Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Generalitati:
T%=I/I0 · 100
Spectrul electronic
Principiul aparaturii
4
Receptorul radiatiilor care au strabatutu cuvele este in principiu o
fotocelula cu strat emisiv. Catodul de cesiu al unei asemenea celule
elibereaza electroni atunci cand este iluminat (cuante de nergie E=Hυ) si
permite inchiderea circuitului electric al fotocelulei. Instrumentul de masura
microampermetru indica un curent fotoelectric proportional cu iluminarea.
Spectrometrele moderne UV-VIZ cuprind de obicei drept receptor un
fotomultiplicator care prezinta un efect de amplificare considerabil al
semnalului. Fotomultiplicatorul este bazat pe principiul celulelor
fotoelectrice, amplificarea realizandu-se prin emisia secundara de elctroni
intr-o succesiune de mai multi electrozi legati la potentiale pozitive
crecatoare,prin intermediul unui divizor de tensiune.
Inregistratorul este dispozitivul de inregistrare mecanica pe hartie a
semnalului obtinut la fotomultiplicator,dupa o noua amplificare intr-un
amplifiactor.
6
In scopul verificarii preciziei inregistrarii aparatele spectrale se
7
Spectrul UV-VIZ al solutiei etalon de cromat de potasiu
λnm T% E λnm T% E
220 35.8 0.446 360 14.8 0.830
250 31.9 0.496 370 10.3 0.978
260 23.3 0.633 375 10.2 0.991
275 17.5 0.757 390 20.2 0.695
290 37.3 0.428 400 40.2 0.396
340 48.3 0.316 440 88.2 0.054
Definitii:
8
Auxocrom este grupa saturata posedand atomi cu electroni
neparticipanti care nu absoarbe in UV,dar care atasata unui cromofor
produce un efect batocrom si hipercrom asupra maximului de absortie al
acestuia:grupa OH,OR si NH2.
Deplasarea batocroma sau deplasarea spre rosu este deplasarea unui
maxim spectral spre valori λ mai mari, adica inchiderea culorii.
Deplasare hipsocroma sau deplasare spre albastru este deplasarea unui
maxim spectral spre valori λ mai mici, adica deschiderea culorii.
Efect hipercrom:efect de crestere a intensitiatii de absortie,adica
intensificarea culorii.
Efect hipocrom: efectul de descrestere a intensitatii de absortie adica
slabirea culorii.
Punct isobestic este punctul comun de extinctie egala al tuturor
spectrelor electronice ale unui compus,generate prin modificari de exemplu:
de timp sau de pH; indica o transformare chimica progresiva A-B(de
exemplu trecerea formei acide a unui indicator colorat in forma bazica).
9
componentii aerului dau si ei absorbtii,necesita o tehnica speciala de lucru in
vid.El este insa un domeniu putin interesant pentru chimistul organic.S-a
vazut ca solventii spectrali cei mai utilizati pentru domeniu UV sunt tocmai
compusii care prezinta numai tranzitii -* fiind transparenti peste circa
200nm.
Tranzitiile de tip -* sunt caracteristice moleculelor cu duble
legaturi(C=C;C=O;C=N).Benzile corespunzatoare transportate pentru
analiza spectrala organica,sunt situate la valori aproximative =170-250
nm.Pozitia lor este puternic afectata de conjugarea cu alti cromafori sau cu
auxocromi.
Tranzitiile de tip n-* si n-*sunt caracteristice sistemelor cu
heteroatomi posedand electroni neparticipanti.Benzile corespunzatoare
tranzitiilor n-* apar in spectru de lungimi de unda =180-260 nm.Pozitia
lor este puternic influentata de electronegativitatea atomului cromofor.
Tranzitiile n-* se manifesta in spectru sub forma unor benzi lungi de
unda =270-370nm.Desi sunt caracterizate de regula prin extinctii mici,ele
ofera multe informatii structurale.Pozitia acestor benzi, dependenta in
oricare masura de natura atomilor care sunt legati prin legaturi duble este
influentata in mod puternic si caracteristic de conjugarea cu auxocromi.
10
in care P-probabilitatea de absorbtie,iar a-asa numita “sectiune de captura” a
moleculei .
11
pentru starea fundamentala.Tranzitia “verticala” legata de absorbtia sau
remisia instantanee a unui foton,conduce la ocuparea unor nivele excitate
atat electronic cat si vibrational.Aceasta se traduce printr-o anumita”
structura vibrationala” a spectrului de absortie in care intensitatea maxima
are o banda corespunzatoare unei tranzitii pe nivele vibrationale superioare.
12
Orbitalii si * ai cromatoforilor etilenici individuali se combina in 4
noi orbitali, al caror continut energetic variaza.Diferenta de energie intre
orbitalul superior ocupat si cel vacant inferior este mai mica la sistemul
conjugat decat la sistemul neconjugat.
Rezulta ca lungimea de unda a maximului de absortie va fi mai mare
pentru sistemul conjugat.
Acesta este motivul pentru care de regula toate spectrele UV-VIS sunt
caracterizate prin benzi largi(mult mai largi decat in domeniul IR).
Vibratiile energiei de rotatie sunt de regula foarte mici in raport cu
cele ale energiei electronice.De aceea in spectrele electronice nu se observa
structura “hiperfina” datorita rotatiei.
Conjugarea cromoforilor
13
mai mult polare decat starile fundamentale.Aceste stari excitate polare sunt
mult stabilizate prin interactiuni dipolare cu sovlenti polari;ca
urmare,energia tranzitiei se micsoreaza iar maximul spectral se deplaseaza
batocrom.Marimea deplasarii batocrome este de circa 1-20nm la trecerea de
la solvent hexan la etanol.
Compusii care pot forma legaturi de hidrogen cu solventul prezinta de
asemenea deplasari batocrome pe masura ce solventul devine un mai bun
acceptor al protonului in legaturi de hidrogen.
Explicatia acestei deplasari rezulta de asemenea prin luarea in
consideratie a starilor excitate polare care retin mai putin protonii proprii
facandu-i apti de a da legaturi de hidrogen cu solventi corespunzatori(de ex
p-nitrofenolul in dioxan);stabilizarea starilor excitate prin legaturile cu
solventul conduce la diminuarea energiei necesare tranzitiei.
Benzile corespunzatoare tranzitiilor n-*(de exemlu in compusii
carbonilici) sufera deplasari hipsocrome la cresterea polaritatii
solventului(solvatocromie negativa).Explicatia rezida in ponderea diminuata
a legaturilor de hidrogen in starea excitata,conducand destabilizarea
acesteia,insotita de cresterea energiei de tranzitie si deci de scaderea valorii
max .Marimea deplasarii hipsocrome la cetone este de~15 nm la trecerea de
hexan la apa.
Efecte mult mai puternice ale solventului se observa cand starea
fundamentala si cea excitata au polaritati mult diferite.Exemplu cazul
indigoului care prezinta o solvatocromie,caci in starea fundamentala
contributia structurii de rezonanta nepolara este mai mare decat a celei
polare,in timp ce in starea excitata situatia este inversa.Solventii polari vor
solvata mai puternic starea excitata decat cea fundamentala.Solvatocromia
negativa a unei betaine de N-hidroxifenilpiridiniu,la care starea
14
fundamentala este mai polara decat cea excitata.O crestere a polaritatii
solventului conduce la o deplasarea batocroma in cazul indigoului si la o
deplasare hipsocroma in cazul betaienei.
Et=28 560/maxnm(betaina 2)
Solventul Et30 AN DN *
n-hexan 30,9 0.00 - 0 0 -0,08
CCl4 32,5 8,6 - 0 0 0,29
Benzen 34.5 8.2 0.1 0 0 0.59
15
Eter etilic 34,6 3,9 19,2 0 0.49 0.27
Acetat de etil 38.1 - 17.1 0 0.47 0.55
cloroform 39.1 23.1 - 0 - 0.76
piridina 40.2 14.2 33.1 0 0.66 0.87
nitrobenzen 42 14.8 4.4 - - -
Filtre colorate
Filtrele colorate sunt utilizate fie pentru izolarea unei anumite linii
spectrale in asociatie cu o sursa de lumina adecvata fie pentru separarea unui
domeniu spectral.In anumite situatii,filtrele se asociaza cu lumina unei lampi
cu vapori de mercur avand drept scop obtinerea unei lumini monocromatice.
Filtrele colorate sunt reprezentate de foi de gelatina colorata ce sunt
montate intre doua discuri de sticla incolora.Filtrul colorat se caracterizeaza
printr-o curba de transmisie care exprima dependenta transmisiei de
lungimea de unda.Eficacitatea filtrului mai este data si de dispersia energiei
spectrale a sursei cat si de sensibilitatea spectrala a receptorului.
Caracteristica unui filtru o reprezinta selectivitatea sa care se poate
determina pentru un izvor de lumina cu o temperatura de aproximativ
3000ºC.
Filtrele spectrale “S” au gravate pe ele un numar care reprezinta
domeniul in care filtrul are cea mai mare transparenta.Trebuie subliniat
16
faptul ca filtrele “S” sunt valabile numai in asociatii cu becul cu
incandescenta al fotometrului Pulfrich.Setul de filtre colorate este format din
9 bucati,insa poate sa fie completat si cu alte filtre,acestea prezentand alte
caracteristici spectrale.
Lampi spectrale
Fotometrul Pulfrich prezinta o lampa cu vapori de mercur.Aceasta
lampa in asociere cu anumite filtre permite selectarea unor lungimi de unda
ale liniilor mercurului:435,8nm(filtrul S 43);546,1nm(filtrul S 53);577,0nm
si 579,1 nm (filtrul S 57).
0,36-1
Sticla crown 0,40-1
Sticla flint greu 0,28-1
Cuart uviol 0,185-3,5
Cuart cristalin 0,12-6
Fluorura de litiu(LiF) 0,125-9
Fluorina(CaF2) 0,20-17
Sare gema(NaCl) 0,20-21
Silvina(KCl) 0,21-28
Bromura de potasiu(KBr) 0,50-40
Bromoiodura de taliu
18
La citirile vizuale dispersia este de obicei in jur de ±1%,insa
ochiul uman are un maxim de sensibilitate spectrala la 555nm,care
scade catre domeniile albastru sau rosu ale spectrului.
Obs!!!
Indiferent de perfectionarile care au fost aduse aparatelor cu citire
vizuala,in ultimii ani au cunoscut o dezvoltare mai mare aparatele care
folosesc celule fotoelectrice si care pot fi utilizate,in egala masura,si in
domeniul ultraviolet.
Dc/c=-dI/I*0,434/E
Eextinctia citita
DI/Ieroarea de citire
0,434modulul de transformare al logaritmilor naturali in logaritmi
zecimali
Fotometrul Pulfrich
Acest fotometru prezinta urmatoarele piese principale:
lampa cu becul de incandescenta(sursa de lumina);
dispozitivul pentru cuve;
fotometrul cu filtrele colorate.
19
Fotometrul Pulfrich este dotat cu becuri cu incandescenta de 6V si cu
lampi cu mercur „HQE 40”.
Obs!!!
1.Campul vizual trebuie sa apara ca find doua jumatati separate printr-
o linie verticala de demarcatie foarte neta.
2.Cu ajutorul tamburilor se poate realiza scaderea intensitatii
fasciculelor de lumina.
20
permit inregistrarea directa a transmisiei si a extinctiei probelor in conditii
de precizie mai mare decat in cazul aparatelor cu un singur fascicul.
21
Spectrofotometrul „Spekol” poate sa functioneze fie ca „aparat
principal”,utilizat pentru determinari de extinctii si transmisii in domeniul
365-700nm,fie ca „aparat universal”,care lucreaza cu amplificator
tranzistorizat si cu celule fotoelectrice cu gaze si care poate fi folosit atat
pentru determinari de transmisii si extinctii cat si pentru determinari de
fluorescenta,turbiditate sau de reflexie difuza,in domeniul 365-750nm .
Aparatul foloseste drept detector un fotoelement cu seleniu iar ca surse de
radiatii fie un bec cu incandescenta de 6V,30W,cu stabilizator de tensiune
fie o lampa cu vapori de mercur.Pentru citiri se vor folosi cuve de sticla de
0,1cm-5cm grosime fie eprubete de sticla.
22
surse de radiatii cu tub de descarcare electrica in deuteriu tip D2E si bec cu
incandescenta (325-800nnm) si ca detectori cu fotomultiplicator.
Ultraviolet
1.Lampa cu Cuve cu Fotomultipli Microam 107-165
argon Filtre ferestre cator permetru
de LiF
2.Lampa cu Filtre de Cuve cu Celula Galvano 150-700
xenon interferenta ferestre fotoelectrica metru
de LiF
3.Lampa de Monocroma Cuve de Celula Punte 180-380
hidrogen tor(prisme cuart fotovoltaica potentio
sau retele) metrica
Vizibil
Element
4.Lampa cu Filtre de Cuve de fotoelectric Ochiul
filament de absorbtie sticla cu seleniu. uman 350-800
wolfram Ochiul
23
uman
Element
5.Lumina Filtre de Cuve de fotoelectric Ochiul
alba absorbtie sticla cu seleniu uman 350-800
Ochiul
uman
24
De exemplu,spectrul de absorbtie in U.V. al clorhidratului de
oxitetraciclina in HCl 0,01N prezinta 2 maxime la 268nm si 353nm;
extinctia unei solutii 0,001%,masurata in cuve de 1cm,este la 268nm de
0,37-0,40 si la 353nm de 0,27-0,29.Proba de identificare a produsului
reprezinta,de cele mai multe ori,un test de puritate.
Principiul metodei:
25
paracetamolul(4-hidroxiacetanilida)dizolvat in H2SO4 0,05M prezinta
o absorbanta in U.V. la 243nm si o absorbanta specifica egala cu 645.
Mod de lucru:
mL;
Obs!!!
C=A/A cm
26
lungimi de unda corespunzatoare maximelor de absorbtie ale celor doua
componente.
Reactivi si aparatura:
Alcool etilic;
Spectrofotometru UV-VIS.
Mod de lucru:
Obs!!!
27
absorbantei solutiilor etalon cu concentratia 0,002%(m/v) la 273nm si
229nm.
I.PENICILINE
28
Penicilinele naturale sunt :benzilpenicilina(penicilina G)
fenoximetilpenicilina(penicilina V)
2-pentenil-penicilina(penicilina F sau I)
3-pentenil-penicilina
n-amil-penicilina
p-hidroxibenzil-penicilina
n-heptil-penicilina(penicilina K)
Reactivi necesari:
29
►solutie de hidroxilamina.Se dizolva 6,95g de clorhidrat de hidroxilamina
crist.in 40 mL apa,se aduce pH-ul la 6 cu NaOH N(circa 50 mL) si se
completeaza volumul la 100mL cu apa.
►Acid acetic 50%(v/v).
►Alcool izobutilic.
►Solutie alaun feriamoniacal.Se dizolva 6,98g alaun feriamoniacal in
100mL apa la balon cotat.
►Solutie de referinta.Se cantareste exact 0,05000g penicilina G sare de
potasiu si se dizolva in 100mL apa la balon cotat.
Mod de lucru:
Pentru construirea unei curbe etalon de extinctie se pipeteaza in 5
palnii de separare de 50mL:0,5mL; 1mL; 2mL; 4mL si 6mL solutie de
referinta.Volumele se aduc la 10 mL cu apa.Se adauga in fiecare palnie cate
1mL solutie de hidroxilamina,se agita si se lasa 10min in repaus.Se
aciduleaza fiecare proba cu acid acetic pana la pH=3,5-5,se adauga 1mL
solutie alaun feric si imediat alcool izobutilic ca dupa saturarea fazei apoase
sa mai ramana un exces de cca. 4 mL.Se agita 30 s,se aduc fazele apoase in
alta palnie de separare si se mai extrag de 2 ori cu cate 2mL de alcool
izobutilic.Solutiile alcoolice se reunesc intr-un balon cotat de 10mL ce se
completeaza cu alcool izobutilic pana la semn.Extinctiile se citesc la
500nm,fata de alcoolul izobutilic ca martor.
30
calculeaza cantitatea de penicilina din proba analizata.In cazul lichidelor de
fermentatie acestea trebuie in prealabil,neutralizate.
31
II.CEFALOSPORINE
32
Din studiul spectrului de absorbtie al Cefalotinei,in diferite conditii de
solvent,temperatura si pH,a rezultat ca aceasta are in solutie apoasa,un
spectru bine conturat,cu un maxim la 237nm,un minim la 212nm si o
inflexiune la 260-270nm.Maximul de absorbtie la 237nm se datoreaza
gruparii tienil.
III.AMINOGLICOZIDE
a.Streptomicina
33
Metodele spectrofotometrice in vizibil se adreseaza numai unei
anumite componente a moleculei.Aceste metode sunt destul de sensibile si
nu sunt nici specifice.De obicei,se foloseste metoda de dozare a maltolului
recomandata pentru dozarea urmelor de streptomicina din dihidrostreptomi
cina,combinata cu o metoda de dozare a streptidinei.
Reactivi:
►reactiv Folin-Ciocaltau;
►Hidroxid de sodiu 5N;
►Acid sulfuric 5N;
►Solutie clorura ferica (FeCl3*6H2O)2% in acid clorhidric;
►Solutie carbonat de sodiu 20%l;
►Sulfat de amoniu;
►Solutie de referinta.Se dizolva 0,06250g sulfat de streptomicina in 50 mL
la balon cotat.
Mod de lucru:
Pentru realizarea curbei etalon se pipeteaza in 5 eprubete urmatoarele
cantitati:0,5mL; 1mL; 1,5mL; 2mL; 2,5mL solutie de referinta.Volumele se
aduc la 4mL cu apa.Se pipeteaza in fiecare eprubeta 1mL NaOH 5N si se
incalzesc eprubetele 3min intr-o baie de apa fierbinte.Dupa racire se aduc
solutiile cantitativ,pe rand,cu 2 mL acid sulfuric in aparatul de distilare,se
adauga 1g sulfat de amoniu si se antreneaza maltolul cu vapori de
apa,prinzandu-se 10mL distilat intr-un cilindru gradat.Se adauga 1mL
34
solutie clorura ferica,se agita si apoi se citeste extinctia la 550nm,fata de un
martor pregatit prin amestecarea a 10mL apa cu 1mL solutie clorura
ferica.Cu extinctiile citite se realizeaza curba etalon de extinctie.
Pentru dozarea unei probe se pregateste o solutie care sa contina
aprox.1mg/mL streptomicina baza.Intr-o eprubeta se pipeteaza 2mL din
aceasta solutie,se completeaza volumul la 4mL cu apa si se lucreaza mai
departe exact ca la realizarea curbei etalon.
b.Kanamicina
35
Reactivi necesari:
►Reactiv cu antrona.Se dizolva 0,200g antrona intr-un amestec format din
5mL apa si 100mL acid sulfuric.
►Solutie de referinta.Solutie apoasa de kanamicina cu un continut de 160
U.I./mL.
Mod de lucru:
Pentru realizarea curbei etalon de extinctie se pipeteaza in 6 eprubete
urmatoarele cantitati:0,1mL; 0,2mL; 0,4mL; 0,6mL; 0,8mL; 1mL solutie de
referinta.Aceste volume se aduc la 2mL cu apa.Separat se pipeteaza intr-o
eprubeta 2mL apa(proba martor).Se adauga in fiecare eprubeta cate 4mL
reactiv cu antrona,se incalzesc 20min intr-o baie de apa in fierbere si se
citesc extinctiile probelor,dupa racire,la 575nm fata de martor.Cu extinctiile
citite se construieste curba etalon de extinctie.
Pentru dozarea unei probe de kanamicina,se prepara o solutie apoasa
care sa contina aprox.100 U.I./mL.Se pipeteaza intr-o eprubeta 1mL solutie
si se lucreaza mai departe exact ca la realizarea curbei etalon de extinctie.
IV.CLORAMFENICOL
36
C.H.Lorenz indica metode pentru dozarea spectrofotometrica in U.V. a
cloramfenicolului si pentru dozarea cloramfenicolului in prezenta
sulfamidelor.Literatura recomanda metode in U.V. pentru dozarea
cloramfenicolului in amestec cu hidrocortizon,cu tetraciclina.
Unele farmacopee au adoptat spectrofotometria in U.V. pentru
dozarea cloramfenicolului si a esterilor sai sau pentru controlul puritatii.
In ceea ce priveste metodele spectrofotometrice in vizibil,cea mai
mare parte se bazeaza pe reactiile de culoare ale gruparii amino,dupa
prealabila reducere cu clorura stanoasa,zinc pulbere,clorura de titan.Ca agent
de cuplare se foloseste diclorhidratul de N-(1-naftil)-etilendiamina.
V.TETRACICLINE
37
lichide de fermentatie a fost dozata prin masurarea extinctiilor la 274nm si
370nm,dupa incalzire cu acid sulfuric sau la 262,5nm si 305nm in acid
clorhidric.
Dijkhuis si Griffiths au recomandat spectrofotometria in U.V. si
vizibil pentru dozarea anhidroderivatului si a epimerului
tetraciclinei.Oxitetraciclina se poate doza la 353nm,dupa incalzire cu NaOH
0,4N.
Metodele spectrofotometrice in vizibil se impart in mai multe grupe:
metode bazate pe degradarea in mediu acid;
metode bazate pe degradarea in mediu alcalin;
metode bazate pe formare de chelati;
metode conditionate de prezenta gruparii fenolice;
metode conditionate de grupa cetonica;
metode diverse.
38
39
40