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MICROBIOLOGIA
AULA PRÁTICA : 01
1- Equipamentos e materiais utilizados na prática microbiológica
Equipamentos
Materiais
Vidraria
* É obrigatório o uso de avental, sendo que este nunca deve ser intercambiado com os
colegas depois de ser usado. Este avental somente deverá ser usado no interior do
laboratório e em corredores de áreas técnicas comuns, devendo ser retirado quando sair do
ambiente.
* Deixar em local apropriado casacos, bolsas, livros e outros pertences ( colocá-los em
local indicado pelo professor).
* Não colocar objetos de uso pessoal sobre as bancadas.
* Lavar as mãos ao entrar e antes de sair do laboratório ( lavagem higiênica) com
sabão líquidos e após friccionar com álcool 70%. Secar ao ar.
* Não fumar, comer ou ingerir líquidos dentro do laboratório.
* Não tocar nos olhos, boca ou nariz com as mãos.
* Não umidecer etiquetas com a língua.
* Não fazer uso de lenços ou avental para limpar objetos ou instrumentos de trabalho.
* Manter nas proximidades do local de trabalho um desinfetante (álcool 70%).
* Cuidado ao acender o bico de gás. Verifique se não existe substância inflamável por
perto.
* Utilizar somente calçados fechados e de solado que dê aderência ao solo. Não é
permitido o uso de sandálias dentro da área laboratorial.
* Não utilizar jóias e bijuterias que dificultem o trabalho e favoreçam a ocorrência de
acidentes e contaminação.
* Usar luvas quando as atividades a serem desenvolvidas exigirem contato com fluidos
corpóreos.
* Usar máscara sempre que manipular substâncias químicas com alto teor de
evaporação , e em área de alta contaminação com produtos biológicos.
* Usar protetor facial, como óculos de segurança, principalmente quando houver
possibilidade de espirros de fluidos.
* É proibido o manuseio de maçanetas, telefones, puxadores de armários , ou outros
objetos de uso comum por pessoas usando luvas durante a execução de atividades em que,
agentes patogênicos ou material correlato ( químico e/ou biológico) esteja sendo
manipulado.
* Não é permitida a presença de animais e plantas que não estejam relacionados com
as atividades do laboratório.
* O acesso ao laboratório é limitado ou restrito ao pessoal técnico e alunos. Não é
permitida a circulação de pessoas estranhas .
* Minimizar a formação de aerosóis durante as manipulações laboratoriais.
* Não levar luvas para áreas externas do laboratório.
* Comunicar ao professor se possuir algum ferimento nas mãos.
* Em caso de acidente, comunicar imediatamente o professor e\ou o técnico
responsável.
* Tratar os cortes, perfurações ou abrasões imediatamente, limpando com solução
antisséptica e cobrindo com curativo.
* Comunicar imediatamente qualquer suspeita de haver contraído uma enfermidade,
como consequência de uma infecção no laboratório.
b) Trabalho individual:
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AULA PRÁTICA : 02
a) Tubos de Ensaio
b) Placas de Petri
c) Pipetas
d) Lâminas e lamínulas
- Ténicas especiais :
pipetas : colocar as pipetas em cubas rasas, cobrir com solução de detergente a 0,5-
1,0% e aquecer até a ebulição. Retirar as pipetas da solução detergente; enxaguar por 5 a 10
vezes em água corrente e por último em água destilada. Escorrer o excesso e colocar para
secar em estufa a 80-100ºC.
lâminas e lamínulas : colocar as lâminas em álcool etílico a 95% contendo 3% de
ácido clorídrico.Deixar de molho durante algumas horas.Retirar as lâminas da mistura
álcool-ácido, enxaguar por 5 a 10 vezes em água corrente e por último em água
destilada.Secar as lâminas com pano limpo e macio. Segurar as lâminas pelas bordas para
evitar a impregnação das mesmas com gordura das mãos. Guardá-las em recipiente fechado.
SECAGEM
ACONDICIONAMENTO
* A boca de toda a vidraria como tubos, garrafas, balões e erlenmeyer é fechada com
tampões de algodão (buchas), que não devem ser folgados ou demasiadamente apertados.
* Nas garrafas, erlenmeyer, balões de fundo chato, etc.a bucha de algodão deve ser
recoberta com gaze (boneca). Levam, também, um envólucro de papel, o qual é amarrado
com barbante.
* Os tubos de ensaio, depois de fechados com as buchas de algodão, são empacotados.
O número de tubos depende da necessidade de uso do laboratório.
* As placas de Petri são embrulhadas individualmente ou em número de 2, 5, 10, etc,
conforme a demanda de uso. os pacotes são fixados com barbante ou fita crepe.
* Pipetas são embuchadas na extremidade destinada a aspiração, com pequena bucha
de algodão colocada com o auxílio de uma agulha ou estilete, sendo então, totalmente
envolta em papel de embrulho.
Elas também podem ser acondicionadas em pacotes de papel ( conjunto de 5, 10, 20) ou em
cilindros de aço inoxidável especialmente fabricado para este propósito. A bucha não
permite a penetração de germes que podem contaminar os líquidos e protegem o operador
contra a ingestão de líquidos contaminados.
* Os swabs ( cotonetes ou zaragatoa ) devem ser recobertos com papel alumínio e
embaladas em pacotes de papel( com marcas que identifiquem o local onde está o cabo do
swab) ou colocados em frascos autoclaváveis que devem ser embuchados e envolvidos
parcialmente em papel.
⇒ ⇒ ACONDICIONAM
LAVAGEM SECAGEM ENTO
⇑ ⇓
Trabalho individual :
- Fazer a desinfecção da bancada com álcool 70%.
- Lavar as mãos conforme instrução da aula anterior.
- Embuchar, conforme a orientação do professor, 3 tubos de ensaio 13 x100 mm e 3
tubos 16x150 mm.
- Acondicionar 4 pipetas sorológicas ( 1, 2, 5 e 10 ml) utilizando o seguinte
procedimento: Com o auxílio de um estilete ( clips para papel), colocar uma pequena bucha
de algodão no bocal da pipeta. Verificar, assoprando suavemente na pipeta, se a bucha está
adequada. Não deve estar frouxa, nem muito apertada o que dificultaria a passagem de ar.
Acondicionar individualmente cada pipeta utilizando papel kraft 50x10 cm. Amarrar com
barbante ou fita crepe; anotar o volume da pipeta.
- Produzir 05 zaragatoa ( swabs) utilizando palito para churrasco , algodão e papel
alumínio.
Trabalho em grupo :
- Deverá ser feita por grupo composto por dois alunos:
- Acondicionar os tubos embuchados em pacotes , utilizando papel kraft e barbante
ou fita crepe. Identifique o material, coloque a data.
- Montar feixes de pipetas, com mesmo volume, conforme orientação do professor.
- Acondicionar 1 erlenmeyer de 250 ml, conforme instrução do professor.
- Acondicionar 07 placas de Petri, utilizando papel kraft e fita crepe. Um pacote
deve conter 02 placas e o outro 05 placas.
- Acondicionar as zaragatoas utilizando papel kraft e barbante.
- Acondicionar 5 tubos em latas para serem autoclavados.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AULA PRÁTICA : 03
- Abrir a tampa da autoclave e colocar água na caldeira até quase atingir a cruzeta( um dedo
abaixo);
- Introduzir o cesto metálico contendo o material a ser esterilizado;
- Fechar a tampa, apertando por igual os manipuladores;
- Ligar a chave elétrica no máximo da intensidade;
- Abrir o registro do orifício do escapamento. A princípio, há expulsão do ar contido na
caldeira. Quando a água começa a ferver, sai um jato intermitente de ar misturado com
vapor de água. Quando todo o ar residual é expulso do aparelho, começa a sair um jato
contínuo de vapor de água. Fechar o registro do orifício de escapamento. O manômetro
começa a acusar o aumento de pressão:
- Ao atingir a temperatura de 121ºC ( 1 atmosfera de pressão), diminuir a intensidade de
calor girando a chave elétrica para a posição média ou mínima, de forma que a pressão
permaneça estável;
- Marcar o tempo de esterilização de 15 minutos;
- Desligar a chave elétrica girando-a para a posição desligado;
- Aguardar que a pressão retorne a zero atmosfera;
- Abrir o registro do orifício de escapamento para equalizar a pressão da autoclave com a do
ambiente;
- Com auxílio de luvas de amianto, de cano longo, afrouxar os manipuladores;
- Abrir a tampa da autoclave com cuidado. Proteger o rosto contra a projeção de vapor;
- Retirar o cesto com o material esterilizado.
Obs: Para regular a válvula de segurança, deslocar o contra-peso para frente ou para trás, de
maneira a estabilizar a pressão desejada, observando-se o limite de até 1,5 atmosferas. A
água da caldeira após a esterilização de material contaminado deve ser drenado através da
válvula de drenagem.
A esterilização de líquidos e gases pode ser efetuada por meio de filtração através de
materiais capazes de reter microrganismos. Atualmente, dois tipos de filtros são
amplamente utilizados em laboratórios de microbiologia : discos filtrantes (Seitz) e
membranas filtrantes (Millipore, Sartorius).
Os discos Seitz são discos de amianto, extremamente absorventes, que retém os
microrganismos principalmente por diferenças de cargas elétricas. As membranas filtrantes
são constituídas de ésteres de celulose e contém milhões de poros microscópicos com
diâmetros uniformes variando de 0,01 a 14 µm. Essas membranas retém, em sua superfície,
todas as partículas que excedem ao tamanho dos seus poros. Na prática bacteriológica,
geralmente são utilizadas membranas com poros de 0,45 a 0,22 µm. Os discos e membranas
filtrantes são muito utilizados no laboratório de microbiologia para a esterilização de
soluções termolábeis, como por exemplo: soro, plasma, açucares, antibióticos, vitaminas
que são adicionadas assepticamente em meios de cultivo.
4- ATIVIDADE PRÁTICA
Trabalho individual :
5) Quantos frascos ,e em que posições ,de indicadores biológicos devem ser colocados em
autoclaves pequenas , média e grandes?
AULA PRÁTICA : 04
CONTEÚDO :
1- Segurança e Higiene no trabalho microbiológico ( Manipulação asséptica)
2- Atividade prática : Técnicas de manipulação asséptica
Área contaminada
Equipamentos de segurança :
Higiene Pessoal:
Em caso de acidentes
4- ATIVIDADE PRÁTICA
Trabalho individual :
Manipulação asséptica :
ANOTAÇÕES
AULA PRÁTICA : 5
A) Introdução
Um pré-requisito para a caracterização de uma espécie microbiana no laboratório de
microbiologia é que ela esteja disponível para estudo como uma cultura pura. O termo
cultura pura quer dizer que todas as células da cultura tem uma origem comum, isto é,
são descendentes da mesma célula. É possível obter uma cultura pura através da
transferência de uma célula para um meio de cultura adequado, através do uso de
micromanipulador acoplado a um microscópio. Entretanto, na prática microbiológica
são empregados métodos indiretos para a obtenção de culturas puras, baseados em
técnicas de isolamento de colônias, como por exemplo: (1) Técnicas de esgotamento por
estrias contínuas ou descontínuas, na superfície do agar nutriente; (2) Diluição e
semeadura por técnica de “pour plate” ou de semeadura em superfície de agar nutriente.
Em termos práticos, considera-se que a população microbiana de uma colônia é
proveniente de uma única célula e portanto representa uma cultura pura. Na realidade,
neste caso, o termo cultura axênica pode ser mais apropriado do que cultura pura porque
cultura axênica significa o crescimento de um microrganismo em um ambiente livre de
outros organismos. Essencialmente, o termo cultura pura implica em pureza genética
enquanto que cultura axênica não.
Trabalho individual:
COLORAÇÃO DE GRAM
O método de Gram se baseia no fato de que o complexo formado entre o iodo (lugol)
e a violeta de genciana (“complexo iodo-pararosa-anilina”) permanece retido dentro da
célula de algumas bactérias mesmo após o tratamento subseqüente com o álcool (“agente
descorante”). Estas bactérias são denominadas Gram positivas ou que tomam o Gram.
Outras bactérias chamadas Gram negativas ou que não tomam o Gram descoram facilmente
pelo álcool. Entretanto, se após a ação do álcool se efetuar uma coloração de fundo
utilizando-se a fucsina básica, as bactérias Gram negativas aparecerão coradas em
vermelho, ao passo que as Gram positivas se apresentarão roxas, isto é, conservarão a cor
violeta do complexo iodo-violeta de genciana.
O mecanismo da coloração de Gram não está ainda bem definido porém, se relaciona
indubitavelmente ás diferenças de permeabilidade da parede celular. Nas bactérias Gram
positivas a parede é constituída essencialmente por um componente mucopeptídico e o
tratamento com álcool resulta uma desidratação e conseqüente diminuição da
permeabilidade,o que impede ou dificulta a eluição do complexo iodo-corante. O mesmo
não acontece nas bactérias Gram negativas, nas quais o solvente orgânico atua em sentido
contrário determinando aumento de permeabilidae celular. A coloração de Gram é de
elevada importância para a sistemática em bacteriologia pois divide as bactérias em dois
grandes grupos: GRAM POSITIVAS e GRAM NEGATIVAS, que reagem
diferentemente frente a muitos agentes físicos e químicos.
1.1 - Fórmula:
1.2 - Fenol fundido: para manter o fenol fundido dissolver em Banho-Maria a 50-
60°C e adicionar 10% de água destilada.
1.3 -. Preparo: triturar o cristal violeta em um gral. Adicionar o álcool,
homogeneizar. Juntar o fenol fundido. Acrescentar aproximadamente 50 ml de água
destilada, misturar e transferir para um frasco âmbar de rolha eesmerilhada. Lavar o gral 2 a
3 vezes com o restante de água destilada. Deixar em repouso durante 24 horas. Filtrar em
papel ou algodão para outro frasco âmbar de rolha esmerilhada. Estocar.
NOTA: Quando da transferência do corante em estoque para frascos conta-gotas
filtrar novamente com papel de filtro ou algodão.
2.1 -Fórmula:
Iodo 1,0 G
Iodeto de potássio 2,0 G
Água destilada 300 Ml
2.2 - Preparo: triturar o iodo com iodeto de potássio em um gral. Adicionar aos
poucos a água destilada. Misturar bem. Filtrar e estocar em frasco âmbar de rolha
esmerilhada.
Usar apenas solventes P.A. podendo-se empregar o álcool etílico 95° à mistura de
álcool-cetona (1:1); ou a de éter-cetona na proporção de (1:3).
Atividade prática
AULA PRÁTICA: 7
ANTIBIOGRAMA: TÉCNICA DE DIFUSÃO EM ÁGAR.
INTRODUÇÃO
MEIO DE CULTURA
Apliação do Disco - Os discos podem ser aplicados com dispoitivos mecânicos múltiplos
ou individuais, ou manualmente com auxílio de uma pinça. Os discos devem ser
precionados levemente contra a superfície do meio. Devem ser colocados pelo menos
20mm da borda da placa e devem distar um do outro de pelo menos 30mm. Considerando-
se que algumas drogas se difundem quase que instantaneamente, o disco não pode ser
movido de posição após o contato com a superfície do ágar de Mueller-Hinton. Colocar no
centro da placa os discos dos antibióticos que se difunde com menos intensidade, EX:
polimixina, bacitracina e vancomicina.
Leitura das Placas - Após 16 a 18 horas de incubação examinar cada placa e medir, com
auxilio de uma régua, o diâmetro da zona de completa inibição incluindo o diâmetro do
disco. O halo de inibição do ágar Mueller-Hinton é medido macroscopicamente, em
milímitros, pelo lado externo do fundo da placa, utilizando-se luz refletida sobre um fundo
escuro. No caso do Mueller-Hinton ser adicionado de sangue, medir as zonas de inibição na
superfície do meio de cultura, com a tampa da placa removida.
Interpretação - A categoria que a bactéria é colocada, isto é, resistente, intermediária ou
sensível, é obtida pelo tamanho do halo de inibição
AMOSTRA:
AULA PRÁTICA : 8
IDENTIFICAÇÃO DE BACILOS DA FAMÍLIA Enterobacteriaceae
INTRODUÇÃO
Nesta unidade estão apresentadas as provas bioquímicas básicas do sistema R/b (não
disponível no comércio brasileiro para a identificação de bacilos Gram negativos
pertencentes à família Enterobacteriaceae. O mecanismo bioquímico aqui apresentado será
sempre o mesmo, independente do sistema utilizado.
TRIPLICE AÇUCAR FERRO (TSI)
1.Finalidade:
Determinar a habilidade de um microrganismo em utilizar, incorporados a um meio basal,
glicose e ou lactose e sacarose com ou sem a produção de gás; evidenciar ainda a produção
de gás sulfídrico (H2S). O meio de TSI é empregado comumente em bacteriologia para a
identificação preliminar (triagem) das enterobactérias.
2. Fórmula:
Extrato de carne 3,0 g
Extrato de levedura 3,0 g
Peptona 20,0 g
Lactose 10,0 g
Sacarose 10,0 g
Glicose 1,0 g
Sulfato ferroso 0,2 g
Tiossulfato de sódio 0,3 g
Cloreto de sódio 5,0 g
Vermelho de fenol 0,024 g
Agar-agar 12,0 g
Água destilada 1000 ml
3. Mecanismo:
A utilização dos açúcares presentes no meio de TSI pode ocorrer aerobicamente na
superfície ou anaerobicamente em profundidade, ou simultaneamente, dependendo do
potencial enzimático do microrganismo em questão. Basicamente encontramos no meio de
TSI os 3 modelos de fermentação abaixo apresentados:
* (3) Não fermentação da lactose, sacarose ou glicose (k/K) ou (K/NC). Certas bactérias,
principalmente bacilos Gram negativos não entéricos, são incapazes de fermentar os
açúcares presentes no TSI. O desenvolvimento destes microrganismos ocorre devido a
degradação das peptonas. A reação K/K é resultado da degradação tanto aeróbica quanto
anaeróbica das peptonas, enquanto que o modelo K/NC é devido ao catabolismo somente
aeróbico destas substâncias.
Os gases produzidos no meio de TSI são CO2 e H2 e as bactérias produtoras são chamadas
aerogênicas. No caso da não formação de gases são ditas anaerogênicas.
O meio de TSI evidencia ainda a presença de bactérias produtoras de gás sulfrídrico (H2S),
resultante da reação em duas etapas:
- A bactéria num ambiente ácido degrada o tiossulfato de sódio (substrato) com a produção
de gás sulfídrico que é um gás incolor e invisível.
- Numa segunda etapa, o H2S reage com o sulfato ferroso existente no meio (revelador)
formando o sulfeto ferroso que é um composto insolúvel, responsável pela coloração negra
que aparece no meio de TSI. Observar que a produção de H 2S implica na produção de ácido
mesmo que a coloração amarela não possa ser observada.
5. Técnica de preparo:
Meio encontrado comercialmente desidratado. Portanto, para o preparo do meio seguir as
instruções do fabricante.
6. Leitura e Interpretação:
Reação na superfície ou ápice / reação na profundidade ou base:
K: alcalino
A: ácido
AG: ácido e gás
H2S: gás sulfídrico
INDOL
2. Mecanismo:
O triptofano é um aminoácido que quando degradado por certas bactérias levam à formação
principalmente dos seguintes produtos metabólicos intermediários: indol, escatol (metil
indol) e ácido indol-acético. As várias enzimas intracelulares envolvidas neste processo
fisiológico são coletivamente denominadas de “triptofanases”. Os produtos intermediários
formados em maior quantidade na degradação do triptofano são o ácido indol pirúvico, que
produz indol por desaminação-deaminação, e o escatol formado pela descarboxilação do
ácido indol-acético. A presença do indol no meio de cultivo é revelada pela adição do
reativo de Kovacs, ocorrendo então a seguinte reação química:
O p-dimetil-amino-benzaldeído se liga à molécula do indol produzindo um composto
quinoidal de coloração vermelha, evidenciado pela formação de um anel na camada
alcoólica superficial do meio. A reação de cor é na realidade devido a reação dos grupos
CH2 do anel pirrólico da molécula do indol com o aldeído, que num meio “ácido” forma
uma “quinona”.
4. Técnica de preparo:
A prova do indol pode ser realizada utilizando-se um meio específico para esta prova.
Entretanto, nos laboratórios de rotina de microbiologia clínica, geralmente, empregam-se
meios que fornecem leitura de outras provas bioquímicas além do indol, como por exemplo
o MIO (motilidade, indol e ornitina).
Os meios são encontrados comercialmente desidratados. Portanto, para o preparo seguir as
instruções do fabricante.
5. Leitura e Interpretação:
Adicionar 5 gotas de Reativo de Kovacs na superfície do meio inoculado:
- Positivo: desenvolvimento de anel vermelho na superfície do meio de cultivo.
- Negativo: sem desenvolvimento de cor na camada alcoólica.
Obs. Pode ocorrer o desenvolvimento de uma coloração laranja na superfície do meio
devido a presença de escatol, que pode ser um dos precursores para a formação do indol.
CITRATO DE SIMMONS
1. Finalidade:
Determinar se um microrganismo é capaz de utilizar o citrato como única fonte de carbono
para o seu crescimento com conseqüente alcalinização.
2. Mecanismo:
Normalmente, o metabolismo do citrato envolve a condensação de uma molécula acetil com
a coenzima A mais o oxalacetato para iniciar o ciclo de Krebs. A grande maioria das
bactérias utilizam o citrato pelo ciclo dos ácidos tri-carboxílicos ou através da via
fermentativa. A clivagem do citrato envolve a participação da “citratase”. O citrato é
transformado em acetato e oxalacetato sendo este último transformado em piruvato e CO2.
O meio de cultivo utilizado para a fermentação do citrato também contém um sal inorgânico
de amônia. O microrganismo que usa o citrato como única fonte de carbono também utiliza
o sal de amônia como única fonte de nitrogênio. A degradação destes sais produz amônia
(NH3) com a conseqüente alcalinização.
5. Técnica de preparo:
Meio encontrado comercialmente desidratado. Portanto, para o preparo do meio seguir as
instruções do fabricante.
6. Leitura e Interpretação:
- Positivo: crescimento bacteriano com ou sem alteração da cor do meio para azul.
- Negativo: ausência de crescimento bacteriano. Não ocorre alteração da cor do meio.
1. Finalidade:
Determinar se um microrganismo é móvel ou imóvel., ou seja se tem ou não flagelo.
2. Técnica de preparo:
A prova da motilidade pode ser realizada utilizando-se um meio específico para esta prova.
Entretanto, nos laboratórios de rotina de microbiologia clínica, geralmente, empregam-se
meios que fornecem leitura de outras provas bioquímicas além do indol, como por exemplo
o MIO (motilidade, indol e ornitina).
Os meios são encontrados comercialmente desidratados. Portanto, para o preparo seguir as
instruções do fabricante.
5. Leitura e Interpretação:
- Positivo: o microrganismo móvel se difunde ao redor da linha da picada, apresentando o
aspecto de uma nuvem difusa.
- Negativo: o microrganismo imóvel cresce apenas ao longo da linha de semedura.
LISINA DESCARBOXILASE
1. Finalidade:
Determinar a habilidade enzimática de um determinado microrganismo em descarboxilar o
aminoácido lisina com a conseqüente alcalinização do meio de cultivo pela formação da
amina correspondente.
2. Mecanismo:
A descarboxilação é um processo no qual as bactérias que possuem enzimas
“descarboxilases” específicas, são capazes de atuar nos grupos carboxila-terminal (-
COOH) dos aminoácidos produzindo uma amina ou diamina e dióxido de carbono. As
enzimas descaboxilases são numerosas, porém específicas para um determinado substrato
(aminoácido). Estas enzimas são adaptativas porque são formadas pelos microrganismos
somente quando estes são cultivados em ambiente ácido, na presença do substrato
específico. Os produtos de descarboxilação por sua vez, determinam uma alcalinidade no
pH do meio de cultura. A descarboxilação é restrita àqueles aminoácidos que possuem pelo
menos um grupo quimicamente ativo além da amina (-NH2) ou do grupo carboxílico (-
COOH) e a quebra do aminoácido ocorre anaerobicamente. A descarboxilação é um
processo irreversível não oxidativo e requer uma coenzima comum. o piridoxal fosfato. O
aminoácido lisina, sob a ação da lisina descarboxilase forma uma diamina (cadaverina) e
dióxido de carbono.
NH2-CH2-(CH2)3-CH-NH2-COOH
(L-lisina)
⇓
⇓ lisina descarboxilase - CO2
⇓
NH2-CH2-(CH2)3-CH2-NH2 + CO2
(cadaverina)
5. Leitura e Interpretação:
- Positivo: desenvolvimento de uma coloração púrpura.
- Negativo: desenvolvimento de uma coloração amarela.
OBSERVAÇÃO
O princípio bioquímico da descarboxilação da ORNITINA E ARGININA é semelhante ao
descrito acima, mudando na fórmula simplesmente o aminácido a ser descarboxilado como
também a diamina formada pela ação do microrganismo no substrato (ornitina e arginina),
originando a putrescina.
NH2-CH2-(CH2)3-CH-NH2-COOH
(L-ornitina)
⇓
⇓ ornitina descarboxilase +
CO2
⇓
NH2-CH2-(CH2)3-CH2-NH2 + CO2
(putrescina)
NH=CNH2-NH-(CH2)3-CH-NH2-COOH
(L-arginina)
⇓
⇓ arginina descarboxilase + CO2
⇓
NH2-CH2-(CH2)3-CH2-NH2 + CO2
(putrescina)
FERMENTAÇÃO DE CARBOIDRATOS
1. Finalidade:
Determinar a habilidade de um microrganismo em fermentar um carbohidrato específico
incorporado num meio basal com a produção de ácido ou ácido e gás.
Obs. Uma única base pode ser empregada para a observação da capacidade do
microrganismo de fermentar diferentes açúcares. O carbohidrato deverá ser
incorporado ao meio base na hora do uso.
Nos laboratórios de rotina de microbiologia clínica são utilizados meios que fornecem
leitura de outras provas bioquímicas além da fermentação de açúcares (glicose,
lactose, sacarose), como por exemplo o TSI, Rugai, KIA, etc...
2. Mecanismo:
A fermentação é um processo metabólico anaeróbico de óxido-redução no qual um
substrato orgânico serve como aceptor final de hidrogênio. Na fermentação de substratos
orgânicos como os carbohidratos ocorre a formação de produtos oxidados e reduzidos, que
dependem de alguns fatores tais como:
(1) o tipo de microrganismo
(2) a natureza do substrato a ser fermentado
(3) as condições ambientais de cultivo com temperatura, acidez, etc...
Os produtos de fermentação dos carbohidratos e álcoois, genericamente denominados de
“açúcares”, são poucos: dois gases (H2 e CO2), poucos ácidos e álcoois e uma cetona.
5. Leitura e Interpretação:
- Fermentação do açúcar: meio ácido - coloração amarela.
- Não fermentação do açúcar: meio alcalino - coloração vermelha.
FENILALANINA DESAMINASE
1. Finalidade:
Determinar a habilidade de um microrganismo em desaminar a fenilalanina com a
conseqüente modificação de meio de cultivo pela formação de ácido fenilpirúvico.
4. Leitura e interpretação:
Após 18 24 horas de incubação adicionar 4 a 5 gotas da solução de cloreto férrico
diretamente no tubo inoculado.
- Positivo: desenvolvimento de uma coloração verde escura.
- Negativo: sem desenvolvimento de cor.
PROVA DA OXIDASE
1. Finalidade:
Determinar a presença da enzima oxidase (citocromo oxidase).
2. Mecanismo:
Os citocromos são hemeproteínas que atuam com aceptores intermediários de elétrons no
processo de respiração aeróbia, envolvendo no estágio final desta cadeia a participação da
enzima oxidase (citocromo oxidase). O sistema citocromo ocorre em organismos aeróbios
ou anaeróbios facultativos, podendo estar associado nestes casos à enzima oxidase. A prova
da oxidase é empregada para investigar aqueles microrganismos que apresentam ou não esta
enzima ou que são anaeróbios obrigatórios. O teste utiliza certos reagentes (corantes) tais
como o dicloridrato de tetrametil-fenilenodiamino, que substituindo o oxigênio atua como
aceptor artificial de elétrons. O corante no estado reduzido é incolor, contudo na presença
da citocromo oxidase e do oxigênio atmosférico é oxidado tomando uma coloração escura.
3. Execução do teste:
Atritar em um pedaço de papel de filtro uma porção da colônia bacteriana a ser testada.
Adicionar uma gota do reativo sobre o inóculo.
4. Leitura e Interpretação:
- Positivo: desenvolvimento de uma coloração púrpura imediatamente após a adição de
reativo
- Negativo: sem o desenvolvimento de cor.
PROVA DO KCN
1. Finalidade:
Determinar a capacidade de um microrganismo em reproduzir-se em um meio que contenha
cianeto de potássio.
2. Mecanismo:
A respiração aeróbia é um processo de óxido-redução que produz energia. A maioria dos
organismo aeróbicos possuem a enzima citocromo-oxidase que as tornam capazes de
utilizar o oxigênio como aceptor de hidrogênio. O Cianeto é um inibidor não competitivo
do sistema citocromo-oxidase. No entanto, alguns microrganismos aeróbicos não são
sensíveis ao cianeto. Esta resistência se deve provavelmente, a um sistema de respiração
flavoproteica.
3. Técnica de semeadura:
Semear por dispersão inóculo pouco denso.
4. Leitura e interpretação:
Após 24 - 48 horas de incubação a 35º C, alguns podem precisar até 4 dias de incubação,
observar a presença ou ausência de crescimento bacteriano.
- Positivo ⇒ Crescimento (meio turvo)
- Negativo ⇒ Ausência de crescimento (meio inalterado).
OBS: O cianeto é extremamente tóxico e deve ser destruído pela adição de sulfato
ferroso e 0,1 ml de KOH a 40 % para inativação do cianeto. Após autoclavar os
tubos.
AULA PRÁTICA: 9
VISUALIZAÇÃO DE FUNGOS
INTRODUÇÃO
MÉTODO
RUSULTADO E INTERPRETAÇÃO
Lâmina 1 -
Lâmina 2
OBS: Apesar dos fungos serem todos Gam-positivos, esta coloração não é utilizada para
bolores, pois a montagem através de esfregaços fixados destruiria a estrutura de
continuidade que existe entre o micélio vegetativo e o reprodutor e também impediria, pela
cor da violeta-genciana, a visualização dos septos.
A coloração de Gram para visualizar a morfologia das leveduras pode ser utilizada,
pois esta é um fungo unicelular, e quando há necessidade de visualizar outras estruturas
utilizam-se os métodos como a coloração com tintura-da-china para cápsula e a prova da
filamentação, que é um cultivo em lâmina para visualizar a pseudo-hifa e os esporos
formados por multiplicação vegetativa .
OBJETIVOS:
- visualizar estruturas vegetativas de fungos filamentosos.
- visualizar estruturas de reprodução dos fungos filamentosos.
- visualizar a formadas leveduras.
- visualizar os esporos formados por multiplicação vegetativa das leveduras e
bolores.
- visualizar cápsulas das leveduras.
- Citar algumas colorações utilizadas para exame microscópico de fungos.
AULA PRÁTICA : 10
CONTROLE DA MICROBIOTA DAS MÃOS
INTRODUÇÃO:
OBJETIVOS
MATERIAL NECESSÁRIO:
PROCEDIMENTO
FIGURA 1
SEGUNDA FASE :
MATERIAL NECESSÁRIO
- Placa de ágar-sangue;
- Lâminas de microscopia;
- Bateria de coloração de Gram;
- Alça de platina
- Microscópio.
INTERPRETAÇÃO
RESULTADOS
1º terço da placa :
2º terço da placa :
3º terço da placa :
AULA PRÁTICA : 11
IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM POSITIVOS
PROVA DA CATALASE
BIOQUÍMICA ENVOLVIDA:
A enzima catalase está presente na grande maioria das bactérias aeróbias ou anaeróbias
facultativas, que contém o complexo citocromo. Usualmente, os microrganismos que não
contém citocromos também não possuem catalase . Grande parte das bactérias anaeróbias
possuem peroxidases em vez de catalase. Na decomposição da molécula de água oxigenada
“in vitro”, uma molécula atua como substrato reduzido e a outra como um doador. O
substrato reduzido pelos átomos de hidrogênio cedidos pelo doador dá como resultado um
substrato reduzido (H20) e um doador oxidado (gás).
H2O2 + H2O2 ⇒ 2 H2O2 + O2
REATIVO EMPREGADO:
Peróxido de hidrogênio 30% (Superoxol)
Conservar em congelador a 4ºC.
TÉCNICA:
Com a alça ou agulha de semeadura bacteriológica depositar uma porção de um cultivo
bacteriano puro no centro de uma lâmina limpa e desengordurada. Adicionar uma gota de
água oxigenada a 30%. “Não inverter a ordem e não agitar”.
LEITURA:
POSITIVO : Formação imediata de bolhas de gás.
NEGATIVO : Ausência de bolhas de gás.
PRINCIPIO:
Verificar se a bactéria é capaz de crescer em meio contendo alta concentração de NaCl (7,5
%).
O gênero Staphylococcus cresce neste meio, enquanto os gêneros Micrococcus,
Planococcus e Stomatococcus não o fazem.
TÉCNICA DE SEMEADURA:
Fazer semeadura por estrias superficiais com auxiílio de uma agulha de semeadura
bacteriológica. Incubar 35ºC por 24 horas.
LEITURA:
POSITIVO: Presença de crescimento.
NEGATIVO: Ausência de crescimento.
DNase
PRINCÍPIO:
Determinar a atividade de um microrganismo em produzir a enzima desoxirribonuclease.
TÉCNICA DE SEMEADURA:
Semear fazendo um “risco” com auxilio de uma agulha de semeadura bacteriológica o meio
contida em placa. Iincubar a 35ºC por 24 horas.
BIOQUÍMICA ENVOLVIDA:
Com a produção da enzima Dnase pelo microrganismo, esta é difundida no meio de cultivo,
e agindo sobre o DNA quebrará sua dupla hélice. Ao se fazer a revelação com HCl 1N
ocorrerá precipitação do DNA íntegro, tornando desta forma o meio com aparencia turva.
Onde não houve precipitação do DNA, por não estar íntegro, ruptura esta causada pela ação
da enzima DNase, não ocorrerá turvação do meio de cultura,aparecendo desta forma um
halo transparente ao redor da semeadura do microrganismo produtor da enzima.
LEITURA:
Cobrir toda a superfície do meio de cultura na placa com äcido clorídrico 1N. Aguardar
alguns minutos para fazer a leitura.
POSITIVO: aparecimento de um halo transparente ao redor da semeadura.
COAGULASE
PRINCÍPIO:
Determinar a capacidade de um microrganismo em coagular o plasma pela ação da enzima
coagulase.
REATIVOS:
Recomenda-se, de preferência, utilizar plasma humano ou de coelho, podendo ser
substituido por plasma de cavalo, carneiro ou bovino.
Coletar assépticamente o sangue em um recipiente previamente esterilizado, contendo uma
quantidade estabelecida de anticoagulante. Deixar as hemácias sedimentarem ou centifugar
a 1500 - 2000 rpm durante 10 minutos.
Assépticamente retirar o plasma e colocar em recipiente esterilizado.
TÉCNICA DE SEMEADURA:
Colocar em um tubo de ensaio (13 x 100 mm) esterilizado, 0,5 ml de plasma humano ou de
coelho não diluído. Adicionar 0,5 ml de um cultivo em caldo simples (cultura pura) de 18 -
24 horas juntamente com o plasma. Girar o tubo suavemente para homogeinizar a
suspensão de microrganismos (Não agitar). Incubar a 37ºC em Banho Maria por 4 horas.
Observar a cada 30 minutos se há formação de coágulo. Se após 4 horas não houver
coágulo visível, incubar em estufa a 37ºC por 18 - 24 horas.
Coagulase
Plasma ⇒⇒⇒⇒⇒⇒⇒⇒⇒ coágulo de fibrina
bacteriana
Alguns autores sugerem que a coagulase é uma substância semelhante a protrombina que
reage com os fatores plasmáticos normais para formar uma substância semelhante a
trombina que por sua vez ativa o fibrinogênio para formar a fibrina.
LEITURA:
POSITIVO: Forma um coágulo ou filamentos de fibrina definidos.
-Completa: o coágulo abrange todo o tubo.
-Parcial: o coágulo não se estende por todo o meio.
Qualquer grau de coagulação se considera positivo.
PRINCÍPIO:
Determinar a habilidade de um microrganismo em degradar o manitol
TÉCNICA DE SEMEADURA:
Semear por picada profunda com auxílio de uma agulha de semeadura bacteriológica dois
tubos contendo o meio. Após adicionar de 10 - 15 gotas de vaselina líquida estéril em um
dos tubos. Incubar a 35ºC, por 48 - 72 horas.
LEITURA:
POSITIVO: Desenvolvimento de cor amarela no meio de cultivo.
NEGATIVO:Não auteração da cor do meio.
MALTOSE
PRINCÍPIO:
Determinar a habilidade de um microrganismo em utilizar a maltose.
TÉCNICA DE SEMEADURA:
Semear por estrias superficiais com auxílio de uma alça bacteriológica.
Incubar a 35ºC por 24 -72 horas.
LEITURA:
POSITIVO: Desenvolvimento de halo de coloração amarela ao redor do crescimento
bacteriano.
VARIÁVEL: Não visualização de halo de coloração amarela na parte supeerior do,agar mas
ocorre o aparecimento de halo amarelo na parte inferior do agar.
NEGATIVO: Sem desenvolvimento de halo de coloração amarela ao redor do crescimento
bacteriano
(Catalase +)
|
Chapman
|
|
| |
(+) (-)
Staphylococcus sp Micrococcus sp
| Planococcus sp
| Stomatococcus sp
DNase
Coagulase
|
| |
(+) (-)
|
| S. aureus S intermedius S. hycus Estafilococos
coagulase negativo
Manitol aeróbio (+) (+) (-)
Manitol anaeróbio (+) (-) (-)
Maltose (+) (+)/(-) (-)