Sunteți pe pagina 1din 11

Fenomene electrice şi mecanice ale fibrei miocardice izolate

17

EXPERIMENTE PE CORD VIRTUAL DE ŞOBOLAN

Dr. Perian Marcel, Dr. Scridon Alina

O dată cu evoluţia surprinzătoare a tehnicii şi invazia computerelor în toate ariile de activitate, experimentele virtuale au devenit o realitate. Aria de utilizare este deosebit de largă, avantajele fiind multiple. Modelele de experimente virtuale permit utilizatorului să realizeze experimente care ar necesita aparatură costisitoare şi care eventual ar exista în laboratoare într-un singur exemplar, iar experimentul ar lua o formă demonstrativă, cadrul de predare fiind cel care realizează experimentul, în compania studenţilor. Tehnica experimentelor virtuale are avantajul că permite fiecărui student să realizeze efectiv experimentele propuse, metoda bazându-se pe impactul vizual al acestor experimente, cu utilitate dovedită în procesul de învăţare. Fiziologia umană beneficiază şi ea de pe urma acestor posibilităţi tehnice. Un bun exemplu este lucrarea de faţă.

În cadrul acestei lucrări, programul Rat Cardiovascular System 3.2.7, din cadrul “ExPharm”, parte a unei serii de produse software sub licenţă GNU, elaborat de Universitatea Strathclyde, va fi utilizat pentru studierea efectelor diverselor substanţe farmacologic active asupra forţei de contracţie a miocardului, frecvenţei cardiace şi presiunii arteriale (http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/page.php?show=software_sims).

STIMULAREA ADRENERGICĂ

Secundar administrării adrenalinei se vor observa (Figura nr. 12):

– efectul cronotrop pozitiv (creşterea frecvenţei cardiace);

– efectul inotrop pozitiv (creşterea forţei de contracţie);

– creşterea presiunii arteriale.

ei de contrac ţ ie); – cre ş terea presiunii arteriale. Figura nr. 12. Efectul stimul

Figura nr. 12. Efectul stimulării adrenergice asupra activităţii cordului (ABP - arterial blood pressure, HF - heart force, HR - heart rate).

Se porne ş te programul Rat Cardiovascular System 3.2.7, apoi experimentul, iar din meniul Standard

Se porneşte programul Rat Cardiovascular System 3.2.7, apoi experimentul, iar din meniul Standard Drugs se alege adrenalina. Se alege doza de 10 µg/kg. Se urmăreşte efectul. Răspundeţi la întrebările din Fişa de lucru!

18

Lucrări practice de fiziologie

STIMULAREA COLINERGICĂ

Secundar administrării acetilcolinei se va observa (Figura nr. 13):

– efectul cronotrop negativ (scăderea frecvenţei cardiace);

– efectul inotrop negativ (scăderea forţei de contracţie);

– scăderea presiunii arteriale.

ei de contrac ţ ie); – sc ă derea presiunii arteriale. Figura nr. 13. Efectul stimul

Figura nr. 13. Efectul stimulării colinergice asupra activităţii cordului.

Se porne ş te experimentul, iar din meniul Standard Drugs se alege acetilcolina. Se alege

Se porneşte experimentul, iar din meniul Standard Drugs se alege acetilcolina. Se alege doza de 50 µg/kg. Se urmăreşte efectul. Răspundeţi la întrebările din Fişa de lucru!

ANTAGONISMUL FIZIOLOGIC ADRENALINĂ ACETILCOLINĂ

Se administrează mai întâi adrenalină şi apoi acetilcolină. Se va observa mai întâi efectul adrenergic şi apoi efectul colinergic urmată de revenirea curbelor frecvenţei cardiace, forţei de contracţie şi presiunii arteriale la valorile normale (Figura nr. 14, revenirea la valorile normale nu este prezentată).

14, revenirea la valorile normale nu este prezentat ă ). Figura nr. 14. Antagonismul adrenalin ă

Figura nr. 14. Antagonismul adrenalină - acetilcolină.

Fenomene electrice şi mecanice ale fibrei miocardice izolate

19

Se porneşte experimentul, iar din meniul Standard Drugs se alege adrenalina în dozSe porne ş ă de 20 µg/kg, observându-se efectele descrise în subcapitolul “Stimularea adrenergic ă ”. ă de 20 µg/kg, observându-se efectele descrise în subcapitolul “Stimularea adrenergică”. În continuare se alege acetilcolina, în doză de 50 µg/kg. Se urmăreşte efectul. Răspundeţi la întrebările din Fişa de lucru!

Întrucât efectele adrenalinei şi acetilcolinei se produc prin activarea unor tipuri diferite de receptori, antagonismul dintre cele două substanţe este unul fiziologic şi nu competitiv.

ANTAGONIZAREA EFECTELOR ADRENERGICE CU BETA-BLOCANTE

În funcţie de afinitatea lor pentru receptorii β1 cardiaci, beta-blocantele se împart în două categorii:

– neselective: propranolol, timolol, pindolol, etc.;

β 1 selective: metoprolol, atenolol, betaxolol, nebivolol, bisoprolol, etc.

Se administrează mai întâi adrenalină şi apoi atenolol. Se va observa revenirea curbelor frecvenţei cardiace, forţei de contracţie şi presiunii arteriale la valorile normale (Figura nr.

15).

i presiunii arteriale la valorile normale (Figura nr. 15). Figura nr. 15. Antagonizarea efectelor adrenergice prin

Figura nr. 15. Antagonizarea efectelor adrenergice prin administrarea de beta-blocant.

Se porneşte experimentul, iar din meniul Standard Drugs se alege adrenalina în dozSe porne ş ă de 20 µg/kg. Dup ă instalarea efectelor adrenalinei, se administreaz ă atenolol ă de 20 µg/kg. După instalarea efectelor adrenalinei, se administrează atenolol în doză de 200 mg/kg. Se urmăreşte efectul. Răspundeţi la întrebările din Fişa de lucru!

Întrucât ambele substanţe, atât adrenalina, cât şi atenololul, acţionează asupra aceluiaşi tip de receptori în cazul de faţă avem de a face cu un antagonism competitiv.

ANTAGONIZAREA EFECTELOR COLINERGICE CU ATROPINĂ

Se administrează mai întâi acetilcolină şi apoi atropină. Se poate observa revenirea curbelor frecvenţei cardiace, forţei de contracţie şi presiunii arteriale la valorile normale, iniţiale (Figura nr. 16).

20

Lucrări practice de fiziologie

20 Lucr ă ri practice de fiziologie Figura nr. 16. Antagonizarea efectelor colinergice cu atropin ă

Figura nr. 16. Antagonizarea efectelor colinergice cu atropină.

Se porneşte experimentul, iar din meniul Standard Drugs se alege Se porne ş acetilcolina în doz ă de 50 µg/kg. Dup ă instalarea efectelor acetilcolinei, se acetilcolina în doză de 50 µg/kg. După instalarea efectelor acetilcolinei, se administrează atropină în doză de 2 mg/kg. Se urmăreşte efectul. Răspundeţi la întrebările din Fişa de lucru!

Şi în acest caz vorbim despre un antagonism adevărat, competitiv, în care cele două substanţe, acetilcolina şi atropina, concurează pentru acelaşi receptor.

Ră spunde ţ i la întreb ă rile din Fi ş a de lucru! ăspundeţi la întrebările din Fişa de lucru!

Fenomene electrice şi mecanice ale fibrei miocardice izolate

21

FENOMENE ELECTRICE ŞI MECANICE ALE FIBREI MIOCARDICE IZOLATE

Dr. Scridon Alina, Dr. Perian Marcel, Biolog Bărbat Gheorghe

Decizia privind ce model de animal ar trebui să fie utilizat este un aspect important al cercetării cardiovasculare şi trebuie să se bazeze pe natura ipotezei care va fi testată şi pe resursele disponibile. Rezultatele cercetării trebuie interpretate întotdeauna ţinând cont de limitările modelului experimental utilizat. Modele aplicabile unor serii de disfuncţii cardiovasculare au fost dezvoltate pe şoareci, şobolani, cobai şi iepuri. Şobolanul rămâne cel mai popular model de animal mic. Pe lângă avantajul economic, şobolanii reprezintă o bună alegere datorită datelor bibliografice vaste asupra diferitelor modele. Rezultatele obţinute prin utilizarea unui model pot fi comparate cu cele obţinute pe alte modele, iar discordanţele pot fi analizate. Inconvenientul major este reprezentat de diferenţele dintre funcţia cardiacă a şobolanului şi cea umană. În primul rând diferenţa apare în ceea ce priveşte părţile componente ale potenţialului de acţiune. Aşa cum este bine cunoscut, potenţialul de acţiune cardiac uman este compus din 5 faze succesive: faza 0 - de depolarizare rapidă, faza 1 - repolarizarea iniţială, faza 2 - faza de platou, faza 3 - de repolarizare finală şi faza 4 - perioada cuprinsă între potenţialele de acţiune. În contrast cu cordul uman, miocardul de şobolan prezintă o descreştere a potenţialului de acţiune, fără a prezenta faza de platou (Figura nr. 17; Figura nr. 20). O altă diferenţă este reprezentată de faptul că frecvenţa cardiacă la şobolani este de circa cinci ori mai mare decât la oameni.

obolani este de circa cinci ori mai mare decât la oameni. Figura nr. 17. Poten ţ

Figura nr. 17. Potenţialul de acţiune al fibrei miocardice de iepure.

22

Lucrări practice de fiziologie

REALIZAREA PRACTICĂ

După anestezierea şi sacrificarea animalului, acesta este plasat pe planşetă. Cu o foarfecă se realizează o nişă la nivel subxifoidian. Se secţionează cutia toracică prin două incizii pe liniile medioclaviculare bilateral. Se vizualizează şi se secţionează diafragmul, evidenţiindu- se în continuare cordul şi vasele mari. Se secţionează vasele mari de la baza cordului, se îndepărtează cordul şi se plasează în cutia Petri umplută în prealabil cu soluţie Tyrode bine oxigenată. Se îndepărtează atriile şi vasele mari de la baza cordului prin secţionarea lor, după care se vizualizează pe secţiunea astfel realizată ventriculul stâng, uşor de recunoscut prin grosimea mai mare a peretelui, septul interventricular şi ventriculul drept. În continuare, se secţionează peretele ventriculului drept şi se fixează cordul pe fundul cutiei Petri prin introducerea unor ace care străpung peretele secţionat al ventriculului drept. Se deschide cu grijă ventriculul stâng, printr-o secţiune dreaptă de la valva aortică la apex. În acest moment se poate vizualiza cavitatea ventriculului stâng şi cei doi muşchi papilari. Se prelevează un muşchi papilar, cu atenţie deosebită pentru a evita traumatizarea lui, şi prelevând totodată la ambele capete ale muşchiului o mică masă de ţesut conjunctiv, prin care va fi fixat muşchiul. La fiecare capăt al muşchiului papilar, la nivelul ţesutului conjunctiv, se fixează câte o buclă de aţă de bumbac (este esenţial ca aceasta să nu fie elastică), prin care acesta va fi ancorat la traductorul de forţă. În continuare muşchiul papilar este transferat în baia de organe Steiert, unde va fi perfuzat continuu cu soluţie Tyrode oxigenată, cu un flux de aproximativ 10 ml/min şi unde, după o echilibrare prealabilă, se va face înregistrarea parametrilor electrici şi mecanici.

Solu ţ ia Tyrode, pentru mamifere este o solu ţ ie izoton ă folosit ă

Soluţia Tyrode, pentru mamifere este o soluţie izotonă folosită pentru experimente fiziologice şi culturi celulare. Există mai multe variante ale acestei soluţii adaptate la fiziologia diferitelor specii, acestea fiind utilizate şi astăzi atât experimental cât şi în practica medicală. Soluţia este asemănătoare cu soluţia Ringer lactat, dar conţine magneziu, glucoză, HEPES pentru tamponare. În funcţie de specia la cere se utilizează soluţia conţine fosfaţi sau sulfaţi respectiv potasiu. Soluţia Tyrode a fost utilizată pentru prima oară de către Maurice Vejux Tyrode (farmacolog american,

1878-1930).

Întregul procedeu, de la sacrificarea animalului şi până la mutarea muşchiului papilar în baia de organe, trebuie să se desfăşoare în cel mai scurt timp, pentru a evita starea de hipoxie a miocardului, care ar putea afecta rezultatele înregistrărilor.

Fenomene electrice şi mecanice ale fibrei miocardice izolate

23

După introducerea muşchiului papilar în baia Steiert

(
(

Figura nr. 18), se fixează sistemul de încălzire astfel încât să menţină temperatura soluţiei Tyrode circulante la o valoare constantă de 36°C şi se realizează o oxigenare a soluţiei cu O 2 95% şi 5% CO 2 . Cu ajutorul vizei micrometrice tracţionăm muşchiul, astfel încât să îl întindem cu o forţă de aproximativ 0,5 mN (presarcină, preload). În continuare se lasă o perioadă de 20-30 de minute pentru echilibrare, după care se trece la înregistrarea fenomenelor electrice şi mecanice.

Microelectrozii de sticlă sunt practic capilare de sticlă, realizaţi prin tracţionare la cald, sub forma unor micropipete cu un diametru al vârfului extrem de mic. Pentru tragerea microelectrozilor de sticlă, atât pentru cea manuală cât şi pentru cea automată, o regulă generală este aceea că, cu cât sistemul de încălzire ridică mai mult temperatura şi cu cât forţa de tragere este mai mare, cu atât vârful microelectrodului este mai subţire. Vârful unui astfel de microelectrod trebuie să fie de sub 1 μm, pentru a putea penetra membrana celulară fără să producă perturbări citoplasmatice severe. De asemenea, lungimea vârfului nu trebuie să depăşească 5-7 mm, în caz contrar electrodul devenind prea elastic şi pătrunzând greu prin membrana celulară. Sticla folosită trebuie să fie una dură (borosilicat), de preferinţă cu filament interior.

24

Lucrări practice de fiziologie

24 Lucr ă ri practice de fiziologie Figura nr. 18. Schema instala ţ iei pentru înregistrarea

Figura nr. 18. Schema instalaţiei pentru înregistrarea simultană a fenomenelor electrice şi mecanice ale fragmentului ventricular. B - baie Steiert, P - perfuzie cu soluţie fiziologică la temperatură constantă, M - micrometru de reglare a lungimii fragmentului, V - fragment ventricular montat pe un suport prevăzut cu electrozi de platină pentru excitare, STIM - stimulator electronic, E - electrod indiferent, mE - microelectrod, T - transductor mecanoelectric, A - amplificator electronic, ACH - sistem de achiziţie computerizată a semnalului.

Aceşti microelectrozi sunt umpluţi cu o soluţie electrolitică. Un fir de argint clorinat este introdus în soluţia electrolitică. Cationii şi anionii soluţiei electrolitice trebuie să aibă aceeaşi viteză de difuziune; în caz contrar, în momentul introducerii sale în fluidul tisular, la vârful micropipetei se dezvoltă un potenţial de difuziune. Soluţia cea mai potrivită este considerată soluţia de clorură de potasiu 2-3 M. Când se realizează clorinarea şi submersia unui electrod de argint într-un electrolit ce conţine clorură, la limita dintre Ag-AgCl şi electrolit se dezvoltă un potenţial stabil de graniţă, atâta timp cât un strat intact de AgCl acoperă electrodul de argint. Umplerea se poate realiza în mai multe moduri. Electrozii realizaţi din sticlă cu fenomen de capilaritate se pot umple pasiv dacă sunt lăsaţi 24 de ore în soluţia KCl 3 M. Cei realizaţi din tuburi capilare simple, se pot umple prin fierbere aproximativ 30 de minute pe becul Bunsen la presiuni sub cea atmosferică (se foloseşte o pompă de vid). Electrozii nu se pot utiliza imediat după umplere; ei trebuie lăsaţi în repaus termic cel puţin 24 de ore.

Poate cel mai important parametru care caracterizează un microelectrod este impedanţa acestuia. În cazul înregistrărilor intracelulare ea nu trebuie să fie mai mică de 10 MΩ şi nici mai mare de 50 M.

Înainte de utilizarea fiecărui microelectrod, acesta trebuie testat, deoarece, în cazul apariţiei unor semnale atipice, este dificil de stabilit sursa acestora. Iniţial se va face o apreciere vizuală: se urmăreşte ca vârful microelectrodului să fie intact şi ca la vârf să nu existe bule de aer. Se apreciază apoi rezistenţa şi impedanţa microelectrodului.

Fenomene electrice şi mecanice ale fibrei miocardice izolate

25

electrice ş i mecanice ale fibrei miocardice izolate 25 Figura nr. 19. C ă derea brusc

Figura nr. 19. Căderea bruscă a potenţialului la penetrarea membranei celulare.

Membrana celulară, o structură bistratificată fosfolipidică, în care sunt integrate proteine transmembranare (de ex. canale ionice), este un slab conducător de electricitate, ceea ce permite menţinerea unei diferenţe de potenţial între cele două feţe ale membranei în repaus. Înregistrările pe care le realizăm sunt de tip unipolar – ele se realizează între un electrod activ (microelectrodul de sticlă) – care culege potenţialul şi unul pasiv, situat pe fundul băii Steiert (o bucată de argint clorurat de puritate înaltă) – care înregistrează tot timpul un potenţial electric nul. Atunci când microelectrodul se află în spaţiul extracelular (în soluţia Tyrode din baie), el nu înregistrează potenţial electric. Pătrunderea microelectrodului prin membrana celulară este semnalizată prin prăbuşirea bruscă a liniei, până atunci izoelectrice, la aproximativ -90 mV (valoarea potenţialului de repaus al fibrei musculare), semn că microelectrodul a început să perceapă potenţialele electrice intracelulare (Figura nr. 19). După pătrunderea microelectrodului în celulă acesta va fi lăsat în repaus 20 – 30 de minute pentru stabilizare, interval de timp în care se realizează o adeziune a membranei celulare la vârful microelectrodului, astfel încât, la începerea stimulării şi apariţia contracţiilor, probabilitatea ca vârful microelectrodului să iasă din celulă să fie mai mică.

Morfologia potenţialului fibrelor miocardice diferă în funcţie de specie. La om, iepure şi cobai potenţialul are aspectul bine cunoscut, fiind alcătuit din 5 faze succesive (Figura nr. 17). La şobolan, morfologia potenţialului de acţiune este diferită, lipsind faza de platou (vezi Figura nr. 20).

diferit ă , lipsind faza de platou (vezi Figura nr. 20). Figura nr. 20. Poten ţ

Figura nr. 20. Potenţialul de acţiune al fibrei miocardice la şobolan.

După perioada de stabilizare, se trece la stimularea muşchiului papilar, care va începe să se contracte în ritmul impulsurilor generate de stimulator, iar pe ecranul calculatorului se va vizualiza mecanograma (traseul galben).

26

Lucrări practice de fiziologie

Pentru înregistrarea mecanogramei se foloseşte un senzor izometric, al cărui semnal de ieşire va fi amplificat de sistemul PlugSys 630 şi afişat pe monitor. Se observă spike-ul de stimulare (mica deflexiune negativă din faţa potenţialului de acţiune, pe traseul verde), urmat de potenţialul de acţiune şi ulterior contracţia mecanică. Între răspunsul electric şi cel mecanic se observă o întârziere de câteva milisecunde, interval de timp necesar pentru cuplarea excitaţiei cu contracţia.

În acest moment sistemul este pregătit şi se poate trece la realizarea diverselor experimente. pot fi studiate totodată o serie de fenomene fiziologice care au loc la nivelul fibrei musculare miocardice. pot fi studiate diverse substanţe, dintre care unele produc modificări ale duratei potenţialului de acţiune, ale forţei musculare, sau ambelor.

R ă spunde ţ i la întreb ă rile din prima pagin ă a Fi

Răspundeţi la întrebările din prima pagină a Fişei de lucru!

DETERMINAREA PRAGULUI DE EXCITABILITATE

După ce muşchiul a fost plasat şi fixat în baia Steiert se va începe stimularea acestuia, cu stimuli cu o frecvenţă de 0,5 Hz şi amplitudine progresiv crescută. Se va observa că atunci când se folosesc amplitudini mici ale stimulului muşchiul papilar nu produce nici răspuns electric, nici mecanic. Se creşte treptat amplitudinea stimulului şi se va observa că la un anumit moment dat stimulul va fi urmat de răspuns electric (potenţial de acţiune) şi mecanic (contracţie pe mecanogramă). Această valoare minimă a amplitudinii stimulului care produce răspuns celular poartă numele de prag de excitaţie. Dacă se creşte în continuare amplitudinea stimulului se observă că efectul nu se modifică – forţa de contracţie, amplitudinea şi durata potenţialului de acţiune rămân constante. Acest fenomen poartă numele de ”Legea tot sau nimic”.

Ră spunde ţ i la întreb ă rile din Fi ş a de lucru! ăspundeţi la întrebările din Fişa de lucru!

DETERMINAREA FAZELOR REFRACTARE

Se conectează în sistem un stimulator care permite modificarea pe parcursul experimentului a duratei dintre 2 stimuli succesivi. Se începe stimularea folosind stimuli a căror amplitudine este cu 10% mai mare decât valoarea prag. Se scade treptat intervalul dintre cei 2 stimuli succesivi, observându-se că, la un moment dat, al doilea stimul nu mai determină răspuns celular. Intervalul de timp dintre cei doi stimuli reprezintă perioada refractară absolută. Dacă se măreşte puţin intervalul dintre cei 2 stimuli, se va observa că al doilea stimul este urmat de răspuns electric şi mecanic, însă acestea sunt morfologic diferite de cele ale primului stimul. Intervalul de timp dintre cei 2 stimuli poartă numele de perioadă refractară relativă. Mărind şi mai mult intervalul dintre stimuli, se observă că ambii stimuli sunt urmaţi de răspunsuri electrice şi mecanice morfologic identice. Acest interval de timp reprezintă faza de refacere completă.

R ă spunde ţ i la întreb ă rile din Fi ş a de lucru!

Răspundeţi la întrebările din Fişa de lucru! Completaţi graficul!

Fenomene electrice şi mecanice ale fibrei miocardice izolate

27

VERIFICAREA LEGII FRANK-STARLING

O serie de stări patologice, precum insuficienţa aortică (în care cordul trebuie să pompeze un volum crescut de sânge), sau hipertensiunea arterială (în care cordul trebuie să împingă coloana de sânge împotriva unei presiuni crescute din circulaţia sistemică), se însoţesc în evoluţie de dilatarea cavităţilor cordului. Conform legii Frank-Starling, forţa de contracţie miocardică creşte odată cu alungirea fibrei musculare. Acest mecanism reprezintă astfel un mecanism compensator în faza iniţială a afecţiunilor amintite, prin creşterea forţei de contracţie odată cu dilatarea cavităţilor cordului. Această relaţie de proporţionalitate are loc însă numai până în momentul în care fibra atinge o anumită lungime (L max ), dincolo de care, dacă fibra continuă să se alungească, forţa începe să scadă. Experimental, legea Frank-Starling poate fi demonstrată crescând progresiv întinderea muşchiului şi urmărind mecanograma. Se observă iniţial creşterea forţei de contracţie, urmând ca după ce L max este depăşită, să înceapă să scadă. Pe parcursul distensiei muşchiului este posibil să apară potenţiale de acţiune şi răspuns mecanic, datorită activării unor canale ionice sensibile la întindere.

Completa ţ i graficul cu privire la aspectul mecanogramei pe parcursul întinderii progresive a mu

Completaţi graficul cu privire la aspectul mecanogramei pe parcursul întinderii progresive a muşchiului papilar!