Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Enzimologia III
Enzimologia III
Biosenzori potentiometrici
Biosenzori Potentiometrici
Biosenzorii potentiometrici utilizeaza ca traductori pentru transformarea semnalului
biologic in semnal electric, electrozi ion-selectivi. In cea mai simpla reprezentare, ei sunt
constituiti dintr-o membrana ce contine enzima imobilizata si care inconjoara membrana de sticla
semi-permeabila a unui electrod de pH. Reactiile catalizate de enzima imobilizata genereaza sau
absorb ioni de hidrogen. Aceste reactii care au loc langa membrana subtire de sticla a electrodului
vor permite inregistrarea schimbarii valorii de pH ce se va afisa direct pe ecranul pH-metrului.
Avantajul acestor electrozi este ca potentialul electric determinat este generat cu o viteza lenta
comparativ cu a reactiei enzimatice, ceea ce face sa nu apara nici o interferenta cu reactia
enzimatica.
Exista trei tipuri de electrozi ion-selectivi care sunt utilizati ca biosenzori:
1. Electrozi de sticla pentru cationi (de exemplu electrozii normali de pH) in care elementul
sensibil este o membrana de sticla hidratata foarte subtire care permite generarea unui
potential electric transversal datorat competitiei, dependente de concentratie, dintre
cationii ce se leaga la situsurile specifice enzimei imobilizate. Selectivitatea acestei
membrane este determinata de compozitia sticlei. Senzitivitatea fata de H + este mai mare
decat fata de cea realizata pentru NH 4 ;
2. Electrozi de pH de sticla inveliti cu membrane selective pentru gaze, CO 2, NH3 sau H2S.
Difuzia gazului prin membrana determina o schimbare in pH-ul solutiei sensibile aflata
intre membrana selectiva pentru gaze si electrod, si care este apoi determinat;
3. Electrozi la care membrana de sticla este inlocuita printr-o membrana subtire a unui ion
conductor specific, de exemplu realizata dintr-un amestec de sulfura de argint si o
halogenura de argint (Ag2S/AgX). Astfel electrodul iodura este utilizat pentru
determinarea I- intr-o reactie catalizata de peroxidaza sau cel cianura intr-una catalizata
de β- glucozidaza raspunzand prezentei ionilor de cianura.
unde E este potentialul masurat (in volti), E0 este o constanta caracteristica pentru sistemul ion-
selectiv/electrod extern cunoscuta si ca potentialul standard al sistemului respectiv, R este
constanta gazelor, T este temperatura absoluta (K), z este sarcina ionica, F este constanta Faraday
si [i] este concentratia speciilor ionice necomplexate, libere (in mod strict [i] ar trebui sa fie
activitatea ionului dar la concentratiile normal intalnite in biosenzori, aceasta este efectiv egala cu
concentratia). Aceasta inseamna, de exemplu, ca pentru fiecare decada de crestere in concentratia
H+ la 250C exista o crestere in potentialul electric de 59 mV. Dependenta logaritmica a
potentialului de concentratia ionica este responsabila atat pentru domeniu analitic larg dar si
pentru exactitatea si precizia scazuta a acestor senzori. Domeniul lor normal de detectie este 10 -4
– 10-2 M, desi exista cativa care sunt de 10 ori mai sensibili. Timpul necesar pentru un raspuns
tipic este intre 1 si 5 minute permitand pana la 30 de analize per ora.
Biosenzorii care implica utilizarea sau eliberarea de H + necesita utilizarea unor solutii
tampon foarte diluate (de ex. < 5mM) pentru a se putea determina schimbari semnificative de
potential. Relatia dintre modificarea de pH si concentratia substratului este complexa, incluzand
unele efecte non-lineare ca variatia activitatii de pH si efectul de tamponare a proteinelor. Insa,
adesea conditiile pentru care exista o relatie lineara intre schimbarea aparenta de pH si
concentratia substratului, pot fi stabilite.
Desi s-a obtinut un important progres in realizarea de biosenzori, exista inca o serie de
probleme care trebuie rezolvate. Una dintre cele mai mari probleme este faptul ca performantele
biosenzorului variaza sau se degradeaza in timp relativ scurt, adesea prin forme, modalitati
neasteptate. Acest fenomen impune calibrarea lor regulata sau mai bine de fiecare data inainte de
utilizare pentru o noua serie de analize.
Necesitatea de a rezolva astfel de probleme a condus la realizarea unor biosenzori cu
electrozi ion-selectivi care contin si tranzistori cu efect intr-un camp ion-selectiv (ISFET = Ion
Selective Field). Cand contin si enzima imobilizata cuplata cu campul in care transistorul
actioneaza se numesc Enzyme Field Effect Transistor (ENFET) (fig…).
Principalul avantaj al acestor sisteme este dimensiunea lor extrem de mica (<<0,1 mm 2)
ceea ce permite producerea ieftina industriala a acestora folosindu-se tehnologia circuitelor
integrate. In plus sunt mult mai stabile decat cele fara tranzistori.
De exemplu un astfel de sistem construit pentru determinarea la ureei, continand ureaza
legata si un electrod de referinta continand glicina legata, a aratat doar o variatie de 15% in
raspunsul fata de uree (0,05 – 10,0 mg/ml) pe o perioada de activitate de o luna.
Au fost realizati diferiti biosenzori miniaturizati continand dispozitive ISFET si ENFET
pentru determinarea unor analiti. Senzitivitatea sistemelor FET poate fi insa afectata de
compozitie, tarie ionica si concentratiile solutiilor analizate.
Biosenzori Amperometrici
Biosenzorii amperometrici functioneaza prin producerea unui curent electric cand se
aplica un potential intre 2 electrozi. Acestia au in general timpi de raspuns, domenii dinamice si
senzitivitati similare biosenzorilor potentiometrici.
Cel mai simplu biosenzor amperometric aflat pe piata implica un electrod de oxigen
Clark. Acesta consta dintr-un catod de platina la care este redus oxigenul si un electrod de
referinta argint/clorura de argint. In mod normal ambii electrozi sunt scufundati intr-o solutie de
clorura de potasiu saturata si separati de masa de solutie in care se afla analitul printr-o membrana
de plastic, permeabila la oxigen (de exemplu Teflon, politetrafluoroetilena).
Cand un potential de + 0,224 V, corespunzator electrodului de Ag/AgCl, se aplica la
catodul de platina, se produce un curent proportional cu concentratia de oxygen si la electrozi au
loc urmatoarele reactii:
anod de Ag: 4Ag0 + 4Cl- 4AgCl + 4e-
catod de Pt: O2 + 4H+ + 4e- 2H2O
Prin aplicarea unui potential de +1,20 V la electrodul de platina, reciproc fata de
Ag/AgCl, se obtin reactii in sens contrar:
Pt anod: H2O2 O2 + 2H+ + 2e-
Ag catod: 2AgCl + 2e- 2Ag0 + 2Cl-
E0 = +0,10 V E0 = +0,19 V
electrod
H2O2 O2 + 2H+ + 2e-
(b)
biocatalizator
FADH2-oxidaza + 2 Ferociniu+ FAD-oxidaza + 2 Ferocen + 2H+
electrod
2 Ferocen 2 Ferociniu+ + 2e-
(c)
biocatalizator/electrod
FADH2-oxidaza FAD-oxidaza + 2H+ + 2e-
Curentul (i) produs prin asemenea biosenzori amperometrici este legat de viteza de reactie (v A)
prin expresia:
i = nFAvA
unde n reprezinta numarul de electroni transferati, A este aria electrodului, si F este numarul lui
Faraday. In mod obisnuit viteza de reactie este influentata mai ales de capacitatea de difuzie a
substraturilor dar si de a produsilor de reactie respectivi. In aceste conditii curentul electric
produs este proportional cu concentratia analitului si independent atat de cinetica enzimatica cat
si electrochimica.
Factori ce influenteaza extractia (tampoane utilizate)
Problemele majore care apar pe parcursul extracţiei, purificării unei proteine sunt:
Denaturarea termica;
Fortele de forfecare;
Variatia/scăderea pH-ului mediului;
Dilutia;
Schimbarea structurii conformationale;
Fenomene de oxidare;
prezenţa ionilor metalici;
formarea radicalilor liberi;
prezenţa enzimelor proteolitice în cantităţi mari;
contaminarea cu acizi nucleici, bacterii şi virusuri;
formarea de spuma.
Tampoanele utilizate
Sistemul tampon ales pentru extracţia unei enzime dintr-o anumită sursă biologică poate influenţa
capacitatea de solubilizare şi activitatea catalitică a acesteia prin:
valoarea pH – ului său;
tăria sa ionică şi
compoziţia sa.
Astfel, la alegerea unui tampon pentru extracţia unei enzime trebuie avuţi în vedere următorii
factori:
să aibă solubilitate mare în apă;
să nu fie volatile;
Tăria ionică a tamponului trebuie să corespundă unei capacităţi de tamponare
suficiente şi să determine extracţia optimă a enzimei;
să asigure manifestarea unei activităţi catalitice maxime;
să asigure stabilitatea enzimei (domeniul pe care tamponul menţine pH – ul mediului
constant să corespundă cu cel de stabilitate al enzimei);
Componentele tamponului nu trebuie să manifeste efecte negative asupra activităţilor
enzimatice si să nu interfere în metodele de determinare a concentraţiilor proteice
(tampoanele polianionice de tipul citratului şi fosfatului sunt agenţi de chelatare ai
unor ioni metalici care pot fi esenţiali în acţiunea unor enzime);
să nu interacţioneze cu substraturi, cu cofactori sau cu ioni metalici;
Concentraţia tamponului nu trebuie să interfere în etapele ulterioare extracţiei
(concentraţii mari de tampoane polivalente pot competiţiona cu proteinele în legarea
la situsurile încărcate ale schimbătorilor de ioni).
Majoritatea proteinelor au solubilitate maximă la tării ionice moderate, cuprinse între 0,05 şi 0,1
M, valori care sunt alese dacă capacitatea de tamponare a sistemului tampon este suficientă în
aceste condiţii.
Deoarece solutiile tampon sunt in general solutii destul de diluate, in evaluarea celor mai bune
tampoane pentru extractia unei enzime de interes se utilizeaza legea dilutiei sau
legea lui Ostwald. Aceasta arată dependenţa constantei de disociere, de gradul de disociere şi de
2C
K
concentraţie: (1 )
Extracţia proteinelor din ţesuturi sau celule poate conduce la obţinerea unor soluţii de enzime
foarte concentrate. În unele compartimente celulare, cum ar fi de exemplu matricea
mitocondrială, concentraţia proteinelor este de peste 500 mg/ml. Pentru a putea determina
activitatea enzimelor, concentraţia proteică trebuie redusă la 5 mg/ml în extractele celulare şi la 5
g/ml în soluţia unei enzime pure.
În practică s-a constatat insa că multe enzime îşi pierd rapid activitatea dacă sunt păstrate în
soluţii diluate. Acest efect poate fi contracarat prin introducerea unei proteine „inerte”, cum este
albumina serică bovină, în concentraţie de 1 – 10 mg/ml. Introducerea acestei proteine poate
preveni pierderea activităţii enzimatice datorate adsorbţiei pe suprafaţa veselei utilizate sau
degradării prioritare a acesteia de către enzimele proteolitice coprezente. Diluţia extractelor
proteice poate avea ca efect şi disocierea unor cofactori de apoenzimă, fenomen care poate
determina pierderea activităţii catalitice. Pentru ca acest efect să poată fi compensat, se
recomandă introducerea cofactorului în sistemul tampon utilizat pentru extracţie.
Câteva tampoane utilizate pentru extracţia proteinelor sunt prezentate în tabelul Utilizarea unor
tampoane cu capacitate slabă de tamponare pentru cantităţi mari de proteine necesită verificare
pH – ului mediului, întrucât proteinele acţionează ca sisteme tampon. Tampoanele utilizate pentru
extracţia proteinelor au în general concentraţii cuprinse între 20 şi 100 mM (concentraţia unui
tampon se referă la concentraţia tuturor speciilor componente).
Tabel….
Sisteme tampon utilizate pentru extracţia proteinelor
Tampon Valori pKa
Acid acetic/Acetat de sodiu 4,75;
Acid acetic/Acetat de amoniu 4,74; 9,25;
Acid carbonic/Bicarbonat de sodiu 6,50; 10,25;
Acid carbonic/Bicarbonat de amoniu 6,50; 9,25;
Acid citric/Citrat de sodiu 3,09; 4,75; 5,41;
fosfat monosodic/fosfat disodic 7,21;
Tris - HCl
10,25;
Tris - fosfat
1,5; 7,5; 12,0; 8,21;
Tris : Tris (hidroximetil) aminometan
Totusi, cea mai utilizată metodă implică utilizarea, în etapele de extracţie şi în cele ulterioare, de
inhibitori ai enzimelor proteolitice. Inhibitorii reacţionează şi modifică ireversibil unele resturi de
aminoacizi implicate în funcţia enzimelor proteolitice. Câteva exemple de astfel de substanţe sunt
:
Diizopropil fluorofosfatul (DIP), inhibitor ireversibil al serin – proteinazelor la
concentraţii de 1 mM în mediu, substanţă foarte toxică şi instabilă în soluţii apoase:
Acidul monoiod acetic sau moniod acetamida ( IAA, IAN), sunt inhibitori ai cistein –
proteinazelor la concentraţii mici, cuprinse între 10 şi 100 M:
E – SH + ICH2- CONH2E – S – CH2- CONH2 + HIIAN
Cistatinele, inhibitori naturali de natură peptidică, se leagă reversibil şi inhibă unele tiol
proteinaze;
Pepstatina A, o substanţă naturală, cu structură asemănătoare unei pentapeptide, secretată
de unele specii de Streptomyces, inhibă la concentraţii de 1 M unele proteaze acide cu
resturi de acid aspartic în centrul catalitic activ.
Pentru a inhiba toate tipurile de enzime proteolitice prezente într-un extract proteic total se
utilizează amestecuri de astfel de inhibitori.
a b c
Fig. Difuzia solventului şi/sau solutului în diferite condiţii prin membrană
.
Aceste fenomene au condus în ultimul timp la dezvoltarea unor proceduri de izolare şi
purificare nu numai ieftine ci şi superioare calitativ.
În prezent există şi sisteme, comerciale, care conţin o membrană între două spaţii, un
spaţiu pentru proba ce se va dializa şi un spaţiu pentru tamponul faţă de care se face dializa şi
care este mai mare deoarece tamponul (apa) faţă de care se dializează se află într-un volum de
200-300 ori mai mare (fig.).
Pe lângă desalifiere, este necesar ca în procesele de purificare să fie îndepărtate şi alte
molecule. De exemplu în lucrul cu proteine şi acizi nucleici este adeseori necesar să fie
îndepărtaţi agenţii reducători (ditiotreitol, 2-mercaptoetanol), liganzi care nu au reacţionat,
reactivi de marcare sau conservanţi.
De asemenea acest procedeu se foloseşte şi atunci când este necesar să se schimbe
tamponul în care se află proba.
Desi procesul de osmoza inversa era folosit doar in industria vinului in prezent este
inteles si larg folosit in diferite domenii.
Prin osmoză inversă pot fi concentraţi toţi compuşii care au o greutate moleculară mai
mare de 150 – 250 Daltoni aşa cum sunt: bacteriile, săruri organice, glucide, proteine, coloranţi,
săruri etc.
Deoarece cei mai mulţi dintre contaminanţi nu trec prin membrane specifice o dată cu
apa, prin acest procedeu se poate obţine apă pură. Membranele utilizate în mod obişnuit în acest
scop sunt realizate din celuloză – triacetat, celuloză – diacetat sau membrane realizate din
poliamide aromatice.
Membranele utilizate pentru osmoza inversă sunt mult mai restrictive decât cele utilizate
pentru ultrafiltare.
Prin particularităţile sale osmoza inversă este deosebit de importantă pentru purificarea
apei fiind utilizată în tehnicile moderne aplicabile în acest scop..
Echilibre in sisteme bifazice apa-solvent organic cu un substrat
Echilibre in sisteme bifazice apa-solvent organic cu un substrat.
Daca consideram o simpla reactie ce implica un echilibru intre un reactant A si un produs
B, Kw reprezinta constanta de echilibru (Keq) a acestei reactii in apa:
(I)
Daca aceasta reactie are loc intr-un sistem bifazic constand dintr-un amestec de apa si un
solvent organic, atat substratul A cat si produsul B vor fi repartizati intre cei doi solventi, avand
coeficientii de partitie PA respective PB si o diferita constanta de echilibru ce se stabileste intre A
si B pentru faza organica (Korg).
(II)
Datorita naturii ciclice a acestui echilibru numai trei din acesti parametri sunt variabile
independente si anume Kw PA si PB in timp ce Korg depinde de acestia. De aceea in discutarea
echilibrului bifazic vom lua in calcul in special parametrii K w PA si PB, desi in anumite conditii de
concentratie foarte scazuta a apei se vor folosi mai degraba parametrii K org, PA si PB. Constanta
generala de echilibru a acestui sistem (Kbifazic) poate fi definita ca:
Bt
Kbifazic =
At (5)
unde t se refera la total, adica la solutia totala formata din apa si solventul organic, substratul total
respectiv produsul total din cele doua faze. Daca notam cu V volumele implicate atunci vom
avea:
[At]Vt = [Aw]Vw + [Aorg]Vorg (6)
[Bt]Vt = [Bw]Vw + [Borg]Vorg (7)
Vt = Vw + Vorg (8)
Substituind din ecuatiile 6 si 7 in 5 obtinem:
Bt Vt Bw Vw Borg Vorg
Kbifazic =
At Vt =
Aw Vw Aorg Vorg (9)
Kbifazic =
Aw Vw Aw Vw =
Aw Vw (10)
= Vw (12)
Constanta generala, globala, de echilibru (Kbifazic) variaza cu volumele relative ale fazelor
organice si apoase si evident cu coeficientii de partitie respectivi; creste cand substratul este
partitionat mai eficient in faza apoasa in comparatie cu comportarea produsului (P A<PB) si
descreste cand are loc fenomenul in sens invers. Daca exista diferente suficiente intre coeficientii
de partitie, si atat substratul cat si produsul sunt relativ non-polari, atunci au loc importante
deplasari in echilibru chiar la continuturi relativ inalte de apa. O crestere importanta a constantei
de echilibru se poate obtine cand atat substratul cat si produsul au coeficienti de partitie mai mici
decat 1 si raportul dintre acestia este potrivit.
In mod evident daca este foarte mic, Kbifazic tinde spre valoarea constantei de echilibru in
solutie apoasa Kw. Insa, daca este suficient de mare ecuatia 11 se simplifica la:
PB
Kbifazic = Kw PA (13)
In consecinta substituind din ecuatiile 2 – 5, vaorile coeficientilor de partitie, se obtine:
B
org
Kbifazic =
A
org
= Korg (14)
Prin urmare Kbifazic tinde spre valoarea Korg, constanta de echilibru a reactiei in lichidul
organic pur.
(IV)
Directia normala pentru reactia in solutia apoasa procesul hidrolitic de la dreapta la
stanga. Insa, constanta generala de echilibru poate fi deplasata in solutiile bifazice, asa cum am
aratat mai sus, si poate permite hidrolazei sa actioneze mai degraba intr-o maniera sintetica decat
hidrolitica (de exemplu de la stanga la dreapta in schema IV). Asemenea reactii des intalnite in
procesele tehnologice care utilizeaza enzime, ca si reactiile sintetice sunt, in general, mult mai
dificil a se realiza in bune conditii prin chimia organica clasica decat reactiile hidrolitice. Ca unul
din reactantii participanti [(H2O)t] poate fi obtinuta din balanta materialelor:
[(H2O)t](Vw + Vorg) = [(H2O)w]Vw + [(H2O)org]Vorg (16)
unde [(H2O)w] este concentratia molara a apei pure ( = 1000/18 = 55,5 M). Substituind P w pentru
[(H2O)org]/ [(H2O)w], obtinem:
55,5(1 Pw )
[(H2O)t] = 1 (17)
Ct (H 2O )t
Kbifazic =
At Bt (18)
Substituind Kbifazic cu valorile din ecuatia 16 (inlocuind PD cu Pw) si rearanjand termenii se
obtine:
(1 PC )(1 ) At Bt
[Ct] = Kw
55,5(1 PA )(1 PB ) (19)
Aceasta reprezinta o relatie foarte complexa dar pot fi facute cateva generalizari. Daca
produsul C este mai putin polar decat oricare dintre reactanti (A si B) atunci productia creste in
general cu concentratia corespunzatoare a fazei organice () pana la atingerea unei valori
constante, un platou. Daca are loc fenomenul invers atunci la valori inalte va fi o productie
scazuta in diagarma - productie. In functie de parametrii de lucru se pot obtine atat valori
maxime cat si minime.
In vederea obtinerii unor conversii inalte, apa produsa trebuie indepartata din sistemul
bifazic. Daca nu este indepartata, atunci apare o continua scadere in valoarea care va determina
scaderea intinderii echilibrului favorabil procesului. Nu exista nici o modalitate simpla de
indepartare a apei dar reactoare care permit adaugarea constanta de catalizator proaspat si faza
organica reduce dimensiunea problemei.
Echilibre in sisteme bifazice apa-solvent organic cu doua substraturi. Cazul acizilor si bazelor
Cazul acizilor si bazelor
Folosirea sistemelor bifazice influenteaza de asemenea procesul de ionizare a gruparilor
acide si bazice. Considerand ionizarea unui acid HA, cand numai formele neionizate ale acidului
sunt solubile in faza organica in timp ce speciile ionice sunt solubile numai in faza apoasa:
(V)
H A
w
Ka,w =
HAw (20)
HAw
A
pKa,w = pH + log10
w (21)
Concentratia ionului de hidrogen, asa cum se stie, este caracteristica fazei apoase:
HAt
A
pKa,bifazic = pH + log10 t (22)
Evaluarea balantelor de masa pentru A - si HA conduce la:
[A t ]Vt = [A w ]Vw (23)
[HAt]Vt = [HAw]Vw + [HAorg]Vorg (24)
inlocuind valoarea de pH din ecuatia 22 in ecuatia 23 se obtine:
HAt Aw
pKa,bifazic = pKa,w + log10
A
t w HA (25)
Substituind din ecuatiile 24 si 25 relatia de mai sus se simplifica obtinandu-se:
(VI)
pKb,bifazic = p Kb,w log10(1 + PBaza) (27)
Unele sinzime sunt simple proteine derivatizate. (Enzimele imobilizate covalent nu intra
in aceasta categorie.) Un exemplu este derivatizarea mioglobinei, transportorul de oxigen din
muschi, prin atasarea ionului (Ru(NH3)5)3+ la trei resturi histidinice de pe suprafata proteinei.
Acest proces converteste mioglobina de la transportor de oxigen la o oxidaza, care catalizeaza
oxidarea acidul ascorbic folosind ca oxidant oxigenul molecular. Aceasta sinzima este aproape la
fel de eficace ca si ascorbat oxidazele naturale.
Este imposibil sa se proiecteze protein-sinzime pornind de la zero, adica direct din
aminoacizi liberi, cu oarece probabilitate de succes, intrucat in prezent doar din structura lor
primara nu pot fi prezise conformatiile lor. In plus, asemenea proteine vor avea suplimentar si
neajunsurile enzimelor naturale, fiind sensibile la denaturare, oxidare si hidroliza.
De exemplu polilizina leaga coloranti anionici ca si albumina serica, dar numai 10% sunt
la fel de puternic legati ca in cazul proteinei naturale, in ciuda faptului ca exista multe sarcini si
lanturi laterale incarcate pozitiv.
Acidul poliglutamic insa arata proprietati sinzimice mult mai apropiate de a unei enzime
naturale. Acesta actioneaza ca o esteraza, in mare masura ca si proteazele acide. De exemplu
pentru hidroliza acetatului 4-nitrofenil, prezinta o frumoasa curba pentru relatia pH-activitate cu o
activitate optima la circa pH = 5,3 si cinetica Michaelis-Menten cu o K m de 2mM si vmax de 10-4 la
10-5 s-1.