Fraccionamento/Separação

Celular
Células Sanguíneas
Células do Sistema Imune
CD4
T
CD8
Linfócitos B
NK
Macrofagos
Monócitos

Neutrófilos
PMN

Eosinófilos

Basófilos
- Eritrocitos (RBC)
- Células sem núcleo ou outros organelos
- Sobrevivem em circulação ate 120 dias
- Constituídos por hemoglobina (90%) e de forma bicôncava

- Plaquetas (platelets)
- Células homeostáticas para a coagulação sanguínea, responsáveis pela
libertação de substancias vaso constritoras

- Polimorfonucleados = Eosinofilos + basofilos + neutrofilos

- Formam-se na medula óssea
- têm uma vida de 3 a 4 h após a qual se fixam nos tecidos
- São atraídos para tecidos inflamados/infectados por factores
quimiostáticos. Matam envolvendo o agente infeccioso e libertando os
grânulos citoplasmáticos (mieloperoxidase)
- Importância destacada nas reacções alérgicas agudas e crónicas
- Macrofago
- Célula fagocitaria derivada do monocito
- Exerce funções no sistema imunitário inato e adquirido
- Estão presentes nos pulmões, baço, fígado, e nódulos linfáticos onde,
grosso modo, combatem bactérias, vírus, e protozoários intracelulares.

- NK - células natural killer

- Sao linfócitos largos e granulares que não expressam IG ou
receptores T mas são capazes de reconhecer e destruir células
tumorais ou infectadas por vírus.
Linfocitos
-Células especializadas no reconhecimento dos antigénios
- Dividem se em dois tipos:
- Células B – desenvolvem-se na medula óssea e
diferenciam se em células produtoras de anticorpos, imunoglobulinas (IG) -
imunidade humoral
- Células T - diferenciam-se no timo e nas suas funções
incluem apoiar células B na produção de IG e actividade microbicida quer
por contacto celular directo ou pela libertação de citoquinas - imunidade
celular
• CD4 células helper (Th)
• CD8 citotóxicas (Tc)
 Separação de células sanguíneas

• Centrifugação

• Panning
• Separação imunomagnética
• Cromatografia de afinidade

• Citometria de fluxo
• FACS (fluorescence-activated cell sorter)
 Centrifugação
A suspensão de células vai ter partículas com diferentes
- tamanho - carga - densidade
Separação pela aplicação de força centrifuga elevada
(600 mil x g)

Aplicações:
• técnica preparativa para
separar um dado
componente para estudo
• técnica analítica para
determinar propriedades físicas
(pm; densidade, forma) ou
pesquisar a presença de macro
moléculas
 Centrifugação Diferencial
Envolve a separação do material solúvel entre o
material celular insolúvel
A força centrífuga e o tempo de centrifugação são
ajustadas de forma a assegurar que o material insolúvel
fica no pellet e o material solúvel (proteínas) fica no
sobrenadante Ex: sangue/plasma

Centrifugação em Gradiente
Envolve a separação de partículas com base na sua
massa e forma mas numa solução de densidade (de
sacarose) e/ou de concentração (de sais) crescente
A amostra é colocada no cimo do tubo e durante a
centrifugação migram de acordo com a sua velocidade de
sedimentação
 Separação de linfócitos em gradiente
de densidade
Numa centrifugação sedimentam primeiro as partículas mais
densas, que por sua vez impedem as menos densas de
sedimentar

• EX: centrifugação de gradiente de Ficoll-Hypaque

Ficol: polisacarideo
– Agrega eritrócitos tornando-os mais densos
Metrizamida (composto denso contendo iodo)
– Densidade ajustável em função da concentração
Eritrócitos + leucócitos polimorfonucleares (granulócitos) –
mais densos
Células mononucleares (linfócitos + monócitos) – menos
densos - recuperados à superfície

Soro
plaquetas

Células
mononucleares

Ficoll-hypaque

density
 PANNING

• Aderência celular a uma superfície sólida

– Monócitos e macrófagos são naturalmente aderentes

(medula óssea)

– Outras células podem aderir se a superfície estiver

conjugada com anticorpos apropriados
(anti IG- separam B de T)
 Separação Imunomagnética

• forma rápida de separação de grandes

quantidades de linfócitos
• acoplamento de esferas magnéticas a
anticorpos monoclonais que reconhecem
moléculas da superfície das células
• os anticorpos acoplados às esferas
magnéticas, são misturados com as
células a separar. A mistura passa por
uma coluna magnética, que reterá as
células ligadas ao anticorpo
Separação Imunomagnética
 Cromatografia
Princípio:
As moléculas dissolvidas numa solução podem associar-se ou
dissociar-se de uma superfície sólida. Se a solução se
mantiver em fluxo as moléculas podem-se separar de acordo
com as interacções com o suporte

Em coluna
 Cromatografia de afinidade

Baseada na capacidade de uma proteína/componente se

ligar especificamente a outra partícula (anticorpo)

• As colunas contêm esferas ligadas covalentemente a

anticorpos específicos da proteína de interesse –
coluna de imunoafinidade
• As partículas são depois eluídas por ex. por uma
solução concentrada de ligando, pH diferente do de
ligação.
 FACS
Fluorescence-activated cell sorter

• Permite separar subpopulações de

linfócitos com base nas dierentes
proteínas expressas á superfície (B,
TCD4, TCD8)

• Cada tipo celular é marcado com

um anticorpo específico que se
encontra acoplado a um corante
fluorescente.

• O citómetro de fluxo detecta e

conta individualmente as células
que passam através do laser
 Purificação positiva e negativa

• Purificação Positiva (as células são separadas por apresentarem

uma dada característica)
• Purificação Negativa
– Panning
– Imuno-separação magnética
– Centrifugação gradiente densidade
– Formação de rosetas (Linf T/B)
– Citometria de Fluxo
– Citotoxicidade mediada por Anticorpo/complemento (Linf T
CD4/CD8)
– RIA (Radioimmunoassay)
– ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
 Preservação
• Tecidos (sangue, medula ossea, outros tecidos linfoides)
- Criopreservação - 80 ºC (3 meses; perda progressiva das
características)

• Células (culturas celulares, células previamente separadas)

- Crioprotecção - 40 ºC (semanas)
- 80 ºC (anos)

– No caso dos linfócitos ocorrem sempre algumas alterações

ao nível das moléculas de superfície (fenotipagem antes da
utilização)