Sunteți pe pagina 1din 40

Spectrometria de adsorbtie electonica( spectrometria in

ultraviolet si vizibil) aplicata in stabilirea structurii compusilor


organici

Generalitati:

Spectrele in ultraviolet (UV) si vizibil (VIS) sunt spectre electronice


ale moleculelor. Ambele tipuri de spectre intre care nu exista nici o diferenta
principala, sunt asociate cu tranzitiile electronice care au loc la trecerea
moleculelor din starea fundamentala intr-o stare excitata electronic. Spectrul
electronic este reprezentarea grafica a variatiei unui parametru legat de
absortia energiei radiante in functie de lungimea de unda sau de frecventa.
Pe abscisa unui spectru electronic se noteaza fie lungimea de unda
λ(exprimata in nm) fie frecventa exprimata ca numar de unda
υ[cm-1]=107λ [nm].
Energiile corespunzatoare tranzitiilor din domeniile UV-VIZ au valori
mult mai mari decat energiile tranzitiilor vibrarorii-rotatorii.Astfel,la 200 nm
energia tranzitiei este de 600 kjouli/moli, la 400 nm este 300kjouli/mol,iar la
800 nm este 150 kjouli/mol.
Pe ordonata unui spectru electronic se reda una din urmatoarele
marimi: transmisia T%(mai rar absortia A%),extinctia E(numita si
absorbanta sau densitate optica),coeficientul molar de extinctie ε(numit si
absorbtivitate molara) sau logaritmul acestuia,definite prin relatiile:

T%=I/I0 · 100

A%=(I0 - I)/ I0 ·100


1
E=lg I0/I

Ε[1000 cm2 · mol-1]=E/l·c

In relatiile de mai sus I0 este intensitatea fluxului luminos


remanent,dupa parcurgerea cuvei cu proba, el este grosimea cuvei in
centometri, iar c este concentratia solutiei analizate,exprimata in moli pe
litru.

Spectrul electronic

Culorile si lungimile de unda corespunzatoare din domeniul vizibil pot


fi reprezentate intr-o diagrama simpla,intuitive. Culorile fundamentale
(cercurile mari) dau prin compunerer doua cate doua,culorile secundare
(cercurile mici) cuprinse in diagrama intre acestea. Culorile opuse sunt
complementare;absorbtia in regiunea unei culori din spectru lasa
necompensata culoarea complementara. O substanta apare astfel colorata
rosu fie cand emite lumina de circa 750nm,fie cand absoarbe lumnia de circa
550nm.Culoarea galbena poatew fi cauzata de absortie fie la limita cu
domeniul ultraviolet(400-450nm),fie la limta cu domeniul infrarosu(750-
800nm).
In reprezentarile grafice ale spectrelor electronice apar diferente mari
de aspect in functie de marimile reprezentate pe abscisa si pe ordonata.
2
Astfel,la spectrele avand reprezentata pe abscisa lungimea de unda λ ,benzile
se distanteaza mult intre ele la valori λ mari,reprezentandu-se pe abscisa
valorile υ ,benzile devin mai echidistante iar ordinea lor se inverseaza.
Reprezentarea pe ordonata a transmisiei T conduce la aparitia benzilor de
absortie in forma unor minime;aceasta orientare este inversata la
reprezentarea pe abscisa a absortiei A. In figurile:e,f,g este prezentat spectrul
aceleeasi substante coordonate:A(T)/υ;E/υ si log E/υ. Se observa ca la
reprezentarea pe ordonata a marimilor A sau T ,benzile intense cres mai
putin prin marirea concentratiei, decat atunci cand pe ordonata se reprezinta
extinctia E sau ε. Reprezentand pe ordonata valorile log E sau log ε spectrele
corespunzand la concentratii diferite au exact acelasi aspect,fiind deplasate
doar pe verticala.

Cel mai util mod de prezentare grafica a spectrelor electronicec este


acela in coordonate ε / λ,se prefera insa prezentarea fotografica a unor
spectre inregistrate direct de aparat in coordonate E/υ.

Principiul aparaturii

Aparatele moderne pentru spectometrie UV-viz sunt spectrometre


automate cu dublu fascicul. Schema bloc este aceeasi cu cea a spectrome-
trelor de IR, fiecare parte componenta fiind adecvata lucrului in domeniul
respectiv. In fugura se prezinta schita de principiu a unui spectrometru UV-
VIZ.
Sursa de radiatii este un bec obisnuit cu filamenet de wolfram pentru
domeniul vizibil si o lampa cu hidrogen sau de uteriu (cu balon din quartz)
3
pentru domeniul UV.Lampa de hidrogen cuprinde doi electrozi metalici,intre
care apare dupa o scurta incalzire prealabila pe cale electrica o descarcare in
atmosfera de hidrogen sau de uteriu la presiune. Aceasta descarcare
furnizeaza o radiatie in domeniul UV(electronii si energii necuantificate isi
reduc energia ajungand la primul nivel excitat al hidrogenului-seria Balmer
din spectrul hidrogenului).
Monocromatorul este costruit fie pe pricipiul dispersiei in
prisme(sticla pentru domeniul VIZ,quartz pentru domeniul UV si VIZ), fie
pe principiul difractiei in retele de difractie. La monocromatoarele cu
dispersie razele trec de regula de doua ori succesiv prin prisma in scopul
imbunatatirii dispersiei.
Acest lucru se realizeaza cu ajutorul unei oglinzi(litrow);prin rotirea ei
cu ajutorul unei came se obtin la fanta de iesire radiatii
monocromatice,avand lungimea de unda variabila monoton,in
timp,permitandu-se deci parcurgerea abscisei spectrului. Prin alegerea
profilului camei care misca oglinda litrow, se poate realiza o variatie liniara
fie a lungimilor de unda fie a frecventelor.
Cuvele sunt confectinate din quartz. Pentru lucrul exclusiv in
domeniul vizibil se pot utiliza cuve din sticla,mai ieftine. Ele au grosimea
stratului de solvent(respectiv solutie)de un centimetru si volumul de cativa
mililitrii. Exista si microcuve cu grisimea de 1mm precum si cuve de gaz
cu volume mai mari. La inregistrarea spectrelor,intr-una din cuve se
introduce solutia probei iar in cealalalta cuva identica cu prima se introduce
solventul curat pentru compensatie.
Realizarea dublului fascicul se face cu ajutorul unei oglinzi
rotative(cu spatii alternante pline si goale) si a mai multor oglinzi plane.

4
Receptorul radiatiilor care au strabatutu cuvele este in principiu o
fotocelula cu strat emisiv. Catodul de cesiu al unei asemenea celule
elibereaza electroni atunci cand este iluminat (cuante de nergie E=Hυ) si
permite inchiderea circuitului electric al fotocelulei. Instrumentul de masura
microampermetru indica un curent fotoelectric proportional cu iluminarea.
Spectrometrele moderne UV-VIZ cuprind de obicei drept receptor un
fotomultiplicator care prezinta un efect de amplificare considerabil al
semnalului. Fotomultiplicatorul este bazat pe principiul celulelor
fotoelectrice, amplificarea realizandu-se prin emisia secundara de elctroni
intr-o succesiune de mai multi electrozi legati la potentiale pozitive
crecatoare,prin intermediul unui divizor de tensiune.
Inregistratorul este dispozitivul de inregistrare mecanica pe hartie a
semnalului obtinut la fotomultiplicator,dupa o noua amplificare intr-un
amplifiactor.

Tehnica de lucru. Solventi spectrali UV-VIZ

De cele mai multe ori spectrele UV-VIZ se inregistreaza pentru probe


aflate in solutie.Intrucat In domeniul UV-VIZ benzile cele mai
importante(din punct de vedere al analizei structurale) au valori ε >104 ,
fiind deci,de circa 100 ori mai intense decat in domeniul IR, probele
spectrale trebuie sa fie extrem de diluate (10-3 -10-4 muli/l ).Cantitatile de
proba de circa 1 mg, cantarite cu precizie la balanta analitica,se dizolva in
100 ml solvent iar din solutia rezultata sunt necesarri doar 2-3 ml pentru o
5
determinare. Concentratiile necesare fiind atat de mici ele pot fi obtinute
usor de la orice substanta organica chiar de la cele foarte putin solubile.
Pentru eliminarea erorilor de cantarire (la cantitati mai mici de 1 mg)
se recomanda cantarirea unor probe mai mari urmata de diluari succesive in
flacoane cotate. Alegerea concentratiei probei trebuie facuta astfel incat
maximele de absortie sa ramana in scala aparatului.Se mentioneaza ca
domeniul de precizie maxima al extinctiilor E este situat intre 0,25-0,75.
Tinand seama de acestea se va lucra in cuve de 1 cm de exemplu cu
concentratii de circa 5·10-5 moli/l. Pentru compusii cu ε =10000 si cu
concentratii de 1 · 10-2 moli/l pentru compusii cu ε=100.
Probele trebuie sa fie extrem de bine purificate intrucat orice
contaminant cu absorbtii proprii intense in domeniul UV-VIZ poate denatura
puternic spectrul.
Solventii spectrali trebuie sa fie transparenti in domeniul de lucru.
Daca in domeniul vizibil se poate lucra practic cu orice solvent incolor, in
UV cei mai uzuali solventi sunt compusi continand numai legaturi σ, de
exemplu hidrocarburi saturate,alcooli .Solventii trebuie sa aiba o puritate
inalta in sensul ca ei nu trebuie sa contina impuritati absorbante in UV-VIZ.
De exemplu alcooli nu trebuie sa contina aldehidele corespunzatoare.
Etanolul nu trebuie sa contina urme de benzen,motiv pentru care se prefera
etanolul de 95% obtinut de regula prin distilari azeotropice cu benzen.

Solventi spectrali pentru domeniul UV- VIZ

6
In scopul verificarii preciziei inregistrarii aparatele spectrale se

Solventul Domeniul de utilizare- valori λ[nm]


mai mari decat:
Apa 191
Metanol 205
Etanol 205
Etanol 95% 205
Pentan, hexan 210
Heptan 195
Ciclopentan 210
Ciclohexan 195
Decalina 200
Eter etilic 215
Tetrahidrofuran 220
Dixan 220
Acetonitil 195
Diclorometan 235
Cloroform 245
Tetraclorura de C 260
N,N- dimetilforamida 270
Dimetilsulfoxid 265
Benzen 280
Toluen 285
Piridina 305
Acetona 330
KBr 200
KCl 200
calibreaza periodic. Pentru verificarea scalei fotometrice (ordonata
spectrului exprimata in T% sau E) se inregistreaza spectrul unei solutii
etalon de KcrO4 in solutie 0,05 M de KOH apos la 25°C in cuva de 1 cm si
se compara valorile T%, E indicate de aparat cu cele etalon.

7
Spectrul UV-VIZ al solutiei etalon de cromat de potasiu

λnm T% E λnm T% E
220 35.8 0.446 360 14.8 0.830
250 31.9 0.496 370 10.3 0.978
260 23.3 0.633 375 10.2 0.991
275 17.5 0.757 390 20.2 0.695
290 37.3 0.428 400 40.2 0.396
340 48.3 0.316 440 88.2 0.054

Calibrarea abscisei spectrelor UV-VIZ se realizeaza prin inregistrarea


spectrelor etalon ale unor filtre de sticla din oxid de holmiu sau al unor
solutii acide de ioni NO3.Oxidul de holmiu are benzi cu maxime de absortie
caracteristice la:279,3;333,8;360,8;418,5;453,4;536,4;637,5 nm.
Acestea se compara cu valorile inregistrate ale abscisei,facandu-se corectiile
respective.Aceeasi proba de oxid de holmiu se utilizeaza si penrru testarea
rezolutiei:440-460 nm apar 3 benzi intense si distincte.

Solventi spectrali pentru domeniul UV- VIZ

Definitii:

Cromofor este sisitemul ce contine electronii (de obicei n sau π)


datorita carora are loc absortia de enrgie radianta in domeniul vizibil si
ultraviolet (exemplu:cromofor carbonilic, etilenic).
Auxocrom este grupa saturata posedand atomi cu electroni
neparticipanti care nu absoarbe in UV,dar care atasata unui cromofor

8
produce un efect batocrom si hipercrom asupra maximului de absortie al
acestuia:grupa OH,OR si NH2.
Deplasarea batocroma sau deplasarea spre rosu este deplasarea unui
maxim spectral spre valori λ mai mari, adica inchiderea culorii.
Deplasare hipsocroma sau deplasare spre albastru este deplasarea unui
maxim spectral spre valori λ mai mici, adica deschiderea culorii.
Efect hipercrom:efect de crestere a intensitiatii de absortie,adica
intensificarea culorii.
Efect hipocrom: efectul de descrestere a intensitatii de absortie adica
slabirea culorii.
Punct isobestic este punctul comun de extinctie egala al tuturor
spectrelor electronice ale unui compus,generate prin modificari de exemplu:
de timp sau de pH; indica o transformare chimica progresiva A-B(de
exemplu trecerea formei acide a unui indicator colorat in forma bazica).

Tranzitiile electronice si corespondenta acestora cu benzile


spectrale UV-VIS

Tipurile de tranzitii electronice ce se produc in iradierea unei


molecule cu iradiatii UV-VIS difera dupa natura orbitalilor implicati.
Tranzitiile σ -σ *
sunt caracterizate prin cele mai mari energii,deci
prin cele mai mici lungimi de unda.Benzile corespunzatoare acestor tranzitii
apar la valori λ <200 nm,in ultravioletul,de vid.Acest domeniu,in care
componentii aerului dau si ei absorbtii,necesita o tehnica speciala de lucru in
vid.El este insa un domeniu putin interesant pentru chimistul organic.S-a

9
vazut ca solventii spectrali cei mai utilizati pentru domeniu UV sunt tocmai
compusii care prezinta numai tranzitii σ -σ * fiind transparenti peste circa
200nm.
Tranzitiile de tip π -π *
sunt caracteristice moleculelor cu duble
legaturi(C=C;C=O;C=N).Benzile corespunzatoare transportate pentru
analiza spectrala organica,sunt situate la valori aproximative λ =170-250
nm.Pozitia lor este puternic afectata de conjugarea cu alti cromafori sau cu
auxocromi.
*
Tranzitiile de tip n-σ si n-π *sunt caracteristice sistemelor cu
heteroatomi posedand electroni neparticipanti.Benzile corespunzatoare
tranzitiilor n-σ * apar in spectru de lungimi de unda λ =180-260 nm.Pozitia
lor este puternic influentata de electronegativitatea atomului cromofor.
Tranzitiile n-π * se manifesta in spectru sub forma unor benzi lungi de
unda λ =270-370nm.Desi sunt caracterizate de regula prin extinctii mici,ele
ofera multe informatii structurale.Pozitia acestor benzi, dependenta in
oricare masura de natura atomilor care sunt legati prin legaturi duble este
influentata in mod puternic si caracteristic de conjugarea cu auxocromi.

Reguli de selectie.Intensitatea benzilor spectrale.Probabilitatea


absortiei cuantelor de frecventa corespunzatoare este corelata cu
coeficientul de extinctie ε prin relatia:
ε max =0,87* 1020*P*a

in care P-probabilitatea de absorbtie,iar a-asa numita “sectiune de captura” a


moleculei .

10
Pentru valorile P~1 absortiile dau nastere unor benzi cu ε max =104-
105;aceste benzi corespund unor tranzitii numite “permise”.Din contra
pentru valori de P<0,01 corespund benzii putin intense,cu ε max= 10-
103.Tranzitiile care genereaza aceste benzi se numesc “interzise” si ele se
produc cu o probabilitate foarte mica.
Natura “permisa” sau “interzisa” a benzilor decurge dintr-o serie de
reguli de selectie,fundamentale mecanic-cuantic.
Astfel sunt interzise tranzitiile in care se schimba multiplicitatea
sistemului(singlet-triplet).Sunt interzise de asemenea tranzitiile intre stari
avand aceeasi simetrie a distributiei electronice.Aceste interdictii nu sunt
insa absolute de exemplui banda de cca 250 nm a benzenului sau banda de
cca 300 nm a cetonelor;desi formal “interzise” de asta data ultima regula de
selectie apar totusi in spectrele corespunzatoare datorita devieriilor de
simetrie aduse de vibratia moleculei sau de substituientii diferiti ai grupei
carbonil(in molecula cetonelor).
O lege importanta a fotochimiei este principiul lui Frank si
Condon.Intre geometria moleculei in stare fundamentala si in cea in stare
excitata pot exista uneori diferente apreciabile.Principiul Franck-Condon
arata ca in timpul in care are loc absorbtia fotonului si excitarea electronului
este atat de scurt(~10-15S),cand molecula excitata apare in primul moment
intr-o geometrie identica cu cea a starii fundamentale.De obicei molecula
excitata apare intr-o stare “dilatata”adica distanta interatomica χ 0
*
(distanta
de echilibru a starii excitate) este mai mare decat distanta de echilibru χ 0

pentru starea fundamentala.Tranzitia “verticala” legata de absorbtia sau


remisia instantanee a unui foton,conduce la ocuparea unor nivele excitate
atat electronic cat si vibrational.Aceasta se traduce printr-o anumita”

11
structura vibrationala” a spectrului de absortie in care intensitatea maxima
are o banda corespunzatoare unei tranzitii pe nivele vibrationale superioare.

Structura fina de vibratie

Energiile starii fundamentale si acelei excitate ale unei molecule nu


reprezinta in realitate nivele unice,intrucat diferitele molecule din proba au
energii vibrationale diferite.In momentul excitatiei eletronice se modifica si
energia de vibratie.Ca urmare,energia tranzitiei va fi usor diferita de la o
molecula la alta.Corespondenta in spectru electronic a acestor numeroase
tranzitii ale diferitelor molecule din proba este o “structura fina de
vibratie”a benzilor electronice.
Aceasta structura fina este vizibila la lucru in faza gazoasa.In solventi
nepolari ,unele molecule nepolare rigide(de exemplu benzenul),prezinta de
asemenea structura fina.
In solventi uzuali(de regula polari),datorita interactiilor solvent-
solvat,tranzitiile individuale pe nivele vibrationale sunt greu de sesizat si in
spectru se observa doar o banda larga(anvelopa) care inglobeaza intreaga
structura fina.
Orbitalii π si π * ai cromatoforilor etilenici individuali se combina in
4 noi orbitali, al caror continut energetic variaza.Diferenta de energie intre

12
orbitalul superior ocupat si cel vacant inferior este mai mica la sistemul
conjugat decat la sistemul neconjugat.
Rezulta ca lungimea de unda a maximului de absortie va fi mai mare
pentru sistemul conjugat.
Acesta este motivul pentru care de regula toate spectrele UV-VIS sunt
caracterizate prin benzi largi(mult mai largi decat in domeniul IR).
Vibratiile energiei de rotatie sunt de regula foarte mici in raport cu
cele ale energiei electronice.De aceea in spectrele electronice nu se observa
structura “hiperfina” datorita rotatiei.

Conjugarea cromoforilor

Prin conjugarea a doi sau mai multi cromofori banda spectrala de


absorbtie caracteristica sufera o deplasare batocroma si hipercroma
Deplasarea batocroma se explica tinand seama de modificarea energiei
orbitalilor implicati in tranzitie.Se considera pentru exemplificare
conjugarea a doi cromofori etilenici ca in butadiena.

Influienta solventului asupra spectrelor electronice

Benzile corespunzatoare tranzitiilor π -π *


sufera deplasari batocrome
la cresterea polaritatii solventului(solvatocromie pozitiva).Acest efect se
explica prin faptul ca cele mai multe tranzitii π -π *
conduc la stari excitate
mai mult polare decat starile fundamentale.Aceste stari excitate polare sunt
mult stabilizate prin interactiuni dipolare cu sovlenti polari;ca

13
urmare,energia tranzitiei se micsoreaza iar maximul spectral se deplaseaza
batocrom.Marimea deplasarii batocrome este de circa 1-20nm la trecerea de
la solvent hexan la etanol.
Compusii care pot forma legaturi de hidrogen cu solventul prezinta de
asemenea deplasari batocrome pe masura ce solventul devine un mai bun
acceptor al protonului in legaturi de hidrogen.
Explicatia acestei deplasari rezulta de asemenea prin luarea in
consideratie a starilor excitate polare care retin mai putin protonii proprii
facandu-i apti de a da legaturi de hidrogen cu solventi corespunzatori(de ex
p-nitrofenolul in dioxan);stabilizarea starilor excitate prin legaturile cu
solventul conduce la diminuarea energiei necesare tranzitiei.
Benzile corespunzatoare tranzitiilor n-π *(de exemlu in compusii
carbonilici) sufera deplasari hipsocrome la cresterea polaritatii
solventului(solvatocromie negativa).Explicatia rezida in ponderea diminuata
a legaturilor de hidrogen in starea excitata,conducand destabilizarea
acesteia,insotita de cresterea energiei de tranzitie si deci de scaderea valorii
λ max .Marimea deplasarii hipsocrome la cetone este de~15 nm la trecerea de
hexan la apa.
Efecte mult mai puternice ale solventului se observa cand starea
fundamentala si cea excitata au polaritati mult diferite.Exemplu cazul
indigoului care prezinta o solvatocromie,caci in starea fundamentala
contributia structurii de rezonanta nepolara este mai mare decat a celei
polare,in timp ce in starea excitata situatia este inversa.Solventii polari vor
solvata mai puternic starea excitata decat cea fundamentala.Solvatocromia
negativa a unei betaine de N-hidroxifenilpiridiniu,la care starea
fundamentala este mai polara decat cea excitata.O crestere a polaritatii

14
solventului conduce la o deplasarea batocroma in cazul indigoului si la o
deplasare hipsocroma in cazul betaienei.

A.Efectul solventilor asupra spectrului electronic al indigoului

Solvent Vapori CCL4 C6H4Me2 EtOH Me2SO Solid(in


KBr)
λ maxnm 540 588 591 610 620 660
Culoarea Rosu Violet Albastru Indigo

B.Efectul solventilor asupra spectrului electronic al betainei2

Solventul MeOH EtOH Me2CH(C Me2CO C6H5OEt


H2)2OH
λ maxnm 515 550 608 677 785
Culoarea rosie violeta albastra Verde galbena
solutiei
Et(kcal/mo 55,5 51,9 47,0 42,2 37,2
l)
Const.diel 32,6 24,3 14,7 20,7 4,2
ectrica
(ε 250)

Pe baza lungimii de unda λ max


nm
a benzii de absorbtie a betainei s-a
propus un parametru Et (kcal/mol) al polaritatii solventilor

nm
Et=28 560/λ max (betaina 2)

Parametrii de polaritate a solventilor

Solventul Et30 AN DN α β π *
n-hexan 30,9 0.00 - 0 0 -0,08
CCl4 32,5 8,6 - 0 0 0,29
Benzen 34.5 8.2 0.1 0 0 0.59
Eter etilic 34,6 3,9 19,2 0 0.49 0.27

15
Acetat de etil 38.1 - 17.1 0 0.47 0.55
cloroform 39.1 23.1 - 0 - 0.76
piridina 40.2 14.2 33.1 0 0.66 0.87
nitrobenzen 42 14.8 4.4 - - -

Aparatura folosita pentru identificari si dozari in domeniul metodelor


fotometrice si spectrofotometrice in ultraviolet si vizibil este reprezentata de
diferite tipuri de spectrofotometre si fotometre.Obtinerea radiatiilor din
anumite domenii spectrale cat si a radiatiilor monocromatice se realizeaza
prin intermediul filtrelor colorate,a lampilor spectrale combinate cu diferite
filtre sau cu ajutorul sistemelor dispersive(retele de difractie,prisme).

Filtre colorate
Filtrele colorate sunt utilizate fie pentru izolarea unei anumite linii
spectrale in asociatie cu o sursa de lumina adecvata fie pentru separarea unui
domeniu spectral.In anumite situatii,filtrele se asociaza cu lumina unei lampi
cu vapori de mercur avand drept scop obtinerea unei lumini monocromatice.
Filtrele colorate sunt reprezentate de foi de gelatina colorata ce sunt
montate intre doua discuri de sticla incolora.Filtrul colorat se caracterizeaza
printr-o curba de transmisie care exprima dependenta transmisiei de
lungimea de unda.Eficacitatea filtrului mai este data si de dispersia energiei
spectrale a sursei cat si de sensibilitatea spectrala a receptorului.
Caracteristica unui filtru o reprezinta selectivitatea sa care se poate
determina pentru un izvor de lumina cu o temperatura de aproximativ
3000ºC.
Filtrele spectrale “S” au gravate pe ele un numar care reprezinta
domeniul in care filtrul are cea mai mare transparenta.Trebuie subliniat
faptul ca filtrele “S” sunt valabile numai in asociatii cu becul cu

16
incandescenta al fotometrului Pulfrich.Setul de filtre colorate este format din
9 bucati,insa poate sa fie completat si cu alte filtre,acestea prezentand alte
caracteristici spectrale.

Lampi spectrale
Fotometrul Pulfrich prezinta o lampa cu vapori de mercur.Aceasta
lampa in asociere cu anumite filtre permite selectarea unor lungimi de unda
ale liniilor mercurului:435,8nm(filtrul S 43);546,1nm(filtrul S 53);577,0nm
si 579,1 nm (filtrul S 57).

Prisme si retele optice


Spectrofotometrele utilizeaza ca sisteme dispersive retele si prisme
care au capacitatea de a sigura o monocromaticitate superioara.
Dispersia luminii reprezinta fenomenul optic pe care se bazeaza
obtinerea unui spectru cu ajutorul unei prisme sau retele.Prin iluminarea
fantei de intrare a sistemului dispersiv cu o sursa de radiatii se obtine un
spectru care este format dintr-o succesiune de imagini monocromatice ale
fantei.Fanta de intrare este o deschidere ingusta,paralela cu muchia prismei
sau cu trasaturile retelei.Calitatea unei prisme depinde de dispersia
unghiulara si de rezolutia cromatica.
Numeroase spectrofotometre folosesc retele ca sistem dispersiv in
locul prismelor.Aceste retele sunt de fapt niste placi de sticla sau cuart pe
care s-au zgariat striatiuni paralele la distante egale in numar de 300-
1000/nm.Dispersia radiatiei se produce la caderea acesteia pe retea.
In cazul prismelor se folosesc materiale diferite pentru perfectionarea
acestora,in functie de modul de lucru in ultravilet,vizibil sau

17
infrarosu.Insa,spre deosebire de prisme,retelele se pot folosi in ultravioletul
indepartat pana in infrarosul indepartat.
Luminozitatea unui spectrofotometru cu prisma este mult mai mare
decat a unui aparat cu retea iar intretinerea unui spectrofotometru este,de
obicei,mai delicata decat in cazul unui aparat cu pris
Domeniul de transparenta al materialelor de confectionare a prismelor

Materialul Domeniul de transparenta

0,36-1
Sticla crown 0,40-1
Sticla flint greu 0,28-1
Cuart uviol 0,185-3,5
Cuart cristalin 0,12-6
Fluorura de litiu(LiF) 0,125-9
Fluorina(CaF2) 0,20-17
Sare gema(NaCl) 0,20-21
Silvina(KCl) 0,21-28
Bromura de potasiu(KBr) 0,50-40
Bromoiodura de taliu

Aparate cu citire vizuala


Ochiul omenesc este sensibil numai in domeniul vizibil(400-760nm)
si nu are facultatea aprecierii directe a raportului dintre diferite intensitati.
Fotometrele si spectrofotometrele cu citire vizuala,functioneaza numai ca
aparate de nul.

18
La citirile vizuale dispersia este de obicei in jur de ±1%,insa
ochiul uman are un maxim de sensibilitate spectrala la 555nm,care
scade catre domeniile albastru sau rosu ale spectrului.

Obs!!!
Indiferent de perfectionarile care au fost aduse aparatelor cu citire
vizuala,in ultimii ani au cunoscut o dezvoltare mai mare aparatele care
folosesc celule fotoelectrice si care pot fi utilizate,in egala masura,si in
domeniul ultraviolet.

Eroarea analitica relativa a metodelor vizuale,care este conditionata de


sensibilitatea ochiului,avand in vedere Legea Lambert-Beer, este data de
urmatoarea expresia dc/c.

Dc/c=-dI/I*0,434/E

Eextinctia citita
DI/Ieroarea de citire
0,434modulul de transformare al logaritmilor naturali in logaritmi
zecimali

Fotometrul Pulfrich
Acest fotometru prezinta urmatoarele piese principale:
lampa cu becul de incandescenta(sursa de lumina);
dispozitivul pentru cuve;

19
fotometrul cu filtrele colorate.
Fotometrul Pulfrich este dotat cu becuri cu incandescenta de 6V si cu
lampi cu mercur „HQE 40”.

Functionarea aparatului este urmatoarea:


a.Cele doua fascicule de lumina,emise de becul cu incandescenta strabat con
densatoarele,discurile de sticla clara sau mata,cele 2 cuve in care se gaseste
solutia de analizat si ajung in fotometru.
b.Fasciculele de lumina trec succesiv prin:diagramele reglabile cu
tambururile,lentilele de focalizare,prismele cu reflectie totala,o biprisma si
un filtru colorat si ajung in ocular.
c.Cu ajutorul lupei se priveste inainte de masurare campul diafragmei care
trebuie sa fie uniform ca si campul vizual privit dupa indepartarea lupei.

Obs!!!
1.Campul vizual trebuie sa apara ca find doua jumatati separate printr-
o linie verticala de demarcatie foarte neta.
2.Cu ajutorul tamburilor se poate realiza scaderea intensitatii
fasciculelor de lumina.

Aparate cu citire fotoelectrica


Aparatele cu citire fotoelectrica prezinta celule fotoelectrice care au
capacitatea de a transforma energia de radiatie in energie electrica.
Exista doua tipuri principale de spectrofotometre de absorbtie si
anume:cu un singur fascicul si cu doua fascicule,acestea folosind una sau
doua celule fotoelectrice (fotoelemente).Insa,aparatele cu doua fascicule
20
permit inregistrarea directa a transmisiei si a extinctiei probelor in conditii
de precizie mai mare decat in cazul aparatelor cu un singur fascicul.

Printre spectrofotometrele si fotometrele cu citire fotoelectrica


utilizate in laboratoarele in care se realizeaza analiza medicamentelor se
numara:
1.Pentru domeniul vizibil:
celula fotoelectrica Elpho adaptabila la fotometrul Pulfrich pentru citiri de
extinctii sau transmisii prin metoda compensatiei sau substitutiei
spectrofotometrul „Spekol”care este un spectrofotometru neinregistrator
cu monocromator cu retea
2.Pentru domeniul ultraviolet si vizibil:
a.aparate neinregistratoare:
spectrofotometrul CΦ4 cu prisma de cuart ce functioneaza cu un singur
fascicul prin metoda compensatiei in domeniul 220-1000nm.
spectrofotometrul VSU-2 cu prisma de cuart sau sticla;acesta functioneaza
cu un singur fascicul prin metoda compensatiei in domeniul 210-1000nm.
spectrofotometrul CΦD-2 cu retele de difractie;functioneaza cu un singur
fascicul prin metoda compensatiei in domeniul 220-1000nm.
b.aparate inregistratoare:
spectrofotometrul „Spekord”cu prisma de cuart;functioneaza cu dublu
fascicul in domeniul 185-800nm.
spectrofotometrul „Unicam SP 1800 B”cu retele de difractie;functioneaza
cu fascicul dublu in domeniul 190-850nmsi este prevazut cu inregistrator,
dispozitiv automat pentru schimbarea cuvelor si alegerea domeniului
spectral.

21
Spectrofotometrul „Spekol” poate sa functioneze fie ca „aparat
principal”,utilizat pentru determinari de extinctii si transmisii in domeniul
365-700nm,fie ca „aparat universal”,care lucreaza cu amplificator
tranzistorizat si cu celule fotoelectrice cu gaze si care poate fi folosit atat
pentru determinari de transmisii si extinctii cat si pentru determinari de
fluorescenta,turbiditate sau de reflexie difuza,in domeniul 365-750nm.
Aparatul foloseste drept detector un fotoelement cu seleniu iar ca surse de
radiatii fie un bec cu incandescenta de 6V,30W,cu stabilizator de tensiune
fie o lampa cu vapori de mercur.Pentru citiri se vor folosi cuve de sticla de
0,1cm-5cm grosime fie eprubete de sticla.

Spectrofotometrul cu prisma de cuart CΦ4 se foloseste la


determinari de extinctii si transmisii in domeniul 220-1100nm.Acesta este
prevazut cu surse de radiatii cu tub de descarcare electrica in hidrogen(220-
350nm) si cu detectori cu celula fotoelectrica cu stibiu si cesiu(220-650nm)
si cu celula fotoelectrica cu oxid de cesiu(600-1100nm).

Spectrofotometrul VSU2-P cu prisma este utilizat pentru determianri


de extinctii si transmisii in domeniul 200-1000nm.Acest spectrofotometru poate
sa utilizeze prisma de sticla in domeniul 200-1000nm.El este prevazut cu surse de
radiatii cu:tub de descarcare electrica in deuteriu(200-380nm) si bec de
incandescenta9320-1000nm) si ca detectori cu:celula fotoelectrica tip
MQVS(200-680nm) si celula fotoelectrica tip MV(630-1000nm).Pentru
etalonare se utilizeaza lampa cu vapori de mercur HQE 40 F.

Spectrofotometrul inregistrator,cu dublu fascicul,SPEKORD UV


VIS,cu prisma de cuart este utilizat pentru determinari de extinctii si

22
transmisii in domeniul 185-800nm.Acest spectrofotometru este prevazut ca
surse de radiatii cu tub de descarcare electrica in deuteriu tip D2E si bec cu
incandescenta (325-800nnm) si ca detectori cu fotomultiplicator.

Spectrofotometrul inregistrator,cu dublu fascicul UNICAM SP


1800,cu retea de difractie,este utilizat la determinari de extinctii si transmisii
in domeniul 190-850nm.Spectrofotometrul prezinta ca surse de radiatii un
tub de descarcare electrica in deuteriu si bec cu incandescenta cu filament de
tungsten.Aparatul prezinta un schimbator automat de cuve,selector de
lungimi de unda,programator.

Caracteristici ale aparaturii utilizate in U.V. si vizibil

Sistemul Locul de Calcul Domeniu


de izolare plasare al Detector automatic spectral
a benzii probei si utilizabil(n
Sursa
spectrale prezentare m)

Ultraviolet
1.Lampa cu Cuve cu Fotomultipli Microam 107-165
argon Filtre ferestre cator permetru
de LiF
2.Lampa cu Filtre de Cuve cu Celula Galvano 150-700
xenon interferenta ferestre fotoelectrica metru
de LiF
3.Lampa de Monocroma Cuve de Celula Punte 180-380
hidrogen tor(prisme cuart fotovoltaica potentio
sau retele) metrica

Vizibil
Element
4.Lampa cu Filtre de Cuve de fotoelectric Ochiul

23
filament de absorbtie sticla
cu seleniu. uman 350-800
wolfram Ochiul
uman
Element
5.Lumina Filtre de Cuve de fotoelectric Ochiul
alba absorbtie sticla cu seleniu uman 350-800
Ochiul
uman

Spectrometria de absorbtie in ultraviolet este o metoda de


investigatie des folosita in controlul medicamentelor cu aplicatii la:

cunoasterea constitutiei moleculare a unor substante,bazata pe


recunoasterea unor grupari cromofore sau a unor grupari care modifica
benziile de absorbtie atribuite altor cromofori;

identificarea si controlul puritatii unor substante;

dozarea unor substante din amestecuri sau ca atare;

studiul echilibrelor in solutie,formarea combinatiilor complexe,ordinul


unei reactii,gradul de polimerizare,interactiuni posibile.

1.Spectrul U.V.-criteriu de identitate si puritate

Absorbtia luminii in U.V. reprezinta o caracteristica a produsului pur.


Pentru identificarea substantelor medicamentoase pure fie se indica cu
precizie lungimile de unda la care se inregistreaza maximele si minimele de
absorbtie cu precizarea valorilor extinctiilor,a coeficientilor de extinctie
molara fie se recomanda compararea spectrului U.V. al substantei de

24
determinat cu cel obtinut in aceleasi conditii experimentale pentru aceeasi
substanta in stare pura.

De exemplu,spectrul de absorbtie in U.V. al clorhidratului de


oxitetraciclina in HCl 0,01N prezinta 2 maxime la 268nm si 353nm;
extinctia unei solutii 0,001%,masurata in cuve de 1cm,este la 268nm de
0,37-0,40 si la 353nm de 0,27-0,29.Proba de identificare a produsului
reprezinta,de cele mai multe ori,un test de puritate.

2.Determinari cantitative in U.V.

Spectrofotometria in U.V. poate fi folosita la determinarea


cantitativa fie a componentelor unui amestec,cu sau fara separarea lor
prealabila,fie ca atare.

Dozarea barbituricelor(barbital sodic,butalbital sodic si fenobarbital


sodic)care sunt prezente alaturi de excipienti in drajeuri,cu maxime situate in
U.V. la aproape aceeasi λ 240nm,se poate realiza numai dupa separarea
lor pe placa cromatografica.

Dozarea codeinei din siropuri se realizeaza dupa diluarea siropului


cu alcool 60° si trecerea unei cantitati determinate peste o coloana
cromatografica cu schimbatori de ioni.De pe coloana,codeina retinuta prin
schimb ionic se elueaza cu metanol amoniacal(10% NH3).Extinctia se
citeste la 287nm in cuve de 1cm fata de solvent.

Dozarea spectrofotometrica in U.V. a paracetamolului

25
Principiul metodei:

paracetamolul(4-hidroxiacetanilida)dizolvat in H2SO4 0,05M prezinta


o absorbanta in U.V. la 243nm si o absorbanta specifica egala cu 645.

Mod de lucru:

0,1000g paracetamol se aduc cu H2SO4 0,05M intr-un balon cotat de


100

mL;

1mL din solutia obtinuta se dilueaza cu H2SO4 0,05M la 100mL;

solutiei formate i se determina absorbanta la 243nm fata de H2SO4


0,05M

ca martor,in cuva de 1cm.

Obs!!!

Cunoscand valoarea absorbantei specifice se calculeaza concentratia


in paracetamol utilizand urmatoarea formula:

C=A/A cm

A=absorbanta probei analizate

Determinarea spectrofotometrica a cafeinei si a acidului


acetilsalicilic

26
Cafeina si acidul acetilsalicilic se pot doza din amestec,chiar daca
spectrele lor se suprapun partial.Se masoara absorbanta probei la doua
lungimi de unda corespunzatoare maximelor de absorbtie ale celor doua
componente.

Spectrul unui amestec de doi componenti(x+y) este echivalent cu rezultatul


insumarii spectrelor caracteristice x si y.

Reactivi si aparatura:

Solutie etalon 0,002%(m/v) de cafeina in alcool etilic;

Solutie etalon 0,002%(m/v) acid acetilsalicilic in alcool etilic;

Alcool etilic;

Spectrofotometru UV-VIS.

Mod de lucru:

Proba de analizat care contine acid acetil salicilic si cafeina se aduce


cu alcool etilic la flacon cotat de 100mL.In functie de continutul probei in
cafeina si acid acetilsalicilic se realizeaza dilutiile corespunzatoare astfel
incat absorbanta sa fie cuprinsa intre 0,1-0,8 pentru ca aceasta sa poata fi
usor citita.Se masoara absorbanta solutiei de lucru la 273 si 229nm,in cuva
de 1cm,folosind ca martor alcool etilic.

Obs!!!

27
Absorbantele specifice pentru cafeina si acidul acetilsalicilic la cele
doua lungimi de unda sunt determinate experimental prin masurarea
absorbantei solutiilor etalon cu concentratia 0,002%(m/v) la 273nm si
229nm.

Metode spectrofotometrice de absorbtie in U.V. si invizibil aplicate


antibioticelor

Antibioticele sunt compusi cu structuri chimice foarte diferite,a caror


denumire se datoreaza specificitatii si eficacitatii pe care o prezinta fata de
numeroase microorganisme.Metodele de obtinere si puritatea relativa a
preparatelor au facut,ca initial, sa se aplice pentru dozare in special metode
microbiologice.Pe masura ce acesti compusi se obtineau cu o puritate mai
avansata,s-a ajuns sa se prefere tot mai multe metode fizico-
chimice,respectiv spectrofotometrice.

Pentru dozarea spectrofotometrica a antibioticelor din lichidele de


fermentatie este necesara,de multe ori,o separare prin metode extractive,la
diferite pH-uri sau prin metode cromatografice.Metodele spectrofotometrice
in U.V. care se adreseaza intregii molecule sunt,de obicei, mai specifice
decat cele in vizibil.

I.PENICILINE

28
Penicilinele sunt acizi monobazici formati dintr-un sistem tiazolidin-
β-lactamic condensat.
Penicilinele naturale sunt :benzilpenicilina(penicilina G)
fenoximetilpenicilina(penicilina V)
2-pentenil-penicilina(penicilina F sau I)
3-pentenil-penicilina
n-amil-penicilina
p-hidroxibenzil-penicilina
n-heptil-penicilina(penicilina K)

Benzilpenicilina si fenoximetilpenicilina prezinta spectre de absorbtie


caracteristice in U.V. care pot fi folosite drept criteriu de puritate.Penicilina
G prezinta in solutie apoasa are maxime de absorbtie la 250nm si 260nm iar
penicilina V prezinta in solutie apoasa maxime de absorbtie la 268nm si
274nm si un minim la 272nm.
Untermann recomanda o metoda spectrofotometrica selectiva in U.V.
pentru dozarea penicilinei V din lichidele de fermentatie.Procainpenicilina
se poate determina in U.V. la 290nm sau la 322nm.Penicilina G se poate
determina in U.V. la 262nm in metanol sau la 322nm dupa prealabila
degradare.
Metodele spectrofotometrice in vizibil desi sunt rapide si simple,nu
prezinta o selectivitate suficienta,reactia de culoare angajand doar o anumita
grupare a moleculei ceea ce face ca produsii de descompunere sa interfereze.

29
Dozarea penicilinelor ca acid hidroxamic

Reactivi necesari:
►solutie de hidroxilamina.Se dizolva 6,95g de clorhidrat de hidroxilamina
crist.in 40 mL apa,se aduce pH-ul la 6 cu NaOH N(circa 50 mL) si se
completeaza volumul la 100mL cu apa.
►Acid acetic 50%(v/v).
►Alcool izobutilic.
►Solutie alaun feriamoniacal.Se dizolva 6,98g alaun feriamoniacal in
100mL apa la balon cotat.
►Solutie de referinta.Se cantareste exact 0,05000g penicilina G sare de
potasiu si se dizolva in 100mL apa la balon cotat.

Mod de lucru:
Pentru construirea unei curbe etalon de extinctie se pipeteaza in 5
palnii de separare de 50mL:0,5mL; 1mL; 2mL; 4mL si 6mL solutie de
referinta.Volumele se aduc la 10 mL cu apa.Se adauga in fiecare palnie cate
1mL solutie de hidroxilamina,se agita si se lasa 10min in repaus.Se
aciduleaza fiecare proba cu acid acetic pana la pH=3,5-5,se adauga 1mL
solutie alaun feric si imediat alcool izobutilic ca dupa saturarea fazei apoase
sa mai ramana un exces de cca. 4 mL.Se agita 30 s,se aduc fazele apoase in
alta palnie de separare si se mai extrag de 2 ori cu cate 2mL de alcool
izobutilic.Solutiile alcoolice se reunesc intr-un balon cotat de 10mL ce se
completeaza cu alcool izobutilic pana la semn.Extinctiile se citesc la
500nm,fata de alcoolul izobutilic ca martor.

30
Pentru dozare se aduc intr-o palnie de separare cca.10mL solutie,care
sa contina aprox.2mg penicilina.Se lucreaza mai departe in modul cum s-a
aratat la construirea curbei etalon de extinctie.Din extinctia citita se
calculeaza cantitatea de penicilina din proba analizata.In cazul lichidelor de
fermentatie acestea trebuie in prealabil,neutralizate.

Pentru dozarea penicilinelor de semisinteza se pot folosi metodele


generale care se adreseaza grupului comun tuturor penicilinelor sau metoda
spectrofotometrica in U.V.Ultima metoda recomandata de Herriot,Stock si
Holbrook este specifica,sensibila si expeditiva si se bazeaza pe faptul ca
molecula penicilinei,incalzita in anumite conditii de pH,de temperatura si de
timp formeaza un produs de degradare stabil,cu maximum de absorbtie la
322nm.Produsul format este acidul penicilenic si prezenta urmelor de cupru
este necesara pentru a obtine rezultate reproductibile.
Aiteanu a studiat comportarea in U.V. a penicilinelor semisintetice in
diferiti solventi,stabilind conditiile de lucru care au fost adoptate si de
F.R.VIII.

Conditii pentru dozarea spectrofotometrica a penicilinelor semisintetice

Denumirea Solventul Concentratia Λ(nm) Extinctie


specifica
Ampicilina Tampon fosfat 50mg/100mL 268 5,50
PH=7
Meticilina Apa 10mg/100mL 280 57,50
Tampon fosfat
Oxacilina PH=5,4(30 min la 100mg/100mL 340 2,50
70°)
Tampon fosfat
Colxacilina PH=4,6(30 min la 100mg/100mL 340 4,95

31
70º

II.CEFALOSPORINE

Cefalosporinele si penicilinele au in comun nucleul β -


lactamic.Nucleul tipic cefalosporinelor este acidul 7-amino-cefalosporinic
care este la fel de putin activ ca si acidul 6-aminopenicilanic.

Principalul antibiotic extras din culturile de Cephalosporium


acremorium este cefalosporina C.Molecula cefalosporinei C este formata
dintr-un nucleu cu structura β -lactamdihidrotiazinica si doua catene
laterale.
Cefalotina este sarea de sodiu a acidului 7-(tiofen-2-acetamido)-
cefalosporinic.Farmacopeea Statelor Unite ed.XVIII(1970) prevede
determinarea absorbtiei solutiei 0,0025% intre 220 si 310nm,comparativ cu
o substanta de referinta.
Cefaloridina este betaina acidului 7-[(2-tienil)-acetamido]-3-(-piridil-
metil)-3-cefam-4-carboxilic.Farmacopeea Engleza 1968 prevede
determinatrea absorbtiei solutiei 0,002% la 240nm,cu o absorbtie cuprinsa
intre 0,72 si 0,79.
Cefalexina este acidul 7-(D-α -amino-α -fenilacetamido)-3-metil-3-
cefem-4-carboxilic.Firmele producatoare prevad determinarea continutului
in substanta activa din capsule,dupa extractie in acid clorhidric si diluare cu
solutie tampon acetat pH=4,5 la 262nm fata de solutia tampon.Extinctia
specifica la 262nm este 232.

32
Datorita sistemului ciclic condensat si gruparii cromofore O=C−N−
C=C−,a fost utilizat,pentru unele cefalosporine,in special,la identificare,
spectrul de absorbtie in U.V.
Din studiul spectrului de absorbtie al Cefalotinei,in diferite conditii de
solvent,temperatura si pH,a rezultat ca aceasta are in solutie apoasa,un
spectru bine conturat,cu un maxim la 237nm,un minim la 212nm si o
inflexiune la 260-270nm.Maximul de absorbtie la 237nm se datoreaza
gruparii tienil.

III.AMINOGLICOZIDE

a.Streptomicina

Streptomicina a fost izolata pentru prima data in anul 1944.Pentru


obtinerea streptomicinei se utilizeaza tulpini de Streptomyces
griseus,Actinomyces globisporus streptomycini.
Streptomicina poate fi dozata in U.V. la 322nm prin masurarea
absorbtiei maltolului care se formeaza cantitativ la hidroliza alcalina.
Dihidrostreptomicina poate fi dozata in prezenta streptomicinei folosind
diferenta absorbtiilor la 265nm si 280nm dupa prealabila hidroliza acida.

In cazul metodelor spectrofotometrice in vizibil se folosesc reactiile


de culoare pe care le dau componentele moleculei.Pentru streptidina se
folosesc reactiile de culoare caracteristice gruparii guanidice:cu α -naftol si

33
hipobromit sau hipoclorit alcalin ;cu α -naftol si diacetil inainte sau dupa
prealabila separare prin cromatografie pe hartie ;cu nitroprusiat de sodiu sau
de amoniu.

Metodele spectrofotometrice in vizibil se adreseaza numai unei


anumite componente a moleculei.Aceste metode sunt destul de sensibile si
nu sunt nici specifice.De obicei,se foloseste metoda de dozare a maltolului
recomandata pentru dozarea urmelor de streptomicina din dihidrostreptomi
cina,combinata cu o metoda de dozare a streptidinei.

Dozarea streptomicinei prin metoda maltolului

Reactivi:
►reactiv Folin-Ciocaltau;
►Hidroxid de sodiu 5N;
►Acid sulfuric 5N;
►Solutie clorura ferica (FeCl3*6H2O)2% in acid clorhidric;
►Solutie carbonat de sodiu 20%l;
►Sulfat de amoniu;
►Solutie de referinta.Se dizolva 0,06250g sulfat de streptomicina in 50 mL
la balon cotat.

Mod de lucru:
Pentru realizarea curbei etalon se pipeteaza in 5 eprubete urmatoarele
cantitati:0,5mL; 1mL; 1,5mL; 2mL; 2,5mL solutie de referinta.Volumele se
aduc la 4mL cu apa.Se pipeteaza in fiecare eprubeta 1mL NaOH 5N si se
incalzesc eprubetele 3min intr-o baie de apa fierbinte.Dupa racire se aduc

34
solutiile cantitativ,pe rand,cu 2 mL acid sulfuric in aparatul de distilare,se
adauga 1g sulfat de amoniu si se antreneaza maltolul cu vapori de
apa,prinzandu-se 10mL distilat intr-un cilindru gradat.Se adauga 1mL
solutie clorura ferica,se agita si apoi se citeste extinctia la 550nm,fata de un
martor pregatit prin amestecarea a 10mL apa cu 1mL solutie clorura
ferica.Cu extinctiile citite se realizeaza curba etalon de extinctie.
Pentru dozarea unei probe se pregateste o solutie care sa contina
aprox.1mg/mL streptomicina baza.Intr-o eprubeta se pipeteaza 2mL din
aceasta solutie,se completeaza volumul la 4mL cu apa si se lucreaza mai
departe exact ca la realizarea curbei etalon.

b.Kanamicina

Kanamicina este produsa de o tulpina a speciei Streptomyces


kanamyceticus.Acest antibiotic este activ in infectiile produse de coci
grampozitivi si gramnegativi.
Kanamicina este constituita din 2 amino-zaharuri ce sunt legate
glicozidic de un derivat al 1,3-diaminociclohexanului,denumit 2-
dezoxistrep tamina.
Este solubila in apa;datorita insusirilor sale bazice formeaza saruri iar
dintre acestea sulfatul fiind cel mai des folosit.
Kanamicina poate fi dozata spectrofotometric in U.V. la 277nm,
masurand absorbtia furfurolului care se formeaza prin hidroliza acida a
produsului.Kanamicina se poate doza si spectrofotometric in vizibil,folosind
reactia de culoare cu antrona,caracteristica hidratilor de carbon sau cu 1,2-
naftochinon-4-sulfonatul de sodiu.

35
Dozarea kanamicinei cu antrona

Reactivi necesari:
►Reactiv cu antrona.Se dizolva 0,200g antrona intr-un amestec format din
5mL apa si 100mL acid sulfuric.
►Solutie de referinta.Solutie apoasa de kanamicina cu un continut de 160
U.I./mL.

Mod de lucru:
Pentru realizarea curbei etalon de extinctie se pipeteaza in 6 eprubete
urmatoarele cantitati:0,1mL; 0,2mL; 0,4mL; 0,6mL; 0,8mL; 1mL solutie de
referinta.Aceste volume se aduc la 2mL cu apa.Separat se pipeteaza intr-o
eprubeta 2mL apa(proba martor).Se adauga in fiecare eprubeta cate 4mL
reactiv cu antrona,se incalzesc 20min intr-o baie de apa in fierbere si se
citesc extinctiile probelor,dupa racire,la 575nm fata de martor.Cu extinctiile
citite se construieste curba etalon de extinctie.
Pentru dozarea unei probe de kanamicina,se prepara o solutie apoasa
care sa contina aprox.100 U.I./mL.Se pipeteaza intr-o eprubeta 1mL solutie
si se lucreaza mai departe exact ca la realizarea curbei etalon de extinctie.

IV.CLORAMFENICOL

Cloramfenicolul a fost izolat in anul 1947 din lichidele de fermentatie


provenite de la Streptomyces venezuelae.Este activ fata de bacilii
gramnegativi,coci grampozitivi si gramnegativi,ricketsii.

36
Cloramfenicolul si esterii sai prezinta spectre de absorbtie
caracteristice in U.V.Sferuzza indica o metoda spectrofotometrica in U.V. de
dozare a cloramfenicolului in prezenta esterilor sai dupa separare prin
C.H.Lorenz indica metode pentru dozarea spectrofotometrica in U.V. a
cloramfenicolului si pentru dozarea cloramfenicolului in prezenta
sulfamidelor.Literatura recomanda metode in U.V. pentru dozarea
cloramfenicolului in amestec cu hidrocortizon,cu tetraciclina.
Unele farmacopee au adoptat spectrofotometria in U.V. pentru
dozarea cloramfenicolului si a esterilor sai sau pentru controlul puritatii.
In ceea ce priveste metodele spectrofotometrice in vizibil,cea mai
mare parte se bazeaza pe reactiile de culoare ale gruparii amino,dupa
prealabila reducere cu clorura stanoasa,zinc pulbere,clorura de titan.Ca agent
de cuplare se foloseste diclorhidratul de N-(1-naftil)-etilendiamina.

Dozarea cloramfenicolului din supozitoare:dupa dizolvarea excipientului


gras cu eter de petrol sau benzen saturat cu cloramfenicol,reziduul insolubil
in acesti solventi,constituit din cloramfenicol,se dizolva in alcool etilic si se
spectrofotometreaza dupa diluare la λ =278nm in cuve de 1cm fata de
solvent
(extinctia specifica=298).

V.TETRACICLINE

Tetraciclinele sunt antibiotice cu spectru bacterian.Aureomicina sau


clortetraciclina a fost primul antibiotic din grupa tetraciclinelor izolat in anul
1945 de catre Duggar dintr-o tulpina de Streptomyces aureofaciens.

37
Tetraciclinele prezinta spectre caracteristice in U.V. Literatura de
specialitate recomanda numeroase metode spectrofotometrice in U.V. pentru
dozarea tetraciclinelor singure sau asociate intre ele cu alti compusi din
medicamente,lichide de fermentatie,furaje,alimente etc.Clortetraciclina din
lichide de fermentatie a fost dozata prin masurarea extinctiilor la 274nm si
370nm,dupa incalzire cu acid sulfuric sau la 262,5nm si 305nm in acid
clorhidric.
Dijkhuis si Griffiths au recomandat spectrofotometria in U.V. si
vizibil pentru dozarea anhidroderivatului si a epimerului
tetraciclinei.Oxitetraciclina se poate doza la 353nm,dupa incalzire cu NaOH
0,4N.
Metodele spectrofotometrice in vizibil se impart in mai multe grupe:
metode bazate pe degradarea in mediu acid;
metode bazate pe degradarea in mediu alcalin;
metode bazate pe formare de chelati;
metode conditionate de prezenta gruparii fenolice;
metode conditionate de grupa cetonica;
metode diverse.

38
39
40