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15. Espectrofotometria
Vamos mostrar o desenvolvimento de uma interface gráfica para aquisição automática das
leituras de um espectrofotômetro.
15.1. Fundamentos
15.1.1. Natureza Eletromagnética da Luz
A ligação entre luz, eletricidade e magnetismo foi sendo concebida ao longo do tempo através de
sucessivas descobertas.
O astrônomo William Herschel, investigando a relação entre luz e calor utilizando um termômetro
e um prisma, descobriu que a temperatura era maior em uma região além da região do vermelho
no espectro de cores da luz visível. Herschel sugeriu que deveria haver "algum tipo de luz" que
não era perceptível ao olho humano.
O termo, radiação eletromagnética, proposto por James Clerk Maxwell, designa as características
elétricas e magnéticas características a todas as formas de enegia ondulatória da qual a luz
visível representa apenas uma pequena fração.
A medida padrão para o comprimento de onda (λ) costuma ser feita em nanômetro (10-9 m) e
definida como a distância entre dois picos (ou vales) sucessivos.
A freqüência (f) corresponde ao número de ciclos (comprimentos de onda) que passam por um
dado ponto por segundo e expressa comumente em Hz ou cps (ciclos por segundo).
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Essas grandezas estão relacionadas entre si e com a velocidade da luz (c) pela seguinte relação:
c=λxf
15.1.3. Cores
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É a absorção seletiva de luz visível que determina a cor exibida pela maior parte das
substâncias. Quando uma amostra de matéria absorve praticamente toda a gama de radiações
visíveis, não transmitindo nem refletindo luz, então ela apresenta-se-nos preta. Se, pelo
contrário, praticamente nada absorve de luz visível, tudo transmitindo ou refletindo da luz
incidente, então trata-se de uma substância incolor (se essencialmente transmite luz recebida)
ou branca (se essencialmente a reflete). Entre estes dois casos extremos situam-se as
substâncias ou materiais corados. A percepção de cor é o resultado da absorção seletiva de
diferentes comprimentos de onda. (Fonte: http://www.angelfire.com/ab/prvs/absor.html
Figura 82. Região espectral transmitida por uma solução aquosa de azul de bromotimol
10-5molar (laranja!) e o respectivo espectro de absorção.(Fonte: Site da Profa. Deborah H.
M. Bastos)
Figura 83. Região espectral transmitida por uma solução de solução etanólica (amarela) de
fluoresceína 10-5 molar e o respectivo espectro de absorção.(Fonte: Site da Profa. Deborah
H. M. Bastos)
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A figura abaixo mostra um feixe de radiação monocromática de Potência P00 incidindo sobre uma
solução, o qual, após os processos internos de absorção sai da solução com uma potência
radiante P.
Transmitância, T = P/P0
T(%) = 100 x T
A = log 10 1/T
Figura 85. Para uma solução com transmitância de 100% a Absorbância é zero ese toda a
luz for absorvida a transmitância é 0 e a absorbância é infinita!
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A = ebc
Atenção
Por que se usa a Absorbância ao invés da Transmitância em análises quantitativas?
Porque, (até um limite de concentração) existe uma relação linear entre a absorbância e a
concentração da substância absorvente. Portanto, mantendo-se o caminho óptico constante,
pode-se determinar a concentração de uma espécie em solução, através da medida de
absorbância.
No entanto a relação não é linear para altas concentrações. Por isso é importante definir a faixa
de concentração adequada para medidas quantitativas, na qual a relação entre absorbância e
concentração é linear.
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Atenção
Por isso uma regra prática em Química Analítica é evitar fazer leituras com
absorbância maior que 1, ou seja, construir a curva de calibração com valores de
absorbância menor que 1.
Rearranjando:
e = A / bc
"e" é a absortividade molar e pode ser definida como a quantidade de luz que é absorvida por
unidade de concentração.
Para se ter uma idéia, a absortividade molar dos íons Cu+2 em solução de sulfato de cobre
(CuSO4) é 20 L mol-1 cm-1 enquanto o β-caroteno, responsável pela cor das cenouras, possui
uma absortividade molar de 100.000 L mol -1 cm-1.
Fiz uma introdução muito sucinta da espectrofotometria de absorção molecular. Agora vamos
fazer um breve resumo da instrumentação usada.
15.2. Instrumentos
15.2.1. Espectrofotômetros de Absorção
Não vamos abordar os equipamentos que operam na região do infravermelho próximo (do inglês,
near infrared - NIR) (800 nm < λ < 3300 nm).
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compartimento de amostra,
As fontes de radiação podem ser lâmpadas de filamento ou LEDs que emitem radiação na região
do espectro que se pretende utilizar.
Características ideais:
longa durabilidade
lâmpadas de deutério (tempo de vida: 1.000 h), para excitação na região do ultravioleta (<
350 nm)
Com respeito às lâmpadas é importante lembrar que com o tempo de uso das lâmpadas
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Atenção
Uma outra questão prática é o fato de que a maioria dos procedimentos analíticos
para águas e efluentes utiliza a região visível do espectro. No entanto é muito comum
a compra de espectrofotômetros UV-Vis, mais caros, e cubetas de quartzo, mas que
serão utilizados apenas para leituras na região do Visível (380-400 < λ < 700-800 nm)!
Elementos dispersivos são aqueles que difratam a luz, como por exemplo prismas e grades de
difração.
A finalidade destes componentes é difratar a luz de modo que diferentes comprimentos de onda
irão incidir sobre a amostra permitindo que se determine sua absorbância para os diferentes
comprimentos de onda.
Uma grade de difração contém uma série de ranhuras, responsáveis pela difração. Quanto maior
o número de ranhuras por milímetro melhor a resolução dos espectros.
Figura 90. Espectro visível da luz de uma lâmpada difratada por um prisma.(Fonte: Site da
Profa. Deborah H. M. Bastos)
Figura 91. Espectro visível da luz de uma lâmpada difratada por uma grade de difração.
(Fonte: Site da Profa. Deborah H. M. Bastos)
15.2.4. Detectores
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15.2.4.1. Fotomultiplicadora
Um tubo fotomultiplicador é formado por um tubo de vidro ou de quartzo sob vácuo, no qual
existe um conjunto de placas metálicas interligadas.
Quando a radiação incide sobre estas placas metálicas elas induzem uma corrente elétrica,
devido ao efeito fotoelétrico proposto por Einstein. Esta "fotocorrente" é amplificada por um
circuito eletrônico e registrado.
Com o uso deste tipo de detector, o sistema óptico deve selecionar cada comprimento de onda,
seqüencialmente, que deve incidir sobre a fotomultiplicadora gerando, segundo uma certa
escala, um sinal de absorbância.
Atenção
É importante lembrar que ao abrir o compartimento de um espectrofotômetro, a
fotomultiplicadora deve ser protegida da luz para que não seja queimada.
O segundo tipo de detector é arranjo de diodos ou detectores do tipo fotodiodo, PDA (photodiode
array).
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15.2.4.3. CCD
Além dos arranjos de diodos existem os detectores CCD (charge-coupled device), os quais
também permitem detecção simultânea de todo o espectro de absorção. Assim como no arranjo
de diodos a luz dispersada pela grade atravessa a amostra e os diferentes comprimentos de
onda atingem os diferentes pixels do detector.
15.2.5. Configuração
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As leituras das amostras serão feitas em relação ao branco, substituindo-o pelas amostras.
Os sinais elétricos gerados pelos detectores são amplificados e "comparados" pelo sistema
eletrônico gerando um espectro de absorbância ou transmitância da amostra "subtraído" do
espectro da referência.
15.2.6. Cubetas
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Figura 98. Existem cubetas com diferentes geometrias para diferentes finalidades.
Para os métodos de análise em fluxo são usadas celas de fluxo nas quais a amostra circula
continuamente através da cela com leitura simultânea da Absorbância ou Transmitância.
Figura 99. Os fabricantes fornecem celas de fluxo com diferentes geometrias e caminho
óptico.(Fonte: www.starna.com)
Figura 100. Exemplo da cela de fluxo Hellma 178.711-OS, com 1 cm de caminho óptico,
30µL de volume, transmitância de 80% na região de 320-2500nm.(Fonte: Helma)
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Com o uso de fibras ópticas é possível manter o compartimento de leitura com a cela de fluxo
separada do conjunto do espectrofotômetro oferecendo maior versatilidade para o sistema de
análise.
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