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EL TRIzol ES UN REACTIVO LISTO PARA UTILIZARSE EN EL AISLAMIENTO DE ARN DE CÉLULAS Y TEJIDOS, ES
UNA SOLUCIÓN MONO-FÁSICA DE FENOL E ISOCIANATO DE GUANIDINA QUE DURANTE LA
HOMOGENIZACIÓN O LISIS DE LA MUESTRA MANTIENE LA INTEGRIDAD DEL RNA, AL MISMO TIEMPO QUE
ALTERA LA ESTABILIDAD DE LAS CÉLULAS Y DISUELVE LOS COMPONENTES CELULARES. HA DEMOSTRADO
ESTABILIDAD HASTA POR 12 MESES A TEMPERATURA AMBIENTE SIN EMBARGO SE RECOMIENDA
ALMACENARLO A TEMPERATURA DE 2-8°C PARA UN OPTIMO RENDIMIENTO

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  LA ADICIÓN DE CLOROFORMO SEGUIDA DE CENTRIFUGACIÓN SEPARA LA MUESTRA EN DOS

FASES, UNA DE ELLAS ACUOSA Y LA OTRA ORGANICA, EL RNA PERMANECE EXCLUSIVAMENTE EN LA FASE
ACUOSA Y PUEDE SER RECUPERADO POR PRECIPITACIÓN CON ALCOHOL ISOPROPÍLICO, UNA VEZ
REMOVIDA LA FASE ACUOSA EL ADN Y LAS PROTEÍNAS EN LA MUESTRA PUEDEN SER RECUPERADAS POR
PRECIPITACIONES SECUENCIALES DE LA MISMA.

 
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TRIzol
CLOROFORMO
ALCOHOL ISOPROPILICO
ETHANOL AL 75% [EN AGUA TRATADA CON DIETIL PIROCARBONATO(DEPC)]
AGUA LIBRE DE RNasas Ó SOLUCIÓN SDS AL 0.5% [ UTILIZAR AGUA TRATADA CON DEPC]


HOMOGENICE LA MUESTRA
HABIENDO AGREGADO 1mL DE
TRIzol A LA MISMA
EN CASO DE TEJIDO EL TAMAÑO DE LA MUESTRA ES DE 50-100MG
EN GENERAL EL VOLUMEN DE LA MUESTRA NO DEBE EXCEDER DEL
10% DEL VOLUMEN DE TRIzol, PUEDE AUXILIARSE DE UN
HOMOGENEIZADOR DE EMBOLO Y TUBO O ALGÚN OTRO APARATO
HOMOGENEIZADOR CON RESULTADOS EQUIVALENTES.

PARA CÉLULAS EN SUSPENSIÓN, HOMOGENICE MEDIANTE PIPETEO

REPETIDAS VECES, UTILICE 1mL DE TRIzol PARA CADA 5-10*10^6
CÉLULAS ANIMALES

PARA CÉLULAS EN MONO-CAPA EL VOLUMEN DEL TRIzol ESTA EN

FUNCIÓN DEL TAMAÑO DEL ÁREA DE CULTIVO Y NO DEL NUMERO
DE CÉLULAS, AGREGUE 1mL PARA DIÁMETROS DE 3.5cm Y
HOMOGENICE MEDIANTE PIPETEO REPETIDAS VECES

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-REPOSE EL HOMOGENIZADO DURANTE 5 MINUTOS Y TEMPERATURA AMBIENTE PARA PERMITIR LA
DISOCIACIÓN COMPLETA DE PROTEÍNAS
-AGREGUE AL HOMOGENIZADO 0.2mL DE CLOROFORMO POR CADA 1mL DE TRIzol UTILIZADO.
-AGITE VIGOROSAMENTE A MANO DURANTE 15 SEGUNDOS Ó UTILICE UN VORTEX
-ENCUBE EL HOMOGENIZADO DURANTE 2-3 MINUTOS Y TEMPERATURA DE 15 A 30 ºC
-CENTRIFUGUE LA MUESTRA A 12 000 RPM DURANTE 15 MINUTOS Y 2-8ºC, DESPUÉS DE CENTRIFUGAR LA
MUESTRA DEBERÁ ESTAR SEPARADA EN DOS FASES, UNA ROJA QUE CORRESPONDE A LA FASE FENOL-
CLOROFORMO Y UNA FASE INCOLORA QUE CORRESPONDE A LA FASE ACUOSA, EL RNA PERMANECE
EXCLUSIVAMENTE EN ESTA ULTIMA FASE
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TRANSFIERA LA FASE ACUOSA A UN NUEVO TUBO, GUARDE LA FASE ORGANICA SI SE DESEA UNA
POSTERIOR EXTRACCIÓN DEL DNA

PRECIPITE EL RNA DE LA FASE ACUOSA UTILIZANDO ALCOHOL ISOPROPILICO, AGREGUE 0.5ML POR CADA
1mL DE TRIzol USADO EN LA FASE DE HOMOGENIZACIÓN

ENCUBE LAS MUESTRAS A TEMPERATURA DE 10-30ºC DURANTE 10 MINUTOS

CENTRIFUGUE LA MUESTRA A 12 000 RPM DURANTE 10 MINUTOS Y 2-8ºC, DESPUÉS DE CENTRIFUGAR LA

MUESTRA, EL RNA PRECIPITADO A MENUDO ES VISIBLE FORMANDO UN BOTÓN AL FONDO DEL TUBO.

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RETIRE EL SOBRENADANTE Y LAVE UNA VEZ EL BOTÓN DE RNA CON 1mL DE ETANOL AL 75% POR CADA
1mL DE TRIzol UTILIZADO EN LA HOMOGENIZACIÓN, LAVE DANDO PEQUEÑOS GOLPECILLOS CON EL DEDO
EN LA PUNTA DEL TUBO

MEZCLE LA MUESTRA MEDIANTE UN VORTEX Y CENTRIFUGE A 7 500 RPM DURANTE 5 MINUTOS Y

TEMPERATURA DE 2 A 8ºC

POR ULTIMO RE-SUSPENDA LA MUESTRA DE RNA EN AGUA LIBRE DE RNASA O SOLUCIÓN AL 0.5% DE SDS