Sunteți pe pagina 1din 7

c  

  

   

In contrast cu alte metode de microscopie optica bazate pe caracteristici ale


specimenului studiat (de exemplu : lumina de absortie, faza gradientului etc),
microscopia fluorescenta este capabila sa studieze caracteristicile unui singure molecule
bazata pe emisia de lumina fluorescenta. Utilizand aceasta tehnica se pot afla pozitiile
precise ale componentelor intracelulare marcate cu diferite substante fluorecente.
Deasemenea, putem afla coeficientii de difuzie, caracteristicile de transport si
interactiunile cu alte biomolecule, pH-ul, vascozitatea, indicele de refractie, concentratiile
ionice, potentialul de membrana si polaritatea solventului in celulele vii si in tesuturi.

   
  

De obicei cercetarea respectivei proprietăţi are loc în prezenţa unei molecule


numite fluorofor : proteina verde fluorescenta (GFP).
Aceasta proteina este compusa din 238 de aminoacizi.A fost descoperita initial la
meduzele Aequorea Victoria, care daca sunt expuse la o sursa de lumina de culoare
albastra reflecta o culoare verde fulorescenta. Intensitatea acestei lumini de excitatie este
maxima la o lungime de unda de 395nm si minima la 475nm.Punctul maxim de emisie a
luminii fluorescente este la 509nm, avand un palier la 540nm.(figura 1).

Figura 1 : Spectrul de lumina pentru proteina verde fluorescenta

In biologia celulara si moleculara, gena GFP este folosita frecvent ca un


³colorant´.In forme modificate a fost folosita pentru crearea de biosenzori; multe
organisme au fost create pentru a argumenta faptul ca o gena poate fi evidentiata intr-un
organism dat.
Gena GFP poate fi introdusa in organisme si mentinuta in genomul acestora, iar
odata ce aceaste organisme sunt reproduse in conditii de laborator, organismele nou
create vor contine si ele GFP.O alta tehnica folosita este cea de injectare a GFP cu
ajutorul unor vectori virali (niste ³unelte´ cu care cercetatorii furnizeaza materialul
genetic in celule).
Structura chimica a proteinei verde fluoreescenta este cilindrica.(figura 2)
Pana in prezent au fost studiate/create cu succes mai multe tipuri de bacterii
printre care si drojdia de bere, celule fungice si vegetale, precum si celule umane
folosindu-se GFP ca un marker (³colorant´).

Figura 2 : Structura proteinei verde fluorecente.

In anul 2008 Martin Chalfie, Osamu Simomura si Roger Tsien au primit premiul
Nobel, prentru biologie, pentru descoperirea si devzoltarea proteinei verde fluorescente.
  

Disponibilitatea GFP şi derivaţii ei au redefinit bine microscopia de fluorescenta
şi modul în care este folosit în biologie celulară şi alte discipline biologice.


  

 

    



Studiul dinamicii celulare este essential pentru


intelegerea functiei celulei. Microscopia fluorescenta
este una din cele mai utilizate abordari in studiul
localizarii si miscarii moleculeor si componentelor
intracelulare in celula.De obicei componentele celulare
nu au o lumina fluorecenta.Prin urmare sunt introdusi in
celula colranti fluorscenti.

Colorantii fluorescenti sunt preluati direct de


celule.Acestia sunt inclusi si concentrati in
compartimente intracelulare specifice.
Celulele sunt montate pe placa unui microscop de
fluorescenta si studiate.

Imunofluorescenta este o alta tehnica folosita.Aceasta


implica utilizarea de anticorpi la care un colorant
fluorescent a fost atasat.Anticorpii sunt molecule care
recunosc si se leaga selectiv de molecule tinta specifice
in celula.Semnalul fluorescent poate fi amplificat prin
utilizarea unui anticorp primar nespecific si depistat cu
anticorpi secundari specifici.

Marcarea proteinelor
Este posibil sa se modifice celulele astfel inccat sa
creeze propriile molecule fluorescente.Aceste molecule
de proteine sunt marcate cu un colorant.

  



 

 
  

Proba de analizat este supusă unei lumini cu o anumită lungime de undă.Radiaţia


luminoasă este absorbită de către fluoroflor, care mai apoi va emite o altă radiaţie
luminoasă cu o altă lungime de undă (de aici şi o altă culoare a luminii emise, culoare
diferită faţă de cea primită).
Un model simplificat (figura 3) este format din:
- sursă de lumină - de regula o lampă cu xenon sau lampă cu vapori de mercur;
- oglindă dicroică ;
- filtru de excitaţie;
- filtru de emisie.

Figura 3 : Modelul simplificat al unui microscop de fluorescenta

Un microscop folosit în acest scop este cel din figura 4 :


Microscopia de fluorescenţă este utilizată mai ales în biologie, ea fiind etalonul
pentru alte tipuri de microscopie: microscopia cu laser confocal şi TIRF (total internal
reflection fluorescence microscope). Fluroflorul îşi poate pierde capacitatea de a emite
fluorescenţa printr-un fenomen numit photobleaching, fenomen care poate fi redus fie
prin utilizarea unor fluorofloruri mai puternice sau prin reducerea intensităţii luminii.

c    
  

Este o metodă de analiză a microscopiei fluorescente în care lumina de excitaţie


este emisă de deasupra (spre deosebire de microscopia inversă în care ea este emisă de
dedesupt), prin obiectiv apoi spre specimen (proba de analizat).Fluoroflorul prezent în
probă va emite o lumină cu o anumită lungime de undă, captată apoi de detector prin
acelaşi obiectiv prin care s-a emis lumina de excitaţie.Filtrul dintre obiectiv şi detector
separă lumina de excitaţie de fluorescenţă. Cum lumina de excitaţie ajunge aproape în
totalitate la suprafaţa specimenului, numai lumina reflectată şi lumina emisă ajung la
obiectiv, iar acest fapt conferă metodei obţinerea unui semnal îmbunătăţit în comparaţie
cu interferenţele care apar.

!"#           


  

! $  


   
 

ADN-ul este colorat în albastru, o proteina în verde, iar microtubulii roşii.


Fiecare fluoroflor este obtinut printr-o altă tehnică utilizănd combinaţii diferite ale
filtrelor de emisie şi de absorbţie.Imaginile sunt obtinute secvential si suprapuse pentru a
obtine o imagine de ansamblu a celulei.



!$
%     

!& 

'  
    % 





V %  (

) (** + '   *+ ' * ,
  , 

) (** + '   *+ ' *
  , -

) (** %   * 
   , *)- *  *
   *