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PRUEBAS BIOQUIMICAS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA

(INFORME)

2004
INTRODUCCIÓN

Los microorganismos a diferencia de las plantas no son capaces de crear materia


orgánica a partir de elementos inorgánicos, por eso, han de nutrirse a expensa del medio
en que se encuentren, y de ahí que en el interior de estos ocurran una serie de reacciones
de síntesis y de descomposición de sustancias orgánicas, las cuales reciben el nombre de
metabolismo.

A partir de estas características metabólicas se realizan pruebas obtenidas para la


identificación de microorganismos y productos obtenidos de la relación microorganismo-
medio.

Otro de los aspectos importantes de la realización de estas pruebas, es que a partir de


estas ayudan a dar una respuesta ante la posible contaminación de los alimentos por
medio de microorganismos patógenos. Las técnicas de bioquímica han proporcionado una
herramienta útil para la detección directa de los microorganismos contaminantes.

La identificación bacteriana se puede realizar por medio de una serie de análisis que
necesitan de diferentes cultivos y procedimientos para llegar a identificar las especies
bacterianas que contaminan los alimentos o las aguas.

A continuación, se desarrollan diferentes técnicas para la identificación de algunos


microorganismos y productos obtenidos en la relación ya mencionada, microorganismo-
medio.
OBJETIVOS

OBJETIVO GENERALES

 Realizar y analizar las diferentes técnicas de identificación bacteriana.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

 Caracterizar en cada medio de cultivo el fundamento de la técnica empleada.

 Analizar los respectivos resultados y por medio de estos hacer una previa
interpretación.
1. TEORÍA RELACIONADA

Metabolismo Bacteriano

La capacidad de utilizar y transformar la energía es una de las propiedades


fundamentales de los sistemas vivientes. La energía puede hallarse en muchas formas,
pero aprovechables a los organismos vivos solo muy pocas. La energía mecánica se
libera, por ejemplo, durante movimiento celular, agitación de cilios y flagelos, y las
alteraciones de la forma celular; la energía electromagnética se encuentra en forma de
radiaciones (la luz es la fuente de energía primaria para los organismos sintéticos como
las algas y las plantas), la energía térmica es producida por la agitación molecular y, la
energía química que es la contenida en los enlaces de sustancias y puede ser liberada
de los compuestos orgánicos e inorgánicos a través de ciertas reacciones. Las reacciones
químicas son acompañadas por cambios en el nivel energético. La energía requerida para
que una reacción inicie se llama energía de activación.

Otros aspectos importantes a considerar es la necesidad de la célula de poseer, además


de catalizadores, una reserva de energía, esta servirá para los procesos de síntesis
celular y en la conversión de sustratos a formar actividades. En la célula ocurre dos
importantes y opuestos procesos, y la generación de energía y utilización de ella en los
procesos de síntesis celular, los cuales constituyen el metabolismo, este es la suma de
transformaciones de la materia que ocurre en el interior de las células y que da lugar a la
síntesis de material celular a partir de sustancias nutritivas.

El metabolismo puede dividirse para su mejor estudio en tres aspectos diferentes pero
íntimamente ligados; el catabolismo que es la suma de reacciones exergónicas que
permiten liberar la energía contenida en los nutrientes o sustratos y ser acumuladas en
forma de ATP, u otros compuestos, el metabolismo intermedio que es el conjunto de
reacciones de los productos de hidrólisis del catabolismo y algunos nutrientes son
transformados en ácidos orgánicos, esteres fosfóricos y otros compuestos como
aminoácidos, y el anabolismo que es la parte del metabolismo implicado en la síntesis e
macromoléculas (ácidos nucleicos, proteínas, sustancias de reserva y otros, todos
reacciones endergónicas).

Ensayos Bioquímicos

La identificación de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes


combinaciones de características y diferentes criterios en la evaluación de similitudes.
Los ensayos bioquímicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioquímicas
convencionales, generalmente determinan la actividad de una vía metabólica (conjunto de
reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y
que la bacteria al crecer transforma o no.

Existen diferentes sistemas que facilitan la realización de tales ensayos, porque proponen
el mejor conjunto de pruebas bioquímicas para la identificación de un grupo bacteriano,
porque simplifican la interpretación de un resultado utilizando un valor numérico, porque
proveen los reactivos listos para su uso o porque son totalmente automatizables.

Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado para
demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como presencia o
ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o determinada vía
metabólica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de
inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo
bacteriano.

Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo,
indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente aún para el mismo ensayo si se trata de
diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el
medio de cultivo para estudiar la fermentación de distintos azúcares cuando se sabe que
el microorganismo en estudio es exigente. A la determinación de la especie se puede
llegar según diversos sistemas (manuales de identificación, comerciales, etc.).

a) Los comerciales utilizan modificaciones de las pruebas bioquímicas convencionales,


ya sea sustratos deshidratados, tiras de papel de filtro impregnadas en reactivos o
pequeños compartimentos con medios listos para sembrar. En todos los casos se
emplean códigos numéricos para la interpretación de resultados.

Los sistemas comerciales más comúnmente usados son:

* BBL, ENTEROTUBE II (Becton Dickinson). Es un sistema para usar en la identificación


de Enterobacterias, definida como bastones Gram -, aerobios o anaerobios facultativos,
oxidasa (-). Consiste en un tubo de plástico con 12 medios de cultivo contenidos en
compartimentos individuales que se inoculan simultáneamente en una etapa y permiten la
detección de 15 características bioquímicas.

* OXI/FERM TUBE II, (Becton Dickinson). Es un sistema listo para usar para la
identificación de bastones gram (-), aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (+).
Consiste en un tubo de plástico de 12 medios de cultivo que permite la realización
simultánea de 14 pruebas bioquímicas.

* API 20 E. Es un sistema estandarizado para la identificación de Bacterias Gram -.


Consiste en una plantilla con microtubos conteniendo medios de cultivo deshidratados
que se reconstituyen al agregar una suspensión bacteriana. Permite la realización de 23
pruebas bioquímicas a partir de una única colonia bacteriana.
Otros sistemas:

Quintet 3H de Diagnostics Pasteur para Enterobacterias.


API 10S, versión miniaturizada del API 20 E
API Listeria
API NH (Neisseria - Haemophilus)

Existen también sistemas de identificación comerciales para levaduras:

API 20 C (Para levaduras del género Candida)


Auxacolor de Diagnostics Pasteur
Fongiscreen 4H de Diagnostics Pasteur (Para identificación de levaduras de interés
médico)

b) En la Cátedra se desarrolló un sistema para la identificación de Enterobacterias que


consta de nueve pruebas bioquímicas convencionales (SYS 9E). Este sistema identifica
las 23 especies más frecuentemente aisladas de muestras clínicas. Está integrado por las
siguientes pruebas: producción de H2S en agar triple azúcar hierro (TSI), fenilialanina
deaminasa, producción de indol, descarboxilación de lisina, descarboxilación de ornitina,
crecimiento en citrato, fermentación de arabinosa, fermentación de sorbitol y producción
de acetoína (VP).

En esquema, la realización de una prueba bioquímica implica:

1) Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado sustrato o


inhibidor y luego de la incubación visualizar el crecimiento y la degradación de un
sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador de la
presencia del sustrato, o de algún producto de su degradación.

2) Cultivar el microorganismo en un medio de propagación que contenga el sustrato de


una enzima inducible y luego de la incubación demostrar la actividad enzimática.

En todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 hrs. de incubación) en un medio
en que el microorganismo se desarrolla en forma óptima, a pH, fuerza iónica, atmósfera y
temperatura adecuados. Siempre que se prepara un nuevo lote de medio de cultivo para
una prueba, deben llevarse a cabo los correspondientes controles de calidad, sembrando
en dicho medio una cepa positiva y otra negativa para ese test.

Si bien existe una gran variedad de pruebas bioquímicas empleadas con fines de
identificación, se enumerarán a continuación solo las que se utilizan más frecuentemente,
agrupadas según el tipo de ensayo y se denominan según su nombre corriente.

1) Enzimas vinculadas con la respiración

a) oxidasa
b) catalasa

2) Descomposición de azúcares simples, ácidos orgánicos y otros

2.1) Requerimientos de oxígeno

OF (óxido-fermentación)
Crecimiento en caldo tioglicolato

2.2) Producción de ácido, o ácido y gas

Fermentación de carbohidratos

2.3) Detección de enzimas y vías metabólicas

a) RM-VP (rojo de metilo - Voges Proskauer)


b) Gluconato
c) O.N.P.G. (orto nitro ß-D-galactopiranósico)
d) Esculina
e) Hipurato

3) Fuente única de carbono

a) citrato
b) malonato
c) hipurato para coliformes

4) Utilización de compuestos nitrogenados

4.1) Reducción de nitrato

a) asimilación
b) denitrificación

4.2) Descomposición de carbohidratos aminoácidos y otros

a) indol
b) H2S
c) Fenilalanina
d) Lisina, arginina, ornitina
e) Urea

5) Ensayos combinados

a) TSI (Triple Azúcar Hierro)


b) LIA (Agar Hierro Lisina)
c) Bilis esculina

6) Detección de exoenzimas

a) lecitinasa
b) proteasas, coagulasa
c) amilasas
d) celulasas
e) desoxirribonucleasas
f) acción de microorganismos sobre la sangre (hemolisinas)

7) Misceláneos

a) KCN
b) Bilis
c) producción de pigmentos

8) Test de crecimiento o inhibición

a) Temperatura
b) NaCl
c) Antibióticos
2. FLUJOGRAM AS

2.1 TSI o KIA

Sembrar en medio TSI o KIA

Incubar 37ºC por 24h

Observar resultados

2.2 CITRATO

Sembrar en medio Simmons Citrato

Incubar 37ºC, (24,48,72h)

Observar resultados

2.3 INDOL

Sembrar en medio Caldo peptona tripticasa

Incubar 37ºC, (24,48h)

Agregar reactivo Kovacs

Agitar

Observar resultados

2.4 ROJO DE METILO

Sembrar en medio Caldo RM.VP

Incubar 37ºC, (2-4días)


Agregar indicador rojo de metilo

Observar resultados

2.5 DESCARBOXILASA

Sembrar en medio LIA

Incubar 37ºC, (28-48horas)

Observar resultados

2.6 VOGES PROSKAUER

Sembrar en medio Caldo RM.VP

Incubar 37ºC, (2-4días)

Agregar 0.6ml ∞Naftol al 5%

Agregar 0.2ml ∞KOH al 40%

Agitar

Exponer al aire 15 min

Observar resultados

2.7 MOTILIDAD Y H2S

Sembrar en medio SIM

Incubar 37ºC, (28-48horas)

Agregar reactivo Kovacs

Agitar
Observar resultados

2.8 CAT ALASA

Extraer colonias

Colocar en portaobjetos

Agregar H2O2

Observar resultados

2.9 UREASA

Sembrar en medio urea Christensen

Incubar 37ºC, (1-6días)

Observar resultados

2.10 GELATINAZA

Sembrar en medio gelatina

Utilizar un tubo de control

Incubar 37ºC, (1-5días)

Observar resultados
TABLA DE RESULTADOS

Pruebas Medios de Rango Indicador Color inicial Color final Resultado


bioquímicas cultivos de pH
TS I TSI 7,4 ± Rojo de fenol Rojo oscuro Negro +
0,2

KLIGER Kliger Rojo de fenol Café vino Café vino -

Citrato Simmons 6.9 Azul de Verde Azul(pico de flauta) y +


citrato bromotimol verde(profundidad)
Indol Caldo Kovacs Incoloro Rosado sin anillo -
peptona
tripticasa

Rojo de metilo Caldo RM - 6,9 ± Rojo de metilo Anaranjado Amarillo -


VP 0,1
Descarboxilasa LIA Púrpura de Amarillo Amarillo -
bromocresol
Voges proskauer Caldo RM - Amarillo Rojo (superficie) y +
VP amarillo(fondo)
Motilidad y H2S SIM Tiosullfato de Amarillo Amarillo +
sodio y sulfato coaguloso(superficie) y
ferroso negro(fondo)

Catalasa H2O2 Amarillo Blanco efervescente +


Gelatinaza Gelatina Amarillo Amarillo transparente -
transparente
Ureasa Urea Rojo de fenol Piel de ante fucsia +
Christensen
Nitrato Nitrato Griess-ilosvay transparente Amarillo -
y Kovacs
Baird parker agar Baird parker 6.8± Cloruro de Amarillas Café oscuro (colonias) +
agar 0.2 lítio y telurito (colonias)

Mac Conkey M ac Conkey 7.1 ± Rojo neutro Amarillas Rosado (colonias) +


0.1 (colonias)
Hektoen Enteric Hektoen 7.7± Azul de Amarillas +
Agar Enteric Agar 0,1. bromotimol y (colonias). Negro con verde
fucsina ácida brillante(colonias)
Endo C Endo C 7.4 ± Fucsina- Amarillas Rojo (colonias) +
0.2 sulfito (colonias)
ANÁLISIS DE RESULTADOS

Las pruebas bioquímicas realizadas en el laboratorio arrojaron los siguientes resultados:

En la prueba TSI (hierro tres azucares) el medio está constituido por tres azucares:
lactosa, glucosa y sacarosa, de las cuales la lactosa y la sacarosa se fermentan en medio
aerobio y la glucosa en medio anaerobio. Al inocular el microorganismo (Pseudomona) se
observó una coloración café-amarillo en el pico de flauta lo cual indica la producción de
ácido por la fermentación de los tres azucares y negro en la profundidad que demuestra la
formación de H2S, además se observó un rompimiento del medio lo que indica la
desprendimiento de gas (CO 2 y H2). (ver anexo 1)

Para la prueba Kliger, el medio ya se encontraba de un color café vino y con rompimiento,
al inocular la Pseudomona no mostró cambio alguno. Por lo tanto, no podemos sacar
conclusiones, de ahí que los resultados sean negativos, pues consideramos que el medio
no estaba en condiciones óptimas para realizar esta prueba. (ver anexo 2)

En la prueba citrato, el medio simmons citrato con la Pseudomona se notó un cambio de


color de verde a azul en el pico de flauta y verde en la profundidad, por lo tanto hubo
proliferación de microorganismos, estos utilizaron el citrato presente en el medio como
fuente de carbono para la realización de sus reacciones metabólicas, por lo tanto el
resultado fue positivo. (ver anexo 3)

La prueba de Indol realizada con la E. Coli fue negativa, después de habérsele adicionado
el reactivo de kovacs, no presentó ningún anillo, lo que indica que el microorganismo no
desdobló el triptófano presente en el caldo peptona tripticasa para convertirlo en Indol.(ver
anexo 4)

La prueba rojo de metilo realizada al microorganismo E. Coli se observó un color amarillo,


lo que indica la incapacidad del organismo de producir ácidos a partir de la fermentación
de la glucosa, siendo la prueba negativa.(ver anexo 5)

En la prueba de descarboxilasa realizada con el microorganismo Pseudomona no


presentó cambio de color, se puede considerar como especie LD negativa debido a que
no origina aumento alguno del pH y por lo tanto, no se produce un viraje del indicador a
causa del débil crecimiento condicionado por este motivo.(ver anexo 6)
En la prueba Voges-Proskauer, se observó un anillo rojo en la superficie lo que indica la
presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína y por lo tanto es una prueba
VP positiva.(ver anexo 7)

En la prueba de Motilidad y H2S, con la inoculación de la Pseudomona, presentó un color


amarillo coaguloso en la parte superior, lo que indica motilidad a lo largo de dicho canal, y
un negro en el fondo que se refiere a la formación de H2S.(ver anexo 8)

Para la catalasa, realizada con Pseudomona, la rápida aparición y producción sostenida


de burbujas de gas o efervescencia, indica una prueba positiva, esto quiere decir que hay
presencia de la enzima catalasa.(ver anexo 9)

En la prueba ureasa, el resultado fue positivo. la degradación de la urea produce


amoniaco e hizo variar el color del indicador de piel de ante a fucsia, poniéndose así de
manifiesto la actividad ureasa.(ver anexo 10)

En la prueba gelatinaza, arrojó un resultado negativo debido a que no se licuó e medio


gelatina.(ver anexo 11)

En la prueba del nitrato, la reacción fue negativa lo que indica que no se ha producido
degradación alguna del nitrito o que este se ha reducido hasta nitrógeno o hasta
amoniaco.(ver anexo 12)

En la prueba de baird-parker, las colonias se observaron café oscuro con halos claros, por
lo tanto se considera un prueba positiva.(ver anexo 13)

En la prueba de MacConkey, se produjeron colonias rosas, el aislado fue capaz de


fermentar la Lactosa, por tanto la prueba resultó positiva.(ver anexo 14)

En la prueba de Hektoen Enteric Agar, el resultado dió positivo, se vió una coloración
negra en las colonias, lo que indica que eran H2S positivas.(ver anexo 15)

Para la prueba de Endo C, se observó una coloración rojas en las colonias debido a que
el aldehído libera fucsina a partir de la combinación fucsina-sulfito, el resultado de esta
prueba fue positiva.(ver anexo 16)
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

Fundamento de las pruebas realizadas

 TSI (Triple Sugar Iron)

El agar triple azúcar hierro es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la
capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un
único medio. También permite la detección de la producción de H2S. Es un medio útil para
la identificación de enterobacterias.

El agar se prepara en forma de pico de flauta. Esto determina que existan 2 cámaras de
reacción dentro del mismo tubo. La porción inclinada (pico) expuesta en toda su
superficie al oxígeno es aerobia y la porción inferior (fondo) está protegida del aire y es
relativamente anaerobia. La porción inclinada del tubo que está expuesta al oxígeno
atmosférico tiende a tornarse alcalina (roja por el rojo fenol) por la utilización aerobia de
las peptonas.

En el fondo del tubo, donde no hay oxígeno, la degradación proteica es mínima y se


pueden detectar pequeñas cantidades de ácido por la aparición de un color amarillo
(indicador: rojo fenol). En ausencia de fermentación de carbohidratos, no se formarán
ácidos y por la producción de aminas en el pico, todo el medio quedará rojo. Esto se da
en organismos no fermentadores.

El medio está diseñado de tal forma que la glucosa se encuentra en una proporción 10
veces menor que la lactosa y la sacarosa. Si el TSI es inoculado con una bacteria
fermentadora de glucosa pero no de lactosa ni de sacarosa, la cantidad de ácido
producida por fermentación a partir de la glucosa será baja porque la concentración de
glucosa es baja. Al principio se producirá viraje del indicador al amarillo en tubo, pero al
continuar la incubación, el pico del tubo retornará al rojo por la degradación aerobia de las
peptonas antes descrita.

Si el microorganismo fermenta la lactosa y/o la sacarosa, como las concentraciones de


estos azúcares es 10 veces mayor, se producirá mayor cantidad de ácido que no puede
ser revirado por la producción de aminas en la superficie por metabolismo aerobio. La
producción de H2S a partir de tiosulfato se pone en evidencia por precipitar el Fe +2 del
sulfato ferroso. Como esta reacción se da sólo en medio ácido, un ennegrecimiento del
fondo del tubo se lee como fermentación de algunos de los azúcares del medio. Además
puede observarse la producción de gas, como burbujas en el fondo del tubo.
Microorganismos Crecimiento Columna vertical Sup inclinada For de H2S
Escherichia coli Bueno Amarillo Amarillo -
Citrobacter freundi Bueno Amarillo y negro Amarillo +
Enterobacter cloacae Bueno Amarillo Amarillo -
Shigella flexneri Bueno Amarillo Rojo -
Salmonella thyphimurium Bueno Amarillo-negro Rojo +
Salmonella enteriditis Bueno Amarillo-negro Rojo +
Proteus mirabilis Bueno Amarillo-negro Rojo +
Proteus vulgaris Bueno Amarillo -negro Amarillo +

Interpretación

Pico alcalino/fondo alcalino (Alc/Alc)


No hay fermentación de azúcares. Característica de bacterias no fermentadoras.

Pico alcalino/fondo ácido (Alc/A)


Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas.

Pico alcalino/fondo negro (Alc/A/H 2S +)


Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción de ácido sulfhídrico.

Pico ácido/fondo ácido (A/A)


Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse H2S o no. (A/A/H2S -)

A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas. Ej. A/A/gas+/H2S-.

 AGAR KLIGER

Medio nutritivo de ensayo, para identificación de bacterias intestinales gram negativas.


pH: 7.4±0.1

La degradación de azúcar, con formación de ácido se manifiesta por un cambio de color


del indicador o por un viraje de tojo intenso en caso de alcalinización.

 CITRATO

La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la


identificación de enterobacterias.

La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo


con citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del
medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al
alcalino a pH 7,6.

CRECIMIENTO MICROORGANISMOS
Positivo: medio de cultivo Citratos - positivos:
Azul oscuro Enterobacter, S. parathyphi, S. enteriditis, S.
typhimurium, Arizona.
Klebsiella, Serratia.
Negativo o inhibido Citratos – negativos:
Shigella, Escherichia, S. paratyphi y otros.

Interpretación

El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría, acompañado


o no de un viraje del indicador al azul.

 INDOL

El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano. Las
bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano
con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una
característica importante para la identificación de muchas especies de microorganismos.

La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol


reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio
activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich descriptos más adelante. El medio de cultivo
utilizado debe ser rico en triptófano.

Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al añadir al medio 5 gotas del reactivo de


Kovacs, se producirá un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la prueba será
considerada positiva. Si esto ocurre después de 24 horas, la prueba se considera
completa, pero si es negativo deberá incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba. Por
ello es conveniente hacer siempre la prueba no en el tubo incubado sino en una porción
de unos 2ml que se retira de él asépticamente

Interpretación

El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos
después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva.
 ROJO DE METILO

Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes
géneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de
fermentación que se originan por la fermentación de la glucosa. Se conocen 2 tipos
generales: La fermentación ácido-mixta y la fermentación del 2,3 butanodiol. En la
fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente láctico, acético y succínico,
además de etanol, H2 y CO2. En la vía del butanodiol se forman cantidades menores de
ácido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H 2 y CO2.

El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo),
que se utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido
mixta.

Reacción cromática Microorganismos


De anaranjado a rojo Eschericha coli citrobacter y otros
De anaranjado a amarillo Enterobacter aerogenes
Rojo (positivo) Enterbacter cloacae
Sin reacción (negativo) Enterobacter coli

Interpretación

La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que la


producción de ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo
fermentó la glucosa por la vía de ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el
rojo y el amarillo no es considerado como positivo.

 DESCARBOXILASAS

Medio de cultivo LIA se utiliza para la demostración simultánea de lisina descarboxilasa


de la formación de sulfuro de hidrógeno. Sirve para identificación bioquímica de
enterobacterianceas.

Este medio de cultivo ajustado a pH 6, muestra un color amarillo debido a su contenido en


púrpura de bromocresol, que actúa como indicador de pH. A este pH las enterobacterias,
solo crecen escasamente, las especies LD positivas lo alteran debido a la formación de
cadaverina por descarboxilación de la lisina cerca del punto de la neutralización,
produciéndose condiciones más favorables para el crecimiento. Este efecto conlleva un
viraje de pH, que pasa de amarillo a violeta, las especies con capacidad para reducir el
tiosulfato formando ácido sulfhídrico, causan el ennegrecimiento del medio cultivo violeta,
por la precipitación del sulfuro de hierro que tiene lugar. Las especies LD negativas no
originan aumento alguno del pH y por lo tanto, no se produce un viraje del indicador a
causa del débil crecimiento condicionado por este motivo, las especies H2S positivas
tampoco producen ácido sulfhídrico. Las especies LD negativas no pueden ser
reconocidas como tales.

Colonias Microorganismos
Negras – eventualmente con la zona LD-positivos: Salmonella y Edwardsiella.
limítrofe visible en tono violeta
Violeta LD-positivos y H2S negativos: Escherichia,
Klebsiella, Hafnia.
Amarillo sin alteración de color: crecimiento LD-negativos: Shigella, Citrobacter,
retardado. Enterobacter, Proteus.

 VOGES-PROSKAUER

En la prueba de Voges-Proskauer se determina la vía de fermentación del butanodiol


descripta en la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un
producto intermediario en la producción de butanodiol. En medio alcalino y en presencia
de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol
dando un color rojo-fucsia.

Interpretación

El desarrollo de un color rojo-fucsia luego de 15 minutos indica la presencia de diacetilo,


producto de oxidación de la acetoína y por lo tanto una prueba VP positiva.

 MOTILIDAD Y H2S

Medio de cultivo de ensayo para comprobar la formación del sulfuro, la formación de indol
y motilidad en el marco del diagnóstico de entero bacteriaceas. El medio de cultivo es
ampliamente recomendado para el análisis de alimentos.

La motilidad se pone de manifiesto de turbidez difusa del medio de cultivo alrededor del
canal de la picadura. La motilidad se caracteriza por el crecimiento producido
exclusivamente a lo largo de dicho canal. La formación de H 2S se reconoce por el
ennegrecimiento de la zona de crecimiento, la demostración del indol se demostrará
mediante el reactivo según Kovacs. La formación del indol da lugar a una coloración rojo-
púrpura de la capa del reactivo.
Sirve para determinar si un organismo es móvil o inmóvil. Las bacterias tienen movilidad
por medio de sus flagelos que se encuentran principalmente entre los bacilos aunque
existen algunas formas de cocos móviles.

Entre las enterobacterias, la movilidad nos permite diferenciar el género Klebsiella (-) de
las restantes que suelen ser movilidad (+).

Dentro del género Bacillus, nos permite diferenciar B.anthracis (-) de otras especies
generalmente (+).

MICROORGANISMOS H2S INDOL MOTILIDAD


Escherichia - + +/-
Enterobacter - - +
Klebsiella - - -
Salmonella + - +
Serratia - - +
Shigella - +/- -

 CAT ALASA

La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua.


Químicamente, la catalasa es una hemoproteína de estructura similar a la de la
hemoglobina, excepto que los 4 átomos de hierro de la molécula están en estado oxidado
(Fe+++) en lugar de reducido (Fe++). Excluyendo los estreptococos, la mayoría de las
bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad catalasa.

El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo
oxidativo aeróbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el peróxido de
hidrógeno es letal para las células bacterianas. La catalasa transforma el peróxido de
hidrógeno en agua y oxígeno de acuerdo a la siguiente reacción:

H2O2 H2O + O2 (burbujas de gas)

Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra en la


mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La
principal excepción es Streptococcus.

Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:
Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).
Bacillus (+) de Clostridium (-).
Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de
C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-)

Interpretación

1. Prueba cualitativa: la rápida aparición y producción sostenida de burbujas de gas o


efervescencia, indica una prueba positiva. Dado que algunas bacterias pueden poseer
enzimas distintas de la catalasa, capaces de descomponer el peróxido de hidrógeno, unas
pocas burbujas diminutas, formadas a los 20 a 30 segundos no se consideran una prueba
positiva.
2. Prueba semicuantitativa: las determinaciones cuantitativas de catalasa se llevan a cabo
más comúnmente en la identificación de micobacterias. Se mide la altura que alcanza la
formación de burbujas de gas en el tubo, luego de añadir el peróxido de hidrógeno. Una
columna de burbujas de 50 mm o más, se considera una reacción fuertemente positiva.

 UREASA

Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas


de amoniaco por acción del enzima ureasa. Esta actividad enzimática es característica de
todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este género de otras
enterobacterias que dan negativo o positivo retardado.

Se cultiva el microorganismo en slant en agar urea de Christensen. Este medio se


complementa después del autoclavado con 50ml/l de urea. Ésta será degradada por
aquellos microorganismos capaces de producir el enzima ureasa. Esta degradación
produce amoniaco que hará variar el color del indicador de amarillo a rojo, poniéndose así
de manifiesto la actividad ureasa.

Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el tiempo de


incubación ya que especies de Proteus vuelven alcalino el medio poco después de la
inoculación y sus resultados deben ser leídos en las primeras 2-6 horas, mientras que
Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienen actividad ureasa dentro de las 24-48
horas de incubación.

Colonias Microorganismos
Rojo-fucsia Urea – positivos:
Amarillo Proteus, Klebsiella, Enterobacter,
Citrobacter.
Urea – negativos:
Shigella, Salmonella, Escherichia,
Citrobacter, Enterobacter, Serratia,
Providencia.
 GELATINAZA

Para la determinación del número total de gérmenes y para la investigación, en aguas de


gérmenes que licuan la gelatina. Hay aparición de halos de aclaración alrededor de las
colonias que licuan la gelatina.

Microorganismos Cuotas de recuperación (%)


Escherichia coli 170
Proteus vulgaris 170
Staphilococcus aureus 170
Enterococcus faecalis 170
Bacillus cereus 170

 Caldo Nitrato

Medio de cultivo de ensayo para la demostración de la reducción del nitrato y formación


del indol con los correspondientes reactivos en la identificación bioquímica de
microorganismos. La coloración roja corresponde a la cantidad de nitratos formada. Si la
reacción es fuerte el color pasa de rojo a amarillo.

La reacción negativa indica que no se ha producido degradación alguna del nitrito o que
este se ha reducido hasta nitrógeno o hasta amoniaco.

 Baird parker agar

Para el aislamiento y la diferenciación de estafilococos en materiales y materiales


farmacéuticos.

Este medio de cultivo contiene cloruro de lítio y telurito para la inhibición de la flora
acompañante, en tanto que el piruvato y la glicocola actúan favoreciendo selectivamente
el crecimiento de estafilococos.

Sobre el medio de cultivo, opaco por su contenido en yema de huevo, las colonias de
estafilococos muestran dos características diagnósticas por lipólisis y proteolisis, se
producen halos y anillos característicos y, debido a la reducción del telurito a teluro, se
desarrolla una colonia negra. La reacción con la yema de huevo y la reducción del telurito
se presentan con notable paralelismo con la coagulasa-positividad, y por tanto, pueden
utilizarse como índice de esta última.
Colonias Microorganismos
Negras, lustrosas, convexas, con borde Staphilococcus aureus.
extrecho blanquecino, rodeado por un halo
claro.
Negras, lustrosas, pero de forma irregular. Staphilococcus epidermis.
Crecimiento ocasional: muy pequeñas, Micrococcus.
pardas hasta negras, ausencia de halos de
clarificación.
Pardo-oscuras, mates, presencia a veces Bacillus.
de halos de clarificación.
Blancas sin halos de clarificación. Levaduras.

 MacConkey

Medio selectivo para BGN. Lactosa+indicador

El agar MacConkey II es una medio selectivo y diferencial para la detección de


organismos coliformes y patógenos entéricos.

La fórmula del agar MacConkey II se diseñó especialmente para mejorar su capacidad de


inhibir el “swarming” de Proteus spp y para alcanzar una definitiva diferenciación entre
fermentadores y no fermentadores de la Lactosa.

Este medio es ligeramente selectivo ya que la concentración de sales Biliares, que inhiben
el crecimiento de los microorganismos Gram positivos, es baja en relación con otros
medios similares. Se incluye también cristal violeta para inhibir el crecimiento de las
bacterias Gram positivas, especialmente estafilococos y enterococos.

La diferenciación de organismos entéricos se lleva a cabo con la combinación de Lactosa


con el indicador Rojo neutro. Se producen colonias rosas a rojas si el aislado es capaz de
fermentar la Lactosa y colonias sin color en caso contario.

LECTURA:
colonias lactosa (-): incoloras (= no hay fermentación de la Lactosa).
Salmonella, Shigella, Pseudomonas

colonias lactosa (+): rosa/rojo ladrillo rodeadas de un halo de sales biliares


precipitadas. E. coli (rosa/roja), E. aerogenes (rosa y mucosa)

 Hektoen Enteric Agar


Agar selectivo para la demostración y aislamiento de bacterias intestinales patógenas.

Debido a los dos indicadores, azul de bromotimol y fucsina ácida, las colonias lactosa-
positivas muestran una expresiva diferencia cromática frente a las colonias lactosa-
negativas. Igual ocurre en el caso de colonias que fermentan lentamente la lactosa y más
fácilmente la sacarosa y la salicina, sustancias reaccionantes fácilmente fermentables, lo
que impide hallazgos de patógenos falsamente positivos. La combinación de tiosulfato,
como sustancia reaccionante, y una sal de hierro como indicador, da una coloración negra
a las colonias H2S positivas. Una mezcla de sales biliares inhiben a una gran parte de la
flora acompañante.

Las placas con medio de cultivo son claras y de color azul-verdoso.

 Endo-C Agar

Medio selectivo para la demostración y aislamiento de E. Coli fecal y coliformes.

El sulfito sódico y la fucsina inhiben a las bacterias grampositivas. E. Coli y coliformes


consumen lactosa formando aldehído y ácido. Por otra parte, el aldehído libera fucsina a
partir de la combinación fucsina-sulfito, lo cual da lugar a la coloración roja de las
colonias. En el caso de E. Coli, esta reacción es tan intensa que la fucsina llega a
cristalizar y por este motivo, confiere a dichas colonias un brillo metálico estable, de reflejo
verde (típico de la fucsina cristalizada).

Las placas con medio de cultivo son claras y casi incoloras. Si una placa con medio de
cultivo muestra, tras la solidificación, un tono rojo demasiado intenso, puede eliminarse
dicho exceso de rojo añadiendo algunas gotas de una solución recién preparada al 10%
de sulfito sódico anhidro.

Por la acción del oxigeno atmosférico y debido a la consiguiente oxidación del sulfito, el
medio de cultivo vertido en placas se vuelve paulatinamente rojo y, por lo tanto, inservible.
Incluso conservando en la oscuridad y a la temperatura de nevera, solo es utilizable
durante pocos días.
BIBLIOGRAFIA

http://bilbo.edu.uy/~microbio/identific02.html

 MARTINEZ SILVA, Jorge y coautores. Microbiología General. Ed. Pueblo y


educación. Playa ciudad de la Habana. 1989

 Manual de medios de cultivos Merck.

 MURRAY y otros. Bioquímica de Harper. ED. Manual moderno S.A. México-


Bogota. 1993
CONCLUSIÓN

 Las pruebas bioquímicas convencionales, generalmente determinan la actividad


de una vía metabólica (conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato
que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o
no.

 A partir de las pruebas bioquímicas de identificación bacteriana, mediante


estándares establecidos, podemos conocer que bacteria tenemos en una muestra
problema basándonos en sus reacciones metabólicas las cuales son
características de cada microorganismo.

 Son funciones especificas del metabolismo:

o Obtención de energía para los procesos celulares.


o Conversión de los compuestos nutritivos en precursores de los componentes
celulares.
o Organización de esas macromoléculas en polímeros.
o Formación y degradación de las biomoléculas necesarias para las funciones
especializadas de la célula.