République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’enseignement et de la recherche scientifique

Université de M’Hammed Bougarra de Boumerdès
Département de Biologie
Module : génomique et protéomique

Thème :

Réaliser par :
 ABDELLAOUI F arida
 ARBANE Nassima
 CHIBANE Hacina

Année universitaire : 2010/2011.

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 Plan de travail :

Introduction
I. Historique
II.Définition
III.Les techniques de séquençage de l’ADN
III.1. La méthode chimique «Maxam &Gilbert »
III.1.1. Le principe de la méthode chimique
III.1.2. Les étapes de la méthode chimique
III.2. La méthode Enzymatique
III.2.1. Principe de la méthode enzymatique
III.2.2. Les étapes de la méthode enzymatique
III.2.3. Les avantages et inconvénient

Conclusion

Introduction :
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La molécule d’ADN est constituée d’une chaine de 4 nucleotides guanine,
cytosine,adénine et thymine,dont la succession détermine la séquence des
differents génes.le séquençage est une méthode qui consiste a determiné la
succession des ces nucleotides sur ADN . ce procédé permrt de determiner les
differentes anomalies responsables de maladies génitiques ou de réaliser des
études d’épidimiologie moléculaire en microbiologie ou dans t’autre domaines.
Deux principales méthodes ont été initialement développées dans ce but : la
méthode chimique (Maxam et Gilbert en1977), et la méthode enzymatique
(Sanger 1981). D’autres techniques recentes comme le séquençage par
hybridation, le pyroséquençage ont eté utilisées et appliquées à l’analyse des
génomes.

I. Historique :
Le séquençage de l’ADN a permis à la biologie de progresser
rapidement dans l’acquisition de nouvelles connaissances.
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Il existe deux méthodes complémentaires de séquençage d’ADN :
➢ Méthode chimique
➢ Méthode enzymatique
1. Méthode chimique 2. Méthode
enzymatique

1977 - génome d’un phage : 5000 bases.

1979 - génome mitochondrial humain : 16000 bases.
1995 - génome de Haemophilus influenzae : 3 106 bases.
1996 - génome de Saccharomyces cerevisiae : 14 106 bases.
1998 - génome de Caenorhabditis elegans : 100 106 bases.
2000 - génome de Drosophila melanogaster : 170 106 bases.
2002 - séquençage du génome humain : 3,5 109 bases.

I. Définition :
➢ En biochimie :
Le séquençage consiste à déterminer l'ordre linéaire des composants
d'une macromolécule (les acides aminés d'une protéine, les nucléotides d'un
acide nucléique comme l'ADN, les monosaccharides d'un polysaccharide,
etc.).
➢ En génétique :
Le séquençage concerne la détermination de la séquence des gènes
voire des chromosomes, voire du génome complet, ce qui techniquement
revient à effectuer le séquençage de l'ADN constituant ces gènes ou ces
chromosomes.

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 I. Les techniques de séquençage de l’ADN :
Chacune des deux méthodes de séquençage des longues molécules
d’ADN (chimique et enzymatique) implique la production d’un lot de molécules
de tailles différentes dotées d’extrémité commune, ensuite séparait par
électrophorèse sur gel de polyacrylamide(PAGE) pour accéder à la lecture de la
séquence.
III.1. La méthode chimique «Maxam &Gilbert » :
Cette première méthode exige que le fragment d’ADN à séquencer soit marqué
à une extrémité, habituellement en ajoutant un phosphate radioactif à l’extrémité
5’ ou 3’, ou un nucléotide à l’extrémité3’.
III.1.1. Le principe de la méthode chimique :
Cette méthode a été développée au début des années 70. Elle est valable pour
l’ADN double brin comme pour l’ADN simple brin et implique des clivages

bases spécifiques qui se déroule en deux étapes.

Le principe de la méthode repose :

➢ sur le marquage radioactif du brin d’ADN à séquencer (Permet une
identification par autoradiographie)
➢ de coupures spécifiques mais incomplètes
➢ séparation des fragments par électrophorèse (PAGE)
La base est d’abord modifiée par application de produits chimiques spécifiques,
puis la piperidine clive le squelette phosphate-sucre de l’ADN au niveau de ce
site. En limitant les temps d’incubation ou les concentrations des composes, une
gamme de molécules de taille de plus en plus importante est crée, plutôt qu’un
clivage complet en courts oligonucléotide. Les réactions de modifications
spécifiques de base utilise le diméthyle-sulfate(DMS), pour méthyle les
guanines. L’acide formique attaque les purines A et G. l’hydrazine est utilisée
pour hydrolyser la pyrimidine(C+T), mais une concentration saline élevée
inhibe la réaction avec la thymine.
III.1.2. Les étapes de la méthode chimique :
SEQUENÇAGE D’ADN

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 Marquage au 32P
Traitement par enzyme de restriction

4 types de traitements chimiques

1. méthylation des G 3. dégradation des pyrimidines

T+C

2. Dépurination sélective G+A 4. dégradation spécifique C

PIPERIDINE
COUPURE AU NIVEAU DES BASES MODIFIEES OU
ABSENTES

➢ Les résultats dans les quatre tubes :

➢ Les résultats de séquençage d’ADN sur gel de Maxam&Gilbert :

Quatre pistes sur le gel de séquençage (G.A+G.C+T et C) permettent ainsi de
déterminer la séquence.
+
Cette méthode a été adaptée pour séquencer l’ADN génomique sans avoir
recours au clonage.
III.2. La méthode enzymatique « méthode de Sanger » :
Dans cette méthode, la polymérisation de l’ADN est initiée par un petit
oligonucléotide (amorce) complémentaire à une partie du fragment d’ADN à
séquencer. L’élongation de l’amorce est réalisée par la « séquénase » (une ADN
polymérase I dépourvue d’activités exonucléasiques 5’→3’et 3'→5', et 100 fois
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plus rapide que le fragment de Klenow). Les quatre désoxynucléosides (dATP,
dCTP, dGTP, dTTP) sont ajoutés, ainsi qu’en faible concentration les quatre 2'-
3'didésoxynucléosides (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) marqués par des
fluorochromes différents. Ces didésoxynucléosides, une fois incorporés à la
nouvelle chaîne synthétisée, empêchent la poursuite de l’élongation. Il en résulte
de nouveaux fragments d’ADN de taille variable, qui sont ensuite séparés par
électrophorèse sur un gel de polyacrylamide.
III.2.1. Le principe de la méthode de Sanger :
Cette méthode a également été développée au début des années 70. Le principe
de la méthode repose :
➢ sur l’utilisation de l’ADN polymérase I
➢ d’un oligonucléotide complémentaire de la partie d’ADN à
identifier (amorce)
➢ d’un mélange de dNTPs (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) dont un sera
radioactif (a32P).
➢ d’un ddNTP (didésoxyribonucléoside triphosphate)
« Cette méthode a servi au séquençage du génome humain. »

III.2.2. Les étapes de la méthode de Sanger :

La méthode chimique de séquençage de l’ADN a été largement remplacée
par la méthode de Sanger, qui utilise quatre didésoxynucléotides spécifique
(ddNTP) pour achever les copies de la matrice, synthétisées de manière
enzymatique.
Une amorce de séquençage est appariée à une molécule simple brin
matrice et l’ADN polymérase prolonge l’amorce en utilisant des ddNTP. La
réaction d’extension est scindée en quatre, chaque quatre est terminé
séparément avec l’un des quatre ddNTP spécifique, et les échantillons
(habituellement radioactifs) sont analysées par PAGE. Les didésoxynucléotides
agissent comme des terminateurs de chaine, car ils ne possèdent pas de
groupement 3’OH sur le désoxyribose dont a besoin la polymérase pour
prolonger la chaine en croissance.
Le marqueur est incorporé durant l’étape de synthèse (exemple : [α-S35]
ddATP, ou l’amorce est d’abord marquée à son extrémité par des colorants
fluorescents ou radioactifs. Ces derniers sont utilisés dans certaines séquences
d’ADN automatiques bien qu’il soit courant d’utiliser des didésoxynucléotides
fluorescent.
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 La méthode originale nécessite une matrice d’ADN simple brin à partir de
laquelle s »effectuera la synthèse des copies complémentaires, ce qui signifie
que l’ADN doit être cloné dans le phage M13 avant le séquençage. L’ADN
simple brin du phage est apparié à une amorce de 15 à 17 nt, complémentaires à
la région proche de la jonction insert-vecteur. Toutes les séquences clonées dans
ce vecteur peuvent être séquencées en utilisant cette amorce universelle. Outre
l’ajout d’une matrice, une ADN polymérase (habituellement l’ADN polymérase
de Klenow ou T7) est ajoutée à l’amorce appariée, avec une petite quantité de
[α-S35] ATP, où un atome de soufre remplace un atome d’oxygène sur le
phosphate α
(si l’amorce n’est pas marquée). Le mélange est ensuite réparti dans quatre
tubes, chacun contenant un terminateur de chaine différent mélangé avec
ddNTP normaux (c’est-à dire le tube C contient ddCTP, ddATP, ddCTP, ddGTP
et ddTTP) dans des proportions spécifiques pour assurer seulement une quantité
limitée de terminaison de chaine.
➢ Séparation des brins par thermodénaturation

Chauffage

➢ Séquence d’ADN à déterminer

Domaine à séquencer Domaine déjà connu

5’P 3’OH5’P32

Amorce radiomarquée par P 32 en 5’

ADN polymérase, ADN dépendante

L’enzyme (l’ADN polymérase ADN dépendante) polymérise le brin

complémentaire à partir du brin à séquencer. Pour se faire, elle utilise comme

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substrats les quatre nucléotides triphosphates : Ils assurent également l’apport
d’énergie nécessaire à la synthèse

dATP dTTP
NH2

N
O N
O O
HO P O P O P O N N
O
OH OH OH
dGTP dATP dCTP
OH

➢ Fractionnement de l’échantillon

ADN + amorce + enzyme

+ dATP + dGTP + dCTP + dTTP

Tube1 Tube2 Tube3

Tube4

+ddATP +ddGTP +ddCTP

+ddTTP
L’analyse des quatre lots de produits de réaction par PAGE conduit
généralement à quelques bandes d’artefacts comme avec le séquençage
chimique.
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Les résultats de tube1 : résultats de tube2

Résultats de tube3 résultats de tube4

Cette méthode des déoxynucléotides a été améliorée ; elle peut aujourd’hui être
pratiquée en utilisant des matrices doubles brin et des produits de PCR.

Résultats de la lecture finale de la PAGE :

La séquence de l’ADN

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III.2.3 : Avantages et inconvénients :

Avantages inconvénients
• Méthode enzymatique • Lecture indirecte de brin
(spécifique) • Dernier nucléotide in
• Automatisable déterminé
• Un domaine doit être connu.

Pyroséquençage : (mini-séquençage luminométrique en temps réel) :

Le Pyroséquençage est une technique de séquençage par synthèse directe d’oligonucléotides.
Sa réalisation nécessite l’emploi d’une cascade de 4 enzymes :

• La taq polymérase pour l’incorporation des oligonucléotides ( dNTP) ;

• L’ATP sulfurylase pour catalyser le pyrophosphate inorganique (ppi) en énergie,
source d’ATP.
• La luciférase pour générer la lumière où le signal fluorescent à partir de l’ATP.
• La pyrase pour dégrader l’ATP et l’excès de nucléotides non incorporés.
A la différence du séquençage automatique par la technique de Sanger, le
Pyroséquençage utilise le 2’ déoxyadénosine-5’-o-(1-triphosphate) ou dATPαS à la
place du dATP.ce nucléotide est reconnu à la fois par la polymérase et la luciférase,
contrairement au nucléotide d’ATP qui est reconnu seulement par la polymérase.les
quatres oligonucléotides sont introduit un par un.

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 Les différentes enzymes utilisées dans la réaction de Pyroséquençage

Principe :

Le séquençage par Pyroséquençage est réalisé en 5 étapes :

➢ Etape 1 : l’ADN a analysé est amplifié en présence d’une amorce de séquençage.

L’ensemble est ensuite incubé en présence des 4 enzymes :
La taq polymérase, l’ATP sulfurylase, la luciférase et l’apyrase, le substrat
l’adénosine 5’ phosphosulfate APS est enfin la luciférine.

➢ Etape 2 : le premier des quatres déoxynucléotides triphosphates (dNTP) est ajouté dans
la réaction .l’ADN polymérase permet l’incorporation de ce dNTP dans le brin en cours
de synthèse, si ce dernier est complémentaire à la base située dans la séquence à
analyser .chaque incorporation de dNTP est suivie d’un relargage d’une molécule de

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 pyrophosphate (ppi). La quantité de (ppi) libéré est proportionnelle à celle de dNTP
incorporée.
➢ Etape3 : en présence de l’adénosine 5’ phosphosulfate (APS) l’ATP sulfurylase
transforme le (ppi) en ATP en quantité équimolaire. Cet ATP sera utilisé comme
substrat par la luciférase lors de la transformation de la luciférine en oxyluciférine et
permet l’émission d’un signal lumineux dont l’intensité est proportionnelle à la quantité
d’ATP. Ce signal lumineux sera détecté par une caméra CCD reliée au séquenceur et
visualisé sous forme d’un pic ou pyrogramme.la hauteur de ce pic sera proportionnelle
aux nombres de (ppi) libéré qui est elle-même proportionnelle aux nombres de
nucléotides incorporés.
➢ Etape 4 : l’excès de dNTP non incorporés ainsi que l’ATP sont dégradés
continuellement par la dernière enzyme de la cascade : la pyrase.
➢ Etape 5 : les dNTP sont introduits l’un après l’autre, selon l’ordre établi. Les dNTP
ainsi incorporés forment une séquence qui sera déterminée à partir du signal lumineux
spécifique de chaque nucléotide puis capté et enregistré sur le pyrogramme.

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 4
dN
avantages Inconvénients :
-la rapidité -limitation en taille des produits
-les appareils de à séquencer.(50 a 100
Pyroséquençage actuellement nucléotides).
disponibles permettent l’analyse
à grande échelle grâce à leur
formats de plaque de 96 puits.

Les applications de Pyroséquençage :

Analyse de séquences :
-étude des profits d’expression des gènes.
-typage d’agents pathogènes (bactéries, virus et parasites).
-identification de séquence.
-séquençage de l’ADN cloné.
-étude de l’ADN mitochondrial (mtDNA).
-étude de microsatellites.

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Autres applications :
-détection de mutations et polymorphismes bi-alléliques.
-étude de la méthylation de l’ADN comme de cas des syndromes de
Prader Willi et Angelman.
-étude de la perte d’hétérozygotie.
-détection des gènes de résistance aux antibiotiques et aux antiviraux.
-quantification de fréquence allélique (même les faibles fréquences
proches de 5%) pouvant être détecté par ce système.

Conclusion :
La méthode chimique de séquençage de l’ADN a été largement remplacée
par la méthode de Sanger.
La séquence d’ADN contient l’information nécessaire aux êtres vivants pour
survivre et se reproduire. Déterminer cette séquence est donc utile aussi bien
pour les recherches visant à savoir comment vivent les organismes que pour des
sujets appliqués.

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Bibliographie :
 Les livres :
✔ Biologie moléculaire
✔ Génie génétique
✔ L’essentiel en biologie moléculaire 1
✔ L’essentiel en biologie moléculaire 2
✔ Biologie moléculaire fondamentale
 Site d’internet :
✔ Wikipédia
✔ Biologie.com
✔ ADN séquence
✔ Diaporama séquence d’ADN
 Encarta 2008

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