HIBRIDIZAREA FLUORESCENTĂ IN SITU

(FISH, FLUORESCENCE IN SITU HIBRIDIZATION)

Prezentare de caz
Barbat, 24 ani, investigatii pentru infertilitate (azoospermie).Fenotip masculin,
pilozitate faciala si tronculara redusa, organe genitale externe de aspect normal. Anamnestic,
concluzionam dezvoltarea caracterelor sexuale secundare in jurul varstei de 16 ani, absenta
altor antecedente personale patologice semnificative.
Din antecedentele heredocolaterale poate fi mentionata prezenta unor cazuri de diabet
zaharat la bunica paterna, bunica materna, o sora a mamei si la un verisor de gradul I
Dintre investigatiile efectuate anterior
• Spermograma: azoospermie
• determinarea cromatinei sexuale X, rezultat: 19%,
• ecografie testiculara care indica relatii normale
• Rx de sa turceasca – relatii normale
• CT cranian - normal.
• Dozarile hormonale sanguine indica o testosteronemie la limita
inferioara a normalului si o moderata crestere a valorilor LH.
Citogenetica moleculara s-a nascut din intalnirea biologiei moleculare cu citogenetica
conventionala. Se situeaza pe o scala de rezolutie intermediara intre cele doua.

Citogenetica clasica – limite

- rezolutia de ~ 4 - 5 Mb;
- necesar - celule in diviziune;
- dificultatea de a elucida rearanjamentele complexe sau pe cele care implica regiuni
cromozomiale cu model de benzi similar.

Metoda FISH (fluorescence in situ hybridization)

- este utilizată pentru analiza ADN prin vizualizare directă pe preparate microscopice celulare
sau cromosomiale ( cromosomi prometafazici).
- se vizualizează simultan caracteristicile genotipice şi fenotipice a celulelor şi ale
cromosomilor.
- se ultilizează molecule de ADN monocatenar specific marcat radioactiv sau chimic (un
nucleotid fluorescent) cu fluorocromi= sonda ADN
- sonda ADN are capacitatea de a se ataşa de secvenţa ADN complementară indiferent unde
este situată aceasta în genom.
- sonda marcată poate fi asociată cu anticorpi monoclonali=> utilizarea mai multor
fluorocromi, creşterea intensităţii semnalului (ADN = antigen).Poate marca: cromozomi
metafazici; nuclei interfazici; cromozomi elongati; fibra de cromatina
 HIBRIDIZAREA
FLUORESCENTA
IN SITU

Definitie Principiu

tehnică de citogenetică hibridizarea prin

moleculară care permite complementaritate,
localizarea unei secvenţe a unei sonde de ADN
specifice de ADN într-un monocatenar, marcata
cromozom fluorescent, cu o anumită
regiune a unui cromozom

Pe ce se hibridizeaza?
Metafaze Nuclei
• clasic, dupa culturi de limfocite • Amniocite
• dar si pe material prelevat din • Limfocite
maduva • Celule bucale
• sau cultura de fibroblasti • Fragmente histopatologice
• Posibil pe orice tesut care
prolifereaza

1) Principiul tehnicii
- se bazeaza pe utilizarea unei sonde:
- a carei localizare este cunoscuta in genom si
- care este marcata chimic
- Sonda este pusa in contact cu cromozomii unei mitoze (sau nuclei interfazici) si
- se va hibridiza (se va fixa) specific la nivelul secventei sale complementare
- se poate vizualiza apoi sonda la microscop, pozitionarea identificand precis regiunea
cromozomiala pe care este complementara

Sondele sunt marcate:

- Fie cu o molecula fluorescenta – sonda direct vizibila la microscopul cu fluorecenta
- Fie cu o haptena (molecula care poate fi recunoscuta de anticorpi) – este necesara o etapa
suplimentara de revelare prin anticorpi fluorescenti pentru a fi vizualizata la microscop

Tehnica FISH
1) Denaturare cu sonda si lama si obtinerea unui ADN monocatenar
2) Hibridizare
• cu sonda denaturata
• in conditii controlate:
- de temperatura
- in prezenta agentului denaturant (formamida)
Citogenetica moleculara
Standard FISH
Multicolor FISH: M-FISH/SKY = vizualizarea simultana a celor 24 de cromozomi umani
diferiti, in culori diferite.
CGH = detectarea modificarilor cantitative si localizarea exacta a acestora pe cromozomi

Standard FISH
Rezolutia metodelor FISH
-cromozomi metafazici: 2 – 5 Mb
-nuclei interfazici: 0,2 – 2 Mb
-cromozomi elongati (prin diverse procedee mecanice-5 kb – 500 kb stretched chromosomes)
-fibre de cromatina/ADN

Sonde:
-centromerice
-telomerice
-locus specifice
-cromosom specifice (sonde pentru painting cromosomial, a unor regiuni sau total)

Sonde centromerice (alfoide) au specificitate pentru regiunile centromerice bogate în secvenţe

repetitive AT.Secventele
AT.Secventele pe care sunt complementare sunt de obicei prezente intr-un numar
mare de exemplare la nivelul centromerelor. Semnalul obtinut este deci in general intens
deoarece sonda se hibridizeaza pe fiecare din secventele complementare prezente .
- identificarea centromerului unui anumit cromozom
- identificarea cromozomilor marker
- identificarea anomaliilor cromozomiale numerice în nucleii interfazici:
interfazici:
diagnostic prenatal al aneuploidiilor, anomalii numerice in tumorile solide

Sonde telomerice
-specificitate pentru regiunile telomerice şi subtelomerice bogate în secvenţe repetitive
TAGGG
-identificarea rearanjamentelor cromozomiale subtelomerice (screening
(screening subtelomeric
pentru pacienţii cu retard mintal)
Sonde telomerice specifice(T2AG3)
Sonde subtelomerice
• Studiul unui telomer
• Studiul mai multor telomere
• Studiul tuturor telomerelor
Studiul subtelomerelor detecteaza majoritatea anomaliilor familiale.Sondele de talie mica
permit identificarea unei regiuni foarte precise din genom.Sunt
genom.Sunt obtinute prin marcajul ADN-
ului clonat in diferiti vectori.
• BAC (bacterial artificial chromosome;1BAC=100Kb)
• YAC (yeast artificial chromosome; 1YAC = 1Mb)
• Cosmide (10-30 Kb)
• Plasmide (100 pb- 3kb)
1 crs= 100Mb
100Mb = 100 YAC = 1000 BAC = 3300 cosmide
- permit detectarea şi studierea anomaliilor structurale de dimensiuni foarte mici:
microdeleţii, microduplicaţii, stabilirea precisă a punctelor de ruptură în cazul translocaţiilor
- au specificitate înaltă (cartografierea genomului uman / reprezentarea poziţiei reale a
genelor în ADN fiecărui cromozom)
Aplicaţiile FISH
Cercetare:
1. ADN:
- secvenţializare
-determinări cantitative
- localizarea genei pe cromosom
- depistarea unor mutaţii genice (deleţii şi duplicaţii submicroscopice)
- prezenţa secvenţelor ADN exogene în celulă (ADN viral)

2.La nivel cromosomial:

- vizualizarea cromosomilor, a unor regiuni sau componente ( telomer, centromer, constricţie
secundară) cromosomiale.
-depistarea unor rearanjamente cromosomiale ( translocaţii, deleţii, duplicaţii ),
-colorarea diferită a perechilor de cromosomi sau a benzilor cromsomiale ( sunt evidenţiate
rearanjamentele intracromosomiale).
- diagnosticul sindroamelor de microdeleţie

3.La nivelul celulelor interfazice:

- proba de ADN este aplicată pe un preparat care conţine nuclei intacti proveniţi din
vilozităţile coriale sau amniocite.
- procesul de hibridizare este similar celui pentru preparatele metafazice
- semnalele de hibridizare apar sub forma de puncte fluorescente in interiorul nucleilor
- diagnosticul unor aneupliodii , de exemplu: evidenţierea prezenţei a trei cromosomi 21 în
amniocite.
- diagnosticul prenatal al sexului prin evidenţierea absenţei sau prezenţei cromosomului Y
fără a fi necesară cariotiparea.
- determinarea distribuţiei temporo-spaţiale în celule şi ţesuturi a diferitelor molecule de
ARNm ( cu ribosonde).
- evalurea cantităţii de ARNm = nivelul expresiei genei
- nu e nevoie de cultura
- posibil pe tesuturi conservate in parafina sau congelate

4.Genom: hibridizarea genomică comparativă (CGH)

- ADN test (tumoral) este marcat cu fluorocrom verde
- ADN normal de control cu un fluorocrom roşu.
În amestec cele două probe hibridizează cu cromosomii metafazici normali şi evidenţiază:
- duplicaţie (exces de verde),
 - deleţie (exces de rosu) în ADN test.

Metoda multipex FISH:

- utilizează mai multe culori
- analiza digitală automată a imaginilor cu o cameră CCD
- soft de procesare a imaginilor
- fiecare cromosom are o culoare unică - detectarea rearanjamentelor cromosomiale

3) Principalele aplicatii ale hibridizarii in situ (FISH: Fluorescence In Situ

Hybridisation):
- punerea in evidenta a anomaliilor de numar ale cromozomilor, omogene sau in mozaic.
- anomalii structurale complexe
- elucidare diagnostică in multiple sindroame plurimalformative
- eficienţă in diagnosticul şi monitorizarea terapiei oncologice
• Avantaje
- Rapid
- Specific
- Dg. unor rearanjari cr. complexe
- Posibilitatea PGD

• Dezavantaje
- Costuri
- Necesita aparatura si software specializate
- Probele nu pot fi stocate
- Lamele trebuie citite f. repede
- Accesibilitate redusa
- Nu poate fi aplicat de rutina