Évaluation immunohistochimique du statut HER2 dans les carcinomes mammaires

infiltrants : mise au point du protocole technique et de la lecture des résultats –

recommandations

© Masson, Paris, 2002

Frédérique.Penault-Llorca[1]André.Balaton[2]Jean-Christophe.Sabourin[3]Viviane.Le
Doussal[3]et le Groupe d'évaluation des facteurs pronostiques par immunohistochimie dans les
cancers du sein (GEFPICS)*[3]

[1] Service d'Anatomie et Cytologie Pathologiques, Centre Jean Perrin, 58 Rue de

Montalembert, 63001 Clermont-Ferrand.

[2] Service d'Anatomie et de Cytologie Pathologiques, Centre de Pathologie, 20 avenue de la

gare, 91570 Bièvres.

[3] Service d'Anatomie et de Cytologie Pathologiques, Centre René Huguenin, 5 Rue Dailly,
92210 St-Cloud.

Tirés à part :
F.Penault-Llorca[3] , voir adresse en début d'article.

[4] fpenault@cjp.u-clermont1.fr

Groupe d'Évaluation des Facteurs Pronostiques par Immunohistochimie dans les Cancers du
Sein (GEFPICS) : L. Arnould. Centre GF Leclerc, service d'Anatomie Pathologique. 1 rue
Professeur Marion, 21034 Dijon Cedex ; A.J. Balaton. Centre de Pathologie, 20 avenue de la
Gare, 91570 Bièvres ; J.P. Bellocq. Hôpital Hautepierre, service d'Anatomie Pathologique, 1
avenue Molière, 67098 Strasbourg ; Y. Denoux. Centre François Baclesse, service
d'Anatomie et Cytologie Pathologiques. Route de Lion-sur-Mer, BP 5026, 14021 Caen Cedex
; F. Ettore. Centre Antoine Lacassagne, service d'Anatomie Pathologique, 33 avenue
Valombrose, 06189 Nice Cedex 2 ; M. Fiche. Hôpital G. et René Laennec, service
d'Anatomie Pathologique, BP 105, 44800 Saint-Herblain ; V. Fridman. Hôpital De La
Citadelle, service d'Anatomie et Cytologie Pathologiques, boulevard du 12e de Ligne, 1 B
4000, Liège, Belgique ; J.P. Ghnassia. Centre Paul Strauss, service d'Anatomie Pathologique,
3 rue de la Porte de l'Hôpital, 67085 Strasbourg ; G. Mac Grogan. Institut Bergonie, service
d'Anatomie et Cytologie Pathologie, 180 rue de Saint-Genès, 33076 Bordeaux Cedex ; J.M.
Guinebretière. Institut Gustave Roussy, service d'Anatomie et Cytologie Pathologiques, rue
Camille Desmoulins, 94805 Villejuif Cedex ; J. Jacquemier. Institut Paoli-Calmettes, service
d'Anatomie Pathologique, 232 boulevard Sainte Marguerite, 13027 Marseille Cedex 9 ; B.
Lannes. Hôpital Hautepierre, service d'Anatomie Pathologique, 1 avenue Molière, 67098
Strasbourg ; V. Le Doussal. Centre René Huguenin, service d'Anatomie Pathologique, 5 rue
Gaston Latouche, 92210 Saint-Cloud ; M.C. Mathieu. Institut Gustave Roussy,
Histopathologie C, rue Camille Desmoulins, 94805 Villejuif Cedex ; C. Migeon. Centre
Alexis Vautrin, service d'Anatomie Pathologique, avenue de Bourgogne, 54511 Vandoeuvre-
Les-Nancy ; F. Penault-Llorca. Centre Jean Perrin, département d'Anatomie et Cytologie
Pathologiques, 58 rue Montalembert, 63011 Clermont-Ferrand Cedex I ; P. Roger. Hôpital
Lapeyronie, CHRU Montpellier, service d'Anatomie Pathologique, avenue Doyen Giraud,
34298 Montpellier Cedex 5 ; J.C. Sabourin. Centre René Huguenin, service d'Anatomie et
Cytologie Pathologiques, 35 rue Dailly, 92210 Saint-Cloud ; A. Salomon. Institut Curie,
service d'Anatomie Pathologique, 26 rue d'Ulm, 75248 Paris Cedex 05 ; B. Sigal. Institut
Curie, service d'Anatomie Pathologique, 26 rue d'Ulm, 75248 Paris Cedex 05 ; J. Simony-
Lafontaine. Centre Val D'Aurelle – Paul Lamarque, service d'Anatomie Pathologique ; 208
rue des Apothicaires. Parc Euromédecine, 34298 Montpellier Cedex 5 ; I. Treilleux. Centre
Léon Bérard, service d'Anatomie Pathologique, 28 rue Laënnec, 69373 Lyon Cedex ; V.
Verriele. Centre Paul Papin, service d'Anatomie Pathologique, 2 rue Moll, 49033 Angers ;
M.O. Vilain. Centre Oscar Lambret, service d'Anatomie Pathologique, 3 rue Frédéric
Combemale, 59020 Lille ; J.J. Voigt. Institut Claudius Regaud ; service d'Anatomie
Pathologique, 20-24 rue du Pont St Pierre, 31052 Toulouse Cedex ; C. Voisin-Rigaud.
Institut Jean Godinot, service d'Anatomie et Cytologie Pathologiques, 1 avenue du Général
Koening, 51100 Reims.

Immunochemistry evaluation of HER2 status in infiltration breast cancer: tecnical protocol

and interpretation guidelines

In Europe, patients who may benefit from Herceptin® (an HER2 targeted drug) are currently
selected by immunohistochemistry (IHC). Reliable detection of HER2 status is essential to the
appropriate usage of Herceptin®, because its specificity is limited to tumours overexpressing
HER2. It is essential that the IHC evaluation of the HER2 status of a mammary carcinoma be
optimized and reliable. This technical paper reviews the different steps of the IHC technique,
the controls and, the rules for interpretation.The sensitivity of the IHC technique must be
adjusted so as not to produce false negatives or false positives. As opposed to other methods,
it can be carried out whatever the fixation conditions of the tissues. The interpretation of the
immunostains also requires training; it is fraught with problems for intermediate positivities.
The ideal score to evaluate HER2 status has not yet been defined. It will thus be necessary to
report the percentage of stained cells, the intensity of the staining, and, in respect to
Herceptin® treatment, the HercepTest scoring system (recommended in the package insert).
Once acquired, this knowledge must be perpetuated by the observation of rules of good
technical practice (internal and external controls, quality assurance programs).FISH should be
used for complementary assessment of 2+ cases (on condition that they have not been fixed in
Bouin's liquid) and for the calibration of the IHC technique.

HER2 , immunohistochemistry , FISH , herceptin® , quality assurance

En Europe, les patientes susceptibles de recevoir un traitement par Herceptin® (traitement

ciblé anti-HER2) sont actuellement sélectionnées sur la base d'un test immunohistochimique
(IHC). Une détection correcte du statut HER2 est indispensable à une utilisation optimale de
l'Herceptin®, puisque son efficacité est limitée aux patientes surexprimant HER2. Il est capital
que l'évaluation du statut HER2 par IHC soit optimisée et fiable. Cette note technique
présente les différentes étapes de la technique IHC, les contrôles utilisables et les règles
générales de l'apprentissage de la lecture. La sensibilité de la technique immunohistochimique
doit être ajustée de manière à ne pas produire de faux négatifs ni de faux positifs. A la
différence d'autres méthodes, elle est réalisable quelles que soient les conditions de fixation
des tissus. L'interprétation des immunomarquages nécessite aussi un apprentissage ; elle est
délicate pour les positivités intermédiaires. Le score idéal pour évaluer le statut HER2 n'est
pas encore défini. Il faudra donc rapporter le pourcentage de cellules marquées, l'intensité du
marquage et dans la perspective d'un traitement par Herceptin®, le score de l'AMM (score
HercepTest). Une fois acquis, ce savoir-faire doit être pérennisé par l'observation de règles de
bonnes pratiques techniques (utilisation rigoureuse de témoins internes et externes et
participation régulière à des programmes d'assurance qualité). La FISH doit être utilisée pour
l'évaluation des cas 2+ (à condition qu'ils n'aient pas été fixés dans le liquide de Bouin) et
pour l'étalonnage de la technique IHC.

HER2 , immunohistochimie , FISH , herceptin® , assurance qualité

La protéine transmembranaire HER2 (HER2/ neu, ERBB2, c-erbB-2), qui existe en faible
quantité dans les cellules glandulaires normales du sein, est surexprimée dans 15 à 30 % des
carcinomes mammaires infiltrants, dans 50 % des carcinomes canalaires in situ et dans plus de
90 % des cas de maladie de Paget du mamelon[1][3]. Elle est la cible thérapeutique d'un
anticorps monoclonal humanisé, le Trastuzumab, commercialisé récemment sous le nom
d'Herceptin®[1]. Le taux de réponse au traitement par l'Herceptin® dépend du niveau de
surexpression immunohistochimique de HER2 observé dans le carcinome infiltrant. En
Europe, les patientes susceptibles de bénéficier d'un traitement ciblé par l'Herceptin® sont
sélectionnées actuellement par immunohistochimie (IHC). Ce médicament, en association
avec le paclétaxel (Taxol®), a reçu l'Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) pour le
traitement du cancer du sein métastatique chez des patientes à forte surexpression tumorale de
HER2 (score 3+) tableau 1. La sélection s'effectue sur coupes histologiques de la tumeur
initiale ou, à défaut, sur une localisation métastatique facilement accessible (nodule de
perméation, biopsie hépatique...). La corrélation du statut HER2 entre les différents sites
tumoraux est très bonne[4][5].

Il est capital que l'évaluation IHC du statut HER2 d'un carcinome mammaire soit optimisée et
fiable[6][7]. La sensibilité de la technique immunohistochimique utilisée pour détecter la
surexpression de HER2 doit être ajustée de manière à ne pas produire de faux négatifs
(sensibilité trop faible) ni de faux positifs (sensibilité trop grande)[8]. Tous les fixateurs
courants sont utilisables mais le type de fixateur utilisé influe sur le signal
immunohistochimique et la technique doit lui être adaptée[9]. L'interprétation des
immunomarquages nécessite aussi un apprentissage ; elle est délicate pour les positivités
intermédiaires[10].

Mise au point du protocole technique

Objectif : disposer d'un protocole IHC fiable qui détecte un pourcentage « attendu » de
carcinomes infiltrants surexprimant HER2.

Moyens : utiliser un protocole immunohistochimique qui a été étalonné tableau 2 soit :

• par corrélation avec l'évaluation de l'amplification du gène HER2 par hybridation in

situ en fluorescence (FISH) ;
• par rapport à un témoin externe basé sur des lignées cellulaires calibrées par IHC et
par FISH[7][10][13]tableau 3figure 1 ;
• à partir d'une série de cas histologiques.

Remarques : Les dilutions des anticorps proposées dans les fiches techniques sont beaucoup
trop concentrées dès lors que l'on utilise un prétraitement par la chaleur. Les deux anticorps
les plus fréquemment utilisés en France sont l'anticorps polyclonal DA485 (Dako) et
l'anticorps monoclonal CB11 (Tebu/Novocastra, Ventana, Biogenex...). Le tableau 4
répertorie, à titre indicatif, des intervalles de dilution pour ces anticorps utilisés dans des
protocoles immunohistochimiques étalonnés. Un démasquage par la chaleur est recommandé.
Par ailleurs, plus le pH du tampon est élevé, plus il faudra diluer l'anticorps. De même, en cas
d'utilisation d'un système d'amplification du signal pour la révélation, une dilution de
l'anticorps sera nécessaire. Une première étape de « débrouillage » peut être effectuée sur
quelques coupes de sein normal et de cas connus pour présenter une forte surexpression de
HER2 (maladie de Paget du mamelon, carcinomes canalaires in situ de haut grade type
comédocarcinome, carcinomes canalaires infiltrants de grade III SBR, à grandes cellules, avec
métastases ganglionnaires)figure 1. Cette étape préliminaire permet de sélectionner des
dilutions de l'anticorps primaire pour lesquelles les glandes mammaires normales sont
négatives alors que les éléments carcinomateux présentent un immunomarquage membranaire
fort pour HER2. La référence idéale pour calibrer la technique IHC est la FISH. La
concordance entre IHC et FISH doit dépasser 90 %[2][14][15]. La CISH (hybridation in situ
avec sonde chromogénique non fluorescente)[11][15] pourra probablement servir de
technique alternative en particulier pour les cas fortement amplifiés (validation en cours par le
GEFPICS). L'emploi d'un kit immunohistochimique approuvé par la FDA (Federal Drug
Administration qui est l'équivalent, aux États Unis, de l'Agence du Médicament) – kit
HercepTest® (Dako) ou Pathway® (Ventana), peut constituer une alternative, à condition de
suivre scrupuleusement tous les détails du protocole (conditions de fixation et de restauration
antigénique par la chaleur notamment). Dans ces conditions, certaines équipes ont trouvé une
bonne corrélation avec l'amplification par FISH[16]. Mais il ne s'agit pas d'une garantie
absolue quant à la fiabilité des résultats. L'emploi de ce kit génère une proportion de positifs
anormalement élevée dans certains laboratoires[2][14][17][19]. Son usage nécessite donc une
étude de validation préalable sur des cas internes. Plusieurs de ces approches visant à
étalonner la technique immunohistochimique peuvent être combinées. L'étalonnage de la
technique vaut pour un fixateur donné. Il ne peut être réalisé de manière valable que si le
laboratoire dispose d'une procédure standardisée de préparation des échantillons tissulaire
(fixation sur tranches minces pendant des intervalles de temps contrôlés etc.). Chaque fois que
cela est possible, l'échantillon tumoral doit être accompagné de tissu non tumoral
(prélèvement réalisé à l'interface entre la tumeur et le tissu environnant ou fragment tumoral
accompagné d'un autre fragment prélevé dans une zone non tumorale et inclus dans le même
bloc). Si la technique immunohistochimique est bien étalonnée, les glandes mammaires
normales ne doivent pas présenter de marquage membranaire complet et constituent un
témoin négatif pour HER2 (absence de surexpression)figure 1. Il convient de vérifier
régulièrement que les pourcentages de cas positifs observés restent dans les limites rapportées
dans la littérature. La positivité de cas de carcinomes lobulaires de forme classique, ou à
l'inverse, l'absence de marquage de plusieurs carcinomes canalaires infiltrants de haut grade à
grandes cellules, doit attirer l'attention du pathologiste. Il pourrait s'agir de faux positifs ou
bien de faux négatifs respectivement. Il convient alors de vérifier la dilution de l'anticorps
et/ou la préservation des sites antigéniques (immunodétection par la vimentine par exemple).

Apprentissage de la lecture

Règles générales

• Le marquage observé au niveau des témoins positifs externes doit être

satisfaisantfigure 1.
• Il ne doit pas y avoir de marquage membranaire circonférentiel des cellules
glandulaires normales[20]figure 1.
 • Il faut considérer uniquement le marquage membranaire circonférenciel et complet
des cellules carcinomateuses infiltrantes, apprécier le pourcentage de cellules
marquées et l'intensité du marquagefigure 1.
• Il faut toujours interpréter l'immunomarquage dans les zones tissulaires bien
préservées morphologiquement et se méfier des artefactsfigure 2.
• Dans la majorité des cas, le marquage est homogène dans toutes les cellules car
l'activation de HER2 est un mécanisme de tout ou rien dans les carcinomes
mammaires[21].
• En cas de marquage hétérogène, s'il s'agit d'un artefact lié à la préparation tissulaire,
l'interprétation doit alors ignorer les zones d'artefact. S'il n'y a pas lieu de suspecter un
artefact, une moyenne est réalisée sur l'ensemble de la lamefigure 2. Au moindre
doute, il ne faut pas hésiter à refaire la technique sur d'autres blocs tumoraux s'ils sont
disponibles.

En pratique
Dans le cadre de l'AMM, il faut transcrire le résultat et l'exprimer selon le score utilisé pour la
décision thérapeutique tableau 1 :

• Au faible grandissement (Objectif X2 ou X4) : si la majorité des cellules tumorales

présentent une positivité nette et distincte, il s'agit d'un 3+, à contrôler au X10. Le
score 3+ se porte au faible grandissement.
• Au grandissement moyen (Objectif X10) : s'il y a un marquage net de la majorité des
cellules, mais à un niveau moindre qu'un 3+, il s'agit d'un 2+ ; si le marquage est
moins distinct, incomplet et « demande » à être observé à un grandissement supérieur,
il s'agit d'un 1+. Les scores faibles (1+, 2+) se portent au grandissement moyen et
se confirment au fort (X40) grandissement. Si l'on doit vérifier à l'objectif X20 ou
au X40, l'intégrité d'un marquage membranaire, il ne peut pas s'agir d'un
3+figure 2.

Remarques
Dans le compte rendu final, qui est conclu par le score à usage thérapeutique, doivent figurer
en clair le pourcentage et l'intensité des cellules marquées[20]. Des travaux en cours au sein
du GEFPICS montrent qu'une excellente corrélation entre l'IHC et la FISH est obtenue à partir
d'un seuil d'immunomarquage de 60 % et cela quelle que soit l'intensité. Ces résultats
demandent à être confirmés et validés en pratique clinique par rapport à la réponse à un
traitement par Herceptin“. Interprétation des tumeurs avec un marquage des glandes non
tumoralesfigure 2 : la technique doit dans un premier temps être réalisée à nouveau en diluant
l'anticorps. La technique peut être refaite en prenant un autre bloc de tumeur. Il peut
également s'agir d'un phénomène lié à la fixation (AFA, formol alcool). Si ce marquage
persiste, il faut interpréter avec précaution le résultat.

Au total

L'immunohistochimie est la technique de référence pour déterminer le statut de HER2 dans

les carcinomes mammaires[6][8][22][24]. À la différence d'autres méthodes, elle est réalisable
quelles que soient les conditions de fixation des tissus. Son optimisation passe par la mise au
point d'une technique correcte et d'un apprentissage de l'interprétation des immunomarquages.
Une fois acquis, ce savoir-faire doit être pérennisé par l'observation de règles de bonnes
pratiques techniques (utilisation rigoureuse de témoins internes et externes et participation
régulière à un programme d'évaluation externe de la qualité technique comme l'AFAQAP ou
l'UK-NEQAS[25]. Le score idéal pour évaluer le statut HER2 n'est pas encore défini. Il faudra
donc rapporter le pourcentage de cellules marquées, l'intensité du marquage[20] et dans la
perspective d'un traitement par Herceptin“, le score de l'AMM tableau 1.

La FISH est utilisée pour l'évaluation des cas 2+ (à condition qu'ils n'aient pas été fixés dans
le liquide de Bouin) et pour l'étalonnage de la technique IHCfigure 3.

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Illustrations

Figure 1a.Lignée cellulaire MDA 175 – IHC HER2 anticorps polyclonal DAKO DA485,
score 1+ (X 20).

a) Cell line MDA 175 – IHC HER2 polyclonal antibody DAKO DA485, score 1+ (X 20).

Figure 1b.b) Lignée cellulaire MDA 453 – IHC HER2 anticorps polyclonal DAKO DA485,
score 2+ (X 40).

b) Cell line MDA 453 – IHC HER2 polyclonal antibody DAKO DA485, score 2+ (X 40).

Figure 1c.Lignée cellulaire SKBR3 – IHC HER2 anticorps polyclonal DAKO DA485, score
3+ (X 40).

c) Cell line SKBR3 – IHC HER2 polyclonal antibody DAKO DA485, score 3+ (X 40).

Figure 1d.Maladie de Paget du mamelon. IHC HER2 anticorps monoclonal CB11. Marquage
membranaire complet de la majorité des cellules tumorales infiltrant l'épithélium(X 20)
(contrôle externe positif).
d) Paget disease – IHC HER2 monoclonal antibody CB11. Complete membrane staining of
the vast majority of the carcinomatous cells infiltrating the epithelia (3+) (X 20) (external
positive control).

Figure 1e.Carcinome canalaire in situ de haut grade – IHC HER2 anticorps monoclonal
CB11, marquage membranaire en maille de filet de la majorité des cellules de carcinome
canalaire in situ (X 20) (contrôle externe positif).

e) High grade ductal carcinoma in situ – IHC HER2 monoclonal antibody CB11, Fish net or
chicken wire pattern of staining in the vast majority of the in situ carcinomatous cells (X 20)
(external positive control).

Figure 1f.Carcinome canalaire infiltrant – IHC HER2 anticorps polyclonal DAKO DA485,
marquage membranaire en maille de filet de la majorité des cellules tumorales infiltrantes et
négativité du contingent non tumoral (3+) (contrôle interne négatif) (X 20).

f) Invasive ductal carcinoma – IHC HER2 polyclonal antibody DAKO DA485, Fish net or
chicken wire pattern of staining in the vast majority of the carcinomatous cells and negativity
of the non neoplasic mammary glands (3+) (internal negative control) (X 20).

Figure 1g.Carcinome canalaire infiltrant – IHC HER2 anticorps polyclonal DAKO DA485,
marquage membranaire en maille de filet de plus de 60 % des cellules tumorales infiltrantes
(3+) (X 4,5).

g) Invasive ductal carcinoma – IHC HER2 polyclonal antibody DAKO DA485, Fish net or
chicken wire pattern of staining in more than 60 % of the invasive cells (3+) (X 4,5).

Figure 1h.Même cas que figure G, fort grossissement, montrant le marquage membranaire
intense des cellules carcinomateuses infiltrantes (3+) (X 40).

h) Same case as figure G, higher magnification showing the typical intense membrane
staining of the invasive component (3+) (X 40).
Figure 2a.Carcinome canalaire infiltrant – IHC HER2 anticorps monoclonal CB11, marquage
membranaire incomplet des cellules infiltrantes (1+) (X 40).

a) Invasive ductal carcinoma – IHC HER2 monoclonal antibody CB11, no circumferential

membranous staining of invasive cells (1+) (X 40).

Figure 2b.Marquage hétérogène montrant des secteurs de positivité 3+ associés à des secteurs
0, 1 ou 2+ – anticorps polyclonal DAKO DA485 (X 20).

b) Heterogeneous staining showing true 3+ areas associated to 0, 1 or 2+ areas – polyclonal

antibody DAKO DA485 (X 20).

Figure 2c.Carcinome canalaire infiltrant – IHC HER2 anticorps polyclonal DAKO DA485,
marquage membranaire en maille de filet, intensité moyenne (2+)(X 20).

c) Invasive ductal carcinoma – IHC HER2 polyclonal antibody DAKO DA485, Fish net or
chicken wire pattern of staining, moderate intensity (2+)(X 20).

Figure 2d.Même cas que figure C, fort grossissement montrant un marquage membranaire
complet d'intensité moyenne de plus de 50 % des cellules (2+) (X 40).

d) Same case as figure C, higher magnification showing the moderate membrane staining in
more than 50 % of the cells (2+) (X 40).

Figure 2e.Contrôle négatif interne non conforme – IHC HER2 anticorps polyclonal DAKO
DA485. Marquage membranaire intense des cellules glandulaires normales (vérifier la
dilution de l'anticorps), le marquage du contingent infiltrant ne peut être interprété dans ce cas
(X 40).

e) Inappropriate internal negative control – IHC HER2 polyclonal antibody DAKO DA485.
Intense membrane staining of normal glandular cells (check the antibody dilution), the
staining of the invasive pattern cannot be interpreted in this case (X 40).
Figure 2f.Artéfact de congélation (échantillon de coupe à congélation) – IHC HER2 anticorps
polyclonal DAKO DA485. Altération membranaire, artéfact de rétraction, dépôt de
chromogène. Un marquage membranaire est observé dans certaines cellules. Si possible
retester d'autres blocs ou bien réaliser une technique de FISH (X 40).

f) Freeze artifact (frozen section sample) – IHC HER2 polyclonal antibody DAKO DA485.
Membrane alteration, retraction artifact, deposition of the chromogen. Circumferential
membrane staining is observed in some cells. If possible retest other blocks or perform FISH
(X 40).

Figure 3.Algorythme décisionnel.

Decision algorithm