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PLAN
C. La réaction d’agglutination
Principe : potentiel ζ
Paramètres internes et externes
Agglutination active : ex système ABO
Agglutination indirecte
Agglutination passive
2. Principe
La production d’Acm chez la souris ou le rat se fait par la technique
d’hybridation cellulaire. Elle consiste à fusionner des cellules
productrices d’Ac et des cellules d’une lignée myélomateuse. Cette
fusion conduit à la production de cellules hybrides ou hybridomes.
Sécréteur PEG
Myélome (immortel)
HGPRT+ LB M Non sécréteur
Mortel HGPRT-
Hétéromyélome
Sécréteur HM
HGPRT+
immortel Culture sur milieu HAT (Hypoxanthine,
aminoptérine, thymidine)
Aminoptérine
Ac
II/ Les réactions antigènes / anticorps
A. Généralités
Paratope
2
La réaction Ag/Ac est due à l’interaction
1
entre l’épitope et le paratope. Le complexe
(immun) Ag/Ac fait intervenir des liaisons Epitope Ag
faibles ; hydrogène, électrostatiques, les 3
forces de Van der Waals et interactions Ag + Ac ⇄ Ag-Ac
apolaires. La constante d’association K varie K = k1 / k2
4 12 K = [Ag Ac] / [Ag].[Ac]
entre 10 et 10 L/M.
Epitope séquentiel (linéaire) / épitope conformationnel
Ac monoclonal Sérum polyclonal (Ac polyclonaux)
B. La réaction de précipitation
1 : En milieu liquide : le test de l’anneau (« Ring Test »)
[Ac] croissantes
[Ag]
constante
ZONE
D’EQUIVALENCE
Ag B Ag B Ag B
Antigènes Ag A Ag A Ag A
Ag
Ac
Les Ag A et B n’ont
Les Ag A et B possèdent
aucun déterminant
des épitopes communs
antigènique commun
1 2 3
Gel
14
d2 = a.[Ag] + b Etalon 1 ; 1,5 mg/l
12
10
diamétre2
Etalon 2 ; 3 mg/l
8
6
4
Etalon 3 ; 6 mg/l
2
0
0 2 4 6 8 [Ag] inconnue ; ? mg/l
[Protéine] (mg/l)
Electro-immunodiffusion (Laurell)
« Rockets » 14
12
hauteur (h)
10
8
h
6
4
2
0
0 2 4 6 8
1 2 3 4 ?
Etalons [Protéine] (mg/l)
C. La réaction d’agglutination
1 : Principe
Les réactions d’agglutination mettent en jeu un Ag situé à la
surface d’une particule de taille comprise entre le dixième et la dizaine
de micron (globules rouges, globules blancs, plaquettes, spermatozoïdes,
micro-organismes, billes de latex ou de sépharose). C’est un phénomène
complexe au cours duquel les Ac s’unissent aux Ag portés par la
particule formant ainsi des ponts spécifiques entre ces particules
permettant leur réunion en amas.
2 : Le potentiel Zêta
Deux forces antagonistes jouent un rôle dans l’interaction des
particules entre elles : - la tension interfaciale, qui tend à agréger les
particules entre elles.
- la force de répulsion (prédominante), à effet
opposé, elle provient des charges électriques identiques des particules.
_ + + + _
+ + + CH2OH
HO C H
_ + +
+ + _ HOOC HO C H
GR O
+
+
ζ H
OH
_ NANA (acide sialique)
+ + OH H
+ H H
+ +
+ + H NH2
_ _
+ +
_ _ La force de répulsion est fonction du
potentiel ζ (-16 mV pour [NaCl] = 0,15
Pollack : ζ = σ / (D x √µ) M). Lorsque les Ac recouvrent les GR,
l’état électrique est modifié, en cela les
IgM s’avèrent plus efficaces.
σ : charge électrique
D : constante diélectrique du milieu
µ : force ionique du milieu
4 : Les réactions
Agglutination active
Elle résulte d’une union spécifique entre un Ac agglutinant et un Ag
appartenant en propre à la particule. Elle peut se faire en tubes, en
microplaques ou sur lame et peuvent être qualitatives ou quantitatives
(la dernière dilution du sérum où l’on observe encore une agglutination).
Les techniques :
1. Ajout au MR des macromolécules qui pontent les Ac unis à des
cellules voisines (par րD). ex la BSA, le Dextran, le Ficoll…
3. Utilisation Ac anti-Ac
GR GR
Ac anti-isotype
Phénotypage Rhésus
Agglutination passive
Elle est réalisée entre un Ac et un Ag normalement soluble, mais rendu
particulaire par fixation sur un support :
1. Les billes de latex ; l’Ag est fixé par simple contact (pH 8,2)
2. Les hématies ; l’Ag est fixé par simple contact, par traitement à
l’acide tannique, par fixation chimique (glutaraldéhyde, di-nitro
chloro-benzéne…) ou par fixation immunologique (cas des Ac dirigés
contre des épitopes du GR).
Inconvénients : - fragiles, elles s’hémolysent en 3 semaines (utilisation
d’hématies formolées, stables plusieurs mois à 4°C)
- elles portent une mosaïque d’Ag
PLAN
II/ L’immuno-empreinte
A. Séparation des Ag par SDS-PAGE
B. Le transfert des protéines sur membrane
C. La révélation immunologique
III/ L’immunofluorescence
A. Indirecte (IFI)
Principe
Rappel sur la fluorescence
Organigramme expérimental
Applications
B. Directe (IFD)
Méthodes
En phase homogène : La fixation de l’enzyme au complexe immun
modifie son activité (révélation directe).
En phase hétérogène : Activité enzymatique inchangée après la
fixation (besoin d’une étape de séparation entre les complexes
marqués et l’Ag ou Ac marqués).
Systèmes biologiques
Ag : liquide biologique, une préparation brute ou purifiée de l’Ag
ou de l’haptène.
Ac : immunosérum total, des Ig purifiées ou des Acm (évite les
réactions croisées).
Tétraaminobenzidine, H2O2
galactopyrannoside
(ONPG)
Activité enzymatique
liée au support (DO)
[Ag x]
Activité enzymatique
liée au support (DO)
[Ac x]
[Ac]
✑ Protocole expérimental en TP
C. Applications
Protéine native A
SDS
Dithiotreïtol
A S S B Fragments polypeptidiques
100°C, 3 minutes
CH2 SH
HC OH CH3 (CH2)11 SO3- Na+
HC OH ⊝
CH2 SH SDS
DTT B
120 V
A t=2h
Coussins absorbants
Papiers buvards
Le tampon de transfert contient
Membrane de nitrocellulose
du méthanol qui augmente la
Gel de polyacrylamide capacité de la NC à absorber les
protéines, et empêche le gel de
Papiers buvards
gonfler
Coussins absorbants
CATHODE
⇐ 35,3-kDa
⇐ 28,2-kDa
⇐ 20,8-kDa
C. La révélation immunologique
1/ Principe
H2O2
Second Ac
Luminol
Peroxydase oxydé
Forme oxydée
Protéine de l'enzyme LUMIERE
+
Premier Ac Luminol
(Sérum) +
Activateur
O O
-
NH H2O2 O
- + N2 + Lumière
NH Peroxydase O
NH2 O NH2 O
Ex : révélation colorimétrique
SDS-PAGE 4%
Extrait de peau
160 kDa
III/ L’immunofluorescence
A. Indirecte (IFI)
1/ Principe
Second Ac - FITC
Premier Ac
FLUORESCENCE
(Sérum)
Microscope à
Coupe tissulaire fluorescence
Emission
Microscope à fluorescence :
A lumière réfléchie
A lumière transmise
Lampes à vapeur d’halogène ou de mercure
Système d’acquisition : appareil photos, caméra…
Incubation des coupes (3-4 µm) fixées sur lame avec le sérum ou l’Ac
dilué dans du tampon PBS (1 h)
4/ Applications
Auto-immunité : détection des Ac anti-nucléaire, anti-organites ou
Ac spécifiques d’organe.
humain
Epiderme
HepG2
Anti-ADN natif, dénaturé, Anti-Dsg1
anti-histones, etc.
Microbiologie : bactériologie, virologie (cinétique de multiplication
de virus, détection de virus responsable d’infection respiratoire)…
B. Directe (IFD)
Méthode en « un temps », l’Ag est recherché directement par l’Ac
spécifique marqué.
2. Méthodes chromatographiques
Echangeuse d’ions, par ex fractionnement sur résine basique type
diéthylaminoéthyl (DEAE cellulose), présence des Ig dans le 1er
pic d’élution à 99,5 % de pureté.
Affinité, sur colonne de protéine A (protéine de paroi de 90% des
S. aureus, capable de fixer le fragment Fc des Ig) ou de protéine
G (Steptococcus).
Exclusion moléculaire (gel filtration, tamis moléculaire), sur
Séphadex 150 (limite d’exclusion 200 kDa) pour fractionner les Ig
(150 kDa), sur Sépharose 4B (limite d’exclusion 4000 kDa) pour
fractionner IgM (970 kDa)…
HPLC, fractionnement d’un sérum en 30 min
3. Ultracentrifugation
Centrifugation du sérum à 100 000 g pendant 18 h sur gradient de
saccharose, IgM dans les premières fractions (19 S) puis les Ig (8 S
à 6,6 S).
4. Purification d’Ac spécifiques
Rq : les solutions d’élution sont acides (pH proche de 2,5), il est donc
nécessaire de neutraliser le pH du milieu rapidement.
FICHE TECHNIQUE N°3
PLAN
A. Principe
Bactéries + phages
Incubation 4 h à 37°C
Incubation 4 h à 42°C
Boîte de Pétri
Révélation des filtres en
Filtre de nitrocellulose imprégné
immuno-empreinte
d’IPTG (expression de l’ADNc de
chaque phage)
1 tache positive
Prélèvement du spot correspondant
sur la boîte de Pétri
(IPTG: isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)
De même dans la PR, une autre cible des auto-Ac présents chez
57% des malades est la calpastatine (Mimori et al)
A. Le protéome
Il est défini (1995) comme la totalité de la partie protéique exprimée
dans une cellule, un tissu, ou un organisme donnée (dans une situation
donnée ; physiologique, pathologique…). C’est un moyen de “décodage”
de l’expression protéique des génes et des mécanismes contrôlant
cette expression.
Pourquoi ?
Les niveaux d’expression protéique ne sont pas le reflet des niveaux
d’expression des ARNm, les protéines peuvent être modifier
(maturation co- et post-traductionnelle) et le protéome est
dynamique !
B. Méthodologie
3 étapes : - séparation des protéines de l’échantillon biologique par
électrophorèse bidimensionnelle (E-2D).
- le traitement et la mise en image pour établir une carte
protéique.
- la caractérisation des protéines par spectrométrie de
masse.
1: L’électrophorèse bidimensionnelle
Elle combine 2 séparations des protéines selon 2 critéres
indépendants le pI et la masse (pouvoir de résolution très élevé de E-
2D). Elle est trés reproductible, a un haut pouvoir de résolution et
posséde un caractère préparatif.
accélérateur
Aiguille de
l ’électrospray
réflecteur
PLAN
A. Les prélèvements
Origine : sang périphérique, moelle osseuse, ganglions, rate, biopsie
pathologique
1. Centrifugation simple
Plasma (riche en
200 g pendant 10 min plaquettes)
Leucocytes
Globules rouges
2. Utilisation du Ficoll
Ficoll : glucide ramifié artificiel (d20°C = 1,077)
Prélèvement
sanguin
400-650 g
Plasma
3. Utilisation du Dextran
Permet de séparer les polynucléaires
Prélèvement
sanguin
Dextran
100 g, 10 min à 20°C
Plaquettes
Polynucléaires
4. Utilisation du Percoll
Percoll : milieu de microbilles de silice enrobées
séparation en gradient continu ou discontinu
Les cellules sont déposées sur le gradient de Percoll et centrifugées
30 min à 400 g. Les cellules mononuclées se trouvent dans l’anneau
d’interphase.
5. L’élutriation
Basée sur gradient de densité
Prélèvement à l’interphase
Appareillage : automate
Séparation de grandes quantités de cellules
But : retenir les cellules soit par adhérence spontanée, soit par
l’intermédiaire d’Ac ou de lectine.
1. Adhérence simple
Adhérence spontanée au plastique de certaines populations
cellulaires (Mo, Ma, certains Ly), incubation 2 h à 37°C.
2. Adhérence immune
Les cellules sont retenues par des Ac ou des lectines fixés au fond
d’une boîte de Pétri
4. Rosettes
Principe : entourer les cellules concernées par de GR = « rosettes »
Après séparation par un Ficoll, les rosettes se trouvent dans le culot
et les GR sont ensuite éliminées.
5. Billes
Variables par leur taille et leur nature (par ex : agarose,
polystyrène, chlorure de polyvinyle, silice, latex, Nylon)
2. Le tri cellulaire
Cette fonction de la CMF, permet de séparer physiquement les
éléments d’une ou deux populations cellulaires définies par leurs
propriétés optiques.
Le flux peut être fractionné par :
- une séparation mécanique (300 cellules déviées / s)
- vibration associée à la déviation dans un champ
électrique ; la veine liquide, préalablement chargée électriquement,
est fractionnée en gouttelettes par vibration (US). La gouttelette
(contenant la cellule) est déviée par un champ électrique et collectée.
Jusqu’à 3.103 – 5. 103 cellules analysées / s (1.104 – 2. 104)
3. Avantages et limites
Analyse quantitative, sensibilité de détection, rapidité, analyse
multiparamétrique cellule par cellule, tri
5. Applications de la CMF
2. Cytotoxicité par Ac
Principe : tuer une population cellulaire par des Ac fixant le
complément ou des Ac couplés à des toxines (la ricine par ex).
II/ La technique ELISPOT (« Enzyme-linked immunospot »)
1983
1. Principe
Détecter et dénombrer les cellules T activés chez un patient, en
détectant la sécrétion de cytokines (l’INFγ notamment).
A l’origine, utilisée pour l’activation des cellules B
En 1996, adaptée pour l’analyse de l’activation des lymphocytes T
Activation
CPA LT LT
Différenciation
Sécrétion de cytokines
Premier signal : CMH/peptide/TCR
Second signaux : cosignaux CD28/B7.1-2, CD154/CD40…
V D J C
Echantillon
Les 4 segments sanguin
recombinés formant
la chaîne β du TCR
Lymphocytes T
ARN
V D J C
Amplification par PCR
Analyse par
électrophorèse
Distribution
Traitement des résultats
Avantages :
- extraordinaire sensibilité
- travailler avec un très petit nombre de cellules (- de
20)
PLAN
-1-
I/ Rappels sur le CMH / HLA
Notion d’épitope T
A. Organisation du CMH
Chr 6p21.3
4000 kb, 1/1000e du génome humain environ
Système multigènique (>200 gènes)
Organisé en 3 sous-régions
• Dont les produits des gènes se distinguent par :
leur structure
leur fonction
leur localisation cellulaire
• On distingue :
Les locus de classe I
. Gènes A, B et C
. Présentation au lymphocyte T CD8+
-2-
Autres locus de classes I et II
. Classes I non classiques ou Ib : gène E, F, G, MIC
. Classes II (rôle d’apprêtement) : DM, DO, TAP1, TAP2, LMP2, LMP7
Codominance
conséquences :
• Diversité des molécules HLA chez un individu : hétérozygotie,
codominance
• Diversité entre individus : nombre élevé d’haplotypes différents
• Transmission en bloc d’un haplotype
Expression forte :
• Lymphocytes
• Cellules dendritiques
• Macrophages
-3-
Expression diminuée par :
• Infection virale
• Cellules tumorales
2. Structure biochimique
Glycoprotéines transmembranaires exprimées à la surface des cellules
Association non covalente :
• D’une chaîne lourde α :
. Codée par les gènes de classe I (A, B et C)
. Polymorphe
. 3 domaines extracellulaires
• D’une chaîne légère β : β2 microglobuline
. Non HLA (Chr 15)
. Monomorphe
. Rôle important (conformation)
Structure tridimensionnelle (Bjorman, 1987) : Sillon de présentation
• Formée par α 1 et α 2
• Fond : 8 feuillets β plissés antiparallèles
• Bords : 2 hélices α
Toujours occupée par un peptide
Autres cellules :
• Epithélium thymique.
• Epithélium digestif et respiratoire.
-4-
• Progéniteur hématopoïétique.
• Endothélium vasculaire activé.
Lymphocyte T activé.
2. Structure biochimique
Glycoprotéines transmembranaires exprimées à la surface des cellules
Structure tridimensionnelle :
• Sillon plus ouvert à ses extrémités.
• Sillon : α1 et β1
- Taille des peptides présentés : plus variable (13 à 34 aa), mais c’est la
séquence centrale de 8-10 aa qui interagit avec le sillon. Les extrémités N
et C-ter débordent du sillon.
Apprêtement ("processing")
Pas le même type d'Ag
Pour les classes I et les classes II
Pas au même lymphocyte
Classes I :
• Ag : protéines intracellulaires
. Constituants cellulaires (normaux, Ag tumoraux)
. Virus, bactéries intracellulaires
-5-
• LT : CD8+ cytotoxique
• Mécanisme effecteur : cytotoxicité
• Fonction :
. Surveillance du contenu protéique de la cellule
. Défense anti-infectieuse vis à vis des germes intracellulaires
En accord avec l'expression ubiquitaire des classes I
Classes II :
• Ag : protéines extracellulaires et membranaires (Bactéries)
• LT : CD4+ auxiliaire
• Mécanisme effecteur : Ac
• Fonction :
. Défense antibactérienne
En accord avec l'expression des classes II sur les APC
-6-
Long, fastidieux => n'est plus utilisé
3. Méthode biochimique
Isoélectrofocalisation
5. Séquençage direct
En recherche
6. Nomenclature
Classes I : A, B, C + N° d'allèle
-7-