (2-3 straturi de cumulus), 1 oocit mare cumulus total (5 straturi de cumulus)

2 oocite mari cu cumulus parţial expandat (2-3

rânduri de cumulus), citoplasmă clară; 2 oocite mari cu cumulus parţial expandat (2-3 rânduri de cumulus), citoplasmă inchisă la culoare, 2 oocite mici

cu 1-2 straturi de cumulus expandat ; 4 oocite denudate (2 oocite cu citoplasmă închisă la culoare şi 2 oocite cu citoplasmă clară).

1 oocit mare cu cumulus total expandat, citoplasmă clară, şi închisă la culoare ; 2 oocite cu cumulus parţial, expandat 1 oocit cu 2-3 straturi de cumulus, citoplasmă clară); 2 oocite denudate cu conţinut citoplasmatic retractat; 1 oocit cu cumulus parţial, expandat, citoplasmă retractată, 1 oocit mic cu un strat de cumulus expandat, citoplasmă clară.

1.3

2.1

5 oocite – 3 oocite cu cumulus parţial (2-

3 oocite cu cumulus parţial expandat citoplasmă

3

straturi de cumulus), 2 oocite denudate

clară şi 2 oocite degenerate

5

oocite - 1 oocit mare cu cumulus total (

1 oocit cu cumulus parţial, expandat

(1 oocit cu

10 straturi de cumulus), 2 oocite denudate şi 2 oocite cu cumulus partial (1- 2 straturi de cumulus)

10 straturi de cumulus; citoplasmă clară), 2 oocite denudate, citoplasma clară, 2 oocite cu cumulus partial, expandat, citoplasmă granulară

2.3

2.4

5 oocite- 4 oocite cu cumulus parţial şi 1 oocit denudate

6 oocite- 1 oocit denudat şi 5 oocite cu cumulus parţial

1 oocit denudat citoplasmă retractată, 3 oocite mari

cu cumulus parţial expandat (2 oocite cu 3-4 rânduri de cumulus, citoplasmă clară) şi 1 oocit mic cu cumulus partial, expandat ( 2 straturi de cumulus, citoplasmă clară).

3 oocite mari cu cumulus expandat, citoplasmă clară,

2 oocite denudate, citoplasmă clară şi 1 oocit cu cumulus partial, expandat cu citoplasmă clară.

După 17 de ore de maturare a complexelor oocite-cumulus s-au observat că procentul oocitelor degenerate a fost de 5,26%, iar rata de maturare a oocitelor a fost de 92,10% (n=35). S-a observat un efect pozitiv a acţiunii lichidului folicular în cazul maturării in vitro a oocitelor (Cognie şi colab., 1995) şi a acţiunii gonadotropinelor care stimulează dezvoltarea foliculilor (Cognie şi Poulin, 2000).

Totuşi adiţia lichidului folicular, FSH şi EGF au influenţă pozitivă asupra potenţialului de dezvoltare al oocitelor, indicând prezenţa unor molecule reglatoare ale acţiunii acestora. Suplimentarea cu FSH mediului TCM 199 ce conţine şi estradiol 17 beta (100 ng/ml) determină o creştere a producţiei de blastocişti. Totuşi acest efect pozitiv nu s-a observat în cazul prezenţei în mediul de maturare a lichidului follicular în care au fost eliminaţi steroizii (Guler şi colab., 2000 ). Prima metodă utilizată pentru maturarea oocitelor a constat în cocultivarea timp de 24 de ore a complexului oocite-cumulus cu celule granuloase într-un mediu suplimentat cu FSH, LH, estradiol şi ser fetal de viţel. Această metodă a fost simplificată, maturarea oocitelor se face într-un mediu complet cu 10% lichid folicular şi 100 ng/ml de FSH ovin (Baril şi colab., 2001). După realizarea maturării oocitelor de oaie, oocitele cu citoplasmă clară şi cumulus expandat sunt selectate pentru a fi puse în contact cu spermatozoizii capacitaţi. Spermatozoizii de berbec viabili centrifugaţi sunt capacitaţi în 7 variante de medii de capacitare pentru o oră şi 30 de minute la 38 0 C în atmosferă de 5% CO 2 . Motilitatea spermatozoizilor de berbec a fost studiată după capacitarea lor în 7 variante experimentale de medii de capacitare (figura 36).

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 medii de capacitare M1 M2
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
medii de capacitare
M1
M2
M3
M4
M5
M6
M7
motilitatea spermatozoizilor

Legendă: M1

capacitare; M% - motilitatea spermatozoizilor de berbec.

– variante experimentale de medii de

M7

Figura 36: Motilitatea spermatozoizilor in cele 7 variante de medii de capacitare

spermatozoizilor in cele 7 variante de medii de capacitare Figura 37: Oocit maturat de oaie puse

Figura 37: Oocit maturat de oaie puse în contact cu spermatozoizii de berbec capacitaţi (Laborator FIV, ICDCOC Palas, Constanţa)

Cel mai bun mediu de capacitare al spermatozoizilor de berbec a fost mediul 5 (70%, mediu PBS suplimentat cu HEPES, 50 ng/ml pFSH ) dar şi mediile 6 şi 7 (60%, mediu Hank’s suplimentat cu 20 ng/ml EGF şi mediu Dulbecos suplimentat cu 20 ng/ml pFSH şi 20 ng/ml LH ). Procentul de oocite selectate după 17 de ore de maturare a fost de 92,10% (n=35) iar procentul de oocite puse în contact cu spermatozoizii este de 86,84% (n=33). După 18 ore de la incubare zigoţii sunt spălaţi, sunt caracterizaţi din punct de vedere morfologic şi citologic (tabel 4, figurile 37), fiind apoi introduşi în mediu de cultură (Hank’s cu BSA şi Folliculotropin). Procentul de oocite fecundate a fost de 31,76% (n=12), iar rata de

nefecundaţie a oocitelor de oaie a fost de 55,21% (n=21). Din numărul total de oocite puse în contact cu spermatozoizii s-a obţinut un procent de 31,57% (n=12) de oocite fecundate, iar procentul de zigoţi obţinuţi a fost de 13,57% (n=5), din care nu s-a dezvoltat stadiu de morulă sau blastocist, embrionii de oaie nefiind rezistenţi la stresul biochimic. Tabel 4: Caracteristicile oocitelor de oaie fertilizate înainte de introducerea lor în cultură

Placa

Petrii

Godeta

Observaţii după realizarea fertilizării

Observaţii după

realizarea

culturării

1

1

6 oocite cu MP înconjurate de spermatozoizi- 3 oocite cu citoplasme clare, contractate, 3 oocite cu citoplasme clare

3

F şi 3 NF

1

2

4 oocite cu MP înconjurate de spermatozoizi; cu citoplasmă clară 4 oocite cu MP înconjurate de spermatozoizi; 2 oocite cu citoplasmă

2 F şi 2 NF

1

3

clară; 1 oocit cu citoplasmă granulară, închisă la culoare, 1 oocit cu citoplasmă contractată, clară. 5 oocite cu MP înconjurate de spermatozoizi; 1 oocit mare cu

2

F şi 2 NF

1

4

citoplasmă granulară, 1 oocit cu citoplasmă granulară, retractată, 2 oocite cu citoplasmă clară 6 oocite; 6 oocite cu MP înconjurate de spermatozoizi, citoplasmă

2

F şi 3 NF

2

1

clară, contractată. 2 oocite cu MP înconjurate de spermatozoizi; 1 oocit cu citoplasmă

2

F şi 4 NF

2

3

1

F şi 1 NF

2

4

clară, 1 oocit cu citoplasmă retractă 6 oocite cu MP înconjurate de spermatozoizi; 4 oocite cu citoplasmă clară, 4 oocite cu citoplasmă retractată

6 NF

Legendă: F- oocite fecundate; NF- oocite nefecundate. Colectarea oocitelor de oaie prin metoda laparoscopică, apoi fertilizarea in vitro a lor şi culturarea in vitro a zigoţilor până la stadiul de blastocist, permite obţinerea unui număr mare de embrioni utilizaţi în transferul embrionar. Descendenţa femelelor de elită creşte în raport cu producţia de miei obţinuţi după transferul embrionilor obţinuţi in vitro (Cognie şi colab., 2001). Viabilitatea după transfer a embrionilor obţinuţi in vitro la femelele adulte este bună, cu evoluţie normală până la sfârşitul gestaţiei, însă este cu 10-15% mai scăzută decât viabilitatea embrionilor obţinuţi in vivo. Optimizarea metodelor de congelare a embrionilor produşi in vitro şi colectarea oocitelor prin puncţie foliculară asociată cu tehnica FIV va avea un efect benefic pentru ameliorarea speciilor (Houdebine ,1998). Oocitele mature sunt puse în contact cu spermatozoizii timp de 17 ore (10 6 /ml) în mediu SOF (Sinthetyc Oviductal Fluid) în atmosferă de 5% CO 2, la temperatura de 38 0 C, obţinându-se 75-80% embrioni fecundaţi normal. După inseminare, zigoţii prezumtivi sunt puşi în cultură în mediu SOF, timp de 7 zile în atmosferă controlată, astfel că după o săptămână de culturare blastocişti se obţin în prezenţa serului BSA (albumină serică bovină) în proporţie de 35-50% din oocitele supuse la FIV. Aceştia sunt transferaţi la oi receptoare, apoi dau naştere la miei normali. În câteva laboratoare s-a observat că prezenţa BSA fracţia V în cultura de embrioni poate induce naşteri anormale în procent de 2-3%, această anomalie neexistând în culturile de embrioni în care nu s-a folosit ser, ci mediul de cultură a fost suplimentat cu BSA şi diferiţi aminoacizi (Thompson şi colab., 1995).

Datorită problemelor tehnice întâlnite în cadrul desfăşurării experimentelor de embriocultură voi expune pe larg factorii care influenţează producerea in vitro a embrionilor.

Embriocultura şi consecinţele stresului adaptativ asupra embrionilor Sistemele de cultură embrionară preimplantaţională au fost realizate pentru studierea dezvoltării timpurii a embrionilor. Consecinţele în urma expunerii embrionilor la acţiune termică îndelungată depind de dezvoltarea tehnicilor de embriocultură, existând reguli stricte pentru explorarea potenţialului lor. Explorarea abilităţii embrionilor de dezvoltare ex vivo au beneficii ca obţinerea de fetuşi, fiind un tratament pentru infertilitate, o ameliorare genetică pentru speciile domestice, conservarea embrionilor animali şi pentru medicina celulelor stem. Tehnologii de embriocultură au fost realizate de Biggers şi colab., 1971; Whittingham, 1971; Wright şi Bondioli, 1981; Prather şi First, 1988; Eyestone şi First, 1991 a; Bavister, 1995; Biggers şi colab., 1998; Gardner şi colab., 1994. Pioneratul tehnologiilor de embriocultură s-a realizat pe şoareci (Biggers, Brinster, Wales şi Whittingham), apoi pe micile rumegătoare ( Wright, First şi Tervit) şi în final pe hamsteri şi oameni (Bavister). S-au observat obstacole în realizarea dezvoltării embrionare in vitro, iar unul din obstacolele frecvente este apariţia blocajului meiotic. Apariţia blocajului în stadiul de 2 celule la şoarece, a fost studiată de către Biggers, 1971; Abramczuck şi colab., 1977; Chatot şi colab., 1989. La micile rumegătoare blocajul se realizează în stadiul de 8-16 celule şi poate fii prevenit prin dezvoltarea unui sistem eficient de culturare (Everstone şi First, 1991 a,b). Resursele necesare pentru realizarea embrioculturii la micile rumegătoare sunt considerabile. Cercetări pe această temă au fost realizate şi de Leese şi colab., 1998; Young şi colab., 1998; McEvoy şi colab., 2001; Lane şi Gardner, 2005. Condiţiile de embriocultură variază, compoziţia mediului de cultură şi atmosfera de gaz nu este prestabilită pentru oricare din speciile mamaliene, excepţie fiind de embrionii de la porcine pentru care se foloseşte mediul NCSU 23. Inferilitatea înregistrată la oameni şi bovine necesită realizarea unor sisteme superioare cu medii calitative pentru asigurarea dezvoltării embrionare timpurii în condiţii optime, existând numeroase medii care ar putea fi folosite dar nu se cunoşte încă cantitatea optimă care ar trebuie utilizată. Mediile pot fi suplimentate cu aditivi precum serul (ser fetal bovin, uman) sau diferite albumine serice (fracţia V). Natura fizică a embrioculturii, temperatura optimă, densitatea embrionară (rata de acumulare a metaboliţilor şi a factorilor de creştere paracrini şi autocrini), utilizarea uleiului, gradul de umidificare şi atmosfera de gaz utilizată sunt diferite de la un laborator la altul. Experienţa tehnică de realizare a embrioculturii, expunerea la lumină şi la temperatura ambientală, calitatea atmosferei de gaz diferă. Embrionii au capacităţii diferite de a se dezvolta într-un sistem de cultură particular depinzând de bagajul genetic al lor (Whitten şi Biggers, 1968; Payne şi colab., 1992). Rămân necunoscute acţiunile substanţelor organice volatile şi a altor contaminanţii din laboratoare asupra embrioculturii. Impactul acestor factori variază de la un laborator la altul fiind un inhibitor al dezvoltării embrionare fiind considerat un stres negativ. Plasticitatea embrionilor se bazează pe capacitatea lor de a se dezvolta în condiţiile arătate. Condiţiile prezentate pot altera echipamentul metabolic al embrionilor (Biggers şi colab., 2005) dar sistemele de medii fără ser sunt utilizate cu succes pentru oameni (Gardner şi colab., 1998) şi la şoarece (Lane 2000 a, Lane şi colab., 2003). Totuşi gradul de adaptare al embrionilor la condiţiile de culturare sau rata de adaptare a embrionilor la condiţii diferite variază în funcţie de stresul biochimic. Măsurarea gradului de plasticitate al embrionilor se bazează pe analiza transcriptomelor, proteomelor şi metabolomelor embrionilor. Numeroase studii prezintă faptul că embrioni sunt supuşi la medii de cultură diferite determinându-se diferenţe ale nivelului ARN m pentru diferite gene (Ho şi colab., 1994; Wrenzycki şi colab., 1999, 2001; Niemann şi Wrenzycki 2000; Rizos şi colab., 2002b; Lonergan şi colab., 2003; 2004; Kind şi colab., 2005). Utilizarea recentă a microanalizelor, pentru embrioni supuşi la condiţii de culturare diferite, a mai mult de 100 de gene expresate în balstocistul de şoarece, arată apariţia unor modificări mici dar semnificative ale transcriptomului (Rinaudo şi Schultz 2004; Wang şi colab., 2005). Este

foarte important ca aceste condiţii de culturare să fie cât mai similare cu condiţiile fiziologice pentru a se produce embrioni de calitate crescută comparativ cu embrionii rezultaţi in vivo, înlăturându-se astfel posibiltatea moficării transcriptomelor, proteomelor pentru embrionii care sunt supuşi unor condiţii de stres crescute (Rinaudo şi Schultz 2004; Katz- Jaffe şi colab., 2005; Corcoran şi colab., 2006). Pentru aceste observaţii experimentale se pot adăuga şi calea de deviaţie pentru expresarea genelor embrionilor obţinuţi in vitro şi profilele de sinteză proteică care determină scăderea viabilităţii embrionilor şi dezvoltarea anormală fetală. Consecinţele prezentate influenţează semnificativ dezvoltarea embrionară.

CONCLUZII

În cadrul acestei lucrării de doctorat s-au efectuat patru experimente pe oi şi capre după cum urmează:

1. Colectarea oocitelor de capră şi oaie prin metoda chirurghicală şi fertilizarea in vitro a oocitelor obţinute

2. Influenţa sucurilor naturale asupra capacitării spermatozoizilor de berbec şi ţap

3. Influenţa sucurilor naturale, a hormonilor şi a factorilor de creştere asupra maturării in vitro şi fertilizării in vitro a oocitelor de capră

4. Realizarea de variante experimentale privind producerea in vitro a embrionilor de oaie Rezultatele obţinute ne permit formularea următoarelor aprecieri, comentarii şi concluzii:

1. a) La două loturi experimentale de oi s-a administrat tratament hormonal prin injectare la 7 zile, după

punerea bureţilor, cu eCG 500 UI, respectiv 400 UI, fiind aplicate tratamente de superovulaţie cu FSH ( doze de 6,25 UA, 4,17 UA şi 2,08 UA de FSH dimineaţa şi seara) sau cu Folligon 1000 UI (în ziua a 14 –a) după retragerea bureţilor;

b) La patru loturi experimentale de capre s-a administrat tratament hormonal prin injectare la 7 zile, după

punerea bureţilor, cu eCG 400 UI, fiind aplicate tratamente de superovulaţie cu FSH ( doze de 6,25 UA, 4,17 UA şi 2,08 UA de FSH dimineaţa şi seara- loturile 1 şi 3 ) sau cu Folligon 1000 UI (în ziua a 14 –a, loturile 2 şi 4)

după retragerea bureţilor;

c) Procentul de maturare a oocitelor la oi şi capre recuperate prin puncţie foliculară in vivo a fost scăzut

(pentru oi 76,92% şi 75,36% pentru capre).

d) Rata de fecundare a oocitelor la ovine şi caprine este mai mică de 50%. În cazul ovinelor rata de

fecundare a oocitelor (43,51%) este mai crescută decât la caprine (30,55%).

e) Examinarea morfologică la un stereomicroscop Nikon a pus în evidenţă clivajul (în 2 celule) pentru

oocitele culturate în mediul SOF+10% LF (n=26 din care n=12 -oaie şi n=14- capră) şi pentru oocitele culturate în mediul SOF cu 5 μl / ml EGF (n=21 din care n=10 - oaie şi n=11- capră).

2. a) Pentru sperma de ţap indicatorii biologici privind motilitatea, viabilitatea şi IS au valorile cele mai

crescute pentru mediul de centrifugare -gradient Percoll 20-80% (65%; 62, 01 şi 76,05% ).

b) Indicatorii biologici pentru sperma de berbec au avut valorile cele mai crescute pentru gradientul Percoll

45-90% comparativ cu mediul RPMI suplimentat cu BSA şi gentamicină (60; 54,31% 72,41% vs 50%; 47,32% şi

63,09%).

c)

După realizarea capacitării spermatozoizilor de berbec s-au studiat motilitatea, viabilitatea şi IS în

diferite medii bazate pe sucuri naturale şi antibiotice, obţinându-se cea mai crescută motilitate, viabilitate şi IS a

spermatozoizilor pentru mediul RPMI cu 50 µl FSH şi 10% suc de morcov (40%; 37,12% şi 62,01%), iar valorile cele mai scăzute au fost observate în cazul mediului RPMI cu 10 µl EGF şi 10 µl gentamicină (20%; 13,14% şi

26,28%).

d)

În cazul capacitării spermei de ţap cele mai crescute valori ale motilităţii, viabilităţii şi IS pentru

spermatozoizi au fost înregistrate pentru mediul RPMI cu 50 µl FSH şi 10 µl gentamicină (40%; 37,13% şi 61,61%) iar cele mai scăzute valori au fost observate pentru mediile TCM 199 cu 10% suc de castravete, cu suc de

portocală şi suc de kiwi (10%; 5,32% ; 8,18% vs 10% ; 4,14%; 6,36% vs 10% ; 4,92%; 7,56%).

3. a) Ovarele de capră au fost prelevate de la animale sacrificate, iar recoltarea oocitelor s-a realizat prin

puncţie foliculară in vitro (n=8) şi disecţie a foliculilor mari (n=24).

b) S-au testat 7 variante experimentale de medii de maturare dintre care mediul optim pentru maturarea in

vitro a oocitelor a fost mediul PBS suplimentat cu 100 µl/ml cisteamină, 20 ng/ml factor de creştere şi 50 ng/ml p FSH .

c) Timpul de incubare pentru o maturare optimă a oocitelor este de 17 ore, rata de maturare fiind de

93,75%, comparativ cu rata de maturare după 24 de ore care a fost de 65,62%.

d) Motilitatea spermatozoizilor de ţap a fost mai mare de 65% pentru mediul de capacitare 4 (mediu SOF

suplimentat cu BSA, 100 ng/ml Folliculotropin şi 10% castravete).

e) Din numărul total de oocite puse în contact cu spermatozoizii s-a obţinut un procent de 53,12% zigoţi, iar

procentul de embrioni în stadiul de 2 celule a fost de 15,62% din care nu a rezultat nici un stadiu de morulă sau

blastocist. Datorită blocajului meiotic al embrionilor în stadiul de 2 celule nu s-a obţinut stadiile de segmentaţie de morulă şi blastocist.

4. a) Ovarele de oaie au fost prelevate de la animale sacrificate, iar recoltarea oocitelor s-a realizat prin

puncţie foliculară in vitro (n=22) şi disecţie foliculară in vitro (n=16).

b) Timpul de incubare pentru o maturare optimă a oocitelor este de 17 ore, rata de maturare a oocitelor de

oaie fiind de 92,10%.

c) Motilitatea spermatozoizilor de bebec a fost mai mare de 60% pentru mediile de capacitare 5, 6 şi 7

(mediu PBS cu HEPES, 50 ng/ml pFSH ; mediu Hank’s, 20 ng/ml EGF şi mediu Dulbecos, 20 ng/ml pFSH şi 20 ng/ml LH ).

d) Din numărul total de oocite puse în contact cu spermatozoizii de berbec s-a obţinut un procent de 31,57%

de oocite fecundate, iar procentul de zigoţi obţinut a fost de 13,57%, din care nu s-a dezvoltat stadiu de morulă sau blastocist, embrionii de oaie nefiind rezistenţi la stresul biochimic, rămânând blocaţi în stadiul de 2 celule.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1.Abeydeera L., Wang W., Prather RS., Day BN.;Maturation in vitro of pig oocytes in protein – free culture media: fertilization subsequent embryo development in vitro. Biol. Reprod. May 58 (5): 1316-1320, (1998) 2.Abramczuk J.,Solter D and Koprowski H; The beneficial effect of EDTA on development of mouse one/cell embryos in chemically defined medium. Dev.Biol. 61, 378-383, (1977) 3.Acardo C., Dattena M., Pilichi S., Mara L., Chessa B., Cappai B.; Effect of recombinant human FSH and LH on in vitro maturation of sheep oocytes; Embryo development and viability. Anim. Reprod. Sci 81, 77-86,(2004) 4.Ali A.A., Bilodeau JF and Sirard MA; Antioxidant requirements for bovine oocytes varies during in vitro maturation, fertilization and development. Theriogenology 59: 939-949,( 2003) 5.Alok Teotia G., Taru Sharma G., and Majumdar A. C.; Fertilization and development of caprine oocytes matured over granulosa cell monolayers. Small Ruminant Research 40, 165-177, (2001) 6.Angiolini E., Fowden A., Coan P., Sandovici I, Smith P.; Regulation of placental efficiency for nutrient transport by imprinted genes. Placenta 27, Suppl A S: 98- S 102, (2006) 7.Avery B. Melsted JK., Greve T.; In vitro maturation of bovine cumulus-oocyte complexes in undiluted follicular fluid: effect on nuclear maturation, pronucleus formation and embryo development. Theriogenology 59, Issue 4: 987, (2002)

8.Baldassare H., Wang B., Lazaris A., Karatzas C.N.; Advances in the production and propagation of transgenic ewe using laparoscopic ovum pick-up and in vitro embryo production technologies. Theriogenology, 57, Issue 1: 275-284, (2002) 9.Baril G., Traldi A.L, Cognie Y., Leboeuf B., Beckers J.F, Mermillod P.; Successful direct transfer of vitrified sheep embryos. Theriogenology, 56: 299-305, (2001)

10. Bavister B.D.; Culture of preimplantational embryos. Fact and artifacts. Hum Reprod Update 1, 91-148, (1995)

11.Bedford JM; The co-evolution of mammalian gametes. In A comparative Overview of Mammalian Fertilization: 3-35, Eds. DS Dunbar and MG O’Rand. Plenum Press, New York, (1991) 12.Bedford JM , Cooper GW, Philips DM and Dryden; Distinctive features of the gametes and reproductive tracts of the Asian

musk shrew, Suncus murinus. Biology of Reproduction 50: 820-834, (1994) 13.Bevers M.M., Van der Hurk R., Izadyar F.; Regulation and modulation of oocyte maturation in the bovine. Theriogenology, 47, 17-22, (1997)

14. Bielanski A., Stewart B.; Ubiquitous microbes isolated from in vitro fertilization (IVF) system. Theriogenology, 45, 269 abstr. , (1996)

15.Biggers JD.; Metabolism of mouse embryos. J.Reprod. Fertile. Suppl 14, 41-54, (1971) 16.Biggers JD.; Reflections on the culture of the preimplantation embryo. Int.J.Dev.Biol.42, 879-884, (1998) 17.Biggers JD, Whitten WK., Whittinghan DG.; The culture of mouse embryos in vitro. In “Methods of Mammalian Embryology”, 86-116, (1971) 18.Biggers JD, Mcginnis LK., Lawitts JA.; One-step versus two-step culture of mouse preimplantation embryos:is there a difference? Hum Reprod. 20, 3376-3384, (2005) 19.Bols PEJ, Van Soom A., Ysebaert MT., Vandenheede JMM, Kruif A.; Effects of aspiration vacuum and needle diameter on cumulus oocytes complex morphology and developmental capacity of bovine oocytes. Theriogenology 45, 1001-1014,

(1996)

20.Bowman P., McLauren A.; Viability and growth of mouse embryos after in vitro culture and fusion. J. Embryol.Exp. Morphol. 23, 693-704, (1970) 21.Brown BW., Radziewic T.; Production of sheep embryos and development of progeny following single and twin embryo transfer. Theriogenology 49, 1525-1536, (1998) 22.Chang AS., Moley KH, Feinberg AP., Wangler M., DeBaun MR.; The association between Beckwith-Weidemann syndrome and assisted reproductive technology. A case series of nineteen patients. Fertil.Steril. 83, 349-354, (2005)

23.Chatot CL., Ziomek CA., Bavister BD., Lewis JL., Torres I.; An improved culture medium supports development of random-bred 1 cell mouse embryos in vitro. J.Reprod.Fertil. 86; 679-688, (1989) 24.Cognié Y, Poulin N., Pisselet C., Monniaux D.; Effect of atresia on the ability of follicular fluid to support citoplasmatic maturation of sheep oocytes in vitro. Theriogenology 43: 188-194 (1995) 25.Cognié Y.; Aplications of immunological techniques to enhance reproductive performance in the ewe 11th ICAR, Dublin, vol. 5, 192-3200, (1998) 26.Cognié Y and Poulin N.; Developmental competence of goats oocytes is increased after in vitro maturation with follicular fluid from goats stimulated by gonadotropins. Proc. 14 th int. Cong. Anim. Reprod. 18: 39-41, (2000) 27.Cognie Y., Poulin N., Baril G., Beckers J.F., Mermillod P.; Embryo survival after of “in vitro” and “in vivo” produced goat embryos. 17 th scientific Meeting of European Embryo Transfer Association, Lyon, 110, (2001) 28.Cognié Y, Poulin N., Mermillod P. ; Cysteamine improves in vitro goat oocytes maturation in defined medium. Proc 18 th Maeeting Assoc. Eur. Trans. Emb: 154-159, (2002) 29.Cognié Y, Baril G., Poulin N., Mermillod P.; Current status of embryo technologies in sheep and goat. Theriogenology 59:171-188, (2003) 30.Cojocaru A., Zamfirescu S., Anghel F., Dan M.; Cercetări privind influenţa unor medii de cultură asupra capacitării spermatozoizilor de berbec. Vol. rezumate “Cel de al 3-lea Simpozion Internaţional Biotehnologiile azi şi maine”: 63,

(1995)

31.Colleau J.J., Heyman Y., Renard J.P. ; Les biotechnologies de la reproduction chez les bovins et leurs applications reelles ou potentielles en selection. INRA Prod.Anim., 11, 41-56, (1998) 32.Comizzoli P., Mermillod P, Cognie Y., Chain N, Legendre X, Mauget R.; Successful in vitro production of embryos in the red deer (Cervus elephus) and the sika deer (Cervus nippon ). Theriogenology, 55, 649-659, (2001) 33.Corcoran D., Fair T., Park S., Rizos D., Patel OV.; Suppressed expression of genes involved in transcription and translation in in vitro compared with in vivo cultured bovine embryos. Reproduction 131, 651-660, (2006) 34.Cox GF, Burger j., lip V., Mau UA, Sperling K., Wu BL., Horsthemke B.; Intracytoplasmic sperm injection may increase the risk of imprinting defects. Am.J.Hum Genet. 71, 162-164, (2002) 35.Crozet N., Huneau D., De Smedt V., Theron MC., Tos S., Sevellec C.; In vitro fertilization with normal development in the sheep. Gamete Res. 16, 159-170, (1987) 36.Cummins JM., Robson SK and Rouse WG.; The acrosome reaction in spermatozoa of the grey-headed flying fox (Pteropus policephalus: Chiroptera) exposed barbed subacrosomal material. Gamete Research 21:11-22, (1987) 37.Day ML., Johnson MH., Cook DI.; A cytoplasmic cell cycle controls the activity of a K + channel in preimplantation mouse embryos .EMBO J. 17, 1952-1960, (1998) 38.DeBaun MR., Niemitz E and Feinberg AP.; Association of in vitro fertilization with Beckwith-Wiedemnn syndrome and epigenetic alteration of LIT 1 and H 19.Am.J.Hum.Genet 72, 156-160, (2003) 39.De Matos D., Furmus C., Moses D., Baldassare H.; Effect of cysteamine on glutathione level and developmental capacity of bovine oocytes maturated in vitro. Mol. Reprod. Dev. 42, 432-436, (1995) 40. De Matos D., Herrera C., Cortvrindt R., Smith J., Van Soom A., Nogueira D., Pasqualini R.; Cysteamine supplementation during in vitro maturation and embryo culture: a useful tool for increasing the efficiency of bovine in vitro embryo production. Mol. Reprod. Dev. 62:203-209, (2002) 41.Doherty AS., Mann MR., Tremblay KD., Bartolomei MS., and Schultz RM.; Differential effects of culture on imprinted H 19 expression in the preimplantation mouse embryo. Biol.Reprod. 62, 1562-1535, (2000) 42.Dojană N.; Fiziologia animalelor domestice. Ed.II. Editura Printech, p: 758-764, (2001) 43.Dulioust E., Toyama K., Busnel MC., Moutier R., Carlier M., Marchaland C., Ducot B., Roubertoux P and Auroux M.; Long –term effects of embryo freezing in mice.Proc. Natl.Acad.Sci. USA 92, 589-593, (1995)

44.Duquesnel R., Parisot D., Pirot G., Mialot J.P., Saboureau L., Étienne P., Delaval J., Guéraud J.M., Prengere E., De

Montigny G., Guerrault P., Perrin G., Humblot P., de Fontaubert Y. and Chemineau P.; La pseudogestation chez la chèvre, Ann. Zootech. 41 : 407-415, (1992) 45.Ecker DJ., Stein P., Xu Z, Williams CJ., Kopf GS., Bilker W.B., Abel T. and Schultz R.M.; Long-term effects of culture of preimplantation mouse embryos on behavior. Proc. Natl.Acad.Sci. USA 101, 1595-1600, (2004) 46.Edwards LJ., Batt PA., Gandolfi F. and Gardner D. K.; Modifications made to culture medium by bovine oviduct epithelial cells: changes to carbohydrates stimulate bovine embryo development.Mol.Reprod.Dev. 46, 146-154, (1997) 47.Eyestone WH., and First NL.; Coculture of early cattle embryos to the blastocyst stage with oviductal tissue or in conditioned media. J.Reprod. Fertil. 85, 715-720, (1991 a) 48.Eyestone WH., and First NL.; Characterization of development arrest in early bovine embryos cultured in vitro. Theriogenology 35, 613-623, (1991 b.) 49.Feil D., Lane M., Robertson CT., Kelly RL., Edwards LJ., Thompson JG., and kind Kl.; Effect of culturing mouse embryos under different oxygen concentrations on subsequent fetal and placental development. J.Psysiol. 572, 87-96, (2006)

50. Ferguson EM., and Leese HJ.; Trygliceride content of bovine oocytes and early embryos. J. Reprod.Fertil. 116, 373-378,

(1999)

51.Fernandez-Gonzalez R., Moreira P., Bilbao A., Jiménez A., Perez -Crespo M., Ramirez MA., Rodríguez de Fonseca F., Pintado B., and Gutierrez Adan.A.; Long-term effect of in Vitro culture of mouse embryo with serum on mRNA expresión of imprinting genes, development and behavior. Proc. Natl. Acad. Sci.101, 5880-5885, (2004) 52.Fieni F., Buggin,M., Bruyas J. F., Tainturier D., Dumont P., Perrin J., Beckers J. F., şi Daubie M. ; Developpement

embryonnaire caprin in vitro: etude des conditions de culture. Recueil de Medecine Veterinaire (FRA) 167, 435-444,

(1991)

53. Fleming TP., Kwong WY., Porter R., Ursel E., Fesenko I., Wilkins A., Miller DJ., Watkins AJ., Eckert JJ.; The embryo and

its future . Biol. Reprod. 71, 1046-1054, (2004) 54.Fukui Y., McGowan LT., James RW., Pugh PA., and Tervit HR.; Factors affecting the in vitro development to blastocyst of bovine oocytes matured and fertilized in vitro. J.Reprod.Fertil. 92, 125-131, (1991) 55.Gandolfi F., and Moor RM.; Stimulation of early embryonic development in sheep by coculture with oviduct epithelial cells. J.Reprod.Fertil. 81, 23-28, (1987) 56.Gandolfi F., Brevini TA., Richardson L., Brown CR., and Moor RM.; Characterisation of proteins secreted by sheep oviduct epithelial cells and their function in embryonic development. Development 106, Issue 2 : 303-312, (1989) 57.Gardner DK and Lane M.; Amino acids and ammonium regulate mouse embryo development in culture. Biol. Reprod. 48, 377-385, (1993) 58.Gardner DK and Lane M.; Ex-vivo early embryo development and effects on gene expression and imprinting. Reprod. Fertile. Dev. 17, 361-370, (2005) 59.Gardner DK, Lane M., Spitzer A., Batt PA.; Enhanced rates of cleavage and development for sheep zygotes cultured to the blastocyst stage in vitro in the absence of serum and somatic cells, amino acids, vitamins and culturing embryos in groups stimulate development. Biol. Reprod. 50, 390-400, (1994) 60.Ghiţă S., Zamfirescu S., Sogorescu E.,Nadolu D., Anghel A.; Influenţa unor medii naturale de diluţie supra pretabilităţii la congelare a materialului seminal la berbec. Simpozionul “Contribuţii ale cercetării ştiinţifice la dezvoltarea zonei rural- montane”, Sibiu –Cristian, Ed. Univerităţii “Lucian Blaga”., Lucrări ştiinţifice, vol 5, (2007) 61.Graff K. J., Meintjes M., Han Y., Reggio B. C., Denniston R. S.; Comparing follicle stimulating hormone from two commercial sources for oocyte production from out-of-season dairy goats. Journal of Dairy Science 83, 484-487, (2000) 62.Guerin Y., Cognie Y., Poulin N. ; Fecondation in vitro et aptitude au developpement chez les ovins et les caprins. In "Commission Speciale de Recherche sur les Ovins et les Caprins", INRA, (1997) 63.Guler A., Poulin N., Mermillod P, Terqui M., Cognie Y.; Effect of growth factors EGF and IFG –I and estradiol on in vitro maturation of sheep oocytes. Theriogenology 57, 209-218, (2000)

64. Harlow GM. and Quinn P.; Foetal and placental growth in the mouse after preimplantation development in vitro under

oxygen concentration of 5- 20%. Aust.J.Biol.Sci. 32, 363-369, (1979) 65.Harwich KM., Robinson JS., Walker SK.; Foetal outcome following the exposure of ovine embryos the high ammonium concentrations in vitro. In 31 st Proceedings of the Australian Society for Reproductive Biology 67, (2000) 66.Hemberger M., and Cross JC.; Genes governing placental development. Trends Endocrinol. Metab.12, 162-168, (2001) 67.Hiendleder S., Wirtz M., Mund C., Klempt M., Reichenbach HD., HD.; Tissue specific effects of in vitro fertilization procedures on genomic cytosine methylation levels in overgrown and normal sized bovine fetuses. Biol. Reprod. 75, 17- 23, (2006)

68. Ho Y., Doherty AS., and Schultz RM.; Mouse preimplantation embryo development in vitro: effect of sodium concentration

in culture media on RNA synthesis and accumulation and gene expression. Mol. Reprod. Dev. 38, 131-141, (1994) 69.Ho Y., Wiggleesworth K., Eppig JJ., Schultz RM.; Preimplantation development of mouse embryos in KSOM. Augmentation by amino acids and analysis of gene expression. Mol. Reprod. Dev. 41. 232-238, (1995) 70.Houdebine L.M. ; La trangenese animale et ses application. INRA Prod. Anim., 11, 81-94, (1998) 71.Izadyar F., Zeinstra E., Colenbrander B., Vanderstichele HM., Bevers M.M., In vitro maturation of bovine oocytes in the presence of bovine activine A and the affect the number of embryos. Animal. Reprod. Sci. Dec 2; 45 (1-2); 37-45,

(1996)

72.Katz DF, Overstreet JW.; Differences in the movement morphologicaly normal and abnormal human seminal spermatozoa. Biol Reprod, 26:556-70, (1982) 73.Katz DF, Morales P, Samuels SJ,Overstreet JW.; Mechanisms of filtration of morphologically abnormal human sperm by cervical muscus. Fertil Steril; 54:513-516, (1990) 74.Katz- Jaffe MG., Linck DW., Schoolcraft WB., and Gardner DK.; A proteomic analysis of mammalian preimplantation embryonic development. Reproduction 130, 899-905, (2005) 75.Kaye PL., and Gardner HG.; Preimplantation access to maternal insulin and albumin increases fetal growth rate in mice. Hum. Reprod. 14, 3052-3059, (1999) 76.Keefer CL., Stice SL., Paprocki Am., and Golueke P.; In vitro culture of bovine IVM-IVF embryos: cooperative interaction among embryos and the role of the growth factors. Theriogenology 41, 1323 -1332, (1994) 77.Kelly J.M.; The effect of nutrition during pregnancy on the “in vitro”production of embryo from resulting lambs, Theriogenology 63, Issue 7: 2020-2031, (2004) 78.Khosla S., Dean W., Brown D., Reik W and Fei R.; Culture of preimplantation mouse embryos affects fetal development and the expression of imprinted genes. Biol. Reprod. 64, 918-926, (2001 a) 79.Khosla S. Dean W, Reick W., and Feil R.; Culture of preimplantation embryos and its long-term effects on gene expression and phenotype. Hum. Reprod. Update. 7, 419-427, (2001 b) 80.Kind KL., Collet RA., Harvey AJ., and Thompson JG.; Oxygen-regulated expression of GLUT-1, GLUT-3, and VEGF in the mouse blastocyst. Mol.Reprod. Dev. 70, 37-44, (2005) 81.Kruip Th. A.M and den Daas JH G.; In vitro produced and cloned embryos: effects on pregnancy parturition of offspring. Theriogenology 47, 43-52, (1997) 82.Kuran M., Robinson JJ., Brown DS., and McEvoy TG.; Development, amino acid utilization and cell allocation in bovine embryos after in vitro production in contrasting culture systems. Reproduction 124, 155-165, (2002) 83.Kuzmina T. I., Alm H., DEnisenko V., Tuchschere A., Kanitz W., Torner H.; Effect of Recombinant bovine somatotropin (rbST) on cytoplasmic maturation of bovine oocyte and their developmental competence in vitro. Journal of Reprod. And Depelopment, vol 53, No 2: 309-316, (2007) 84.Lane M., and Gardner D.K.; Effect of incubation volume and embryo density on the development and viability of mouse embryos in vitro. Hum. Reprod. 7, 558-562, (1992) 85.Lane M., and Gardner D.K.; Increase in postimplantation development of cultured mouse embryos by amino acids and induction of fetal retardation and exencephaly by ammonium ions. J. Reprod. Fertil. 102, 305-312, (1994)

86.Lane M., and Gardner D.K.; Differential regulation of mouse embryo development and viability by amino acids. J. Reprod. Fertil. 109, 153-164, (1997) 87.Lane M., and Gardner DK.; Inhibiting 3- phosphoglycerate kinase by EDTA stimulates the development of cleavage stage mouse embryo. Mol. Reprod. Dev.60, 233-240, (2001) 88.Lane M., and Gardner D.K.; Ammonium induces aberrant blastocyst differention, metabolism, pH regulation, gene expression and subsequently alters fetal development in the mouse. Biol. Reprod. 69, 1109-1117, (2003 a)

89. Lane M., and Gardner DK, HaslerMJ., and Hasler J.F.; Use of G1.2/G2.2 media for commercial bovine embryo culture :equivalent development and pregnancy rates compared to coculture. Theriogenology 60, Issue 3: 407-419, (2003 b)

90. Lane M., and Gardner D.K.; Understanding cellular disruptions during early embryo development that perturb viability and fetal development. Reprod. Fetil. Dev. 17, 371-378, (2005)

91.Leese HJ., Donnay I., and Thompson JG.; Human assisted conception: a cautionary tale. Lessons from domestic animals.

Human Reprod. 13, suppl 4: 184-202, (1998) 92.Ling L., Jufen Q., Young Z.; In vitro fertilization of goat ovarian oocytes. Theriogenology 37:347, ( 1992) 93.Lonergan P, Rizos D, Gutierrez –Adan A., Fair T and Boland M.P.; Oocyte and embryo quality: effect of origin, culture conditions and gene expression patterns. Reprod. Domest. Anim. 38, 259-267, (2003)

94. Lonergan P, Pedersen HG., Rizos D., Geeve t, Thomsen PD., Fair T., Evans A and Boland MP.; Effect of the

postfertilization culture environment on the incidence of chromozone aberrations in bovine blastocysts. Biol. Reprod. 71, 1096-1100, (2004) 95.Mahner ER., Brueton LA, Bowdin SC., Luharia A., Cooper W., Cole TR., Macdonald F., Sampson JR., Barratt CL., Reik W., Hawkins MM.; Beckwith – Wiedemann syndrome and assisted reproduction technology. J. Med. Genet. 40, 62-64,

(2003)

96.Mann MR., Lee SS., Doherty AS., Verona RI, Nolen LD., Schultz RM., and Bartolomei MS.; Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture. Development 131. 3727-3735, (2004) 97.Marques, C.C., Pereira, R.M., Vasques, M.I., Baptista, M.C., Horta, A.E.M.; Role of prostaglandins on bovine oocyte maturation in vitro. Proceedings of 1st Iberian Congress on Animal, Vol. II: 142-149, (2000) 98.Mermillod P., Crozet N., şi Cognie Y.; Production in vitro d'embryons bovins, ovins et caprins: le point et les perspectives. In "2. Rencontres, Recherches, Ruminants", 373-378. INRA; Institut de 1'Elevage, Paris, (1996) 99.Mermillod P., Qussaid B and Cognie Y.; Aspects of folicular and oocyte maturation that affect the developmental potential of embryos. J. Reprod. Fert., Suppl., 54, 449-460, (1999) 100.McEvoy TG., Robinson JJ., Findlay PA., and Madibella O.R.; Ammonia concentrations during in vitro culture are elevated by human serum and somatic cells. J. Reprod. Fertil. Abstr. Ser 15, 72-75, (1995) 101.McEvoy TG., Robinson JJ., Aitken RP, Findlay PA. and Robertson I.S.; Dietary excess of urea influence the viability and metabolism of preimplantation sheep embryos and may affect fetal growth among survivors. Anim. Reprod. Sci. 47, 71- 90, (1997) 102.McEvoy TG., Robinson JJ., and Sinclair KD.; Developmental consequences of embryo and cell manipulation in mice and farm animals. Reproduction 122, 507-518, (2001) 103.Moor R.M. and Trounson A.O.; Hormonal and follicular factors affecting maturation of sheep oocytes in vitro and their subsequent development capacity. J. Reprod. Fert. 49, 101- 109, (1977) 104.Morales P, Cross NL, Overstreet JW, Hanson F.W.; Acrosome intact and acrosoome-reacted human sperm can initiate binding to the zona pellucida. Dev Biol 133: 385-392, (1994) 105.Niemann H., and Wrenzycki C.; Alterations of expression of developmentally important genes in preimplantation bovine embryos by in vitro culture conditions:Implications for subsequent development. Theriogenology 53, 21-34, (2000) 106.Nowshari M. A., and Holtz W.; Transfer of split goat embryos without zonae pellucidae either fresh or after freezing. Journal of Animal Science (USA) 71, 3403-3408, (1993)

107.Pareira R. J. T. A., Ayoub M., şi Holtz W.; Birth of live goat kids after in vitro maturation, fertilization and culture. Reproduction in Domestic Animals 30, 299-300, (1995) 108.Paria BC., and Dey SK.; Preimplantation embryo development in vitro: cooperative interactions amongst embryos and role of growth factors. Proc. Natl.Acad.Sci. USA 87, 4756-4760, (1990) 109.Payne SR., Munday R. and Thompson JG.; Addition of superoxide dismutaze and catalase does not necessarily overcome developmental retardation of one- cell mouse embryos during in in vitro culture. Reprod. Fetil. Dev. 4, 167-174, (1992)

110.Polland JW., and Leibo SP.; Chilling sensitivity of mammalian embryos. Theriogenology 41, 1555-1569, (1994) 111.Prather RS., and First NL.; A review of early mouse embryo genesis and its applications to domestic species. J.Anim. Sci. 66, 2626-2635, (1988)

112. Otoi T., Tachikawa S., Kondo S., Suzuki T.; Effect of antibiotics treatment of in vitro fertilized bovine embryos to remove adhering bacteria J Vet Med 54, Issue 4, 763-765 (1992)

113. Quinn P., Warnes GM., Walker SK., and Seamark RF.; Culture of preimplantation sheep and goat embryos. In “Reproduction in Sheep” 289-290, (1984) 114.Oussaid B. , Mariana JC., Poulin N., Fontaine J., Lonergan P., Beckers JF., Cognie Y.; Reduction of the developmental competence of sheep oocyte by inhibition of LH pulses during the follicular phase with a GnRH antagonist. J. Reprod.

Fert., 117, 71-77, (1999) 115.Rinaundo P and Schultz RM.; Effects of embryo culture on global pattern of gene expression in preimplantational mouse embryos. Reproduction 128. 301-311, (2004) 116.Rizos D., Fair T., Papadopulus S., Boland MP and Lonergan P. ; Developmental, qualitative and structural differences between ovine and bovine embryos produced in vivo and in vitro. Mol. Reprod. Dev., 62, 320-327, (2002 a.)

117. Rizos D., Lonergan P., Boland M.P., Arroyo –Garcia R., Pintado B., De La Fuente J., Boland MP., and Gutierrez –Andan

A.; Analysis of differential messenger RNA expression between bovine blastocysts produced in different culture systems: implication for blastocyst quality. Biol. Reprod. 66, 589-595, (2002 b) 118.Rizos D., Gutiérrez –Andan A, Perez –Garnelo S., De La Fuente J., Boland MP., and Lonergan P.; Bovine embryo culture in the presence or absence of serum : implications for blastocyst development, cryotolerance and messager RNA expression. Biol. Reprod. 68, 236-243, (2003)

119.Rodríguez-Gonzales E., Lopez –Bejar M., Velilla E.,Paramio MT.; Selection of prepubertal goat oocytes using the brilliant cresyl blue test. Theriogenology 57, 1397-1409, (2002) 120.Ryan J.P., Hunton J.R., Maxwell W.M.C.; Increased production of sheep embryos following superovulation of Merino ewes with a combination of PMSG and FSH-P. Reprod. Fert. Dev., 3, 551-560, (1991) 121.Shamsuddin M., and Rodriguez-Martinez H.; Fine structure of bovine blastocysts developed either in serum free medium or in conventional coculture with oviduct epithelial cells. J. Vet.Med.41, 307-316, (1994)

122. Shi W., and Haaf T.; Aberrant methylation patterns at the two-cell stage as an indicator of early developmental failure.

Mol. Reprod. Dev. 63. 329-334, (2002) 123.Sidhu, K.S. and Guraya, S.S.; Cellular and Molecular Biology of capacitation and Acrosome Reaction in Mammalian Spermatozoa. Int. Rev. Cytology 118, 231-280, (1989) 124.Silva C.C, Groome N.P., Knight P.G.; Demonstration of a suppressive effect of inhibin α subunit on the developmental competence of in vitro matured bovine oocytes . J. Reprod. Fert. 115, 381-388, (1999) 125.Sinclair KD., McEvoy TG., Maxfield EK., Maltin CA., Young LE., Wilmut I., Broadbent PJ. And Robinson JJ.; Aberrant fetal growth and development after in vitro culture of sheep zygotes. J. Reprod. Fertil. 116, 177-186, (1999) 126.Sjoblom C., Roberts CT., Wikland M., and Robertson SA.; Granulocyte- macrophage colony stimulating factor alleviates adverse consequences of embryo culture on fetal growth trajectory and placental morphogenesis. Endocrinology 146, 2142-2153, (2005) 127.Stock A.E., Woodruff T.K., Smith L.C.; Effect of inhibin A and activin A during in vitro maturation of bovine oocytes in hormone / and serum free medium. Biol. Reprod. 56,1559-1564, (1997)

128.Stringfellow DA, Wrathall AE. Epidemiological implications of the production and transfer of IVF embryos. Theriogenology, 43, 89-96 (1995) 129.Sogorescu E., Zamfirescu S. , Ghiţă S.; The biochemical and cytological characteristics of the production “in vitro” of sheep embryos, Annals of University of Iasi: 281-285, (2007) 130.Şogorescu E., Zamfirescu S., Rosoiu N., Anghel A.; The influence of natural media on the cryopreservation of ram semen, Romanian Journal of Biochemistry 45, Annual Internaţional Conference of the Romanian Society of Biochemistry and Molecular Biology, Bucharest, Ed. Academiei Române: 123, (2008)

131.Sogorescu E., Zamfirescu S., Rosoiu N.; The influence of natural media on the developmental competence of goat oocytes, 1 st Conference of the Balkan Network for the Animal Reproduction Biotechnology, Sofia:22, (2009 a) 132.Sogorescu E., Zamfirescu S. , Rosoiu N.; The influence of natural media on the capacitation of ram and buck semen, 1 st Conference of the Balkan Network for the Animal Reproduction Biotechnology, Sofia:66-72, (2009 b) 133.Sogorescu E., Zamfirescu S. , Anghel A.H.; The influence of media on the viability of the sheep embryos were obtained in vitro fertilization, International Scientific Symposium: “Modern Animal Husbandry – Science, Creativity and Inovation”: 162, (2009 c) 134.Taftă V. , Vintilă I., Zamfirescu S.; Producţia, ameliorarea şi reproducţia ovinelor. Ed. Ceres Bucureşti, 109- 111, (1997) 135.Tervit H.R., Pugh P.A., McGowan L.T., Bell A.C.S., Wells R.W.; The freezability of sheep embryos is affected by culture system and source. Theriogenology , 41, 315, (1996) 136.Tervit H.R.; Laparoscopy/laparotomy oocyte recovery and juvenile breeding. Animal Reproduction Science, 42, Number 1 (1996 ) 137.Thibault C., Levasseur M.C. ; La reproduction chez les mamiferes et l.homme. Coedition INRA-Ellipse, Paris, 505-532,

(2001)

138.Thibodeaux JK., Del Vecchio RP., and Hansel W.; Role of platelet derived growth factor in development of in vitro matured and in vitro fertilized bovine embryos. J. Reprod. Fertil. 98, 61-66, (1993) 139.Thompson JG. Simpson AC., Pugh PA., Donnelly PE. And Tervit HR.; Effect of oxygen concentration on in vitro development of preimplantation sheep and cattle embryos. J. Reprod. Fertil. 89, 573-578, (1990) 140.Thompson JG. Simpson AC., Pugh PA., Wright RW., jr. and Tervit H.R.; Glucoze utilization by sheep embryos derived in vitro and in vivo. Reprod. Fertil. Dev. 3,571-576, (1991) 141.Thompson JG. Simpson AC., Pugh PA. and Tervit HR.; In vitro development of erarly sheep embryos is superior in medium supplemented with human serum compared with sheep serum or human serum albumin. Anim. Reprod. Sci. 29. 61-68, (1992) 142.Thompson JG., Gardner Dk., Pugh PA., McMillan WH., and Tervit HR.; Lamb birth weight is affected by culture system utilized during in vitro pre-elongation development of ovine embryos. Biol. Reprod. 53, 1385-1391, (1995) 143.Thompson JG., Partridge RJ., Houghton FD., Cox CI., and Leese HJ.; Oxigen uptake and carbohydrate metabolism by in vitro derived bovine embryos. J Reprod. Fertil. 106, 299-306, (1996) 144. Thompson JG.; Comparison between in vivo derived and in vitro produced preelongation embryos from domestic ruminants. Reprod. Fertil. Dev. 9, 341-354, (1997) 145.Thompson JG., Sherman AN., Allen NW., McGowan LT., and Tervit HR.; Total protein content and protein synthesis within pre-elongation stage bovine embryos. Mol. Reprod. Dev 50, 139-145, (1998) 146.Thompson JG., McNaughton C., Gasparrini B., McGowan LT., and Tervit HR.; Effect of inhibitors and uncouplers od oxidative phosphorylation during compaction and blastulation of bovine embryos cultured in vitro. J Reprod. Fertil. 118, 47-55, (2000 a) 147.Thompson JG., and Peterson AJ.; Bovine embryo production in vitro: new developments and post-transfer consequences. Hum Reprod, 15 ,Suppl 5: 59-67, (2000 b)

148. Thompson JG., Kind KL., Roberts CT., Robertoson SA. and Robinson JS.; Epigenetic risks related to assisted reproductive technologies: Short and long term consequences for the health of children conceived through assisted

reproduction technology : more reason for caution? Hum Reprod 17, 2783-2786, (2002) 149.Topoleanu I., Zamfirescu S., Şogorescu E.; Recovery rate of oocytes using follicular puncture by different techniques on goats, Annals of University of Iasi: 286-291, (2007)

150. Van Wagtendonk de Leeuw AM., Aerts BJ., and Den Daas JH.; Abnormal offspring following in vitro production of

bovine preimplantation embryos: a field study. Theriogenology 49. 883-894, (1998) 151.Van der Ven HH, Hoebbel K, Al-Hasani S, Diedrich K, Krebs D.; Fertilization of human oocytes in capillary tubes using very low number of spermatozoa. A new treatment of severe oligozoospermia? Ann Urol;23:317-321, (1989) 152.Walker SK., Seamark RF., Quinn P., Warnes GM., Ashman RJ., Smith H and Ancell P.; Culture of pronuclear embryos of sheep in a simple medium. Proc. 11 th Int.Congr. Anim. Reprod. Artif. Insem. 4, 483-485, (1988) 153.Walker SK.,Heard TM., Bee CA., Frensham Ab., Warnes DM., and Seamark R.F.; Culture of embryos from farm animals. In “Embryonic Development and Manipulation in Animal Production” 77-92, (1992 a) 154.Walker SK.,Heard TM., and Seamark RF.; In vitro culture of sheep embryos without co-culture : successes and perspectives. Theriogenology 37, 111-126, (1992 b) 155.Walker SK.,Hartwich KM., and Seamark RF. ; The production of unusually large offspring following embryo manipulation: concepts and challenges. Theriogenology 45, 111-120, (1996) 156.Wang S., Cowan CA., Chipperfield H and Powers RD. ; Gene expression in the preimplantation embryo: in vitro developmental changes. Reprod. Biomed On line 10, 607-616, (2005) 157.Whitten WK., and Biggers JD.; Complete development in vitro of the preimplantation stages of the mouse in a simple chemically defined medium. J. Reprod. Fertil. 17, 399-401, (1968) 158.Whittingham DG.; Culture of mouse ova. J Reprod. Fetil. Suppl. 14, 7-21, (1971) 159.Wrenzycki C, Herrman D, Carnwarth JW and Niemann H.; Alteration in the relative abundance of gene transcripts in preimplantation bovine embryos cultured in medium supplemented with either serum or PVA. Mol. Reprod. Dev. 53,8- 18, (1999) 160.Wrenzycki C, Herrman D, Keskintepe L., Martins A jr, Sirisathien S., Barckett B., and Niemann H.; Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos. Hum. Reprod. 16, 893- 901, (2001) 161.Wright RW., jr. and Bondioli KR.; Aspects of in vitro fertilization and embryo culture in domestic animals. J. Anim. Sci. 53, 702-729, (1981) 162.Yamagimachi R.; Mammalian fertilization. The Physiology of Reproduction, vol 1: 135-185, In: Knobil EO, Neil JD Eds.,

(1994)

163.Young LE., Sinclair KD., and Wilmut I.; Large off spring syndrome in cattle and sheep. Rev. Reprod. 3, 155-163, (1998) 164.Young LE., Fernandes K., McEnvoy TG., Butterwith SC., Guttierez CG., Carolan C., Broadbent PJ., Robinson JJ., Wilmut I and Sincalair KD.; Epigenetic change in IGF 2R is associed with fetal overgrowth after sheep embryo culture. Nat. Genet. 27. 153-154, (2001) 165.Zamfirescu S., Anghel Fl.; Cercetari privind capacitarea spermatozoizilor de berbec, conditie pentru realizarea fertilizarii in vitro . Lucr.stiintif., IBD Buc.,Vol.II, 9, (1994) 166.Zamfirescu S., Cojocaru A., Barboi G., Confederat M.; Rezultate preliminare privind maturarea în cultură a oocitelor de la ovine şi caprine, Vol. rezumate “Cel de al 3-lea Simpozion Internaţional Biotehnologiile azi şi maine”: 10, (1995) 167.Zamfirescu S.; Metode de diagnostic şi tratament în stările de infertilitate la oaie. IABN Buc., 56- 59, (1997) 168.Zamfirescu S., Şchiopu S., Popa M., Nadolu D.; Morfological caracterization of morulae derived from prepubertal ewes oocytes. 17-th Sci. Meeting AETE, Lion, Franţa: 178-179, (2001) 169.Zamfirescu S., Al.Sonea.; Biotehnologii de reproducere la rumegatoarele mici. Ed. Ex. Ponto-Constanta, 350 pagini,

(2004)

170.Zander Dl., Thompsosn JG., and Lane M.; Perturbations in mouse embryos development and viability caused by ammonium are more severe after exposure at the cleavage stages. Biol. Reprod. 74, 288-294, (2006) 171. Zuelke K.A., Brackett B.G.; Luteinizing hormone enhanced in vitro maturation of bovine oocytes with without protein supplementation. Biol. Reprod. Nov. 43 (5), 784-787, (1990)

A. LUCRĂRI PUBLICATE ÎN REVISTE COTATE CNCSIS B + SAU B

1. Sogorescu E., Zamfirescu S., Ghiţă S.; The biochemical and cytological characteristics of the production in vitro of sheep embryos, Annals of University of Iasi: 281-285; ISSN- 1454-7368, (2007)

2. Topoleanu I., Zamfirescu S., Şogorescu E.; Recovery rate of oocytes using follicular puncture by

different techniques on goats, Annals of University of Iasi: 286-291; ISSN- 1454-7368, (2007)

3. Ghiţă S., Zamfirescu S., Sogorescu E., Nadolu D., Anghel A.; Influenţa unor medii naturale de diluţie

supra pretabilităţii la congelare a materialului seminal la berbec. Simpozionul “Contribuţii ale cercetării ştiinţifice la dezvoltarea zonei rural-montane”, Sibiu –Cristian, Ed. Univerităţii “Lucian Blaga”., Lucrări ştiinţifice, vol 5, ISSN 1842-1466, (2007)

4. Ghita Simona, Stela Zamfirescu, Şogorescu Elena; Haematological and biochemical parameters

obtained subsequent to the passive immunization of sheep with antiadipose tissue, Annals of University of Iasi:

271-276; ISSN 1842-1466, (2007)

5. Zamfirescu Stela, Sogorescu Elena şi Nadolu Dorina; Tendencies in the romanian sheep and goats

industries before and after the acesion to the European Union, „A Juhtenyesztes jelene es jovoje az Eu- Ban”,

Conferinta Internationala Expo Farmer, Debrecen, Ungaria, 63-67, ISBN 978-963-8030-58-0, (2008)

6. Sogorescu E., Zamfirescu S., Anghel Andreea Hortanse; Influenţa rasei asupra profilului biochimic al

serului recoltat de la ovine, Analele SNBC vol XIII:137-141, ISBN 1583-6258 (2008) 7. Anghel Andreea, D. Coprean, E. Sogorescu; Studiu preliminar privind incidenţa şi transferul

deoxinivalenolului din furaje în ser la ovine, Analele SNBC vol XIII:190-195, ISBN 1583-6258 (2008)

8. Sogorescu E., Zamfirescu S., Roşoiu N., Anghel Andreea Hortanse; Noi medii de cultură utilizate în

obţinerea embrionilor in vitro la micile rumegătoare, A XXVII-a Sesiune Anuala a Societatii Romane de Biologie Celulara, Bistriţa, Analele SNBC vol XVI, (2009, în curs de publicare)

B. LUCRĂRII PUBLICATE ÎN EXTENSO ÎN CADRUL VOLUMELOR DE CONFERINŢE,

SIMPOZIOANE NAŢIONALE ŞI INTERNAŢIONALE

1. Stela Zamfirescu, Elena Sogorescu si Gilbert Toussaint; Investigaţii asupra sistemelor de producţie

caprină în Romania, Simpozion „Dezvoltarea durabilă a zonei montane prin aplicarea unor tehnologii prietenoase cu mediul”, Sibiu (2008, în curs de publicare)

2. Zamfirescu Stela si Şogorescu Elena; Tendinţe ale sistemelor de producţie de ovine şi caprine în

Romania, înainte şi după intrarea Romaniei în Uniunea Europeană, Simpozion „Dezvoltarea durabilă a zonei

montane prin aplicarea unor tehnologii prietenoase cu mediul” , Sibiu, (2008, în curs de publicare)

3. Şogorescu E., Zamfirescu S. , Roşoiu N., Anghel A. si Gogozeanu N.; Acţiunea mediilor naturale de

capacitare asupra viabilităţii spermatozoizilor de berbec şi ţap, Simpozionul “Contribuţii ale cercetării ştiinţifice la dezvoltarea zonei rural-montane”, Sibiu –Cristian, Ed. Univerităţii “Lucian Blaga”, (2008) (în curs de publicare)

4. Şogorescu E., Zamfirescu S. , Rosoiu N.; The influence of natural media on the capacitation of ram

and buck semen, 1 st Conference of the Balkan Network for the Animal Reproduction Biotechnology, Sofia:66-72,

(2009)

C. LUCRĂRII PUBLICATE ÎN REZUMAT ÎN CADRUL VOLUMELOR DE CONFERINŢE,

SIMPOZIOANE NAŢIONALE ŞI INTERNAŢIONALE

1. Stela Zamfirescu, Şogorescu Elena, Leonard George Tobă; Embryo transfer in CEEC, Book of

abstracts of the international symposium, Goat Farming in Central and Eastern European Countries: Present and

Future, Constanţa, Ovidius University Press, Constanta: 31; ISBN: 973-614-311-2, (2006)

2. Stela Zamfirescu, Elena Şogorescu şi Gilbert Toussaint; The investigations of goat production systems

in Romania, Simpozion Internaţional FAO-CIHEAM, Ponte de Lima, Portugalia (2007)

3. Stela Zamfirescu, Irina Topoleanu, Dorina Nadolu, Simona Ghita, Elena Sogorescu; Observations

concerning hematological profile in goat, Simpozion Internaţional FAO-CIHEAM, Ponte de Lima, Portugalia,

(2007)

4. Stela Zamfirescu, Dorina Nadolu, Simona Ghita, Elena Sogorescu; Influenţa imunizării pasive cu ser

antigrăsime asupra cantităţii de grăsime din carcasele de iezi, Simpozion Biotech, Iaşi, (2007)

5. Simona Ghita, Stela Zamfirescu, Elena Sogorescu, Topoleanu Irina,

Anghel Andreea; Parametrii

Simpozion Biotech,

hematologici şi biochimici obţinuţi în urma imunizării pasive a ovinelor cu ser antiadipos, Iaşi, (2007)

6. Stela Zamfirescu, Dorina Nadolu, Simona Ghita, Elena Sogorescu; Influence of Passive

Immunization by Antifat Serum on Quantities of Fat in Kids Carcasses, Simpozion Internaţional IBNA, Baloteşti,

(2007)

7. Stela Zamfirescu, Dorina Nadolu, Elena Sogorescu şi Simona Ghita; The method of ex situ genofond

preservation on small ruminant in Romania. Embryotransfer in sheep and goat Simpozion Internaţional IBNA, Baloteşti, (2007)

8. Stela Zamfirescu, Dorina Nadolu, Simona Ghita, Elena Sogorescu; Influenţa imunizării pasive cu ser

antigrăsime asupra cantităţii de grăsime din carcasele de iezi si miei, Simpozion Biotech , Cluj –Napoca, (2007)

9. Şogorescu Elena, Stela Zamfirescu, Anghel Andreea; Influenţa rasei asupra profilului biochimic al serului recoltat de la ovine, Simpozion Biologie celulară (SNBC), Cluj – Napoca, (2007)

10. Andreea Anghel, Coprean Dragomir, Florica Busuricu, Elena Şogorescu; Studiu preliminar privind

incidenta si transferul deoxinivalenolului din furaje in ser la ovine, Simpozion Biologie celulară (SNBC), Cluj – Napoca, (2008)

11. Şogorescu E., Zamfirescu S., Rosoiu N., Anghel A.; The influence of natural media on the cryopreservation of ram semen, Romanian Journal of Biochemistry 45, Annual Internaţional Conference of the Romanian Society of Biochemistry and Molecular Biology, Bucharest, Ed. Academiei Române: 123, (2008)

12. Şogorescu E., Zamfirescu S., Rosoiu N.; The influence of natural media on the developmental

competence of goat oocytes, 1 st Conference of the Balkan Network for the Animal Reproduction Biotechnology, Sofia:22, (2009) 13.Sogorescu E., Zamfirescu S. , Anghel A.H.; The influence of media on the viability of the sheep embryos were obtained in vitro fertilization, International Scientific Symposium: “Modern Animal Husbandry – Science, Creativity and Inovation” Iaşi: 162, (2009)

14. Şogorescu E., S. Zamfirescu , N. Roşoiu si AH. Anghel; Noi medii de cultură utilizate în obţinerea embrionilor in vitro la micile rumegătoare, Buletinul Societăţii Române de Biologie Moleculară nr. 37, A XXVII- a Sesiune Anuala a Societatii Romane de Biologie Celulara, Bistriţa: 50,ISSN : 1584-5532 (2009 ) 15. Anghel A.H., S. Zamfirescu, D. Coprean, Şogorescu E.; Efectul cisteinei, albuminei serice şi a vitaminei E asupra calităţii spermei de berbec după congelare- decongelare, Buletinul Societăţii Române de Biologie Moleculară nr. 37, A XXVII-a Sesiune Anuala a Societatii Romane de Biologie Celulara, Bistriţa: 48, ISSN : 1584-5532 (2009)

D. STAGII DE SPECIALIZARE

1. - Diplomă de specializare la INRA Tours- Nouzilly, Franţa- tema: Fertilizarea in vitro a oocitelor de

capră - 26 noiembrie –15 decembrie, 2004

2. - Diplomă de specializare la CIHEAM-IAMZ –CIFEA- „Producţia caprină” – Murcia - Molina de

Segura, Spania - 6 noiembrie- 17 noiembrie 2006

3. - Vizita de lucru privind biotehnologiile de reproducţie la oi, şobolani şi iepuri– 1- 2 septembrie 2008 la

Institutul de Agricultură şi Biotehnologii, Godollo, Ungaria

E. PARTICIPĂRI LA CONFERINŢE NAŢIONALE ŞI INTERNAŢIONALE

1. Sesiunea Naţională de Biologie Celulară – Sighişoara, 10-13 iunie 2004

2. Sesiunea Naţională de Biologie Celulară – Sibiu 9-12 iunie 2005

3. „Info Day Biotech- Realizări, perspective, oprtunităţi”-16 decembrie 2005 Constanţa

4. Conferinţa Internaţională pentru Creşterea Caprinelor – Constanţa, 27-30 iunie 2006

5. Comunicare ştiinţifică – „Universitatea Ovidius” – Fertilizarea in vitro a oocitelor de ovine şi caprine,

2006 (prezentare orală)

6. „International Scientific Symposium – Performances and Competitiveness in Animal Production” , 26-27

aprilie, 2007 Iaşi (poster)

7. Simpoziomul Internaţional de Biologie animală şi nutriţie – Baloteşti 25-26 septembrie 2007 (poster)

8. Simpozion Biotech- Perspective în biotehnologia românească susţinute prin rezultatele obţinute în cadrul

programului CEEX – Modul 1, Biotech- 24-26 octombrie 2007, Cluj- Napoca (prezentare orală)

9. Simpozionul Internaţional FAO- CIHEAM – Ponte de Lima, Portugalia, 15-17 noiembrie

2007(prezentare orală)

10. Simpozionul Internaţional „Expo-Farmer 2008” – Debrecen, Ungaria, 27-31 august 2008 (prezentare

orală)

11. 1 st Conference of the Balkan Network for the Animal Reproduction Biotechnology, Sofia, Bulgaria, 16-

20 februarie 2009(prezentare orală, poster)

12. A XIX –a Sesiune de Comunicări Ştiinţifice,Universitatea Ovidius, Facultatea de Ştiinţe ale Naturii şi

Ştiinţe Agricole, Constanţa, 27-28 martie 2009(prezentare orală)

13. A XXVII-a Sesiune Anuală a Societăţii Române de Biologie Celulara, Bistriţa,11-14 iunie 2009

(prezentare orală)