1

CAPITULO 1
INTRODUCCIÓN

1.1 OBJETIVOS
Los objetivos planteados para esta experiencia son de realizar dos métodos para la
determinación de proteína total en una muestra patrón y dos muestras problemas por
duplicado. Estos métodos serán Bradford y Lowry. Para cada uno se obtendrá una
curva de calibrado por duplicado.
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CAPITULO 2
ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS

2.1 PROTEÍNAS Y ALIMENTOS

2.2 FUNDAMENTOS CARACTERIZACION PROTEÍNAS

2.2.1 Espectofotometria

2.3 METODOS CARACTERIZACION PROTEINAS

2.3.1 Método de Bradford

2.3.2 Método de Biuret

Método colorimétrico de cuantificación de proteínas. Esta reacción apreciable a simple

vista ocurre gracias a la presencia de enlaces peptídicos.
El reactivo del Biuret lleva sulfato de Cobre (II) y sosa. El ión Cu2+, en este medio
fuertemente alcalino, se coordina con cuatro átomos de Nitrógeno, formando un
complejo de color violeta (Biuret) cuya intensidad es proporcional a la concentración
de proteínas.
Se mide la absorbancia a 540 [nm]. La sensibilidad del método es de 0,25-200 mg de
proteínas por ml de solución.

2.3.3 Método de Lowry

También es un método colorimétrico de cuantificación proteica. Se basa en la

naturaleza de las cadenas laterales de ciertos aminoácidos, como el triptófano y la
tirosina. La muestra de proteína de trata con el compuesto de Folin-Ciocalteau
modificado, en un proceso dividido en partes:
1. En medio cúprico alcalino, las proteínas se unen a los iones Cu2+ formando
complejos con átomos de Nitrógeno; éstos provocan el desdoblamiento de la
estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos de interés La
solución adquiere una coloración azul claro.
 3

2. La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau por los

grupos fenólicos de los residuos de tirosina y triptófano presentes en las proteínas
(actuando el cobre como catalizador). El principal constituyente del reactivo de Folin
Ciocalteau es el ácido fosfomolibdo túngstico, que al ser reducido por los grupos
fenólicos dando lugar a un complejo de color azul intenso.
Se mide la absorbancia a 650 nm. La sensibilidad del método es de 1-200 µg de
proteínas por ensayo.

2.3.4 Método de Kjeldahl

2.3.5 Método de absorción UV a 280 nm
2.3.6 Otros métodos

CAPITULO 3
 4

RESULTADOS

3.1 DILUCIONES MUESTRAS

Para poder realizar la experiencia de manera efectiva, fue necesario realizar diluciones
diferentes para cada método, esto debido a la diferencia de rango en cuanto a su
especificidad.

Por ello se tomo un valor arbitrario que se encontrase entre los limites del rango de
cada método y con ello se pudo obtener las diluciones correspondientes. Esto se
puede apreciar en las tablas a continuación.

Tabla 3.1 Dilución Harina de soya

Muestra 1 : Harina de Soya Bradford Lowry
Especificidad [ug/ml] 100-1000 10-100
% Proteína Harina de soya 30-40 30-40
Valor estimado [ug/ml] 2400 50
Concentración proteínas esperado [ug/ml] 720-960 15-20
Muestra harina [ug] 60000 1250
Volumen Agua [ml] 25 25
Concentración muestra [ug/ml] 2400 50

Tabla 3.2 Dilución Leche descremada

Muestra 2 : Leche descremada Bradford Lowry

Especificidad Lowry [ug/ml] 100-1000 10-100
% p/v Proteína Leche descremada [ug/ml] 34500 34500
Valor estimado [ug/ml] 690 80
Volumen aforado [ml] 250 250
Volumen muestra [ml] 5,0 0,6
Concentración muestra [ug/ml] 690 80

3.2 METODO DE BRADFORD

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Tabla 3.3 Datos método de Bradford

Concentración
Tubo Absorbancia
Albúmina
B 0 método de Bradford
Tabla 3.4 Curvas calibrado 0
1
Grupo Duplicado 200
Curva : Y= mx +b / y: Absorbancia [nm] ; x: Concentración [ug/ml]
Curva Correlación (R )2 0,176
21 400 ·x+0,051048
-4
A y=9,004286·10 ·x+0,02929 0,9778
B y=8,875714·10 -4

-4
0,9894 0,466
A y= 7,675·10 ·x+0,0322 0,9840
32 B
A
600
y=7,45·10 -4

-4
·x+0,031
y=7,53·10 ·x+0,0434
0,9800
0,9590
0,619
4 3 B
800 - -
0,701
decidió5 1000
De acuerdo a las curvas de calibrado, además de sus respectivas correlaciones, se
utilizar la curva y=8,875714·10-4
·x+0,051048 obtenida por nuestro grupo, ya 0,915
que es la que posee la mejor correlación.

Los datos de absorbancia de los otros grupos obtenidos en el laboratorio se

encuentran en el apéndice 1.

Tabla 3.5 Resultados muestras problemas por método de Bradford

Muestra Duplicad Concentración
Absorbancia [nm]
Problema o [ug/ml]
A 0,055 4,4526
1
B 0,072 23,6060
A 0,566 580,1809
2
B 1,312 1420,6767

Gráfico 3.2 Curva calibrado Absorbancia A Grupo 1 método de Bradford

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Gráfico 3.3 Curva calibrado Absorbancia B Grupo 1 método de Bradford

Para los gráficos solo se consideró las curvas realizadas por nuestra experiencia, y no
la de los otros grupos.

3.3 METODO DE LOWRY

A continuación se muestran los datos experimentales obtenidos por los grupos que
realizaron el método de Lowry

Tabla 3.6 Datos de laboratorio para método de Lowry

Tubo Concentración Absorbancia A [nm] Absorbancia B [nm]

B 0 0 0
1 20 0,049 0,059
2 40 0,098 0,083
3 60 0,132 0,132
4 80 0,153 0,155
5 100 0,197 0,158

Tabla 3.7 Curva calibrado método de Lowry

Curva : Y= mx +b / Y: Absorbancia [nm] ; x: Concentración [ug/ml]
Grupo Duplicado Curva Correlación (R2)
A y=0,001901·x+0,009762 0,9844
Lowry B y=0,00161·x+0,017333 0,9375

Según las correlaciones de la tabla 3.7, se decide utilizar la curva

y=0,001901·x+0,009762, ya que es la que posee la correlación más cercana a 1.

Tabla 3.8 Resultados muestras problemas por método de Lowry

Muestra Duplicad Concentración
Absorbancia [nm]
Problema o [ug/ml]
A
1
B
2 A
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Tabla 3.4 Curva calibrado absorbancia A método de Lowry

Tabla 3.5 Curva calibrado absorbancia B método de Lowry

CAPITULO 4
DISCUSIONES

4.1 DILUCIONES MUESTRAS

Las diluciones realizadas fueron escogidas arbitrariamente, esperando que se
cumpliera lo que el producto indicaba, ya que por ejemplo podría haber sido que el
rango que se escogió para la harina no fuese el adecuado, pues quizás podría ser que
cumpliese con el 30-40% de proteínas pero en un rango menor, o viceversa, en un
rango mayor.
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Para la leche ocurre exactamente lo mismo, estas decisiones podrían incidir en el valor
que se obtuvieron en al medir las absorbancias en cada método. Pudiendo quedar
fuera del rango que se deseaba.

4.2 METODO DE BRADFORD

Al realizar el método se obtuvieron 5 curvas de calibrado diferentes, de las cuales

todas están en un rango aceptable debido a sus correlaciones las cuales son bastante
cercanas a 1 (variando en una rango de [0,96-0,98]), dentro de estas existen algunas
más cercanas que otras, pero en general, este hecho demuestra que el método es
claramente especifico, certero y eficaz tal como se menciona en los antecedentes
bibliográficos. Se escogió la curva con la mejor correlación para obtener la
concentración de las muestras problemas, interpolar los valores de absorbancia, para
ambas muestras, sus duplicados difirieron de gran manera. Si bien el procedimiento de
construcción de curva de calibrado se realizó exitosamente, esta diferencia podría
deberse a una mala dilución de la muestra, o bien los tubos utilizados podrían haber
tenido algún otro compuesto lo que altero el resultado del duplicado. Para la muestra
1 (harina de soya) ambas concentraciones están bajo el rango de especificidad del
método de Bradford, siendo sus concentraciones de 4,4526 y 23,6060 [ug/ml] esto
pudo deberse a una mala elección en la dilución, ya que lo más probable es que la
harina de soya contenga menor cantidad de proteínas de lo que se indicaba, o bien el
rango para la dilución debió haber sido menor. Por ello como los valores de
concentración de proteínas de las muestras no se encuentra en el rango de
especificidad de Bradford, no podríamos aseverar si la muestra realmente contiene
entre un 30-40% de proteínas. Esto además debido a que no podemos tomar una
promedio de los duplicados ya que estos difieren bastante y menos podríamos elegir a
uno de los dos, pues ambos valores son bajos y no muestran correlación alguna.

Para la muestra 2 (leche descremada) se obtuvieron las concentraciones de 580,1809

ug/ml y 1420,6767 ug/ml donde se puede apreciar que ocurre lo mismo que con la
muestra 1, esto indica que hubo alguna mala manipulación de las muestras durante la
experiencia en el laboratorio, o bien se seleccionó una mala dilución. Aun la primera
concentración se encuentra dentro del rango de especificidad, con lo cual podríamos
obtener la concentración real de proteínas en la leche. El segundo dato excede el
rango del método de Bradford, por lo cual los datos obtenidos no son coherentes ni
fiables, esto debido a un mal tratamiento de las muestras, ya que la curva de calibrado
no puede ser la responsable en esta diferencia de concentraciones pues se corroboró
que su construcción fue realizada con éxito.
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4.3 METODO DE LOWRY

CAPITULO 5
CONCLUSIONES

De acuerdo a los objetivos planteados, podemos decir que se realizó con éxito la
determinación de las curvas de calibrado para una muestra patrón ( Albumina 0,102
mg/ml) a través de los métodos de Bradford y Lowry. Aun así no se cumplió el objetivo
de determinar la cantidad de proteína total de las muestras de Harina de Soya y Leche
descremada, con el método de Bradford, pues las concentraciones obtenidas no eran
coherentes con el método. Por ello se recomienda escoger otra dilución, y un mejor
desempeño en el tratamiento de muestras previo al procedimiento de
espectrofotometría.
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REFERENCIAS

Fernández Reyes,Emilio. Galván Cejudo, Aurora. Métodos para la cuantificación de

proteínas.Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de
Rabanales.Córdoba
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APÉNDICE 1
DATOS LABORATORIO METODO DE BRADFORD

Grupo 1
Concentración
[ug/ml] Absorbancia A Absorbancia B
[nm] [nm]
200 0,176 0,266
400 0,466 0,437
600 0,699 0,601
800 0,701 0,739
1000 0,915 0,926

Grupo 2
Concentración
[ug/ml] Absorbancia A Absorbancia B
[nm] [nm]
200 0,2 0,22
400 0,375 0,35
600 0,507 0,44
800 0,614 0,635
1000 - -
 12

Grupo 3
Concentración
[ug/ml] Absorbancia A
[nm]
200 0,26
400 0,359
600 0,442
800 0,662
1000 -

APÉNDICE 2
CÁLCULOS

1. Curva calibrado
Desarrollo Cálculos
Según tabla datos (x,y), se obtiene por Para método de Bradford se obtuvo la
regresión lineal la curva de calibrado. curva :
Donde x: concentración en [ug/ml] e y: y=8,875714·10-4·x+0,051048
Absorbancia [nm] con una correlación R2=0,9894

y=mx+b Lo cual indica que es una curva

adecuada, pues su correlación es muy
cercana a 1, que es lo ideal.

2. Concentración muestra problema

Desarrollo Cálculos
De acuerdo al punto anterior, Sea y=0,055[nm] la absorbancia de mi
obtuvimos una curva muestra problema
y=8,875714·10-4·x+0,051048
donde y=8,875714·10-4·x+0,051048
y: Absorbancia [nm]
x: Concentración [ug/ml] x= (0,055-0,051048)/ 8,875714·10-4)
x=4,4526
Luego mi concentración de proteínas es
 13

de 4,4526 [ug/ml]

3. Dilución Harina de Soya

Desarrollo Cálculos
Para el método de Bradford, donde su Rango concentración esperado : 720-
especificidad es de 100-1000 [ug/ml] 960 [ug/ml]

% Proteína en la harina es de 30-40%. Entonces diremos que

0,3 720
Se elige un rango dentro del cual 1,0 x
deseamos que esté nuestra x=2400 [ug/ml] : valor estimado
concentración.
Volumen : 25 ml
Calculamos la concentración que debe Concentración=masa muestra/ Volumen
tener, es decir, mi valor estimado.
Masa muestra = 2400*25 = 60000[ug]
Decidimos volumen a aforar. =0,06[g]
(NaCl 0,15 M)
Utilizaremos 0,06 g Harina de soya y
Como conocemos volumen y aforaremos a 25 ml con NaCl 0,15M
concentración determinamos la masa
de muestra a utilizar.
*Para el método de Lowry se aplica la misma idea.

4. Dilución Leche descremada

Desarrollo Cálculos
Para el método de Bradford, donde su 3,45% p/v = 3,45 g/100 ml
especificidad es de 100-1000 [ug/ml] 3,45 g/100 ml = 3450000ug/100ml
% p/v Proteína en la leche es de 3,45%. 3450000ug/100ml = 34500 ug/ml

Expresamos % p/v en [ug/ml] Volumen a aforar :250 ml

Luego decidimos el volumen a aforar Valor elegido : 690 ug/ml
Se elige un valor dentro del rango de Aplicamos fórmula
especificidad. C1·V1=C2·V2
Aplicamos formula
C1·V1=C2·V2 C1: 34500 ug/ml V1 : X

Y obtenemos V2 que corresponde a el C2: 690 ug/ml V2 : 250 ml

volumen de muestra a diluir
X=V2= 5 ml
.
Utilizaremos 5 ml de muestra y
aforaremos a 250 ml con agua
destilada.
*Para método de Lowry se aplica la misma idea.