Sunteți pe pagina 1din 4

Facultatea de Ştiinţa şi Ingineria Alimentelor

Specializarea de licenţă Biotehnologii industriale, anul III

Metoda MIUG (Microbiologie Industrială Universitatea Galaţi)


de determinare a activităţii α- amilazice

α- amilazele au ca substrat amidonul, format din amiloză şi amilopectină.


α- amilazele sunt endoamilaze ce hidrolizează unic şi la întâmplare legăturile
α – 1,4 din amiloză şi amilopectină, eliberând fragmente de ozide şi dextrine
limită.

Structura amidonului. Săgeţile indică situsurile de hidroliză α- amilazică

Sursele de α- amilaze sunt de origine


9 animală: amilaze din salivă şi pancreas
9 vegetală: amilaze din malţ şi alte cereale germinate
9 bacteriană: amilaze normale (Bacillus subtilis) sau
termorezistente (Bacillus licheniformis)
9 fungică: amilaze termostabile, cu acţiune maltogenică (Aspergillus niger,
Aspergillus oryzae)

Prin hidroliza enzimatică a amidonului sunt eliberate dextrine cu mase


moleculare din ce în ce mai mici, ce pot fi evidenţiate prin colorare cu soluţie
Lugol: amilodextrinele dau coloraţie violet, eritodextrinele roşu- brun şi
achrodextrinele nu mai dau coloraţie cu iodul, soluţia având culoare galben-
brun.

Metoda MIUG este o metodă colorimetrică bazată pe coloraţia dată de soluţia


Lugol cu amidonul şi produşii de hidroliză rezultaţi ca urmare a acţiunii
amilazelor.

Protocol de lucru:
1. Se numerotează 10 eprubete.
2. În prima şi a doua eprubetă se introduc câte 1mL de extract enzimatic.
3. În toate eprubetele, cu excepţia primei eprubete, se adaugă câte 1mL de
apă distilată.
4. După omogenizare, din eprubeta a doua se transferă 1mL de soluţie în a
treia eprubetă, din a treia eprubetă se transferă 1mL în a patra eprubetă,
ş.a.md. Din ultima eprubetă se aruncă 1mL soluţie.
Lucrări practice_ Enzimologie aplicată
1
Facultatea de Ştiinţa şi Ingineria Alimentelor
Specializarea de licenţă Biotehnologii industriale, anul III
Ca rezultat se obţine o serie de eprubete, în care extractul enzimatic iniţial
se găseşte în următoarele cantităţi:

Numărul Cantitatea de
eprubetei extract enzimatic, mL
1 1,00000
2 0,50000
3 0,25000
4 0,12500
5 0,06250
6 0,03120
7 0,01560
8 0,00780
9 0,00390
10 0,00195

5. După pregătirea seriei de eprubete, în fiecare dintre ele se adaugă câte


4mL soluţie substrat (amidon 1%, tamponat şi temperat la pH-ul şi
temperatura optime pentru activitatea enzimei), moment considerat timpul
de iniţiere a reacţiei de hidroliză.

6. Eprubetele se temperează la temperatura optimă de activitate a enzimei,


prin menţinere pe baie de apă, timp de 10minute, apoi se adaugă
cronologic, în fiecare eprubetă, câte 0,5mL soluţie Lugol 0,001N.
Amidonul se consideră hidrolizat la amilodextrine în eprubetele în care
culoarea amestecului este roşie- brună şi hidrolizat în glucide reducătoare şi
dextrine ce nu mai dau coloraţie cu iodul în eprubetele în care culoarea
amestecului este galben- brună.

7. Pentru aprecierea activităţii α- amilazice se folosesc primele eprubete din


seria în care culoarea amestecului este albastră- violet (eprubete care
conţin cea mai redusă cantitate de amilază capabilă ca în decurs de
10 min. să producă o hidroliză redusă a amidonului).
Activitatea amilazică este apreciată faţă de culoarea pe care o dă cu iodul un
amestec de 4mL soluţie amidon 1% şi 1mL apă distilată (proba martor).

8. Pentru ambele amestecuri coloidale (martor şi proba de analizat) se


determină extincţia la 610nm.

O unitate α- amilazică (conform metodei MIUG) reprezintă cantitatea de


enzimă care produce în timp de 1 minut scădere de 0,05 ori a densităţii
optice, măsurată la 610nm a compusului colorat iod- amidon, într-o soluţie
de amidon 1% în condiţii optime de activitate ale enzimei.

Lucrări practice_ Enzimologie aplicată


2
Facultatea de Ştiinţa şi Ingineria Alimentelor
Specializarea de licenţă Biotehnologii industriale, anul III
Protocolul de lucru este prezentat schematic în continuare:

Nr. eprubetei 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Volum apă
distilată, mL
0 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Volum enzimă,
mL
2 1 1 1 1 1 1 1 1 1
se aruncă

Menţinere pe baie de apă 2-3 min (40°C)

4mL soluţie amidon 1% (la diferenţă de 30sec.)

Menţinere 10min. (40°C)

0.5mL soluţie Lugol 1/ 10

Determinarea extincţiei la λ= 610nm

Activitatea enzimatică a preparatelor brute se stabileşte utilizând una din


următoarele formule:
► pentru preparate enzimatice lichide:

ΔE 1
Activitateaα − amilazică = ⋅ ⋅ k ⋅, UAxcm −3 x min −1
0,05 τ
în care: ΔE = Em – Ep
Em – extincţia la 610nm a probei martor (fără enzimă);
Ep – extincţia la 610nm a probei de analizat (amidon parţial
hidrolizat sub acţiunea amilazelor);
τ – timpul de hidroliză, min;
k – coeficientul de diluare a preparatului enzimatic.

► pentru preparate enzimatice obţinute în sistem SSF:

ΔE 1 1
Activitateaα − amilazică =
⋅ ⋅k ⋅ , UAxcm −3 x min −1
0,05 τ s.u.
în care: s.u. – cantitatea de substanţă uscată conţinută de 1g mediu
fermentat.

Lucrări practice_ Enzimologie aplicată


3
Facultatea de Ştiinţa şi Ingineria Alimentelor
Specializarea de licenţă Biotehnologii industriale, anul III

Determinarea activităţii amilazice prin metoda MIUG prezintă următoarele


avantaje:
9 timp scurt de hidroliză, ceea ce presupune un timp redus de obţinere a
răspunsului;
9 posibilitatea determinării celei mai mici cantităţi de enzimă capabilă să
hidrolizeze amidonul, chiar în condiţiile în care nu se ştie cât de diluat ar
trebui să fie extractul enzimatic, eliminând tatonările pentru găsirea
concentraţiei optime de enzimă a cărei activitate poate fi evidenţiată în
condiţiile metodei;
9 precizie ridicată şi obiectivitate crescută comparativ cu alte metode
(Klimovski şi SKB) prin efectuarea de măsurători de densitate optică.

Lucrări practice_ Enzimologie aplicată


4