Sunteți pe pagina 1din 3

1

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
AL INFECTIILOR STAFILOCOCICE
Familia Micrococcaceae cuprinde genurile Staphylococcus, Micrococcus, Stomatococcus
ºi Planococcus.
Genul Staphylococcus conþine mai multe specii microbiene, dintre care de interes
medical sunt S. aureus (specie patogenã), S. epidermidis, specie accidental patogenã,
S. schleiferi, S. lugdunensis, S. haemolyticus, S. saprophyticus, specie cu potenþial patogen
redus etc.
Stafilococii sunt coci gram pozitivi, aerobi ºi facultativ anaerobi, nesporulaþi, rotunzi,
dispuºi în grãmezi, sub formã de ciorchine de strugure.
10.1. Staphylococcus aureus
Semnificaþia clinicã. S. aureus, germen condiþionat patogen, este cauza unor infecþii
de gravitate variabilã, cu diverse localizãri, în funcþie de poarta de intrare:
» cutanate ºi subcutanate: foliculite, furuncule, impetigo, orgelet, hidrosadenite,
panariþii, mastite, carbuncule;
» ale mucoaselor: otite, sinuzite, pneumonii etc.;
» ale þesutului osos ºi articular: osteomielite, artrite septice;
» ale aparatului urinar: cistite, prostatite, pielonefrite, abcese renale;
» ale aparatului cardio-vascular: endocardite, flebite , septicemii;
» ale aparatului digestiv: toxiinfecþii alimentare;
» ale aparatului genital: metrite, anexite;
» ale SNC: meningite, abces cerebral;
» infecþii nosocomiale.
Diagnosticul de laborator al infecþiilor produse de S. aureus este bacteriologic, cel
serologic neavând valoare practicã.
Recoltarea. Produsele patologice sunt variate, în funcþie de localizarea infecþiei:
» în infecþiile cutanate ºi osteomielitã produsul patologic este puroiul, a cãrui
recoltare se efectueazã în raport cu colecþia purulentã. Dintr-o colecþie închisã,
prelevarea puroiului se face de cãtre chirurg, dupã deschiderea colecþiei. Din
colecþiile deschise sau fistulizate recoltarea se face cu un tampon steril;
» în infecþiile purulente ale seroaselor, produsele patologice (lichidul pleural, articular,
cefalo-rahidian) sunt prelevate prin puncþionarea cavitãþilor respective cu o
seringã sterilã ºi introduse apoi în eprubete sterile;
» în infecþiile urinare se practicã urocultura;
» în septicemii se recolteazã sângele;
» în toxiinfecþii alimentare se recolteazã materiile fecale, vãrsãturi, resturi alimentare;
» în angine ºi la purtãtorii sãnãtoºi se recolteazã exudatul nazal ºi faringian.
Recoltarea produselor patologice se face înaintea începerii oricãrui tratament cu
antibiotice.
Examenul direct. Examenul macroscopic evidenþiazã un puroi galben cremos iar
examenul microscopic pe frotiuri colorate Gram, efectuate din puroi, relevã în primul
rând prezenþa leucocitelor, din care majoritatea sunt distruse ºi coci sferici cu diametrul
de 0,5-1 μm, gram pozitivi, dispuºi în grãmezi (ciorchine), în perechi sau izolat, intra
ºi extracelular.
Izolarea se face diferenþiat în funcþie de provenienþa produsului patologic:
» cele provenite din colecþii închise sau cele care nu sunt puternic contaminate
(exudatul faringian, de pildã) sunt însãmânþate direct pe gelozã-sânge de oaie
5%. Produsele puternic contaminate (materii fecale) se cultivã iniþial pe mediul
de îmbogãþire hiperclorurat Chapman lichid. Dupã o incubare de 12-18 ore la
37°C se face trecerea pe mediul de izolare Chapman solid, mediu care prin
conþinutul sãu în manitol ºi indicator de pH diferenþiazã coloniile manitolpozitive
(de culoare galbenã) de cele manito-negative (roz);
2

» sângele pentru hemoculturã se recolteazã conform tehnicii obiºnuite ºi se


însãmânþeazã în 100 ml bulion simplu, la care se adaugã substanþe ce anihileazã
acþiunea antibioticelor, în situaþia în care acestea au fost administrate deja
bolnavului. Din bulion se fac treceri pe gelozã sânge.
Identificarea se face pe baza caracterelor morfotinctoriale, culturale ºi a unor teste
de patogenitate. În scop epidemiologic, diagnosticul se completeazã cu lizotipia.
Caractere morfotinctoriale. Pe frotiurile din culturi se vãd coci gram pozitivi cu aºezare
caracteristicã, în grãmezi.
Caractere culturale. Pe gelozã sânge S. aureus produce colonii caracteristice uºor de
recunoscut. Ele sunt colonii de tip S, mari, cu diametru de 1-3mm, rotunde, bombate,
netede, cu margini regulate, hemolitice ºi pigmentate. Coloniile tinere sunt incolore.
Pigmentarea coloniilor mature se face în prezenþa oxigenului ºi la temperatura camerei.
Cel mai frecvent pigment este cel auriu (80%), apoi alb ºi foarte rar citrin. Pentru
stabilirea apartenenþei la specia S. aureus se fac teste de patogenitate, din care
evidenþierea coagulazei este obligatorie.
Teste de patogenitate in vitro
» hemolizinele se evidenþiazã pe gelozã-sânge. Stafilococul elaboreazã 5 tipuri de
hemolizine, dintre care mai importante sunt hemolizina α, ce produce o zonã
de lizã clarã în jurul coloniilor, ºi hemolizina β, care determinã o zonã de lizã
incompletã, tulbure, net delimitatã ce se clarificã dupã 12 ore la +4°C;
95
» coagulaza: S. aureus secretã douã coagulaze, una legatã, numitã ºi “clumping
factor” ºi coagulaza liberã. Ele se evidenþiazã prin:
› tehnica pe lamã pentru coagulaza legatã - “clumping factor”. Pe o lamã se
pune o picãturã de apã distilatã, un inocul din cultura de stafilococ de pe
gelozã sânge, o picãturã de plasmã ºi se omogenizeazã. Testul este pozitiv
dacã dupã 1-2 minute apare aglutinarea;
› tehnica în tuburi (pentru coagulaza liberã): se recolteazã 9 ml sânge de iepure
pe 1 ml soluþie de oxalat de potasiu 2%. Plasma obþinutã se dilueazã 1/10 cu
ser fiziologic steril, repartizându-se câte 1 ml în tuburi sterile, peste care se
adaugã cîte 3 picãturi dintr-o culturã de 18 ore în bulion sau o ansã din
cultura de pe gelozã-sânge. Tuburile se introduc în termostat la 37°C,
examinându-se din 30 în 30 minute. Testul este pozitiv dacã plasma
coaguleazã în primele 4 ore;
» fibrinolizina: se face un amestec format din 7 pãrþi gelozã ºi o parte plasmã
oxalatatã care se þine 5 minute la 56°C, apoi se toarnã în plãci petri în strat de
4 mm. Pe acest mediu se însãmânþeazã stafilococi pe arii mici ºi se incubeaazã
timp de 24 ore la 37°C. Dacã tulpina elaboreazã fibrinolizinã, în jurul coloniilor
dezvoltate va apare o zonã clarã;
» fermentarea manitolului: pe mediul Chapman solid, stafilococii manito-pozitivi
produc virarea culorii mediului din roz în galben datoritã indicatorului de pH.
Lizotipia este o metodã de testare a sensibilitãþii tulpinilor microbiene la bacteriofagi.
Întrucât între tulpini ºi bacteriofagi existã o specificitate strictã, determinarea
lizotipurilor este de interes epidemiologic, deoarece stã la baza filiaþiei cazurilor.
Sensibilitatea la antibiotice. Începând deja cu anii 1950-60 a fost semnalatã o
creºtere rapidã a rezistenþei tulpinilor S. aureus la antibiotice, efectuarea antibiogramei
devenind obligatorie pentru toate tulpinile de S.aureus izolate din diverse infecþii.
Rezistenþa se instaleazã fie prin producerea beta-lactamazelor, fie prin modificarea
unor proteine ale peretelui celular. Al doilea mecanism duce la scãderea permeabilitãþii
înveliºurilor bacteriene ºi modificarea þintei antibioticului în aºa fel încât acesta sã nu
se mai poatã lega de structurile bacteriene respective. Acest tip de rezistenþã conferã
tulpinilor de stafilococ, mai ales celor din spital (deci cu mare potenþial nosocomial)
rezistenþa la toate beta-lactaminele (peniciline ºi cefalosporine). Depistarea acestor
stafilococi se face prin testarea sensibilitãþii la meticilinã, rezistenþa la acest antibiotic
(MRSA = Methicilin resistent S. aureus) semnificând rezistenþã la toate betalactaminele.
3

Diagnosticul toxiinfecþiilor alimentare. Toxiinfecþiile alimentare date de stafilococ


se produc prin ingerarea unui aliment contaminat cu S. aureus enterotoxic. Diagnosticul
se bazeazã pe izolarea din alimente ºi din produsele patologice (vãrsãturi, fecale) a
acestuia ºi evidenþierea enterotoxinei care are 6 tipuri antigenice A, B, C, C1, D, E.
Însãmânþarea produselor patologice se face pe mediul Chapman solid, iar coloniile
manito-pozitive se repicã pe gelozã. Izolarea stafilococilor din produsele menþionate
nu are valoare decât dacã se evidenþiazã enterotoxina care se tipizeazã. Mai frecvent
întâlnite sunt serotipurile A ºi D.
Enterotoxinele se evidenþiau în trecut in vivo printr-o boalã experimentalã la pisici
tinere, numitã testul Dolman. În principiu, se injecta intraperitoneal la pisici tinere
filtrat de culturã de stafilococ. Dacã în filtrat era prezentã enterotoxina, animalul
prezenta diaree ºi vãrsaturi, semne ce se amendau în câteva ore.
In vitro, enterotoxina se evidenþia pe baza proprietãþii ei de a precipita plasma
oxalatatã. Concomitent cu cercetarea fibrinolizinei se poate observa un inel de precipitare,
independent de haloul clar din jurul culturii care rezultã ca urmare a acþiunii
fibrinolizinei.
Astãzi determinarea enterotoxinelor stafilococice se face prin metoda latex-aglutinãrii
(aglutinare pasivã inversã). Pentru efectuarea testului se utilizeazã seruri cu anticorpi
antitoxici A, B, C, C1, D ºi E adsorbiþi pe particule de latex ce se pun în contact cu
antigenul solubil (enterotoxina) extras dintr-un filtrat de culturã lichidã. Reacþia
pozitivã se manifestã prin apariþia aglutinãrii.
Stafilococii coagulazo-negativi
Semnificaþia clinicã. S. epidermidis, comensal obiºnuit al tegumentelor umane,
devine accidental patogen, fiind implicat în etiologia endocarditelor subacute la
pacienþii cu proteze valvulare cardiace sau în urma altor intervenþii pe cord, când
bacteria poate fi antrenatã de pe tegumente în þesuturile profunde. De asemenea, în
urma unor puncþii lombare poate produce meningite. Este germenele care compromite
cel mai frecvent protezele de sold.
S. schleiferi ºi S. lugdunensis colonizeazã materialele de implant, catetere, tuburi de
dren. Ambele speciile se gãsesc rar ºi în cantitate micã pe tegumentele sãnãtoase.
S. lugdunensis este responsabil de producerea unor infecþii severe: endocardite pe
valvele naturale ºi pe protezele valvulare, septicemii, abcese cerebrale, infecþii profunde
ale þesuturilor, osteite, osteo-artrite cronice, infecþii vasculare protetice, infecþii ale
plãgilor ºi tegumentelor. S. schleiferi apare mai puþin frecvent în mediul spitalicesc ºi
are un rol mai scãzut în infecþiile umane. Germenele a fost izolat în cazuri de empiem
cerebral, infecþii ale plãgilor ºi osteite cu bacteriemie.
S. haemolyticus, al doilea ca frecvenþã dintre speciile coagulazo-negative, poate fi
implicat în endocardite valvulare, septicemii, peritonite, infecþii ale tractului urinar ºi
ale plãgilor.
S. saprophyticus determinã infecþii ale tractului urinar la femei tinere active sexual.
Stafilococii coagulazo-negativi sunt luaþi în considerare numai în cazul în care
sunt izolaþi ca florã predominantã sau în culturã purã din urinã, LCR, lichid sinovial,
hemoculturi (adicã din produse în mod natural sterile). Identificarea acestor stafilococi
se face pe baza unor teste biochimice ºi de patogenitate