P. 1
Tehnica PCR

Tehnica PCR

|Views: 1,139|Likes:
Published by Ionita Dragos

More info:

Published by: Ionita Dragos on Feb 04, 2011
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PPTX, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

03/06/2013

pdf

text

original

Tehnica PCR

‡ Reactia de polimerizare in lant PCR (polimerase chain reaction) are la baza o tehnologie in vitro care imita capacitatea naturala de replicare a ADN. . ‡ Tehnica consta in generarea rapida a unor copii multiple a unei secvente nucleotidice tinta (ADN sau ARN) dintr-o gena de interes sau un patogen specific.

O enzima care faciliteaza sinteza lantului complementar de acid nucleic (ADN polimeraza Taq pentru o tinta ADN sau RTth ADN polimeraza pentru o tinta ARN) .ADN sau ARN tinta: extras din proba in cursul etapei de prelucrare .‡ Amplificarea se realizeaza intr-un analizor special. iar amestecul de reactie trebuie sa contina urmatoarele elemente: .

marcand inceputul si sfarsitul regiunii care trebuie sa fie amplificata..Cofactori enzimatici: Mg2+ si/sau Mn2+ . .Primeri (P1 si P2): sunt secvente scurte de20-30 nucleotide. ei servesc ca punct de plecare pentru sinteza lantului complementar cu ajutorul ADN polimerazei.

Deoxinucleotidele (dATP.. dGTP.Amperaza: enzima care promoveaza amplificarea selectiva a tintei si distrugerea produsilor de contaminare din cursul reactiilor de amplificare anterioare . dCTP si dUTP): folosite pentru sinteza noii catene ADN prin atasarea lor la capatul primerilor. .

Denaturarea 2.Reactia PCR se desfasoara in 3 etape: 1. Hibridizarea primerilor 3. Elongatia .

timp de 20-30 de secunde ‡ ADN-ul dublu catenar este desfasurat in doua lanturi complementare. de care se vor lega apoi primerii ‡ La sfarsitul acestei etape in mediul de reactie vor fi prezente doua lanturi ADN monocatenare .DENATURAREA ADN-ULUI ‡ 94-98 ºC.

timp de 2040 de secunde ‡ Primerii sunt in exces in mediul de reactie ‡ Se vor atasa complementar la capetele 3¶ ale celor 2 catene .HIBRIDIZAREA PRIMERILOR ‡ Se scade temperatura la 50-65 ºC.

pe baza regulii complementaritatii .ELONGATIA ‡ Temperatura depinde de ADN-polimeraza (de obicei 72ºC) ‡ ADN-polimeraza: ± Se leaga de lantul hibrid ± ÄCiteste´ secven a lantului ADN-tinta ± Alungeste primerii prin adaugarea de dNTP.

.Exponentiala: la fiecare ciclu se dubleaza cantitatea de amplicon ADN. . . se produce o incetinire a reactiei iar produsii PCR incep sa se degradeze. iar daca faza se prelungeste mult produsii PCR vor suferi o degradare importanta. nu se mai formeaza alti produsi de amplificare.Platou (end-point): reactia este stopata.Lineara: pe masura ce componentele reactiei sunt consumate.Procesul global de amplificare este divizat in 3 faze: .

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->